JP4259868B2 - ニューブラスチンのポリマー結合体および同様の使用方法。 - Google Patents

Description

（発明の分野）
本発明は、一般的に、ポリペプチドに関し、そしてより詳細には、改変神経栄養ポリペプチドおよびこれらの改変ポリペプチドの使用方法に関する。

（発明の背景）
神経栄養因子は、神経細胞および神経組織の生存を促進し、表現型分化を維持し、変性を予防し、そして活性を増強する、天然に存在するタンパク質である。神経栄養因子は、神経組織および神経系によって刺激される非神経組織から単離され、そして機能的に関連する群および構造的に関連する群（ファミリー、スーパーファミリー、またはサブファミリーとも称される）に分類される。神経栄養因子スーパーファミリーには、線維芽細胞増殖因子、ニューロトロフィン、およびトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）のスーパーファミリーがある。神経栄養因子の個々の種は、その物理的構造、その同族レセプターとのその相互作用、および種々の型の神経細胞に対するその影響によって識別される。ＴＧＦ−βスーパーファミリー内に分類されるのは、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）リガンド（これは、ＧＤＮＦ、パーセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）（ＰＳＰ）およびニューロチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）（ＮＴＮ）を含む）である。

ＧＤＮＦサブファミリーのリガンドは、共通して、ＲＥＴレセプターチロシンキナーゼを介してシグナル伝達を誘導する能力を有する。ＧＤＮＦサブファミリーのこれらの３つのリガンドは、神経栄養レセプターのファミリー（ＧＦＲαレセプター）に対するその相対的な親和性が異なる。

最近記載された神経栄養因子は、「ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）」、すなわち「ＮＢＮ」である。ニューブラスチンは、ＧＤＮＦサブファミリー内に分類される。なぜなら、ニューブラスチンは、他のＧＤＮＦリガンドと相同性の領域を共有し、そしてＲＥＴに結合し、そしてこれを活性化する能力を有するからである。他のＧＤＮＦリガンドと異なり、ニューブラスチンは、ＧＦＲα３−ＲＥＴレセプター複合体に対して高度に選択性である。さらに、ＮＢＮは、そのアミノ酸配列に特有のサブ領域を含む。

あいにく、ニューブラスチンは、体によって急速に清澄される。この急速なクリアランスは、治療適用におけるニューブラスチンの使用を阻止し得る。従って、増大したバイオアベイラビリティを有するニューブラスチン改変体を同定する必要性が存在する。

（発明の要旨）
本発明は、一部、インビボにおいて増強した薬物動態学的（ｐｈａｒｍｏｋｉｎｅｔｉｃ）特性およびバイオアベイラビリティ特性を示す、新しい形態のニューブラスチンの発見に基づく。これらの新規形態としては、ポリマー分子に結合体化された改変ニューブラスチンポリペプチドが挙げられる。

１つの局面において、本発明は、成熟ニューブラスチンダイマーの溶媒露出位置にて１つ以上のアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含む、改変体ニューブラスチンポリペプチド、またはムテインニューブラスチンポリペプチドを特徴とする。この置換は、基材（例えば、天然に存在するポリマーまたは合成ポリマー）がポリペプチドに結合され得、インビボにおいてそのポリペプチドの可溶性を増強し、ゆえにそのポリペプチドのバイオアベイラビリティを増強する１つ以上の部位を、ネイティブなニューブラスチンポリペプチドに導入する。好ましくは、本改変体ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸８〜１１３に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む。この改変体ニューブラスチンポリペプチドは、以下のような１つ以上のアミノ酸置換を含む：アミノ酸の位置を配列番号１のポリペプチド配列に従って番号付けした場合、アルギニン以外のアミノ酸が改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の１４位に生じる、アミノ酸置換；アルギニン以外のアミノ酸が改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の３９位に生じる、アミノ酸置換；アルギニン以外のアミノ酸が改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の６８位に生じる、アミノ酸置換；または、アスパラギン以外のアミノ酸が改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の９５位に生じる、アミノ酸置換。

本明細書中に使用される場合、「野生型ニューブラスチン」または「ｗｔ−ＮＢＮ」は、天然に存在するニューブラスチンポリペプチド配列またはネイティブなニューブラスチンポリペプチド配列、例えば、ラットニューブラスチン、マウスニューブラスチン、またはヒトニューブラスチンのポリペプチド配列（例えば、配列番号２、３または４を参照のこと）をいう。特定の改変体ニューブラスチンポリペプチドは、本明細書中、「ＮＢＮ−Ｘ_１Ｎ_１Ｘ_２」または「Ｘ_１Ｎ_１Ｘ_２−ＮＢＮ」と称され、ここで、Ｘ_１は、野生型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸をいい、Ｎ_１は、配列番号１に従って番号付けした場合の配列におけるＸ_１アミノ酸の位置番号をいう。Ｘ_２は、配列中に示された位置番号における野生型アミノ酸に対するアミノ酸置換をいう。従って、例えば、ＮＢＮ−Ｎ９５Ｋは、９５位におけるアスパラギンがリジンによって置換された改変体ニューブラスチンポリペプチドを同定する。

改変体ニューブラスチンポリペプチドは、マルチマーポリペプチドとして提供され得る。例えば、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、少なくとも１つの改変体ニューブラスチンポリペプチドを含むダイマーとして提供され得る。いくつかの実施形態において、このダイマーは、改変体ニューブラスチンポリペプチドのホモダイマーである。他の実施形態において、このダイマーは、１つの改変体ニューブラスチンポリペプチドおよび１つの野生型ニューブラスチンポリペプチドを含む、ヘテロダイマーである。他のダイマーは、２つの異なる改変体ニューブラスチンポリペプチド形態を含み得る。

いくつかの実施形態において、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、アミノ酸８〜１１３に加え配列番号１のアミノ酸１〜７を含む。

好ましい実施形態において、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、ダイマー化する場合、ＧＦＲα３に結合する。さらなる好ましい実施形態において、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、ダイマー化する場合、それ自体でかまたはＧＦＲα３に結合した場合かのいずれかにて、ＲＥＴポリペプチドのチロシンリン酸化を刺激する。

なお他の好ましい実施形態において、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、ダイマー化する場合、ニューロンの生存を増強する（例えば、感覚ニューロンの生存を増強する）。

なお他の好ましい実施形態において、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、ダイマー化する場合、ニューロン（例えば、感覚ニューロン）の病理学的な変化を正規化する。

なおさらなる好ましい実施形態において、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、ダイマー化する場合、ニューロン（例えば、自律性ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロン）の生存を増強する。

いくつかの実施形態において、改変体ポリペプチドは、以下からなる群より選択される２、３またはそれより多くのアミノ酸置換を含む：改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の１４位でのアルギニン以外のアミノ酸、改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の３９位でのアルギニン以外のアミノ酸、改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の６８位でのアルギニン以外のアミノ酸、および改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の９５位でのアスパラギン以外のアミノ酸。

好ましい実施形態において、１４位、３９位、６８位および９５位の１つ以上におけるアミノ酸は、リジンである。

好ましくは、改変体ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸８〜９４および９６〜１１３は、配列番号１のアミノ酸８〜９４および９６〜１１３と少なくとも９０％同一である。より好ましくは、このアミノ酸配列は、これらに対して少なくとも９５％同一である。最も好ましくは、改変体ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、天然に存在するラットニューブラスチンポリペプチド、ヒトニューブラスチンポリペプチドまたはマウスニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列を、改変体ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸８〜９４および９６〜１１３に含む。例えば、改変体ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸８〜９４および９６〜１１３は、配列番号２、配列番号３、または配列番号４のアミノ酸８〜９４および９６〜１１３のアミノ酸配列を含み得る。

改変体ニューブラスチンポリペプチドまたは野生型ニューブラスチンポリペプチドを含む融合タンパク質もしくは融合ポリペプチド、または２つのニューブラスチン融合タンパク質のダイマーであるタンパク質もまた、本発明によって提供される。ニューブラスチン融合タンパク質はまた、インビボにおいて増強された薬物動態学的特性およびバイオアベイラビリティ特性を有する。

別の局面において、本発明は、改変体ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。改変体ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸は、好ましくは、ベクター（例えば、発現ベクター）中に提供される。改変体ニューブラスチン核酸またはこれを含むベクターは、細胞中に提供され得る。この細胞は、例えば、哺乳動物細胞、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または細菌細胞であり得る。好ましい哺乳動物細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（「ＣＨＯ細胞」）である。

改変体ニューブラスチンポリペプチドの発現を可能にする条件下で改変体ニューブラスチン核酸をコードする核酸を含む細胞を培養することによって、改変体ニューブラスチンポリペプチドを作製する方法もまた、本発明によって提供される。所望される場合、この改変体ニューブラスチンポリペプチドは、その後回収され得る。本発明はさらに、細胞によって産生される改変体ニューブラスチンポリペプチドを含む。本発明の融合タンパク質（例えば、ニューブラスチン−血清アルブミン融合タンパク質）について、類似の核酸、ベクター、宿主細胞、およびポリペプチドの産生方法が、本明細書中に開示される。

天然に存在するポリマーに結合体化されたニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドを含む組成物もまた、本発明によって提供される。この組成物中の改変体ニューブラスチンポリペプチドは、好ましくは、配列番号１のアミノ酸８〜１１３に少なくとも７０％同一なアミノ酸配列を含み、ただし、この改変体ニューブラスチンポリペプチドは、以下からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む：改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の１４位でのアルギニン以外のアミノ酸、改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の３９位でのアルギニン以外のアミノ酸、改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の６８位でのアルギニン以外のアミノ酸、および改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の９５位でのアスパラギン以外のアミノ酸（ここで、アミノ酸の位置は、配列番号１のポリペプチド配列に従って番号付けされる）。

好ましい実施形態において、ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分（例えば、ポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ））を含む。

好ましい実施形態において、このポリアルキレングリコール部分は、ニューブラスチンポリペプチドのアミン基に結合されるか、または改変体ニューブラスチンポリペプチドのリジンに結合される。

カップリングは、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステルを介して生じ得る。この活性エステルは、例えば、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）、スクシンイミジルブチレート（ＳＰＢ−ＰＥＧ）、またはスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）であり得る。

このポリアルキレングリコール部分は、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳ、ノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、またはＰＮＰカルボネートであり得る。

いくつかの実施形態において、ポリアルキレングリコール部分は、ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドのシステイン基に結合される。例えば、カップリングは、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基、およびチオール基を介して生じ得る。

いくつかの実施形態において、組成物中のニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドは、グリコシル化される。ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ポリペプチドがグリコシル化される場合、ポリマーはグリコシル化ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドの糖質部分に結合され得る。例えば、グリコシル化ニューブラスチンポリペプチドもしくは改変体ニューブラスチンポリペプチドのヒドラゾール基もしくはアミノ基の酸化、またはポリマーの反応基の酸化の後、ポリマーがグリコシル化ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドに結合され得る。

種々の実施形態において、ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドは、１、２、３、または４つのＰＥＧ部分を含む。

好ましい実施形態において、ニューブラスチンポリペプチド、改変体ニューブラスチンポリペプチド、またはポリマー結合体は、ポリマーの非存在下でのそのポリペプチドまたは改変体ポリペプチドの半減期と比較して、より長い血清半減期を有する。

好ましい実施形態において、複合体中のニューブラスチンポリペプチド、改変体ニューブラスチンポリペプチド、またはポリマー結合体は、ＧＦＲα３結合、ＲＥＴ活性化、ニューロンの病理学的変化の正規化、またはニューロン生存の増強からなる群より選択される生理学的活性を有する。

「ニューロンの病理学的変化の正規化」は、本結合体が、以下の細胞性パラメーター：構造タンパク質、神経栄養因子レセプター、イオンチャネル、もしくは神経伝達物質の発現レベル、のうちの１つ以上に変化を誘導するか、あるいは、細胞形態に変化を誘導して、各場合において、疾患、変性、傷害、または損傷による影響を受けていない同じまたは類似の表現型のニューロンにおけるこれらのレベルまで、このようなパラメーターを実質的に回復させることを意味する。ニューロンの病理学的変化の正規化は、免疫組織化学的にモニターされ得るか、あるいは分泌もしくは流出された細胞生成物のレベルにおける変化を評価することによって、または冒されたニューロンの機能に生理学的に原因がある挙動におけるインビボ変化を評価することによってモニターされ得る。例えば、神経障害疼痛症候群と関連する病理学的変化の場合、、疼痛挙動（例えば、痛覚過敏、痛感鈍麻、または異痛）が、モニターされ得る。

「ニューロン生存を増強する」は、同じ型の疾患、障害、傷害、または損傷によって冒されたが本発明のニューブラスチン結合体またはニューブラスチン融合タンパク質で処理されていない対応するニューロンにおいて観察される生存期間を超えた、冒されたニューロンの生存の延長を意味する。

いくつかの実施形態において、ポリマーは、Ｎ末端のニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）上の部位で、このポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態において、ポリマーは、ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドの非末端アミノ酸における部位で、このポリペプチドに結合される。

好ましい実施形態において、ポリマーは、ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドの溶媒に露出されたアミノ酸に結合される。

好ましい実施形態において、ポリマーは、以下からなる群より選択される残基で、ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドに結合される：改変体ポリペプチドのアミノ末端アミノ酸、ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列の１４位、ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列の３９位、ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列の６８位、およびニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ポリペプチドのアミノ酸配列の９５位。

本発明のニューブラスチンポリペプチド、改変体ニューブラスチンポリペプチドまたは結合体を含むかまたはその中に分散された生理学的に受容可能なビヒクルを含む、薬学的組成物もまた、本発明によって提供される。

さらなる局面において、本発明は、安定な水溶性の結合体化ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドの複合体を包含し、この複合体は、ポリエチレングリコール部分に結合されたニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドを含み、ここで、このニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドは、不安定な結合によってポリエチレングリコール部分に結合されている。いくつかの実施形態において、この不安定な結合は、生化学的な加水分解、タンパク質分解、またはスルフヒドリル切断によって切断可能である。好ましい実施形態において、この不安定な結合は、インビボ条件下で切断可能である。

野生型ニューブラスチンと比較して、インビトロまたはインビボで延長された活性を有する、改変ニューブラスチンポリペプチドを作製するための方法もまた、本発明によって提供され、これは、ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドを提供し、そしてこのポリペプチドまたは改変改変体ニューブラスチンポリペプチドを天然に存在しないポリマー部分に結合させ、それによって、結合されたポリマーニューブラスチンポリペプチド組成物を形成することによる。

さらなる局面において、本発明は、被験体（例えば、ヒト）における神経系の障害を処置または予防する方法を提供し、この方法は、その処置が必要とされる被験体に、治療有効量の、改変体ニューブラスチンポリペプチド、ポリマーに結合されたニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドを含む組成物、あるいは安定な水溶性の結合体化ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドの複合体（ポリエチレングリコール部分に結合されたニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドを含む）を含む複合体、を投与することによる。

好ましくは、神経系の障害は、末梢神経障害（例えば、末梢ニューロパシーまたはニューロパシー性疼痛症候群）である。ヒトが、この処置に好ましい被験体である。

投与は、例えば、全身的または局所的であり得る。

他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料に類似または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中に言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（定義を含む）が支配する。さらに、材料、方法および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図されない。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。

（発明の詳細な説明）
本発明は、その薬物動態特性およびバイオアベイラビリティ特性を増強するように改変され得る、新規改変体ニューブラスチンポリペプチドを提供する。好ましい改変体ニューブラスチンポリペプチドは、ポリマー薬剤（例えば、ポリアルキレングリコールポリマー）への結合を容易にする、変更されたアミノ酸配列を有する。

（改変体ニューブラスチンポリペプチド）
本発明は、野生型ニューブラスチンポリペプチド配列に対する改変体アミノ酸配列を有する、ニューブラスチンポリペプチドを提供する。ヒトおよびマウスのニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、ＷＯ００／０１８１５に開示される。本発明に従う改変体ニューブラスチンポリペプチドの例を、表１に示す。

好ましくは、改変体ニューブラスチンポリペプチドの変更された残基は、改変されたアミノ酸の位置でのポリマー（例えば、ポリアルキレングリコールポリマー）の結合を容易にするように選択される。ニューブラスチンポリペプチドの好ましい改変部位は、ニューブラスチンポリペプチドにおける溶媒が接近可能な領域の部位である。このような部位は、関連する神経栄養因子であるＧＤＮＦの結晶構造の精査に基づいて選択され得、この結晶構造は、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：４３５−３８，１９９７に記載される。部位はまた、パーセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）／ニューブラスチンのキメラタンパク質について提供された構造−機能情報に基づいて選択され得る。これらのキメラは、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３４１２−２０，２０００に記載される。この方法によって同定された、溶媒が接近可能な、すなわち表面に露出された、ニューブラスチンアミノ酸の例示的列挙を、表２に示す。

本発明は、表１に示される、配列番号１のアミノ酸８〜１１３に少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、改変体ニューブラスチンポリペプチドを包含する。いくつかの実施形態において、このポリペプチドのアミノ酸配列の１４位、３９位、６８位のアルギニンまたは９５位のアスパラギンのうちの１以上が、アルギニンまたはアスパラギン以外のアミノ酸によって置換される。好ましくは、この野生型アミノ酸は、リジンまたはシステインと置換される。

表２は、表面に露出されることが予測される、ヒトニューブラスチンにおける残基および番号の列挙を提供する。表面に露出された残基は、鎖ＡおよびＢによって形成されるラットＧＤＮＦダイマーの構造（ＰＤＢコード１ＡＧＱ）を試験して、そしてこの構造の表面上に残基が存在するか否かを決定することによって、決定される。次いで、この構造を、Ｂａｌｏｈら、Ｎｅｕｒｏｎ、第２１巻、１２９１頁、１９９８におけるＧＤＮＦおよびニューブラスチンの配列アライメントと比較して、ニューブラスチンにおける適切な残基を決定する。この番号付けスキームを、表１に示す。

ｎ／ａは、その残基がＧＤＮＦの構造に存在しないことを示す。これは、構造設計、可撓性領域、またはＧＤＮＦに対するニューブラスチンにおける挿入（残基６８〜７１）のいずれかに起因する。
−は、その残基が包埋されており、そして表面上にないか、またはジスルフィド結合に関与するシステイン残基であることを示す。このタンパク質がシステイン節である場合、これらの残基の大多数は、表面上に存在する。
＋は、その残基がＧＤＮＦ構造中で表面に露出されており、従って、ニューブラスチン中で表面に露出されることが推測されることを示すが、残基６６〜７５を含むループは、ＧＤＮＦモノマーのうちの一方（おそらく可撓性）のみに見られ得る。このループはまた、ＧＤＮＦに対するニューブラスチン中の４残基挿入を含む。

本明細書中で使用される場合、「同一性」および「相同」または「相同性」は、交換可能に使用され、２つのポリペプチド、分子または２つの核酸間の配列類似性をいう。２つの比較配列の両方におけるある位置が、同じ塩基またはアミノ酸のモノマーサブユニットによって占有される場合（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々におけるある位置が、アラニンによって占有される場合か、または２つのポリペプチドの各々におけるある位置が、リジンによって占有される場合）、それぞれの分子は、その位置で相同である。２つの配列間の相同性％は、その２つの配列によって共有される一致するかまたは相同な位置の数の関数であり、この数を、比較した位置の数で除算して１００を掛けたものである。例えば、２つの配列中の１０個の位置のうちの６個が、一致するかまたは相同である場合、２つの配列は、６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴおよびＣＡＧＧＴＴは、５０％の相同性を共有する（全６個の位置のうちの３個が一致する）。一般に、比較は、２つの配列を最大の相同性を与えるように整列された場合に行われる。このようなアライメントは、例えば、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）のようなコンピュータープログラムによって簡便に実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）の方法を使用して提供され得る。「類似」の配列は、整列された場合に、同一および類似のアミノ酸残基を共有する配列であり、ここで、類似の残基は、その整列された参照配列中の対応するアミノ酸残基に対する保存的置換またはその対応するアミノ酸の「許容される点変異」である。この点において、参照配列中の残基の「保存的置換」は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似する（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、化学特性（共有結合または水素結合を形成する能力を含む）などを有する）残基による置換である。従って、「保存的置換改変体」配列は、１以上の保存的置換または許容される点変異が存在するという点で参照配列または野生型配列と異なる配列である。

好ましい実施形態において、本発明に従うポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸８〜１１３に８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。いくつかの実施形態において、改変体ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列は、その改変体ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸１〜９４および９６〜１１３で、天然に存在するラット、ヒトまたはマウスのニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列を含み、例えば、このポリペプチドは、これらの位置で配列番号２、３または４のアミノ酸配列を有する。

配列番号１〜４に開示されるポリペプチドと配列が異なる改変体ニューブラスチンポリペプチドは、１以上の保存的アミノ酸置換を含み得る。あるいは、またはさらに、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、１以上の非保存的アミノ酸置換によってか、あるいは欠失または挿入によって異なり得る。好ましくは、置換、挿入または欠失は、単離されたタンパク質の生物学的活性を消失しない。

保存的置換としては、代表的に、以下のグループ内での置換のような、あるアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸での置換が挙げられる：バリン、アラニンおよびグリシン；ロイシン、バリンおよびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システインおよびトレオニン；リジンおよびアルギニン；ならびにフェニルアラニンおよびチロシン。非極性の疎水性アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。上記の極性、塩基性または酸性のグループの１つのメンバーの、同グループの別のメンバーでの任意の置換は、保存的置換とみなされ得る。

他の置換は、当業者に容易に同定され得る。例えば、アミノ酸アラニンについて、Ｄ−アラニン、グリシン、β−アラニン、Ｌ−システインおよびＤ−システインのいずれか１つで、置換がなされ得る。リジンについて、置換は、Ｄ−リジン、アルギニン、Ｄ−アルギニン、ホモ−アルギニン、メチオニン、Ｄ−メチオニン、オルニチン、またはＤ−オルニチンのいずれか１つであり得る。一般に、単離されたポリペプチドの特性において変化を誘導することが予測され得る機能的に重要な領域における置換は、（ｉ）極性残基（例えば、セリンまたはトレオニン）が、疎水性残基（例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンまたはアラニン）の代わりに置換されるか、または極性残基が疎水性酸基によって置換される；（ｉｉ）システイン残基が、任意の他の残基の代わりに置換されるか、またはシステイン残基が、任意の他の残基で置換される；（ｉｉｉ）正に荷電した側鎖を有する残基（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）が、負に荷電した側鎖を有する残基（例えば、グルタミン酸またはアスパラギン酸）の代わりに置換されるか、または正に荷電した側鎖を有する残基が、負に荷電した側鎖を有する残基で置換される；あるいは（ｉｖ）かさ高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が、このような側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）の代わりに置換されるか、またはかさ高い側鎖を有する残基が、このような側鎖を有さない残基で置換される、置換である。前述の非保存的置換の１つがタンパク質の機能的特性を変更し得る可能性はまた、タンパク質の機能的に重要な領域に対する置換位置に相関し：従って、いくつかの非保存的置換は、生物学的特性にほとんどまたは全く影響を有し得ない。

改変体ニューブラスチンポリペプチドを含む、マルチマーポリペプチドもまた、本発明によって提供される。マルチマーポリペプチドは、好ましくは、精製されたマルチマーポリペプチドとして提供される。マルチマー複合体の例としては、例えば、ダイマー複合体が挙げられる。マルチマー複合体は、ヘテロマーまたはホモマーの複合体として提供され得る。従って、マルチマー複合体は、１つの改変体ニューブラスチンポリペプチドおよび１つの非改変体ニューブラスチンを含むヘテロダイマー複合体であり得るか、または２以上の改変体ニューブラスチンポリペプチドを含むヘテロダイマー複合体であり得る。

いくつかの実施形態において、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、ＧＦＲα３に結合する。好ましくは、改変体ニューブラスチンポリペプチドの結合は、ＲＥＴポリペプチドのリン酸化を刺激する。ポリペプチドがＧＦＲα３に結合するか否かを決定するために、ＷＯ００／０１８１５に記載されるようなアッセイを行い得る。例えば、ＣＨＯ細胞株の培地上清中のニューブラスチンの存在は、Ｓａｎｉｃｏｌａら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９７，９４：６２３８）によって記載される三元複合体アッセイの改変形態を使用して示され得る。このアッセイにおいて、ＧＤＮＦ様分子の能力は、ＲＥＴの細胞外ドメインと種々のコレセプターＧＦＲα１、ＧＦＲα２およびＧＦＲα３との間の結合を媒介するそれらの能力について評価され得る。ＲＥＴの可溶性形態およびコレセプターは、融合タンパク質として生成される。ラットＲＥＴの細胞外ドメインと胎盤アルカリホスファターゼとの間の融合タンパク質（ＲＥＴ−ＡＰ）、およびラットＧＦＲα−１の細胞外ドメイン（公開された出願ＷＯ９７４４３５６（１９９７年１１月２７日）（本明細書中に参考として援用される）に開示される）とヒトＩｇＧ１のＦｃドメインとの間の融合タンパク質（ｒＧＦＲ（α１−Ｉｇ）が、記載されている（Ｓａｎｉｃｏｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９７，９４：６２３８）。

いくつかの実施形態において、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、ニューロンの生存を増強するか、またはニューロンの病理学的変化を正規化するか、あるいはその両方を行う。ポリペプチドが、ニューロンの生存を増強するか、またはニューロンの病理学的変化を正規化するかを決定するためのアッセイは、例えば、ＷＯ００／０１８１５に記載される。好ましくは、ニューロンは、感覚ニューロン、自律ニューロンまたはドパミン作用性ニューロンである。

（改変体ニューブラスチンポリペプチドの合成および単離）
改変体ニューブラスチンポリペプチドは、当該分野で公知の方法を用いて単離され得る。天然に存在するニューブラスチンポリペプチドは、標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームにより、細胞源または組織源から単離され得る。あるいは、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成され得る。短いアミノ酸配列の合成は、ペプチド分野で十分に確立されている。例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、１９８４）を参照のこと。

別の実施形態において、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術により生成される。例えば、改変体ニューブラスチンポリペプチドをコードする核酸分子が、ベクター（例えば、発現ベクター）に挿入され得、そしてこの核酸は、細胞に導入され得る。適切な細胞として、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞）、真菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および細菌細胞が挙げられる。組換え細胞中で発現される場合、細胞は、好ましくは、改変体ニューブラスチンポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養される。改変体ニューブラスチンポリペプチドは、所望の場合、細胞懸濁物から回収され得る。「回収する」は、改変ポリペプチドが、その回収プロセス前に存在する細胞または培養培地の成分から取り出されることを意味する。この回収プロセスは、１つ以上の再フォールディング工程または精製工程を含み得る。

改変体ニューブラスチンポリペプチドは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかを用いて構築され得る。１つのこのような方法は、部位特異的変異誘発であり、この方法において、特定のヌクレオチド（または、所望の場合、少数の特定のヌクレオチド）が、コードされるニューブラスチンポリペプチド中の１つのアミノ酸（または、所望の場合、少数の予め決定されたアミノ酸）を変更するために変更される。当業者は、部位特異的変異誘発が慣用的であり、広く利用されている技術であることを認識している。実際、多くの部位特異的変異誘発キットが市販されている。１つのこのようなキットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）から販売されている「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ」である。

本発明の実施には、他に示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組替えＤＮＡ、タンパク質化学、および免疫学の従来技術を利用し、これらは当該分野の技術範囲内である。このような技術は、文献に記載されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８９；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏｌｕｍｅ ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編）、１９８５；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ、編）、１９８４；米国特許第４，６８３，１９５（Ｍｕｌｌｉｓら）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｉｎｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）、１９８４；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）、１９８４；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）．Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．、１９８７；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６；Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１３．Ｐｅｒｂａｌ）、１９８４；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ １５４および１５５（Ｗｕら編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編）、１９８７、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｒｎｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）、１９８６；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８６を参照のこと。

（改変体ニューブラスチン融合タンパク質）
所望の場合、改変体ニューブラスチンポリペプチドは、融合タンパク質として提供され得る。本発明のタンパク質の融合ポリペプチド誘導体はまた、生物学的活性を保持する種々の構造形態の主要タンパク質を含む。本明細書中で使用する場合、「融合」は、２つ以上のタンパク質またはそれらのフラグメントの、それらの個々のペプチド骨格を通じた同一直線上の共有結合を意味し、最も好ましくは、同一のリーディングフレームにそれらのタンパク質をコードする（すなわち、「インフレーム」の）ポリヌクレオチド分子の遺伝子発現を通じた同一直線上の共有結合である。タンパク質またはそれらのフラグメントが、異なる供給源由来であることが好ましい。従って、好ましい融合タンパク質として、第２の部分（改変体ニューブラスチンではない）に共有結合された改変体ニューブラスチンタンパク質またはフラグメントが挙げられる。好ましくは、第２の部分は、モノマーとして存在し、ニューブラスチンポリペプチドに増強された溶解性および／または生物学的利用性（バイオアベイラビリティー）を付与するのに十分なポリペプチドから獲得される。

例えば、「改変体ニューブラスチン／ヒト血清アルブミン融合体」は、本発明の改変体ニューブラスチンポリペプチドまたはそのフラグメントのＮ末端またはＣ末端が、ヒト血清アルブミンポリペプチドにインフレームで連結された本発明の改変体ニューブラスチンポリペプチドまたはそのフラグメントを含むタンパク質である（例えば、Ｓｙｅｄら、Ｂｌｏｏｄ、１９９７、８９：３２４３およびＹｅｈら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． ＵＳＡ １９９２、８９：１９０４）ならびに米国特許第５，８７６，９６９号および同第５，３０２，６９７号を参照のこと。用語「融合タンパク質」は、さらに、改変体ニューブラスチンタンパク質ではなく、以下に記載されるような精製タンパク質からデノボ合成された第２の部分に、単機能分子または複機能分子を介して化学的に連結された改変体ニューブラスチンを含む。

ニューブラスチン−血清アルブミン融合体は、当該分野で公知の方法を用いて構築され得る。対応するアミノ反応基およびチオール反応基を含む多くの架橋剤のいずれかが、ニューブラスチンを血清アルブミンに連結するために使用され得る。適切なリンカーの例として、チオール反応性マレイミドを挿入するアミン反応性架橋剤が挙げられる。これらとして、例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、またはＧＭＢＳが挙げられる。他の適切なリンカーは、チオール反応性ハロアセテート基を挿入する。これらとして、例えば、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢが挙げられ、スルフヒドリル基と反応して還元性連結を提供するための保護チオールまたは非保護チオールを提供するものは、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、またはＳＡＴＰであり、これらは全て、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）。当業者は、ニューブラスチンのＮ末端と血清アルブミンを連結する代替のストラテジーを同様に想到し得る。

当業者が、ＮＢＮのＮ末端または血清アルブミンのチオール部分に標的化されない血清アルブミンとの結合体を作製し得ることもまた想到される。所望の場合、ＮＢＮ−血清アルブミン融合体は、遺伝子工学技術を用いて作製され得る。ここで、ＮＢＮは、そのＮ末端、Ｃ末端または両末端で血清アルブミン遺伝子と融合される。

動物（ヒトを含む）中で延長された半減期を有する生成物を生じる任意のＮＢＮ結合体が、類似のストラテジーを用いて作製され得ることが、さらに企図される。

改変体ニューブラスチンの他の誘導体として、改変体ニューブラスチンまたはそのフラグメントと、他のタンパク質またはポリペプチドとの（例えば、さらなるＮ末端またはＣ末端としての組換え培養物中での合成による）共有結合性結合体または凝集性結合体が挙げられる。例えば、結合体化されるペプチドは、細胞膜または細胞壁の内側または外側でその合成部位から機能部位への移動を同時翻訳によるかまたは翻訳後に指向する、タンパク質のＮ末端領域のシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列（例えば、酵母α因子リーダー）であり得る。ニューブラスチンレセプタータンパク質は、ニューブラスチンの精製または同定を容易にするために付加されたペプチドを含み得る（例えば、ヒスチジン／ニューブラスチン融合体）。ニューブラスチンのアミノ酸配列はまた、ペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）に連結され得る（Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４、１９８８）。後者の配列は、非常に抗原性であり、そして特異的なモノクローナル抗体により可逆的に結合され、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にするエピトープを提供する。

この配列はまた、Ａｓｐ−Ｌｙｓ対の直後の残基で、ウシ粘膜エンテロキナーゼにより特異的に切断される。

（ポリマーに結合体化された改変体ニューブラスチンポリペプチド）
所望の場合、１つのポリマー分子が、ニューブラスチンポリペプチドとの結合体化のために使用され得るが、１つより多いポリマー分子が同様に結合され得ることもまた企図される。本発明の結合体化ニューブラスチン組成物は、インビボ適用および非インビボ適用の両方において有用性を見出し得る。さらに、結合体化ポリマーは、最終用途の適用に適切なように、任意の他の基、部分、または他の結合体化された種を使用し得ることが認識される。例として、そのポリマーに対してＵＶ分解耐性または抗酸化性あるいは他の特性または特徴を付与する官能部分をそのポリマーに共有結合させることが、いくつかの適用において有用であり得る。さらなる例として、結合体化物質全体の種々の特性または特徴を増強するようにそのポリマーを反応性または架橋可能にするために、そのポリマーを官能化することが、いくつかの適用において有利であり得る。従って、ポリマーは、その意図する目的のための結合体化ニューブラスチンムテイン組成物の効果を妨げない任意の官能基、反復基、連結、または他の構成性構造を含み得る。

これらの所望の特徴を達成するために有用に使用され得る例示的なポリマーは、例示的な反応スキームにおいて本明細書中以下に記載される。共有結合したペプチドの適用において、ポリマーは官能化され得、次いで、このペプチドの遊離アミノ酸に連結されて不安定な結合を形成し得る。

いくつかの実施形態において、ニューブラスチンポリペプチドは、ポリペプチドの末端反応基を通じてポリマーに連結される。あるいは、またはそれに加えて、ニューブラスチンポリペプチドは、内部リジン残基（例えば、天然に存在するニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸配列に導入されたリジン残基）の側鎖アミノ基を通じて連結され得る。従って、結合体はまた、非末端反応基から分枝され得る。反応基を有するポリマーは、本明細書中で「活性化ポリマー」として表される。この反応基は、タンパク質中の遊離アミノ基または他の反応基と選択的に反応する。

結合は、活性化ポリマーにおいて、任意の利用可能なニューブラスチンアミノ基（例えば、リジン残基またはニューブラスチンポリペプチドもしくはその改変体のアミノ酸配列に導入された残基のαアミノ基またはεアミノ基）で生じ得る。ニューブラスチンの遊離のカルボキシル基、適切に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化糖質部分、およびメルカプト基（利用可能な場合）もまた、結合部分として使用され得る。

一般的に、タンパク質濃度に依存して、１モルのタンパク質あたり約１．０〜約１０モルの活性化ポリマーが使用される。最終量は、反応の程度を最大にしつつ生成物の非特異的修飾を最小限に抑えることと、同時に最適な活性を維持する化学特性を規定しつつ同時に、可能な場合、タンパク質の半減期を最適化することとの間の釣り合いである。好ましくは、そのタンパク質の生物学的活性の少なくとも約５０％が保持され、そして最も好ましくは、ほぼ１００％が保持される。

この反応は、反応基がＮ末端のαアミノ基上に存在する場合、好ましくは、約ｐＨ５〜８（例えば、ｐＨ５、６、７、または８）にて、生物学的に活性な物質と不活性ポリマーとを反応させるために使用される任意の適切な方法により行われ得る。一般的に、このプロセスは、活性化ポリマーを調製する工程、およびその後にこの活性化ポリマーとタンパク質を反応させて処方に適した可溶性タンパク質を生成する工程を包含する。上記の修飾反応は、１つ以上の工程を包含し得るいくつかの方法により実施され得る。

ポリマーは、当該分野で公知の方法を用いて改変体ニューブラスチンポリペプチドに連結され得る。例えば、１つの実施形態において、ポリアルキレングリコール部分が、ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドのリジン基に連結され得る。リジン基への連結は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル（例えば、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（ＳＳ−ＰＥＧ）およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ））を用いて実施され得る。適切なポリアルキレングルコール部分として、例えば、カルボキシメチル−ＮＨＳ、ノルロイシン−ＮＨＳ、ＳＣ−ＰＥＧ、トレシレート、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール、およびＰＮＰカルボネートが挙げられる。

さらにアミン反応性ＰＥＧリンカーが、スクシンイミジル部分と置換され得る。これらとして、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカルボネート、エポキシド、およびベンゾトリアゾールカルボネートが挙げられる。条件は、好ましくは、選択性および程度または反応を最大にするよう選択される。直鎖形態または分枝形態のＰＥＧは、他のアルキル形態と同様に使用され得る。ＰＥＧの長さは変更され得る。最も一般的な形態は、２Ｋ〜１００Ｋの大きさで変更され得る。本実施例は、Ｎ末端での標的化されたペグ化が薬物動態特性に影響を及ぼさないこと、生理学的機能を保持する物質は、本明細書中で開示される部位での修飾が有害でないことを示すという事実を報告する。従って、リジン残基の挿入を通じた結合のさらなる部位を提供し得る変異形態のＮＢＮを作製する上で、これらの形態はリジンおよびＮ末端の両方でペグ化されるという起こり得る結果が、容認可能であるとみなされる。

所望の場合、ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）改変体ポリペプチドは、タグ（例えば、その後のタンパク質分解によって放出され得るタグ）を含み得る。従って、リジン部分は、ヒスタグ改変体を、リジンおよびＮ末端の両方と反応する低分子量リンカー（例えば、Ｔｒａｕｔ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ））と最初に反応させ、次いで、このヒスタグを放出することによって、選択的に改変され得る。次いで、このポリペプチドは、チオール反応性ヘッド基（例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基または遊離ＳＨもしくは保護ＳＨ）を含むＰＥＧで選択的に修飾され得る遊離ＳＨを含む。

Ｔｒａｕｔ試薬は、ＰＥＧ結合についての特定の部位を構築する任意のリンカーで置換され得る。例として、Ｔｒａｕｔ試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡまたはＳＡＴＰ（全てＰｉｒｅｃｅから入手可能）で置換され得る。同様に、このタンパク質を、マレイミド（例えば、ＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳまたはＧＭＢＳ）、ハロアセテート基（ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ）またはビニルスルホン基を挿入するアミン反応性リンカーと反応させ得、そして得られた生成物を、遊離ＳＨを含むＰＥＧと反応させ得る。使用されるリンカーのサイズに対する唯一の制限は、Ｎ末端タグの引き続く除去をブロックできないことである。

従って、他の実施形態において、ポリアルキレングリコール部分は、ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドのシステイン基とカップリングされる。カップリングは、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基およびチオール基を使用して、もたらされ得る。

改変体ニューブラスチンポリペプチド上の１以上の部位は、ポリマーとカップリングされ得る。例えば、１、２、３、４、または５個のＰＥＧ部分が、ポリマーに結合され得る。いくつかの実施形態において、ＰＥＧ部分は、表１に示されるように番号付けされたニューブラスチンポリペプチドのアミノ末端および／またはアミノ酸１４、３９、６８および９５で結合される。

好ましい実施形態において、組成物中の改変体ニューブラスチンポリペプチドは、ポリマーの非存在下での改変体ニューブラスチンポリペプチドの半減期と比較して、より長い半減期を有する。あるいは、またはさらに、組成物中の改変体ニューブラスチンポリペプチドは、ＧＦＲα３に結合し、ＲＥＴを活性化し、ニューロンの病理学的変化を中和するか、またはニューロンの生存を増強するか、あるいはこれらの生理学的機能の組み合わせを実行する。

好ましい実施形態において、この組成物は、安定な水溶性結合体化ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチド複合体（これは、ポリエチレングリコール部分とカップリングされたニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドを含む）として提供され得る。所望の場合、ニューブラスチンポリペプチドまたは改変体ニューブラスチンポリペプチドは、不安定な結合によってポリエチレングリコール部分とカップリングされ得る。この不安定な結合は、例えば、生化学的加水分解、タンパク質分解またはスルフヒドリル切断によって、切断され得る。例えば、この結合は、インビボ（生理学的）条件下で切断され得る。

（改変体ニューブラスチン−ポリマー結合体を含む薬学的組成物）
本発明の改変体ニューブラスチン−ポリマー結合体を含む薬学的組成物がまた、提供される。「薬学的組成物」は、本明細書中で使用される場合、本発明のニューブラスチンタンパク質または結合体を含み、生理学的に受容可能なビヒクル中に分散され、必要に応じて１以上の他の生理学的に適合性の成分を含むとして定義される。従って、薬学的組成物は、賦形剤（例えば、水、１以上のミネラル、糖、界面活性剤）および１以上のキャリア（例えば、不活性タンパク質（例えば、ヘパリンまたはアルブミン））を含み得る。

本発明のポリマー−ニューブラスチン結合体は、それ自体で、ならびに薬学的に受容可能なエステル、塩および他の生理学的に機能的な誘導体の形態で、投与され得る。このような薬学的処方物または医学的処方物において、改変体ニューブラスチン結合体は、好ましくは、１以上の薬学的に受容可能なキャリアおよび必要に応じて任意の他の治療成分と共に使用される。

キャリアは、処方物の他の成分と適合性であり、そしてそのレシピエントに対して過度に有害でないという意味で、薬学的に受容可能でなければならない。改変体ニューブラスチンは、本明細書中に記載されるような所望の薬理学的効果または医学的に有利な効果を達成するに有効な量で、そして所望の生物利用可能なインビボ用量または濃度を達成するに適切な量で提供される。

処方物としては、非経口投与ならびに経口投与および特異的投与様式（経口、直腸、頬、局所、鼻、眼、皮下、筋内、静脈内、経皮、髄腔内、関節内、動脈内、クモ膜下、気管支、リンパ、膣、および子宮内投与を含む）に適切な処方物が挙げられる。エアロゾルおよび非経口投与、局所的投与および全身投与の両方に適切な処方物が好ましい。

改変体ニューブラスチンが、液体溶液を含む処方物中で使用される場合、この処方物は、経口的、気管支的または非経口的に、有利に投与され得る。ニューブラスチンが、液体懸濁処方物中で、または生物適合性のキャリア処方物中の粉末として使用される場合、この処方物は、経口的、直腸的または気管支的に有利に投与され得る。あるいは、この処方物は、適切な噴霧デバイスを備える呼吸回路から患者により吸入される粉末の気体分散物を形成する、キャリア気体中の粉末の噴霧を介して、経鼻または気管支的に投与され得る。

本発明のタンパク質を含む処方物は、単位投薬形態で簡便に提供され得、そして薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製され得る。このような方法は、一般に、活性成分を、１以上のアクセサリ成分を構成するキャリアと結合させる工程を包含する。

代表的に、この処方物は、活性成分を、液体キャリア、微細に分割された固体キャリアまたはこれら両方と均一かつ密に関連させ、次いで必要な場合には、生成物を所望の処方物の投薬形態へと成形することによって、調製される。

経口投与に適切な本発明の処方物は、別個の単位（例えば、カプセル、カシェ剤、錠剤またはロゼンジ（各々、粉末または顆粒として所定量の活性成分を含む））として提供され得るか；または水性溶液もしくは非水性溶液中の懸濁物（例えば、シロップ、エリキシル剤、エマルジョンまたは一回分）として提供され得る。

非経口投与に適切な処方物は、簡便には、活性結合体の滅菌水性調製物（これは、好ましくは、レシピエントの血液と等張である（例えば、生理学的食塩水））を含む。このような処方物は、懸濁剤および増粘剤、または化合物を血液成分もしくは１以上の器官へと標的化するために設計される他の微粒子系を含み得る。この処方物は、単位用量または単位投薬形態で提供され得る。

鼻スプレー処方物は、保存剤および等張剤と共に活性な結合体の精製水溶液を含む。このような処方物は、好ましくは、鼻粘膜に適合性のｐＨおよび等張状態に調整される。

直腸投与のための処方物は、適切なキャリア（例えば、ココアバター、水素付加脂肪、または水素付加脂肪カルボン酸）を用いて、坐剤として提供され得る。ｐＨおよび等張因子が、好ましくは、眼のｐＨおよび等張に調整される点を除いて、点眼剤のような眼処方物は、鼻スプレーと類似の方法により調製される。

局所的処方物は、１以上の媒体（例えば、鉱油、石油、ポリヒドロキシアルコール）または局所的薬学的処方物のために使用される他の基剤中に、溶解または懸濁された本発明の結合体を含む。

上記の成分に加えて、本発明の処方物は、希釈剤、緩衝液、香味剤、崩壊剤、界面活性剤、増粘剤、潤沢剤、保存剤（抗酸化剤を含む）などから選択される１以上のアクセサリ成分をさらに含み得る。上記の考慮はまた、本発明のニューブラスチン融合タンパク質（例えば、ニューブラスチン−ＨＳＡ融合物）にも適用される。

従って、本発明は、本発明の好ましい例示的な適用として、溶液中の改変体ニューブラスチン結合体のインビトロ安定性に適切な融合タンパク質の提供を意図する。融合タンパク質は、例えば、酵素的分解に対する改変体ニューブラスチンポリペプチドの耐性を増大し、そして有効期限、室温での安定性などを改善する手段を適用するために、使用され得る。上記の考慮はまた、本発明のニューブラスチン−血清アルブミン融合タンパク質（ヒトニューブラスチン−ヒト血清アルブミン融合タンパク質を含む）にも適用されることが理解される。

（処置方法）
改変体ニューブラスチンポリペプチドならびにその融合タンパク質または結合体は、生きている動物体（好ましくは、哺乳動物、より好ましくはヒトを含む霊長類）の障害または疾患を処置または改善するために使用され得、この障害または疾患は、神経栄養剤の活性に応答性である。

本発明の組成物は、例えば、注射、移植または摂取された薬学的組成物を介して、直接的に、ニューブラスチンポリペプチドに対して応答性の病理学的プロセスを処置するために使用され得る。この組成物は、生きている動物体（ヒトを含む）の障害または疾患を処置または改善するために使用され得、この障害または疾患は、神経栄養剤の活性に応答性である。この障害または疾患は、特に、外傷、手術、虚血、感染、代謝疾患、栄養欠乏、悪性疾患または毒性因子、および遺伝的プロセスまたは特発性プロセスによって引き起こされる神経系の損傷であり得る。

この損傷は、特に、脊髄の背側神経節中、または以下の組織：膝神経節、下神経節および結節神経節；８番目の脳神経の聴覚前庭複合体；三叉神経節の上下顎葉の腹側外側局；ならびに中脳三叉核のいずれか中のニューロンを含む、感覚ニューロンもしくは網膜神経節細胞に対して生じたものであり得る。

本発明の方法の好ましい実施形態において、この疾患または障害は、病変したニューロンまたは外傷性ニューロンを含む神経変性疾患（例えば、末梢神経、髄質および／または脊髄の外傷性病変、大脳虚血神経損傷、ニューロパシーおよび特に末梢ニューロパシー、末梢神経外傷または損傷、虚血発作、急性脳損傷、急性脊髄損傷、神経系腫瘍、多発性硬化症、神経毒への曝露、代謝疾患（例えば、糖尿病もしくは腎機能不全）、ならびに感染性因子によって引き起こされる損傷、神経変性障害（アルツハイマー病、ハンティングトン病、パーキンソン病、パーキンソン−プラス（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ−Ｐｌｕｓ）症候群、進行性核上麻痺（スティール−リチャードソン−オルスゼフスキー症候群）、オリーブ橋小脳萎縮（ＯＰＣＡ）、シャイ−ドレーガー症候群（多発性系萎縮症）、ゴム腫振せん麻痺痴呆複合症、筋萎縮性側索硬化症、または任意の他の先天性疾患もしくは神経変性疾患、および痴呆に関連する記憶障害）である。

好ましい実施形態において、感覚ニューロンおよび／または自律神経系ニューロンが、処置され得る。特に、侵害受容ニューロンおよび機械的受容ニューロン、より具体的にはデルタ線維ニューロンおよびＣ−線維ニューロンが、処置され得る。さらに、自律神経系の交感ニューロンおよび副交感ニューロンが、処置され得る。

別の好ましい実施形態において、運動神経疾患（例えば、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」））および脊髄筋萎縮症が処置され得る。なお別の好ましい実施形態において、本発明のニューブラスチン分子は、外傷性損傷後の神経回復を増強するために使用され得る。あるいは、またはさらに、改変体ニューブラスチンポリペプチド、または改変体ニューブラスチンポリペプチドの融合物もしくは結合体を含むマトリックスを有する神経ガイダンスチャネルが、本明細書中に記載される方法において使用され得る。このような神経ガイダンスチャネルは、例えば、米国特許第５，８３４，０２９号（本明細書中で参考として援用される）に開示される。

好ましい実施形態において、本明細書中に開示される組成物（および同じものを含む薬学的組成物）は、末梢ニューロパシーの処置において使用される。本発明の分子を用いる処置について意図される末梢ニューロパシーのなかでも、外傷誘導性のニューロパシー（例えば、物理的損傷状態もしくは疾患状態、脳に対する物理的損傷、脊髄に対する物理的損傷、脳損傷に関連する発作および神経変性に関連する神経学的障害によって引き起こされるニューロパシー）である。感染、毒素曝露、および薬物曝露に二次的なニューロパシーもまた、本明細書に含まれる。全身疾患または代謝疾患に二次的なニューロパシーもまた、なおさらに本明細書中に含まれる。本明細書中で開示される組成物はまた、化学療法誘導性のニューロパシー（例えば、化学療法剤（例えば、タキソールまたはシスプラチン）の送達により引き起こされるニューロパシー）；毒素誘導性ニューロパシー、薬物誘導性ニューロパシー、ビタミン欠乏誘導性ニューロパシー；特発性ニューロパシー；および糖尿病性ニューロパシーを処置するために使用され得る。例えば、米国特許第５，４９６，８０４号および同第５，９１６，５５５号（各々、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。

本明細書中に記載される組成物を使用して処置され得るさらなる状態は、軸索のニューロパシーおよび脱髄性ニューロパシーを含む、モノニューロパシー、モノ複合型（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ニューロパシーおよび多発性ニューロパシーであり、本明細書中に記載される組成物を使用する。

別の好ましい実施形態において、本発明の組成物（およびニューロブラスチンを含む薬学的組成物）は、黄斑変性、色素性網膜炎、緑内障および類似の疾患に罹患した患者の網膜における光受容体の損失を含む、眼における種々の障害の処置において使用される。

本発明は、さらに、以下の非限定的な実施例において例証される。

（実施例１−Ｎ末端ペグ化されたニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）のバイオアベイラビリティ）
ラットの静脈内に投与された場合、ＣＨＯ細胞から得られた組換えヒトニューブラスチンが、循環から迅速に取り除かれることが観察された。皮下の投与のあとには、いかなるタンパク質も、血清中に検出されなかった。ニューブラスチンのバイオアベイラビリティーを増加するために、ペグ化形態を、構築した。

ＮＢＮ配列中にはリジンが存在しないので、アミン特異的ペグ化化学は、アミノ末端で、ＮＢＮポリペプチドのペグ化を生じる。従って、ニューブラスチンの２量体の各々について、２つのＰＥＧ部分が、結合されるはずである。従って、アミン特異的化学によって、ＰＥＧ形態を、Ｎ末端に対して、はじめに直接的に標的化する。驚くべきことに、２つのペグ化でも、結合した２０Ｋ ＰＥＧは、半減期に対する利益をほとんど有さず、クリアランス経路に基づく機構が、ペグ化によって達成されると期待された半減期の増強より優先したことを示す。

（実施例２−ペグ化ニューブラスチンＮ９５Ｋムテインの構築）
内部のアミノ酸残基がペグ化されたＮＢＮ変異体形態のバイオアベイラビリティーを、次に試験した。配列中の選択された部位にリジンを挿入するため、天然に存在する残基を１４位、３９位、６８位および９５位で置換する一連の４つの変異体を、設計した。これらのリジンは、ＰＥＧ結合のための代替部位を提供する。表面残基を同定するための枠組みとして、ＧＤＮＦの結晶構造（Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：４３５−８，１９９７）を用いて、そして、回避されるべき機能的に重要な領域を構造において同定するために、パーセフィン（ｐｅｒｓｅｐｈｉｎ）／ニューブラスチンキメラ変異誘発研究（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：３４１２−２０，２０００）を用いて、これらの部位を選択した。

２つの変異（Ｒ３９およびＲ６８）を、ヘパリン結合部位（その迅速なクリアランスにおそらく寄与するそのタンパク質の特性）を示し得る、表面上の正電荷の分布に基づく領域において標的化した。第３の部位を、野生型ＮＢＮにおける天然のグリコシル化部位であるＮ９５で標的化した。この部位を、複雑な糖質構造を用いて天然に改変される。従って、この部位におけるＰＥＧを用いる改変は、機能に影響するとは予測されない。第４の部位（Ｒ１４）を、いずれの他の改変によってもカバーされない領域において、選択した。９５位のアスパラギン残基がリジンで置換された変異体（Ｎ９５Ｋ変異体）を、本明細書中に開示される研究のために選択した。

ラットニューブラスチンポリペプチドの野生型配列において１つ以上の変更を有する、４つの異なるラットニューブラスチンムテインを構築した。これらのムテインとしては、単一のＮ９５Ｋムテインならびにラットニューブラスチンのアミノ酸配列中の他の部位に単一の置換を有するムテイン：Ｒ１４Ｋ；Ｒ６８ＫおよびＲ３９Ｋが挙げられる。「Ｘ_１Ｎ_１Ｘ_２」という名称において、Ｘ_１は、野生型ニューブラスチンポリペプチドのアミノ酸をいい、Ｎ_１は、配列番号１に従い番号付けされた、配列中におけるＸ_１アミノ酸の数値的な位置をいう。Ｘ_２は、配列中の示された数値的な位置における、野生型アミノ酸を置換したアミノ酸をいう。

ラットＮ９５Ｋニューブラスチン変異を構築するために、部位特異的変異誘発を、野生型ラットニューブラスチンをコードするプラスミド、ｐＣＭＢ０２０に対して行った。野生型ラットニューブラスチン核酸配列およびこれによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を、以下に示す：

。

オリゴヌクレオチドＫＤ２−３１０およびＫＤ３−２１１：

を使用するｐＣＭ０２０の変異誘発によって、プラスミドｐＣＭＢ０２７の形成を生じた。

ｐＣＭＢ０２７において、９５位でアスパラギンをコードするコドンを、リジンをコードするコドンで置換した。

ｐＣＭＢ０２０のニューブラスチンコード配列中の１４位でアルギニンをコードするコドンを、リジンをコードするコドンで置換することによって、Ｒ１４Ｋニューブラスチンムテインを形成した。オリゴヌクレオチドＫＤ３−２５４およびＫＤ３−２５５：

を使用して、部位特異的変異誘発を、ｐＣＭＢ０２０に対して行った。

得られた構築物を、ｐＣＭＢ０２９と名付けた。

ｐＣＭＢ０２０のニューブラスチンコード配列中の６８位でアルギニンをコードするコドンを、リジンをコードするコドンで置換することによって、Ｒ６８Ｋニューブラスチンムテインを形成した。オリゴヌクレオチドＫＤ３−２５８およびＫＤ３−２５９：

を使用して、部位特異的変異誘発を、ｐＣＭＢ０２０に対して行った。

得られた構築物を、ｐＣＭＢ０３０と名付けた。

ｐＣＭＢ０２０のニューブラスチンコード配列中のアミノ酸３９位のアルギニンを、リジンで置換することによって、Ｒ３９Ｋニューブラスチンムテインを形成した。オリゴヌクレオチドＫＤ３−２５６およびＫＤ３−２５７：

を使用して、部位特異的変異誘発を、ｐＣＭＢ０２７に対して行った。

発現および精製のために、ラットＮＢＮ Ｎ９５Ｋムテインをコードするプラスミドを、成熟した１１３アミノ酸のＮＢＮ配列の開始部位に直ぐ隣接するエンテロキナーゼ切断部位を有するＨｉｓタグ融合タンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉを、５００Ｌの発酵槽で増殖させ、そして凍結した細胞ペーストを、提供した。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、Ｍａｎｔｏｎ Ｇａｕｌｉｎ Ｐｒｅｓｓにおいて溶解し、ラットＮＢＮ ＮＫを、洗浄された不溶性ペレット画分から回収した。

塩酸グアニジンを用いて、ペレットからＮＢＮを抽出し、リフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）し、そしてエンテロキナーゼを用いてヒスチジンタグを除去した。次いで、産物を、Ｎｉ ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）およびＢａｋｅｒｂｏｎｄ ＷＰ ＣＢＸカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィーに供した。

ヒスタグ産物のエンテロキナーゼ処理は、成熟配列中のアルギニン７でのタンパク質の異常な切断を起こした。得られたｄｅｓ１−７ ＮＢＮ産物は、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡにおいて十分に活性であり、そしてグアニジン誘導性の変性に対する感受性において成熟形態と構造的に識別できなかったので、引き続く作業に使用した。

ラットＮＢＮ Ｎ９５Ｋを、反応物として１０，０００Ｄａの分子量を有するメトキシルポリ（エチレングリコール）−スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ−ＰＥＧ）を使用して、平均３．３ＰＥＧ部分／１分子で、ペグ化した。得られたペグ化産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、逆相ＨＰＬＣ、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析法（ＭＡＬＤ／ＩＭＳ）、ペプチドマッピング、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡにおける活性の評価および内毒素含有量の決定による分析を含む、大規模な特性付けに供した。ペグ化に先立って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣによって測定された、ＮＢＮ Ｎ９５Ｋ産物の純度は、９５％より高かった。非還元条件の下で、２量体として移動したＮＢＮ Ｎ９５Ｋ産物は、予想された構造と一致する。ペグ化の後、得られた産物は、２ＰＥＧ／分子が産物の５％、３ＰＥＧ／分子が産物の６０％、４ＰＥＧ／分子の産物の３０％およびより高い質量のいくつかの微量形態を含む一連の修飾された付加物からなった。ペグ化されたサンプルにおいて、凝集の証拠はなかった。産物における未修飾ＮＢＮの残留レベルは、定量の限界を下回った。材料の内毒素含有量は、通常１ＥＵ／ｍｇ未満である。ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡにおけるペグ化されたＮＢＮの比活性は、１０ｎＭである。このペグ化産物を、ｐＨ６．５のＰＢＳ中に１．１ｍｇ／ｍＬで処方した。ｗｔ−ＮＢＮと類似の効力である材料を、凍結した液状物として提供し得、これを−７０℃で保存する。

Ｒ１４Ｋムテイン、Ｒ３９ＫムテインおよびＲ６８Ｋムテインを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、Ｎ９５Ｋ−ＮＢＮについて上記のように、精製、ペグ化および機能の評価について同一の方法に供し得る。

（ペグ化ＮＢＮの調製）
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生され、そしてを含む５ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ中で４℃で保管した、２３０ｍＬのリフォールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）されたラットＮＢＮ Ｎ９５Ｋ（２．６ｍｇ／ｍＬ）を、７７ｍＬの水、１４．４ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、および２．８ｇ（１０ｍｇ／ｍＬ最終濃度）のＰＥＧ ＳＰＡ １０，０００ Ｄａ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．）を使用して希釈した。サンプルを、遮光して、室温で４時間インキュベートし、次いで５ｍＭのイミダゾール（最終濃度）で処置し、濾過し、そして４℃で一晩保管した。２つのバッチ（１つは１３０ｍＬのＮＢＮ Ｎ９５Ｋバルクを有し、もう１つは１００ｍＬのバルクを有する）で、産物を生成した。ペグ化ＮＢＮを、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＥＭＤ Ｓ０_３ ⁻（Ｍ）（ＥＭ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）上で、反応混合物から精製した。このカラムを、室温で流した。全ての緩衝液を、発熱物質を含まないように調製した。塩化ナトリウムを、最終濃度８７ｍＭとなるように、反応混合物に加え、サンプルを、４５ｍＬのＦｒａｃｔｏｇｅｌカラム（内径５ｃｍ）にロードした。

このカラムを、１カラム容量の５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、８０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄し、次いで、１カラム容量アリコートの、５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５ｍＭリン酸ナトリウムで３回洗浄した。この樹脂を、直径２．５ｃｍ径のカラムに移し、そしてペグ化ＮＢＮを、５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、４００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＬの工程を６回、５００ｍＬのＮａＣｌを含む工程を３回、６００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＬの工程を６回使用して、カラムから溶出した。溶出画分を、２８０ｎｍの吸光度を用いて、タンパク質含量について、分析し、次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥによって修飾の程度について分析した。選択された画分をプールし、０．２μｍのフィルタを通して濾過し、そして水を用いて１．１ｍｇのペグ化ラットＮＢＮ／ｍＬに希釈した。個々のバッチ中の内毒素レベルの評価の後、これらをプールし、そして０．２μｍの膜を通して再濾過した。最終物質を、等分し、そして−７０℃で保存した。

（精製されたペグ化ＮＢＮ ＮＫのＵＶスペクトル）
ペグ化ＮＢＮ ＮＫのＵＶスペクトル（２４０〜３４０ｎｍ）を、ニートなサンプルにとった。サンプルを、３連で分析した。ペグ化サンプルは、２７５〜２７７ｎｍに吸収極大を、そして２４７〜２４９ｎｍに吸収極小を示した。この結果は、未修飾ＮＢＮバルク中間体について観測された結果と一致した。このペグ化産物のタンパク質濃度を、Σ_２８０ ^０．１％＝０．５０である吸光率を使用してスペクトルから評価した。ペグ化ＮＢＮバルクのタンパク質濃度は、１．１ｍｇ／ｍＬである。３２０ｎｍに吸収を欠くことによって明らかなように、サンプル中に濁りは存在しなかった。

（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるペグ化ＮＢＮ ＮＫの特徴付け）
３、１．５、０．７５および０．３μｇの産物を含有するペグ化ＮＢＮのアリコートを、４〜２０％のゲル勾配（Ｏｗｌ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。このゲルを、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色した。分子量マーカー（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を、並列して流した。

非還元条件下でのペグ化ＮＢＮ ＮＫのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、一連のバンドが、２、３、４および４より多くのＰＥＧ／分子を有する改変に対応することを明らかにした。９８ｋＤａの見掛けの分子量を有する主要なバンドは、３ ＰＥＧ／分子を含む。精製において、ペグ化産物である未修飾ＮＢＮは、検出されなかった。２、３または４つのＰＥＧが結合した産物の混合物の存在を、ＭＡＬＤＩ質量分析法によって立証した。２、３および４つのＰＥＧを含有する産物の比を、デンシトメトリーによって決定し、そしてそれぞれ全体で、７％、６２％および３０％であることを決定した。

（ペグ化ＮＢＮのサイズ除外クロマトグラフィーによる特徴付け）
ペグ化ＮＢＮを、５ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．５）、３００ｍＭ ＮａＣｌを移動相として使用して、分析用Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６ ＨＲ１Ｏ／３０ＦＰＬＣカラムでのサイズ除外クロマトグラフィーに供した。カラムを、２０ｍＬ／時間で流した。溶出分画を、２８０ｎｍでの吸光度について、モニタリングした。約２００ｋＤａの見かけの分子量を有する単一のピークとして溶出されたペグ化ＮＢＮは、ＰＥＧの大きな流体力学的容積と一致する。凝集の証拠は観察されなかった。約３０ｋＤａの見かけの分子量を有して溶出する遊離のＮＢＮは、調製物中に検出されなかった。

（逆相ＨＰＬＣによるペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）ＮＢＮの分析）
ペグ化ＮＢＮ ＮＫをＶｙｄａｃ Ｃ_４（５μｍ、１ｘ２５０ｍｍ）カラムの逆相ＨＰＬＣに供した。このカラムを、４０〜６０％Ｂ（緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：７５％アセトニトリル／０．０８５ＴＦＡ）の６０ｍｍ勾配を用いて展開した。このカラム溶出液を、２１４ｍｍの吸収についてモニターし、そして画分を引き続く分析のために収集した。ペグ化ＮＢＮ ＮＫを、Ｃ_４カラムの逆相ＨＰＬＣにより、その種々のジペグ化成分（６０．５ｍｍ）、トリペグ化成分（６３．３ｍｍ）、およびテトラペグ化成分（６７．８ｍｍ）に分画した。ピークの相対強度は、この成分の比率が、それぞれ、５．４％、６０．５％、および３０．１％であることを示唆する。ピーク同定を、ＭＡＬＤＩ−ＭＳにより検証した。この生成物における非ペグ化ＮＢＮ ＮＫ（５〜１５ｍｍで溶出する）の証拠はなかった。

（質量分析によるペグ化ＮＢＮの分析）
ペグ化ＮＢＮ ＮＫを、Ｃ_４Ｚｉｐ Ｔｉｐにより脱塩し、そしてマトリクスとしてシナピン酸を用いる、Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ^ＴＭＳＴＲ（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）マトリクスアシスティドレーザーデソープション／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析計での質量分析により、分析した。精製したタンパク質の０．５μＬを、標的プレート上の０．５μＬのマトリクスと混合した。ペグ化ＮＢＮの質量分析は、これらの付加物の一重および二重に荷電した形態を示した。４３８０３Ｄａ、５４０４６Ｄａ、および６４４３８Ｄａの観察された質量は、２ＰＥＧ、３ＰＥＧ、および４ＰＥＧ／分子の修飾と一致する。

（ペプチドマッピングによるペグ化ＮＢＮの分析）
ペグ化反応の特異性を、ペプチドマッピングにより評価した。ペグ化ＮＢＮを、ジペグ化成分、トリペグ化成分、およびテトラペグ化成分に分離し、次いで、これらを、還元し、アルキル化し、そして、さらに、Ｃ_４カラムのＨＰＬＣにより、それらの単鎖成分へと分離した。これらの成分、および、コントロールとして、還元しそしてアルキル化した未修飾ＮＢＮ ＮＫを、Ａｓｐ−Ｎプロテイナーゼを用いて消化し、そして得られた切断生成物を、Ｖｙｄａｃ Ｃ１８（５μｍ、１ｘ２５０ｍｍ）カラムにおいて、０〜６０％Ｂ（緩衝液Ａ：０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：７５％アセトニトリル／０．０８５ＴＦＡ）の６０ｍｍ勾配を用いる逆相ＨＰＬＣにより分画した。このカラムの溶出液を２１４ｍｍの吸収についてモニターした。

ラットＮＢＮ配列は、４つの内部アスパラギン酸を含み、従って、エンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎを用いて消化した場合、単純な切断プロフィールを生じることが予想された。ラットＮＢＮ ＮＫのＡｓｐ−Ｎ消化由来のピークの全てを、質量分析および／またはエドマンＮ末端配列決定により同定し、従って、ペプチドマッピングを、単純なツールとして用いて、ピークの存在または不在により修飾部位を精査し得る。種々のピークの正体を、以下の表３にまとめる。

（Ｍ）：モノアイソトピック質量
^＊：ＭＡＬＤＩのメチオニン含有ペプチドの酸化に起因する
ＮＢＮは、ホモ二量体として存在するので、ラットＮＢＮ ＮＫ産物は、ペグ化について４つの潜在的部位（鎖の各々に由来する２つのＮ末端アミンおよびこの構築物へと操作される２つのＮ９５Ｋ部位）を含む。ジペグ化鎖のペプチドマップにおいて、ＮＫ変異を有するペプチドを含むピークのみが、ＰＥＧ修飾により変化された。他のピークは、ＰＥＧ修飾による影響を受けなかった。従って、このマッピングデータは、ＰＥＧ部分が、このペプチドに特異的に結合し、そしてスクリーニングされた他のペプチドには結合しないことを示す。付着の第２の潜在的部位は、わずかに３つのアミノ酸長であり、そしてペプチドマップにおいて検出されないペプチドのＮ末端ある。さらなるＰＥＧ付着がこの部位で起こることが推測される。この考えと一致して、わずかな割合のラットＮＢＮ ＮＫは、短縮化されず、そして成熟Ａｌａ−１配列を含む。このペプチドは、３０μｍで溶出し、そして非ペグ化消化由来のペプチドマップにおいて出現するが、ペグ化ＮＢＮ ＮＫ消化由来のペプチドマップには存在しない。

（実施例３．キナーゼレセプター活性化（ＫＩＲＡ）ＥＬＩＳＡにおける内部ペグ化ニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）の効力の評価）
ペグ化ラットＮＢＮの効力を、リン酸化ＲＥＴの存在に特異的である、ＥＬＩＳＡにおけるＮＢＮ活性についてのレポーターとして、ｃ−ＲｅｔのＮＢＮ依存活性化／リン酸化を用いて測定した。ＮＢ４１Ａ３−ｍＲＬ３細胞（ＲｅｔおよびＧＦＲα３を発現する付着性マウス神経芽細胞腫細胞株）を、１０％ウシ胎仔血清を補充した、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＮ）中の２４ウェルプレートの１ウェルあたり２×１０^５細胞でプレートし、そして３７℃および５％ＣＯ_２で、１８時間培養した。

細胞をＰＢＳで洗浄し、そして０．２５ｍＬのＤＭＥＭ中のＮＢＮの連続希釈物を用いて、３７℃および５％ＣＯ_２で、１０分間処理した。各サンプルを二連で分析した。細胞を１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、そして０．３０ｍＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０、０．２％デオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＦ、０．１ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオライドを用いて、プレートを穏やかに振盪させながら、４℃にて１時間溶解した。溶解物を、さらに、ピペッティングを繰り返すことによりアジテートし、そして０．２５ｍＬのサンプルを、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中の５μｇ／ｍＬの抗Ｒｅｔ ｍＡｂ（ＡＡ．ＧＥ７．３）を用いて、４℃にて１８時間コートした、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに移し、そしてブロック緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）（１％正常マウス血清および３％ウシ血清アルブミンを含む））を用いて、室温で１時間ブロックした。

室温にて２時間のインキュベーションの後、ウェルをＴＢＳＴで６回洗浄した。リン酸化Ｒｅｔを、ブロック緩衝液中の２ｇ／ｍＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＰＲ）−結合体化抗ホスホチロシン４Ｇ１０抗体と共に、ウェルを室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで６回洗浄し、そして比色検出試薬を用いて４５０ｎｍでＨＰＲ活性を測定することにより検出した。溶解物または溶解緩衝液で処理したウェルからの吸光度の値を測定し、そしてバックグラウンドを較正したシグナルを、活性化混合物中に存在するＮＢＮの濃度の関数としてプロットした。ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡにおけるペグ化ＮＢＮの効力は、１０ｎＭであり、これは、ＮＢＮ ＮＫ開始物質の効力と区別不可能である。効力に対する２回の凍結−解凍サイクルの影響はなく、そしてこの処置後に、サンプルの濁度における有意な増加はなかった。このことは、サンプルが研究のために安全に解凍され得ることを示す。３つおよび４つの１０ｋＤａ ＰＥＧ／分子を別々に用いて、生成物の活性を入手する独立した研究において、３つのＰＥＧを有する付加物は完全に活性であり、一方、４つのＰＥＧ産物は低下した活性を有していたことを測定した。

（実施例４．ラットおよマウスにおける内部ペグ化ラットニューブラスチンの薬物動態学的研究）
ラットモデルおよびマウスモデルにおける、種々のペグ化ＮＢＮ生成物および非ペグ化ＮＢＮ生成物の薬物動態学的特性を試験した。

データは、３．３，１００００Ｄａ ＰＥＧを有する、ラットＮＢＮ ＮＫのペグ化が、ニューブラスチンの半減期およびバイオアベイラビリティーに対して有意な影響を生じたことを示した。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットにおける１ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与の後、３０００ｎｇ／ｍＬのペグ化ＮＢＮのピークレベルを７分後に検出し、そして７００ｎｇ／ｍＬのレベルを２４時間後に、２００ｎｇ／ｍＬのレベルを４８時間後に、および１００ｎｇ／ｍＬのレベルを７２時間後に検出した。１ｍｇ／ｋｇ ＩＶ投与後の非ペグ化ＮＢＮとは対照的に、１５００ｎｇ／ｍＬのレベルを７分後に検出したが、次いで、このレベルは、３時間後に７０ｎｇ／ｍＬへと急速に低下し、そして７時間後には検出されなかった。ペグ化の効果は、皮下投与によりペグ化ＮＢＮを用いて処置した動物において、さらにより明白になった。

１ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．投与の後、ペグ化ＮＢＮの循環レベルは、２４時間後に最大の２００ｎｇ／ｍＬに達し、そして３日間の研究期間の間このレベルを維持した。対照的に、非修飾ＮＢＮの投与の後のどの時点でも、検出可能なＮＢＮは観察されなかった。

ペグ化ＮＢＮサンプルの分析は、１分子あたり２つ、３つ、および４つのＰＥＧを含む付加物の存在により複雑化する。これらの付加物の各々は、異なるＰＫプロフィールを表す。初期のＰＫ研究において、種々の候補および投与の経路を介してスクリーニングを容易にするために、マウスを用いた。このマウスの研究は、候補のバイオアベイラビリティーにおいて劇的な差異を示した。しかし、３．３ １０Ｋ ＰＥＧ付加物をラットにおいて評価した場合、マウスにおけるバイオアベイラビリティーよりも、ラットにおけるバイオアベイラビリティーが低いことを見出した。バイオアベイラビリティーにおけるこの差異は、ｉ．ｐ．投与の後に特に明確である。マウスにおけるレベルは、７時間後に１６００ｎｇ／ｍＬに達し、そして２４時間後に４００ｎｇ／ｍＬを維持した。対照的に、ラットのレベルは、４〜４８時間の間、１００ｎｇ／ｍＬで一定であった。

野生型ラットニューブラスチン（ｗｔ−ＮＢＮ）および９５位にＡｓｎからＬｙｓへの置換を有するニューブラスチン（ＮＫ−ＮＢＮ）の両方をリフォールディングさせ、そしてＳＴＺ糖尿病ラットニューロパシーモデルにおける効力試験にのために９５％より高く精製した。Ｗｔ−ＮＢＮを、動物試験を直接行えるように処方し、一方、ＮＫ−ＮＢＮを、１０ｋＤａ ＰＥＧ−ＳＰＡを用いるペグ化のために調製した。リフォールディングおよび精製の目的を達成するために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を利用するリフォールディング方法を開発した。これは、大量かつ高濃度のＥ．ｃｏｌｉ封入体由来のＮＢＮの再生を可能にした。ＳＥＣに加えて、Ｎｉ−ＮＡＴカラムクロマトグラフィー工程およびＣＭシリカカラムクロマトグラフィー工程の両方を用いて、最終タンパク質純度を増加させた。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー、ＥＳＭＳによる分析、ＫＩＲＡ、ＥＬＩＳＡによる活性の評価、およびエンドトキシン含有量の測定を含む、広範な特徴づけに供した。最終タンパク質生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣは、９５％を超える純度を示した。各生成物のエンドトキシンレベルは、０．２ＥＵ／ｍｇ未満であった。ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡにおける両方のタンパク質の比活性は、約１０ｎＭである。Ｗｔ−ＮＢＮを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ６．５）中で、１．０ｍｇ／ｍｌで処方し、そしてＮＫ−ＮＢＮを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ６．５）中で、２．６ｍｇ／ｍｌで処方した。ｗｔ−ＮＢＮを、１５ｍｌチューブへと等分し、そして−７０℃で冷凍し、一方、ＮＫ−ＮＢＮを、当分および冷凍する前に、ペグ化に供した。

（実施例５．野生型ニューブラスチンおよびＮＫ９５ニューブラスチンムテインのリフォールディング）
両方のＮＢＮ形態を、成熟１１３アミノ酸配列の開始位置の直ぐ後に隣接するエンテロキナーゼ切断部位を有する、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質として、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させた。Ｗｔ−（１．８ｋｇペレット）またはＮＫ−ＮＢＮ（２．５ｋｇペレット）のいずれかを発現する細菌を、Ｇａｕｌｉｎプレスを用いて、２リットルのＰＢＳ中で溶解に供した。封入体をペレットになるまで遠心分離（１０，０００ｒｐｍ）した後、各調製物由来の上清を破棄した。封入体ペレットを緩衝液（０．０２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で二回洗浄し、次いで、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（２％、ｖ／ｖ）を含む同じ緩衝液を用いて２回洗浄し、次いで、界面活性剤なしで、２回さらに緩衝液洗浄した。両方のペレットを、６Ｍグアニジン塩酸、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）、０．１Ｍ ＤＴＴ、および１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて可溶化した。可溶化プロセスを補助するために、各ペレットを、ポリトロン（ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモジナイザーを用いるホモジネーションに供し、次いで、室温で一晩攪拌した。可溶化タンパク質を、遠心分離により清澄化した後、２０ｍｌ／分のＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００（０．０５Ｍグリシン／Ｈ_３ＰＯ_４（ｐＨ３．０）および２Ｍグアニジン−ＨＣｌで平衡化した５．５リットルカラム）を介する変性クロマトグラフィーに供した。

変性したＮＢＮを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定した。Ｗｔ−ＮＢＮまたはＮＫ−ＮＢＮのいずれかを含む画分をプールし、そしてＡｍｉｃｏｎ２．５リットル攪拌細胞濃縮器を用いて約２５０ｍＬまで濃縮した。任意の沈殿物を取り除くためのろ過の後、濃縮したタンパク質を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、０．５Ｍグアニジン−ＨＣｌ、８．８ｍＭ還元型グルタチオンおよび０．２２ｍＭ酸化型グルタチオンで平衡化した、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００を介する再生サイズ排除クロマトグラフィーに供した。このカラムを、２０ｍＬ／分で０．５Ｍグアニジン−ＨＣｌを用いて展開した。再生したｗｔ−ＮＢＮまたはＮＫ−ＮＢＮを含む画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより同定し、プールし、そしてＨｉｓタグ除去が必要となるまで４℃で保存した。

（Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによるＮＢＮの濃縮（ＴＲ５９１９−１３８））
再生したＮＢＮを、ＮＢＮモノマー間のジスルフィド形成を促進させるために、精製を進める前に、少なくとも２４時間４℃で貯蔵した。この期間に、沈殿物が形成し、そしてこの沈殿物を０．２μＰＥＳフィルターユニットを通じる濾過により除去した。非特異的な結合を減少させるために、このタンパク質溶液を、２０ｍＭイミダゾールとした後、１分あたり５０ｍｌでカラム緩衝液（０．５Ｍグアニジンおよび２０ｍＭイミダゾール（ｉｒｎｉｄａｚｏｌｅ））を用いて平衡化した１００ｍｌ Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）カラム上にロードした。タンパク質のアプライに続き、このカラムを、同一の緩衝液を用いてベースラインまで洗浄した。ＮＢＮを、０．５Ｍグアニジン−ＨＣｌおよび０．４Ｍイミダゾールを含有する約３００ｍＬの溶出緩衝液を使用して樹脂から溶出した。溶出後、ＮＢＮを１０容量の５ｍＭ ＨＣｌに対して室温で一晩（１０ｋＤａ透析チューブを用いて）透析した。透析は、混入する物質の加水分解を促進し、そしてグアニジン−ＨＣｌおよびイミダゾールの濃度をそれぞれ０．０５Ｍおよび０．０４Ｍまで減少させた。

（リシルエンドペプチダーゼまたはエンテロキナーゼによるＨｉｓタグの切断）
次の日、透析の間に形成される任意の沈殿物も、濾過により除去した。このタンパク質サンプルを、残留するグアニジン−ＨＣｌを含有する約１５０ｍＭの最終塩濃度にするための５Ｍストックの添加によって、０．１Ｍ ＮａＣｌに調整した。この濃度を、導電率計を使用して確認した。さらに、１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ８を、２５ｍＭの最終濃度にするために添加した。タグを切断するために、両方ともにプロテアーゼ：ＮＢＮが約１：３００の比率で、リシルエンドペプチダーゼを、ｗｔ−ＮＢＮに添加し、そしてエンテロキナーゼを、ＮＫ−ＮＢＮに添加した。Ｌｙｓ９５で変異したタンパク質におけるさらなるプロテアーゼ切断部位に起因して、エンテロキナーゼを、リシルエンドペプチダーゼの代わりにＮＫ−ＮＢＮに使用した。このサンプルを、室温で２時間攪拌し、そして消化物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターした。

（Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーによるＨｉｓタグの除去）
プロテアーゼ処理したＮＢＮを、１分あたり５０ｍＬで０．５Ｍグアニジン−ＨＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールで平衡化した１００ｍＬ Ｎｉ−ＮＴＡカラムにアプライした。このカラムを、同一の緩衝液でベースラインまで洗浄した。カラムから洗い出される任意のタンパク質を、ＨｉｓタグのないＮＢＮを含有する貫流した（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）タンパク質と共にプールした。

（ＣＭシリカクロマトグラフィー）
Ｎｉ−ＮＴＡクロマトグラフィーに続いて、このタンパク質を、直ちにＣＭシリカ樹脂を通じるさらなる精製に供した。ローディング緩衝液（５ｍＭホスフェートｐＨ６．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で平衡化した２０ｍＬ ＣＭシリカカラムに、１分あたり２０ｍＬでＮＢＮをロードした。このカラムを、２０カラム容量の洗浄緩衝液（５ｍＭホスフェートｐＨ６．５、４００ｍＭ ＮａＣｌ）で洗浄し、そしてタンパク質を、５ｍＭホスフェートｐＨ６．５を含有するが１Ｍ ＮａＣｌも含む溶出緩衝液で段階的に溶出させた。溶出したタンパク質を、ホスフェートのみに対して一晩透析して、ＮＫ−ＮＢＮについて１００ｍＭおよびｗｔ−ＮＢＮについて１５０ｍＭまで塩濃度を低下させた。両方のサンプルを、０．２μＰＥＳフィルターユニットを通じて濾過し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、そしてさらなる特徴付けおよび／またはペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）に必要とされるまで４℃で貯蔵した。

Ｗｔ−ＮＢＮおよびＮＫ−ＮＢＮを、ＵＶスペクトル分析に供して、これらの２８０での吸光度を評価した。マイクロ石英キュベットを使用して、そして緩衝液のみをブランクとして、ｗｔ−ＮＢＮまたはＮＫ−ＮＢＮのいずれかの１００μｌを、Ｂｅｃｋｍａｎ分光光度計を使用して２３０〜３３０ｎｍまで連続的に走査した。この分析に基づいて、Ｗｔ−ＮＢＮを、１．１ｍｇ／ｍｌの濃度であることを決定し、そしてＮＫ−ＮＢＮを、２．６ｍｇ／ｍｌの濃度であることを決定した（それぞれのタンパク質についてＡ２８０ｎｍ−Ｅ^０．１％＝０．５を用いた）。１％未満の沈殿物質を、３３０ｎｍの吸光度に基づいて同定した。

両方のタンパク質調製物の純度を評価するために、それぞれのサンプル（０．５ｍｇ）を、１６／３０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムを通じるサイズ排除クロマトグラフィーに供した。このカラムを、４００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５ｍＭホスフェートｐＨ６．５を用いて平衡化し、そして１分あたり１．５ｍＬの流速で展開した。２８０ｎｍの吸光度に基づいて、ｗｔ−ＮＢＮおよびＮＫ−ＮＢＮの両方は、予想される分子量（２３〜２４ｋＤａ）で単一のピークとして移動し、そしてこれらは有意なタンパク質の混入物を含まなかった。

ｗｔ−ＮＢＮおよびＮＫ−ＮＢＮの両方を、２．５Ｍグアニジン−ＨＣｌ、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０および１６ｍＭ ＤＴＴ中で還元した。還元されたサンプルを、ショートＣ_４カラムを通じて脱塩し、そして三連四重極装置を使用するＥＳＭＳによってオンラインで分析した。ＥＳＭＳの生データを、ＭａｘＥｎｔプログラムによってデコンボリュートして、質量スペクトルを生成した。この手順は、複数の荷電したシグナルをキロダルトン（ｋＤａ）の分子量に直接対応する１ピークに崩壊（ｃｏｌｌａｐｓｅ）させ得る。ｗｔ−ＮＢＮについてのデコンボリュートした質量スペクトルは、１２０４６ｋＤａである優勢な化学種を示し、これは、このタンパク質の１１３個のアミノ酸形態について推定される分子量の１２０４６．７ｋＤａに一致する。微量成分もまた観察され（１２０６３ｋＤａ）、これは、酸化生成物の存在を示唆する。３本のピークを、ＮＫ−ＮＢＮサンプルにおいて同定した。主成分は、このタンパク質の１０６個のアミノ酸形態について推定される質量と一致する１１３４５ｋＤａの見かけの分子量を示した。他の２本のピークは、１１３６２ｋＤａおよび１２０６１ｋＤａの質量を有し、これらは、それぞれＮＫ−ＮＢＮの酸化および１１３個のアミノ酸形態の存在を示唆する。

ＮＫ−ＮＢＮ調製物における１０６個および１１３個のアミノ酸形態の存在は、エンテロキナーゼを用いる消化に起因し得る。ビオザイム（Ｂｉｏｚｙｍｅ）由来のこのプロテアーゼは、仔ウシの腸管粘膜から精製された天然酵素調製物であり、そしてわずかなトリプシンの混入物（エンテロキナーゼ１μｇあたりトリプシン０．２５ｎｇ）を含むことが報告されている。従って、トリプシンは、ＮＫ−ＮＢＮのカルボキシ末端側のＡｒｇ７に作用して、優勢な１０６個のアミノ酸形態を生成し得る。一方、Ｗｔ−ＮＢＮを切断するために使用したリシルエンドペプチダーゼは、Ｈｉｓタグ内に含有されるカルボキシ末端側のリシン残基に作用して、成熟した１１３個のアミノ酸ＮＢＮ形態を生成する、単一のプロテアーゼ活性である。ＮＢＮの１０６個および１１３個のアミノ酸形態の両方は、試験した全てのアッセイにおいて同等に活性であり、そしてグアニジン−ＨＣｌ安定性試験において同様に挙動する。

実施例３に記載されるＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡを用いるＮＢ４１Ａ３−ｍＲＬ３細胞におけるｃ−Ｒｅｔリン酸化を刺激するその能力によって、ＮＢＮ活性を決定した。リン酸化されたＲｅｔを、ＨＲＰを結合体化したホスホチロシン抗体（４Ｇ１０；１ウェルあたり０．２μｇ）を用いて捕捉されたレセプターをインキュベートする（２時間）ことによって検出した。インキュベーションに続いて、このウェルを、ＴＢＳＴで６回洗浄し、そしてＨＲＰ活性を、比色定量アッセイを使用して４５０ｎｍで検出した。溶解物または溶解緩衝液単独で処理したウェル由来の吸光度の値を測定し、バックグラウンド補正し、そしてデータを、活性化混合物中に存在するニューブラスチン（ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ）の濃度の関数としてプロットした。このデータは、精製されたＮＢＮが、リン酸化されたＲＥＴの出現をもたらすことを示し、このことは、精製されたＮＢＮが、このアッセイにおいて活性であることを示す。

（実施例６．血清アルブミン−ニューブラスチン結合体の調製）
ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌの濃度の野生型ラットニューブラスチンを、１ｍＭスルホ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）で処理し、そして過剰な架橋剤を除去するために脱塩した。野生型ＮＢＮタンパク質は、そのＮ末端に単一のアミンのみ含み、そして遊離のスルフヒドリル基を持たないので、ＳＭＣＣを用いる反応は、そのＮ末端に結合したＳＭＣＣによるＮＢＮの部位特異的な修飾を生じることが予想された。

６０μｇのＮＢＮ−ＳＭＣＣ結合体を、１２０μｇのウシ血清アルブミンと共にインキュベートし、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによる架橋の程度について分析した。ＢＳＡは、単一の遊離のＳＨ基を含有し、従ってＮＢＮ−ＳＭＣＣ結合体との反応は、ＳＭＣＣ上のマレイミドを介してこの部位に修飾をもたらすと予想される。これらの条件下で、より高い分子量の２つのさらなるバンドを観察し、これらは、単一のＢＳＡ部分および２つのＢＳＡ分子を有するＮＢＮの修飾を有する質量と一致する。なぜなら、各ＮＢＮ分子は、反応を受け得る２つのＮ末端を含有し、従ってこの考えと一致するからである。これらのバンドの形成と同時に、ＮＢＮ−ＳＭＣＣおよびＢＳＡのバンドの強度が減少した。残存するＮＢＮのバンドの強度に基づいて、この反応が完了の７０〜８０％まで進行したと考えた。

この物質を、本質的に上記で議論されるペグ化研究について記載されるように、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によるカチオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーに供して、一置換生成物を、反応混合物から精製した。ゲル濾過実行由来のカラム画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、そして一置換生成物を含有するカラム画分を、２８０ｎｍの吸光度によってタンパク質含量について分析した。ＢＳＡの質量は、ニューブラスチンの質量の約２倍であるので、見かけの濃度を、３で割ってＮＢＮ当量を得た。この画分を、ＫＩＲＡ ＥＬＩＳＡにおける機能について分析に供した。ｗｔ−結合体化ＮＢＮおよびＢＳＡ−結合体化ＮＢＮの両方についてのＩＣ５０値は、３〜６ｎＭであり、このことはＢＳＡに対する結合体化が機能を損なわないことを示唆した。

これらの予備的な研究は、ＢＳＡでもたらされたが、ラットおよびヒト由来の対応する血清アルブミンタンパク質もまた、遊離のＳＨを含有する。従って、同様のアプローチを、ラットにおいてＰＫおよび効力の研究を実施するためのラット血清アルブミン−ラットＮＢＮ結合体、ならびに臨床試験を実施するためのヒト血清アルブミン−ヒトＮＢＮの生成に適用し得る。同様にＳＭＣＣを、一方でアミノ反応性基および他方にチオール反応性基を含有する多数の架橋剤のいずれかで置換し得る。チオール反応性−マレイミドを挿入するアミン反応性架橋剤の例としては、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ、またはＧＭＢＳが挙げられ、チオール反応性−ハロアセテート基を挿入するアミン反応性架橋剤の例としては、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢが挙げられ、そして還元可能な架橋を生成するようなスルフヒドリル基と反応させるための保護チオールまたは非保護チオールを提供するアミン反応性架橋剤の例としては、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ、またはＳＡＴＰ（これらの全てはＰｉｅｒｃｅから入手可能である）が挙げられる。このような架橋剤は、単なる例示であり、そして多数の代替的なストラテジーが、ＮＢＮのＮ末端と血清アルブミンとの架橋について予想される。当業者はまた、ＮＢＮのＮ末端または血清アルブミン上のチオール部分を標的化しない血清アルブミンに対する結合体を生成し得る。ＮＢＮ−血清アルブミン融合物は、遺伝子工学を使用して作製し、ここでＮＢＮは、血清アルブミン遺伝子に対して、機能性であることがまた予想される、そのＮ末端、Ｃ末端、または両末端で融合される。

この方法は、動物において、従ってヒトにおいて延長された半減期を有する生成物を生じる任意のＮＢＮ−血清アルブミン結合体に対して慣用的な適応を通じて拡張され得る。

Claims (18)

1. 配列番号１のアミノ酸８〜１１３に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号１の９５位に対応する位置がリジンであるアミノ酸置換を含み、
   該ポリペプチドは、二量体化した場合に、グリア細胞由来神経栄養因子ファミリーレセプターα３（ＧＦＲα３）に結合し、ここで、ポリアルキレングリコールが該置換アミノ酸において該ポリペプチドに結合されている、ポリペプチド。
2. 請求項１に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号３または配列番号４のアミノ酸８〜１１３を含み、ここで、９５位にあるアスパラギンがリジンに置換されている、ポリペプチド。
3. 前記アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸８〜１１１と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
4. 前記アミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸８〜１１１と少なくとも９５％同一である、請求項１に記載のポリペプチド。
5. 前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項１に記載のポリペプチド。
6. 第２の部分に融合された請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
7. 前記第２の部分が、ヒト血清アルブミン配列である、請求項６に記載の融合タンパク質。
8. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項６もしくは７に記載の融合タンパク質をコードする、核酸。
9. 請求項８に記載の核酸を含む、ベクター。
10. 請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
11. 前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
12. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項６もしくは７に記載の融合タンパク質を作製する方法であって、該方法は、
    （ａ）請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項６もしくは７に記載の融合タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項１０または１１に記載の宿主細胞を培養する工程、および
    （ｂ）該ポリペプチドまたは融合タンパク質を回収する工程
    を包含する、方法。
13. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド２つ、または請求項６もしくは７に記載の融合タンパク質２つを含む、二量体。
14. ポリアルキレングリコールと結合された、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項６もしくは７に記載の２つの融合タンパク質を含む、結合体。
15. 請求項１４に記載の結合体であって、前記ポリアルキレングリコールは、配列番号１、配列番号２、配列番号３または配列番号４の９５位に対応する位置で置換されたリジン残基と結合されている、結合体。
16. 前記ポリペプチドが、グリコシル化されている、請求項１４〜１５のいずれか１項に記載の結合体。
17. 前記ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の結合体。
18. 請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項６もしくは７に記載の融合タンパク質、または、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の結合体と、生理学的に受容可能なビヒクルとを含む、薬学的組成物。