JP4377690B2 - 拍動する心筋細胞へ形質転換する幹細胞 - Google Patents

Description

先行する特許請求
本願は、本明細書に参照として組入れられている、2001年10月22日に出願された米国特許出願第10/003,400号の優先権を主張するものである。

分野
本願は、幹細胞の分野、特に筋幹細胞の作成および分化の方法に関する。

背景
毎年多くのヒトがうっ血性心不全で亡くなっている。心不全は、様々な原因により生じ、これは心筋症、心筋虚血、先天性心疾患、および弁膜性心疾患を含み、心臓の細胞の死および心筋の機能不全を生じる場合がある。心筋細胞は成人の心筋組織においては置き換わらないので、現存の健常な心筋細胞に対する生理的要求によりそれらは肥大する。心疾患最終病期の患者にとって、心臓移植は唯一の頼りであるが、米国臓器移植ネットワーク(Uniterd Network of Organ Sharing; UNOS)は、2000年2月時点で40,000名を超す患者が心臓移植を待っていたが、1998年にはわずかに2,345名が提供された心臓を受け取ったにすぎないことを報告している。更に心臓移植は、移植されたドナー組織とレシピエント免疫系の間の不適合により複雑であり、長期間の免疫抑制が必要である。更に心臓移植の別の欠点は、それには経費がかかることである。

心臓移植の代替法は、心不全および心筋細胞の死または機能不全を特徴とする他の心疾患の治療に使用することができる、インビトロにおける幹細胞からの心筋細胞の作成である。この方法は、幹細胞の自己複製能、および心筋細胞を含む1種または複数の成熟細胞型への分化能の両方に基づく。損傷を受けた心筋層を修復するために、幹細胞を、心疾患に罹患している個体から得、次に心筋細胞のインビトロにおける作成に使用することができる。この方法は、移植に適した心臓の不足または移植された心臓の免疫拒絶反応のような、心臓移植に付き物の諸問題を回避する。

国際公開公報第01/11011 A2号に開示された、胚盤胞の内部細胞塊に由来した胚性幹(ES)細胞は、最も原始的な幹細胞である。これらの細胞は、限定されない自己複製能を有し、かつこれらはいくつかの細胞系へ分化し、移植時に組織を再び定着させることができるので、これらは多分化能を有する。胚性幹細胞の拍動心筋細胞への分化に関するプロトコールを入手することはできるが、医学研究のためのヒト胚の使用については倫理的議論の渦中にある。

ほとんどの臓器組織において同定された系統特異的幹細胞は、ES細胞よりも自己複製能が低く、およびそれらの分化能は、その系統の組織に限定されている。系統特異的幹細胞である造血幹細胞(HSC)は、骨髄、血液、臍帯血、胎児肝および卵黄嚢に由来し、これは最も良く特徴付けられている。これらの細胞は、c-kit(c-kit+)のような細胞表面マーカーの発現により定義されており、ならびにあらゆる造血細胞種へ最終分化することができる。HSCは、インビボにおける機能的心臓組織の形成に寄与することが示されている(Jacksonら、J. Clin. Invest.、107:1395-1402(2001))。間葉系幹細胞(MSC)は、中胚葉起源の組織由来の多能性前駆細胞である(米国特許第5,486,359号)。これらの細胞は、最も多くは骨髄から入手されるが、これらは血液または真皮などの他の供給源から得ることができる。これらの細胞は、分化し、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄間質および腱を形成することが示されているが、心筋細胞へ分化することは示されていない。加えて、サテライト細胞と称される前駆細胞(CornelisonおよびWold、Dev. Biol.、191:270-283(1997))が、骨格筋において同定されている。これらの細胞は、その静止期および活動期の両方での細胞表面マーカーc-met(c-met⁺)の発現により特徴付けられる。活性化されたこれらの細胞が、細胞周期へ再び入る場合、筋原性調節因子を発現し、筋芽細胞へ分化する。

しかし、多様な幹細胞の存在にもかかわらず、現在インビトロにおいて、規定された条件下で、自発的に拍動する心筋細胞への分化が誘導され得る幹細胞の純粋な集団は存在しない。従って当技術分野において、心筋細胞へ分化するように誘導することができる幹細胞の単離された集団が、依然必要とされている。

概要
本明細書に説明された方法および細胞は、ある種が幹細胞のインビトロにおいて分化し2種以上の多い所定の型の完全な機能細胞を形成する能力を基にしている。

心筋細胞へ分化するために、インビボまたはインビトロのいずれかにおいて誘導され得るspoc細胞と称される幹細胞の新規の単離された集団が、本明細書において開示されている。Spoc細胞を分化する方法、および心筋細胞に影響を及ぼす物質をスクリーニングするためにこれらのspoc細胞を使用する方法が、本明細書で開示されている。治療的適用においてspoc細胞を使用する方法も本明細書において提供されている。

前述のおよびその他の目的、特徴および利点は、添付図面を参照し進めるいくつかの態様の下記の詳細な説明により、より明らかになると思われる。

いくつかの態様の詳細な説明
本明細書に開示された様々な態様の検証を容易にするために、下記の略語の一覧および用語の説明が提供される。

I. 略語および用語
A. 略語
CS：spoc細胞由来の心臓前駆体
DNA：デオキシリボ核酸
EGF：上皮増殖因子
EGFP：増強された緑色蛍光タンパク質
ES：胚性幹
FACS：蛍光標示式細胞分取装置
FBS：ウシ胎仔血清
FGF：線維芽細胞増殖因子
HSC：造血幹細胞
MI：心筋梗塞
MRNA：メッセンジャーリボ核酸
PBS：リン酸緩衝生理食塩水
RNasc：リボヌクレアーゼ
RT-PCR：逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
SP：サイド・ポピュレーション
SPOC：骨格筋が元になる心筋細胞前駆体

B. 用語
特に記さない限りは、技術用語は、通常の使用に従い使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin Lewin、「Genes VI」、Oxford University Press社刊、1997年(ISBN 0-19-857778-8)；Kendrewら(編集)、「The Encyclopedia of Molecular Biology」、Blackwell Science社刊、1994年(ISBN 0-632-02182-9)；および、Robert A. Meyers (編集)、「Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference」、VCH Publishers社刊、1995年(ISBN 1-56081-569-8)に見ることができる。

成体：
完全なサイズおよび強度を有する、完全に発達しかつ生理的に成熟した対象。

動物：
生存している多細胞脊椎生物、例えば哺乳類および鳥類を含む範疇。

心臓の(cardiac)：
心臓に関係する。

心機能障害：
心臓のポンプ機能の任意の障害。これは、例えば、収縮能の障害、弛緩能の障害(時には拡張期機能不全と称される)、心臓弁の異常な機能もしくは不適切な機能、心筋の疾患(時には心筋症と称される)、心筋への不適切な血液供給により特徴付けられるアンギナおよび心筋虚血および梗塞のような疾患、アミロイドーシスおよびヘモクロマトーシスのような浸潤性疾患、全体のまたは局所的肥大(心筋症の一部の種類または体静脈高血圧症において起こりうるものなど)、ならびに心房間の異常な連絡(例えば、心房中隔欠損)を含む。更なる考察については、Braunwald、「Heart Disease: a Textbook of Cardiovascular Medicine」、第5版、1997年、WB Saunders社、フィラデルフィア、PA(以後Braunwaldの著書と称す)を参照のこと。

心筋：
心臓は、平滑筋と骨格筋の両方に一部類似した特殊な筋肉組織でできている。これは不随性であり、ほとんどの心臓の筋細胞は、平滑筋のように単核である。心筋には、骨格筋のような横紋があり、これは鏡検により視認可能なサルコメアを含む平行に配列された筋フィラメントを有することを意味する。これらのフィラメントは、骨格筋において生じるのと同じ様式で、収縮過程において互いに沿って滑り込む。更に心筋は、心筋線維は分枝しおよび通常1個の中心に位置した核を有する点が、骨格筋とは異なる。心筋の別の相違点は、心筋細胞間の特定化された連結として使用される介在板の存在である。これらの密な連結は、イオンのほとんど完全に自由な移動を可能にし、その結果活動電位は、1個の細胞から別のものへと自在に伝わることができる。この配置は、心筋組織を機能性シンシチウムとしている。1個の細胞が興奮した場合、得られる活動電位はその全体に広がる。これは、心房または心室の筋肉が強力に血液をポンピングするための単位として収縮することを可能にする点で重要な特徴である。心筋は、洞房結節からそれ自身の興奮性インパルスを形成でき、これは生物学的ペースメーカーのように作用する。この方法で、心筋の収縮シグナルは、心臓それ自身を起源としている。しかし、自律神経系(例えば迷走神経を介した)は、いかに迅速にこれらのシグナルを形成しかつ心臓を通じて伝播するかを制御することに力を及ぼすことができ、このことは心筋収縮速度を調節している。「心筋細胞」とは、心臓筋肉の細胞である。

Spoc細胞由来の心臓前駆体(CS細胞)：
Spoc細胞が、骨格筋から単離され、それらの増殖を促進するように設計された増殖条件下で培養される場合、spoc細胞は、数回分裂する。この増殖期において、これらは、直径がspoc細胞と比べ増大した、浮遊している円形細胞クラスターとなる。これらの大きい直径を伴う円形細胞は、CS細胞と称される。ひとつの態様において、CS細胞の直径は約10〜約14μmである。CS細胞は、インビトロにおいて増殖促進条件に配置された場合(例えば下記に説明された実施例など)、自発的に拍動する心筋細胞へと分化する。

心筋症：
心臓が異常に肥大、肥厚および／または硬化している心筋層(心臓の筋肉)の何らかの疾患または機能不全。結果的に、心筋の血液をポンピングする能力は、通常減弱される。この疾患または障害は、例えば、炎症性、代謝性、毒性、浸潤性、線維症性、造血性、遺伝性、または原因不明である場合がある。心筋症には一般に虚血性(酸素の不足に起因する)および非虚血性のふたつの型が存在する。虚血性心筋症は、心臓表面上の冠動脈のアテローム性狭窄または閉塞が存在する疾患である、冠動脈疾患に続発する虚血により引き起こされる慢性障害である。冠動脈疾患は、心筋に十分な酸素が豊富な血液が供給されない心臓虚血の発症につながることが多い。最終的にはこの心筋は、虚血による筋細胞の死に起因した最早機能しない領域のために、減弱される。機能しなくなりつつある心臓からの拍出を増強するために、より多量の血液が心臓に充満するために必要とされる。このことは最終的には、拡張および心機能の増悪につながる。

非虚血性心筋症は一般に、主として臨床的および病理学的特徴を基に3群に分類される：
(1)拡張型心筋症、心臓の肥大および一方または両方の心室の損なわれた収縮機能を特徴とする症候群；
(2)肥大型心筋症、ここで、(a)心室壁または心室中隔のいずれかの厚さの全体的または部分的増加、もしくは、(b)例えば遺伝疾患、高血圧または心臓弁の機能不全において生じ得るような、心室壁または心室中隔のいずれかの厚さの全体的または部分的な増加に対する増大した罹病性と定義される；または
(3)拘束型および浸潤性の心筋症、通常、支配的臨床の特徴が損なわれた心臓の弛緩能である(拡張期機能不全)疾患群であり、および心筋のアミロイド線維、鉄、もしくは糖脂質のような外来物質による浸潤により特徴付けられることが多い。WynneおよびBraunwaldの「The Cardiomyopathies and Myocarditities」第41章、前掲を参照のこと。

CD34：
造血前駆細胞抗原1、およびMY10として既に知られている細胞表面抗原は、公知のヒト造血幹細胞のマーカーである。ヒトCD34遺伝子は、染色体lq32にマッピングされ、26kbにわたり、および8個のエキソンを有する。CD34は、67kDaの膜貫通型糖タンパク質である。CD34は、ヒト造血前駆細胞において選択的に発現され、このような細胞はCD34陽性(CD34⁺)である。CD34を発現しない細胞は、CD34陰性(CD34^-)である。CD34の生物学的機能は依然不明である。

細胞表面マーカー：
細胞の表面に発現されたタンパク質、糖タンパク質、または他の分子であり、これは細胞の同定に役立つ。細胞表面マーカーは一般に、常法により検出することができる。細胞表面マーカー検出法の具体的で限定されない例は、免疫組織化学、蛍光標示式細胞分取(FACS)、または酵素による分析である。

c-kit：
その細胞内ドメインに、固有のチロシン特異的プロテインキナーゼ活性を伴う膜貫通型受容体をコードしている癌原遺伝子。これは、HZ4-FSVのウイルス(Hardy-Zuckerman 4-ネコ肉腫ウイルス)kit癌遺伝子の細胞相同体である。このkit受容体は、CD117としても公知である。このkit受容体のためのリガンドは、幹細胞因子(SCF)である。

ヒトc-kitは、同じく血小板由来増殖因子(PDGF)受容体(PDGFRA)のひとつをコードしている同じ領域に、染色体4q11-q12上にマッピングされる。これらふたつの遺伝子は、およそ700kbのDNA断片上に位置している。ヒトkit遺伝子は、長さが70kbよりも大きく、21個のエキソンを含む。最長の転写産物は5230bpであり、かつ選択的にスプライシングされている。c-kit陰性(c-kit^-)細胞は、c-kitを発現していない細胞である。c-kitを発現している細胞は、c-kit陽性(c-kit⁺)である。

c-met：
リガンド肝細胞増殖因子(HGF)／分散因子に反応して、発生および創傷治癒時に様々な非筋肉組織において、有糸分裂、移動または形態発生のシグナルを伝達する、膜貫通型受容体チロシンキナーゼをコードしている癌原遺伝子。HGFは、肝再生の体液性メディエーターであると考えられるプラスミノーゲン様タンパク質である。筋肉発生において、HGF/c-metシグナル伝達は、胚形成時の軸系列(axial lineage)の筋前駆細胞の適切な遊出に必須である。c-met遺伝子産物は、190kDa前駆体として合成され、かつアミノ末端側50KDα鎖およびカルボキシ末端側140KDaβ鎖へとタンパク質分解性にプロセシングされる。

c-metは、静止期サテライト細胞において発現されるが、筋肉由来の線維芽細胞または健常な筋肉外植片の他の単核細胞においては発現されない(CornelisonおよびWold、Developmental Biology、191:270(1997))。Metは、正常な造血において役割を果たし、様々なリンパ系および白血球系細胞株において発現される。これは、神経膠腫の悪性進行にも寄与する。c-met陰性(c-met^-)細胞は、c-metを発現しない細胞である。c-metを発現する細胞は、c-met陽性(c-met⁺)である。

先天性心疾患：
出生児から存在するおよび多くの場合出生前に形成される心臓としての心臓関連の異常。先天性心疾患は、心臓、心臓弁、心臓への静脈流もしくは心臓からの動脈流、またはこれらの生体部品間の連結に影響を及ぼし得る。

分化：
それにより比較的特定化されない細胞(例えば、幹細胞)が、成熟細胞を特徴とする特定化された構造および／または機能の特徴を獲得する過程。同様に、「分化する」とは、この過程を意味する。典型的には、分化時に、細胞構造は変化し、および組織特異性タンパク質が出現する。「分化した筋肉細胞」という用語は、特異的筋肉細胞型を特徴とするタンパク質を発現している細胞を意味する。分化した筋肉細胞は、骨格筋細胞、平滑筋細胞、および心筋細胞を含む。

分化培地：
培養された細胞の増殖または生存を支援するために必要な栄養素を伴う培養条件の合成セットであり、これは幹細胞の分化細胞への分化を可能にする。

DNA：
デオキシリボ核酸。DNAは、ほとんどの生きている生物の遺伝物質を含む長鎖ポリマーである(一部のウイルスはリボ核酸(RNA)を含む遺伝子を有する)。DNAポリマーの反復単位は、4種の異なるヌクレオチドであり、各々、リン酸基が結合したデオキシリボース糖に結合した4種の塩基、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンのひとつを含む。トリプレットヌクレオチド(コドンと称す)は、ポリペプチド内の各アミノ酸をコードしている。コドンという用語は、そのDNA配列が転写されたmRNAの3個のヌクレオチドの対応する(および相補的)配列についても使用される。

上皮増殖因子(EGF)：
特定の例において、EGFは、53個のアミノ酸からなる6.4kDaの球状タンパク質である。これは、生物学的活性に必須である分子内ジスルフィド結合を3個有する。EGFタンパク質は、進化上密に保存されている。ヒトEGFとマウスEGFは、37個のアミノ酸が共通である。およそ70％の相同性が、ヒトEGFと他の種から単離されたEGFの間に認められる。哺乳類EGFは、マウス、鳥類、イヌ、ウシ、ブタ、ウマおよびヒトEGFを含むが、これらに限定されるものではない。これらのEGFポリペプチドのアミノ酸配列および作出法は、当技術分野において周知である。

EGF前駆体をコードしている遺伝子は、およそ110kbの長さを有し、24個のエキソンを含む。これらのエキソンのうちの15個は、他のタンパク質で認められるドメインと相同であるタンパク質ドメインをコードしている。ヒトEGF遺伝子は、染色体4q25-q27にマッピングされる。

EGFは、外胚葉、中胚葉、および内胚葉起源の多くの細胞にとって、強力な分裂促進因子である。EGFは、インビトロにおいて、線維芽細胞、腎上皮細胞、ヒト神経膠細胞、卵巣果粒膜細胞、および甲状腺細胞を含む、表皮細胞および上皮細胞の増殖を制御および刺激する。EGFは胚細胞増殖も刺激する。しかし、一部の細胞株の増殖は、EGFにより阻害されることが示されている。

EGFは、一部の細胞型にとって分化因子として作用することもわかっている。これは、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニンおよびグリコサミノグリカンを含む細胞外マトリックスのタンパク質の合成および代謝回転に強く影響を及ぼし、ならびに線維芽細胞および上皮細胞にとって強力な化学走化性因子であることが示されている。

EGFは、細胞集団の増殖がアッセイされるような細胞を用いたアッセイ法においてアッセイすることができる。EGFは、ELISA法のような、イムノアッセイ法においてもアッセイすることができる。

完全長配列よりも小さいEGF断片も、本明細書で開示された方法において使用することができる。適当な生物学的活性変種も使用することができる。使用されるEGF変種のひとつの具体的で限定されない例は、1個または複数のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有するEGF配列であり、ここでEGFの生物学的機能は維持されている。別のEGF変種の具体的で限定されない例は、EGFの生物学的機能が維持される限りは、グリコシル化またはリン酸化が変更されるEGF、または外来部分が追加されたEGFである。EGFの断片、類似体、および誘導体を作成する方法は、当技術分野において利用可能である。EGF変種の例は、当技術分野において公知であり、例えば米国特許第5,218,093号および国際公開公報第92/16626A1号である。多くの異なる種由来のEGFの例は、変種の例、およびそれらの作成戦略と同様、国際公開公報第92/16626A1号に開示されている。

本明細書において使用される「EGF」とは、天然のEGF、および本明細書において開示された培地においてEGFと同じ機能を発揮する変種および断片を意味する。

胚性幹(ES)細胞：
発達中の胚盤胞の内部細胞塊から単離された全能性細胞であり、体に存在する全ての細胞(例えば、骨細胞、筋細胞、脳細胞など)を作成することができる。「ES細胞」は、いずれかの生物体に由来、例えば、ヒトのような哺乳類に由来することができる。

線維芽細胞増殖因子(FGF)：
任意の動物に由来した任意の適当な線維芽細胞増殖因子、ならびにそれらの機能変種および断片。様々なFGFが公知であり、ならびにFGF-1(酸性線維芽細胞増殖因子)、FGF-2(塩基性線維芽細胞増殖因子、bFGF)、FGF-3(int-2)、FGF-4(hst/K-FGF)、FGF-5、FGF-6、FGF-7、FGF-8、およびFGF-9を含むが、これらに限定されるものではない。FGFは、FGF-1、FGF-2、FGF-4、FGF-6、FGF-8、もしくはFGF-9のような線維芽細胞増殖因子タンパク質、またはそれらの生物学的活性断片もしくは変異体を意味する。FGFは、いずれかの動物種に由来することができる。ひとつの態様において、FGFは、齧歯類、鳥類、イヌ、ウシ、ブタ、ウマおよびヒトを含むが、これらに限定されるものではない哺乳類のFGFである。FGFのアミノ酸配列および作成法は、当技術分野において公知である。

説明されたものよりもより小さいFGF断片も使用することができる。適当な生物学的活性変種は、FGF類似体または誘導体であることができる。FGFの類似体は、1個または複数のアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する未変性のFGF配列および構造を含むFGFまたはFGF断片のいずれかである。1種または複数のペプトイド配列(ペプチド模倣配列)を有する類似体も含まれる(例えば、国際公開公報第91/04282号参照)。「誘導体」とは、FGF活性が維持される限りは、FGF、FGF断片、またはグリコシル化、リン酸化のようなそれらの各類似体の適当な修飾、またはその他の外来部分の付加が意図される。FGF断片、類似体および誘導体を作成する方法は、当技術分野において利用可能である。

増殖因子：
細胞の増殖、生存および／または分化を促進する物質。概して、増殖因子は、細胞がそれらの受容体との結合時に、細胞の増殖または成熟を刺激する。ひとつの態様において、増殖因子は、筋肉細胞の増殖、分化、および成熟を制御するポリペプチドホルモンまたは生物学的因子の複合ファミリーである。別の態様において、増殖因子は、筋幹細胞の増殖を促進しおよびこの幹細胞を未分化の状態に維持するために使用することができる。増殖因子は、天然の因子または分子生物学的技術を用い合成された因子であることができる。増殖因子の例は、とりわけ、血小板由来増殖因子、線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、インスリン、ソマトメジン、幹細胞因子、血管内皮増殖因子、顆粒球コロニー刺激因子、およびトランスフォーミング増殖因子-βが挙げられる。筋肉細胞増殖因子は、筋肉細胞の発生(成熟)、分化、分裂または増殖に作用する増殖因子である。

増殖培地：
微生物または培養細胞の増殖または生存を維持するために必要な栄養素を伴う、培養条件の合成のセット。

心臓：
血液を循環する動物の筋肉臓器。心臓の壁は、ワーキング(working)筋肉、または心筋層、および結合組織で構成される。心筋層は、心筋細胞で構成され、これは本明細書において、心臓の細胞、心臓の筋細胞、心筋細胞および／または心臓の線維とも称される。心筋細胞は、心房の細胞または心室の細胞であることができる。

心不全：
対象の組織および細胞の代謝必要量に合致する十分に酸素添加された血液を供給することの心臓の不能。これは、循環血うっ血、例えば肺静脈または全身静脈におけるうっ血に随伴し得る。本明細書において使用される心不全という用語は、あらゆる原因に起因した心不全を包含し、本明細書においては「うっ血性心不全」、「前方心不全」、「後方心不全」、「高拍出量心不全」、「低拍出量心不全」などの用語を包含することが意図されている。詳細な考察については、Braunwaldの著書第13-17章を参照のこと。心不全につながり得る状態は、冠動脈疾患、心筋症、または先天性心疾患を含むが、これらに限定されるものではない。

異種：
異種配列は、第二配列に隣接して認められる正常でない配列(すなわち、野生型配列において)である。ひとつの態様において、この配列は、第二配列以外の、ウイルスまたは生物体のような異なる遺伝的供給源に由来する。

単離された：
「単離された」生物学的成分(核酸分子、タンパク質またはオルガネラなど)は、その成分が天然に生じる生物体の細胞内の他の生物学的成分から、すなわち他の染色体および染色体外のDNAおよびRNA、タンパク質ならびにオルガネラから、実質的に分離または精製される。「単離されている」核酸およびタンパク質は、標準の精製方法により精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語は、宿主細胞における組換え発現により調製された核酸およびタンパク質に加え、化学的に合成された核酸も包含している。

系統特異的マーカー：
細胞の特異的集団により発現されたマーカー。ひとつの態様において、これらの細胞は、spoc細胞のような、サテライト細胞以外の筋肉の細胞である。

哺乳類：
この用語は、ヒトおよびヒトでない哺乳類の両方を含む。同様に、「対象」という用語は、ヒトおよび脊椎動物の両方の対象を含む。

筋肉細胞：
骨格筋、心筋または平滑筋の組織細胞を含む。この用語は、筋細胞と同義であり、およびより特殊化された筋肉細胞を形成するために分化する細胞(例えば、筋芽細胞)を包含している。「心筋細胞」とは、心筋細胞を意味する。

心筋損傷：
疾患または外傷の結果としての、心壁の筋肉または「心筋層」に対する損傷。心筋損傷は、心筋症、心筋梗塞、または先天性心疾患などであるが、これらに限定されるものではない多くのことに帰因し得る。

ヌクレオチド：
「ヌクレオチド」には、糖部分に連結した塩基、例えばピリミジン、プリンもしくはそれらの合成類似体、またはペプチド核酸(PNA)中のような、アミノ酸に連結された塩基を含むモノマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヌクレオチドは、ポリヌクレオチド内の1個のモノマーである。ヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド中の塩基の配列を意味する。

機能的に連結された：
第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的関係で配置されている場合に、第一の核酸配列は、第二の核酸配列に機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に作用する場合に、プロモーターはコード配列へ機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたDNA配列は、相接しており、およびふたつのタンパク質コード領域が結合する必要がある場合は、同じリーディングフレーム内にある。

Pax：
「ペアードボックス転写因子」と称される、進化上で保存された転写因子のファミリーの構成員。このファミリー構成員は9員であり、その各々が、対のあるドメインとして公知である、128個のアミノ酸の保存されたDNA結合ドメインを含む。

核転写因子のPax遺伝子ファミリーは、胚発生時に、細胞の時間的および位置的に依存した分化を調節するように機能する。加えてこのファミリーは、成体生物の様々なシグナル伝達経路に関与している。例えばPax3転写因子は、神経管内の背側細胞の運命を決定すると考えられる。Pax7は、筋肉サテライト細胞系内で発現され、およびPax7^-/-マウス由来の骨格筋は、サテライト細胞が完全に除去されている。タンパク質のPaxファミリーの突然変異は、ヒトの疾患および癌に関連している。例えば、いくつかのPax遺伝子が、特異的腫瘍関連染色体転座の標的として同定されている。

Pax(3/7)^-である細胞は、Pax(3/7)抗体により検出されるような、Pax3またはPax7を発現しない。この抗体は、Pax-3およびPax-7の両方と反応性であるが、他のPax転写因子ファミリーの構成員とは交差反応しない。Pax(3/7)抗体により検出されるPax(3/7)⁺である細胞は、Pax3、もしくはPax7のいずれか、またはPax3およびPax7の両方を発現する。

薬学的に許容される担体：
「Remington's Pharmaceutical Sciences」(E. W. Martin、Mack Publishing社、イーストン、PA、第15版(1975年))は、本明細書において開示された幹細胞の薬学的送達に適した組成物および製剤について説明している。

一般に、担体の性質は、使用される投与の特定の様式によって決まると考えられる。例えば、非経口製剤は通常、ビヒクルとして水、生理食塩水、平衡塩溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの、薬学的および生理学的に許容される液体を含有する注射可能な液体を含んでいる。投与される薬学的組成物は、生物学的に中性の担体に加え、少量の無毒の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤など、例えば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含有することができる。

薬学的物質：
対象または細胞へ適切に投与される場合に、望ましい治療的または予防的作用を誘導することが可能な化学的化合物または組成物。「インキュベートする」は、物質が細胞と相互作用するのに十分な時間、標的をこの物質に曝露することを含む。「接触する」は、固形または液体型中の物質を細胞と共にインキュベートすることを含む。

ポリペプチド：
モノマーが、互いにアミド結合を介して結合しているアミノ酸残基であるポリマー。アミノ酸がα-アミノ酸である場合、L型光学的異性体またはD型光学的異性体のいずれかを使用することができ、L型異性体が好ましい。本明細書において使用される「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、アミノ酸配列を包含することが意図されており、および糖タンパク質のような修飾された配列を含む。「ポリペプチド」という用語は、天然のタンパク質に加え、組換えまたは合成により作出されたものを対象とすることが具体的には意図されている。

「ポリペプチド断片」という用語は、少なくとも1個の有用なエピトープを示すポリペプチドの一部を意味する。「ポリペプチドの機能断片」という用語は、そのポリペプチドの活性を保持している全てのポリペプチド断片を意味する。生物学的機能断片は、例えばサイズが、抗体分子の結合が可能なエピトープのように小さいポリペプチド断片から、細胞内の表現型の変化の特徴的誘導またはプログラムへの参加が可能な大きいポリペプチドまで変動することができる。「エピトープ」とは、抗原との接触に反応して作成された免疫グロブリンの結合が可能なポリペプチドの領域である。従ってインスリンの生物学的活性を含むより小さいペプチド、またはインスリンの保存的変種は、使用されるものとして含まれる。

「可溶性」という用語は、細胞膜に挿入されないポリペプチドの形態を意味する。

本明細書において使用される「実質的に精製されたポリペプチド」という用語は、天然に会合している他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を実質的に含まないポリペプチドを意味する。ひとつの態様において、ポリペプチドは、天然に会合している他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を、少なくとも50％、例えば少なくとも80％含まない。別の態様において、ポリペプチドは、天然に会合している他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を、少なくとも90％含まない。更に別の態様において、ポリペプチドは、天然に会合している他のタンパク質、脂質、炭水化物または他の物質を、少なくとも95％含まない。

保存的置換は、1個のアミノ酸を、大きさ、疎水性などが類似している別のアミノ酸と置換する。保存的置換の例を以下に示す。

保存的であるかどうかにかかわらず、アミノ酸変化を生じるcDNA配列の変動は、コードされたタンパク質の機能的同一性および免疫学的同一性を保存するために通常最小化される。タンパク質の免疫学的同一性は、抗体により認識されるかどうかを決定することにより評価され；そのような抗体で認識される変種は、免疫学的に保存されている。好ましくはあらゆるcDNA配列変種は、20個を超えずに導入され、好ましくは10個より少ないアミノ酸置換が、コードされたポリペプチドへ導入される。変種アミノ酸配列は、例えば、未変性のアミノ酸配列と80％、90％または95％もしくは98％さえも同じであることができる。同一性の割合を決定するためのプログラムおよびアルゴリズムは、NCBIウェブサイトに認めることができる。

前駆細胞：
少なくとも1種の所定の細胞型の完全に分化した機能細胞を作出することができる細胞。一般に前駆細胞は分裂することができる。分裂後、前駆細胞は、前駆細胞で有り続けるか、または終末分化へと進んでもよい。「筋前駆細胞」とは、完全に分化した機能性筋肉細胞、例えば心筋細胞または骨格筋細胞を作出することができる前駆細胞である。筋前駆細胞のある具体的で限定されない例は、「心筋細胞前駆細胞(cardiomyocyte precursor cell)」であり、これは心筋細胞を生じる細胞である。

始原細胞：
定義された細胞系統の後代を生じる細胞。「筋肉始原細胞」とは、筋肉系統の細胞を生じる細胞である。骨格筋始原細胞のひとつの具体的で限定されない例は、「サテライト細胞」であり、これは未熟なおよび成熟した骨格筋細胞を生じる。

組換え：
組換え核酸は、天然ではない配列を有するもの、もしくはふたつのそうでなければ分離された配列セグメントの人工的組合わせにより作成された配列を有するものである。この人工的組合わせは、核酸の単離されたセグメントの、化学合成により、またはより一般的には人工的操作により、例えば遺伝子工学技術により、達成されることが多い。同様に組換えタンパク質は、組換え核酸分子によりコードされたものである。

サイド・ポピュレーション(side population)(SP)細胞：
関心のある細胞と同じマーカーの補体を発現しない細胞の集合。ある具体的で限定されない例において、SPは、Sca-1を発現する細胞を含む。別の限定されない例において、SP細胞は、c-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1⁺である。

骨格筋：
骨格筋は、体の筋肉のほとんどを形成し、神経刺激がないと収縮しない。これは、随意制御下にあり、および線維間の解剖学的細胞連結を欠いている。これらの線維(細胞)は、多核であり、アクチンおよびミオシンのタンパク質フィラメントの配置のために、線条に見える。各線維は、単独の細胞で、長く、円筒状で、細胞膜で囲まれている。この筋肉線維は、筋フィラメントで形成された筋原線維を多く含む。これらの筋フィラメントは、収縮タンパク質で形成されている。筋肉収縮において重要なタンパク質は、ミオシン、アクチン、トロポミオシンおよびトロポニンである。

心筋細胞の骨格(筋)に基づく前駆体(Spoc)細胞：
骨格筋由来の幹細胞であり、これは細胞表面マーカーc-met、c-kit、またはCD34を発現せず、心筋細胞へ分化することができる。Spoc細胞は、Sca-1細胞表面マーカー(造血細胞において認められる)についての選別により、更に精製することができる。従ってspoc細胞は、Sca-1^-であり、このことはそれらをSP細胞から区別する。加えてspoc細胞は、Pax3およびPax7転写因子(Pax(3/7))を発現しない。従ってひとつの限定的でない例において、spoc細胞は、c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-である。別の限定的でない例において、spoc細胞は、インビトロにおいて培養した場合に、直径が約4μmである筋肉由来の前駆細胞である。これらの細胞は、浮遊液中に留まり、および増殖因子の存在下で培養した場合に増殖する。Spoc細胞の増殖に使用される増殖因子の具体的な限定しない例は、FGF、EGF、またはそれらの組合わせである。

ひとつの態様において、spoc細胞は、インビトロにおいて自発的に拍動する心筋細胞へ分化することができる。増殖期(例えば、インビトロにおいて増殖因子の存在下維持された約7日後)、spoc細胞はクラスター化し、およびサイズが、直径約10〜14μmに増大する。CS細胞と称されるこれらのクラスター中の細胞は、増殖因子の非存在下で培養した場合に、成熟心筋細胞へと分化する能力を有する。Spoc細胞を単離および分化する方法は、本明細書に開示されている。

自発的：
明らかな外部の影響を伴わず、内なる原因から生じ、内部または自然の過程の結果であること。「自発的に拍動する心筋細胞」とは、内部シグナルの結果として拍動を開始する細胞である。

幹細胞：
1種より多い所定の細胞型の完全に分化した機能細胞を作成することができる細胞。幹細胞のインビボにおける役割は、正常な動物の生涯にわたって破壊される細胞を交換することである。一般に幹細胞は、無制限に分裂する。分裂後、幹細胞は、幹細胞として維持されるか、前駆細胞となるか、もしくは終末分化へと進むことができる。幹細胞は、形態学的に特定されないことは明らかであるが、更なる分化の可能性が制限される場合に、分化したとみなすことができる。「筋幹細胞」とは、筋肉由来の幹細胞または分化後に筋肉細胞を生じる幹細胞である。筋幹細胞のひとつの具体的で限定的でない例は、心筋細胞を生じる細胞である。

幹細胞抗原-1(Sca-1)：
Ly-6A/Eとも称される、マウスの細胞表面抗原。Sca-1は、未熟な造血始原細胞および幹細胞上に発現される。Sca-1に対する抗体は、インビボにおいて骨髄を再集合(repopulate)する能力を有する初期の造血始原細胞の分画に使用される。Sca-1を発現していない細胞は、Sca-1陰性(Sca-1^-)であるが、Sca-1を発現している細胞は、Sca-1陽性(Sca-1⁺)である。具体的で限定されない例において、Sca-1(またはいずれか他の細胞マーカー)の発現は、蛍光標示式細胞分取(FACS)または免疫組織化学により測定することができる。

対象：
特定の処置のレシピエントとなるべき、哺乳類、例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、ブタ、ヒツジ、ウシ、齧歯類など。ひとつの態様において、対象は、ヒト対象またはマウス対象である。

浮遊液：
培地または等張(生理的に適合可能)緩衝液のような液体の本体全体への、細胞のような固形粒子の分散体。

治療的物質：
一般的な意味で使用される、治療薬、予防薬、および代償療法薬を含む。

治療的有効量：
症状および／もしくは障害または疾患のいずれか根本となる原因の予防、治療、軽減ならびに／または改善に十分な、物質の量。ひとつの態様において、「治療的有効量」は、心疾患の症状を軽減または排除するのに十分である。別の態様において、治療的有効量は、疾患それ自身を克服するのに十分な量である。

物質の治療的有効量は、単回用量、または治療期間中例えば毎日、反復用量で投与することができる。しかし物質の有効量は、治療される対象、状態の重症度および種類、ならびに化合物の投与法によって決まる。「投与」は、治療的有効量の対象への局所的または全身的導入により実現することができる。全身的導入は、静脈内、筋肉内、経皮的または皮下的手段を用い実現することができる。このような手段は、注射による、またはカテーテルによる治療的有効量の導入を含む。

「対象への治療的有効量の投与」という一般的用語は、ある型の心臓の機能不全を有するまたは発症し得る全ての動物(例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマおよびウシ)を含むと理解される。

細胞の治療的有効量：
実験に基づいた用量−反応曲線の作成、モデリングを使用する効力および有効性の予測、ならびに生物科学において使用される他の方法を含む、様々な方法により決定されうる、spoc細胞(例えば、c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)の量。一般にc-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞の治療的有効量は、心疾患の症状および／または根本的な原因の予防、治療、軽減、排除および／または改善に十分な量である。ひとつの態様において、治療的有効量は、心臓の障害を克服するのに十分な量である。

c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞の治療的有効量は、治療される対象(例えば、対象の種またはサイズ)、対象が罹患した心臓の機能不全の種類、ならびに細胞への投与部位(例えば、静脈内、局所的など)によって決まると考えられる。ひとつの態様において、細胞の治療的有効量は、心筋損傷に罹患した対象を治療するのに十分な細胞の量である。具体的で限定されない例において、c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞の治療的有効量は、約100個細胞よりも多い、約1000個細胞よりも多い、約10,000個細胞よりも多い、約100,000個細胞よりも多い、約250,000個細胞よりも多い、約1,000,000個細胞よりも多い、または約250,000個細胞〜約1,000,000個細胞である。

c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞の治療的有効量を決定するための具体的アッセイ法が、本明細書において提供されている。本発明において開示された方法は、医学および獣医学の状況において同等の適用を有する。従って「治療される対象」という一般的用語は、全ての動物(例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、マウスおよびウシ)を含み、および心筋損傷の治療は、心臓の機能を測定するアッセイ法を用いてモニタリングされることが理解される。他のアッセイ法は、移植後のc-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-心筋細胞前駆細胞の移植の成功を決定することができる。

トランスフェクションされた：
トランスフェクションされた細胞とは、分子生物学的技術により核酸分子が導入されている細胞である。本明細書において使用される「形質導入」という用語は、核酸分子がそのような細胞へ導入される全ての技術を包含し、ウイルスベクターによる形質導入、プラスミドベクターによる形質転換、および電気穿孔、リポフェクション、および微粒子銃加速によるDNAの導入を含むことができる。

移植：
ある体または体の一部から、別の体または体の一部への、組織もしくは臓器、またはそれらの一部の移入。

ベクター：
宿主細胞へ導入され、これにより形質転換された宿主細胞を作出する、核酸分子。組換えDNAベクターは、組換えDNAを有するベクターである。ベクターは、複製起点のような、それが宿主細胞において複製できるようにする核酸配列を含むことができる。ベクターは、当技術分野において公知である1個または複数の選択マーカー遺伝子および他の遺伝因子も含む。ウイルスベクターは、1種または複数のウイルス由来の少なくともいくつかの核酸配列を有する組換えDNAベクターである。

本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、特に定義しない限りは、当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に説明されたものに類似したまたは同等の方法および材料を使用することができるが、適当な方法および材料を以下に説明する。矛盾する場合は、用語の説明を含む本明細書が支配することとする。加えて材料、方法および実施例は、単に例証するものであり、限定を意図するものではない。

Spoc細胞
骨格筋由来の幹細胞(spoc細胞)が本明細書において開示されている。Spoc細胞は、細胞表面マーカーc-met、CD34、Sca-1、またはc-kitを発現しない。加えて、spoc細胞は、Pax3およびPax7転写因子も発現しない。従って一例において、spoc細胞は、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-である。Spoc細胞は、あらゆる年齢のヒトまたはヒト以外のいずれかの哺乳類から単離することができる。従ってspoc細胞は、哺乳類種の胎児(胎仔)、小児(小仔)、または成人(成獣)から得ることができる。ひとつの態様において、spoc細胞は、インビトロにおいて心筋細胞へと分化することができるヒトまたはマウスのc-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞である。ひとつの態様において、spoc細胞は、直径が約3μm〜10μmであるか、または直径が約4μmである。

Spoc細胞(例えば、c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)の培養条件は、確定されており、本明細書において開示されている。ひとつの態様において、spoc細胞は、少なくとも1個の増殖因子の存在下で培養した場合、培養皿に接着せず、浮遊液のままである。ひとつの具体的で限定されない例において、この増殖因子はEGFである。別の具体的で限定されない例において、この増殖因子はFGFである。

Spoc細胞の分化のための培養条件も、本明細書において開示されている(下記参照)。Spoc細胞の心筋細胞への分化は、形態学的変化を観察することにより評価することができる。一部の例において、分化したspoc細胞は、自発的に拍動する心筋細胞である。いくつかの態様において、組織化されたギャップジャンクションならびに明確なZ線ならびにA帯およびI帯を伴うサルコメアが、分化したspoc細胞において認められる。加えて、分化したspoc細胞の特定の例は、単核または多核であることがある。ひとつの具体的で限定されない例において、この細胞は二核である。

単離されたspoc細胞(例えば、c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)は、関心のある核酸分子を細胞へ導入するために、分子生物学において公知の標準手法を用い形質導入することができる。ひとつの態様において、この核酸分子は、ポリペプチドをコードしている。核酸分子によりコードされたポリペプチドは、細胞と同じ種(同種)に由来するか、または異なる種(異種)に由来することができる。例えば、そのような欠損が特定の障害の症状の原因であるような宿主の組織により、ペプチドの欠損生成を補充または交換する核酸分子を使用することができる。この場合、これらの細胞は、そのペプチドの供給源として作用する。ひとつの具体的で限定されない例において、このポリペプチドは、心臓に特異的な転写因子GATA-4である。

ひとつの態様において、関心のある核酸分子は、心臓の細胞の増殖調節または新生物性形質転換に関連したポリペプチドをコードしている。関心のある核酸配列の具体的で限定されない例は、SV40 Tag、p53、myc、src、およびbcl-2がある。別の態様において、関心のある核酸配列は、酵素をコードしている。酵素の具体的で限定されない例は、プロドラッグの薬物への転換に関連したタンパク質、または心臓の始原細胞の増大、分化、もしくは生存を促進する増殖因子、例えばEGF、FGF、または心房性ナトリウム利尿因子である。更に別の態様において、関心のある核酸配列は、転写調節因子をコードしている。

ひとつの態様において、関心のある核酸配列は、転写調節配列および／または翻訳調節配列のような調節配列へ、機能的に連結されている。調節配列は、プロモーター、開始コドン、停止コドン、mRNA安定性調節配列、およびポリアデニル化シグナルのような配列を含む。プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーターであることができる。プロモーターの具体的で限定されない例は、CMVプロモーター、心房性ナトリウム利尿因子プロモーター、および導入遺伝子の誘導性発現のためのTET応答配列を含むプロモーターがある。別の態様において、関心のある核酸配列は、発現ベクターのようなベクターへ挿入される。発現ベクターを調製する手法は、当業者に公知であり、およびSambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」第2版、Cold Spring Harbor Press社、コールドスプリングハーバー、NY (1989)に認めることができる。関心のある核酸の発現は、発現ベクターが適当な宿主細胞へ導入された場合に生じる。

更に別の具体的で限定されない例において、核酸配列は、拒絶反応を軽減するために導入することができる。例えば、細胞の免疫原性は、宿主(ノックアウト)により「異物」として認識されるタンパク質を産生する遺伝子を欠失することによるか、または宿主に対して自生(native)でありおよび宿主免疫系により「自己」タンパク質として認識されるタンパク質のようなタンパク質を産生する遺伝子を導入することにより、抑制することができる。

従ってひとつの態様において、spoc細胞(例えば、c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)は、関心のある遺伝子が機能的に欠失または「ノックアウト」されるように設計された核酸分子でトランスフェクションすることができる。この方法において、関心のある核酸分子は、相同組換えを受ける核酸分子であり、およびspoc細胞のゲノムに挿入される。ES細胞内に「ノックアウト」を形成する方法は、当業者に公知である(例えば、米国特許第5,939,598号；国際公開公報第00214495A2号)。

この例に従い、細胞は、本明細書に説明されたように、インビトロにおいて培養され、外来性核酸が、当業者に公知のいずれかの方法、例えば、トランスフェクションまたは電気穿孔により、これらの細胞へ導入される。その後トランスフェクションされた培養細胞は、インビトロにおいて研究されるか、または対象へ投与することができる(下記参照)。核酸配列の幹細胞への導入法は、当技術分野において公知である(例えば、米国特許第6,110,743号参照)。

筋幹細胞の単離および増大法
Spoc細胞(例えば、筋肉起源のc-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-心筋細胞前駆細胞)を単離する方法が、本明細書に説明されている。この方法において、spoc細胞は、筋肉細胞の懸濁液からサイズにより分離され、およびこれらの細胞は、固形基板上で培養される。培地中の浮遊液の状態である細胞は、単離される。

Spoc細胞(例えば、c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)の単離法は、対象の筋肉から細胞を得ることを含む。筋肉組織は、当業者に周知の方法を用い、個別のspoc細胞を単離するかまたは入手することを目的として調製することができる。組織調製法の一例は、コラゲナーゼのような酵素による酵素消化、手持ち式または電動のホモジナイザーのような器具を使用する機械的破壊、または例えばカルシウムおよびマグネシウムのキレート剤を使用する化学的破壊を含む。

筋肉細胞の調製は、細胞サイズを基に細胞を分離するいずれかの方法により選別することができる。ひとつの態様において、spoc細胞(例えば、c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)は、消化された骨格筋を、異なる孔径の一連のフィルターを通すことにより、単離される。筋肉細胞は、ふたつのフィルターを通され、ここで第一のフィルターは、孔径約50〜200μm、約60〜150μm、約80〜100μm、または約100μmを有し、および第二のフィルターは、孔径約10〜50μm、20〜40μm、または約40μmを有する。ひとつの態様において、単離された細胞は、直径が40μm未満である。別の態様において、単離された細胞は、直径が約3μm〜10μmである。別の態様において、単離された細胞は、直径が約4μmである。

筋肉細胞は、サイズ排除カラムを通過することで、サイズにより選別することもできる。このような態様のひとつにおいて、細胞は、最大細胞が最初に溶出され、および最小細胞は最後に溶出されるようなサイズ勾配に従い溶出される。細胞は、FACSを用いてサイズ別に選別することもできる。直径が約3μm〜10μmの細胞、または直径が約4μmの細胞が単離される。

一旦筋肉細胞がサイズ別に選別されたならば、これらの筋肉細胞は更に選択され、その後培地において増大される。ひとつの態様において、これらの細胞は、培地の存在下で、細胞亜集団の接着が可能であるような固形基板上で培養される。ひとつの態様において、固形基板は、組織培養皿のような容器である。別の態様において、固形基板は、組織培養用に設計されたビーズの形状である。この培地は、増殖培地であるか、または細胞の生存度を維持する任意の緩衝液であることができる。様々な培地が公知であり、かつ使用に適している。一般に増殖培地は、最小必須培地を含む。ひとつの態様において、培地は、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)および／もしくはF12、またはDMEMおよびF12の組合せ(比は約1:1〜約10:1の間)である。

この増殖培地は、血清を補充してもよい。血清の具体的で限定されない例は、ウマ、コウシまたはウシ胎仔の血清である。この培地は、約3容量％〜約10容量％の血清、または約5容量％の血清を有することができる。

ひとつの態様において、培地は、栄養素のような、1種または複数の追加添加物を含有する。これらの栄養素の具体的で限定されない例を、下記表に示す。

筋幹細胞増殖培地は更に、増殖因子を補充することもできる。ひとつの態様において、増殖培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含有する。ひとつの具体例において、増殖培地は、bFGFを約2ng/ml〜約100ng/ml、例えば約5ng/ml〜約50ng/ml、約8ng/ml〜約20ng/ml、または約5〜約10ng/mlのbFGFを含有する。更に別の例において、この培地は、約10ng/mlのbFGFを含有する。別の態様において、増殖培地は、上皮増殖因子(EGF)を含有する。ひとつの具体的例において、増殖培地は、約2ng/ml〜約100ng/mlのEGF、例えば約5ng/ml〜約50ng/ml、約8ng/ml〜約20ng/ml、または約5ng/ml〜約10ng/mlのEGFを含有する。更に別の例において、培地は、約10ng/mlのEGFを含有する。従って、ひとつの具体的で限定されない例において、増殖培地は、1:1のDMEM/F12であり、5％ウシ胎仔血清、10ng/mlのFGF、10ng/mlのEGF、5μg/mlインスリン、5μg/mlトランスフェリン、6ng/mlセレン、2μg/mlエタノールアミンを含有する。

ひとつの具体的で限定されない例において、この細胞は、増殖培地において約4日〜約8日間培養される。別の具体的で限定されない例において、これらの細胞は、この増殖培地において約6日〜約7日間培養される。

細胞が増殖因子の存在下で培養される期間に、これらの細胞はクラスター化しおよびサイズが増大する。これらのクラスター内で、細胞は直径約5〜20μm、または直径約10〜14μmである。

抗体、例えば、細胞表面マーカーを認識するモノクローナル抗体などのような特異的結合剤を用いspoc細胞が同定されるような、spoc細胞(例えば、c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)を単離する方法も提供される。この詳細なspoc細胞単離法は、前述のように、対象の筋肉由来の細胞を得ることを含む。ひとつの態様において、これらの細胞は、サイズにより選択され(前記参照)、次にspoc細胞が、c-met、c-kit、CD34、Sca-1細胞表面マーカーを認識する抗体のような、特異的結合剤を用いて同定される。

ひとつの態様において、c-met、Sca-1、CD34、およびc-kit抗体は固定化されている。詳細な態様は、磁気カラム細胞選別を使用する。この方法は、磁気ビーズの表面に共有結合されおよび選択される細胞に存在しない細胞表面マーカーへ方向づけられているようなモノクローナル抗体の組合せを含む。例えば、c-met、c-kit、CD34、またはSca-1を発現していない(c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-)spoc細胞を単離するために、磁気ビーズに結合したc-met、c-kit、CD34、およびSca-1に対するモノクローナル抗体が使用される。CD34、Sca-1、c-met、もしくはc-kitのいずれか、またはこれらの細胞表面マーカーの任意の組合せを発現している全ての細胞は、これらの抗体により結合され、ビーズにより保持されると考えられる。磁気ビーズに結合された細胞は磁石により固定されるので、浮遊液の状態のままであるc-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-細胞は、他の細胞から単離することができる。更なる態様において、c-kit^-c-met^-CD34^-であるために最初に単離された細胞は、更にSca-1^-および／またはSca-1⁺c-kit^-c-met^-CD34^-細胞へと選別することができる。

別の態様において、細胞の精製された集団は、FACSにより単離される。c-met、c-kit、CD34、およびPax(3/7)マーカーに対する蛍光標識抗体を使用し、c-met、c-kit、CD34、およびPax(3/7)マーカーの任意の組合せを発現している細胞から、c-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-細胞を識別することができる。更なる態様において、c-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-細胞は、更にSca-1^-またはSca-1⁺について選別することができる。従ってc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1^-またはc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1⁺のいずれかが単離される。

別の態様において、単独の抗体、または抗体の組合せを、セファロースビーズのような不活性ビーズへ共有結合することができる。これらのビーズは、カラムに充填するかまたはスラリーとして維持することができる。1種または複数の細胞表面マーカーを発現している細胞は、1種または複数の抗体により認識され、その結果ビーズに結合し始め、これにより細胞表面マーカーのこの組合せを発現しない未結合の細胞の亜集団を同定する。

別の態様において、これらの抗体は固定されない。詳細な態様において、細胞混合物へのこれらの抗体の添加は、抗体により認識される細胞表面マーカーを発現している細胞の凝集を引き起こす。細胞表面マーカーを発現していない細胞は、凝集物から排除され、および単離することができる。

これらおよび他の方法により単離されたspoc細胞は、培養物中に維持することができる。このspoc細胞は更に、心筋細胞へ分化することができる。

筋幹細胞の分化法
Spoc細胞(例えば、c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)を心筋細胞へ分化する方法が、本明細書において開示されている。詳細な例において、心筋細胞は、自発的に拍動する心筋細胞である。

ひとつの態様において、心筋細胞への分化は、増殖培地に類似しているが少なくとも1種の増殖因子を含有しない培地で、細胞を培養することにより誘導される。従って、分化培地の具体的で限定されない例は、少なくとも1種の増殖因子を欠いている増殖培地である。この培地から除去された増殖因子は、bFGFもしくはEGF、またはbFGFおよびEGFの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。

少なくとも1種の増殖因子の除去は、これらの細胞の組織培養皿への接着を引き起こし、分化した心筋細胞の特性を獲得する。分化は、spoc細胞(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-の筋肉由来の幹細胞)のような、比較的特殊化されない細胞が、心筋細胞のような、成熟細胞に特徴的な特殊化された構造的および／または機能的な特徴を獲得する過程を意味する。

Spoc細胞(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)の、自発的に拍動する心筋細胞のような心筋細胞への分化は、当業者に公知の任意の方法により測定することができる。具体的で限定されない例は、心臓のポリペプチド(例えば、トロポニン-T、L型カルシウムチャンネル、または心臓特異的転写因子であるGATA-4、またはNkx2.5)の発現を検出する免疫組織化学的分析、またはELISA法およびウェスタンブロット分析のようなアッセイ法である。細胞の分化は、ノーザンブロット、RNaseプロテクションおよびRT-PCRのような技術を用いる、心臓のポリペプチドをコードしているmRNAレベルのアッセイ法によっても測定することができる。別の態様において、自発的に拍動する細胞の数が評価される。

カルシウム過渡応答、または細胞内カルシウム濃度の流入は、心筋細胞分化の測定値として使用することができる。ひとつの態様において、カルシウム造影は、カルシウム過渡応答を測定するために使用される。例えば、fura-2、fluo-3、またはfluo-4のような、レシオメトリック色素を用い、細胞内カルシウム濃度を測定する。レシオメトリック色素で処理された細胞集団内の相対的カルシウムレベルは、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用い、可視化することができる。別の態様において、細胞膜を横断する膜電位をモニタリングし、カルシウム過渡応答を評価する。例えば、パッチクランプが使用される。この方法において、細胞内微小電極が、心筋細胞へ挿入される。

ひとつの態様において、カルシウム過渡応答は、認知可能な心筋細胞の収縮の前に認めることができる。別の態様において、カルシウム過渡応答は、認知可能な心筋細胞収縮の期間またはその後のいずれかに認められる。別の態様において、これらの細胞は、細胞が拍動しない条件の存在下、例えばカルシウムキレート剤(例えば、EDTAまたはEGTA)の存在下などで培養され、およびそれらのカルシウム過渡応答が測定される。

心臓の疾患または障害の治療法
別の態様において、開示された方法に従い単離および培養された細胞を投与することにより、心筋損傷のような疾患または障害に罹患した対象を治療する、もしくはそのような障害の症状を緩和する方法が提供される。

ひとつの態様において、spoc細胞(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)が、本明細書に説明されたように単離され、およびspoc細胞の治療的有効量が対象へ投与される。別の態様において、c-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1^-心筋細胞前駆細胞の治療的有効量およびc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1⁺細胞の治療的有効量の混合物が、対象へ投与される。更なる態様において、spoc細胞は、先に開示されたように単離され、および心筋細胞へ分化し、ならびに分化した細胞の治療的有効量が、ヒトのような対象へ投与される。これらの細胞は、用量例が例えば0.25〜1.0x10⁶個細胞のような、いずれかの様式で投与することができる。当然様々な用量を、臨床的状況に応じて使用することができる。これらの細胞は、全身的(例えば静脈内)または局所的(例えば心エコー図の指示の下で心筋欠損部へ直接、または手術時の眼下での直接適用により)に投与することができる。別の例において、これらの細胞は、その中で投与された細胞が増殖することができる基板を形成するために重合するようなゲルマトリックス(Upjohn社から入手できるGelfoamなど)に投与することができる。

ひとつの態様において、対象は心筋損傷を有する。心筋損傷は、心筋層へ貫通したナイフまたは銃弾のような物体または発射体の結果、もしくは例えば腫瘍摘出手術の結果として生じ、外傷に起因することがある。心筋損傷は、心筋症、心筋梗塞、または先天性心疾患のような疾患から生じることもある。ある具体的な限定されない例において、治療的有効量のspoc細胞(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)が、心筋損傷を伴う対象へ投与される。別の具体的で限定されない例において、c-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1^-細胞の治療的有効量およびc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1⁺細胞の治療的有効量の混合物が、心筋損傷を伴う対象へ投与される。

別の態様において、対象は、例えば、心臓弁の異常なもしくは不適切な機能、または心臓の房室間の異常な連絡を含む、心臓の機能不全に罹患している。ある具体的で限定されない例において、治療的有効量のspoc細胞(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)は、心臓の機能不全を伴う対象へ投与される。別の具体的で限定されない例において、c-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1^-心筋細胞前駆細胞の治療的有効量およびc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1⁺細胞の治療的有効量の混合物が、心臓の機能不全の対象へ投与される。

ひとつの態様において、 spoc細胞(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)または分化した心筋細胞は、注射により全身へ投与される。別の態様において、c-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1^-心筋細胞前駆細胞の治療的有効量およびc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1⁺細胞の治療的有効量の混合物は、注射により全身へ投与される。注射による投与の具体的で限定されない例は、皮下注射、筋肉内注射または静脈内注射による投与を含む。投与が静脈内である場合、spoc細胞浮遊液の注射可能な液体が調製され、連続点滴または大量瞬時投与として投与することができる。

ひとつの態様において、spoc細胞(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)または分化した心筋細胞は、局所的に投与される。別の態様において、c-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1^-心筋細胞前駆細胞の治療的有効量およびc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1⁺細胞の治療的有効量の混合物が、局所的に投与される。局所投与のひとつの具体的で限定されない例は、心筋内注射である。心臓内注射のために、spoc細胞は、浮遊液調製物の注射可能な液体で、または液体型で注射可能でありおよび損傷した心筋層部位において半固形となる、生体適合性媒体内にある。常用の心臓内注射器または制御可能な内視鏡式送達装置を、針の内腔(lumen)または内径が、剪断力がspoc細胞へ損傷を及ぼさないのに十分な直径(例えば、30ゲージまたはそれよりも大きい)である限りは、使用することができる。

別の態様において、spoc細胞(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)、分化した心筋細胞、またはc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1^-心筋細胞前駆細胞の治療的有効量およびc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1⁺細胞の治療的有効量の混合物は、支持媒体へ局所的に投与される。支持媒体のひとつの具体的で限定されない例は、その上で細胞が培養される滅菌メッシュ、またはマトリックスである。そのようなマトリックス上で培養された心筋細胞の層、例えば心筋細胞の集密層は、心筋損傷部位もしくはその近傍に、局所的に適用または移植することができる。ひとつの態様において、支持媒体は、生分解性メッシュである。別の態様において、支持媒体は、生分解性ではない。メッシュのサイズ、およびその上の細胞密度は、治療される心筋損傷に応じて変動することができる。

別の態様において、これらの細胞は、当技術分野において公知の生体適合性マトリックスとの同時インキュベーションなどにより、投与前に被包することができる。様々な被包技術が開発されている(例えば、Lacyら、Science、254:1782-84(1991)；Sullivanら、Science、252:7180712(1991)；国際公開公報第91/10470号；国際公開公報第91/10425号；米国特許第5,837,234号；米国特許第5,011,472号；米国特許第4,892,538号)。心臓への直接の物理的アクセスが関わっている開心術の際には、説明されたspoc細胞送達調製物の全ての型が、利用可能な選択肢である。

ひとつの態様において、形質転換されたspoc細胞株(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)は、拍動しおよび継続して分裂する。具体的で限定されない例において、形質転換されたspoc細胞、形質転換され分化した心筋細胞の細胞、または形質転換されたc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1^-心筋細胞前駆細胞および形質転換されたc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1⁺細胞の混合物が、罹患しおよび不全となった心臓を修復するために「ポンピングパッチ(pumping patch)」を作成するのに十分な細胞を得るために使用される。ひとつの態様において、対象からエキソビボで得た形質転換されたspoc細胞が、循環を介して対象へ導入される。別の態様において、対象からエキソビボで得た形質転換されたspoc細胞は、対象へ、ガイド付きカテーテルを用い直接心臓へ導入される。いくつかの態様において、対象からエキソビボで得た形質転換されたspoc細胞は、内皮細胞前駆体、筋線維芽細胞、または他の対象由来の支持細胞と共に使用され、補助装置として心臓内に配置される血管形成した拍動細胞のパッチを作成する。このパッチは、固有の心臓のペーシング電流を捕獲することによるか、または心臓全体を心拍調整するペースメーカー移植片の使用のいずれかにより、残りの心臓に同調させる。

本開示の細胞は、望ましい治療作用に達するまで、間隔を空けて反復投与することができる。

心筋細胞の分化または機能に影響を及ぼす物質のスクリーニングのために作成されたspoc細胞の使用
別の態様において、心筋細胞の分化または機能に影響を及ぼす物質をスクリーニングする方法が提供される。この方法に従い、spoc細胞(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)または分化した心筋細胞の集団が、前述のように作成される。この細胞集団は、関心のある物質と接触され、次にこの物質の細胞集団に対する作用がアッセイされる。これらの細胞の分化、生存、増殖、または機能に対する作用が評価される。

本明細書に説明された方法を使用し、心筋細胞分化に対する物質の作用を評価することができる。被験物質の心筋細胞の分化または機能に対する作用を評価するために、物質は、spoc細胞(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)またはCS細胞のいずれかと接触される。いくつかの態様において、spoc細胞は、物質の添加前に、約1日〜約8日間、約4日〜約7日間、または約7日間、増殖因子を含む培地において維持される。

別の態様において、増殖因子は、その物質が添加される際またはそれ以前に、CS細胞を作成する培地から除去される。いくつかの具体的で限定されない例において、CS細胞は、物質添加前に、その培地において、約1日〜約56日間、約7日〜約28日間、または約14日〜約21日間、維持される。

物質と接触されたspoc細胞(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)の分化は、当業者に公知の手段により評価することができる。ひとつの態様において、形態が試験され、例えば電子顕微鏡を用い、細胞の超微細構造が評価される。評価の適当なパラメータは、接触している心筋細胞間のギャップジャンクションの評価を含むが、これに限定されるものではない。別の態様において、免疫組織化学技術または免疫蛍光技術を用い、分化を評価する。更に別の態様において、分化は、心筋細胞において発現される特異的mRNA分子の発現の分析により評価される。適当なアッセイシステムは、RT-PCR、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザン分析、またはRNaseプロテクションアッセイ法を含むが、これらに限定されるものではない。更なる態様において、分化した心筋細胞において発現されたポリペプチドレベルがアッセイされる。使用されるポリペプチドアッセイ法の具体的で限定されない例は、ウェスタンブロット分析、ELISA法、または免疫蛍光がある。または前述のように、カルシウム過渡応答が測定される。

このアッセイ法を使用し、物質の心筋細胞機能に対する作用をスクリーニングすることもできる。当業者に公知の任意の方法を使用し、心臓の機能を評価することができる。ひとつの態様において、心筋細胞の拍動数を評価し、拍動を増加または減少する物質が同定される。拍動数を評価するひとつの方法は、顕微鏡下での拍動の観察である。この方式でスクリーニングすることができる物質は、交感神経様作用薬のような、強心薬(inotropic drug)を含む。

ひとつの態様において、物質に接触された細胞は、対照と比較される。適当な対照は、物質と接触されないもしくはビヒクル単独と接触されたspoc細胞またはCS細胞を含む。標準値も、対照として使用することができる。

ひとつの態様において、形質転換された心臓の細胞株を使用し、ハイスループットアッセイ法において、コンビナトリアルケミカルライブラリーに由来した治療的物質をスクリーニングすることができる。いくつかの態様において、形質転換された心臓の細胞株は、心臓の機能および発生に重要な遺伝子を研究するために作出されたトランスジェニック、ノックアウト、またはノックインマウスの骨格筋の細胞株から作成される。

別の態様において、分化の異なる段階のspoc細胞または形質転換されたspoc細胞のトランスクリプトームが、RNAアレイ技術(cDNAアレイ、遺伝子チップオリゴヌクレオチドアレイ、SAGE分析、または差し引きライブラリー)により決定される。これらの異なる細胞集団のトランスクリプトームのサブセットからなるフィンガープリントを使用し、ヒト対象由来の類似体前駆体および幹細胞の候補をスクリーニング(PCR分析またはアレイ分析により)する。その後選択された細胞は、初代細胞培養物中で、形質転換または増大される。

キット
本明細書に説明された細胞は、キットの調製に適した理想的なものである。このキットは、箱、バッグ、またはプラスチック製カートンのような、運搬容器手段を備えることができる。ひとつの態様において、この運搬容器は、spoc細胞(例えば、c-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-細胞)の試料および／またはc-met^-c-kit^-CD34^-Sca-1⁺Pax(3/7)^-細胞の試料を含むバイアル、チューブなどの1個または複数の容器を備える。別の態様において、この運搬容器は、分化に影響を及ぼす物質、緩衝液、または細胞導入のためのビヒクルを伴う容器を備えている。キットの構成部材の使用を詳述するために、書面による使用説明書、ビデオテープによる説明、またはコンピュータ上で開くことができるフォーマット(例えば、フロッピーディスクまたはCD-ROMディスク)の使用説明書などが提供される。これらの使用説明書は、例えば、心筋欠損を治療するために細胞をいかにして投与するか、または関心のある被験物質(強心薬など)をスクリーニングするために細胞をいかにして使用するかを説明している。

更に詳細に説明しなくとも、当業者は本説明を用い、本発明を完全な程度で使用することができると考えられる。下記実施例は、単なる例証であり、いかなる意味においても本開示の残りの部分を制限するものではない。

実施例
実施例1
成体マウス骨格筋由来の心筋細胞前駆細胞を単離および増大する方法
6〜10週齢の雄C57B1/SJ6マウスの後肢からの骨格筋組織を、小片に切断し、コラゲナーゼで37℃で2時間消化した。消化した組織を、100μmフィルターを通し、次に40μmフィルター(Falcon社)を通すことにより、細胞片および他の未消化の組織断片を排除した。この細胞浮遊液を、低速(1,400rpm)で遠心分離し、可能な限り多くの小さい筋肉繊維断片を排除した。この段階の細胞は、ほとんど直径がおよそ4μmの小さい円形細胞のクラスターからなり、spoc(心筋細胞の骨格筋に基づく前駆体(skeletal-based precursors of cardiomyocytes))細胞と称した。これらの細胞を、Miltenyi磁気カラム上でSca-1抗体を用い、更に分画した。Spoc細胞は、Sca-1^-画分において溶出され、かつほとんど非接着性円形細胞からなるのに対し、Sca-1⁺画分は、主に接着細胞からなった。

これらのspoc細胞を、通常の組織培養皿中の完全増殖培地(1:1 DMEM/F12に5％ウシ胎仔血清(FBS)、10ng/mlヒトEGF、10ng/mlヒトbFGF(PeproTech社)、5μg/mlインスリン、5μg/mlトランスフェリン、6ng/mlセレン、2μg/mlエタノールアミン(ITS-X、Invitrogen社)、25μg/mlゲンタマイシンおよび2.5μg/mlフンジゾン(Life Technologies社)を補充したもの)に、およそ10⁵個細胞/cm²の密度で播種した。数日後、この培養物は、円形細胞の浮遊している集団および若干の接着性線維芽細胞からなっていた。円形細胞は、数回の細胞分裂を受け、膨大し、その間にこれらは増大した直径10〜14μmを持つ浮遊している円形細胞のクラスターとなっていた。これらのクラスター内の細胞は、GATA-4陽性であり、およびCS(spoc由来の心臓前駆体(caridiac precursors from spoc)細胞と称した。

実施例2
spoc細胞の心筋細胞への分化法
CS細胞は、完全増殖培地中で7日間増殖した後、穏やかに収集した。その後これらの細胞を、EGFおよびbFGFの存在しない同じ培地(分化培地)に播種し、37℃で維持した。これらの細胞の分化の進行を評価するために、これらの培養物を、様々な時点で、倒立顕微鏡を用い観察した。これらの心筋細胞の拍動頻度の測定値を、ビデオ式顕微鏡により得た。

分化培養条件下で、これらの細胞は、次第に培養皿に接着し始め、および形が伸長し、筋芽細胞の外観を呈した。数日間分化培地に維持している間に、細胞は自発的に拍動し始めた。伸長された単核細胞(長さ60μm)および円形の単核細胞(直径15μm)の両方共、自発的拍動を示した。再播種後4日目までに、拍動細胞はより多くなった。拍動細胞は、それ以上は細胞分裂せず、この培地に数週間維持され、自発的に拍動する表現型を維持した。自発的拍動は継続し、頻度1〜8Hzを測定した。14日目の細胞(長さ30μm)において観察された小さい収縮は、未熟な収縮器官(contractile apparatus)の結果である可能性が高い(図1C)。室温に保持した細胞は、少なくとも3時間連続して拍動した。細胞は、3ヶ月間培養した後であっても、拍動し続けた。骨格筋由来のspoc細胞の単離および分化は、極めて再現可能であり、70回よりも多く成功している。

実施例3
Spoc細胞の免疫蛍光
骨格筋由来の培養された細胞を、4％パラホルムアルデヒド中で4℃で10分間固定し、次にPBS中で合計15分間洗浄した(3回)。細胞は、0.2％トライトン（Triton）X-100で10分間透過処理した。PBS中3％BSA、PBS中5％ヤギ血清、またはPBS中10％ヤギ血清のいずれかにより、室温で30分間ブロッキングした。一次抗体とのインキュベーションは、4℃で一晩行った。使用した一次抗体は、myoD(Novocastra社)、Sca-1(Cedarlane社)、CD34およびCD45(PharMingen社)に対するものであった。GATA-4、Myf-5、ミオゲニン、Pax 3/7、c-met、およびcKit抗体は、Santa Cruz社のものである。RLCP抗体は、ResGen社により作成された。その後細胞を、1xPBS中で、合計15分間洗浄した(5回)。二次抗体とのインキュベーションを、室温で1時間行った。その後、細胞をPBSで3回洗浄した。DAPI(Vector社)を含む蛍光封入剤(fluorescent mounting medium)およびカバーガラスを、試料の上に置いた。細胞画像を、アルゴンおよびアルゴン-クリプトンレーザー源を装着した共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡(Leica社TCS-4D DMIRBE)により得た。励起波長365nm(DAPI)、488nm(FITC)、および568nm(ローダミン)を用い、各々、青色、緑色、および赤色の蛍光を得た。

骨格筋から単離された細胞の非接着性亜集団は、拍動する心筋細胞へ発生するそれらの能力により、「spoc」細胞(心筋細胞の骨格(筋)に基づく前駆体)と命名された。Spoc細胞は、CD34^-、CD45^-、およびc-kit^-であり、骨格筋に由来するものとして先に説明された他の非接着細胞(Deasyら、Blood Cells Mol Dis.、27:924(2001))から分化している。Spoc細胞は、下記の判定基準によりサテライト細胞とは識別される：
(1)spoc細胞は、Pax-7(Sealeら、Cell、102:777(2000))または表面マーカーc-met(CornelisonおよびWold、Dev Biol、191:270(1997))を発現しないこと；
(2)ほぼ同数のspoc細胞が、若齢マウス(4週齢未満)および高齢マウス(12-16週齢)の両方から単離されているが、サテライト細胞は、若齢マウス(4週齢未満)の損傷していない筋肉からのみ効率的に単離されていること；
(3)spoc細胞は、円形の、直径約4μmの浮遊細胞であるのに対し、サテライト細胞は事実上接着性であること；ならびに、
(4)spoc細胞は、静止期サテライト細胞のクラス由来のものを除いて、CD34^-およびMyf5^-であること(Beauchampら、J. Cell Biol.、151:1221(2000))。

3種の骨格筋超調節遺伝子Myf5、MyoDおよびミオゲニンは、時にはサテライト細胞中に存在することが分かっている(CornelisonおよびWold、Dev Biol、191:270(1997))。これらの細胞は、3種のマーカー全てが長期の培養を通じて0日目から陰性であるので、サテライト細胞でも、更には発達した骨格筋細胞でもない。更にはspoc細胞は、サテライト細胞の増殖および筋管への分化を支持する条件下で培養された場合は、生存しない。

実施例4
免疫蛍光による心臓特異的ポリペプチドの検出(1)
標本(骨格筋由来の培養細胞)を、30分間風乾し、その後4％パラホルムアルデヒド中において4℃で固定し、引き続きリン酸緩衝生理食塩水(PBS)により5分間すすいだ。これらは、ヤギ血清で30分間ブロッキングし、その後GATA-4(mAb H-112、Santa Cruz Biotechnology社)、サルコメアミオシン(MF-20 Ab、ATTC)、心臓特異的トロポニン-T(mAb RDI-TRK4T19-1A11、Molecular Probes社)、心臓L型カルシウムチャンネル(mAB AB5412-2000U1a、Chemicon社)、心臓特異的転写因子Nkx2.5(mAb N19、Santa Cruz Biotechnology社)、またはコネキシン43(mAb 71-07000、Zymed Laboratories社)(1:200)のいずれかと共に、4℃で一晩インキュベーションした。一晩インキュベーションした後、これらの標本をPBSで3回すすぎ(各5分間)、再度ヤギ血清で30分間ブロッキングした。これらの標本を次に、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、テキサスレッド、またはテトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)のいずれかで標識した二次抗体と室温で1時間インキュベーションした。これらは再度PBSで3回すすぎ(各5分間)、その後共焦点レーザー顕微鏡(Leica社)により可視化し、蛍光シグナルを検出した。

GATA-4発現の最も早い時期は、増殖因子含有培地において培養の3日後であった。これらの細胞を因子含有培地(分化培地)中に再播種後3日以内に、一部の細胞は、サルコメアミオシンを発現し始めた。モノクローナル抗体で染色した7日目のCS細胞のサイトスピンは、心臓特異的転写因子GATA-4、サルコメアミオシン、および心臓特異的トロポニン-Tの発現を明らかにした。14日目に、細胞は、GATA-4およびサルコメアミオシンで染色した。GATA-4およびサルコメアミオシンで染色した細胞画像を重ねると、これらは細胞内で共局在化していることが明らかになった。この発生の早い時点で、一部の細胞は、GATA-4またはサルコメアミオシンのいずれかに対して陽性であることができる。28日目までに、大半の細胞は、両タンパク質を発現する。21日目までに、これらの細胞は、心臓のL型カルシウムチャンネル、心臓特異的転写因子Nkx2.5、およびコネキシン43について陽性であった。

実施例5
免疫蛍光による心臓特異的ポリペプチドの検出(2)
骨格筋由来の培養細胞は、4％パラホルムアルデヒド中において4℃で10分間固定し、その後PBSにより合計15分間洗浄した(3回)。細胞は、0.2％トライトン X-100で10分間透過処理した。PBS中3％BSA、PBS中5％ヤギ血清、またはPBS中10％ヤギ血清のいずれかにより、室温で30分間ブロッキングした。一次抗体とのインキュベーションは、4℃で一晩行った。使用した一次抗体は、myoD(Novocastra社)、MF-20(ATTC)、GFP(Clontech社)、心臓L型チャンネル(US Biologicals社)、Sca-1(Cedarlane社)、CD34およびCD45(PharMingen社)、および心臓トロポニン-T(Research Diagnostics社)に対するものであった。GATA-4、Myf-5、ミオゲニン、コネキシン43、Nkx-2.5、Pax 3/7、c-metおよびcKit抗体は、Santa Cruz社のものである。RLCP抗体は、ResGen社により作成された。その後細胞を、1xPBS中で、合計15分間洗浄した(5回)。二次抗体とのインキュベーションを、室温で1時間行った。その後、細胞をPBSで3回洗浄した。DAPI(Vector社)を含む蛍光封入剤およびカバーガラスを、試料の上に置いた。細胞画像を、アルゴンおよびアルゴン-クリプトンレーザー源を装着した共焦点レーザー走査型蛍光顕微鏡(Leica社TCS-4D DMIRBE)により得た。励起波長365nm(DAPI)、488nm(FITC)、および568nm(ローダミン)を用い、各々、青色、緑色、および赤色の蛍光を得た。

最初の7日間に因子含有培地中で、spoc細胞は数回分裂し、GATA-4(心臓特異的転写因子)を発現し始め、ならびに増大した直径10〜14μmを持つ、浮遊している円形「CS」細胞(spoc細胞由来の心臓前駆体)のクラスターとなり始めた。これらの細胞は、心臓トロポニン-T、Nkx-2.5、および心臓特異的L型カルシウムチャンネルを含む他の心臓特異的マーカーを発現し続ける。それらが接着性となる以前であっても、一部の細胞は拍動し始め、および再播種後14日目までに、集密な皿の細胞の10％が、自発的に拍動した。Spoc細胞は、骨格筋において隔絶された骨髄細胞であるようには見えず、これらはcKit^-であるので、梗塞を起こした心臓を再構成する実験において直接または間接に使用されるcKit⁺骨髄細胞およびSP細胞から識別される(Jacksonら、J Clin Invest、107:1395(2001)；Orlicら、Nature、410:701(2001))。骨髄または解離された全心臓をGFP標識されたspoc細胞と共に直接または透過膜で分離されたコンパートメント内で共培養する場合は、標識されたspoc細胞のみが、拍動する心筋細胞へと発達する。従って、骨髄および心臓は、この方法で単離され得、およびこれは表現上spoc細胞に類似しているような細胞集団を含まない。

実施例6
分化した心筋細胞の超微細構造
日常的な透過型電子顕微鏡のために、骨格筋由来の培養した細胞を、1％CaCl₂を含有する0.1Mカコジル酸緩衝液中の1.25％グルタルアルデヒドが入ったペトリ皿に、4℃で2時間インサイチュー固定した。固定後、細胞を、サバティーニ（Sabatini）液(6.8％ショ糖を含有する0.1Mカコジル酸緩衝液)で3回洗浄し、カコジル酸緩衝液中の1％四酸化オスミウムで後固定(post-fix)した。サバティーニ液で3回洗浄した後、試料をアルコールで脱水し、Scipoxy 812(Energy Beam Sciences社、アガワーム、MA)中に包埋した。重合を、37℃で24時間行い、その後60℃で一晩行った。超薄切片を、Leica Ultracut UCTウルトラミクロトームを用いて切断し、酢酸ウラニルおよびReynoldクエン酸鉛で染色し、およびJEOL 1200 CXII透過型電子顕微鏡で調べた。

図1において、透過型電子顕微鏡像は、CS細胞の発達(progression)を示している。再播種後3日目に、律動性の拍動を示している細胞数が増大した際、不規則なミオシンフィラメント(図1A)および豊富なミトコンドリアにより囲まれた大きい中心核(図1D、枠内および詳細)を伴う円形細胞が存在する。7日目までに、伸長した細胞(図1E)は、濃染顆粒（dense body）(図1E矢先および図1B、下側枠)を含む。特徴的な1.6μm-長のミオシンフィラメント(図1B、上側枠)は、外向きに放射状に広がっている。単独の中心核を伴う14日目の細胞(図1CおよびF)は、濃染顆粒の外側への伸長を示し、これは経過間で(coursing between)フィラメントと並置し始めた(図1C)。これらの構造は、胚様体由来の発生している心筋細胞(Westfallら、Cell Motil Cytoskeleton、36:43(1997))において認められるものとほぼ同じである。56日目までに、高電子密度構造が、A帯およびI帯ならびにZ線を伴う同定可能な十分規定され組織化されたサルコメアへと発達した(図1G)。拍動細胞は、ミトコンドリアに囲まれた1個または2個の中心に位置した核も有し、これらは多くの筋線維膜下(subsarcolemmal)核を有する骨格の筋管と識別された。

実施例7
心筋細胞分化の測定値としてのカルシウム過渡応答
Spoc細胞由来の心筋細胞を、DMEM/F-12中で、約5〜10μmの濃度のfluo-3またはfluo-4色素と共に、37℃で30分間インキュベーションした(プルロニック溶液とDMSO1:1に溶解した色素)。その後これらの細胞を、直前に調製したDMEM/F-12で洗浄した。画像を、Zeiss LSM-510レーザー走査型共焦点システムおよびC-Apochromat 63x対物レンズ(1.2 N.A.)により収集した。fluo-3およびfluo-4は、アルゴンレーザーにより488nmで励起し、LP 505フィルターを用いて放出光を収集した。ピンホールを5μmスライスを作成するように調節し、カルシウム過渡応答を見る際の収縮による軸の移動の影響を最小とした。全ての透過光画像を、488nm励起光と組合わせた透過型光検出装置を用いて同時に収集した。画像に関するデータ深度(depth)は8ビットであった。画像サイズは、512x512ピクセルから128x128ピクセルまで変動した。

カルシウム過渡応答は、fluo-3およびfluo-4処理した細胞において、共焦点顕微鏡により観察することができる(図2)。蛍光強度は、筋小胞体からのカルシウム放出時の、fluo-3色素へのカルシウム結合量に比例している。図2Aは、拍動するCS細胞由来の心筋細胞におけるカルシウム過渡応答の図を示している。ピーク強度およびベースラインは、各々、図2Bおよび図2Cに示す。一部のCS細胞において、カルシウム過渡応答は、認知可能な収縮が注目される前であっても共焦点顕微鏡により認めることができ、このことは収縮要素の成熟または高密度細胞外マトリックスによる細胞運動性の制限に先立つ心筋細胞興奮要素の発達を示唆している。

実施例8
Spoc細胞由来の心筋細胞における活動電位の測定
カルシウム過渡応答は、培養物中において単独のspoc細胞由来の心筋細胞のパッチ記録法で特徴付けられる活動電位(AP)の存在を示している。電流固定記録を、136mM NaCl、5.4mM KCl、1mM MgCl₂、1.8mM CaCl₂、0.33mM NaH₂PO₄、10mMグルコースおよび10mM HEPESを含有するTyrode液(NaOHでpH7.4に調節)中で、室温での、密封した全細胞パッチ技術を用いて行った。ピペット溶液は、20mM KCl、110mMアスパラギン酸カリウム、1mM MgCl₂、10mM HEPES、5mM EGTA、0.1mM GTP、および5mM Mg²⁺/ATPを含有した(KOHでpH7.2に調節)。電圧は、2kHzでフィルターをかけた(-3dB；四極、低域ベッセル（Bessel）フィルター)。開放(break in)時の静止膜電位は、39.8±1.6mV(n＝9)であったが、一般に10mVまたはそれ以上に改善された。場合によっては、細胞は、活動電位閾値よりもわずかに過分極された。

様々な心臓のAPを、拍動細胞および非拍動細胞において観察し(図3A、3B)、両者とも、50〜90mVの強いオーバーシュートを伴う、およそ-60mVの静止膜電位を示す。APの形および期間は、他の種の心筋細胞において認められるプラトー期を欠いている成体マウス心筋細胞APの説明に合致している(Wangら、Circ Res、79:79(1996))。拍動細胞は、L型Ca⁺⁺チャンネルおよびNa⁺チャンネルの非特異的ブロッカーである0.5mM CdCl₂の添加は、予想される活動電位を廃する(Piperら、「Isolated Adult Cardiomyocytes」、30-65頁(CRC Press社、ボカラートン、FL)、1989；Sperelakis, N.、「Physiology and Pathophysiology of the Heart」、101-114頁(Kluwer Academic Publishers社、ボストン、MA)、1995)が、骨格筋管に対しては作用を有さない(Mould and Dulhunty Pjlugers Arch、437:197(1999)；Garciaら、J Membr Biol、168:141(1999))(図3C、3E)という点が、骨格筋と異なる。同様に、25nMイソプロテレノールの添加によるAP振動数の増大により示されるように(図3D)、拍動および非拍動の両心臓細胞は、無傷のアドレナリン作動性経路を有する(Shumakerら、Am J Physiol、261:H1937-44(1991)；Tanakaら、Proc R Soc Lond B Biol Sci、263:241(1996)；Gilesら、J Physiol、415:233(1989))。予想される作用の欠如(ReineckeおよびMurry、Cardiovasc Pathol、9:337(2000))は、骨格筋管において認められる(図3F)。自発的カルシウム過渡応答および活動電位を有する単核の筋芽細胞は、標準の培養条件下では説明されず(Cognardら、Development、117:1153(1993))、例えこれらが細胞融合を停止することにより考え出された場合であっても、これらは、CdCl₂に対する反応の欠如のような、骨格筋細胞の電気的活動特性を維持している(Constantinら、Exp Cell Res、217:497(1995))。

実施例9
骨髄細胞からのspoc細胞の識別
Spoc細胞は、c-kit^-であり、梗塞心臓を再構成する実験において直接または間接に使用されるc-kit⁺骨髄細胞とは識別される。これにも関わらず、spoc細胞は、骨格筋への移動後c-kit^-となる循環血中骨髄細胞に由来することができる。この問題点をより十分に評価するために、全骨髄を、c-kit+およびc-kit-集団に分画した。分離した集団および一緒にした集団の両方を、spoc細胞と同じ条件下で培養した。3種の骨髄細胞集団は、自発的拍動細胞へは発達しなかった。

骨髄細胞は、spoc細胞から放出された可溶性因子の存在下で心筋細胞へ分化する可能性を有するかどうかを試験するために、骨髄細胞およびspoc細胞の同割合を、ふたつのチャンバーが0.4μmの透過膜により隔てられているCostarトランスウェルシステムにおいて共培養した。細胞総数は各コンパートメントにおいて増大したが、spoc細胞のみが、心臓マーカーを発現している拍動細胞へと分化した。

骨髄細胞とspoc細胞の間の細胞間接触が骨髄細胞を心筋細胞へ分化させるかどうかを試験するために、総骨髄を、EGFP発現しているトランスジェニックマウス(ACTbEGFP、The Jackson Laboratory社)から得たEGFP発現しているspoc細胞と同割合で混合した。3種の個別の実験において、同じ培養条件下で、総細胞数は増大したが、EGFP発現している細胞のみが拍動細胞へ発達した。逆の実験は、細胞数は同様の増加を示したが、拍動細胞はEGFPを発現しなかった。これらの実験をまとめると、骨髄は、骨格筋から単離されたspoc細胞に表現型が類似しているいかなる細胞集団も含まないことを示している。

実施例10
Spoc細胞の骨髄再構築能の試験
造血幹細胞の場合とは異なり、spoc細胞を、エリスロポイエチン、IL-3、IL-6およびSCFの存在下、メチルセルロース中で培養した場合に、コロニー形成単位は作成されない。Spoc細胞の骨髄再構築能を評価するために、spoc細胞を伴う標準的および競合的な骨髄移植を行った。4匹のマウスにおいて、3x10⁶個の骨髄細胞および3x10⁴個のGFP⁺Sca-1^- spoc細胞を、致死的に放射線照射した各マウスへ注射した。4匹のマウスは全て生存したが、稀なGFP⁺のドナー由来の細胞のみが、末梢血液または骨髄において認められた。1.5x10⁵個のSca-1^- spoc細胞または2x10⁵個のSca-1について分画していないspoc細胞のいずれかを注射した6匹の致死的に放射線照射したマウスの骨髄は、救出できず、全てのマウスが2週間以内に死亡した。

実施例11
心臓由来の細胞からのspoc細胞の識別
Spoc細胞が、骨格筋同様、心臓から単離できるかどうかを決定するために、同じマウスから心臓または骨格筋500mgを切除し、これらを使用し、先に実施例1に説明したように細胞を単離した。組織をマウスから摘出し、個別に同じ条件下で培養した。7〜8日目までに、骨格筋由来の細胞において、およそ3x10⁵個の細胞が拍動細胞への発達が可能であることが認められたが、心臓由来の細胞の培養物においては認められなかった。骨格筋由来の細胞のおおまかに10％が、自発的拍動を示した。従って、骨格筋由来のspoc細胞調製物のみが、心臓のマーカーを発現している拍動細胞へ分化した。2回繰り返したCostarトランスウェルシステムにおける両細胞集団の共培養実験は、両方のチャンバーにおいて細胞数の増加をもたらしたが、同じく骨格筋由来の細胞のみが、心臓のマーカーを発現している拍動細胞へ発達した。

実施例12
Spoc細胞の間葉系幹細胞からの識別
Spoc細胞を間葉系幹細胞(MSC)から識別することができるかどうかを決定するために、MSCを、培養物中でspoc細胞と比較した。MSC(Clonetics社)を、前記方法において説明したように、骨格筋から作成したspoc細胞と平行して培養した。MSCは、播種後直ちにプレートへ接着し、観察の12日間を通じて接着し続け、拍動のいかなる徴候も示さなかった。対照的に、骨格筋由来の心臓の始原細胞は、サイズがより小さく、非接着であり続ける一方で、これらはspoc細胞の浮遊クラスターへと発達し、かつこれらは心臓マーカーを発現している拍動する心臓の筋細胞へと発達した。Spoc細胞は、MSCクラスターにおいては形成されなかった。従ってspoc細胞はMSCではない。

実施例13
Spoc細胞のインビボ分化
Spoc細胞を心筋梗塞内へ移植しかつ成熟心筋細胞へ分化するかどうかを決定するために、1x10⁵個のEGFP⁺ spoc細胞を、急性心筋梗塞(MI)モデルの末梢循環内に注射した。14週間後には、多くのドナー由来のEGFP⁺細胞が生着していた。梗塞へ移動したドナー細胞の8％(63/782)が、心筋細胞へ発達していた。

より高齢の梗塞における同様の作用を評価するために、同数のGATA-4陰性spoc細胞を、2匹のマウス(MI後8週および14週の状態)へ、尾静脈から注射した。注射後2週間で、8週齢梗塞モデルの心臓は、梗塞の周辺領域に移動したドナー細胞の3％(4/136)において、EGFPおよびGATA-4の共局在を示す。14週齢梗塞モデルへの注射後5週間で、梗塞領域において、増大した数のEGFP⁺/RLCP⁺細胞(7/102ドナー由来細胞)が明らかである。Spoc細胞はGATA-4もRLCPも陽性ではないので、これらの知見は、インビトロにおいて認められたように、それらが心筋細胞へと分化し始める心臓の損傷領域から、元に戻ったか(home)またはフィルター除去されたことを示唆している。7日間の培養により部分的に分化したspoc細胞を、3匹の急性梗塞マウスの心臓および尾静脈へ注射した。梗塞時に生理食塩水を注射した2匹の対照マウスと比べ、7日目およびそれ以降に、心臓において標識した細胞は同定されなかった。このことは、未分化の細胞は心臓において、より容易に元に戻ったかまたは優先的にフィルター除去されたことを示唆している。

Sca-1マーカー(造血幹細胞において認められる表面抗原)についての選別による更なるspoc細胞の分画は、圧倒的多数の拍動細胞が、Sca-1^-プールから発達していることが明らかである。Spoc細胞のおよそ90％が、迅速に接着し、拍動細胞へ発達しないSca-1⁺細胞である。Sca-1⁺集団を除去すると、残りのSca-1^-集団は、分化開始前に未分化の細胞として2〜3回追加の分裂を受ける。これらの細胞の一部は、拍動し始めるが、依然浮遊している。CS細胞の段階に到達しているSca-1^-集団を、Sca-1⁺細胞の接着単層上に再播種した場合、Sca-1^-細胞は、24時間以内に単層に接着し、これは通常これらが接着する日よりも早い。3日以内に、これらは、そうでない場合の程度を越えて伸長し、かつ拍動細胞の割合の増加が認められる。

Sca-1^- spoc細胞が心筋梗塞内に生着しおよび成熟心筋細胞へ分化するかどうかを決定するために、C57Bl/6Jマウスにおける前方心筋梗塞(MI)モデルを、左冠動脈結紮により作出した。梗塞直後に尾静脈へ1x10⁵個Sca-1^- EGFP⁺ドナー細胞を注射した場合、低レベルの生着が生じ、時折ドナー由来の心筋細胞が、梗塞ゾーンの周辺に認められたのみであった。分化または未分化の標識細胞は、梗塞心臓の正常部分には認められなかった。Sca-1^-細胞の生着レベルの低さを克服するために、Sca-1⁺およびSca-1^-細胞の混合物を、異なる割合で、マウスモデルへ提供する。

実施例14
拍動および分裂し続ける形質転換した細胞株の作出法
拍動および分裂を継続する形質転換したspoc細胞株を作出する。Spoc細胞は、市販の試薬を用いてSV40ラージT抗原またはポリオーマラージT抗原を収容しているプラスミド発現ベクターで、トランスフェクションする。これらの細胞を、テフロン製容器内で培養し、細胞の増殖集団を単離しクローニングした。単独の形質転換した細胞を増大し、クローン集団を作出する。これらの細胞株を用い、罹患した機能不全となっている心臓を修復するための「ポンピングパッチ」を作成するのに十分な細胞を得る。対象からエキソビボで得た形質転換された細胞を、循環血を介してまたはガイド付きカテーテルを用い直接心臓へのいずれかにより対象へ導入する。対象からエキソビボで得た形質転換された細胞を同じく、内皮細胞前駆体、筋線維芽細胞および他の対象由来の支持細胞と共に使用し、補助装置として心臓内に配置される血管形成した拍動細胞のパッチを作成する。このパッチは、固有の心臓のペーシング電流を捕獲するかまたは心臓全体を心拍調整するペースメーカー移植片の使用のいずれかにより、心臓の残余に同調した。

実施例15
心筋細胞分化または機能に影響を及ぼす物質のスクリーニング法
多くの様々な形質転換された心臓の細胞株を、心臓の機能および発生に重要な遺伝子を研究するために作出されたトランスジェニックマウス、ノックアウトマウス、またはノックインマウス骨格筋の細胞株から作出した。これらの細胞株を用い、ハイスループットアッセイ法において、コンビナトリアルケミカル由来の治療的物質をスクリーニングする。ひとつの態様において、形質転換された細胞のクローン集団は、カルシウムチャンネルおよび他のチャンネルへ影響を及ぼす物質で処理することができる。細胞は、心筋細胞機能に影響を及ぼすアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするための免疫蛍光または電気的活性などの様々な方法によりスクリーニングすることができる。関心のあるノックアウトマウスの例は、コネキシン-43ノックアウトマウスおよびp53ノックアウトマウスを含むが、これらに限定されるものではない。

実施例16
Spoc細胞のサテライト細胞からの識別
Spoc細胞およびサテライト細胞を、ガラススライド上で30分間風乾し、その後4％パラホルムアルデヒド中で4℃で固定し、引き続きPBSで5分間すすぐ。これらの細胞を、ヤギ血清で30分間ブロッキングし、次にウサギ抗met(1:200、Santa Cruz Biotechnology社)と共に、一晩4℃でインキュベーションする。一晩インキュベーションした後、これらのスライドを、PBSで3回(各5分間)すすぎ、再度ヤギ血清で30分間ブロッキングする。その後これらの細胞を、二次抗体と共に室温でインキュベーションし、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)で1時間結合させる。これらは再度PBSで3回(各5分間)洗浄し、次に共焦点レーザー顕微鏡(Leica社)で視認し、蛍光シグナルを検出した。試験したふたつの細胞型のうち、サテライト細胞のみが、c-metで陽性染色され、このことはサテライト細胞がそれらの細胞表面にc-metを発現するのに対し、spoc細胞は発現しないことを示している。

実施例17
心筋細胞前駆細胞の成人骨格筋からの単離法
骨格筋組織を、成人の三角筋から外科的に得て、これを小切片に切断し、およびコラゲナーゼを用い37℃で2時間消化する。消化した組織は、100μmフィルターおよび次に40μmフィルターを通すことにより、細胞片および他の未消化の組織断片を排除する。この細胞浮遊液を、低速で遠心分離し、できる限り多くの小さい筋肉線維断片を排除する。この段階で、これらの細胞は、ほとんど直径が約4μmの小さい円形細胞のクラスターからなり、これはヒトspoc細胞である。これらの細胞は、サテライト細胞表面マーカーであるc-metを発現しない。

これらのspoc細胞を、およそ10⁵個細胞/cm²の密度で、通常の組織培養皿において完全増殖培地(5％ウシ胎仔血清(FBS)、10ng/mlヒトEGF、10ng/mlヒトbFGF(PeproTech社)、5μg/mlインスリン、5μg/mlトランスフェリン、6ng/mlセレン、2μg/mlエタノールアミン(ITS-X、Invitrogen社)、25μg/mlゲンタマイシンおよび2.5μg/mlフンジゾン(Life Technologies社)を補充した、1:1 DMEM/F12)中に播種する。数日後、この培養物は、円形細胞の浮遊集団および若干の接着性線維芽細胞からなる。円形細胞は、細胞分裂を数回受けるので、膨大し、その間これらは10〜14μmの増大した直径を持つ浮遊している円形細胞のクラスターとなる。これらのクラスター内の細胞は、CS(spoc由来心臓前駆（cardiac precursors from spoc)）細胞と称される。

本発明者らの開示の原理を適用することができる多くの可能性のある態様を考慮し、例証された態様はこれらの開示の単なる例であり、開示の範囲を限定するものと考えられるべきではないことは認められるべきである。むしろ、本発明の範囲は、先の特許請求の範囲により定義される。従って本発明者らは、これらの特許請求の範囲および特許請求の範囲の精神に収まる全てを、本発明として請求するものである。

分化培地において培養した場合の、経時的CS(spoc細胞由来の心臓前駆体)細胞の分化の進行を示している一連の透過型電子顕微鏡のデジタル画像である。図1Aは、不規則なミオシンフィラメントを伴う、3日目のCS細胞のデジタル画像である。図1Bは、外側に広がる特徴的1.6μm-長の7日目のミオシンフィラメント(上側囲み)、および濃染顆粒を含む細胞(下側囲み)を示しているデジタル画像である。図1Cおよび図1Fは、単独の中心核を示す14日目の細胞が、組織化しているサルコメアへと濃染顆粒の外側伸展していることを示している、14日目の細胞のデジタル画像である。図1Dは、3日目のCS細胞が、大量のミトコンドリアを伴う円形細胞であることを示す(囲みおよび詳細)。図1Eは、伸長した7日目の細胞が、濃染顆粒(矢先)を含むことを示している。図1Gは、56日目までに、同定可能なA帯およびI帯ならびにZ線を伴う、十分に定義されたサルコメア(図1G)が存在することを示している。 CS細胞から分化した心筋細胞におけるカルシウム過渡応答の存在を示している。図2Aは、拍動しているCS細胞由来の心筋細胞におけるカルシウム過渡応答のグラフ表示を示している。ピーク強度およびベースラインは、各々、図2Bおよび図2Cに示されている。 spoc細胞由来の心筋細胞からの全細胞電圧記録は、拍動していない涙型細胞における自発性活動電位発生(firing)を明らかにしていることを示している(図3a)。図3bは、延長された時間枠での、図3aの記録からの代表的活動電位を示し；活動電位閾値は-60mVである。図3cは、別の細胞における、0.5mM CdCl₂の浴灌流時(水平棒)の、活動電位開始のブロッキングを示している。25nMイソプロテレノール灌流時(水平棒)の活動電位発生の加速は、図3dに示されており、これはこれらの細胞にアドレナリン受容体が存在することを示している。骨格筋管APは、それらの振動数が、Cd²⁺(図3e)またはイソプロテレノール(図3f)では影響を受けないという点が異なる。

Claims (43)

1. 筋肉起源の、単離された非接着性の哺乳類c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-心筋細胞前駆細胞。
2. 細胞がヒト細胞である、請求項1記載の細胞。
3. 細胞がマウス細胞である、請求項1記載の細胞。
4. 細胞が、胎児(胎仔)、小児(小仔)または成人(成獣)由来の、請求項1記載の細胞。
5. 細胞が、浮遊液中にある、請求項1記載の細胞。
6. 細胞が、直径約3μm〜10μmである、請求項1記載の細胞。
7. 細胞が、直径およそ4μmである、請求項6記載の細胞。
8. 細胞が、心筋細胞に分化する、請求項1記載の細胞。
9. 細胞が、自発的に拍動する心筋細胞に分化する、請求項1記載の細胞。
10. 細胞が、ウイルスベクターにより導入されるかまたは不死化遺伝子により形質転換される、請求項1記載の細胞。
11. ウイルスベクターが、異種核酸を含む、請求項10記載の細胞。
12. 細胞が、GATA-4、トロポニン-T、L型カルシウムチャンネル、もしくはNkx2.5、またはそれらの組合わせを発現している心筋細胞に分化する、請求項8記載の細胞。
13. 筋肉起源の非接着性のc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-心筋細胞前駆細胞を単離する方法であって：
    筋肉細胞の浮遊液から直径40μm未満の細胞を分離する工程；
    組織培養用の培地において浮遊液中の直径40μm未満の細胞を4〜8日間培養する工程；および
    該培地において浮遊液中の直径40μm未満の細胞を単離し；これにより、筋肉起源のc-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-心筋細胞前駆細胞を単離する工程であって、該c-kit ^- c-met ^- CD34 ^- Pax(3/7) ^- 細胞の単離が、Sca-1細胞表面マーカーが発現していない細胞を選別することを含む工程を含む、方法。
14. 細胞の浮遊液から直径40μm未満の細胞を分離する工程が：
    細胞浮遊液を、孔径約50〜200μmの第一のフィルターを通過させ、直径が約50μmより大きくおよび約200μm未満である細胞を含む第一の溶出液を収集する工程；および
    第一の溶出液を孔径約40μmの第二のフィルターを通させ、直径が約40μm未満の細胞を含む第二の溶出液を収集する工程を含む、請求項13記載の方法。
15. 第一のフィルターが、少なくとも100μmの孔径を有しおよび第二のフィルターが約40μmの孔径を有する、請求項14記載の方法。
16. 組織培養用の培地が増殖培地である、請求項13記載の方法。
17. 増殖培地に増殖因子が補充されている、請求項16記載の方法。
18. 増殖因子が、上皮増殖因子、もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子、またはそれらの組合わせである、請求項17記載の方法。
19. 上皮増殖因子が、濃度約5〜50ng/mlである、請求項18記載の方法。
20. 上皮増殖因子が、濃度約5〜10ng/mlで存在する、請求項19記載の方法。
21. 上皮増殖因子が、濃度約10ng/mlで存在する、請求項19記載の方法。
22. 塩基性線維芽細胞増殖因子が、濃度約5〜50ng/mlで存在する、請求項18記載の方法。
23. 塩基性線維芽細胞増殖因子が、濃度約5〜10ng/mlで存在する、請求項22記載の方法。
24. 塩基性線維芽細胞増殖因子が、濃度約10ng/mlで存在する、請求項22記載の方法。
25. 請求項13記載の方法に従い単離された、筋肉起源の非接着性の哺乳類c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-心筋細胞前駆細胞。
26. 筋肉起源の非接着性のc-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-心筋細胞前駆細胞を分化させる方法であって：
    筋肉細胞の浮遊液から直径40μm未満の細胞を分離する工程；
    増殖因子の存在下で組織培養用の培地において浮遊液中の直径40μm未満の細胞を4〜8日間培養する工程であって、該増殖因子が、上皮増殖因子もしくは塩基性線維芽細胞増殖因子、またはそれらの組合わせである工程；
    該培地において浮遊液中の直径40μm未満の細胞を単離する工程；および
    増殖因子を除去し、これにより筋肉起源のc-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-心筋細胞前駆細胞を、心筋細胞へ分化させる工程を含む、方法。
27. 心筋細胞が、自発的に拍動する、請求項26記載の方法。
28. 上皮増殖因子が、濃度約5〜50ng/mlで存在する、請求項26記載の方法。
29. 上皮増殖因子が、濃度約5〜10ng/mlで存在する、請求項28記載の方法。
30. 上皮増殖因子が、濃度約10ng/mlで存在する、請求項28記載の方法。
31. 塩基性線維芽細胞増殖因子が、濃度約5〜50ng/mlで存在する、請求項26記載の方法。
32. 塩基性線維芽細胞増殖因子が、濃度約5〜10ng/mlで存在する、請求項31記載の方法。
33. 塩基性線維芽細胞増殖因子が、濃度約10ng/mlで存在する、請求項31記載の方法。
34. c-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1⁺細胞を添加する工程を更に含む、請求項26記載の方法。
35. 筋肉起源の非接着性の哺乳類c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-心筋細胞前駆細胞を、薬学的に許容される担体中に含有する、薬学的組成物。
36. 物質の心筋細胞への分化に対する作用を決定するために、物質をスクリーニングする方法であって：
    筋肉起源の非接着性の哺乳類c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-心筋細胞前駆細胞を提供する工程；
    該細胞を分化させる工程；
    該細胞を物質と接触させる工程；および
    細胞の心筋細胞への分化に対する物質の作用を観察し、これにより物質をスクリーニングする工程を含む、方法。
37. 作用の観察が、物質の細胞の分化に対する作用を決定することを含む、請求項36記載の方法。
38. 分化に対する作用を決定することが、GATA-4の発現、心臓トロポニン-Tの発現、L型カルシウムチャンネルの発現、もしくはNkx2.5の発現、またはそれらの組合わせをアッセイすることを含む、請求項37記載の方法。
39. 作用の観察が、この細胞の心筋細胞機能のパラメータをアッセイすることを含む、請求項37記載の方法。
40. パラメータが、細胞の自発的拍動を含む、請求項39記載の方法。
41. 筋肉起源の非接着性の哺乳類c-kit^-c-met^-CD34^-Sca-1^-Pax(3/7)^-心筋細胞前駆細胞の精製された集団を含む容器を備えるキットであって、該キット中の細胞を心筋細胞に分化させることが可能なキット。
42. 哺乳類c-kit^-c-met^-CD34^-Pax(3/7)^-Sca-1⁺細胞の精製された集団を含む容器を更に備える、請求項41記載のキット。
43. 増殖因子を含む容器、培地を含む容器、キットの使用に関する使用説明書、またはそれらのいずれかの組合わせを更に備える、請求項41記載のキット。

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