ES2289091T3 - Conjugados polimeros de neublastina y metodos para usar los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos 90% idéntica a los aminoácidos 8-113 del Nº ID SEC: 1, en donde el polipéptido incluye un aminoácido distinto de asparagina en la posición correspondiente a la posición 95 en el Nº ID SEC: 1, en donde el aminoácido substituido en la posición correspondiente a la posición 95 introduce un sitio en el que un polialquilenglicol puede ligarse al polipéptido.
Description
Conjugados polímeros de neublastina y métodos
para usar los mismos.
La invención se refiere generalmente a
polipéptidos y más particularmente a polipéptidos neurotróficos
modificados y a métodos para usar estos polipéptidos
modificados.
Los factores neurotróficos son proteínas
presentes en la naturaleza que promueven la supervivencia, mantienen
la diferenciación fenotípica, evitan la degeneración y potencian la
actividad de células y tejidos neuronales. Los factores
neurotróficos se aíslan de tejido neural y de tejido no neural que
está inervado por el sistema nervioso, y se han clasificado en
grupos relacionados funcionalmente y estructuralmente, también
denominados familias, superfamilias o subfamilias. Ente las
superfamilias de factores neurotróficos están las superfamilias de
factores de crecimiento de fibroblastos, neurotrofinas y factores de
crecimiento transformantes \beta (TGF-\beta).
Las especies individuales de factores neurotróficos se distinguen
por su estructura física, su interacción con sus receptores
cognados y sus efectos sobre diversos tipos de células nerviosas.
Clasificados dentro de la superfamilia de
TGF-\beta están los ligandos de factor
neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF), que
incluyen GDNF, persefina (PSP) y neurturina
(NTN).
(NTN).
Los ligandos de la subfamilia de GDNF tienen en
común su capacidad para inducir señalización a través de la
tirosina quinasa receptora RET. Estos tres ligandos de la subfamilia
de GDNF difieren en sus afinidades relativas para una familia de
receptores neurotróficos, los receptores GFR\alpha.
Un factor neutrotófico recientemente descrito es
la "neublastina" o "NBN". La neublastina se clasifica
dentro de la subfamilia de los GDNF debido a que comparte regiones
de homología con otros ligandos de GDNF y debido a su capacidad
para unirse a, y activar, RET. A diferencia de otros ligandos de
GDNF, la neublastina es altamente selectiva para el complejo
GFR\alpha3-receptor RET. Además, la NBN contiene
subregiones únicas en su secuencia de aminoácidos.
Desgraciadamente, la neublastina es depurada
rápidamente por el cuerpo. Esta depuración rápida puede frustrar el
uso de neublastina en aplicaciones terapéuticas. Así, existe una
necesidad de identificar variantes de neublastina que tengan
biodisponibilidad incrementada.
La presente invención se basa en parte en el
descubrimiento de nuevas formas de neublastina que muestran
propiedades farmacocinéticas y de biodisponibilidad potenciadas
in vivo. Estas nuevas formas incluyen polipéptidos de
neublastina variantes conjugados a moléculas polímeras.
En un aspecto, la invención presenta un
polipéptido de neublastina variante, o polipéptido de neublastina
muteínico, que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene una o
más substituciones de aminoácidos en posiciones expuestas a
disolventes del dímero de neublastina maduro. Las presentes
substituciones introducen en el polipéptido de neublastina natural
uno o más sitios en los que substancias, tales como polímeros
presentes en la naturaleza o sintéticos, pueden ligarse a los
polipéptidos a fin de potenciar su solubilidad y, de ahí, su
biodisponibilidad, in vivo. Preferiblemente, los presentes
polipéptidos variantes incluyen una secuencia de aminoácidos al
menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-113 del Nº
ID SEC: 1. El polipéptido de neublastina variante incluye una o más
substituciones de aminoácido en las que un aminoácido distinto de la
arginina se presenta en la posición 14 en la secuencia de
aminoácidos del polipéptido variante, un aminoácido distinto de la
arginina en la posición 39 se presenta en la secuencia de
aminoácidos del polipéptido variante, un aminoácido distinto de la
arginina en la posición 78 se presenta en el polipéptido variante o
un aminoácido distinto de la asparagina en la posición 95 se
presenta en el polipéptido variante, cuando las posiciones de los
aminoácidos se numeran de acuerdo con la secuencia polipeptídica
del
Nº ID SEC: 1.
Nº ID SEC: 1.
Según se usa aquí, "neublastina silvestre"
o "wt-NBN" se refiere a la secuencia
polipeptídica de neublastina presente en la naturaleza o natural,
tal como la de neublastina de rata, ratón o ser humano (véanse, por
ejemplo, los Nº ID SEC: 2, 3 ó 4). Polipéptidos de neublastina
variantes específicos se denominan aquí
"NBN-X_{1}N_{1}X_{2}" o
"X_{1}N_{1}X_{2}-NBN", en donde X_{1}
se refiere a un aminoácido de un polipéptido de neublastina
silvestre, N_{1} se refiere a la posición numérica de los
aminoácidos X_{1} en la secuencia, que se numera de acuerdo con
el Nº ID SEC: 1. X_{2} se refiere a un aminoácido que substituye
al aminoácido silvestre en la posición numérica indicada en la
secuencia. Así, por ejemplo, NBN-N95K identifica los
polipéptidos de neublastina variantes en los que la asparagina en
la posición 95 se reemplaza por una lisina.
El polipéptido de neublastina variante puede
proporcionarse como un polipéptido multímero. Por ejemplo, el
polipéptido de neublastina variante puede proporcionarse como un
dímero que incluye al menos un polipéptido de neublastina variante.
En algunas modalidades, el dímero es un homodímero de polipéptidos
de neublastina variantes. En otras modalidades, el dímero es un
heterodímero que incluye un polipéptido de neublastina variante y
un polipéptido de neublastina silvestre. Otros dímeros pueden
incluir dos formas de polipéptido de neublastina variante
diferentes.
En algunas modalidades, el polipéptido de
neublastina variante incluye los aminoácidos 1-7 del
Nº ID SEC: 1 además de los aminoácidos 8-113.
En modalidades preferidas, el polipéptido de
neublastina variante, cuando se dimeriza, se une a GFR\alpha3. En
modalidades preferidas adicionales, el polipéptido de neublastina
variante, cuando se dimeriza, estimula la fosforilación de tirosina
de un polipéptido de RET, bien por sí mismo o bien cuando está unido
a GFR\alpha3.
En otras modalidades preferidas más, el
polipéptido de neublastina variante, cuando se dimeriza, potencia
la supervivencia de neuronas, por ejemplo, potencia la supervivencia
de una neurona sensorial.
En otras modalidades preferidas adicionales, el
polipéptido de neublastina variante, cuando se dimeriza, normaliza
cambios patológicos de una neurona, tal como una neurona
sensorial.
En otras modalidades preferidas adicionales, el
polipéptido de neublastina variante, cuando se dimeriza, potencia
la supervivencia de una neurona, por ejemplo una neurona autónoma o
una neurona dopaminérgica.
En algunas modalidades, el polipéptido variante
incluyen dos, tres o más de las substituciones de aminoácidos
seleccionadas del grupo que consiste en un aminoácido distinto de
arginina en la posición 14 en la secuencia de aminoácidos del
polipéptido variante, un aminoácido distinto de arginina en la
posición 39 en la secuencia de aminoácidos del polipéptido
variante, un aminoácido distinto de arginina en la posición 68 del
polipéptido variante y un aminoácido distinto de asparagina en la
posición 95 del polipéptido variante.
En modalidades preferidas, el aminoácido en una
o más de las posiciones 14, 39, 68 y 95 es lisina.
Preferiblemente, los aminoácidos
8-94 y 96-113 del polipéptido de
neublastina variante son al menos 90% idénticos a los aminoácidos
8-94 y 96-113 del Nº ID SEC: 1. Más
preferiblemente, las secuencias de aminoácidos son al menos 95%
idénticas a las mismas. Lo más preferiblemente, la secuencia de
aminoácidos del polipéptido de neublastina variante incluye la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido de neublastina de rata,
ser humano o ratón presente en la naturaleza en los aminoácidos
8-94 y 96-113 del polipéptido de
neublastina variante. Por ejemplo, los aminoácidos
8-94 y 96-113 del polipéptido de
neublastina variante pueden incluir la secuencia de aminoácidos de
los aminoácidos 8-94 y 96-113 del Nº
ID SEC: 2, el Nº ID SEC: 3 o el Nº ID SEC: 4.
También se proporciona mediante la invención una
proteína o un polipéptido de fusión que incluye un polipéptido de
neublastina variante o un polipéptido de neublastina silvestre o una
proteína que es un dímero de dos proteínas de fusión de
neublastina. Las proteínas de fusión de neublastina también tienen
propiedades farmacocinéticas y de biodisponibilidad potenciadas
in vivo.
En otro aspecto, la invención proporciona una
molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de
neublastina variante. El ácido nucleico que codifica el polipéptido
de neublastina variante se proporciona preferiblemente en un
vector, por ejemplo un vector de expresión. Un ácido nucleico de
neublastina variante, o un vector que incluye el mismo, puede
proporcionarse en una célula. La célula puede ser, por ejemplo, una
célula mamífera, una célula fúngica, una célula de levadura, una
célula de insecto o una célula bacteriana. Una célula mamífera
preferida es una célula de ovario de hámster chino ("célula
CHO").
También se proporciona mediante la invención un
método para elaborar un polipéptido de neublastina variante,
cultivando una célula que contiene un ácido nucleico que codifica un
ácido nucleico de neublastina variante bajo condiciones que
permiten la expresión de un polipéptido de neublastina variante. Si
se desea, el polipéptido de neublastina variante puede recuperarse
a continuación. La invención incluye además el polipéptido de
neublastina variante producido por la célula. Ácidos nucleicos,
vectores, células huésped y métodos de producción de polipéptidos
similares se describen aquí para las proteínas de fusión (tal como
las proteínas de fusión de neublastina-albúmina de
suero) de esta invención.
También se proporciona mediante la invención una
composición que incluye un polipéptido de neublastina o un
polipéptido de neublastina variante acoplado a un polímero no
presente en la naturaleza. El polipéptido de neublastina variante
en la composición incluye preferiblemente una secuencia de
aminoácidos al menos 70% idéntica a los aminoácidos
8-113 del Nº ID SEC: 1, con tal de que el
polipéptido de neublastina variante incluya una o más de las
substituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste
en un aminoácido distinto de arginina en la posición 14 en la
secuencia de aminoácidos del polipéptido variante, un aminoácido
distinto de arginina en la posición 39 en la secuencia de
aminoácidos del polipéptido variante, un aminoácido distinto de
arginina en la posición 68 del polipéptido variante y un aminoácido
distinto de asparagina en la posición 95 del polipéptido variante,
en donde las posiciones de los aminoácidos se numeran de acuerdo con
la secuencia polibpeptídica del Nº ID SEC: 1.
En modalidades preferidas, el polímero comprende
un resto de polialquilenglicol, por ejemplo un resto de
polietilenglicol (PEG).
En modalidades preferidas, el resto de
polialquilenglicol se acopla a un grupo amina del polipéptido de
neublastina o una lisina en el polipéptido de neublastina
variante.
El acoplamiento puede producirse a través de un
éster activo de N-hidroxisuccinimida (NHS). El éster
activo puede ser, por ejemplo, PEG-succinato de
succinimidilo (SS-PEG), butirato de succinimidilo
(SPB-PEG) o propionato de succinimidilo
(SPA-PEG).
El resto de polialquilenglicol puede ser, por
ejemplo, carbometil-NHS,
norleucina-NHS, SC-PEG, tresilato,
aldehído, epóxido, carbonilimidazol o carbonato de PNP.
En algunas modalidades, el resto de
polialquilenglicol se acopla a un grupo cisteína de un polipéptido
de neublastina o un polipéptido de neublastina variante. Por
ejemplo, el acoplamiento puede producirse a través de un grupo
maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato y un grupo
tiol.
En algunas modalidades, el polipéptido de
neublastina o el polipéptido de neublastina variante en la
composición está glicosilado. Cuando el polipéptido o el
polipéptido de neublastina variante está glicosilado, el polímero
puede acoplarse a un resto de carbohidrato del polipéptido de
neublastina o el polipéptido de neublastina variante glicosilado.
Por ejemplo, el polímero puede acoplarse al polipéptido de
neublastina o el polipéptido de neublastina variante glicosilado
después de la oxidación de un grupo hidrazol o un grupo amino del
polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina variante
glicosilado, o la oxidación de un grupo reactivo del polímero.
En diversas modalidades, el polipéptido de
neublastina o el polipéptido de neublastina variante comprende uno,
dos, tres o cuatro restos de PEG.
En modalidades preferidas, el polipéptido de
neublastina, el polipéptido de neublastina variante o el conjugado
polímero tiene una semivida en suero más prolongada con relación a
la semivida del polipéptido o el polipéptido variante en ausencia
del polímero.
En modalidades preferidas, el polipéptido de
neublastina, el polipéptido de neublastina variante o el conjugado
polímero en el complejo tiene una actividad fisiológica seleccionada
del grupo que consiste en: unión a GFR\alpha3, activación de RET,
normalización de cambios patológicos de una neurona o potenciación
de la supervivencia de neuronas.
Por "normalización de cambios patológicos de
una neurona" se entiende que el presente conjugado induce un
cambio en uno o más de los siguientes parámetros celulares: nivel de
expresión de una proteína estructural, un receptor de factor
neurotrófico, un canal iónico o un neurotransmisor, o induce un
cambio en la morfología celular, en cada caso a fin de restaurar
substancialmente tal parámetro hasta el nivel del mismo en una
neurona de un fenotipo igual o similar que no está afectada por
enfermedad, degeneración, daño o lesión. La normalización de
cambios patológicos de una neurona puede verificarse
inmunohistológicamente, o determinando cambios en los niveles de
productos celulares secretados o liberados, o determinando cambios
in vivo en el comportamiento fisiológicamente atribuibles a
la función de la neurona o las neuronas afectadas. Por ejemplo, en
el caso de cambios patológicos asociados con un síndrome de dolor
neuropático, pueden verificarse comportamientos de dolor tales como
hiperalgesia, hipoalgesia o alodinia.
Por "mejora de la supervivencia neuronal"
se entienden prolongar la supervivencia de una neurona afectada más
allá del período de supervivencia observado en una neurona
correspondiente afectada por el mismo tipo de enfermedad,
trastorno, daño o lesión pero no tratada con el conjugado o la
proteína de fusión de neublastina de esta invención.
En algunas modalidades, el polímero se acopla al
polipéptido en un sitio de la neublastina que es un extremo N. En
algunas modalidades, el polímero se acopla al polipéptido en un
sitio en un aminoácido no terminal del polipéptido de neublastina o
el polipéptido de neublastina variante.
En modalidades preferidas, el polímero se acopla
un aminoácido expuesto a disolvente del polipéptido de neublastina
o el polipéptido de neublastina variante.
En modalidades preferidas, el polímero se acopla
al polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina
variante en un residuo seleccionado del grupo que consiste en el
aminoácido aminoterminal del polipéptido variante, la posición 14
en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de neublastina o el
polipéptido de neublastina variante, la posición 39 en la secuencia
de aminoácidos del polipéptido de neublastina o el polipéptido de
neublastina variante, la posición 68 en la secuencia de aminoácidos
del polipéptido de neublastina o el polipéptido de neublastina
variante y la posición 95 en la secuencia de aminoácidos del
polipéptido o el polipéptido variante de neublastina.
También se proporciona mediante la invención una
composición farmacéutica que comprende un vehículo fisiológicamente
aceptable que contiene o que tiene dispersado en el mismo un
polipéptido de neublastina, un polipéptido de neublastina variante
o un conjugado de la presente invención.
En un aspecto adicional, la invención incluye un
complejo de polipéptido de neublastina o polipéptido de neublastina
variante conjugado, soluble en agua, estable, que comprende un
polipéptido de neublastina o un polipéptido de neublastina variante
acoplado a un resto de polietilenglicol, en el que el polipéptido de
neublastina o el polipéptido de neublastina variante está acoplado
al resto de polietilenglicol mediante un enlace lábil. En algunas
modalidades, el enlace lábil es segmentable mediante hidrólisis
bioquímica, proteolisis o segmentación de sulfhidrilo. En
modalidades preferidas, el enlace lábil se segmenta bajo condiciones
in vivo.
También se proporciona mediante la invención un
método para elaborar un polipéptido de neublastina modificado que
tiene actividad prolongada, in vitro o in vivo, con
relación a una neublastina silvestre, proporcionando un polipéptido
de neublastina o un polipéptido de neublastina variante y acoplando
el polipéptido o el polipéptido de neublastina variante modificado
a un resto polímero no presente en la naturaleza, formando de ese
modo una composición de polímero-polipéptido de
neublastina acoplados.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un método para tratar o prevenir un trastorno del
sistema nervioso en un sujeto (tal como un ser humano),
administrando a un sujeto que lo necesite una cantidad
terapéuticamente eficaz de un polipéptido de neublastina variante,
una composición que contiene un polipéptido de neublastina o un
polipéptido de neublastina variante acoplado a un polímero, o un
complejo que incluye un complejo de polipéptido de neublastina o
polipéptido de neublastina variante conjugado, soluble en agua,
estable, que comprende un polipéptido de neublastina o un
polipéptido de neublastina variante acoplado a un resto de
polietilenglicol.
Preferiblemente, el trastorno del sistema
nervioso es un trastorno nervioso periférico, tal como una
neuropatía periférica o un síndrome de dolor neuropático. Los seres
humanos son los sujetos preferidos para el tratamiento.
La administración puede ser, por ejemplo,
sistémica u oral.
A no ser que se defina otra cosa, todos los
términos técnicos y científicos usados aquí tienen el mismo
significado que se entiende comúnmente por un experto normal en la
técnica a la que pertenece esta invención. Aunque pueden usarse
métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí
en la práctica o las pruebas de la invención, métodos y materiales
adecuados se describen posteriormente. Todas las publicaciones,
solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas
aquí se incorporan mediante referencia en su totalidad. En caso de
conflicto, la presente memoria descriptiva, incluyendo las
definiciones, dominará. Además, los materiales, los métodos y los
ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser
limitativos.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la descripción detallada y las
reivindicaciones siguientes.
La invención proporciona nuevos polipéptidos de
neublastina variantes que pueden modificarse para potenciar sus
propiedades farmacocinéticas y de biodisponibilidad. Polipéptidos de
neublastina variantes preferidos tienen secuencias de aminoácidos
alteradas que facilitan el acoplamiento a un agente polímero tal
como un polímero de polialquilenglicol.
La invención proporciona polipéptidos de
neublastina que tienen secuencias de aminoácidos variantes con
respecto a una secuencia de polipéptido de neublastina silvestre.
Las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de neublastina de ser
humano y ratón se describen en WO00/01815. Ejemplos de polipéptidos
de neublastina variantes de acuerdo con la invención se presentan
en la Tabla 1.
Preferiblemente, los residuos alterados en el
polipéptido de neublastina variante se eligen para facilitar el
acoplamiento a un polímero tal como un polímero de
polialquilenglicol en la posición del aminoácido modificado. Sitios
preferidos de modificación de un polipéptido de neublastina son
aquellos en regiones accesibles al disolvente en el polipéptido de
neublastina. Tales sitios pueden elegirse basándose en la inspección
de la estructura cristalina del factor neurotrófico relacionado,
GDNF, cuya estructura cristalina se describe en Nat Struct. Biol.
4:435-38, 1997. Los sitios también pueden elegirse
basándose en la información estructural-funcional
proporcionada para proteínas quiméricas de persefina/neublastina.
Estas quimeras se describen en J. Biol. Chem.
275:3412-20, 2000. Un listado ejemplar de
aminoácidos de neublastina accesibles al disolvente o expuestos
superficialmente identificados a través de esta metodología es como
la indicada en la Tabla 2.
La invención incluye un polipéptido de
neublastina variante que incluye una secuencia de aminoácidos que es
al menos 70% idéntica a los aminoácidos 8-113 del
Nº ID SEC: 1, que se muestra en la Tabla 1. En algunas modalidades,
una o más de las argininas en la posición 14, la posición 39, la
posición 68 o la asparagina en la posición 95, en la secuencia de
aminoácidos del polipéptido, se reemplaza por un aminoácido distinto
a la arginina o la asparagina. Preferiblemente, el aminoácido de
tipo silvestre se reemplaza por lisina o cisteína.
en la
que
Xaa_{1} es Gly o Thr
Xaa_{2} es Pro o Arg
Xaa_{3} es Gly o Ser
Xaa_{4} es Ala o Thr
Xaa_{5} es Ala o Thr
Xaa_{6} es Gly o Asp
Xaa_{7} es Arg o Ser
Xaa_{8} es Arg o Ser
Xaa_{9} es Val o Ile
Xaa_{10} es Pro o Gln
Xaa_{11} es Pro o Ser
Xaa_{12} es Val o Ile
Xaa_{13} es Arg o His
La Tabla 2 proporciona una lista de residuos y
números en neublastina humana que se espera que estén expuestos
superficialmente. Los residuos expuestos superficialmente se
determinaron examinando la estructura del dímero de GDNF de rata
formado por las cadenas A y B (PDB código 1AGQ) y determinando si un
residuo estaba sobre la superficie de la estructura. Esta
estructura se comparó a continuación con un alineamiento de
secuencias de GDNF y neublastina en Baloh y otros, Neuron, vol 21,
pg 1291, 1998, para determinar los residuos apropiados en la
neublastina. El esquema de numeración es el mostrado en la Tabla
1.
- \quad
- 1 Ala n/a
- \quad
- 2 Gly n/a
- \quad
- 3 Gly n/a
- \quad
- 4 Pro n/a
- \quad
- 5 Gly n/a
- \quad
- 6 Ser n/a
- \quad
- 7 Arg n/a
- \quad
- 8 Ala n/a
- \quad
- 9 Arg n/a
- \quad
- 10 Ala n/a
- \quad
- 11 Ala n/a
- \quad
- 12 Gly +
- \quad
- 13 Ala -
- \quad
- 14 Arg +
- \quad
- 15 Gly +
- \quad
- 16 Cys -
- \quad
- 17 Arg +
- \quad
- 18 Leu +
- \quad
- 19 Arg +
- \quad
- 20 Ser +
- \quad
- 21 Gln +
- \quad
- 22 Leu +
- \quad
- 23 Val -
- \quad
- 24 Pro +
- \quad
- 25 Val -
- \quad
- 26 Arg +
- \quad
- 27 Ala +
- \quad
- 28 Leu -
- \quad
- 29 Gly +
\newpage
(Continuación)
- \quad
- 30 Leu +
- \quad
- 31 Gly +
- \quad
- 32 His +
- \quad
- 33 Arg +
- \quad
- 34 Ser -
- \quad
- 35 Asp +
- \quad
- 36 Glu +
- \quad
- 37 Leu +
- \quad
- 38 Val -
- \quad
- 39 Arg +
- \quad
- 40 Phe -
- \quad
- 41 Arg +
- \quad
- 42 Phe +
- \quad
- 43 Cys -
- \quad
- 44 Ser +
- \quad
- 45 Gly +
- \quad
- 46 Ser +
- \quad
- 47 Cys -
- \quad
- 48 Arg +
- \quad
- 49 Arg +
- \quad
- 50 Ala -
- \quad
- 51 Arg +
- \quad
- 52 Ser +
- \quad
- 53 Pro +
- \quad
- 54 His -
- \quad
- 55 Asp -
- \quad
- 56 Leu +
- \quad
- 57 Ser -
- \quad
- 58 Leu -
- \quad
- 59 Ala +
- \quad
- 60 Ser +
- \quad
- 61 Leu -
- \quad
- 62 Leu +
- \quad
- 63 Gly +
- \quad
- 64 Ala +
\newpage
(Continuación)
- \quad
- 65 Gly +
- \quad
- 66 Ala +
- \quad
- 67 Leu -
- \quad
- 68 Arg n/a
- \quad
- 69 Pro n/a
- \quad
- 70 Pro n/a
- \quad
- 71 Pro n/a
- \quad
- 72 Gly +
- \quad
- 73 Ser +
- \quad
- 74 Arg n/a
- \quad
- 75 Pro n/a
- \quad
- 76 Val-
- \quad
- 77 Ser
- \quad
- 78 Gln +
- \quad
- 79 Pro -
- \quad
- 80 Cys -
- \quad
- 81 Cys -
- \quad
- 82 Arg -
- \quad
- 83 Pro -
- \quad
- 84 Thr +
- \quad
- 85 Arg +
- \quad
- 86 Tyr +
- \quad
- 87 Glu +
- \quad
- 88 Ala +
- \quad
- 89 Val +
- \quad
- 90 Ser +
- \quad
- 91 Phe -
- \quad
- 92 Met +
- \quad
- 93 Asp +
- \quad
- 94 Val +
- \quad
- 95 Asn +
- \quad
- 96 Ser +
- \quad
- 97 Thr +
- \quad
- 98 Trp +
- \quad
- 99 Arg +
\newpage
(Continuación)
- \quad
- 100 Thr +
- \quad
- 101 Val -
- \quad
- 102 Asp +
- \quad
- 103 Arg +
- \quad
- 104 Leu -
- \quad
- 105 Ser-
- \quad
- 106 Ala-
- \quad
- 107 Thr +
- \quad
- 108 Ala +
- \quad
- 109 Cys-
- \quad
- 110 Gly +
- \quad
- 111 Cys -
- \quad
- 112 Leu +
- \quad
- 113 Gly
- \quad
- n/a
n/a indica que los residuos no
están presentes en la estructura de GDNF. Esto es debido bien al
diseño del constructo, bien a regiones flexibles o bien a insertos
en neublastina con relación al GDNF (residuos
68-71).
- indica que los residuos están enterrados y no
sobre la superficie o son residuos de cisteína implicados en
enlaces de disulfuro. Como esta proteína es un nudo de cisteínas,
una gran mayoría de los residuos no están sobre la superficie.
+ indica que este residuo está expuesto
superficialmente en la estructura del GDNF, y por lo tanto se
presume que está expuesto superficialmente en la neublastina,
aunque el bucle que contiene los residuos 66-75 sea
visible solo en uno de los monómeros de GDNF (presumiblemente
flexible). Este bucle también contiene un inserto de cuatro
residuos en la neublastina con relación al GDNF.
Según se usa aquí, "identidad" y
"homólogo" u "homología" se usan intercambiablemente y se
refieren a la similitud de secuencia entre dos polipéptidos,
moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición en ambas
de las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o
subunidad monómera de aminoácido (por ejemplo, si una posición en
cada una de las dos moléculas de DNA está ocupada por adenina, o una
posición en cada uno de los polipéptidos está ocupada por una
lisina), entonces, las moléculas respectivas son homólogas en esa
posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una
función del número de posiciones iguales u homólogas compartidas
por las dos secuencias dividido por el número de posiciones
comparadas x 10. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos
secuencias son iguales o son homólogas, entonces las dos secuencias
son 60% homólogas. A modo de ejemplo, las secuencias de DNA CTGACT
y CAGGTT comparten 50% de homología (3 de las 6 posiciones totales
son iguales). Generalmente, se realiza una comparación cuando dos
secuencias están alineadas para dar homología máxima. Tal
alineamiento puede proporcionarse usando, por ejemplo, el método de
Needleman y otros, J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970),
puesto en práctica convenientemente por programas informáticos tales
como el programa Align (DNAstar, Inc.). Secuencias "similares"
son aquellas que, cuando están alineadas, comparten residuos de
aminoácido idénticos y similares, donde los residuos similares son
substituciones conservativas para, o "mutaciones puntuales
permitidas" de, residuos de aminoácido correspondientes en una
secuencia de referencia alineada. A este respecto, una
"substitución conservativa" de un residuo en una secuencia de
referencia es una substitución por un residuo que es físicamente o
funcionalmente similar al residuo de referencia correspondiente,
por ejemplo, que tiene similares tamaño, conformación, carga
eléctrica, propiedades químicas, incluyendo la capacidad para
formar enlaces covalentes o de hidrógeno, o similares. Así, una
secuencia "variante de substitución conservativa" es una que
difiere de una secuencia de referencia o una secuencia silvestre en
que están presentes una o más substituciones conservativas o
mutaciones puntuales permitidas.
En modalidades preferidas, un polipéptido de
acuerdo con la invención es 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ó 99% idéntico
a los aminoácidos 8-113 del Nº ID SEC: 1. En algunas
modalidades, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de
neublastina variante incluye la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido de neublastina de rata, ser humano o ratón presente en
la naturaleza en los aminoácidos 1-94 y
96-113 del polipéptido de neublastina variante, por
ejemplo, el polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de los Nº
ID SEC: 2, 3 ó 4 en estas posiciones.
Un polipéptido de neublastina variante que
difiere en la secuencia de los descritos en el Nº ID SEC:
1-4 puede incluir una o más ambas substituciones de
aminoácidos conservativas. Alternativamente, o además, el
polipéptido de neublastina variante puede diferir en una o más
substituciones de aminoácidos no conservativas, o en deleciones o
inserciones. Preferiblemente, las substituciones, inserciones o
deleciones no suprimen la actividad biológica de la proteína
aislada.
Substituciones conservativas incluyen
típicamente la substitución de un aminoácido por otro con
características similares, tales como substituciones dentro de los
siguientes grupos: valina, alanina y glicina; leucina, valina e
isoleucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y
glutamina; serina, cisteína y treonina; lisina y arginina;
difenilalanina y tirosina. Los aminoácidos hidrófobos no polares
incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina,
fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros
polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina,
asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente
(básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos
cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido
glutámico. Cualquier substitución de un miembro de los grupos polar,
básico o ácido mencionados anteriormente por otro miembro del mismo
grupo puede considerarse una substitución conservativa.
Otras substituciones pueden ser identificadas
fácilmente por operarios de experiencia normal. Por ejemplo, para
el aminoácido alanina, puede tomarse una substitución de uno
cualquiera de D-alanina, glicina,
beta-alanina, L-cisteína y
D-cisteína. Para la lisina, una substitución puede
ser una cualquiera de D-lisina, arginina,
D-arginina, homoarginina, metionina,
D-metionina, ornitina o D-ornitina.
Generalmente, las substituciones en regiones funcionalmente
importantes que puede esperarse que induzcan cambios en las
propiedades de polipéptidos aislados son aquellas en las que: (i)
un residuo polar, por ejemplo serina o treonina, substituye a (o es
substituido por) un residuo hidrófobo, por ejemplo, leucina,
isoleucina, fenilalanina o alanina; (ii) un residuo de cisteína
substituye a (o es substituido por) cualquier otro residuo; (iii) un
residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo,
lisina, arginina o histidina, substituye a (o es substituido por) un
residuo que tiene una cadena lateral electronegativa, por ejemplo
ácido glutámico o ácido aspártico; o (iv) un residuo que tiene una
cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, substituye a (o
es substituido por) uno que no tiene tal cadena lateral, por
ejemplo glicina. La probabilidad de que una de las substituciones
no conservativas precedentes pueda alterar propiedades funcionales
de la proteína también se correlaciona con la posición de la
substitución con respecto a regiones funcionalmente importantes de
la proteína: algunas substituciones no conservativas pueden de
acuerdo con esto tener poco o ningún efecto sobre las propiedades
biológicas.
También se proporcionan mediante la invención
polipéptidos multímeros que incluyen un polipéptido de neublastina
variante. Los polipéptidos multímeros se proporcionan
preferiblemente como polipéptidos multímeros purificados. Ejemplos
de complejos multímeros incluyen, por ejemplo, complejos dímeros. El
complejo multímero puede proporcionarse como un complejo heterómero
u homómero. Así, el complejo multímero puede ser un complejo
heterodímero que incluye un polipéptido de neublastina variante y
una neublastina no variante o un complejo heterodímero que incluye
dos o más polipéptidos de neublastina variantes.
En algunas modalidades, el polipéptido de
neublastina variante se une a GFR\alpha3. Preferiblemente, la
unión del polipéptido de neublastina variante estimula la
fosforilación de un polipéptido de RET. Para determinar si un
polipéptido se une a GFR\alpha3, pueden realizarse ensayos como
los descritos en WO00/01815. Por ejemplo, la presencia de
neublastina en el medio de sobrenadantes de línea celular CHO puede
describirse usando una forma modificada de un ensayo complejo
ternario descrito por Sanicola y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1997, 94: 6238). En este ensayo, la capacidad de moléculas similares
a GDNF puede evaluarse con respecto a su capacidad para mediar en
la unión entre el dominio extracelular de RET y los diversos
correceptores, GFR\alpha1, GFR\alpha2 y GFR\alpha3. Formas
solubles de RET y los correceptores se generan como proteínas de
fusión. Se han descrito una proteína de fusión entre el dominio
extracelular de RET de rata y fosfatasa alcalina placentaria
(RET-AP) y una proteína de fusión entre el dominio
extracelular de GFR\alpha-1 de rata (descrito en
la solicitud publicada WO9744356; 27 de noviembre de 1997,
incorporada aquí mediante referencia) y el dominio Fc de IgGI
humana (rGFR(\alpha1-Ig) (Sanicola y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 6238).
En algunas modalidades, el polipéptido de
neublastina variante potencia la supervivencia de una neurona o
normaliza cambios patológicos de una neurona o ambos. Ensayos para
determinar si un polipéptido potencia la supervivencia de una
neurona o normaliza cambios patológicos de una neurona se describen
en, por ejemplo, WO00/01815. Preferiblemente, la neurona es una
neurona sensorial, una neurona autónoma o una neurona
dopaminérgica.
Polipéptidos de neublastina variantes pueden
aislarse usando métodos conocidos en la técnica. Polipéptidos de
neublastina presentes en la naturaleza pueden aislarse de células o
fuentes de tejido mediante un esquema de purificación apropiado
usando técnicas de purificación de proteínas estándar.
Alternativamente, polipéptidos de neublastina variantes pueden
sintetizarse químicamente usando técnicas de síntesis de péptidos
estándar. La síntesis de secuencias de aminoácidos cortas está bien
establecida en la técnica de los péptidos. Véase, por ejemplo,
Stewart y otros, Solid Phase Peptide Synthesis (2ª ed., 1984).
En otra modalidad, polipéptidos de neublastina
variantes se producen mediante técnicas de DNA recombinante. Por
ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido
de neublastina variante puede insertarse en un vector, por ejemplo,
un vector de expresión, y el ácido nucleico puede introducirse en
una célula. Células adecuadas incluyen, por ejemplo, células
mamíferas (tales como células humanas o células de ovario de hámster
chino), células fúngicas, células de levadura, células de insecto y
células bacterianas. Cuando se expresan en una célula recombinante,
la célula se cultiva preferiblemente bajo condiciones que permiten
la expresión de un polipéptido de neublastina variante. El
polipéptido de neublastina variante puede recuperarse de una
suspensión celular, si se desea. Por "recuperarse" se entiende
que el polipéptido variante se retira de los componentes de una
célula o medio de cultivo en el que está presente antes del
procedimiento de recuperación. El procedimiento de recuperación
puede incluir una o más etapas de repliegue o purificación.
Polipéptidos de neublastina variantes pueden
construirse usando cualquiera de varios métodos conocidos en la
técnica. Uno de tales métodos es la mutagénesis dirigida al sitio,
en el que un nucleótido específico (o, si se desea un pequeño
número de nucleótidos específicos) se cambia para cambiar un solo
aminoácido (o, si se desea, un pequeño número de residuos de
aminoácido predeterminados) en el polipéptido de neublastina
codificado. Los expertos en la técnica apreciarán que la
mutagénesis dirigida al sitio es una técnica habitual y ampliamente
usada. De hecho, muchos estuches de mutagénesis dirigida al sitio
están disponibles comercialmente. Uno de tales estuches es el
"Transformer Site Directed Mutagenesis Kit" vendido por
Clontech Laboratories (Palo Alto, Calif.).
La práctica de la presente invención empleará, a
no ser que se indique otra cosa, técnicas convencionales de
biología celular, cultivo celular, biología molecular,
microbiología, DNA recombinante, química de proteínas e inmunología
que están dentro de la experiencia de la especialidad. Tales
técnicas se describen en la literatura. Véanse, por ejemplo,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición. (Sambrook,
Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1989; DNA Cloning, Volúmens I y II (D.N. Glover, ed), 1985;
Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, ed.), 1984; Patente de
EE.UU. Nº 4.683.195 (Mullis y otros,); Nucleic Acid Hybridization
(B.D. Haines y S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and
Translation (B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of
Animal Cells (R.I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987;
Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide
to Molecular Cloning (13.Perbal), 1984; Methods in Enzymology,
Volúmens 154 y 155 (Wu y otros, eds), Academic Press, Nueva York;
Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P.
Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochernical
Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer y Walker, eds.),
Academic Press, Londres, 1987; Handbook of Experiment Immunology,
Volúmenes I-IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.),
1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 1986.
Si se desea, el polipéptido de neublastina
variante puede proporcionarse como una proteína de fusión. Derivados
polipeptídicos de fusión de proteínas de la invención también
incluyen diversas formas estructurales de la proteína primaria que
retienen la actividad biológica. Según se usa aquí, "fusión" se
refiere a una conexión covalente colineal de dos o más proteínas o
fragmentos de las mismas a través de sus cadenas principales
peptídicas individualmente, lo más preferiblemente a través de la
expresión genética de una molécula polinucleotídica que codifica
esas proteínas en el mismo marco de lectura (es decir, "en el
marco"). Se prefiere que las proteínas o los fragmentos de las
mismas sean de diferentes fuentes. Así, proteínas de fusión
preferidas incluyen una proteína o fragmento de neublastina
variante conectado covalentemente a un segundo resto que no es una
neublastina variante. Preferiblemente, el segundo resto se deriva
de un polipéptido que existe como un monómero, y es suficiente para
conferir propiedades de solubilidad y/o biodisponibilidad
potenciadas al polipéptido de neublastina.
Por ejemplo, una "fusión de neublastina
variante/albúmina de suero humano" es una proteína que comprende
un polipéptido de neublastina variante de la invención, o un
fragmento del mismo, cuyo extremo N o extremo C está conectado en
el marco a un polipéptido de albúmina de suero humano (Véase, Syed y
otros, Blood, 1997, 89: 3243 y Yeh y otros, P.N.A.S. USA 1992,
89:1904 y las Patentes de EE.UU. Nº 5.876.969 y 5.302.697). El
término "proteína de fusión" incluye adicionalmente una
neublastina variante conectada químicamente a través de una
molécula mono- o hetero-funcional a un segundo resto
que no es una proteína de neublastina variante y se elabora de novo
a partir de proteína purificada según se describe
posteriormente.
Fusiones de neublastina-albúmina
de suero pueden construirse usando métodos conocidos en la
especialidad. Puede usarse cualquiera de un número de reticuladores
que contienen un grupo reactivo con amino correspondiente y un
grupo reactivo con tiol para conectar neublastina a albúmina de
suero. Ejemplos de conectores adecuados incluyen reticuladores
reactivos con amina que insertan una maleimida reactiva con tiol.
Estos incluyen, por ejemplo, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB,
SMPH, KMUS o GMBS. Otros conectores adecuados insertan un grupo
haloacetato reactivo con tiol. Estos incluyen, por ejemplo, SBAP,
SIA, SIAB, y los que proporcionan un tiol protegido o no protegido
para la reacción con grupos sulfhidrilo para producir una conexión
reducible son SPDP, SMPT, SATA o SATP, todos los cuales están
disponibles comercialmente (por ejemplo, Pierce Chemicals). Un
experto en la especialidad puede prever de forma similar con
estrategias alternativas qué conectará el extremo N de la
neublastina con albúmina de suero.
También se prevé que un experto en la
especialidad pueda generar conjugados con albúmina de suero que no
están orientados al extremo N de NBN o al resto tiol en la albúmina
de suero. Si se desea, pueden generarse fusiones de
NBN-albúmina de suero usando técnicas de ingeniería
genética, en donde NBN se fusiona al gen de albúmina de suero en su
extremo N, extremo C o en ambos extremos.
\newpage
Se contempla además que cualquier conjugado de
NBN que dé como resultado un producto con una semivida prolongada
en animales (incluyendo seres humanos) pueda generarse usando una
estrategia similar.
Otros derivados de neublastinas variantes
incluyen conjugados covalentes o agregados de neublastina variante
o sus fragmentos con otras proteínas o polipéptidos, tales como
mediante la síntesis en cultivo recombinante como extremos N o
extremos C adicionales. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser
una secuencia polipeptídica de señal (o líder) en la región
N-terminal de la proteína que dirige
cotraduccionalmente o postraduccionalmente la transferencia de la
proteína desde su sito de síntesis a su sitio de función dentro o
fuera de la membrana o pared celular (por ejemplo, el factor líder
alfa de levadura). Proteínas receptoras de neublastina pueden
comprender péptidos añadidos para facilitar la purificación o la
identificación de neublastina (por ejemplo, fusiones de
histidina/neublastina). Las secuencias de aminoácidos de neublastina
también pueden conectarse al péptido
Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
(DYKDDDDK) (Hopp y otros, Biotechnology 6:1204,1988). La última
secuencia es altamente antigénica y proporciona un epítopo unido
reversiblemente por un anticuerpo monoclonal específico, que
permite el ensayo rápido y la purificación fácil de proteína
recombinante expresada.
Esta secuencia también se segmenta
específicamente mediante enteroquinasa mucosal bovina en el residuo
inmediatamente siguiente al apareamiento
Asp-Lys.
Si se desea, puede emplearse una sola molécula
de polímero para la conjugación con un polipéptido de neublastina,
aunque también se contempla asimismo que más de una molécula de
polímero pueda ligarse. Las composiciones de neublastina conjugada
de la invención pueden encontrar utilidad en aplicaciones tanto
in vivo así como no in vivo. Adicionalmente, se
apreciará que el polímero de conjugación puede utilizar cualesquiera
otros grupos, restos u otras especies conjugadas, según sea
apropiado para la aplicación de uso final. A modo de ejemplo, puede
ser útil en algunas aplicaciones unir covalentemente al polímero un
resto funcional que imparte resistencia a la degradación UV, o
antioxidación, u otras propiedades o características al polímero.
Como un ejemplo adicional, puede ser ventajoso en algunas
aplicaciones funcionalizar el polímero para hacerlo de carácter
reactivo o reticulable, para potenciar diversas propiedades o
características del material conjugado global. De acuerdo con esto,
el polímero puede contener cualquier funcionalidad, grupos
repetitivos, conexiones u otras estructuras constituyentes que no
impiden la eficacia de la composición de muteína de neublastina
conjugada para su propósito pretendido.
Polímeros ilustrativos que pueden emplearse
útilmente para alcanzar estas características deseables se describen
aquí más adelante en esquemas de reacción ejemplares. En
aplicaciones de péptidos unidos covalentemente, el polímero puede
funcionalizarse y a continuación acoplarse a un aminoácido o
aminoácidos libres del péptido o los péptidos para formar enlaces
lábiles.
En algunas modalidades, el polipéptido de
neublastina está conectado al polímero a través de un grupo reactivo
terminal del polipéptido. Alternativamente, o además, el
polipéptido de neublastina puede conectarse a través del grupo
amino de cadena lateral de un residuo de lisina interno, por
ejemplo, un residuo de lisina introducido en la secuencia de
aminoácidos y un polipéptido de neublastina presente en la
naturaleza. Así, las conjugaciones también pueden ramificarse a
partir de los grupos reactivos no terminales. El polímero con el
grupo o los grupos reactivos se denomina aquí "polímero
activado". El grupo reactivo reacciona selectivamente con amino
libre u otros grupos reactivos en la proteína.
La ligación puede producirse en el polímero
activado en cualquier grupo amino de la neublastina disponible tal
como los grupos amino alfa o los grupos amino épsilon de un residuo
o residuos de lisina introducidos en la secuencia de aminoácidos de
un polipéptido de neublastina o variante del mismo. Grupos
carboxílicos libres, grupos carbonilo adecuadamente activados,
hidroxilo, guanidilo, imidazol, restos de carbohidrato oxidados y
grupos mercapto de la neublastina (si están disponibles) también
pueden usarse como sitios de ligación.
Generalmente, se emplean de aproximadamente 1,0
a aproximadamente 10 moles de polímero activado por mol de
proteína, dependiendo de la concentración de proteína. La cantidad
final es un equilibrio entre maximizar la extensión de la reacción
mientras se minimizan modificaciones no específicas del producto y,
al mismo tiempo, definir químicas que mantendrán la actividad
óptima, mientras que al mismo tiempo se optimiza, si es posible, la
semivida de la proteína. Preferiblemente, se retiene al menos
aproximadamente 50% de la actividad biológica de la proteína y, lo
más preferiblemente, se retiene cerca de 100%.
Las reacciones pueden tener lugar mediante
cualquier método adecuado usado para hacer reaccionar materiales
biológicamente activos con polímeros inertes, preferiblemente a
aproximadamente pH 5-8, por ejemplo pH 5, 6, 7 u 8,
si los grupos reactivos están sobre el grupo amino alfa en el
extremo N. Generalmente, el procedimiento implica preparar un
polímero activado y posteriormente hacer reaccionar la proteína con
el polímero activado para producir la proteína soluble adecuada
para la formulación. La reacción de modificación anterior puede
realizarse mediante varios métodos, que pueden implicar una o más
etapas.
El polímero puede acoplarse al polipéptido de
neublastina variante usando métodos conocidos en la técnica. Por
ejemplo, en una modalidad, el resto de polialquilenglicol se acopla
a un grupo lisina del polipéptido de neublastina o el polipéptido
de neublastina variante. La conexión al grupo lisina puede
realizarse con un éster activo de
N-hidroxisuccinimida (NHS), tal como
PEG-succinato de succinimidilo
(SS-PEG) y propionato de succinimidilo
(SPA-PEG). Restos polialquilenglicol adecuados
incluyen, por ejemplo, carboximetil-NHS,
norleucina-NHS, SC-PEG, tresilato,
aldehído, epóxido, carbonilimidazol y carbonato de PNP.
Conectores de PEG reactivos con amina
adicionales pueden substituir al resto succinimidilo. Estos
incluyen, por ejemplo, isotiocianatos, nitrofenilcarbonatos,
epóxidos y benzotriazolcarbonatos. Las condiciones se eligen
preferiblemente para maximizar la selectividad y la extensión de la
reacción. Pueden usarse formas lineales y ramificadas de PEG así
como otras formas alquílicas. La longitud del PEG puede variarse.
Las formas más comunes varían en tamaño de 2 K-100
K. Aunque los presentes ejemplos dan cuenta de que la pegilación
orientada en el extremo N no afecta a las propiedades
farmacocinéticas, el hecho de que el material retuviera la función
fisiológica indica que la modificación en el sitio o los sitios
descritos aquí no es perjudicial. Por consiguiente, al generar
formas mutantes de NBN que podrían proporcionar sitios adicionales
de ligación a través de inserción de residuos de lisina, se
considera aceptable el resultado probable de que estas formas se
pegilaran tanto en la lisina como en el extremo N.
Si se desea, los polipéptidos variantes de
neublastina pueden contener una etiqueta, por ejemplo una etiqueta
que puede liberarse posteriormente mediante proteolisis. Así, el
resto de lisina puede modificarse selectivamente haciendo
reaccionar en primer lugar una variante con etiqueta de his con un
conector de bajo peso molecular tal como el reactivo de Traut
(Pierce) que reaccionará tanto con la lisina como en el extremo N, y
a continuación liberando la etiqueta de his. El polipéptido
contendrá entonces un grupo SH libre que puede modificarse
selectivamente con un PEG que contiene un grupo de cabeza reactivo
con tiol tal como un grupo maleimida, un grupo vinilsulfona, un
grupo haloacetato o un SH libre o protegido.
El reactivo de Traut puede reemplazarse por
cualquier conector que establezca un sitio específico para la
ligación de PEG. A modo de ejemplo, el reactivo de Traut podría
reemplazarse por SPDP, SMPT, SATA o SATP (todos disponibles de
Pierce). De forma similar, podría hacerse reaccionar la proteína con
un conector reactivo con amina que inserte una maleimida (por
ejemplo, SMCC, AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS o GMBS), un
grupo haloacetato (SBAP, SIA, SIAB) o un grupo vinilsulfona y hacer
reaccionar el producto resultante con un PEG que contenga un SH
libre. La única limitación para el tamaño del conector que se emplea
es que no pueda bloquear la retirada subsiguiente de la etiqueta
N-terminal.
Así, en otras modalidades, el resto de
polialquilenglicol está acoplado a un grupo cisteína del polipéptido
de neublastina o el polipéptido de neublastina variante. El
acoplamiento puede efectuarse usando, por ejemplo, un grupo
maleimida, un grupo vinilsulfona, un grupo haloacetato y un grupo
tiol.
Uno o más sitios en un polipéptido de
neublastina variante pueden acoplarse a un polímero. Por ejemplo,
uno, dos, tres, cuatro o cinco restos de PEG pueden ligarse al
polímero. En algunas modalidades, un resto de PEG está ligado en el
extremo amino y/o los aminoácidos 14, 39, 68 y 95 de un polipéptido
de neublastina numerado como se muestra en la Tabla 1.
En modalidades preferidas, el polipéptido de
neublastina variante en la composición tiene una semivida en suero
más prolongada con relación a la semivida del polipéptido variante
en ausencia del polímero. Alternativamente, o además, el
polipéptido de neublastina variante en las composiciones se une a
GFR\alpha3, activa RET, normaliza cambios patológicos de una
neurona o potencia la supervivencia de una neurona, o realiza una
combinación de estas funciones fisiológicas.
En modalidades preferidas, la composición se
proporciona como un complejo de polipéptido de neublastina o
polipéptido de neublastina variante conjugado, soluble en agua,
estable, que comprende un polipéptido de neublastina o un
polipéptido de neublastina variante acoplado a un resto de
polietilenglicol. Si se desea, el polipéptido de neublastina o el
polipéptido de neublastina variante puede estar acoplado al resto de
polietilenglicol mediante un enlace lábil. El enlace lábil puede
segmentarse en, por ejemplo, hidrólisis, proteolisis o segmentación
de sulfhidrilo bioquímicas. Por ejemplo, el enlace puede segmentarse
bajo condiciones in vivo (fisiológicas).
También se proporciona una composición
farmacéutica que incluye un conjugado de neublastina
variante-polímero de la presente invención. Una
"composición farmacéutica", según se usa aquí, se define por
comprender una proteína de neublastina o un conjugado de la
invención, dispersado en un vehículo fisiológicamente aceptable,
que contiene opcionalmente uno o más de otros ingredientes
fisiológicamente compatibles. La composición farmacéutica puede así
contener un excipiente tal como agua, uno o más minerales, azúcares,
detergentes y uno o más portadores tales como una proteína inerte
(por ejemplo, heparina o albúmina).
Los conjugados de
polímero-neublastina de la invención pueden
administrarse como tales así como en la forma de ésteres, sales y
otros derivados fisiológicamente funcionales de los mismos,
farmacéuticamente aceptables. En tales formulaciones farmacéuticas
y medicamentosas, el conjugado de variante de neublastina se utiliza
preferiblemente junto con uno o más portador o portadores
farmacéuticamente aceptables y opcionalmente cualesquiera otros
ingredientes terapéuticos.
\newpage
El portador o los portadores deben ser
farmacéuticamente aceptables en el sentido de ser compatibles con
los otros ingredientes de la formulación y no excesivamente
perjudiciales para el receptor de la misma. La neublastina variante
se proporciona en una cantidad eficaz para alcanzar un efecto
farmacológico o un efecto médicamente beneficioso deseado, según se
describe aquí, en una cantidad apropiada para alcanzar la dosis o
concentración in vivo biodisponible deseada.
Las formulaciones incluyen las adecuadas para
administración parenteral así como no parenteral, y modalidades de
administración específicas incluyen la administración oral, rectal,
bucal, tópica, nasal, oftálmica, subcutánea, intramuscular,
intravenosa, transdérmica, intratecal, intraarticular,
intraarterial, subaracnoide, bronquial, linfática, vaginal e
intrauterina. Se prefieren las formulaciones adecuadas para
administración en aerosol y parenteral, tanto localmente como
sistémicamente.
Cuando la neublastina variante se utiliza en una
formulación que comprende una solución líquida, la formulación
puede administrarse ventajosamente oralmente, bronquialmente o
parenteralmente. Cuando la neublastina se emplea en una formulación
de suspensión líquida o como un polvo en una formulación portadora
biocompatible, la formulación puede administrarse ventajosamente
oralmente, rectalmente o bronquialmente. Alternativamente, puede
administrarse nasalmente o bronquialmente, a través de nebulización
del polvo en un gas portador, para formar una dispersión gaseosa
del polvo que es inspirada por el paciente a partir de un circuito
respirador que comprende un dispositivo nebulizador adecuado.
Las formulaciones que comprenden las proteínas
de la presente invención pueden presentarse convenientemente en
formas de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante
cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la
farmacia. Tales métodos incluyen generalmente la etapa de asociar el
ingrediente o los ingredientes activos con un portador que integra
uno o más ingredientes auxiliares.
Típicamente, las formulaciones se preparan
asociando uniformemente e íntimamente el ingrediente o los
ingredientes activos con un portador líquido, un portador sólido
finamente dividido, o ambos, y a continuación, si es necesario,
conformando el producto en formas de dosificación de la formulación
deseada.
Formulaciones de la presente invención adecuadas
para administración oral pueden presentarse como unidades discretas
tales como cápsulas, cachets, tabletas o grageas, conteniendo cada
una una cantidad predeterminada del ingrediente activo como un
polvo o gránulos; o una suspensión en un licor acuoso o un líquido
no acuoso, tal como un jarabe, un elixir, una emulsión o una
poción.
Formulaciones adecuadas para la administración
parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa
estéril del conjugado activo, que preferiblemente es isotónica con
la sangre del receptor (por ejemplo, solución salina fisiológica).
Tales formulaciones pueden incluir agentes de suspensión y agentes
espesantes u otros sistemas en micropartículas que están diseñados
para orientar el compuesto a componentes de la sangre o uno o más
órganos. Las formulaciones pueden presentarse en forma de dosis
unitaria o dosis múltiples.
Las formulaciones de pulverización nasal
comprenden soluciones acuosas purificadas del conjugado activo con
agentes conservantes y agentes isotónicos. Tales formulaciones se
ajustan preferiblemente hasta un pH y un estado isotónico
compatible con las membranas de la mucosa nasal.
Las formulaciones para administración rectal
pueden presentarse como un supositorio con un portador adecuado tal
como mantequilla de cacao, grasas hidrogenadas o un ácido
carboxílico graso hidrogenado. Las formulaciones oftálmicas, tales
como gotas oculares, se preparan mediante un método similar a la
pulverización nasal, excepto que el pH y los factores isotónicos se
ajustan preferiblemente para adaptarse a los del ojo.
Las formulaciones tópicas comprenden los
conjugados de la invención disueltos o suspendidos en uno o más
medios, tales como aceite mineral, petróleo, alcoholes
polihidroxilados u otras bases usadas para formulaciones
farmacéuticas tópicas.
Además de los ingredientes mencionados
anteriormente, las formulaciones de esta invención pueden incluir
además uno o más ingredientes auxiliares seleccionados de
diluyentes, tampones, agentes saboreantes, desintegrantes, agentes
tensioactivos, espesantes, lubricantes, conservantes (incluyendo
antioxidantes) y similares. Las consideraciones previas también se
aplican a las proteínas de fusión de neublastina de la invención
(por ejemplo, fusiones de neublastina-HSA).
De acuerdo con esto, la presente invención
contempla el suministro de proteínas de fusión adecuadas para la
estabilización in vitro de un conjugado de neublastina
variante en solución, como una aplicación ilustrativa preferida de
la invención. Las proteínas de fusión pueden emplearse, por ejemplo,
para incrementar la resistencia a la degradación enzimática del
polipéptido de neublastina variante y proporcionar un medio para
mejorar la vida útil, la estabilidad a temperatura ambiente, y
similares. Se entiende que las consideraciones precedentes se
aplican también a las proteínas de fusión de
neublastina-albúmina de suero (incluyendo las
proteínas de fusión de neublastina humana-albúmina
de suero humano) de la invención.
Los polipéptidos de neublastina variantes, así
como las proteínas de fusión o los conjugados de los mismos, pueden
usarse para tratar o aliviar un trastorno o enfermedad de un cuerpo
animal vivo, preferiblemente de un mamífero, más preferiblemente un
primate incluyendo un ser humano, trastorno o enfermedad que es
sensible a la actividad de agentes neurotróficos.
Las composiciones de la invención pueden usarse
directamente a través de, por ejemplo, composiciones farmacéuticas
inyectadas, implantadas o ingeridas para tratar un proceso
patológico sensible a los polipéptidos de neublastina. Las
composiciones pueden usarse para aliviar un trastorno o enfermedad
de un cuerpo animal vivo, incluyendo un ser humano, trastorno o
enfermedad que es sensible a la actividad de agentes neurotróficos.
El trastorno o la enfermedad puede en particular ser daño del
sistema nervioso provocado por trauma, cirugía, isquemia,
infección, enfermedades metabólicas, deficiencia nutricional,
agentes malignos o tóxicos y procesos genéticos o idiopáticos.
El daño puede haberse producido en particular a
neuronas sensoriales o células ganglionales retinales, incluyendo
neuronas de los ganglios radicales dorsales de la médula espinal o
en cualquiera de los siguientes tejidos: los ganglios geniculados,
petrosales y nodosos; el complejo vestibuloacústico del octavo
nervio craneal, el polo ventrolateral del lóbulo maxilomandibular
del ganglio trigeminal y el núcleo trigeminal mesencefácilo.
En una modalidad preferida del método de la
invención, la enfermedad o el trastorno es una enfermedad
neurodegenerativa que implica neuronas lesionadas y traumáticas,
tales como lesiones traumáticas de nervios periféricos, la médula
y/o la médula espinal, daño neuronal isquémico cerebral, neuropatía
y especialmente neuropatía periférica, trauma o lesión de nervios
periféricos, apoplejía isquémica, lesión cerebral aguda, lesión
aguda de la médula espinal, tumores del sistema nervioso,
esclerosis múltiple, exposición a neurotoxinas, enfermedades
metabólicas tales como diabetes o disfunciones renales y daño
provocado por agentes infecciosos, trastornos neurodegenerativos
incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington,
enfermedad de Parkinson, síndrome de Parkinson-plus,
parálisis supranuclear progresiva (síndrome de
Steele-Richardson-Olszewski),
atrofia olivopontocerebelar (OPCA), síndrome de
Shy-Drager (atrofia de múltiples sistemas), complejo
de demencia-parkinsonismo guamanio, esclerosis
lateral amiotrófica o cualquier otra enfermedad congénita o
neurodegenerativa, y deterioro de la memoria conectado con
demencia.
En una modalidad preferida, pueden tratarse
neuronas sensoriales y/o del sistema autónomo. En particular,
pueden tratarse neuronas nociceptivas y mecanoreceptivas, más
particularmente neuronas de la fibra delta y la fibra C. Además,
pueden tratarse neuronas simpáticas y parasimpáticas del sistema
autónomo.
En otra modalidad preferida, pueden tratarse
enfermedades de neuronas motrices tales como esclerosis lateral
amiotrófica ("ALS") y atrofia muscular espinal. En otra
modalidad preferida más, las moléculas de neublastina de esta
invención pueden usarse para potenciar la recuperación de los
nervios después de una lesión traumática. Alternativamente, o
además, puede usarse en los métodos descritos aquí un canal de guía
del nervio con una matriz que contiene polipéptidos de neublastina
variante o una fusión o conjugados de polipéptidos de neublastina
variante. Tales canales de guía del nervio se describen, por
ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.834.029, incorporada
aquí mediante referencia.
En una modalidad preferida, las composiciones
descritas aquí (y composiciones farmacéuticas que contienen las
mismas) se usan en el tratamiento de neuropatías periféricas. Entre
las neuropatías periféricas contempladas para el tratamiento con
las moléculas de esta invención están neuropatías inducidas por
trauma, por ejemplo las provocadas por lesión física o estado
patológico, daño físico al cerebro, daño físico a la médula espinal,
apoplejía asociada con daño cerebral y trastornos neurológicos
relacionados con la neurodegeneración. También se incluyen aquí las
neuropatías secundarias a infección, exposición a toxinas y
exposición a fármacos. Además, también se incluyen aquí las
neuropatías secundarias a enfermedad sistémica o metabólica. Las
composiciones descritas aquí también pueden usarse para tratar
neuropatías inducidas por quimioterapia (tales como las provocadas
por aporte de agentes quimioterapéuticos, por ejemplo taxol o
cisplatino); neuropatías inducidas por toxinas, neuropatías
inducidas por fármacos, neuropatías inducidas por deficiencia de
vitaminas; neuropatías idiopáticas y neuropatías diabéticas.
Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 5.496.804 y
5.916.555, cada una incorporada aquí mediante referencia.
Estados adicionales que pueden tratarse usando
las composiciones descritas aquí son mononeuropatías, neuropatías
mono-múltiples y polineuropatías, incluyendo
neuropatías axonales y desmielinizantes, usando las composiciones
descritas aquí.
En otra modalidad preferida, las composiciones
de la invención (y las composiciones farmacéuticas que contienen
las mismas) se usan en el tratamiento de diversos trastornos del
ojo, incluyendo pérdida de fotorreceptores de la retina en
pacientes afectados de degeneración macular, retinitis pigmentosa,
glaucoma y enfermedades similares.
La invención se ilustrará adicionalmente en los
siguientes ejemplos no limitativos.
Se observó que neublastina humana recombinante
derivada de células CHO se depuraba rápidamente de la circulación
si se administraba intravenosamente en ratas. No se detectaba nada
de la proteína en el suero después de la administración subcutánea.
Para incrementar la biodisponibilidad de la neublastina, se
construyeron formas pegiladas.
Debido a que no estaban presentes lisinas en la
secuencia de NBN, las químicas de pegilación específicas para
aminas darán como resultado la pegilación de un polipéptido de NBN
en su extremo amino. Así, para cada dímero de neublastina, deben
ligarse dos restos de PEG. De acuerdo con esto, las formas de PEG se
orientaron en primer lugar directamente al extremo N a través de
químicas específicas para aminas. Sorprendentemente, la pegilación
incluso con dos PEGs de 20 K ligados tenía poco beneficio sobre la
semivida, indicando que un mecanismo basado en la ruta de
depuración estaba anulando la potenciación en la semivida que se
esperaba que se alcanzara mediante pegilación.
Se examinó a continuación la biodisponibilidad
de formas mutantes de NBN pegiladas en residuos de aminoácido
internos. Se diseñó una serie de cuatro mutantes que reemplazaban
los residuos presentes en la naturaleza en las posiciones 14, 39,
68 y 95 para insertar lisinas en sitios seleccionados de la
secuencia. Estas lisinas proporcionarían sitios alternativos para
la ligación del PEG. Estos sitios se seleccionaron usando la
estructura cristalina de GDNF (Nat. Struct. Biol. 4:
435-8, 1997) como un marco estructural para
identificar residuos superficiales y el estudio de mutagénesis de
quimeras de persefina/neublastina (J. Biol. Chem. 275:
3412-20, 2000) para identificar regiones
funcionalmente importantes de la estructura que debían evitarse.
Dos de las mutaciones (R39 y R68) se orientaron
en una región que, basado en la distribución de posibles cargas
sobre la superficie, podría representar un sitio de unión a
heparina, una propiedad de la proteína que contribuye probablemente
a su rápida depuración. Un tercer sitio se orientó en N95, el sitio
de glicosilación natural en NBN silvestre. El sitio está
naturalmente modificado con una estructura de carbohidratos
compleja. Por lo tanto, no se esperaba que la modificación con PEG
en este sitio tuviera impacto sobre la función. El cuarto sitio
(R14) se seleccionó en una región que no estaba cubierta con ninguna
otra de las modificaciones. Un mutante en el que el residuo de
asparagina en la posición 95 era reemplazado por una lisina (el
"mutante N95K") se eligió para los estudios descritos
aquí.
Se construyeron cuatro muteínas de neublastina
de rata diferentes que contenían una o más alteraciones en la
secuencia silvestre de polipéptido de neublastina de rata. Las
muteínas incluyen la muteína N95K simple y las muteínas que
contienen substituciones simples en otros sitios de la secuencia de
aminoácidos de neublastina de rata: R14K, R68K y R39K. En la
nomenclatura "X_{1}N_{1}X_{2}", X_{1} se refiere a un
aminoácido y un polipéptido de neublastina silvestre, N_{1} se
refiere a la posición numérica de los aminoácidos X_{1} en la
secuencia, según se numera de acuerdo con el Nº ID SEC: 1. X_{2}
se refiere a un aminoácido que substituye al aminoácido silvestre
en la posición numérica indicada en la secuencia.
Para construir la mutación de neublastina N95K
de rata, se realizó mutagénesis dirigida al sitio sobre pCMB020, un
plásmido que codifica neublastina de rata silvestre. La secuencia de
ácido nucleico y de aminoácidos de neublastina de rata silvestre
del polipéptido codificado de ese modo se presenta
posteriormente:
\vskip1.000000\baselineskip
La mutagénesis de pCM020 usando los
oligonucleótidos KD2-310 y KD3-211
daba como resultado la formación del plásmido pCMB027:
En pCMB027, el codón que codifica asparagina en
la posición 95 se ha reemplazado por un codón que codifica
lisina.
Una muteína de neublastina R14K formada por la
substitución de un codón que codifica arginina en la posición 14
por un codón que codifica lisina en la secuencia de codificación de
neublastina de pCMB020. Se realizó mutagénesis dirigida al sitio
sobre pCMB020 usando los oligonucleótidos KD3-254 y
KD3-255:
El constructo resultante se denominó
pCMB029.
Una muteína de neublastina R68K formada por la
substitución de un codón que codifica arginina en la posición 68
por un codón que codifica lisina en la secuencia de codificación de
neublastina de pCMB020. Se realizó mutagénesis dirigida al sitio
sobre pCMB020 usando los oligonucleótidos KD3-258 y
KD3-259:
El constructo resultante se denominó
pCMB030.
Una muteína de neublastina R39K formada por la
substitución de la arginina en el aminoácido 39 por lisina en la
secuencia de codificación de neublastina de pCMB020. Se realizó
mutagénesis dirigida al sitio de pCMB027 usando los
oligonucleótidos KD3-256 y
KD3-257:
Para la expresión y la purificación, un plásmido
que codifica la muteína N95K de NBN de rata se expresó en E.
coli como una proteína de fusión etiquetada con His con un sitio
de segmentación de enteroquinasa inmediatamente adyacente al inicio
de la secuencia de NBN de 113 aminoácidos madura. La E. coli
se desarrolló en un fermentador de 500 l y se proporcionó pasta
celular congelada. Las células de E. coli se sometieron a
lisis en una prensa de Manton Gaulin y la NBN NK de rata se
recuperó de la fracción en forma de pella lavada insoluble.
La NBN se extrajo de la pella con hidrocloruro
de guanidina, se replegó y la etiqueta de his se retiró con
enteroquinasa. El producto se sometió a continuación a cromatografía
sobre agarosa Ni NTA (Qiagen) y en una resina de intercambio
catiónico Bakerbond WP CBX.
El tratamiento con enteroquinasa de este
producto etiquetado con his daba como resultado una segmentación
aberrante de la proteína en la arginina 7 en la secuencia madura. El
producto des-1-7-NBN
resultante era completamente activo en el ELISA de KIRA y
estructuralmente indistinguible de la forma madura en su
susceptibilidad a desnaturalización inducida por guanidina y por lo
tanto se usó para el trabajo subsiguiente.
N95K de NBN de rata se pegiló con un promedio de
3,3 restos de PEG/molécula usando propionato de
metoxipoli(etilenglicol)-succinimidilo
(SPA-PEG) con una masa molecular de 10.000 Da como
el reaccionante. El producto pegilado resultante se sometió a
caracterización intensiva incluyendo análisis mediante
SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaños
(SEC), HPLC en fase inversa, espectrometría de masas de
desorción/ionización lasérica asistida por matriz (MALDI/MS), mapeo
de péptidos, determinación de la actividad del ELISA de KIRA y
determinación del contenido de endotoxinas. La pureza del producto
de N95K de NBN antes de la pegilación según se medía mediante
SDS-PAGE y SEC era mayor que 95%. El producto de
N95K de NBN migraba bajo condiciones no reductoras como un dímero,
de acuerdo con su estructura predicha. Después de la pegilación, el
producto resultante consistía en una serie de aductos modificados
que contenían 2 PEGs/5% de moléculas del producto, 3 PEGs/60% de
moléculas del producto, 4 PEGs/30% de moléculas del producto y
varias formas secundarias de masa superior. En la muestra pegilada
no había evidencia de agregados. Los niveles residuales de NBN no
modificada en el producto estaban por debajo de los límites de
cuantificación. El contenido de endotoxinas del material es
habitualmente menor que 1 EU/mg. La actividad específica de la NBN
pegilada en el ELSIA de KIRA es 10 nM. El producto pegilado se
formuló en 1,1 mg/ml en PBS, pH 6,5. El material, que es similar en
potencia a wt-NBN, puede suministrarse como un
líquido congelado, que se almacena a -70ºC.
Las muteínas R14K, R29K y R68K se expresaron en
E. coli y pueden someterse a los mismos métodos para la
purificación, la pegilación y la determinación de la función que se
describen anteriormente para la N95K-NBN.
230 ml de la N95K de NBN de rata replegada (2,6
mg/ml) que se había producido en E. coli y almacenado a 4ºC
en fosfato sódico 5 mM, pH 6,5, NaCl 100 mM, se diluyeron con 77 ml
de agua, 14,4 ml de HEPES 1M, pH 7,5, y 2,8 g (10 mg/ml finales) de
PEG SPA 10.000 Da (Shearwater Polymers, Inc.). La muestra se incubó
a temperatura ambiente durante 4 horas en la oscuridad, a
continuación se trató con imidazol 5 mM (final), se filtró y se
almacenó durante la noche a 4ºC. El producto se generó en dos
partidas, una que contenía 130 ml de la masa de N95K de NBN y la
otra que contenía 100 ml de la masa. La NBN pegilada se purificó de
la mezcla de reacción en Fractogel EMD S0_{3}^{-} (M) (EM
Industries). La columna se recorrió a temperatura ambiente. Todos
los tampones se prepararon libres de pirógenos. Se añadió cloruro
sódico a la mezcla de reacción hasta una concentración final de 87
mM y la muestra se cargó en una columna Fractogel de 45 ml (5 cm de
diámetro interno).
La columna se lavó con un volumen de columna de
fosfato sódico 5 mM, pH 6,5, NaCl 80 mM, y a continuación con tres
partes alícuotas de un volumen de columna de fosfato sódico 5 mM que
contenía NaCl 50 mM. La resina se transfirió a una columna de 2,5
cm de diámetro y la NBN pegilada se eluyó de la columna con seis
etapas de diez ml que contenían fosfato sódico 5 mM, pH 6,5, NaCl
400 mM, tres etapas que contenían 500 ml de NaCl y seis etapas que
contenían NaCl 600 mM. Las fracciones de elución se analizaron con
respecto al contenido de proteína mediante absorbancia a 280 nm y a
continuación con respecto a la extensión de la modificación
mediante SDS-PAGE. Las fracciones seleccionadas se
reunieron, se filtraron a través de un filtro de 0,2 \mum y se
diluyeron con agua hasta 1,1 mg de NBN de rata pegilada/ml. Después
de determinar los niveles de endotoxinas en las partidas
individuales, se reunieron y se refiltraron a través de una membrana
de 0,2 \mum. El material final se dividió en partes alícuotas y
se almacenó a -70ºC.
El espectro UV (240-340 nm) de
NBN NK pegilada se tomó sobre la muestra neta. La muestra se analizó
por triplicado. La muestra pegilada exhibía un máximo de
absorbancia a 275-277 nm y un mínimo de absorbancia
a 247-249. Este resultado está de acuerdo con lo
que se observa en el producto intermedio de masa de NBN no
modificada. La concentración de proteína del producto pegilado se
estimó a partir del espectro usando un coeficiente de extinción de
\Sigma_{280} 0,1% = 0,50. La concentración de proteína de la
masa de NBN pegilada es 1,1 mg/ml. No estaba presente turbidez en
la muestra según era evidente por la falta de absorbancia a 320
nm.
Partes alícuotas de NBN pegilada que contenían
3, 1,5, 0,75 y 0,3 \mug del producto se sometieron a
SDS-PAGE en un gel con gradiente de
4-20% (Owl). El gel se tiñó con azul brillante de
Coomassie R-250. Marcadores del peso molecular
(GIBCO-BRL) se hicieron pasar en paralelo.
El análisis por SDS-PAGE de NBN
NK pegilada bajo condiciones no reductoras revelaba una serie de
bandas correspondiente a modificaciones con 2, 3, 4 y más de 4
PEGs/molécula. La banda principal con una masa aparente de 98 kDa
contiene 3 PEGs/molécula. En el producto pegilado purificado no se
detectó NBN no modificada. La presencia de una mezcla de producto
con 2, 3 y 4 PEGs ligados se verificó mediante análisis
espectrométrico de masas MALDI. La relación de producto que
contiene 2, 3 y 4 PEGs se determinó mediante densitometría y se
determinó que era 7, 72 y 30 por ciento del total,
respectivamente.
NBN pegilada se sometió a cromatografía de
exclusión por tamaño en una columna Superose 6 HR1O/30 FPLC
analítica usando MES 5 mM, pH 6,5, NaCl 300 mM como la fase móvil.
La columna se recorrió a 20 ml/h. Las fracciones de elución se
verificaron con respecto a la absorbancia a 280 nm. La NBN pegilada
se eluía como un solo pico con un peso molecular aparente de
aproximadamente 200 kDa de acuerdo con el volumen hidrodinámico
grande de PEG. No se observó evidencia de agregados. NBN libre, que
se eluye con una masa molecular aparente de aproximadamente 30 kDa,
no se detectó en la preparación.
NBN NK pegilada se sometió a HPLC de fase
inversa en una columna Vydac C_{4} (5 \mum, 1 x 250 mm). La
columna se desarrolló usando un gradiente de 60 nm desde 40 a 60% de
B (Tampón A: TFA al 0,1%, Tampón B: acetonitrilo al 75%/TFA al
0,085%). El efluente de la columna se verificó con respecto a la
absorbancia a 214 nm y se recogieron fracciones para el análisis
subsiguiente. La NBN NK pegilada se fraccionó en sus diversos
componentes di-(60,5 mm), tri (63,3 mm) y tetra (67,8 mm) pegilados
mediante HPLC en fase inversa en una columna C_{4}. Las
intensidades relativas de los picos sugieren que las relaciones de
los componentes son 5,4, 60,5 y 30,1%, respectivamente. Las
densidades de los picos se verificaron mediante
MALDI-MS. No existía evidencia de NBN NK no pegilada
(se eluye a 15 mm) en el producto.
NBN NK pegilada se desaló en una Zip Tip C_{4}
y se analizó mediante espectrometría de masas en un espectrómetro
de masas de desorción/ionización lasérica asistida por
matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF)
Voyager-DE^{TM} STR (PerSeptive Biosystems)
usando ácido sinapínico como una matriz. 0,5 \mul de la proteína
purificada se mezclaron con 0,5 \mul de matriz sobre la placa
elegida. La espectrometría de masas de NBN pegilada revelaba formas
simplemente y doblemente cargadas de tres aductos. Las masas
observadas de 43803 Da, 54045 Da y 64438 Da están de acuerdo con
las modificaciones de 2, 3 y 4 PEGs/molécula.
La especificidad de la reacción de pegilación se
evaluó mediante mapeo peptídico. NBN pegilada se separó en
componentes di-, tri- y tetra-pegilados, que a
continuación se redujeron, se alquilaron y se separaron
adicionalmente en sus componentes monocatenarios mediante HPLC en
una columna C_{4}. Estos componentes y NBN NK no modificada
reducida y alquilada como un control se digirieron con proteinasa
Asp-N y los productos de segmentación resultantes
se fraccionaron mediante HPLC en fase inversa en una columna Vydac
C_{18} (5 \mum, 1 x 250 mm) usando un gradiente de 60 mm desde
0 a 60% de B (Tampón A: TFA al 0,1%, Tampón B: acetonitrilo al
75%/TFA al 0,085%). El efluente de la columna se verificó con
respecto a la absorbancia a 214 mm.
La secuencia de NBN de rata contiene cuatro
ácidos aspárticos internos y por lo tanto se esperaba que diera un
perfil de segmentación simple cuando se digería con endoproteinasa
Asp-N. Todos los picos del digesto de
Asp-N de NBN NK de rata se han identificado mediante
espectrometría de masas y/o secuenciación N-terminal
de Edman y así el mapa peptídico puede usarse como una herramienta
simple para sondear los sitios de modificación mediante la
presencia o ausencia de un pico. La identidad de los diversos picos
se resume posteriormente en la Tabla 3.
Puesto que la NBN existe como un homodímero, el
producto de NBN NK de rata contiene cuatro sitios potenciales para
la pegilación, las dos aminas N-terminales de cada
una de las dos cadenas y los dos sitios N95K que se sometieron a
ingeniería hasta el constructo. En el mapa peptídico de la cadena
así pegilada, solo el pico que contiene el péptido con la mutación
NK estaba alterado por la modificación con PEG. Ninguno de los otros
picos estaba afectado por la modificación con PEG. Los datos del
mapeo indican por lo tanto que el resto de PEG se liga
específicamente a este péptido y no a ninguno de los otros péptidos
que se rastreaban. El segundo sitio potencial de unión, el extremo
N, está en un péptido que solo tiene tres aminoácidos de largo y no
es detectado en el mapa peptídico. Se infiere que las ligazones de
PEG adicionales están en este sitio. De acuerdo con esa noción, un
pequeño porcentaje de la NBN NK de rata no está acoplado y contiene
la secuencia de Ala-1 madura. Este péptido se eluye
en 30 \mum y es visible en el mapa peptídico a partir del digesto
no pegilado, pero está ausente de los digestos de NBN NK
pegilados.
La potencia de NBN de rata pegilada se midió
usando activación/fosforilación dependiente de NBN de
c-Ret como un informador para la actividad de NBN
en un ELISA que era específico para la presencia de RET fosforilado.
Células NB41A3-mRL3, una línea celular de
neuroblastoma múrido adherente que expresa Ret y GFR\alpha3, se
cultivaron en placa a 2 x 10^{5} células por pocillo en placas de
24 pocillos en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM),
complementado con suero bovino fetal al 10%, y se cultivaron durante
18 h a 37ºC y CO_{2} al 5%.
Las células se lavaron con PBS y se trataron con
diluciones en serie de NBN en 0,25 ml de DMEM durante 10 min a 37ºC
y CO_{2} al 5%. Cada muestra se retiró por duplicado. Las células
se lavaron con 1 ml de PBS y se sometieron a lisis durante 1 h a
4ºC con 0,30 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, Nonidet
P40 al 0,5%, desoxicolato sódico al 0,2%, NaF 50 mM,
Na_{3}VO_{4} 0,1 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM,
haciendo girar suavemente las placas. Los lisados se agitaron
adicionalmente mediante pipeteo repetido y 0,25 ml de muestras se
transfirieron a una placa de ELISA de 96 pocillos que se había
revestido con 5 \mug/ml de mAb anti-Ret (AA.GE7.3)
en tampón de carbonato 50 mM, pH 9,6, a 4ºC durante 18 h, y se
bloquearon a temperatura ambiente durante 1 hora con tampón de
bloqueo (Tris HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM,
Tween-20 al 0,1% (TBST) que contenía 1% de suero de
ratón normal y 3% de albúmina de suero bovino).
Después de una incubación de 2 h a temperatura
ambiente, los pocillos se lavaron 6 veces con TBST. Ret fosforilado
se detectó incubando los pocillos a temperatura ambiente durante 2 h
con 2 \mug/ml de anticuerpo anti-fosfotirosina
4G10 conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) en tampón de
bloqueo, lavando 6 veces con TBST y midiendo la actividad de HRP a
450 nm con un reactivo de detección colorimétrico. Los valores de
absorbancia de los pocillos tratados con lisado o con tampón de
lisis se midieron y la señal corregida para el fondo se representó
como una función de la concentración de NBN presente en la mezcla de
activación. La potencia de NBN pegilada en el ELISA de KIRA era 10
mM, que era indistinguible de la del material de partida de NBN NK.
No había efecto de dos ciclos de
congelación-descongelación sobre la potencia y
después de este tratamiento no había un incremento significativo en
la turbidez de la muestra, indicando que las muestras pueden
descongelarse con seguridad para el estudio. En estudios
independientes que acceden a la actividad de producto con 3 y 4 PEGs
de 10 kDa/molécula separadamente, se deter-
minó que el aducto con 3 PEGs era completamente activo, mientras que el producto de 4 PEG tenía actividad reducida.
minó que el aducto con 3 PEGs era completamente activo, mientras que el producto de 4 PEG tenía actividad reducida.
Se examinaron las propiedades farmacocinéticas
de diversos productos de NBN pegilados y no pegilados en modelos de
rata y ratón.
Los datos revelaban que la pegilación de NBN NK
de rata con 3,3 PEGs de 10000 Da daba como resultado un efecto
significativo sobre la semivida y la biodisponibilidad de la
neublastina. Después de una administración IV de 1 mg/kg en ratas
Sprague Dawley, los niveles máximos de NBN pegilada de 3000 ng/ml se
detectaban después de 7 minutos, y niveles de 700 ng/ml se
detectaban después de 24 h, 200 ng/ml después de 48 h y 100 ng/ml
después de 72 h. En contraste, para NBN no pegilada, después de una
administración IV de 1 mg/kg, se detectaban niveles de 1500 ng/ml
después de 7 minutos, pero a continuación los niveles caían
rápidamente hasta 70 ng/ml después de 3 h y no eran detectables
después de 7 h. Los efectos de la pegilación eran aún más
pronunciados en animales tratados con NBN pegilada mediante
administración subcutánea.
Después de una administración s.c. de 1 mg/kg,
los niveles en circulación de NBN pegilada alcanzaban un máximo de
200 ng/ml, después de 24 h y permanecían a este nivel a lo largo de
la duración de los tres días de estudio. En contraste, no se
observaba NBN detectable en ningún punto temporal después de la
administración de NBN no modificada.
El análisis de las muestras de NBN pegilada se
complicaban por la presencia de aductos que contenían 2, 3 y 4 PEGs
por molécula, que presentaban cada uno un perfil de PK diferente. En
estudios de PK iniciales, se usaron ratones para facilitar el
rastreo a través de una variedad de candidatos y rutas de
administración. Los estudios en ratones revelaban diferencias
drásticas en la biodisponibilidad de los candidatos. Sin embargo,
cuando el aducto de 3,3 PEGs de 10 K se evaluaba en ratas, se
encontró que estaba menos biodisponible en ratas que en ratones. La
diferencia en la biodisponibilidad era particularmente pronunciada
después de la administración i.p. Los niveles en ratones alcanzaban
1600 ng/ml después de 7 h y permanecían a 400 ng/ml después de 24 h.
En contraste, los niveles en ratas eran constantes a 100 ng/ml
durante 4-48 h.
Tanto la neublastina de rata silvestre
(wt-NBN) como neublastina con una substitución de
Asn por Lys en la posición 95 (NK-NBN) se
replegaron y se purificaron hasta >95% para pruebas de eficacia
en el modelo de neuropatía de rata diabética STZ.
Wt-NBN se formuló para ir directamente a la prueba
animal mientras que la NK-NBN se preparó para la
pegilación con PEG de 10 kDa-SPA. Para conseguir el
objetivo de repliegue y purificación, se desarrolló un método de
repliegue que utilizaba cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
que permitía la renaturalización de NBN a partir de cuerpos de
inclusión de E. coli en grandes cantidades y con altas
concentraciones. Además de SEC, se emplearon etapas de cromatografía
en columna tanto de Ni-NTA como de sílice CM para
incrementar la pureza de la proteína final. Las proteínas se
sometieron a caracterización intensiva incluyendo análisis mediante
SDS-PAGE, cromatografía de exclusión por tamaño,
ESMS, determinación de la actividad mediante ELISA de KIRA y
determinación del contenido de endotoxina. SDS-PAGE
y SEC de los productos proteínicos finales indicaban una pureza de
más de 95%. El nivel de endotoxinas de cada producto era <0,2
EU/mg. La actividad específica de ambas proteínas en el ELISA de
KIRA es aproximadamente 10 nM. Wt-NBN se formuló en
1,0 mg/ml y NK-NBN se formuló en 2,6 mg/ml en
solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 6,5. La
Wt-NBN se dividió en partes alícuotas en tubos de
15 ml y se almacenó congelada a -70ºC mientras que la
NK-NBN se sometió a pegilación antes de dividir en
partes alícuotas y congelar.
Ambas formas de NBN se expresaron en E.
coli como sus proteínas de fusión etiquetadas con His con un
sitio de segmentación de enteroquinasa inmediatamente adyacente al
inicio de la secuencia de 113 aminoácidos madura. Bacterias que
expresaban bien wt- (1,8 kg de pellas) o bien NK-NBN
(2,5 kg de pellas) se sometieron a lisis en 2 litros de PBS usando
una prensa de Gaulin. Después de la centrifugación (10.000 rpm) para
formar como pellas los cuerpos de inclusión, los sobrenadantes de
cada preparación se descartaron. Las pellas de cuerpos de inclusión
se lavaron dos veces con tampón (Tris-HCl 0,02M, pH
8,5, EDTA 0,5 mM), a continuación se lavaron dos veces con el mismo
tampón que contenía Triton X-100 (2%, v/v), seguido
por dos lavados con tampón adicionales sin detergente. Ambas pellas
se solubilizaron usando hidrocloruro de guanidina 6M, Tris 0,1M, pH
8,5, DTT 0,1M y EDTA 1 mM. Para ayudar en el procedimiento de
solubilización, cada pella se sometió a homogeneización usando un
homogeneizador Polytron seguido por remoción nocturna a temperatura
ambiente. Las proteínas solubilizadas se clarificaron mediante
centrifugación antes de la cromatografía desnaturalizante a través
de Superdex 200 (columna de 5,5 litros equilibrada con glicina
0,05M/H_{3}PO_{4}, pH 3,0 con guanidina-HCl 2M)
a 20 ml por minuto.
La NBN desnaturalizada se identificó mediante
SDS-PAGE. Las fracciones que contenían bien
Wt-NBN o bien NK-NBN se reunieron y
se concentraron hasta aproximadamente 250 ml usando un concentrador
de células removido Amicon de 2,5 litros. Después de la filtración
para retirar cualquier precipitado, la proteína concentrada se
sometió a cromatografía de dimensionamiento renaturalizante a
través de Superdex 200 equilibrada con Tris-HCl
0,1M, pH 7,8, guanidina-HCl 0,5M, glutationa
reducida 8,8 mM y glutationa oxidada 0,22 mM. La columna se
desarrolló usando guanidina-HCl 0,5M a 20 ml por
minuto. Las fracciones que contenían wt-NBN o
NK-NBN renaturalizadas se identificaron mediante
SDS-PAGE, se reunieron y se almacenaron a 4ºC hasta
que fuera necesario para la retirada de la etiqueta de His.
NBN renaturalizada se almacenó a 4ºC durante al
menos 24 horas antes de proceder a la purificación para promover la
formación de disulfuro entre los monómeros de NBN. Durante este
tiempo, se formaba un precipitado y se retiraba mediante filtración
a través de una unidad filtrante PES de 0,2 \mu. Para disminuir la
unión no específica, la solución de proteína se llevó hasta
imidazol 20 mM antes de cargar en una columna de 100 ml de
Ni-NTA (Qiagen) equilibrada con tampón de columna
(guanidina 0,5M e imidazol 20 mM) a 50 ml por minuto. Después de la
aplicación de proteína, la columna se lavó hasta la línea de base
usando el mismo tampón. La NBN se eluyó de la resina usando
aproximadamente 300 ml de tampón de elución que contenía
guanidina-HCl 0,5M e imidazol 0,4M. Después de la
elución, la NBN se dializó durante la noche (usando tubo de diálisis
de 10 kDa) a temperatura ambiente contra 10 volúmenes de HCl 5 mM.
La diálisis promueve la hidrólisis de substancias contaminantes y
disminuye las concentraciones de guanidina-HCl e
imidazol hasta 0,05M y 0,04M, respectivamente.
El día siguiente, cualquier precipitado que se
formaba durante la diálisis se retiraba mediante filtración. La
muestra de proteína se hizo NaCl 0,1M mediante la adición de una
reserva 5M para una concentración final de sal, incluyendo el
guanidina-HCl restante, de aproximadamente 150 mM.
Esta concentración se confirmó usando un medidor de conductividad.
Adicionalmente, HEPES 1M, pH 8, se añadió para una concentración
final de 25 mM. Para segmentar la etiqueta, se añadió
lisilendopeptidasa a wt-NBN y se añadió
enteroquinasa a NK-NBN, ambas en una relación de
aproximadamente 1:300 de proteasa a NBN. Se usó enteroquinasa en
lugar de lilsilendopeptidasa para NK-NBN debido a
un sitio de segmentación de proteasa adicional en la proteína mutada
en Lys95. Las muestras se removieron a temperatura ambiente durante
2 horas y las digestiones se verificaron mediante
SDS-PAGE.
NBN tratada con proteasa se aplicó a una columna
de Ni-NTA de 100 ml equilibrada con
guanidina-HCl 0,5M e imidazol 20 mM a 50 ml por
minuto. La columna se lavó hasta la línea de base con el mismo
tampón. Cualquier lavado de proteína procedente de la columna se
reunió con la proteína pasante que contenía NBN y la etiqueta de
His.
Después de la cromatografía con
Ni-NTA, la proteína se sometió inmediatamente a
purificación adicional a través de resina de sílice CM. Una columna
de sílice CM de 20 ml equilibrada con tampón de carga (fosfato 5 mM,
pH 6,5, NaCl 150 mM) se cargó con NBN a 20 ml por minuto. La
columna se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón de lavado
(fosfato 5 mM, pH 6,5, NaCl 400 mM) y la etapa proteínica se eluyó
con tampón de elución que contenía fosfato 5 mM, pH 6,5, pero con
NaCl 1M. La proteína eluida se dializó durante la noche contra el
fosfato solo para llevar la concentración de sal hasta 100 mM para
NK-NBN y 150 mM para wt-NBN. Ambas
muestras se filtraron a través de una unidad filtrante PES de 0,2
\mu, se analizaron mediante SDS-PAGE y se
almacenaron a 4ºC hasta que fueran necesarias para
caracterizaciones adicionales y/o pegilación.
Wt-NBN y NK-NBN
se sometieron a análisis del espectro UV para determinar su
absorbancia a 280. Usando una microcubeta de cuarzo y utilizando
como blanco tampón solo, 100 \mul bien de wt-NBN o
bien NK-NBN se exploraron continuamente de 230 a
330 nm usando un espectrofotómetro Beckman. Basándose en este
análisis, se determinó que la wt-NBN estaba a una
concentración de 1,1 mg/ml y la NK-NBN a 2,6 mg/ml
(a 280 nm-E^{0,1%} = 0,5 usado para cada
proteína). Se identificó menos de 1% de material precipitado
basándose en la absorbancia a 330 nm.
Para determinar la pureza de ambas preparaciones
proteínicas, cada muestra (0,5 mg) se sometió a cromatografía de
exclusión por tamaño a través de una columna 16/30 Superdex 75. La
columna se equilibró con fosfato 5 mM, pH 6,5, que contenía NaCl
400 mM y se desarrolló con un caudal de 1,5 ml por minuto. Basándose
en la absorbancia a 280 nm, tanto la wt- como la
NK-NBN migraban como un solo pico con un peso
molecular esperado (23-24 kDa) y no contenían
contaminación de proteína significativa.
Tanto la wt- como la NK-NBN se
redujeron en guanidina-HCl 2,5M, Tris 60 mM, pH 8,0,
y DTT 16 mM. Las muestras reducidas se desalaron a lo largo de una
columna C_{4} corta y se analizaron en línea mediante ESMS usando
un instrumento cuadrupolar triple. Los datos brutos de ESMS se
desconvolucionaron mediante el programa MaxEnt para generar
espectros de masas. Este procedimiento permite que señales cargadas
múltiples colapsen en un pico que se corresponde directamente con
la masa molecular en kilodaltons (kDa). El espectro de masas
desconvolucionado para wt-NBN mostraba que la
especie predominante es 12046 kDa, lo que está de acuerdo con el
peso molecular predicho de 12046,7 kDa para la forma de 113
aminoácidos de la proteína. Un componente secundario también se
observó (12063 kDa), sugiriendo la presencia de un producto de
oxidación. Se identificaron tres picos en la muestra de
NK-NBN. El componente principal mostraba una masa
molecular aparente de 11345 kDa de acuerdo con la masa predicha
para la forma de 106 aminoácidos de la proteína. Los otros dos picos
tenían masas de 11362 y 12061 kDa, sugiriendo la oxidación de
NK-NBN y la presencia de la forma de 113
aminoácidos, respectivamente.
La presencia de las formas de 106 y 113
aminoácidos en las preparaciones de NK-NBN es
atribuible a la digestión con enteroquinasa. Esta proteasa de
Biozyme es una preparación enzimática natural purificada de mucosa
intestinal de ternero y se presenta que contiene una ligera
contaminación de tripsina (0,25 ng de tripsina por \mug de
enteroquinasa). Por lo tanto, la tripsina puede estar actuando sobre
la NK-NBN en la parte carboxiterminal de Arg7 para
producir la forma de 106 aminoácidos predominante. Por otra parte,
la lisilendopeptidasa usada para segmentar wt-NBN
es una actividad de proteasa simple que actúa sobre la parte
carboxiterminal del residuo de lisina contenido dentro de la
etiqueta de His para producir la forma de NBN de 113 aminoácidos
madura. Las formas tanto de 106 como de 113 aminoácidos de NBN son
igualmente activas en todos los ensayos probados y se comportan de
forma similar en pruebas de estabilidad frente a
guanidina-HCl.
La actividad de NBN se determinó mediante su
capacidad para estimular la fosforilación de c-Ret
en células NB41A3-mRL3 usando el ELISA de KIRA
descrito en el Ejemplo 3. Ret fosforilado se detectó incubando (2
horas) el receptor capturado con anticuerpo para fosfotirosina
conjugado a HRP (4G10; 0,2 \mug por pocillo). Después de la
incubación, los pocillos se lavaron 6 veces con TBST y la actividad
de HPR se detectó a 450 nm con un ensayo colorimétrico. Los valores
de absorbancia de los pocillos tratados con lisado o con tampón de
lisis solo se midieron, se corrigieron para el fondo y los datos se
reunieron como una función de la concentración de neublastina
presente en la mezcla de activación. Los datos demuestran que la NBN
purificada daba como resultado la aparición de RET fosforilado,
indicando que la NBN purificada era activa en este ensayo.
Neublastina de rata silvestre en una
concentración de 1 mg/ml en PBS se trató con
sulfo-SMCC (Pierce) 1 mM y se desaló para retirar
el reticulador en exceso. Puesto que la proteína de NBN silvestre
contiene solo una amina simple en su extremo N y no tiene grupos
sulfhidrilo libres, se esperaba que la reacción con SMCC diera como
resultado una modificación específica para el sitio de la NBN con
SMCC ligado en su extremo N.
60 \mug del conjugado de
NBN-SMCC se incubaron con 120 \mug de albúmina de
suero bovino y se analizaron con respecto a la extensión de la
reticulación mediante SDS-PAGE. La BSA contiene un
solo grupo SH libre y por consiguiente se espera que la reacción
con el conjugado de NBN-SMCC dé como resultado la
modificación en este sitio a través de la maleimida sobre el SMCC.
Bajo estas condiciones, se observaron dos bandas adicionales de
peso molecular superior, que están de acuerdo en la masa con la
modificación de la NBN con un solo resto de BSA y con dos moléculas
de BSA ya que cada molécula de NBN contiene dos extremos N que
pueden sufrir reacción, y por consiguiente están de acuerdo con
esta noción. Simultáneamente con la formación de estas bandas, había
una disminución en la intensidad de las bandas de
NBN-SMCC y BSA. Basándose en la intensidad de la
banda de NBN restante, la reacción parecía haber llegado hasta
70-80% de terminación.
El producto monosubstituido se purificó de la
mezcla de reacción sometiendo el material a cromatografía de
intercambio catiónico y cromatografía de exclusión por tamaño en una
columna Superdex 200 (Pharmacia) esencialmente como se describe
para los estudios de pegilación analizados anteriormente. Fracciones
de columna de la filtración en gel efectuada se analizaron mediante
SDS-PAGE y las que contenían el producto
monosubstituido se analizaron con respecto al contenido de proteína
mediante absorbancia a 280 nm. Puesto que la masa de BSA es
aproximadamente dos veces la de la neublastina, la concentración
aparente se dividió por un factor de tres para dar el equivalente
de NBN. Esta fracción se sometió a análisis para la función en el
ELISA de KIRA. Los valores de IC50 para la NBN tanto silvestre como
conjugada a BSA eran 3-6 nM, indicando que la
conjugación a la BSA no había comprometido la función.
Aunque estos estudios preliminares se generaron
con BSA, las proteínas de albúmina de suero correspondientes de
ratas y seres humanos contienen un SH libre. Por consiguiente, puede
aplicarse un sistema similar para generar un conjugado de albúmina
de suero de rata-NBN de rata para realizar estudios
de PK y eficacia en ratas y albúmina de suero
humano-NBN humana para realizar pruebas clínicas. De
forma similar, el SMCC puede substituirse por cualquiera de un
número de reticuladores que contienen un grupo reactivo con amino en
un lado y un grupo reactivo con tiol en el otro lado. Ejemplos de
reticuladores reactivos con amina que insertan una maleimida
reactiva con tiol son AMAS, BMPS, MBS, EMCS, SMPB, SMPH, KMUS o
GMBS, que insertan un grupo haloacetato reactivo con tiol son SBAP,
SIA y SIAB, y los que proporcionan un tiol protegido o no protegido
para la reacción con grupos sulfhidrilo para producir una conexión
reducible son SPDP, SMPT, SATA o SATP, todos los cuales están
disponibles de Pierce. Tales reticuladores son meramente ejemplares
y se anticipan muchas estrategias alternativas para conectar el
extremo N de NBN con albúmina de suero. Un experto también podría
generar conjugados con albúmina de suero que no están orientados en
el extremo N de NBN o en el resto tiol sobre la albúmina de suero.
También se espera que sean funcionales las fusiones de
NBN-albúmina de suero creadas usando ingeniería
genética en las que la NBN está fusionada al gen de albúmina de
suero en su extremo N, extremo C o en ambos extremos.
Este método puede extenderse a través de
adaptaciones habituales a cualquier conjugado de
NBN-albúmina de suero que diera como resultado un
producto con un semivida prolongada en animales y por consiguiente
en seres humanos.
<110> Biogen, Inc.
\hskip1cmSah, Dinah W.Y.
\hskip1cmPepinsky, Blake R
\hskip1cmBorjack-Sjodin, Paula Ann
\hskip1cmMiller, Stephan S
\hskip1cmRossomando, Anthony
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<120> Conjugados Polímeros de Neublastina
y Métodos para Usar los Mismos
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<130>
00689-506-061
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<140> No Cedida Todavía
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<141>
2002-01-23
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<150> 60/266,071
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<151>
2001-02-01
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<160> 13
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<212> PRT
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Secuencia de Consenso
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<222> (3)
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<223> En donde Xaa es Gly o Thr
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<223> En donde Xaa es Pro o Arg
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<222> (5)
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<223> En donde Xaa es Gly o Ser
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<223> En donde Xaa es Ala o Thr
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<223> En donde Xaa es Ala o Thr
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido KD3-211
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido KD3-254
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido KD2-255
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido KD3-258
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido KD3-256
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido KD3-257
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\hskip1cmSah, Dinah W.Y.
\hskip1cmPepinsky, Blake R
\hskip1cmBorjack-sjodin, Paula Ann
\hskip1cmMiller, Stephan S
\hskip1cmRossomando, Anthony
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<120> Conjugados Polímeros de Neublastina
y Métodos para Usar los Mismos
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<140> No Cedida Todavía
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Artificial: Secuencia de Consenso
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Artificial: Oligonucleótido KD3-211
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido KD3-254
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<212> DNA
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido KD2-255
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido KD3-258
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido KD3-259
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido KD3-256
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<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: Oligonucleótido KD3-257
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Claims (22)
1. Un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos al menos 90% idéntica a los aminoácidos
8-113 del Nº ID SEC: 1, en donde el polipéptido
incluye un aminoácido distinto de asparagina en la posición
correspondiente a la posición 95 en el Nº ID SEC: 1, en donde el
aminoácido substituido en la posición correspondiente a la posición
95 introduce un sitio en el que un polialquilenglicol puede ligarse
al polipéptido.
2. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el aminoácido en la posición
correspondiente a la posición 95 en el Nº ID SEC: 1 es lisina.
3. El polipéptido de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, en donde el polipéptido comprende una
secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
- (a)
- aminoácidos 8-94 y 96-113 del Nº ID SEC: 2;
- (b)
- aminoácidos 8-94 y 96-113 del Nº ID SEC: 3; y
- (c)
- aminoácidos 8-94 y 96-113 del Nº ID SEC: 4.
4. El polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende los aminoácidos 1-94
y 96-113 del Nº ID SEC: 2, el Nº ID SEC: 3 o el Nº
ID SEC: 4, en donde la asparagina está substituida por lisina en la
posición 95.
5. El polipéptido de acuerdo con las
reivindicaciones 1 ó 2, en el que la secuencia de aminoácidos es al
menos 95% idéntica a los aminoácidos 8-113 del Nº
ID SEC: 1.
6. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho polipéptido,
cuando está dimerizado, se caracteriza por al menos una
actividad biológica seleccionada del grupo que consiste en:
- a.
- unión a GFR\alpha3;
- b.
- estimulación de fosforilación de la tirosina de un polipéptido de RET;
- c.
- potenciación de la supervivencia neuronal; y
- d.
- normalización de cambios patológicos en una neurona.
7. Una proteína de fusión que comprende el
polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
precedentes fusionado a un segundo resto.
8. La proteína de fusión de acuerdo con la
reivindicación 7, en la que el segundo resto es un polipéptido de
albúmina de suero humano.
9. Un ácido nucleico que codifica el polipéptido
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la
proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8.
10. Un vector que comprende el ácido nucleico de
la reivindicación 9.
11. Una célula huésped que comprende el vector
de acuerdo con la reivindicación 10.
12. La célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 11, en donde la célula huésped es una célula de
ovario de hámster chino.
13. Un método para elaborar el polipéptido de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la
proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, que
comprende
- (a)
- cultivar la célula huésped de acuerdo con las reivindicaciones 11 ó 12 bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8, y
- (b)
- recuperar dicho polipéptido o proteína de fusión.
14. Un dímero que comprende dos polipéptidos de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o dos
proteínas de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8.
15. Un conjugado que comprende el polipéptido de
acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 conjugado
a un polialquilenglicol, en donde el polialquilenglicol está
conjugado al polipéptido en el aminoácido substituido en la
posición correspondiente a la posición 95 en el Nº ID SEC: 1.
16. Un conjugado que comprende la proteína de
fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8 conjugada a un
polialquilenglicol, en donde el polialquilenglicol está conjugado a
la proteína de fusión en el aminoácido substituido en la posición
correspondiente a la posición 95 en el Nº ID SEC: 1.
17. El conjugado de acuerdo con las
reivindicaciones 15 ó 16, en el que el polialquilenglicol es
polietilenglicol.
18. El conjugado de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 15 a 17, en el que el polipéptido está
glicosilado.
19. Una composición farmacéutica que comprende
el polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6, la proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 7
u 8 o el conjugado de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 18 y un vehículo fisiológicamente
aceptable.
20. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 6, la proteína de fusión de acuerdo con
las reivindicaciones 7 u 8 o el conjugado de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, para el uso en
terapia.
21. El uso del polipéptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la proteína de fusión de
acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8 o el conjugado de acuerdo con
una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, para la preparación
de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una
enfermedad o un trastorno del sistema nervioso.
22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21,
en el que la enfermedad o el trastorno es una neuropatía periférica
o un síndrome de dolor neuropático.
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