CN118460528A - 用于iPSC和ESC衍生的心肌细胞的功能成熟的方法和系统 - Google Patents
用于iPSC和ESC衍生的心肌细胞的功能成熟的方法和系统 Download PDFInfo
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Abstract
本发明为诱导未成熟心肌细胞功能成熟的方法，所述未成熟心肌细胞衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)和胚胎干细胞(ESC)，所述方法为通过根据诱导成熟的脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到未成熟心肌细胞成熟为功能上的成体心肌细胞时为止。
Description
本发明申请是基于申请日为2018年03月03日，申请号为201880029024.6(国际申请号为PCT/US2018/020817)、名称为“用于iPSC和ESC衍生的心肌细胞的功能成熟的方法和系统”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年3月3日提交的美国临时专利申请no.62/466,992和2017年4月26日提交的美国临时专利申请no.62/490,505的优先权权益，将其各自的全部内容通过提述完整并入本文。
技术领域
本发明涉及将iPSC和ESC衍生的心肌细胞以电方式诱导成具有成体样表型的细胞并且以电方式监测该成熟过程的方法。
发明背景
诱导多能干细胞(iPSC)是一种可以直接从成体细胞生成的多能干细胞。这项技术是在十年前通过在胚胎干(ES)细胞培养条件下将编码转录因子Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4的四个特定基因引入到小鼠成体成纤维细胞中而开创的。Takahashi等人(2006)。Takahashi等人后来证明其因子也对人类起作用。Takahashi等人(2007)。
iPSC的使用在再生医学应用以及药物发现和开发方面前景广阔。具体而言，iPSC可以分化成用于潜在疗法的许多不同类型的细胞，比如神经元、心肌细胞和肝细胞。这些细胞还可以用于了解潜在的疾病机制和筛选可用于减轻疾病状况的治疗剂。源自iPSC技术的首批细胞类型之一是心肌细胞。这些源自iPSC的心肌细胞显得表达适当的离子通道库以及在正常心肌细胞中发现的结构蛋白和其他蛋白质。然而，使iPSC完全分化成具有成体表型的心肌细胞是具有挑战性的。相反，其发育通常在未成熟阶段停滞，与成熟或成体表型相比，不成熟心肌细胞趋于具有圆形的形态，肌节紊乱，缺乏T管，基因表达谱不同，并且动作电位分布不同。不成熟的心肌细胞作为治疗途径的潜力是有限的。Yang等人(2014)。
已采用多种不同的途径来改善iPSC衍生心肌细胞的成熟状态，包括长期心肌细胞培养(Lundy等人，2013)，在劲度接近天然心肌的基底上培养细胞(Jacot等人，2008)，将细胞接种到提供拓扑线索的图案化基底上(McDevitt等人，2002)，对细胞施加机械负载(Zimmermann等人，2002)，以及定向电刺激(Sathaye等人，2006)。所有这些方法都可以导致心肌细胞在结构和功能上类似于成体样表型。但是，每个系统都有其弱点，例如难以实现高通量筛选，且需要高水平的技术知识。
因此，仍然需要用于使心肌细胞前体细胞(包括iPSC衍生的和胚胎干细胞(ESC)衍生的心肌细胞)进一步成熟为具有成熟表型或成体样表型的心肌细胞的改进的系统和方法。
发明简述
本发明解决了上述不足并提供了相关益处。具体而言，本发明提供了以电方式诱导iPSC或ESC衍生的心肌细胞进一步成熟并且以电方式监测其成熟为更像成体样的表型的方法和系统。这至少部分地是通过扩展由ACEA Biosciences公司(San Diego,CA)开发的xCELLigence CardioECR系统的电起搏和监测特征来实现的，上述系统使用专门开发的诱导成熟的脉冲谱系统地使iPSC和其他未成熟心肌细胞起搏(pace)，同时还监测培养细胞的搏动谱，以监测成熟过程。
更具体地说，在本发明的一个方面，提供了一种使功能未成熟的心肌细胞成熟的方法，所述方法包括：提供系统，该系统被配置为培养搏动细胞、使搏动细胞电起搏并监测搏动细胞搏动；在所述系统中培养未成熟心肌细胞；监测未成熟心肌细胞以将该心肌细胞搏动表征为同步的或不同步的；并且，如果是同步的，则按照脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到未成熟心肌细胞成熟为功能上成体性的(functionally adult)心肌细胞时为止。
在一些实施方案中，所述系统包括位于基底上并且与阻抗分析器可操作连接的阻抗监测电极阵列，用于监测系统中培养的细胞群的细胞-基底阻抗。在其他实施方案中，所述系统包括与细胞外记录放大器可操作连接的细胞外记录电极阵列，用于对系统中培养的细胞群体进行细胞外记录。在其他实施方案中，通过提供上述二者，诸如基底上的阻抗监测电极阵列、基底上的细胞外记录电极阵列、阻抗分析器和细胞外记录放大器，系统被配置为监测细胞-基底阻抗并对系统中培养的细胞群进行细胞外记录。在一些实施方案中，细胞-基底阻抗监测电极阵列与细胞外记录电极阵列之间共享电极，但在其他实施方案中，各阵列各自具有其自己独特的电极对。
提供的改进之处包括能够使心肌细胞从不同的未成熟水平或程度开始分化，而无需考虑培养中的搏动速率。换言之，本申请中的方法可用于诱导以特征为负性力-频率关系为特征的被视为未成熟的任何心肌细胞群的成熟。为此，被表征为未成熟的(在本文中也称为具有胚胎表型的)心肌细胞，只要经历兴奋-收缩偶联，就可以使用。这样，未成熟心肌细胞可衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。
此外，可以对未成熟心肌细胞进行电监测，以将其阶段表征为未成熟或成体，并评估其是否适合经历进一步分化。其中，监测心肌细胞成熟的有用手段包括监测心肌细胞的细胞-基底阻抗。在其他实施方案中，通过心肌细胞的细胞外记录来对未成熟心肌细胞进行电监测。在一种混合手段中，通过心肌细胞的细胞-基底阻抗监测和心肌细胞的细胞外记录对未成熟心肌细胞进行电监测。心肌细胞搏动的电测量使得确定力-频率关系成为可能，其中，正性的力-频率关系指示成熟心肌细胞群，而负性的力-频率关系指示未成熟心肌细胞群。
另外，可以利用未成熟心肌细胞的电监测来确定心肌细胞搏动是否同步，例如通过确定未成熟心肌细胞的搏动速率并随时间比较该搏动速率。如果心肌细胞搏动不同步，则未成熟心肌细胞可能需要额外的培养。还可利用未成熟心肌细胞的电起搏来诱导未成熟心肌细胞的同步搏动。可以通过以恒定频率施加电脉冲来实现电诱导同步搏动。具体而言，通常以与未成熟细胞的搏动速率相同的速率或大约相同的速率提供电脉冲。通常，约0.5Hz至1Hz的脉冲频率可以帮助同步化搏动。
一旦搏动同步化，即按照脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，以诱导进一步成熟为功能上成熟或成体表型。这些脉冲谱是为了诱导iPSC衍生的心肌细胞、ESC衍生的心肌细胞和功能不成熟的心肌细胞成熟而建立的。一种示例性的脉冲谱具有矩形脉冲形状。一种示例性脉冲强度为0.7V至1V，且高达几伏(例如2V或3V)的强度或电压是可接受的。脉冲强度应该高至足以使未成熟心肌细胞起搏(即，每个施加的脉冲都会导致装置中的心肌细胞的搏动周期)。
示例性脉冲谱具有0.1毫秒至0.2毫秒的脉冲持续时间或宽度，其中高达10毫秒的持续时间是可接受的。在适当施加脉冲强度的情况下，脉冲持续时间应该足够长，以使心肌细胞起搏(即，每个施加的脉冲都会促成装置中的心肌细胞的搏动周期)。通常，应该施加尽可能短的脉冲持续时间，只要它促成心肌细胞的有效起搏即可(即，每个施加的脉冲都会促成孔中的心肌细胞的搏动周期)。
使用所述系统使未成熟心肌细胞分化主要是通过施加具有变化的脉冲频率的脉冲谱使未成熟心肌细胞随时间推移起搏来完成的。技术人员将理解，脉冲谱可以根据未成熟心肌细胞的搏动速率而变化，并且还可以根据所使用的使未成熟心肌细胞分化为成熟心肌细胞的方法而变化。作为示例，脉冲谱将典型地以与未成熟心肌细胞的搏动速率一致或几乎一致的频率开始，该频率可以变化。大多数情况下，脉冲谱将以较慢的脉冲频率开始，并且频率随时间推移而增加。这个初始较低的脉冲频率应该是适当的，以便心肌细胞可以跟随起搏脉冲(即，每个起搏脉冲都会促成装置中的心肌细胞的一个搏动周期)。作为示例，建立了具有随时间推移在0.5Hz和2Hz之间变化的脉冲频率的脉冲谱。作为另一示例，脉冲谱包括随时间推移在1Hz和2Hz之间变化的脉冲频率。作为另一示例，脉冲谱包括随着时间推移从0.75Hz增加到2Hz的脉冲频率。作为另一示例，某些基因型或表型(比如患病的基因型/表型)的心肌细胞可能需要较低的初始脉冲频率，例如0.5Hz或0.3Hz或甚至更低，以便使心肌细胞可以有效起搏。另一方面，脉冲频率可以随时间推移从最初的低脉冲频率增加到较高的脉冲频率，比如3Hz或甚至更高，这取决于将使用正在被起搏的这些心肌细胞的测定法的要求。技术人员将理解，增加脉冲频率之间的时程也可以变化，但在一些实施方案中，增加脉冲频率的时程为2-6天。在其他实施方案中，增加脉冲频率的时程为1至5周。作为非限制性实例，当以0.75Hz脉冲1周，以1.5Hz脉冲另一周，以2Hz脉冲又一周时，未成熟心肌细胞可发生进一步分化。优选地，递增的脉冲频率随时间推移频率加倍。可以通过定期测试搏动培养物的力-频率关系，确定力-频率关系是增强(指示成熟)还是减弱(指示未成熟)，来追踪心肌细胞的成熟。具体而言，测试可以包括逐渐增加心肌细胞的起搏率并同时记录搏动幅度——力的替代指标。如果搏动幅度/电起搏率关系为负，则心肌细胞视为未成熟；反之，如果幅度/电起搏率关系为正，则心肌细胞视为“成熟”。
功能成熟的心肌细胞，或称成体心肌细胞，具有正性力-频率关系；而未成熟的心肌细胞具有负性力-频率关系。因此，通过电监测某种对应于搏动力的参数(比如搏动幅度测量值)，可以评估力-频率关系，以便监测成熟过程。这样，所述方法包括对未成熟心肌细胞进行电起搏，直到心肌细胞被表征为具有指示成体表型的正性力-频率关系时为止。
在本发明的相关方面，提供了表征化合物对心肌细胞搏动的作用的方法。所述方法包括：提供系统，该系统被配置为培养收缩细胞、使其电起搏并监测其搏动；在所述系统中培养未成熟心肌细胞；按照脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到心肌细胞功能成熟时为止；向功能成熟的心肌细胞添加疑似对心肌细胞搏动力或心肌细胞搏动速率有作用的化合物；在添加化合物之前和之后进行培养心肌细胞的电监测；确定在添加化合物之前和之后的至少一个表征搏动幅度或搏动速率的参数；比较在添加化合物之前和之后确定的所述至少一个参数，由此鉴定响应于添加化合物的差异；并且将所述化合物表征为：如果在添加化合物之后搏动幅度增加，则为正性肌力化合物，或者，如果在添加化合物之后搏动幅度减小，则为负性肌力化合物；并且/或者，如果在添加化合物之后搏动速率增加，则为正性变时化合物，或者，如果在添加化合物之后搏动速率降低，则为负性变时化合物。
鉴于本文中的技术改进，所述方法可以与衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)的未成熟心肌细胞一起使用。优选将未成熟心肌细胞培养到搏动同步时为止。优选通过电测量来确定同步搏动，但也可以通过光学确定。作为非限制性示例，电测量可以是细胞-基底阻抗监测、细胞外记录，或细胞-基底阻抗监测和细胞外记录两者。如果搏动不同步，则可以使心肌细胞电起搏，直到心肌细胞搏动同步时为止。这样的电脉冲可具有恒定频率。
为了测试一种或多种化合物的作用而使心肌细胞起搏，以获得更成熟的表型或成体表型，所述起搏包括施加能够诱导进一步成熟的脉冲谱。这种脉冲谱可以表征为具有矩形脉冲形状，约0.1V至0.2V的强度(高达2伏或3伏)，以及从0.1毫秒至0.2毫秒(高达10毫秒)的脉冲持续时间。
可以通过施加具有变化的脉冲频率的脉冲谱来实现将未成熟心肌细胞群进一步分化为可以表征为具有成体表型的心肌细胞群。具体而言，脉冲谱以较慢的脉冲频率开始，频率随时间推移而增加。作为非限制性实例，建立了具有随时间推移在0.3Hz和3Hz之间变化的脉冲频率的用于心肌细胞分化的脉冲谱。更优选地，脉冲谱包括随时间推移在0.5Hz和2Hz之间变化的脉冲频率。更优选地，脉冲谱包括随时间推移在1Hz和2Hz之间变化的脉冲频率。在特别优选的方法中，脉冲谱包括随着时间推移从0.75Hz增加到2Hz的脉冲频率。增加脉冲频率之间的时程可以变化，但在一些实施方案中，增加脉冲频率的时程为2-6天。在其他实施方案中，增加脉冲频率的时程为1至5周。作为进一步指导，可以将未成熟心肌细胞以0.75Hz脉冲1周，以1.5Hz脉冲另一周，再以2Hz脉冲又一周，以诱导和维持成熟表型。优选地，增加脉冲频率随时间推移使得频率加倍。
将同步化的搏动培养物与对培养物的高分辨率电监测相结合，还使得鉴定响应于化合物施用的搏动幅度和搏动速率的变化成为可能。为此，所述方法允许表征潜在药物对心肌细胞的作用，因此可以用于开发新的疗法或已知化合物的新治疗用途。作为非限制性实例，所述方法可以对响应于施用血管扩张剂的心肌细胞群变化进行电检测。可以通过在添加化合物之前和之后的培养的心肌细胞的电监测来评估这些变化，电监测通过细胞-基底阻抗的监测、未成熟心肌细胞的细胞外记录、或心肌细胞的细胞-基底阻抗监测和未成熟心肌细胞的细胞外记录这两者来进行。
在又一个相关方面，提供了一种表征化合物对心肌细胞成熟的作用的方法，所述方法包括：提供一种系统，其被配置为培养收缩细胞、使收缩细胞电起搏和监测收缩细胞搏动；在该系统中培养未成熟心肌细胞；按照使心肌细胞功能成熟的脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏；添加疑似对心肌细胞成熟有作用的化合物；在添加化合物之前和之后对培养心肌细胞进行电监测；在添加化合物之前和之后确定至少一种可表征所监测的心肌细胞的搏动力-频率关系的参数；比较在添加化合物之前和之后确定的至少一种参数，由此鉴定响应于添加化合物的差异。
在又另一个相关方面，提供了一种表征化合物对心肌细胞搏动的作用的方法，所述方法包括：提供一种系统，其被配置为培养收缩细胞、使收缩细胞电起搏和监测收缩细胞搏动；在该系统中培养两群未成熟心肌细胞；将疑似对心肌细胞成熟有作用的化合物添加到其中一群未成熟心肌细胞；按照使未成熟心肌细胞功能成熟的脉冲谱使两群未成熟心肌细胞群电起搏，直到两群心肌细胞中的至少一群功能成熟时为止；并且，如果添加化合物的群的功能成熟在另一心肌细胞群之前，则将所述化合物表征为进一步驱动成熟。
在又另一个相关方面，提供了一种用于未成熟心肌细胞功能成熟的系统。所述系统包括：电子脉冲发生器，其被配置为按照诱导未成熟心肌细胞成熟的脉冲谱来输送电子脉冲；装置站，其被配置为与细胞培养装置衔接，并将电子脉冲从脉冲发生器输送至衔接的细胞培养装置；细胞培养装置，其具有被配置为培养细胞的基底，每种基底具有在衔接时可被装置站寻址的电极阵列；和用于培养细胞电监测的模块。
鉴于本文所述的用于心肌细胞分化的方法，脉冲发生器可以输送具有矩形形状的脉冲形状的电子脉冲。在一些实施方案中，脉冲发生器输送0.1V至0.2V至2伏的强度。在其他实施方案中，脉冲发生器输送高达3伏的强度。在一些实施方案中，脉冲发生器输送0.1毫秒到0.2毫秒到10毫秒的脉冲持续时间。
在一些实施方案中，装置站具有接口，接口具有多个电触点和能够独立地将电子脉冲输送到每个电触点的开关。在一些实施方案中，装置站被配置为接受多孔板，任选多个多孔板。在这样的实施方案中，电子脉冲发生器和装置站可以被配置为将脉冲同时输送到多孔板的多于一个孔。此外，电子脉冲发生器和装置站可以被配置为将脉冲同时输送到多孔板的所有孔。更进一步地，在一些实施方案中，电子脉冲发生器和装置站被配置为将脉冲同时输送到多于一个多孔板。在一些实施方案中，电子脉冲发生器和装置站被配置为将不同的脉冲谱输送到多孔板的不同的孔。在其他实施方案中，装置站被配置为衔接一个或多个细胞培养瓶。
在一些实施方案中，细胞培养装置是烧瓶。在其他实施方案中，培养装置是多孔板，任选地选自6孔板、48孔板和96孔板。
在一些实施方案中，所述系统包括在细胞培养装置的基底上培养的未成熟心肌细胞。示例性心肌细胞包括衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)的未成熟心肌细胞。
用于培养细胞的电监测的模块可以包括可操作连接的阻抗分析器，用于监测在细胞培养装置中培养的细胞群的细胞-基底阻抗。在其他实施方案中，用于培养细胞电监测的模块包括可操作连接的细胞外记录放大器，用于对细胞培养装置中培养的细胞群进行细胞外记录。在更进一步的实施方案中，用于培养细胞电监测的模块包括可操作连接的阻抗分析器和可操作连接的细胞外记录放大器，阻抗分析器用于监测在细胞培养装置中培养的细胞群的细胞-基底阻抗，细胞外记录放大器用于对细胞培养装置中培养的细胞群进行细胞外记录。
综上所述，本发明包括但不限于以下各项：
1.一种使功能未成熟的心肌细胞成熟的方法，所述方法包括：
e)提供被配置为培养搏动细胞、使搏动细胞电起搏并监测搏动细胞搏动的系统；
f)在该系统中培养未成熟心肌细胞；
g)监测未成熟心肌细胞，以将心肌细胞搏动表征为同步或不同步；和
h)如果是同步的，则按照诱导成熟的脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到未成熟心肌细胞成熟为功能上成体的心肌细胞为止。
2.项1的方法，其中所述系统包括细胞-基底阻抗监测电极阵列，所述阵列位于基底上并且与阻抗分析器可操作连接，用于监测该系统中培养的细胞群的细胞-基底阻抗。
3.项1的方法，其中所述系统包括细胞外记录电极阵列，所述阵列与细胞外记录放大器可操作连接，用于对该系统中培养的细胞群进行细胞外记录。
4.项1的方法，其中所述系统包括基底上的细胞-基底阻抗监测电极阵列、基底上的细胞外记录电极阵列、阻抗分析器和细胞外记录放大器，其中所述系统被配置为监测细胞-基底阻抗并对该系统中培养的细胞群进行细胞外记录。
5.项1的方法，其中未成熟心肌细胞衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。
6.项1的方法，其中监测未成熟心肌细胞的步骤包括监测未成熟心肌细胞的细胞-基底阻抗。
7.项1的方法，其中监测未成熟心肌细胞的步骤包括对未成熟心肌细胞进行细胞外记录。
8.项1的方法，其中表征心肌细胞搏动是否同步是通过确定未成熟心肌细胞的搏动速率并随时间比较该搏动速率来进行的。
9.项1的方法，其中如果心肌细胞搏动不同步，则所述方法进一步包括使未成熟心肌细胞电起搏，直到心肌细胞搏动同步为止。
10.项9的方法，其中使搏动同步的电起搏是在恒定频率下的。
11.项1的方法，其中脉冲谱包括矩形脉冲形状。
12.项1的方法，其中脉冲谱包括0.7V至1V的脉冲强度。
13.项1的方法，其中脉冲谱包括从0.1毫秒到0.2毫秒的脉冲持续时间。
14.项1的方法，其中脉冲谱包括1Hz至2Hz之间的脉冲频率。
15.项1的方法，其中脉冲谱包括随时间增加的脉冲频率。
16.项15的方法，其中所述增加的脉冲频率历时几天到几周增加。
17.项15的方法，其中所述增加的脉冲频率随着时间推移频率加倍。
18.项15的方法，其中所述增加的脉冲频率从0.75Hz增加到2Hz。
19.项1的方法，其中所述功能上成体的或成熟心肌细胞包括正性搏动力-频率关系，而未成熟心肌细胞包括负性搏动力-频率关系。
20.项1的方法，其中使未成熟心肌细胞起搏直到其显示出正性搏动力-频率关系为止。
21.一种表征化合物对心肌细胞搏动的作用的方法，所述方法包括：
a)提供被配置为培养搏动细胞、使搏动细胞电起搏并监测搏动细胞搏动的系统；
b)在该系统中培养未成熟心肌细胞；
c)按照脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到心肌细胞功能成熟为止；
d)向功能成熟的心肌细胞添加疑似对心肌细胞搏动力或心肌细胞搏动速率有作用的化合物；
e)在添加化合物之前和之后对培养心肌细胞进行电监测；
f)确定在添加化合物之前和之后的至少一个表征搏动力或搏动速率的参数；
g)比较在添加化合物之前和之后确定的至少一个参数，由此鉴定响应于添加化合物的差异；并且
h)将所述化合物表征为：
如果在添加化合物之后搏动力增加，则为正性肌力化合物，或者如果在添加化合物之后搏动力降低，则为负性肌力化合物，和/或
如果在添加化合物之后搏动速率增加，则为正性变时性化合物，或者如果在添加化合物之后搏动速率降低，则为负性变时性化合物。
22.项21的方法，其中未成熟心肌细胞衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。
23.项21的方法，其中培养所述未成熟心肌细胞直到搏动同步为止。
24.项23的方法，其中通过电测量来确定同步搏动。
25.项24的方法，其中所述电测量选自下组：细胞-基底阻抗监测、细胞外记录、细胞-基底阻抗监测与细胞外记录。
26.项23的方法，其中如果搏动不同步，则所述方法进一步包括使心肌细胞电起搏，直到心肌细胞搏动同步为止。
27.项21的方法，其中使心肌细胞起搏直到显示出正性搏动力-频率关系为止。
28.项21的方法，其中脉冲谱包括矩形脉冲形状。
29.项21的方法，其中脉冲谱包括0.7V至1V的强度。
30.项21的方法，其中脉冲谱包括从0.1毫秒到0.2毫秒的脉冲持续时间。
31.项21的方法，其中脉冲谱包括1Hz至2Hz之间的脉冲频率。
32.项21的方法，其中脉冲谱包括随时间增加的脉冲频率。
33.项32的方法，其中所述增加的脉冲频率历时几天到几周增加。
34.项33的方法，其中所述增加的脉冲频率随着时间推移频率加倍。
35.项33的方法，其中所述增加脉冲频率从0.75Hz增加到2Hz。
36.项21的方法，其中所述化合物为疑似血管扩张剂。
37.项21的方法，其中监测培养心肌细胞的步骤选自下组：监测心肌细胞的细胞-基底阻抗，对心肌细胞进行细胞外记录，以及监测心肌细胞的细胞-基底阻抗并对心肌细胞的细胞外进行记录。
38.一种表征化合物对心肌细胞搏动的作用的方法，所述方法包括：
a)提供被配置为培养搏动细胞、使搏动细胞电起搏并监测搏动细胞搏动的系统；
b)在该系统中培养两个未成熟心肌细胞群；
c)将疑似对心肌细胞成熟有作用的化合物添加到其中一个未成熟心肌细胞群；
d)按照使未成熟心肌细胞功能成熟的脉冲谱使两个未成熟心肌细胞群电起搏，直到两个心肌细胞群中的至少一个功能成熟为止；并且
e)如果添加化合物的心肌细胞群在另一个心肌细胞群之前功能成熟，则将所述化合物表征为进一步驱动成熟。
39.项38的方法，其中未成熟心肌细胞衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。
40.项38的方法，其中培养所述未成熟心肌细胞直到搏动同步为止。
41.项40的方法，其中通过电测量来确定同步搏动。
42.项40的方法，其中如果搏动不同步，则所述方法进一步包括使心肌细胞电起搏，直到心肌细胞搏动同步为止。
43.项38的方法，其中脉冲谱包括矩形脉冲形状。
44.项38的方法，其中脉冲谱包括0.7V至1V的强度。
45.项38的方法，其中脉冲谱包括从0.1毫秒到0.2毫秒的脉冲持续时间。
46.项38的方法，其中脉冲谱包括1Hz至2Hz之间的脉冲频率。
47.项38的方法，其中脉冲谱包括随时间增加的脉冲频率。
48.项38的方法，其中所述增加的脉冲频率历时几天到几周增加。
49.项38的方法，其中所述增加的脉冲频率随着时间推移频率加倍。
50.项38的方法，其中所述增加的脉冲频率从0.75Hz增加到2Hz。
51.项38的方法，其中，通过力-频率关系来确定成熟度，并且其中，成熟心肌细胞群以正性力-频率关系来表征，而未成熟心肌细胞群以负性力-频率关系来表征，其中，所述方法进一步包括对两个心肌细胞群进行电监测以确定搏动幅度。
52.项51的方法，其中电监测选自下组：细胞-基底阻抗监测、细胞外记录、细胞-基底阻抗监测与细胞外记录。
53.一种用于未成熟心肌细胞的功能成熟的系统，所述系统包括：
a)电子脉冲发生器，其被配置为按照诱导未成熟心肌细胞成熟的脉冲谱来输送电子脉冲；
b)装置站，其被配置为与细胞培养装置衔接，并将电子脉冲从脉冲发生器输送至衔接的细胞培养装置；
c)细胞培养装置，其包括被配置为培养细胞的基底，每种基底包括可被装置站在衔接时寻址的电极阵列；和
d)用于对培养细胞进行电监测的模块。
54.项53的系统，其中脉冲发生器输送电子脉冲，所述电子脉冲包括作为矩形形状的脉冲形状。
55.项53的系统，其中脉冲发生器输送0.7V至1V的强度。
56.项53的系统，其中脉冲发生器输送从0.1毫秒到0.2毫秒的脉冲持续时间。
57.项53的系统，其中装置站包括接口，所述接口包括多个电触头的和能够独立地将电子脉冲输送到每个电触点的开关。
58.项53的系统，其中装置站被配置为多孔板，任选多个多孔板。
59.项53的系统，其中电子脉冲发生器和装置站被配置为将脉冲同时输送到多孔板的多于一个孔。
60.项53的系统，其中电子脉冲发生器和装置站被配置为将脉冲同时输送到多孔板的所有孔。
61.项53的系统，其中电子脉冲发生器和装置站被配置为将脉冲同时输送到多于一个多孔板。
62.项53的系统，其中电子脉冲发生器和装置站被配置为将不同的脉冲谱输送到多孔板的不同的孔。
63.项53的系统，其中装置站被配置为衔接一个或多个细胞培养瓶。
64.项53的系统，其中细胞培养装置是烧瓶。
65.项53的系统，其中培养装置是多孔板，任选地选自6孔板、48孔板和96孔板。
66.项53的系统，其中细胞培养装置包括基底上的未成熟心肌细胞。
67.项66的系统，其中未成熟心肌细胞衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。
68.项53的系统，其中用于对培养细胞进行电监测的模块包括可操作连接的阻抗分析器，用于监测该细胞培养装置中培养的细胞群的细胞-基底阻抗。
69.项53的系统，用于对培养细胞进行电监测的模块包括可操作连接的细胞外记录放大器，用于对该细胞培养装置中培养的细胞群进行细胞外记录。
70.项53的系统，其中所述系统测量心肌细胞的搏动幅度，确定心肌细胞的搏动力-频率关系，并报告成熟或不成熟状态，其中，如果所述力-频率关系为正，则报告成熟状态，如果所述力-频率关系为负，则报告未成熟状态。
附图简述
图1描绘了示例性系统100，其用于诱导和监测iPSC和ESC衍生的心肌细胞的功能成熟，并且用于筛选变力性和变时性化合物以及影响未成熟心肌细胞成熟的化合物，描绘了基本单元110，其容纳电子脉冲发生器模块110A、集成的阻抗分析器模块110B和细胞外记录放大器模块110C；以电子多孔板站方式实现的装置站120和以电子板方式实现的细胞培养装置130。
图2A描绘了电极配置的示意图，其中两个记录电极12A各自的直径为100μm；两个记录电极12A之间的距离为2.98mm；“线上圆”(circle-on-line)电极元件19A中的圆形的直径为90μm，两个相邻的线上圆电极元件19A之间的中心距为110μm；两个共享的阻抗/电刺激电极16A、18A之间、且覆盖记录电极12A的间隙为约290μm。电极12A、14A、16A、18A中的每一者经由电迹线26A连接至连接垫24A。
图2B描绘了电极配置的示意图，其中每个电极阵列10B包括两个圆环形的细胞外记录电极12B和单个单一性参考电极14B。电极结构16B、18B通过电子开关切换用于进行电脉冲和监测细胞阻抗二者(尽管在不同的时间点)。在这个示例性实施方案中，每个记录电极12B的直径为60μm；两个记录电极12B之间的距离为2mm；线上圆电极元件19B中的圆形的直径为90μm，两个相邻的线上圆电极元件19B之间的中心距为110μm；位于两个阻抗电极结构16B、18B之间且覆盖记录电极12B的间隙为约290μm。
图2C描绘了电极配置的示意图，其中每个电极阵列10C被配置在与单个孔相关联的非导电基底上。电极阵列10C包括圆环形细胞外记录电极12C和单一性一体式(unitaryone-piece)参考电极14C。电极结构16C、18C通过电子开关切换在不同的时间点执行细胞的阻抗测量和电脉冲。在这个实例中，多个“圆线上圆”(circle-on-circular line)电极元件19C形成叉指电极结构16C、18C。在这个示例性实施方案中，记录电极12C的直径为80μm；两个记录电极12C之间的距离为1.44mm；线上圆电极元件19C中的圆的直径为90μm，两个相邻的线上圆电极元件19C之间的中心距为110μm。
图2D描绘了一幅示意图，其中电极阵列10D包括两个圆环形细胞外记录电极12D和单个单一性参考电极14D。电极结构16D、18D用于细胞阻抗监测。电极结构20D、22D用于电脉冲和细胞阻抗监测。在这个示例性实施方案中，每个记录电极12D的直径为60μm；两个记录电极12D之间的距离为2mm；线上圆电极元件19D中的圆的直径为90μm，两个相邻的线上圆电极元件19D之间的中心距为110μm；位于两个阻抗电极结构16D、22D之间且覆盖记录电极12D的间隙为约290μm。
图3是描绘具有成熟或成体样表型的心肌细胞的搏动周期的曲线图。
图4是显示在起搏之前、以1Hz起搏之后、以1.5Hz起搏之后以及以2Hz起搏之后连续记录6秒的脉冲设置和搏动活动的相应屏幕截图的表。
图5是将电起搏的心肌细胞与自发搏动的心肌细胞的搏动幅度与搏动频率进行比较的曲线图，其显示搏动幅度(搏动力)随着电起搏频率的增加而增加。在此，力-频率关系在起搏的细胞中增强，而在自发搏动的细胞中减弱。
图6的一系列曲线图显示与自发搏动的心肌细胞相比，iPSC成熟的心肌细胞的搏动速率响应于施用异丙肾上腺素的反应性改善。
图7的一系列曲线图显示与自发搏动的心肌细胞相比，iPSC成熟的心肌细胞的搏动速率响应于施用米力农的反应性改善。
图8是显示以代表性浓度起搏之后定量正性肌力化合物对功能成熟的iCell心肌细胞的收缩活性的作用的汇总表。数据呈现为均值±SD。(N＝5)。
优选实施方案详述
本发明涉及培养未成熟心肌细胞、使其电起搏并监测其成熟为具有成体样表型的细胞的系统和方法。具体而言，上述的系统和方法能够诱导iPSC衍生的心肌细胞和胚胎干细胞(ESC)衍生的心肌细胞并以电监测其功能成熟。此外，所述系统和方法提供了用于测试影响心肌细胞成熟过程的变力性化合物、变时性化合物和测试化合物的新方法。
A.用于细胞电起搏和电测量的系统
本文所述系统的一个核心优势是它们能够以电方式诱导胚胎干细胞衍生的心肌细胞和iPSC衍生的心肌细胞进一步成熟。优选的系统将基于电极的监测系统与电刺激系统配对，以提供关于成熟细胞群响应于电刺激的功能表型的即时反馈。在优选的方法中，所述系统包括用于诱导分化的电刺激，同时提供对成熟心肌细胞的高分辨率的平行的基于阻抗的监测和/或平行的基于细胞外记录的监测，从而填补了体外监测心肌细胞成熟的重大技术空白。
参考图1-2D，用于使未成熟心肌细胞功能成熟的系统100包括：电子脉冲发生器110A，其被配置为按照诱导未成熟心肌细胞成熟的脉冲谱来输送电子脉冲；装置站120，其被配置为衔接细胞培养装置130并将电子脉冲从脉冲发生器110A输送至衔接的细胞培养装置130；细胞培养装置130，其具有被配置用于培养细胞的基底，每个基底具有在装置站120衔接时可被其寻址的电极阵列10A-D；和用于培养细胞电监测的模块110B、110C。
脉冲发生器110A生成电子脉冲并将其输送到装置站120，在装置站它们被按路线发送到在细胞培养装置130中培养的细胞群，以使未成熟心肌细胞电起搏。生成和输送的脉冲本身可以具有任何期望的可诱导成熟的波形，但在优选实施方案中，脉冲发生器110A以矩形波形的形式生成和输送脉冲。脉冲发生器110A还能够生成其他波形，比如正弦波形、三角波形和/或锯齿波形。脉冲持续时间或脉冲宽度也可以根据需要变化，但通常在约0.1毫秒至约10毫秒之间，但更通常为0.1毫秒至0.2毫秒。在iPSC成熟中特别有用的电压的非限制性实例可以高达约3伏、2伏，但更典型的是0.7V至1V。
脉冲发生器110A是可编程的，使得它能够选择性地向每个孔内的每个电极阵列10A-D输送电刺激脉冲而独立于其他孔中的其他电极阵列10A-D，并且使得它能够根据需要同时向每个电极阵列10A-D输送脉冲。可以通过插入原始脉冲参数或通过预编程的可选选项来执行用户编程，其中用户定义一个或多个脉冲谱，并将一个或多个脉冲谱分配给装置130的一个或多个孔。如本文中使用的，“脉冲谱”是指在一段脉冲持续时间(或宽度)上以一定的脉冲强度(或电压)和一定的脉冲频率脉冲的电流。脉冲谱可以由用户编程或可以预先编程。为此，在一些实施方案中，编程或预编程多个脉冲谱或脉冲子谱用于串联运行，其中一系列脉冲子谱保持相同的波形和电压，但脉冲频率增加。作为非限制性实例，脉冲谱可以是这样的系列：约1Hz的第一脉冲子谱，然后是具有约1.5Hz频率的第二脉冲子谱，然后是具有约2Hz频率的第三脉冲子谱。此外，可以编程或预编程该系列，以便在一段预定的时间内(例如但不限于每脉冲子谱一周)内执行所述谱。
用户可编程特性是特别有用的，因为如本文中证明的，使iPSC起搏，诱导其成熟为具有更类似成体的表型的心肌细胞的典型实验，可能需要花费约三周以上的时间，这限制了对装置站的访问。通过提供用户可编程特性，可以用同一电子脉冲发生器110A和装置站120于跨多个细胞培养装置130为多个用户执行多个实验。或者，可能希望令脉冲谱在同一个多孔装置130的各孔之间变化，来研究脉冲本身的作用，以便例如在测试化合物(如被认为驱动成熟的化合物)存在下进一步调节成熟。
在一个相关实施方案中，脉冲发生器110A预编程有指令，以评估未成熟心肌细胞或iPSC到心肌细胞的成熟，并根据该评估进行脉冲编程。也就是说，系统100可以配备有根据电测量的成熟来调整心肌细胞起搏的反馈回路。在这样的实施方案中，脉冲发生器110A加载有一个或多个指示成熟的搏动参数(例如，力-频率关系的替代指标)，用于与根据在成熟过程中获取的实时测量值计算的参数进行比较，并且脉冲谱相应地受到调整。也就是说，通过形成指示成熟的控制搏动参数和用于进一步成熟的相应脉冲谱的数据库，系统100能够自动评估成熟的阶段，并根据该数据库调节心肌细胞的起搏进一步使细胞群成熟或示意(signal)成熟过程完成。
监测未成熟心肌细胞或iPSC到成熟心肌细胞的成熟是通过监测经历进一步成熟的细胞的兴奋-收缩偶联来进行的。兴奋-收缩偶联(ECC)这一术语用于描述将电刺激转换为机械反应的生理过程。该过程是肌肉生理学的基础，其中电刺激可以是动作电位，机械反应是收缩的形式。心肌细胞中的兴奋-收缩偶联通常称为搏动。也就是说，心肌细胞搏动本身对应于细胞的兴奋-收缩偶联。
发现心肌细胞群的搏动谱(特别是其搏动力-频率关系)是其表型的准确预测指标，这是因为早期未成熟心肌细胞和iPSC倾向于以不规则的频率搏动，并且随着同步搏动频率由于电刺激而增加，搏动幅度或力趋于减小。为此，脉冲发生器包括硬件和软件，或被偶联到具有适合的硬件和软件的单元，以评估培养中的细胞群的兴奋-收缩偶联或搏动，并可以确定力-频率关系。
可以利用细胞-基底阻抗、对细胞的细胞外记录、通过细胞-基底阻抗和细胞外记录的组合、或通过光学系统(比如共振波导或共振波导光栅传感器)，来执行细胞的兴奋-收缩偶联监测。因此，容纳脉冲发生器110A的中央基座110还可包括阻抗分析器功能性、细胞外记录功能性或共振波导功能性中的一项或多项。这样的功能性可以借助于将所需的硬件和软件集成到脉冲发生器中，或者可以借助于将脉冲发生器110A与单独的阻抗分析器110B、细胞外记录放大器110C、光学或共振波导系统通信偶联。最优选地，脉冲发生器110A被集成到单个基本单元110中，所述单个基本单元还至少包括用于分析细胞-基底阻抗的阻抗分析器110B。
细胞基底阻抗监测是一种用于监测活细胞的非侵入性方法。简要概述而言，将具有适当几何形状的微电极16A-D、18A-D制造到基底，如多孔板或类似装置130的底表面上，将微电极16A-D、18A-D暴露于板/装置130的内孔。将细胞引入孔中，使其接触并附着至电极表面。细胞附着的存在、不存在或变化影响电极传感器表面上的电子和离子通道。当细胞的生物学状态发生变化(比如形态变化)时，将自动实时测量模拟电子读出信号，并将其转换为用于处理和分析的数字信号。此外，在不同频率下的细胞-基底阻抗的监测可揭示细胞行为的差异。大体上说，较低频率下的细胞-基底阻抗的波动倾向于反映细胞下方或细胞之间的间距变化，而较高频率下的细胞-基底阻抗的波动倾向于反映电极的整个细胞覆盖范围的变化。
在xCELLigence RTCA系统中，阻抗测量值被转换为单个参数，称为“细胞指数”。基于测量的电极阻抗值自动得出并提供细胞指数。针对给定孔获得的细胞指数反映：1)有多少细胞附着至孔中的电极表面，以及2)细胞对孔中的电极表面附着得多好。因此，在相似生理条件下附着在电极表面上的相同类型的细胞越多，细胞指数就越大。类似地，电极表面的细胞附着越大(例如，更大的接触面积，通过更多细胞散布以具有更大的接触面积，或者细胞更紧密地附着于电极表面)，细胞指数就越大。
更进一步地，已经发现，将心肌细胞搏动的毫秒分辨率转换为基于阻抗的参数，例如细胞指数(CI)和/或细胞变化指数(CCI)，允许高度地解析与心肌细胞的成熟状态密切相关的力-频率关系。在US 7,470,533、US 7,560,269、US 8,026,080、US 8,263,375、US 9,612,234以及其他地方已详细论述了细胞指数(CI)和细胞变化指数(CCI)。这样，在优选实施方案中，脉冲发生器110A加载有或与计算机通信连接，所述软件或计算机被配置为通过适合的编程来计算多孔装置的一个或多个孔的一个或多个时间点的细胞指数(CI)。在一些优选实施方案中，所述软件还可以根据多孔装置的一个或多个孔的阻抗测量结果来计算细胞变化指数(CCI)。所述软件优选地可以生成随时间推移的基于阻抗的参数的作图，诸如但不限于选自阻抗测量值、CI或CCI的基于阻抗的曲线，其描绘搏动力和搏动频率。所述软件还可以执行其他分析，比如从CI计算细胞数，基于阻抗数据生成剂量反应曲线，基于阻抗值计算IC值，以及根据基于阻抗的参数和基于阻抗的曲线计算细胞兴奋周期的动力学参数。在US 9,612,234以及实施例I和II中可找到用于计算和比较搏动参数的方法的非限制性实例。
还可以至少部分地使用细胞的细胞外记录来测量兴奋-收缩偶联监测。在细胞外记录中，细胞外记录放大器110C与基底上的细胞外记录电极对12A-D、14A-D通信偶联，以允许放大和记录在记录电极12A-D和参考电极14A-D之间的电压信号。也就是说，将细胞外电压信号记录为记录电极12A-D和参考电极14A-D之间的电位差。由于在动作电位持续期间跨越细胞膜的不同离子通道的打开和/或关闭，导致穿过细胞培养基或溶液的离子电流或运动，结果在电极12A-D、14A-D上诱导了这样的电压。在US 9,612,234和US 2011/0039294中详细论述了心肌细胞群的细胞外记录。
系统100还包括装置站120，装置站120被配置为衔接一个或多个细胞培养装置130，从而可以将电子脉冲从脉冲发生器110A输送至细胞培养装置130而使心肌细胞起搏。装置站120还优选地被配置为放置在培养箱中，或者具有促进细胞生长和/或分化的温度和/或湿度控制器。在一些实施方案中，装置站120被配置为衔接以烧瓶方式实现的细胞培养装置130。在优选的实施方案中，装置站120包括用于定位一个或多个多孔装置130的一个或多个平台或一个或多个插槽。一个或多个平台或一个或多个插槽可以包括用于将装置130与装置站120电连接(例如通过连接垫24A的相互作用)的插座、插脚或其他导电结构。系统100可以被配置为足够便携，使得可以在电刺激、细胞外记录或阻抗监测期间将多孔装置130定位在组织培养箱中。
装置站120还可以包括用于连接至电子脉冲发生器的电子电路，并且可以包括电子开关，所述电子开关可以接通和断开与系统100中使用的多孔装置130内的每个电极阵列10A-D的连接。装置站120的开关可受到脉冲发生器110A内的软件程序的控制。
细胞培养装置130被配置为培养细胞以及输送和接收电信号。这通过提供具有适合的电极传感器10A-D的室状壳体来实现。传感器10A-D被配置为将电脉冲输送到培养的细胞，并且被配置为通过细胞-基底阻抗测量和/或对细胞的细胞外记录来检测搏动频率和幅度的变化。在图2A-D中说明了这样的配置的实例。
优选地，装置130包括两个或更多个孔；不过同样，装置130可具有特定实验所需的任何数目的孔。例如，所述装置可以具有1个孔、2个孔、3个孔、6个孔、8个孔、12个孔、24个孔、36个孔、96个孔、384个孔等。优选地，孔的直径在孔的底部(布置在基底上的端部)为约1毫米至约20毫米，更优选为约2毫米至约8毫米。孔可以具有均匀的直径，或者可以朝向底部逐渐变细，使得在与基部基底接触的端部处的孔的直径小于相对端的直径。
基底的表面适于细胞附着和细胞生长。优选地，非导电基底是平面的，并且是平坦的或近似平坦的。基底可以由本领域已知的各种非导电材料构成，包括但不限于硅上的二氧化硅、绝缘体上硅(SOI)晶片、玻璃(例如石英玻璃、铅玻璃或硼硅酸玻璃)、蓝宝石、陶瓷、聚合物、玻璃纤维、塑料，例如聚酰亚胺(例如Kapton，DuPont提供的聚酰亚胺薄膜)、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚酯、聚丙烯和尿素树脂。优选地，所述基底与可兴奋细胞如iPSC和心肌细胞是生物相容的；然而，非生物相容性材料通过应用具有适合材料例如生物相容性聚合物或其他材料的生物相容性或生物分子涂层，可以变成生物相容性。
基底可以是刚性的，但在其他实施方案中，基底具有1kPa至50kPa、5kPa至15kPa、8kPa至12kPa或10kPa的弹性模量，接近天然心肌的刚度。这样的基底可以按照Jacot等人(2008)的教导来形成，例如，通过在玻璃盖玻片上使3％-7％的丙烯酰胺溶液聚合，然后用通过异双功能交联剂N-磺基琥珀酰亚胺基-6-[4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基]己酸酯(磺基-SANPAH，PierceBiotechnology,Rockville,IL)结合的0.5mg/mL的胶原蛋白涂覆凝胶。拉伸弹性模量可以通过在15mm厚的凝胶圆柱体上悬挂砝码求出的应力-应变曲线，计算该曲线的斜率来测量。Jacot等人(2008)。
在一些实施方案中，基底包括至少一个改善心肌细胞排列的图案化小岛(patterned island)。作为非限制性实例，可如下所述使基底图案化：添加聚合物膜(比如掺杂有丙烯酰基-NHS的聚丙烯酰胺)，通过聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)将纤连蛋白压印到凝胶表面上，以形成共价结合的约50μm x 50μm的纤连蛋白小岛。在这样的实施方案中，可能优选的是用斥细胞性的丙烯酰胺分离出图案化小岛。可以在Werley等人(2017)中找到有关图案化小岛的进一步指导。
为了提高生产效率，可以将本发明的电极12A-D、14A-D、16A-D、18A-D、20D、22D施加到基底上，然后将施加到基底上的电极12A-D、14A-D、16A-D、18A-D、20D、22D与无底孔(bottomless wells)的板接合，或者可以将所述电极施加到已经具有所述基底作为底部的孔。电极12A-D、14A-D、16A-D、18A-D、20D、22D可以由较大的导电金属片形成、例如经由金属膜的激光烧蚀而形成，并且可以直接施加到基底上。或者，可使用印刷技术(例如类似于喷墨印刷的印刷技术)将电极12A-D、14A-D、16A-D、18A-D、20D、22D印刷在基底上，其中将具有紫外线(UV)可固化单体、聚合物或化合物的导电流体印刷在基底上，然后施加光源以固化所施加的导电流体而形成电极。技术人员将理解，可以将导电材料直接施加到平面基底上，或者可以将导电材料插入到在基底表面中激光烧蚀或形成的凹槽中。可以在基底和电极之间或在电极上应用胶(例如UV固化胶)以增加安全性。此外，当施加导电流体时，可能优选在施加流体之前应用掩模，以进一步限定电极区域。
电极传感器10A-D为电极阵列，其被配置为将电脉冲输送到基底上的细胞并且被配置为监测细胞的搏动。监测搏动利用细胞基底阻抗监测和/或细胞的细胞外记录来进行。适合的电极12A-D、14A-D、16A-D、18A-D、20D、22D配置的实例在图2A-2D中示出。
在一些实施方案中，所述装置包括用于每个功能的单独的电极。例如，在一些实施方案中，所述装置包括用于电刺激细胞的电极、用于监测附着于基底的细胞的细胞基底阻抗的不同电极、以及还有用于细胞的细胞外记录的不同电极。在其他实施方案中，电极在不同的功能对之间共享。举例而言，一对电刺激电极中的一个电极与另一个电极共享而作为细胞-基底阻抗监测电极对发挥功能，或者与另一个电极共享而作为细胞外记录电极对发挥功能。
在其他实施方案中，同一对电极执行两种不同的功能。举例而言，当不测量阻抗时，一对细胞-基底阻抗监测电极可用于电刺激。
优选地，所述装置的每个孔内的电极12A-D、14A-D、16A-D、18A-D、20D、22D被单独寻址，这意味着阵列的电迹线26A和连接垫24A被配置为使得每个阵列可以独立地与装置站120和电子脉冲发生器110A连接，使得每个电极对的操作可以独立于其他电极孔中的其他电极对。这允许根据需要对装置130内的每个孔独立地进行监测和电刺激。
用于将电极12A-D、14A-D、16A-D、18A-D、20D、22D各自连接到对应的连接垫24A的导电材料的电迹线26A可以由任何导电材料制成。迹线26A可以位于基底的表面，并且可任选地被绝缘层覆盖。或者，可以将迹线布置在基底的第二平面中。
现在来看细胞-基底阻抗监测电极对16A-D、18A-D，每对包括两个或更多个电极结构，所述电极结构被构造成具有这样的尺寸和间距，使得它们在与阻抗分析器连接时，能够作为一个单元而运作，在阻抗电极结构周围的空间区域中产生电场。在优选实施方案中，阻抗电极对16A-D、18A-D包括两个阻抗测量电极结构，每个阻抗测量电极结构包括从电极结构分支的多个电极元件19A或子结构。在优选实施方案中，每对中的电极结构具有基本相同的表面积。
利用形成阻抗监测电极对16A-D、18A-D的电极元件19A以及在给定对中的电极16A-D、18A-D与电极总线之间的间隙的优选布置，所有细胞(无论它们在哪里落下并附着在阻抗测量电极对上)都能够为测得的该电极对的总阻抗变化做出相似的贡献。因此，当将测量电压施加到任意给定的阻抗测量电极对16A-D、18A-D时，期望在阻抗测量电极对16A-D、18A-D内的任何两个位置具有相似的电场强度。在该电极对的任何给定位置处，场强与该电极对的第一电极结构上的最近点和该电极对的第二电极结构上的最近点之间的电位差相关。因此，期望在给定的电极对的全部电极元件19A和全部电极总线上具有相似的电位降。基于这个要求，最好在整个电极对上具有近似均匀的电极电阻分布，其中在感兴趣位置处的电极电阻等于第一电极结构上的最近点(即第一电极结构上最接近感兴趣位置的点)和连接到第一电极结构的第一连接垫之间的电极电阻与第二电极结构上的最近点(即第二电极结构上最接近感兴趣位置的点)和连接到第二电极结构的第二连接垫之间的电极电阻之和。
在整个阻抗测量电极对16A-D、18A-D上大致均匀的分布，可以例如这样来实现：具有特定间距和尺寸(长度、宽度、厚度和几何形状)的电极结构和电极总线，使得电极对上的任何单个位置处的电阻大致等于该电极对上的任何其他单个位置处的电阻。在大多数实施方案中，给定电极对的电极元件(或电极结构)将具有均匀的间距，并且具有相似的厚度和宽度，给定电极对的电极总线将具有相似的厚度和宽度，并且从给定的电极对引至连接垫24A的电极迹线26A将具有非常相似的厚度和宽度。因此，在这些优选实施方案中，电极结构对被如此设计，使得电极元件或结构的长度和几何形状、电极迹线的长度和几何形状以及总线的长度和几何形状为该电极对全体上近似均匀的电极电阻分布提供条件。
当整合具有两个或更多个孔的配置时，不同孔的电极阵列10A-D之间的阻抗测量电极16A-D、18A-D可以通过连接到完全分离的连接垫24A而彼此完全独立，也可以共享共有的连接垫24A。例如，第一孔的阻抗测量电极结构中的一个可以连接到连接垫24A，该连接垫也连接到另一孔的阻抗测量电极结构。
接下来讨论细胞外记录电极12A-D、14A-D，一般而言，细胞外记录通过放大和记录记录电极(一或多个)12A-D和参考电极(一或多个)14A-D之间的电压信号来进行。为了提高记录的电压信号的一致性和再现性，期望尽可能减小任何来自参考电极14A-D的电信号对记录的电压信号的贡献，并确保大部分(即使不是全部)的记录电压信号来源于记录电极12A-D。因此，通常，参考电极14A-D具有小的电极阻抗是理想的，而且是得到承认的。小的电极阻抗可以通过使用具有大的有效表面积的参考电极14A-D来实现：将参考电极14A-D的表面积与记录电极12A-D的表面积之比增加至一百倍甚至数千倍。
参考电极14A-D通常可以是单一性的或不分支的电极，并且可以具有简单的几何形状，比如圆形、正方形或其他形状。在其他实施方案中，参考电极14A-D具有分支的构型，这可以使得参考电极表面变大。在一些实施方案中，参考电极14A-D的表面积与记录电极12A-D的表面积之比大于2。在其他实施方案中，参考电极14A-D的表面积与记录电极12A-D的表面积之比为10或大于10。在其他实施方案中，参考电极14A-D的表面积与记录电极12A-D的表面积之比为100或大于100。在其他实施方案中，参考电极14A-D的表面积与记录电极12A-D的表面积之比为1000或大于1000。在其他实施方案中，参考电极14A-D的表面积与记录电极12A-D的表面积之比为10,000或大于10,000。
在一些实施方案中，装置130同时测量阻抗且执行细胞外记录。然而，某些些装置130并不同时执行的阻抗监测和细胞外记录，而是在阻抗测量电极对与细胞外记录电极对之间共享一个或两个电极。当使用具有多个电极元件的叉指电极结构形式的阻抗电极时，通常将共享的电极用作细胞外记录电极对中的参考电极。这种做法当阻抗监测电极的表面积比记录电极的表面积大到足以充当参考电极时可以实现。技术人员将理解，通过将叉指阻抗电极对从阻抗监测电切换为执行单个参考电极功能，将大大增加复合叉指电极与记录电极的表面积比，因此在一些情况下可能是优选的。此外，当参考电极足够大于阻抗测量电极时，也可以将阻抗测量电极用作记录电极，但这不是优选的。虽然不是优选的，但是当使用具有小的工作电极和大的对电极的阻抗测量电极配置时，更有可能使用这种方法，如本领域先前所详述的。B.使用电刺激使衍生自多能干细胞(iPSC)的未成熟心肌细胞功能成熟
已显示iPSC心肌细胞经常表现出不成熟或胚胎表型，如通过基因表达分析、结构研究和功能研究证明的。iPSC心肌细胞未成熟表型的标志之一是负性力-频率关系，其中增加的搏动速率并不增加幅度或搏动力。相反，如图5所示，幅度或搏动力趋于减小或变弱。为此，本发明提供了监测这种力-频率关系的方法，并将其与开发用于诱导iPSC衍生的心肌细胞和ESC衍生的心肌细胞进一步成熟为具有更成熟或更类似成体表型的心肌细胞的方法配合。具体而言，本文中的系统和方法不仅诱导iPSC和ESC衍生的心肌细胞功能成熟，而且通过测量搏动幅度和计算力-频率关系而电监测成熟。结果是产生一群以正性力-频率关系作出适当反应的功能成熟的心肌细胞，这些细胞随后可用于后续的变力性和变时性化合物测试或成熟过程研究。
鉴于以上所述，提供了一种使功能未成熟心肌细胞成熟的方法，所述方法包括：提供一种优选地具有电极传感器阵列的系，该系统被配置为培养搏动细胞、使搏动细胞电起搏并监测搏动细胞的搏动；在所述系统中培养未成熟心肌细胞；监测未成熟心肌细胞，以将心肌细胞搏动表征为同步或不同步；并且，如果是同步的，则按照脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到未成熟心肌细胞成熟为功能上的成体心肌细胞时为止。
如同上述系统100并简要参考图1-2D，阻抗监测电极阵列16A-D、18A-D可以定位在基底上并且可与阻抗分析器110B可操作连接，以监测在系统100中培养的细胞群的细胞-基底阻抗。或者，细胞外记录电极阵列12A-D、14A-D可与细胞外记录放大器110C可操作连接，以对系统中培养的细胞群进行细胞外记录。更进一步地，系统100可以包括基底上的阻抗监测电极阵列16A-D、18A-D，基底上的细胞外记录电极阵列12A-D、14A-D，阻抗分析器110B和细胞外记录放大器110C，其中系统100被配置为监测细胞-基底阻抗并进行系统100中培养的细胞群的细胞外记录。
作为非限制性实例，所述方法可以使用如图1描绘的xCELLigence RTCACardioECR系统(ACEA Biosciences,Inc.San Diego,CA)通过如下方式来实施：以适当的密度将iPSC衍生的心肌细胞接种到CardioECR平板(E-Plate CardioECR 48)的孔中；允许细胞附着、生长并实现自发搏动节律，同时使用CardioECR系统连续监测自发搏动活动；然后在接种后4周过程中在观察到心肌细胞单层的自发同步搏动之后对iPSC衍生的心肌细胞进行定向电起搏，同时连续监测搏动活动。
技术人员将理解，所述方法可用于使各种心肌细胞前体细胞分化。具体而言，所述方法可用于使已经部分地分化为未成熟心肌细胞的iPSC或ESC进一步分化。从概念上讲，ESC到终末分化的心肌细胞的分化与iPSC并无区别。两者的分化都依赖于引导体内胚胎发育的调节信号通路(激活素/节、TGFβ、GSK3、Wnt、BMP等)，并遵循相同的一般程序。Moran等人(2010)。分化7天后，衍生自PSC的心肌细胞即可开始收缩。Moran等人(2010)。但是，如前文已经暗示的，这样的PSC具有未成熟表型。与成熟心肌细胞相比，未成熟心肌细胞趋于在基因表达谱方面不同，并且在动作电位谱方面不同。Moran等人(2010)。因此，可以通过基因表达分析或者更优选地使用本文所述的电监测方法来确定心肌细胞是否未成熟。具体而言，可利用细胞-基底阻抗监测和/或细胞外记录来评估搏动频率、收缩性、搏动幅度和动作电位。此外，然后可以通过比较递增的搏动频率(通过起搏诱导)下的搏动幅度来评价力-频率关系。搏动幅度随频率增加的增加指示成熟心肌细胞；而搏动幅度随频率增加的减小指示未成熟心肌细胞。这样，可以通过在增加搏动频率的同时测定搏动幅度来对心肌细胞进行电测试，以确定它们是具有成体表型还是具有未成熟表型。可以在整个成熟过程的不同时段执行此测试，以评估成熟度或作为调整脉冲频率的反馈。
需要补充说明的是，所述方法不限于任何特定物种，但这些方法最常使用的细胞来自最终被诊断或用治疗剂治疗的同一物种。为此，当进行可能引向人体治疗如心脏病的治疗的测定时，最常使用人iPSC。当进行兽医学研究时，最常使用来自将被诊断或治疗的同一物种的iPSC或ESC。更进一步地，当目的是诊断或治疗人类患者时，iPSC最优选地来自从待治疗或诊断的同一位患者收集的细胞。
本发明方法进一步的可取之处在于不需要特殊的细胞培养基。可以使用常规的细胞培养基。然而，所述系统也可以结合使用除了促进电起搏之外还能进一步促进成熟的专用培养基。
虽然所述的方法是备用于未成熟心肌细胞的进一步分化，但初始分化程序也可以在细胞培养装置上进行，并进行电监测。另外，也可以将用于使iPSC分化为成熟心肌细胞的涂层应用于细胞培养装置，并进行相应的程序。
更进一步地，在一些实施方案中，通过将未成熟心肌细胞排列在图案化基底上来进行未成熟心肌细胞的成熟。作为非限制性实例，在由斥细胞性的裸(bare)聚丙烯酰胺分隔的纤连蛋白图案化小岛上培养心肌细胞显示出改善自发搏动。Werley等人(2017)。这样，本文中的方法可包括在图案化基底上培养未成熟心肌细胞，所述图案化基底例如但不限于如Werley等人教导或提议的纤连蛋白图案，外加用于脉冲心肌细胞及其电监测的电极。也就是说，可以对iPSC成熟装置加以图案化，用于进一步驱动成熟。
在一些实施方案中，在具有接近天然心肌刚度的1kPa至50kPa、5kPa至15kPa、8kPa至12kPa或10kPa的弹性模量的基底上培养未成熟心肌细胞。这样的基底可以遵循Jacot等人(2008)的教导来形成，外加用于脉冲心肌细胞及其电监测的电极。也就是说，iPSC成熟装置可以具有模拟心肌的弹性模量。
在一些实施方案中，在血管样网络的存在下培养未成熟心肌细胞。作为非限制性实例，将未成熟心肌细胞接种在内皮细胞(EC)的血管网络上。血管EC产生多种自分泌和旁分泌因子，包括VEGF、血管生成素和一氧化氮，这些因子影响心肌细胞的代谢、生长、收缩性和节律性。Brustaert(2003)。在其他实施方案中，将未成熟心肌细胞接种在成纤维细胞的血管网络上。在其他实施方案中，将未成熟心肌细胞接种在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人脂肪基底细胞(hASC)的血管网络上。脂肪基底细胞(hASC)已显示可产生大量血管生成因子和细胞因子，包括VEGF、肝细胞生长因子和血管生成素。在其他实施方案中，将未成熟心肌细胞接种在HUVEC和人包皮成纤维细胞的血管网络上。已证明上述每一者对于培养心肌细胞都是有益的。Vourenpaa等人。每一者都可与本文中的方法和系统一起使用。
回头来看确定搏动是否同步的未成熟心肌细胞的电监测，优选在未成熟心肌细胞进一步分化为成熟心肌细胞的脉冲谱执行之前，细胞的搏动是同步的。电监测可包括监测未成熟心肌细胞的细胞-基底阻抗、未成熟心肌细胞的细胞外记录，或这两者。更优选地，通过细胞-基底阻抗监测获得搏动参数(无论是原始阻抗值还是细胞指数)，然后随时间进行比较，从而确定搏动是否同步。具体而言，通过确定搏动速率(也称为“搏动频率”)，并随时间比较搏动速率，来确定搏动是否同步。也就是说，搏动不同步的群体将不会生成连续且可再现的基于阻抗的曲线。搏动培养物也不会产生可再现的搏动峰(图3描绘了一系列的搏动峰)。相反，曲线会移位或缺乏精细度(refinement)。监测搏动一直到同步为止，其通常历时约4天到几周。
已经发现，通过使未成熟心肌细胞电起搏可以更快实现同步搏动。也就是说，如果心肌细胞搏动不同步，则所述方法还可包括使未成熟心肌细胞电起搏，直到心肌细胞搏动同步时为止。与用于分化的脉冲谱相比，使心肌细胞电起搏以使搏动同步通常保持较慢的脉冲频率。也就是说，可以使未成熟心肌细胞缓慢但稳定地起搏，一直到搏动同步时为止。通常，在恒定频率下起搏。最优选地，起搏与培养中的未成熟心肌细胞的搏动速率的步调相同。该频率通常为约0.5Hz至约1Hz，但也可以较慢，比如0.5Hz、0.1Hz、0.2Hz、0.3Hz或0.4Hz。患病的基因型/表型可具有慢的搏动速率(例如0.5Hz-0.5Hz)。
一旦搏动同步化，所述方法包括将脉冲谱电输送至未成熟心肌细胞，从而诱导进一步分化。也就是说，使用适当选择的脉冲强度或幅度，以一定的脉冲频率起搏或刺激未成熟心肌细胞，以驱动成熟。脉冲强度应该高至足以使心肌细胞起搏(即，每个施加的脉冲都会导致孔中的心肌细胞的一个搏动周期)。另一方面，脉冲强度或幅度应该在一定范围内，因为非常高的场强可能对心肌细胞产生不希望的作用。例如，当脉冲强度太高时，电极上可能发生水电解，导致细胞培养基中的局部pH值改变以及O2和/或H2鼓泡，从而对心肌细胞产生不希望的生理作用。使心肌细胞在任何给定实验条件下有效起搏的确切脉冲强度范围也可依赖于装置的孔中使用的电极几何形状。例如，相邻电极之间具有较大间距的电极阵列将比具有较小间距的电极阵列需要更大的脉冲强度来实现相同的起搏效果。例如，相邻电极之间具有较大距离的电极几何形状可能需要高达几伏(例如3V)或甚至更高的大脉冲强度。
一种示例性的脉冲谱具有0.1毫秒至0.2毫秒的脉冲持续时间或宽度，其中高达10毫秒的持续时间是可接受的。应该使用适当选择的脉冲持续时间刺激心肌细胞或使心肌细胞起搏。在适当施加脉冲强度的情况下，脉冲持续时间应该足够长，以使心肌细胞起搏(即，每个施加的脉冲都会促成孔中的心肌细胞的一个搏动周期)。另一方面，脉冲持续时间不必太长，因为脉冲持续时间太长可能对心肌细胞产生不希望的作用。例如，当脉冲持续时间太长时，可能会对电极施加大的平均有效直流DC场偏置(例如，对于1Hz的700毫秒的脉冲持续时间，1V脉冲意味着施加到电极上的的DC电压为0.7V(＝1V*700毫秒*1Hz))，从而导致电极上发生水电解并引起细胞培养基中的局部pH值改变以及O2和/或H2鼓泡等不希望的作用，并且对心肌细胞产生不希望的生理作用。通常，施加的脉冲持续时间应该尽可能短，只要能引起心肌细胞的有效起搏即可(即每个施加的脉冲都会促成孔中的心肌细胞的一个搏动周期)。
最优选地，脉冲谱具有矩形脉冲形状以及约0.7V至1V(但也可以高达约2伏)的强度或电压。在其他实施方案中，电压高达3伏。在一些情况下，当起搏频率增加时，强度增加。脉冲持续时间或脉冲宽度通常为约0.1毫秒至0.2毫秒，但可以长达10毫秒，并且也可以随着起搏频率的增加而增加。
虽然脉冲强度和持续时间可以随时间增加，但是加速未成熟心肌细胞的分化被认为主要是由于增加细胞培养物的搏动速率所致，增加细胞培养物的搏动速率是通过增加电起搏来实现的。在实验中，发现随时间推移增加未成熟心肌细胞培养物的搏动速率可提高分化速率。为此，本文中证明，本来要花费数月至一年左右的时间的在几周内就可以完成。为此，未成熟心肌细胞的分化主要是通过施加具有变化的脉冲频率的脉冲谱使未成熟心肌细胞随时间推移起搏来完成的。
技术人员将理解，脉冲谱可以随未成熟心肌细胞的搏动速率而改变，还可以随所使用的未成熟心肌细胞分化为成熟心肌细胞的方法而改变。作为示例，脉冲谱开始时的频率通常以与未成熟心肌细胞的搏动速率一致或几乎一致，该频率可以变化。大多数情况下，脉冲谱将以较慢的脉冲频率开始，并且频率随时间推移而增加。这个初始较低的脉冲频率应该适当，使得心肌细胞可以跟上起搏脉冲(即，每个起搏脉冲都能够促成孔中的心肌细胞的一个搏动周期)。实验上，当随时间推移以约0.5Hz的增量逐步增加起搏直到达到2Hz的最终起搏频率时，可以更快地获得成体样或成熟的表型。当以相同的速率保持起搏频率一周，然后以每周约0.5Hz增加起搏，直到达到2Hz的起搏频率时，令人惊讶地实现了有益结果。然而，预期较短的时间(比如几天)将会和较长的持续时间(比如几周)一样都是可以接受的。
作为示例，开发了具有随时间推移在0.5Hz和2Hz之间变化的脉冲频率的脉冲谱。作为另一示例，脉冲谱包括随时间推移在1Hz和2Hz之间变化的脉冲频率。作为另一示例，脉冲谱包括随着时间推移从0.75Hz增加到2Hz的脉冲频率。作为另一示例，某些基因型或表型(比如患病的基因型/表型)的心肌细胞可能需要较低的初始脉冲频率，例如0.5Hz或0.3Hz或甚至更低，以便使心肌细胞可以有效起搏。另一方面，脉冲频率可以随时间推移从最初的低脉冲频率增加到较高的脉冲频率，比如3Hz或甚至更高，这取决于将要使用这些正在接受起搏的心肌细胞的测定法的要求。技术人员将理解，增加脉冲频率之间的时间段也可以变化，但在一些实施方案中，增加脉冲频率的时程为2-6天。在其他实施方案中，增加脉冲频率的时程为1至5周。作为非限制性实例，当以0.75Hz脉冲1周，以1.5Hz再脉冲一周，以2Hz又脉冲一周时，未成熟心肌细胞可发生进一步分化。增加脉冲频率优选地为随时间推移频率加倍。可以通过定期测试搏动培养物的力-频率关系，确定力-频率关系是增强(指示成熟)还是减弱(指示未成熟)，来跟踪心肌细胞的成熟。具体而言，测试可以包括逐渐增加心肌细胞的起搏率并同时记录作为力的替代指标的搏动幅度。如果搏动幅度/电起搏率关系为负，则将心肌细胞视为未成熟；反之，如果幅度/电起搏率关系为正，则将心肌细胞视为“成熟”。
因此，诱导未成熟心肌细胞分化为具有成体表型的心肌细胞的脉冲谱可以包括通过施加具有在1Hz和2Hz之间的脉冲频率的脉冲谱使心肌细胞电起搏。最优选地，脉冲谱随时间推移增加脉冲频率。在实施方案中，在未成熟心肌细胞以小于1Hz的频率搏动的情况下，所施加的脉冲频率可以随时间推移而在频率方面加倍。脉冲未成熟心肌细胞直到获得正性力-频率关系时为止。具体而言，功能上成熟的心肌细胞具有正性力频率；而未成熟心肌细胞具有负性力-频率。
在一些实施方案中，将驱动心肌细胞成熟的化合物添加至未成熟心肌细胞以帮助驱动成熟。在一些实施方案中，将生长因子或生长激素添加至未成熟心肌细胞。在一些实施方案中，将血管生成因子添加至未成熟心肌细胞。在一些实施方案中，将血管生成素添加至未成熟心肌细胞。血管生成素是生长因子的一个家族，包括糖蛋白血管生成素1和2以及直向同源物4。在其他实施方案中，添加VEGF。
三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)是最优心脏生长必不可少的生长激素。Yang等人(2014)。Yang发现，T3处理未成熟心肌细胞增加了心肌细胞的大小，增加了肌节长度，降低了增殖，增加了收缩力产生，增强了钙处理特性，并且增加了最大线粒体呼吸能力。这样，当与电起搏偶联时，添加生长激素可以进一步加速成熟过程。
作为上文的进一步证明，实施例III描述了xCELLigence RTCA CardioECR系统在对iPSC心肌细胞慢性应用电起搏期间测量和监测搏动活动的动态变化的用途。然后在实施例IV中测试细胞以评估功能成熟，方法是通过在40分钟间隔内使细胞电起搏以确定细胞是否以正性力-频率关系作出反应。证实结果显示在图4-5中。
作为进一步的证实，实施例V提供了使用变力性化合物进行测试以确定被处理的细胞是否适当反应，其中“适当反应”的意义是，正性肌力化合物治疗将导致搏动幅度增加，而负性肌力化合物治疗将导致搏动幅度减小。结果描绘在图6A-B中。总的来说，暴露于异丙肾上腺素后，在自发搏动心肌细胞和慢性起搏的心肌细胞两者中都检测到搏动速率(B)的增加，而仅在起搏的细胞中观察到由搏动幅度(A)的增加所反映的正性肌力作用。数据表示为均值±SD(N＝5)
C.使用具有更类似成体的表型的iPSC衍生的心肌细胞或EC衍生的心肌细胞筛选变力和/或变时性化合物。
变力剂，或称变力药，是改变心脏收缩力的药物。变力药有两种：正性变力药和负性变力药。正性变力药增强心跳的力量，而负性变力药减弱心跳的力量。两种类型的变力药都用于治疗许多不同的心血管病症。因此，本发明提供了筛选用于潜在治疗用途的变力药的方法。
给予的变力药的种类取决于病症。正性变力药增强心脏的收缩，使得心脏可以以更少的心跳泵出更多的血液。通常将这种药物给予充血性心力衰竭或心肌病患者。也可将这些药物给予最近有心脏病发作的患者。在一些情况下，对心脏手术后心脏变弱的患者(在心源性休克的情况下)给予变力药。正性变力药的实例包括地高辛、胺碘酮(amidarone)、小檗碱、左西孟旦、奥美卡米夫(omecamitiv)、多巴胺、多巴酚丁胺、多培沙明、肾上腺素、异丙肾上腺素、血管紧张素(antiotension)。
相反，负性变力药减弱心脏的收缩并减慢心律。这些药物用于治疗高血压(血压升高)、慢性心力衰竭、异常心律(心律失常)和胸痛(心绞痛)。它们有时用于心脏病发作患者，以减轻心脏压力并防止将来心脏病发作。负性变力药的实例包括地尔硫卓、维拉帕米、氯维地平、奎尼丁、普鲁卡因胺、丙吡胺(dispryramide)和氟卡尼。
因此，与未成熟心肌细胞相比，使用具有更类似成体的表型的iPSC衍生的心肌细胞或ESC衍生的心肌细胞来筛选变力性化合物可能是一种重要的工具，并可提供更具再现性的结果。因此，本发明还提供了使用功能成熟的心肌细胞筛选潜在的变力性化合物的方法。一旦鉴定了化合物，可以给化合物提供适合于预期给药途径的药学上可接受的载体，并将其施用于有此需要的患者，比如患有充血性心力衰竭、心肌病、高血压(血压升高)、慢性心力衰竭、异常心律(心律失常)和/或胸痛(心绞痛)的患者。或者，药物可在心脏手术之后处方。
影响搏动速率的化合物称为变时性化合物或变时性药。正性变时药增加搏动速率，并且包括大多数肾上腺素能激动剂。这些药物包括阿托品、多巴胺、肾上腺素、异丙肾上腺素、米力农和茶碱。负性变时药降低搏动速率，并且包括β受体阻滞剂，比如美托洛尔、乙酰胆碱、地高辛、地尔硫卓和维拉帕米。
如本文中证明的，所述方法能够以高分辨率解析搏动力或幅度以及搏动频率。在实验上，本文中还证明了使用起搏方法分化的iPSC对心脏药物有反应。为此，提供了一种表征化合物对心肌细胞搏动的作用的方法，所述方法包括：提供具有电极传感器阵列的系统，其中所述系统被配置为培养搏动细胞、使搏动细胞电起搏和对搏动细胞进行电监测；在所述系统中培养未成熟心肌细胞；使用电脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到心肌细胞功能成熟时为止；向功能成熟的心肌细胞添加疑似对心肌细胞搏动力或心肌细胞搏动速率有作用的化合物；在添加化合物之前和之后进行培养心肌细胞的电监测；在添加化合物之前和之后确定至少一个表征搏动力或搏动速率的参数；并比较在添加化合物之前和之后确定的至少一个参数，由此鉴定响应于添加化合物的差异。根据该方法，如果在添加化合物之后搏动力增加，则该化合物可被表征为正性肌力化合物，或者如果在添加化合物之后搏动力降低，则该化合物可被表征为负性肌力化合物，并且/或者，如果在添加化合物之后搏动速率增加，则该化合物可被表征为正性变时性化合物，或者如果在添加化合物之后搏动速率降低，则该化合物可被表征为负性变时性化合物。
作为原理证明，在实施例VI中使用米力农进行了测定。如图7A-B所示，在暴露于正性肌力化合物米力农之后，自发搏动心肌细胞和慢性起搏的心肌细胞的搏动速率(B)都略有增加。然而，在电起搏的心肌细胞中，搏动幅度(A)显著增加。数据表示为均值±SD(N＝5)。
进行了进一步的分析以评估在施用一组另外的变力性化合物后，搏动力是否会增加。图8显示在使iPSC心肌细胞电起搏之前和之后施用一组变力性化合物之后的一组力频率展示。正性肌力化合物bayK和地高辛显示出具有正性肌力作用，而ISO具有正性变时作用。
如同上述系统所述，并简要参考图1-2D，电极阵列10A-D可包括定位在基底上并且与阻抗分析器110B可操作连接的阻抗监测电极阵列16A-D、18A-D，以监测在系统100中培养的细胞群的细胞-基底阻抗。或者，电极阵列10A-D可包括与细胞外记录放大器110C可操作连接的细胞外记录电极阵列12A-D、14A-D，以进行系统100中培养的细胞群的细胞外记录。更进一步地，系统100可以包括在基底上的阻抗监测电极阵列16A-D、18A-D，基底上的细胞外记录电极阵列12A-D、14A-D，阻抗分析器110B和细胞外记录放大器110C，其中系统100被配置为监测细胞-基底阻抗并进行系统100中培养的细胞群的细胞外记录。
作为非限制性实例，所述方法可以使用xCELLigence RTCA CardioECR系统(如图1所示)通过如下方式来实施：以适当的密度将iPSC心肌细胞接种到CardioECR平板(E-PlateCardioECR 48)的孔中；允许细胞附着、生长并实现自发搏动节律，同时使用CardioECR系统连续监测自发搏动活动；然后在观察到心肌细胞单层的自发同步搏动之后，在接种后4周的时间内对iPSC心肌细胞进行定向电起搏，同时连续监测搏动活动。
可以将疑似对功能成熟的心肌细胞的心肌细胞搏动力或心肌细胞搏动速率有作用的化合物直接添加到装置中，并随时间推移进行心肌细胞的电监测。优选地，在添加化合物之前和之后，对心肌细胞进行电监测。在一些实施方案中，将心肌细胞与未接受化合物的对照群体进行比较。然后确定至少一种表征搏动力或搏动速率的参数，并进行比较以鉴定添加化合物是否影响了该搏动参数。
需要补充说明的是，所述方法不限于任何特定物种，但这些方法最常使用的细胞来自最终被诊断或用治疗剂治疗的同一物种。为此，当进行可能引向人体治疗如心脏病的治疗的测定时，最常使用人iPSC。当进行兽医学研究时，最常使用来自将被诊断或治疗的同一物种的iPSC或ESC。更进一步地，当目的是诊断或治疗人类患者时，iPSC最优选地来自从待治疗或诊断的同一位患者收集的细胞。
虽然所述的方法是备用于未成熟心肌细胞的进一步分化，但初始分化程序也可以在细胞培养装置上进行，并进行电监测。另外，也可以将用于使iPSC分化为成熟心肌细胞的涂层应用于细胞培养装置，并进行相应的程序。。
在一些实施方案中，通过将未成熟心肌细胞排列在图案化基底上来进行未成熟心肌细胞的成熟。作为非限制性实例，在由斥细胞性的裸(bare)聚丙烯酰胺分隔的纤连蛋白图案化小岛上培养心肌细胞显示出改善自发搏动。Werley等人(2017)。这样，本文中的方法可包括在图案化基底上培养未成熟心肌细胞，所述图案化基底例如但不限于如Werley等人教导或提议的纤连蛋白图案，外加用于脉冲心肌细胞及其电监测的电极。也就是说，可以对iPSC成熟装置加以图案化，用于进一步驱动成熟。
在一些实施方案中，在具有接近天然心肌刚度的1kPa至50kPa、5kPa至15kPa、8kPa至12kPa或10kPa的弹性模量的基底上进行测定法。这样的基底可以遵循Jacot等人(2008)的教导来形成，外加用于脉冲心肌细胞及其电监测的电极。也就是说，iPSC成熟装置可以具有模拟心肌的弹性模量。
在一些实施方案中，在血管样网络的存在下进行测定法。作为非限制性实例，将未成熟心肌细胞接种在内皮细胞(EC)的血管网络上。血管EC产生多种自分泌和旁分泌因子，包括VEGF、血管生成素和一氧化氮，这些因子影响心肌细胞的代谢、生长、收缩性和节律性。Brustaert(2003)。在其他实施方案中，将未成熟心肌细胞接种在成纤维细胞的血管网络上。在其他实施方案中，将未成熟心肌细胞接种在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人脂肪基底细胞(hASC)的血管网络上。脂肪基底细胞(hASC)已显示产生大量血管生成因子和细胞因子，包括VEGF、肝细胞生长因子和血管生成素。在其他实施方案中，将未成熟心肌细胞接种在HUVEC和人包皮成纤维细胞的血管网络上。已表明上述每一者对于培养心肌细胞都是有益的。Vourenpaa等人(2004)。每一者都可与本文中的方法和系统一起使用。
优选地，对正在经历同步搏动的心肌细胞群进行起搏。可以使用未成熟心肌细胞的细胞-基底阻抗监测来获得搏动参数(无论是原始阻抗值还是细胞指数)，然后随时间进行比较，从而确定同步搏动。搏动不同步的群体将不生成连续且可再现的基于阻抗的曲线。搏动培养物也不会产生可再现的搏动峰。也就是说，这些曲线将不正确地相互重叠。相反，曲线会移位或缺乏精细度。为此，本文中提供的心肌细胞搏动分辨率足够高，使得足以确定心肌细胞搏动是否同步。本文中的系统通常达到40ms的分辨率，也可再现地达到20ms的分辨率。“40ms分辨率”或“20ms分辨率”意味着所述系统将进行彼此相隔40ms或20ms的连续测量。还包括10ms或1ms的更高分辨率。通常，在约20秒的时程内测量细胞群，在此期间，优选停止起搏。在没有电刺激的情况下实现同步搏动通常需要6天到2周。
已经发现，通过使未成熟心肌细胞电起搏可以更快实现同步搏动。也就是说，如果心肌细胞搏动不同步，则所述方法还可包括使未成熟心肌细胞电起搏，直到心肌细胞搏动同步时为止。与用于分化的脉冲谱相比，使心肌细胞电起搏以使搏动同步通常保持较慢的脉冲频率。也就是说，可以使未成熟心肌细胞缓慢但稳定地起搏，一直到搏动同步时为止。通常，在恒定频率下起搏。最优选地，起搏与培养中的未成熟心肌细胞的搏动速率的步调相同。该频率通常为约0.5Hz至约1Hz。在一些情况下(例如患病的基因型/表型)，该频率可为0.05Hz至0.5Hz。为实现同步搏动的起搏通常在几天之内存在。
使未成熟心肌细胞起搏包括将脉冲谱以电方式输送至未成熟心肌细胞，从而诱导进一步分化。最优选地，脉冲谱具有矩形脉冲形状以及约0.7V至1V或高达2伏的强度。在一些实施方案中，电压高达3伏。然而，也可以使用其他脉冲形状，比如正弦波形、三角波形和/或锯齿波形。在一些情况下，当起搏频率增加时，强度增加，但在其他情况下，强度保持一致。脉冲持续时间通常为约0.1毫秒至0.2毫秒或长达10毫秒，并且也可以随着起搏频率的增加而增加。然而，在脉冲频率随着时间推移而增加的同时，脉冲持续时间也可以保持一致。
虽然脉冲强度和持续时间可以随时间增加，但是加速未成熟心肌细胞的分化被认为主要是由于增加细胞培养物的搏动速率所致，增加细胞培养物的搏动速率是通过增加电起搏来实现的。在实验中，发现随时间推移增加未成熟心肌细胞培养物的搏动速率可提高分化速率。为此，本文中证明，本来要花费数月至一年左右的时间的在几周内就可以完成。当以相同的速率保持起搏频率一周，然后以每周约0.5Hz增加起搏，直到达到2Hz的起搏频率时，令人惊讶地实现了有益结果。不过，预期较短的时间(比如几天)与较长的持续时间(比如几周)一样都是可以接受的。
因此，诱导未成熟心肌细胞分化为具有成体表型的心肌细胞的脉冲谱可以包括通过施加具有在1Hz和2Hz之间的脉冲频率的脉冲谱使心肌细胞电起搏。最优选地，脉冲谱的脉冲频率随时间推移增加。在实施方案中，在未成熟心肌细胞以小于1Hz的频率搏动的情况下，所施加的脉冲频率可以随时间推移而频率加倍。电起搏持续进行到心肌细胞具有正性力-频率关系时为止。具体而言，功能成熟的或成体型的心肌细胞具有正性力-频率关系；而未成熟心肌细胞具有负性力-频率关系。
与监测心肌细胞的功能成熟一样，当添加相应地影响搏动力和/或频率的化合物时，高分辨率的心肌搏动揭示在搏动力和/或频率方面的转换。也就是说，虽然这些方法使用心肌细胞的电监测来跟踪向成熟心肌细胞的分化，但相同的电监测方法可以测量和跟踪潜在的治疗化合物或有毒化合物对心肌细胞的作用。具体而言，心肌细胞的电监测可以揭示搏动力或幅度的变化，并且可以揭示响应于添加化合物的搏动频率的变化。
因此，通过监测搏动力或幅度和搏动频率，可以评价变力性和变时性作用。作为非限制性实例，在添加化合物之前和之后确定的至少一个参数的比较可用于如下表征化合物：如果在添加化合物之后搏动力增加，则为正性肌力化合物，或者如果在添加化合物之后搏动力降低，则为负性肌力化合物，和/或如果在添加化合物之后搏动速率增加，则为正性变时性化合物，或者如果在添加化合物之后搏动速率降低，则为负性变时性化合物。
D.使用iPSC衍生的心肌细胞或ESC衍生的心肌细胞筛选影响心肌细胞成熟为更类似成体的表型的化合物
技术人员将理解，所述方法也可用于评估化合物对成熟过程的影响。作为示例性实施方案，提供了一种表征化合物对心肌细胞成熟的作用的方法，所述方法包括：提供一种系统，其被配置为培养搏动细胞、使搏动细胞电起搏和监测搏动细胞的搏动；在系统中培养未成熟心肌细胞；根据使心肌细胞功能成熟的脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏；添加疑似对心肌细胞成熟有作用的化合物；在添加化合物之前和之后进行培养心肌细胞的电监测；确定在添加化合物之前和之后的至少一个表征搏动力-频率关系的参数；比较在添加化合物之前和之后确定的至少一个参数，由此鉴定响应于该化合物添加的差异。
与之相关地，提供了一种表征化合物对心肌细胞搏动的作用的方法，所述方法包括：提供被配置为培养搏动细胞、使其电起搏和监测其搏动的系统；在系统中培养两群未成熟心肌细胞；将疑似对心肌细胞成熟有作用的化合物添加到其中一群未成熟心肌细胞；按照使未成熟心肌细胞功能成熟的脉冲谱使两群未成熟心肌细胞电起搏，直到两群心肌细胞中的至少一群功能成熟时为止；并且，如果添加化合物的心肌细胞群的功能成熟在另一心肌细胞群之前，则将所述化合物表征为进一步驱动成熟。
正如以上公开内容所述，在一些实施方案中，未成熟心肌细胞衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。优选的是，在添加化合物之前培养两群未成熟心肌细胞直到相应群内的搏动同步时为止。也就是说，每群心肌细胞应该具有同步化的搏动，但两个不同群体间的搏动不必同步化。可以使用未成熟心肌细胞的细胞-基底阻抗监测来获得搏动参数(无论是原始阻抗值还是细胞指数)，然后随时间进行比较，来确定同步化的搏动。搏动不同步的群体不会生成连续且可再现的基于阻抗的曲线。搏动培养物也不会产生可再现的搏动峰。也就是说，这些曲线将不正确地相互重叠。相反，曲线将移动或缺乏精细度。为此，本文中提供的心肌细胞搏动分辨率足够高，足以确定心肌细胞搏动是否同步。本文中的系统通常达到40ms的分辨率，也可再现地达到20ms的分辨率。40ms分辨率或20ms分辨率意味着所述系统将进行彼此相隔40ms或20ms的连续测量。还包括10ms或1ms的更高分辨率。通常，在约20秒的时程内测量细胞群，在此期间，优选停止起搏。在没有电刺激的情况下实现同步搏动通常需要6天到2周。
使未成熟心肌细胞起搏包括将脉冲谱以电方式输送至未成熟心肌细胞，从而诱导进一步分化。最优选地，脉冲谱具有矩形脉冲形状以及约0.7V至1V或高达2伏的强度。在一些实施方案中，电压高达3伏。然而，也可以使用其他脉冲形状，比如正弦波形、三角波形和/或锯齿波形。在一些情况下，当起搏频率增加时，强度增加，但在其他情况下，强度保持一致。脉冲持续时间通常为约0.1毫秒至0.2毫秒或长达10毫秒，并且也可以随着起搏频率的增加而增加。然而，脉冲持续时间也可以保持一致，但脉冲频率随着时间推移而增加。
虽然脉冲强度和持续时间可以随时间增加，但是加速未成熟心肌细胞的分化被认为主要是由于维持细胞培养物的递增的搏动速率所致，这是借助于细胞的电起搏实现的。在实验上，发现随时间推移增加搏动速率可提高分化速率。为此，本文中证明，本来要花费数月至一年左右的时间的在几周内就可以完成。当以相同的速率保持起搏频率一周，然后以每周约0.5Hz增加起搏，直到达到2Hz的起搏频率时，令人惊讶地实现了有益结果。然而，预期较短的时间(比如几天)将会和较长的持续时间(比如几周)一样都是可以接受的。
因此，诱导未成熟心肌细胞分化为具有成体表型的心肌细胞的脉冲谱可以包括通过施加具有在1Hz和2Hz之间的脉冲频率的脉冲谱使心肌细胞电起搏。最优选地，脉冲谱随时间推移增加脉冲频率。在实施方案中，在未成熟心肌细胞以小于1Hz的频率搏动的情况下，所施加的脉冲频率可以随时间推移而频率加倍。继续进行电起搏，直到心肌细胞以正性力-频率关系搏动时为止。具体而言，功能上的成体心肌细胞具有正性力-频率关系；而未成熟心肌细胞具有负性力-频率关系。
在电起搏期间或之前，可以将一种或多种化合物添加至未成熟心肌细胞群，并通过与对照进行比较来评估其对成熟的作用。也就是说，可以比较响应于添加化合物的细胞群体之间的力-频率关系，以确定添加的化合物是进一步驱动成熟还是减慢成熟。技术人员将理解，通过提供不同浓度的此类化合物以确定对成熟的剂量效应，可以进一步研究确定响应于化合物施用的成熟变化。
与监测成熟一样，可将化合物施用于一个或多个未成熟心肌细胞群，并评估随时间推移的力-频率关系。响应于化合物施用的力-频率关系的变化证明了成熟度或成熟过程的差异。
实施例
实施例I
确定搏动细胞培养物的搏动参数
在一种方法中，使用细胞-基底阻抗测量来确定与细胞相关的搏动周期峰。搏动本身对应于细胞的兴奋-收缩偶联。具体而言，将搏动定义为正峰(图3中的+P)和负峰(图3中的-P)的序列。这些正峰和负峰的值以及对应的时程决定了搏动特征，搏动特征揭示了心肌细胞群的状态。例如，正峰可对应于心肌细胞的收缩，而测量值返回至基线以及负峰可对应于心肌细胞的松弛。
作为示例，对于孔的时间相关阻抗值或细胞指数值，通过使用数值方法导出其一阶导数和二阶导数进行分析。搏动周期峰是其中阻抗值或细胞指数值的一阶导数的绝对值为零或接近零的那些数据点。如果搏动周期峰是正峰(即峰对应于搏动周期内测得的阻抗或细胞指数中的最大值)，则该峰将对应于其中阻抗值或细胞指数值的二阶导数为负并且其中阻抗值或细胞指数值的一阶导数的绝对值为零或接近零的数据点。如果搏动周期峰是负峰(即峰对应于搏动周期内测得的阻抗或细胞指数中的最小值)，则该峰将对应于其中阻抗值或细胞指数值的二阶导数为正并且其中阻抗值或细胞指数值的一阶导数的绝对值为零或接近零的数据点。
在另一种方法中，用于搜索和鉴定“正峰”和“负峰”的方法可能涉及使用和修改各种数学算法(例如Douglas-Peucker算法)。Douglas-Peucker算法是用于减少由一系列点近似构成的曲线中的点数的算法。基于原始曲线和简化曲线之间的必需最大距离，也可以采用Douglas-Peucker算法来鉴定针对阻抗值和/或细胞指数值的时间相关数据点系列中的正峰和负峰。
在另一种方法中，确定搏动周期峰的方法是搜索其中数据趋势随时间从“升高”变为“降低”(对于正峰)或从“降低”变为“升高”(对于负峰)的数据点。在鉴定搏动周期峰之后，在这样的峰时间点的阻抗或细胞指数值提供了搏动周期峰的大小或幅度。
在确定搏动周期峰之后，可以使用各种方法来计算搏动速率。搏动速率参数通常提供为每分钟搏动数的形式。在正峰计数方法中，确定在给定时间区间内的正峰数，并将其转换为期望的单位，优选每分钟搏动数。类似地，在负峰计数方法中，确定在给定时间区间内的负峰数，并将其转换为期望的单位。作为示例，如果在一秒间隔中有2个峰，则搏动速率将为每秒2次搏动或每分钟120次搏动。在又另一种方法中，通过确定一系列的两个或更多个正峰之间或一系列的两个或更多个负峰之间的时程来计算搏动速率。也就是说，在这种方法中，用时间单位(例如1分钟)除以两个相邻峰之间的时程。例如，如果两个相邻峰相隔500毫秒，则搏动速率将为每分钟120次。在包括多个正峰或负峰的时间区间中，可以通过以下方法确定搏动速率。以正峰为例，计算出每一对两个相邻的正峰之间的时程。然后可以用两种方法计算搏动速率。第一种方法是将时间单位(例如1分钟)除以给定时间区间内所有两个相邻正峰之间的时程的平均值。第二种方法是基于每一对两个相邻正峰计算出对应的搏动速率，然后取相邻峰得出的搏动速率的平均值。
为了进一步帮助比较，还可以将搏动速率归一化。用选定的数据分析时间处的搏动速率除以归一化时间处的搏动速率，来确定归一化的搏动速率。因此，将与在归一化时间处的搏动速率相同的搏动速率定义为1。归一化搏动速率可以更清楚地指示搏动速率是否发生变化以及发生何种程度的变化。例如，接近1或小于1的归一化搏动速率可能意味着尚未出现进一步成熟，这表明脉冲谱应该继续，以进一步诱导成熟。大于1的归一化搏动速率可能意味着iPSC已经历成熟或仍在经历成熟。
搏动幅度或搏动力是在一些实施方案中用于描述或对应于峰强度的参数，其可反映在搏动周期中心肌细胞的收缩或松弛程度。搏动幅度的确定可涉及一种全峰方法(wholepeak approach)，可通过负峰与随后的正峰之间的差确定，如图3所示。例如，在图3中，搏动幅度被显示为负峰与随后的相邻正峰之间的细胞指数差(Amp-1、Amp-2、Amp-3、…、Amp-m)。在另一种方法中，正峰的搏动幅度是确定的基线与正峰之间的差。在又一种方法中，负峰的搏动幅度是确定的基线与负峰之间的差。示例性基线显示在图3中。
因此，对于单个搏动周期而言，可以定义或识别搏动周期峰的不同类型的幅度(或一种幅度)，包括周期中的正峰的幅度、负峰的幅度和全峰的幅度。根据测量数据点系列，可以从时间系列中的测量数据值确定或鉴定基线值，基线值理论上可以对应于心肌细胞处于其完全松弛状态时的值。正峰幅度是在正峰时间点的阻抗值或细胞指数值或其他测量值减去基线值。负峰幅度是在负峰时间点的阻抗值或细胞指数值或其他测量值减去基线值。全峰幅度是在正峰时间点和负峰时间点之间的阻抗值或细胞指数值或其他测量值之差。
虽然以上段落论述了单个搏动周期的幅度的不同类型，但对于包括多个搏动周期的时程，可以确定正峰幅度、负峰幅度和全峰幅度的平均值和标准偏差(或标准误差)。
也可以将搏动幅度归一化为归一化幅度。归一化幅度是在选定的数据分析时间处的幅度除以在归一化时间点的幅度。将与在归一化时间的搏动幅度相同的搏动幅度定义为1。因此，归一化幅度可揭示与参考幅度相比的差异，比如搏动的幅度或强度的升高或降低，其中升高通常指示进一步成熟。
可以针对所有三种类型的搏动幅度(即基于正峰的幅度、基于负峰的幅度和全峰幅度)求出归一化搏动幅度。
搏动期(也称为“搏动周期”)是提供两个正峰之间、两个负峰之间的时程的参数，或者可以是提供正峰和负峰之间的时程的参数。搏动周期可以用来鉴定搏动速率的变化，或者可以作为一个限定的周期用于比较其他参数(比如幅度的差异)。在图3中，在一个扫描持续期(Sweep Duration)，正峰的数目为m(+P1、+P2、+P3、…、+Pm)，负峰的数目为n(–P1、–P2、–P3、…、-Pn)。将两个相邻的各个正峰(或/和两个相邻的各个负峰)之间的时间定义为搏动周期。例如，基于正峰的搏动周期为T+P1、T+P2、…、T+P(m-1)，而基于负峰的搏动周期为T–P1、T–P2,…、T–P(n-1)。
实施例II
比较搏动模式
搏动模式相似性(beating pattern similarity)是一种为了量化两段不同时间区间之间的搏动波形之间的相似性而导出的参数。为此，搏动模式相似性可用于确定心肌细胞搏动是否同步化，或者是否受施用变力性或变时性化合物的影响。对于任何给定的时间区间，搏动模式均显示为由该时间区间内的多个时间点上的多个测量值(阻抗值、细胞指数值或其他值)组成的搏动曲线。两段时间区间中的搏动模式可以在数值上比较，比如通过比较在这两段时间区间中的搏动曲线的确定参数，或者可以通过比较搏动曲线来比较模式。当比较曲线时，理想的是对齐曲线以匹配初始正峰或初始负峰。对齐曲线还可以使用各种曲线算法，这些算法可以鉴定曲线之间的距离或位移。
在一个实施方案中，搏动模式相似性作为这样的参数导出：其比较在两段时间区间上的搏动曲线的确定参数。例如，可以比较在两段时间区间上的搏动速率BR1和BR2。如下给出搏动模式相似性的一个例子：
搏动模式相似性＝(2*BR1*BR2)/(BR1*BR1+BR2*BR2)
在上述例子中，当在两个时间区间处的搏动速率相同时，搏动模式相似性为1(最高值)。如果在两个时间区间中的搏动速率不同，搏动模式相似性将小于1。搏动速率差异越大，搏动模式相似性值就越小。
然而，在一个优选实施方案中，搏动模式相似性作为这样的参数导出：其直接比较在两个时间区间上的搏动曲线。搏动模式相似性的理念应该具备这样的性质，即当两条搏动曲线相似时，搏动模式相似性的值大，而当两条搏动曲线不相似时，搏动模式相似性的值小。用于导出这样的搏动模式相似性值的方法有多种。
在一种方法中，如上文简述的，为了比较在两个时间区间上的搏动曲线(假定测得的数据点的测量时间分辨率相同)，可能期望对齐曲线以匹配初始正峰或初始负峰。对齐初始峰之后，对两条搏动曲线的时间点执行“与”运算，使得两条搏动曲线上的重叠时间点被保留，而任一条搏动曲线上的非重叠时间点被丢弃。这样一来，两条搏动曲线上剩余的重叠数据点的数目相同，并且可能易于定义一个距离(distance)用来描述两条搏动曲线是否相似。例如，搏动模式相似性可以是两条搏动曲线的剩余部分中的两个数据系列之间的相关系数。显然，两条曲线越相似，相关系数就越大(即，搏动模式相似性值越大)。在另一个实例中，搏动模式相似性可以简单地是在两条搏动曲线的剩余部分中的两个数据系列之间的某一数学上定义的距离(例如，欧几里得距离)。要注意的是，如果测量时间分辨率在测量数据点之间有不同，则可以在缺少时间点的搏动曲线中插入附加的时间点，这些时间点在基于其他测量数据点通过数学插值而得出值后插入。通过此操作，两条搏动曲线将具有相同的时间分辨率。
在另一种用于比较在两个时间区间上的搏动曲线的方法中(同样，对测量数据点假定相同的测量时间分辨率)，可以(从两条曲线中)选取具有较短持续时间的搏动曲线。如果时间较短的搏动曲线包含另一条搏动曲线的数据点的一半以上，则去除较短的搏动曲线末尾的一些数据点，形成一条“基本曲线”，使得较短的搏动曲线中的剩余数据点的数目是另一条搏动曲线中的数据点数目的一半。然后，确定若干个相关系数，其中每个相关系数相当于基本曲线与另一条搏动曲线的一个连续段(包含与基本曲线相同的数据点数目)对齐。例如，在基本曲线的数据系列和另一搏动曲线的前一半的数据系列(从第一数据点开始)之间确定第一相关系数。在基本曲线的数据系列与另一条搏动曲线的以起始点为第二数据点的数据系列之间确定第二相关系数。在基本曲线的数据系列与另一条搏动曲线的后半部分的数据系列(以最后一个数据点结束)之间确定最后的相关系数。最后，以所有相关系数的最大值作为搏动模式相似性。
可能有其他方法或算法可用于推导搏动模式相似性。搏动模式相似性可用于分析化合物对心肌细胞搏动模式的作用。比较两个时间区间的搏动曲线。为了分析化合物的作用，一个时间区间对应于化合物处理之前的时间段，另一个时间区间对应于化合物处理之后的时间段。在比较化合物对心肌细胞的作用方面，搏动模式相似性相对于其他参数具有优势。该优势在于，它可以包括或概括所有归因于该化合物的作用，即，对搏动速率、搏动波形形状或搏动幅度等的作用都可以包括在搏动模式相似性这一个参数中。
搏动节律不规则性(BRI)是标识搏动曲线在一定时间区间内搏动速率变化或峰期之间的变化的参数。搏动节律不规则性也称为搏动速率不规则性指数。如果搏动速率或搏动峰期不随时间变化，则搏动节律是规则的，并且搏动节律不规则性的参数应该小，即为零或接近零。另一方面，如果搏动速率或搏动期随时间改变，则搏动节律是不规则的，并且搏动节律不规则性的参数应该具有大的值。作为一项要求，搏动节律不规则性的参数应该能够标识心肌细胞的节律不齐的搏动。因此，如果心肌细胞表现出心律不齐的搏动，心肌细胞搏动曲线的搏动节律不规则性应达到较大的值。用于计算时间区间内搏动曲线的搏动节律不规则性的方法有多种。例如，计算搏动曲线在给定时间区间内的每个相邻正峰对的正峰期。然后，计算这样的多个正峰期的平均值和标准偏差。可以用正峰期的标准偏差除以平均值来计算搏动节律不规则性。在另一个实例中，计算搏动曲线在给定时间区间内的每个相邻的负峰对的负峰期。然后，计算这样的多个负峰期的平均值和标准偏差。可以用负峰期的标准偏差除以平均值来计算搏动节律不规则性。
实施例III
使用CardioECR系统通过定向电起搏使iPSC心肌细胞功能成熟
这里使用的iPSC衍生的心肌细胞是iCell心肌细胞2(iCell CM2)，其购自CellularDynamic Internationals(CDI)。根据CDI用户指南，将iCell CM2解冻，并以50,000个活细胞/孔接种在纤连蛋白预包被的E-plate CardioECR 48中。使用长期放置在37℃组织培养箱中的xCELLigence RTCA CardioECR站实时记录细胞的附着、生长和搏动活性。
使用xCELLigence RTCA cardioECR系统观察到iCell CM2的稳定而鲁棒的搏动活动(通常在E-plate CardioECR 48中进行细胞的平板接种之后6-8天出现)之后，开始电起搏并将其施加到细胞单层。在CardioECR站中，以最佳脉冲设置使细胞在1Hz、1.5Hz和2Hz连续起搏，每个起搏频率分别持续1周。每天进行培养基更换。因此，使细胞连续起搏3周(第1周：1Hz起搏；第2周：1.5Hz起搏；第3周：2Hz起搏)。我们发现，这种具有逐渐增加的起搏频率的起搏方案对于通过这样的频率逐步增加(ramping up)电起搏实现心肌成熟非常有效。图4显示了在起搏的每个阶段连续记录6秒的起搏活动的屏幕截图。
实施例IV
评估电刺激的iPSC心肌细胞的功能成熟
为了评估使用电起搏的iPSC心肌细胞的功能成熟，我们进行了以下程序。在使用实施例III中的逐步增加电起搏方法完成成熟过程之后，在测试力-频率关系之前将起搏暂停6小时，以确保细胞在搏动速率和搏动幅度方面稳定其搏动活性。每5分钟记录一次搏动活动的基线，持续20秒，一直到刚好在测试前30分钟为止。然后通过分别以0.75Hz、1Hz、1.5Hz和2Hz连续电起搏10分钟来逐渐增加细胞的搏动速率。在不同频率的每次起搏结束时记录细胞的收缩活性20秒。使用CardioECR数据分析软件计算在每个搏动频率下获得的收缩力的替代指标，即搏动幅度，并针对搏动频率绘图。
图5描绘了一项示例性研究的结果，其中在起搏的心肌细胞中观察到指示成熟表型的正性搏动幅度与搏动频率关系。简要地说，首先以1Hz、1.5Hz和2Hz分别使细胞电起搏1周(第1周以1Hz起搏，第2周以1.5Hz起搏并且第3周以2Hz起搏)。在测试搏动幅度和搏动频率关系之前5小时，终止2Hz的电刺激。计算在受电刺激控制的每个搏动频率下的搏动幅度。从未起搏的心肌细胞(自发搏动心肌细胞)收集的数据以蓝色表示。从慢性起搏的心肌细胞收集的数据以橙色显示。
实施例V
使用变力性化合物评估电刺激的iPSC心肌细胞的功能成熟
使用变力性化合物测试来自实施例III的iPSC心肌细胞的功能成熟。结果显示在图6A-B中。
具体而言，将iPSC心肌细胞接种到CardioECR平板(E-Plate CardioECR 48)的孔中约7天，直到它们形成同步、稳定的搏动单层时为止。以1Hz、1.5Hz和2Hz分别使细胞电起搏1周(第1周：1Hz起搏；第2周：1.5Hz起搏；第3周：2Hz起搏)。暂停2Hz起搏后，在添加化合物前一夜，将细胞培养基换成90μL的新鲜预热培养基。
然后以2Hz使细胞连续起搏另外8小时。在添加化合物之前5小时终止电起搏，以确保细胞产生稳定的搏动速率和搏动幅度以便处理。每5分钟记录一次基线搏动活动，持续20秒，一直到刚好在添加化合物前30分钟为止。然后使用多通道移液器将10μL的10X化合物溶液添加到CardioECR板的孔中。在暴露于化合物之后，立即使用CardioECR系统每2分钟记录一次对化合物的细胞反应，持续20秒。在添加化合物后30分钟评价细胞的搏动活性，包括搏动速率和搏动幅度。
实施例VI
使用功能成熟的心肌细胞筛选潜在的变力性化合物
为了证明功能成熟的iPSC用于鉴定变力性化合物的用途，测试了电刺激的iPSC对施用化合物米力农的反应。
细胞单层制备。将iPSC衍生的心肌细胞以最佳接种密度接种在预先包被有基底的E-plate CardioECR 48的孔中。在细胞接种之后，使用放置在37℃组织培养箱中的xCELLigence RTCA CardioECR站实时记录细胞的附着、生长和搏动活性。每隔一天进行一次培养基更换。
功能成熟的iPSC衍生的心肌细胞的诱导。在使用xCELLigence RTCA cardioECR系统观察到iPSC衍生的心肌细胞的稳定而鲁棒的搏动活动之后，开始电起搏并将其施加到细胞单层。然后使用xCELLigence RTCA CardioECR系统以1Hz、1.5Hz和2Hz使iPSC衍生的心肌细胞分别电起搏1周。将脉冲强度和脉冲持续时间在每个起搏频率之前优化，并将其连续施加到细胞。证实所述细胞在起搏条件下以与起搏频率相同的频率搏动。在慢性起搏程序期间每天进行一次培养基更换。
变力性化合物筛选。在经过逐步增加的起搏程序持续3周的过程完成心肌细胞的功能成熟后，进行变力性化合物筛选。在添加化合物前一夜晚，将旧培养基换成90μL的新鲜预热培养基。使用CardioECR系统，以2Hz使细胞连续起搏另外的12小时。在施加化合物之前6小时终止电起搏，以确保细胞产生了稳定的搏动速率和搏动幅度以便处理。在CardioECR系统上实时监测并记录细胞搏动活动。
确定了测试物质的有效浓度范围。如下制备化合物溶液。将化合物溶解在适当的溶剂中。如果使用DMSO作为溶剂，则尽可能将化合物以高储备浓度溶解(理想地高于最高测试浓度1000倍)，并在-20℃下储存。制备在适当的溶剂(DMSO或H2O)中浓缩1000倍的化合物的系列稀释液。将稀释的化合物转移至V型底微量滴定板的孔中，以在培养基(10倍浓缩)中进一步稀释。
在CardioECR系统上每5分钟记录一次搏动活动的基线，持续20秒，一直到刚好在添加化合物前30分钟。使用多通道移液器将10μL的10X化合物溶液添加到CardioECR板的孔中。刚好在暴露于化合物之后，使用CardioECR系统每2分钟记录一次对化合物的细胞反应，持续20秒。在添加化合物后30分钟评价细胞的搏动活性，包括搏动速率和搏动幅度。
作为原理证明，以上测定是使用米力农进行的。如图7A-B所示，在暴露于正性肌力化合物米力农之后，自发搏动心肌细胞和慢性起搏的心肌细胞的搏动速率(B)都略有增加。然而，在电起搏的心肌细胞中，搏动幅度(A)显著增加。数据表示为均值±SD(N＝5)。
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Claims (10)
1.一种使功能未成熟的心肌细胞成熟的方法，所述方法包括：
a)提供被配置为培养搏动细胞、使搏动细胞电起搏并监测搏动细胞搏动的系统；
b)在该系统中培养未成熟心肌细胞；
c)监测未成熟心肌细胞，以将心肌细胞搏动表征为同步或不同步；和
d)如果是同步的，则按照诱导成熟的脉冲谱使未成熟心肌细胞电起搏，直到未成熟心肌细胞成熟为功能上成体的心肌细胞为止。
2.权利要求1的方法，其中所述系统包括细胞-基底阻抗监测电极阵列，所述阵列位于基底上并且与阻抗分析器可操作连接，用于监测该系统中培养的细胞群的细胞-基底阻抗。
3.权利要求1的方法，其中所述系统包括细胞外记录电极阵列，所述阵列与细胞外记录放大器可操作连接，用于对该系统中培养的细胞群进行细胞外记录。
4.权利要求1的方法，其中所述系统包括基底上的细胞-基底阻抗监测电极阵列、基底上的细胞外记录电极阵列、阻抗分析器和细胞外记录放大器，其中所述系统被配置为监测细胞-基底阻抗并对该系统中培养的细胞群进行细胞外记录。
5.权利要求1的方法，其中未成熟心肌细胞衍生自诱导的多能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。
6.权利要求1的方法，其中监测未成熟心肌细胞的步骤包括监测未成熟心肌细胞的细胞-基底阻抗。
7.权利要求1的方法，其中监测未成熟心肌细胞的步骤包括对未成熟心肌细胞进行细胞外记录。
8.权利要求1的方法，其中表征心肌细胞搏动是否同步是通过确定未成熟心肌细胞的搏动速率并随时间比较该搏动速率来进行的。
9.权利要求1的方法，其中如果心肌细胞搏动不同步，则所述方法进一步包括使未成熟心肌细胞电起搏，直到心肌细胞搏动同步为止。
10.权利要求9的方法，其中使搏动同步的电起搏是在恒定频率下的。
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