JP4219402B2 - ヘリコバクター・ピロリによる感染の治療および診断 - Google Patents
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Description
本発明は、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）による感染（症）の予防、治療および診断に関する。
ヘリコバクター・ピロリは、最近、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌および萎縮性胃炎の原因になると報告されている（Lee、A他、1993, Infect. Immun., 61 : 1601-1610）。これに関連する臨床学上の問題は、以下のとおりである。
1.侵入性のバイオプシー（生検）を必要とせずに診断することが困難であり、そのため、血清学的テストにおいて多数の手法が試みられているが、どれが最良であるかということに関して見解は一致していない（Weiss, J.他、1994, J. Clin. Microbiol., 32 : 1663-1668）。
2.従来の抗微生物化学療法では治療が困難であり（Nagata他、1992, Infect. Immun., 60 : 4826-4831）、このため、ビスマス（Bismuth）のような抗潰瘍薬と組み合わせることが行われている（Peterson, W. L., 1991, New England J. Med., 324 : 1043-1048）。しかしながら、潰瘍は再発しがちである。
（キー抗原の１つである）ウレアーゼに対する抗体が感染のマーカーであることが示され（Nagata他、1992, Infect. Immun., 60 : 4826-4831）、ウレアーゼを接種することによりある程度の防御が得られている（Lee, A他、上述、およびBlachard, T. G.他、1995, Infect. Immun., 63 : 1394-1399）。
ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ遺伝子が単離され配列決定され（Wwiss, J.他、上述）、さらに、該遺伝子によってコードされたタンパク質の配列決定も行われたが、キーエピトープは未だ明らかにされていない。
本発明は、ヘリコバクター・ピロリからウレアーゼを検出するための作用物質（agent）、ならびに、ヘリコバクター・ピロリによる感染（症）を治療または診断するために用いられる作用物質（agents）およびエピトープを提供し、さらに、そのための診断テストおよび診断キットならびに薬剤の製造において該作用物質およびエピトープを使用することに関する。
本発明に従えば、ureA由来のＬＴＰＫＥＬＤ（SEQ ID NO:3（配列番号：３））、ならびにureB由来のＦＩＳＰ（SEQ ID NO:6（配列番号：６））、ＰＴＡＦ（SEQ ID NO:13（配列番号：13））、ＥＶＧＫＶＡ（SEQ ID NO:11（配列番号：11））およびＳＩＰから成る群より選ばれるエピトープに特異的に結合する作用物質を用いて、ヘリコバクター・ピロリからウレアーゼを検出する方法、またはヘリコバクター・ピロリによる感染を治療または診断する方法が提供される。
エピトープとは、そのアナログ（同じエピトープを発現する分子）も指称するものとする。そのような分子としては、例えば、当該エピトープのミモトープ（mimotope）（Geysen, H. M.他、1987, Journal of Immunological Methods, 102 : 259-274）が挙げられる。
作用物質としては、ウレアーゼの（触媒）活性を抑制するものが挙げられる。
作用物質としては、抗体、または抗原結合生のある断片（フラグメント）が挙げられる。
該抗体は、全抗体またはその抗原結合性フラグメントのいずれでもよく、一般に、いずれの免疫グロブリンクラスに属していてもよい。すなわち、例えば、免疫グロブリンＭ抗体または免疫グロブリンＧ抗体である。該抗体またはそのフラグメントは、例えば、動物性のもの、例えば、哺乳動物由来、例えば、マウス、ラット、ヒツジまたはヒト由来のものである。また、天然の抗体またはそのフラグメントであってもよく、さらに、所望に応じて、組換え抗体フラグメント、すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて産生された抗体または抗体フラグメントでもよい。
組換えによる抗体または抗体フラグメントとしては、（1）抗原結合性部位の少なくとも一部が異種の抗体由来のもの、例えば、１つの抗体の超可変または相補性決定領域が第２の別異の抗体の可変フレームワーク領域にグラフト結合された抗体（例えば、ヨーロッパ特許明細書第２３９４００号に記載されたもの）；（2）非Fv配列が他の異なる抗体の非Fv配列によって置換されている組換え抗体またはフラグメント（例えば、ヨーロッパ特許明細書第１７１４６９号、１７３４９４号および１９４２７６号に記載されているもの）；または（3）組換えによる抗体またはフラグメントであり実質的に天然の免疫グロブリン構造を保有しているが、ヒンジ領域はその天然免疫グロブリンに見出されるのとは異なる数のシステイン残基を有しながら、組換え抗体またはフラグメントの表面ポケットにある１つまたはそれ以上のシステイン残基が天然の免疫グロブリンに存在する他のアミノ酸残基を置換しているもの（例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ８８／００７３０およびＰＣＴ／ＧＢ８８／００７２９に記載されているもの）が挙げられる。
抗体または抗体フラグメントは、ポリクローナル源でもよくモノクローナル源でもよい。それらは、少なくとも１つのエピトープに特異性を有するものである。
抗原結合性の抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ´）2、Ｆａｂ´またはＦａｂフラグメントのような全抗体をタンパク分解酵素で切断したもの、あるいは、Fvフラグメントのような組換えＤＮＡ技術で得られたフラグメント（例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ８８／１７４７に記載されたもの）が挙げられる。
本発明に従う抗体は、感染中に発現されたタンパク質を抗原として用いる周知の免疫学的手法により調製することができる。すなわち、例えば、任意の適当なホスト（宿主）に該タンパク質を注入し、適当な精製および／または濃縮（例えば、アフィニティ媒体として固定化タンパクを用いるアフィニティクロマトグラフィによる）の後、血清を集めることにより所望のポリクローナル抗体が得られる。別の方法として、タンパク質注入ホストから脾臓細胞またはリンパ球を回収し、例えばKohler等の方法（1976, Eur. J. Immunol., 6 : 511）を用いて不死化し、得られた細胞を分離することによりモノクローナル抗体を産生する単一の遺伝子系を得ることができる。抗体フラグメントの製造には慣用技術、例えばペプシンやパパインによる酵素分解を用いることができる。本発明に従い組換え抗体を産生することが所望される場合には、例えば、ヨーロッパ特許明細書１７１４６９、１７３４９４、１９４２７６および２３９４００号に記載されている方法を用いて該抗体を産生することができる。
本発明に従う抗体は、検出可能なラベルで標識することができ、あるいはエフェクター分子（作動分子）、例えば、抗菌剤のような薬剤またはトキシンまたは酵素と結合させることもでき、本発明はそのような標識化抗体または抗体結合体も包含する。
本発明に従えば、さらに、ヘリコバクター・ピロリ感染由来のウレアーゼの診断テストが提供され、該テストは、
i）被検サンプルを本発明に従う少なくとも１つの作用物質と反応させる工程；
ii）結合反応を検出する工程；さらに
iii）該結合反応の検出結果をヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼの存在と相関させる工程；
を含む。
このテストは患者からのサンプルについてヘリコバクター・ピロリの感染を調べるのに用いることができる。この診断テストの本質は、エピトープ、すなわちウレアーゼタンパク質がホスト生体に存在しているか否かを判定することにある。該テストは、一般に、ホスト由来の体液を本発明に従う作用物質と接触させ、複合物質を検出することによって実施される。
かくして、作用物質が抗体から成る場合、ヘリコバクター・ピロリの診断テスト法は、
i）患者の血清サンプルを本発明に従う少なくとも１つの作用物質と反応させる工程；
ii）結合反応を検出する工程；さらに
iii）該結合反応の検出結果をヘリコバクター・ピロリの感染と相関させる工程；
を含む。
本発明のテストは、ureAに特異的に結合する少なくとも１つの作用物質およびureBに特異的に結合する少なくとも１つの作用物質を使用することができる。診断テストとして適当な方式は周知のものであり、例えば、間接ＥＬＩＳＡ、ラジオイムオアッセイおよびラテックス凝集アッセイが挙げられる。
さらに、本発明に従えば、本発明の診断テストを実施するためのキットが提供される。
本発明は、さらに、ヘリコバクター・ピロリによる感染を治療するための薬剤の製造に本発明の作用物質を使用することに関する。治療とは、勿論、事後的治療および／または予防を指称する。
治療のために用いられる場合、本発明の作用物質は、薬剤的に許容できる担体（キャリア）、稀釈剤および賦形剤とともに使用することができる（例えば、米国ペンシルバニア州EastonのMack出版社の「レミングトンの薬剤学と米国薬局方（Remington’s Pharmaceutical Scienses and US Pharmacopoeia（1984）参照）。
別の用途として、本発明に従う作用物質は、慣用技術を用いて、ヘリコバクター・ピロリの感染（症）治療用の活性抑制物質を得るためのスクリーニングに採用することもできる。
本発明に従えば、さらに、ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼを検出し、またはヘリコバクター・ピロリによる感染（症）を治療もしくは診断するための方法であって、ureA由来のＬＴＰＫＥＬＤ（配列番号：３）、ならびにureB由来のＦＩＳＰ（配列番号：６）、ＰＴＡＦ（配列番号：13）、ＥＶＧＫＶＡ（配列番号：11）およびＳＩＰから成る群より選ばれるエピトープに特異的に結合する作用物質を用いることから成る方法が提供される。
本発明は、別の視点として、ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼの検出方法、またはヘリコバクター・ピロリによる感染（症）の治療または診断方法において、ureA由来のＬＴＰＫＥＬＤ（配列番号：３）、ならびにureB由来のＦＩＳＰ（配列番号：６）、ＰＴＡＦ（配列番号：13）、ＥＶＧＫＶＡ（配列番号：11）およびＳＩＰから成る群より選ばれるエピトープを使用することを提供する。
これらのエピトープは、免疫原またはワクシンとして使用することができ、そして、アジバントとともに使用することができる。
本発明に従えば、さらに、ヘリコバクター感染の診断テストであって、
i）患者からの血清を本発明に従う少なくとも１つのエピトープと反応させる工程；
ii）抗体−抗原結合反応を検出する工程；さらに
iii）該抗体−抗原結合反応の検出結果をヘリコバクター・ピロリによる感染と相関させる工程、
を含む診断テストが提供される。
患者血清は、例えば、該血清のＩｇＭ画分またはＩｇＡ画分である。
該テストに用いられるエピトープとしては、ureA由来の少なくとも１つのエピトープとureB由来の少なくとも１つのエピトープとから成るものが挙げられる。
該診断テストは、例えば、ＥＬＩＳＡテスト、ラジオイムノアッセイ、またはラテックス凝集アッセイである。
本発明に従えば、本発明の診断テストを実施するためのキットも提供される。
さらに、本発明は、ヘリコバクター・ピロリによる感染（症）治療用の薬剤を製造するに当たって、本発明に従うエピトープを使用することに関する。
治療のために用いられる場合、本発明のエピトープは、薬剤的に許容できる担体（キャリア）、稀釈とともに使用することができる。
別の用途として、本発明に従うエピトープは、従来の技術を用いて、ヘリコバクター・ピロリの感染（症）治療用の活性抑制物質を得るためのスクリーニングに採用することもできる。
本発明に従えば、さらに、ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼを検出し、またはヘリコバクター・ピロリによる感染（症）を治療もしくは診断するための方法であって、ureA由来のＬＴＰＫＥＬＤ（配列番号：３）、ならびにureB由来のＦＩＳＰ（配列番号：６）、ＰＴＡＦ（配列番号：13）、ＥＶＧＫＶＡ（配列番号：11）およびＳＩＰから成る群より選ばれるエピトープを用いることから成る方法が提供される。
本明細書において検討している引用文献のそれぞれは、その全内容を参考にしているものとする。
本発明の特徴は、以下の説明および図面からさらに明らかになるであろう。図面の説明は次のとおりである。
図１は、ureAの正味のＥＬＩＳＡ示数であり、２ＳＤを用いた場合のカットオフ点より上のエピトープ（３〜９）を示すものである。カットオフ点＝平均＋２ＳＤ＝1.034。
図２は、ウレアーゼタンパク質のureBの正味のＥＬＩＳＡ示数であり、陽性患者から対照患者の平均値を差し引いたものである。カットオフ点＝平均＋２ＳＤ＝1.133。
実施例
イムノブロッティング
抗原の調製：ヘリコバクター・ピロリ菌株ＮＣＴＣ１１６３７をChocolate寒天培地（Oxoid製）上で37℃において３〜４日間、ミクロ好気性雰囲気下に培養した。細胞をハーベストし、蒸留水で３回洗浄した。4000gで10分間、遠心分離を行い、上清をすてた。得られたサンプルをXpress（スウェーデンのBrommaのＬＫＢ製）内で圧力200mPa、−20℃において３回破砕した。この破砕細胞を４℃において30分間、12,000で遠心分離した。上清を−20℃で保存した。
血清
グループ１：バイオプシーと培養、該バイオプシーに対する陽性ウレアーゼテストおよびヘリコバクター・ピロリの31または62Kda抗原に対する抗体を用いるイムノブロットでヘリコバクター・ピロリの保有が確認された患者からの血清。
グループ２：バイオプシーと培養、および該バイオプシーに対する陰性ウレアーゼテストにより陰性であった患者からの血清。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティング：
文献に詳述されている（Burnie, J. P.他、1988, J. Med. Microbiol., 27 : 153〜159）ようにイムノブロットを調製した。略述すれば、0.05Ｍのトリス／塩酸（ｐＨ6.8）に溶かしたＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）2.6%、２−メルカプトエタノール1.3%、ブロモフェノールブルー0.2%の25μｌおよび殺菌した蒸留水15μｌ中で、５分間、10μｌのヘリコバクター・ピロリ抗原を煮沸し、10％アクリロアミドゲルに入れた。これを非連続緩衝液中で４時間流した。ＬＫＢトランスブロッター（スウェーデンBrommaのＬＫＢ製）でニトロセルロース膜に転写した。該緩衝液は、メタノール20％、25ｍＭのトリスと192ｍＭのグリシン（ｐＨ8.3）を含有するものであり、転写は25℃において45分間かけて行われるようにした。また、ニトロセルロース紙は、緩衝塩溶液（saline）（塩化ナリウム0.9%、および10ｍＭトリス、ｐＨ7.4）に溶かしたウシ血清アルブミン３％中で、４℃において一晩ブロックしたものである。
次に、ウシ血清アルブミン（３％）およびTween 20（0.05%）を含有する緩衝塩溶液で10倍に稀釈した患者血清を用いて、ニトロセルロースを25℃で２時間インキュベートした。塩溶液（0.5%）およびTween 20（0.05%）中で30分間洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体（緩衝塩溶液に溶かしたウシ血清アルブミン３％で1000倍に稀釈）を用いてニトロセルロースのストリップを25℃で１時間インキュベートした。再び上述のように洗浄を行った後、660μｌのＮＢＴ（Nitro blue tetrazolium）（N,N−ジメチルホルムアミド70％に溶かしたＮＢＴ50mg/ml）および330μｌの５−ブロモ−４−クロロ−３イノソリルホスフェート（ＢＣＩＰ）（N,N−ジメチルホルムアミド70％に溶かしたＢＣＩＰ50mg/ml）から成る混合液を含有する100mlの緩衝液（100mlとトリスーＨＣｌ、ｐＨ9.5、100ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2）を用いて該膜を25℃で５〜15分間インキュベートした。水中で洗浄することにより反応を停止させた。反射デンシオメトリー（Chromoscan 3 ; Joyce Loebl）による抗体応答が50mmよりも大きいイムノブロットを陽性とした。
エピトープマッピング：
エピトープスキャンニングキット（英国CambridgeのCambridge Research Biochemicals社製）を用いて、ureAおよびureBの誘導アミノ酸配列を含む一連の互いに重複するノナペプチドを合成した。メーカーの指示どおりに実施した。ピン結合した合成ペプチドの各患者抗血清（200倍稀釈）に対する反応性を測定してＥＬＩＳＡによるＩｇＧを調べた。30分間のインキュベーション後にＡ405におけるデータを求めた。調べた血清は、ケース１〜10（グループ１）およびケース１〜５（グループ２）である。
間接ＥＬＩＳＡテスト：
エピトープマッピングにより明らかにされたエピトープのうちの２つをペプチドとして合成した。ペプチド１（LTPKELDKLM LHYAG）（配列番号：１）はureA由来であり、ペプチド２（VGSVEVGKVA DLVLW）（配列番号：２）はureB由来である。各ペプチドを50ｍＭのリン酸緩衝塩溶液（ｐＨ7.0）に溶解して10μｇ／ｍｌとした。該稀釈ペプチドの100μｌをＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに添加して、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ Tween 20（0.05％）で10分間洗浄（４回）した。各血清をスーパーカクテル〔オバルブミン10ｇ／ｌ、ウシ血清アルブミン10ｇ／ｌ、ＰＢＳ（ｐＨ7.2）中〕で200倍に稀釈し、その100μｌを３ヶのウエルに入れ、37℃で２時間インキュベートした。洗浄を繰り返し、100μｌの二次抗体〔セイヨウワサビペルオキシダーゼを結合したＩｇＭまたはＩｇＧ（Sigma製）、適当な作用倍率に稀釈したもの〕を各ウエルに添加した。これを37℃で１時間インキュベートした。洗浄後、150μｌのＡＢＴＳ〔アミノ−ジ−３−エチルベンズアゾール−６−スルホネート（Sigma製）を、0.03％過酸水素含有クエン酸緩衝液（ｐＨ4.0）に溶かして0.5ｍｇ／ｍｌとしたもの〕を添加した。30分後、Ａ405において測定した光学密度としてデータを求めた。
結果
グループ１の血清を免疫ブロッティングすることにより、それらは全て、31ＫＤａのバンドおよび62ＫＤａのバンドの一方または両方に対するＩｇＧを有していることが示された。グループ２においては、患者の１人が31ＫＤａに対する抗体、また、４人が62ＫＤａに対する抗体を有していた。この事実および通常のテストの結果に基づき、10ヶの血清（患者１〜10、表１）を全ての判定基準による陽性とし、５ヶの血清を全ての判定基準による陰性とした（患者１〜５、表２）。
これらについてureAおよびureBに対するエピトープスキャンニングを行うと、ＥＬＩＳＡの示数（読み）は、陰性血清については、0.240から0.527の範囲で変化し、また、陽性血清については、0.491から2.654の範囲で変化した。全ての陰性血清の平均示数を全ての陽性血清の平均示数から差し引くことにより正味のＥＬＩＳＡ示数を求めた。この正味のＥＬＩＳＡ示数は、陽性と対照との間に明らかに差異が存するようなタンパク質領域を示すことになる（表１および表２）。
各サブユニットについてカットオフ点を算出した。これは、（ureAに対する陰性患者については0.830、また、ureBに対する陰性患者については0.929という値を差し引いた）正味のＥＬＩＳＡ示数の全部の値についての平均値に１標準偏差を加えることによって求めた。また、エピトープは、少なくとも３ヶのアミノ酸且つ多くても９ヶのアミノ酸に相当する長さを有するものとして求めた。ureAは４ヶのエピトープを有し、ureBは11ヶのエピトープを有した（表３）。平均値に２標準偏差を加えたものをカットオフ点として計算を繰り返した場合、エピトープ１（ureA）およびエピトープ５、６、12および15（ureB）は依然として残存していた。
エピトープ１を表すものとしてペプチド１を合成し、エピトープ12を表すものとしてペプチド２を合成した。当初の血清およびその他の症例について間接ＥＬＩＳＡにより、それらのペプチドを評価した（表１および表２）。グループ１は活性なヘリコバクター・ピロリ感染を示し、グループ２は対照患者を示すものとし、また、光学密度の好適なカットオフが0.6であるとすれば、ペプチド１またはペプチド２のいずれかに対するＩｇＭの検出は高い特異性を有していたが感度は低かった（表３）。陰性患者および陽性患者のいずれにおいてもＩｇＧの出現の方が多かった。最も効率的なテスト（69.6％）は、該ペプチドの一方または両方に対するＩｇＭの検出であった。
配列表
（1）一般情報：
（i）出願人：
（A）名称：ザ ビクトリア ユニヴァーシティ オブ マンチェスター（The Victoria University of Manchester）
（B）ストリート：オックスフォード ロード（Oxford Road）
（C）シティ：マンチェスター（Manchester）
（D）国名：イギリス国
（F）郵便番号（ＺＩＰ）：エム１３ ９ピーティー（Ｍ１３ ９ＰＴ）
（ii）発明の名称：ヘリコバクター・ピロリによる感染の治療および診断（Treatment and Diagnosis of Infections due to Helicobacter pylori）
（iii）配列の数：１３
（iv）コンピュータ読み取り形態
（A）媒体：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウェア：PatentIn リリース＃1.0、バージョン＃1.30（EPO）
（vi）先出願データ
（A）出願番号：ＧＢ 9524934.8
（B）出願日：1995年12月６日
（1）配列番号：１（SEQ ID NO:1）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：１
（2）配列番号：２（SEQ ID NO:2）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：２
（3）配列番号：３（SEQ ID NO:3）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：３
（4）配列番号：４（SEQ ID NO:4）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：４
（5）配列番号：５（SEQ ID NO:5）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：５
（6）配列番号：６（SEQ ID NO:6）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：６
（7）配列番号：７（SEQ ID NO:7）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：７
（8）配列番号：８（SEQ ID NO:8）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：８
（9）配列番号：９（SEQ ID NO:9）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：９
（10）配列番号：10（SEQ ID NO:10）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：８アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：10
（11）配列番号：11（SEQ ID NO:11）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：11
（12）配列番号：12（SEQ ID NO:12）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：12
（13）配列番号：13（SEQ ID NO:13）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：12
ヘリコバクター・ピロリは、最近、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌および萎縮性胃炎の原因になると報告されている（Lee、A他、1993, Infect. Immun., 61 : 1601-1610）。これに関連する臨床学上の問題は、以下のとおりである。
1.侵入性のバイオプシー（生検）を必要とせずに診断することが困難であり、そのため、血清学的テストにおいて多数の手法が試みられているが、どれが最良であるかということに関して見解は一致していない（Weiss, J.他、1994, J. Clin. Microbiol., 32 : 1663-1668）。
2.従来の抗微生物化学療法では治療が困難であり（Nagata他、1992, Infect. Immun., 60 : 4826-4831）、このため、ビスマス（Bismuth）のような抗潰瘍薬と組み合わせることが行われている（Peterson, W. L., 1991, New England J. Med., 324 : 1043-1048）。しかしながら、潰瘍は再発しがちである。
（キー抗原の１つである）ウレアーゼに対する抗体が感染のマーカーであることが示され（Nagata他、1992, Infect. Immun., 60 : 4826-4831）、ウレアーゼを接種することによりある程度の防御が得られている（Lee, A他、上述、およびBlachard, T. G.他、1995, Infect. Immun., 63 : 1394-1399）。
ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ遺伝子が単離され配列決定され（Wwiss, J.他、上述）、さらに、該遺伝子によってコードされたタンパク質の配列決定も行われたが、キーエピトープは未だ明らかにされていない。
本発明は、ヘリコバクター・ピロリからウレアーゼを検出するための作用物質（agent）、ならびに、ヘリコバクター・ピロリによる感染（症）を治療または診断するために用いられる作用物質（agents）およびエピトープを提供し、さらに、そのための診断テストおよび診断キットならびに薬剤の製造において該作用物質およびエピトープを使用することに関する。
本発明に従えば、ureA由来のＬＴＰＫＥＬＤ（SEQ ID NO:3（配列番号：３））、ならびにureB由来のＦＩＳＰ（SEQ ID NO:6（配列番号：６））、ＰＴＡＦ（SEQ ID NO:13（配列番号：13））、ＥＶＧＫＶＡ（SEQ ID NO:11（配列番号：11））およびＳＩＰから成る群より選ばれるエピトープに特異的に結合する作用物質を用いて、ヘリコバクター・ピロリからウレアーゼを検出する方法、またはヘリコバクター・ピロリによる感染を治療または診断する方法が提供される。
エピトープとは、そのアナログ（同じエピトープを発現する分子）も指称するものとする。そのような分子としては、例えば、当該エピトープのミモトープ（mimotope）（Geysen, H. M.他、1987, Journal of Immunological Methods, 102 : 259-274）が挙げられる。
作用物質としては、ウレアーゼの（触媒）活性を抑制するものが挙げられる。
作用物質としては、抗体、または抗原結合生のある断片（フラグメント）が挙げられる。
該抗体は、全抗体またはその抗原結合性フラグメントのいずれでもよく、一般に、いずれの免疫グロブリンクラスに属していてもよい。すなわち、例えば、免疫グロブリンＭ抗体または免疫グロブリンＧ抗体である。該抗体またはそのフラグメントは、例えば、動物性のもの、例えば、哺乳動物由来、例えば、マウス、ラット、ヒツジまたはヒト由来のものである。また、天然の抗体またはそのフラグメントであってもよく、さらに、所望に応じて、組換え抗体フラグメント、すなわち、組換えＤＮＡ技術を用いて産生された抗体または抗体フラグメントでもよい。
組換えによる抗体または抗体フラグメントとしては、（1）抗原結合性部位の少なくとも一部が異種の抗体由来のもの、例えば、１つの抗体の超可変または相補性決定領域が第２の別異の抗体の可変フレームワーク領域にグラフト結合された抗体（例えば、ヨーロッパ特許明細書第２３９４００号に記載されたもの）；（2）非Fv配列が他の異なる抗体の非Fv配列によって置換されている組換え抗体またはフラグメント（例えば、ヨーロッパ特許明細書第１７１４６９号、１７３４９４号および１９４２７６号に記載されているもの）；または（3）組換えによる抗体またはフラグメントであり実質的に天然の免疫グロブリン構造を保有しているが、ヒンジ領域はその天然免疫グロブリンに見出されるのとは異なる数のシステイン残基を有しながら、組換え抗体またはフラグメントの表面ポケットにある１つまたはそれ以上のシステイン残基が天然の免疫グロブリンに存在する他のアミノ酸残基を置換しているもの（例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ８８／００７３０およびＰＣＴ／ＧＢ８８／００７２９に記載されているもの）が挙げられる。
抗体または抗体フラグメントは、ポリクローナル源でもよくモノクローナル源でもよい。それらは、少なくとも１つのエピトープに特異性を有するものである。
抗原結合性の抗体フラグメントとしては、例えば、Ｆ（ａｂ´）2、Ｆａｂ´またはＦａｂフラグメントのような全抗体をタンパク分解酵素で切断したもの、あるいは、Fvフラグメントのような組換えＤＮＡ技術で得られたフラグメント（例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ８８／１７４７に記載されたもの）が挙げられる。
本発明に従う抗体は、感染中に発現されたタンパク質を抗原として用いる周知の免疫学的手法により調製することができる。すなわち、例えば、任意の適当なホスト（宿主）に該タンパク質を注入し、適当な精製および／または濃縮（例えば、アフィニティ媒体として固定化タンパクを用いるアフィニティクロマトグラフィによる）の後、血清を集めることにより所望のポリクローナル抗体が得られる。別の方法として、タンパク質注入ホストから脾臓細胞またはリンパ球を回収し、例えばKohler等の方法（1976, Eur. J. Immunol., 6 : 511）を用いて不死化し、得られた細胞を分離することによりモノクローナル抗体を産生する単一の遺伝子系を得ることができる。抗体フラグメントの製造には慣用技術、例えばペプシンやパパインによる酵素分解を用いることができる。本発明に従い組換え抗体を産生することが所望される場合には、例えば、ヨーロッパ特許明細書１７１４６９、１７３４９４、１９４２７６および２３９４００号に記載されている方法を用いて該抗体を産生することができる。
本発明に従う抗体は、検出可能なラベルで標識することができ、あるいはエフェクター分子（作動分子）、例えば、抗菌剤のような薬剤またはトキシンまたは酵素と結合させることもでき、本発明はそのような標識化抗体または抗体結合体も包含する。
本発明に従えば、さらに、ヘリコバクター・ピロリ感染由来のウレアーゼの診断テストが提供され、該テストは、
i）被検サンプルを本発明に従う少なくとも１つの作用物質と反応させる工程；
ii）結合反応を検出する工程；さらに
iii）該結合反応の検出結果をヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼの存在と相関させる工程；
を含む。
このテストは患者からのサンプルについてヘリコバクター・ピロリの感染を調べるのに用いることができる。この診断テストの本質は、エピトープ、すなわちウレアーゼタンパク質がホスト生体に存在しているか否かを判定することにある。該テストは、一般に、ホスト由来の体液を本発明に従う作用物質と接触させ、複合物質を検出することによって実施される。
かくして、作用物質が抗体から成る場合、ヘリコバクター・ピロリの診断テスト法は、
i）患者の血清サンプルを本発明に従う少なくとも１つの作用物質と反応させる工程；
ii）結合反応を検出する工程；さらに
iii）該結合反応の検出結果をヘリコバクター・ピロリの感染と相関させる工程；
を含む。
本発明のテストは、ureAに特異的に結合する少なくとも１つの作用物質およびureBに特異的に結合する少なくとも１つの作用物質を使用することができる。診断テストとして適当な方式は周知のものであり、例えば、間接ＥＬＩＳＡ、ラジオイムオアッセイおよびラテックス凝集アッセイが挙げられる。
さらに、本発明に従えば、本発明の診断テストを実施するためのキットが提供される。
本発明は、さらに、ヘリコバクター・ピロリによる感染を治療するための薬剤の製造に本発明の作用物質を使用することに関する。治療とは、勿論、事後的治療および／または予防を指称する。
治療のために用いられる場合、本発明の作用物質は、薬剤的に許容できる担体（キャリア）、稀釈剤および賦形剤とともに使用することができる（例えば、米国ペンシルバニア州EastonのMack出版社の「レミングトンの薬剤学と米国薬局方（Remington’s Pharmaceutical Scienses and US Pharmacopoeia（1984）参照）。
別の用途として、本発明に従う作用物質は、慣用技術を用いて、ヘリコバクター・ピロリの感染（症）治療用の活性抑制物質を得るためのスクリーニングに採用することもできる。
本発明に従えば、さらに、ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼを検出し、またはヘリコバクター・ピロリによる感染（症）を治療もしくは診断するための方法であって、ureA由来のＬＴＰＫＥＬＤ（配列番号：３）、ならびにureB由来のＦＩＳＰ（配列番号：６）、ＰＴＡＦ（配列番号：13）、ＥＶＧＫＶＡ（配列番号：11）およびＳＩＰから成る群より選ばれるエピトープに特異的に結合する作用物質を用いることから成る方法が提供される。
本発明は、別の視点として、ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼの検出方法、またはヘリコバクター・ピロリによる感染（症）の治療または診断方法において、ureA由来のＬＴＰＫＥＬＤ（配列番号：３）、ならびにureB由来のＦＩＳＰ（配列番号：６）、ＰＴＡＦ（配列番号：13）、ＥＶＧＫＶＡ（配列番号：11）およびＳＩＰから成る群より選ばれるエピトープを使用することを提供する。
これらのエピトープは、免疫原またはワクシンとして使用することができ、そして、アジバントとともに使用することができる。
本発明に従えば、さらに、ヘリコバクター感染の診断テストであって、
i）患者からの血清を本発明に従う少なくとも１つのエピトープと反応させる工程；
ii）抗体−抗原結合反応を検出する工程；さらに
iii）該抗体−抗原結合反応の検出結果をヘリコバクター・ピロリによる感染と相関させる工程、
を含む診断テストが提供される。
患者血清は、例えば、該血清のＩｇＭ画分またはＩｇＡ画分である。
該テストに用いられるエピトープとしては、ureA由来の少なくとも１つのエピトープとureB由来の少なくとも１つのエピトープとから成るものが挙げられる。
該診断テストは、例えば、ＥＬＩＳＡテスト、ラジオイムノアッセイ、またはラテックス凝集アッセイである。
本発明に従えば、本発明の診断テストを実施するためのキットも提供される。
さらに、本発明は、ヘリコバクター・ピロリによる感染（症）治療用の薬剤を製造するに当たって、本発明に従うエピトープを使用することに関する。
治療のために用いられる場合、本発明のエピトープは、薬剤的に許容できる担体（キャリア）、稀釈とともに使用することができる。
別の用途として、本発明に従うエピトープは、従来の技術を用いて、ヘリコバクター・ピロリの感染（症）治療用の活性抑制物質を得るためのスクリーニングに採用することもできる。
本発明に従えば、さらに、ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼを検出し、またはヘリコバクター・ピロリによる感染（症）を治療もしくは診断するための方法であって、ureA由来のＬＴＰＫＥＬＤ（配列番号：３）、ならびにureB由来のＦＩＳＰ（配列番号：６）、ＰＴＡＦ（配列番号：13）、ＥＶＧＫＶＡ（配列番号：11）およびＳＩＰから成る群より選ばれるエピトープを用いることから成る方法が提供される。
本明細書において検討している引用文献のそれぞれは、その全内容を参考にしているものとする。
本発明の特徴は、以下の説明および図面からさらに明らかになるであろう。図面の説明は次のとおりである。
図１は、ureAの正味のＥＬＩＳＡ示数であり、２ＳＤを用いた場合のカットオフ点より上のエピトープ（３〜９）を示すものである。カットオフ点＝平均＋２ＳＤ＝1.034。
図２は、ウレアーゼタンパク質のureBの正味のＥＬＩＳＡ示数であり、陽性患者から対照患者の平均値を差し引いたものである。カットオフ点＝平均＋２ＳＤ＝1.133。
実施例
イムノブロッティング
抗原の調製：ヘリコバクター・ピロリ菌株ＮＣＴＣ１１６３７をChocolate寒天培地（Oxoid製）上で37℃において３〜４日間、ミクロ好気性雰囲気下に培養した。細胞をハーベストし、蒸留水で３回洗浄した。4000gで10分間、遠心分離を行い、上清をすてた。得られたサンプルをXpress（スウェーデンのBrommaのＬＫＢ製）内で圧力200mPa、−20℃において３回破砕した。この破砕細胞を４℃において30分間、12,000で遠心分離した。上清を−20℃で保存した。
血清
グループ１：バイオプシーと培養、該バイオプシーに対する陽性ウレアーゼテストおよびヘリコバクター・ピロリの31または62Kda抗原に対する抗体を用いるイムノブロットでヘリコバクター・ピロリの保有が確認された患者からの血清。
グループ２：バイオプシーと培養、および該バイオプシーに対する陰性ウレアーゼテストにより陰性であった患者からの血清。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティング：
文献に詳述されている（Burnie, J. P.他、1988, J. Med. Microbiol., 27 : 153〜159）ようにイムノブロットを調製した。略述すれば、0.05Ｍのトリス／塩酸（ｐＨ6.8）に溶かしたＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）2.6%、２−メルカプトエタノール1.3%、ブロモフェノールブルー0.2%の25μｌおよび殺菌した蒸留水15μｌ中で、５分間、10μｌのヘリコバクター・ピロリ抗原を煮沸し、10％アクリロアミドゲルに入れた。これを非連続緩衝液中で４時間流した。ＬＫＢトランスブロッター（スウェーデンBrommaのＬＫＢ製）でニトロセルロース膜に転写した。該緩衝液は、メタノール20％、25ｍＭのトリスと192ｍＭのグリシン（ｐＨ8.3）を含有するものであり、転写は25℃において45分間かけて行われるようにした。また、ニトロセルロース紙は、緩衝塩溶液（saline）（塩化ナリウム0.9%、および10ｍＭトリス、ｐＨ7.4）に溶かしたウシ血清アルブミン３％中で、４℃において一晩ブロックしたものである。
次に、ウシ血清アルブミン（３％）およびTween 20（0.05%）を含有する緩衝塩溶液で10倍に稀釈した患者血清を用いて、ニトロセルロースを25℃で２時間インキュベートした。塩溶液（0.5%）およびTween 20（0.05%）中で30分間洗浄した後、アルカリホスファターゼ結合ヒツジ抗ヒトＩｇＧ抗体（緩衝塩溶液に溶かしたウシ血清アルブミン３％で1000倍に稀釈）を用いてニトロセルロースのストリップを25℃で１時間インキュベートした。再び上述のように洗浄を行った後、660μｌのＮＢＴ（Nitro blue tetrazolium）（N,N−ジメチルホルムアミド70％に溶かしたＮＢＴ50mg/ml）および330μｌの５−ブロモ−４−クロロ−３イノソリルホスフェート（ＢＣＩＰ）（N,N−ジメチルホルムアミド70％に溶かしたＢＣＩＰ50mg/ml）から成る混合液を含有する100mlの緩衝液（100mlとトリスーＨＣｌ、ｐＨ9.5、100ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2）を用いて該膜を25℃で５〜15分間インキュベートした。水中で洗浄することにより反応を停止させた。反射デンシオメトリー（Chromoscan 3 ; Joyce Loebl）による抗体応答が50mmよりも大きいイムノブロットを陽性とした。
エピトープマッピング：
エピトープスキャンニングキット（英国CambridgeのCambridge Research Biochemicals社製）を用いて、ureAおよびureBの誘導アミノ酸配列を含む一連の互いに重複するノナペプチドを合成した。メーカーの指示どおりに実施した。ピン結合した合成ペプチドの各患者抗血清（200倍稀釈）に対する反応性を測定してＥＬＩＳＡによるＩｇＧを調べた。30分間のインキュベーション後にＡ405におけるデータを求めた。調べた血清は、ケース１〜10（グループ１）およびケース１〜５（グループ２）である。
間接ＥＬＩＳＡテスト：
エピトープマッピングにより明らかにされたエピトープのうちの２つをペプチドとして合成した。ペプチド１（LTPKELDKLM LHYAG）（配列番号：１）はureA由来であり、ペプチド２（VGSVEVGKVA DLVLW）（配列番号：２）はureB由来である。各ペプチドを50ｍＭのリン酸緩衝塩溶液（ｐＨ7.0）に溶解して10μｇ／ｍｌとした。該稀釈ペプチドの100μｌをＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに添加して、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ Tween 20（0.05％）で10分間洗浄（４回）した。各血清をスーパーカクテル〔オバルブミン10ｇ／ｌ、ウシ血清アルブミン10ｇ／ｌ、ＰＢＳ（ｐＨ7.2）中〕で200倍に稀釈し、その100μｌを３ヶのウエルに入れ、37℃で２時間インキュベートした。洗浄を繰り返し、100μｌの二次抗体〔セイヨウワサビペルオキシダーゼを結合したＩｇＭまたはＩｇＧ（Sigma製）、適当な作用倍率に稀釈したもの〕を各ウエルに添加した。これを37℃で１時間インキュベートした。洗浄後、150μｌのＡＢＴＳ〔アミノ−ジ−３−エチルベンズアゾール−６−スルホネート（Sigma製）を、0.03％過酸水素含有クエン酸緩衝液（ｐＨ4.0）に溶かして0.5ｍｇ／ｍｌとしたもの〕を添加した。30分後、Ａ405において測定した光学密度としてデータを求めた。
結果
グループ１の血清を免疫ブロッティングすることにより、それらは全て、31ＫＤａのバンドおよび62ＫＤａのバンドの一方または両方に対するＩｇＧを有していることが示された。グループ２においては、患者の１人が31ＫＤａに対する抗体、また、４人が62ＫＤａに対する抗体を有していた。この事実および通常のテストの結果に基づき、10ヶの血清（患者１〜10、表１）を全ての判定基準による陽性とし、５ヶの血清を全ての判定基準による陰性とした（患者１〜５、表２）。
これらについてureAおよびureBに対するエピトープスキャンニングを行うと、ＥＬＩＳＡの示数（読み）は、陰性血清については、0.240から0.527の範囲で変化し、また、陽性血清については、0.491から2.654の範囲で変化した。全ての陰性血清の平均示数を全ての陽性血清の平均示数から差し引くことにより正味のＥＬＩＳＡ示数を求めた。この正味のＥＬＩＳＡ示数は、陽性と対照との間に明らかに差異が存するようなタンパク質領域を示すことになる（表１および表２）。
各サブユニットについてカットオフ点を算出した。これは、（ureAに対する陰性患者については0.830、また、ureBに対する陰性患者については0.929という値を差し引いた）正味のＥＬＩＳＡ示数の全部の値についての平均値に１標準偏差を加えることによって求めた。また、エピトープは、少なくとも３ヶのアミノ酸且つ多くても９ヶのアミノ酸に相当する長さを有するものとして求めた。ureAは４ヶのエピトープを有し、ureBは11ヶのエピトープを有した（表３）。平均値に２標準偏差を加えたものをカットオフ点として計算を繰り返した場合、エピトープ１（ureA）およびエピトープ５、６、12および15（ureB）は依然として残存していた。
エピトープ１を表すものとしてペプチド１を合成し、エピトープ12を表すものとしてペプチド２を合成した。当初の血清およびその他の症例について間接ＥＬＩＳＡにより、それらのペプチドを評価した（表１および表２）。グループ１は活性なヘリコバクター・ピロリ感染を示し、グループ２は対照患者を示すものとし、また、光学密度の好適なカットオフが0.6であるとすれば、ペプチド１またはペプチド２のいずれかに対するＩｇＭの検出は高い特異性を有していたが感度は低かった（表３）。陰性患者および陽性患者のいずれにおいてもＩｇＧの出現の方が多かった。最も効率的なテスト（69.6％）は、該ペプチドの一方または両方に対するＩｇＭの検出であった。
（1）一般情報：
（i）出願人：
（A）名称：ザ ビクトリア ユニヴァーシティ オブ マンチェスター（The Victoria University of Manchester）
（B）ストリート：オックスフォード ロード（Oxford Road）
（C）シティ：マンチェスター（Manchester）
（D）国名：イギリス国
（F）郵便番号（ＺＩＰ）：エム１３ ９ピーティー（Ｍ１３ ９ＰＴ）
（ii）発明の名称：ヘリコバクター・ピロリによる感染の治療および診断（Treatment and Diagnosis of Infections due to Helicobacter pylori）
（iii）配列の数：１３
（iv）コンピュータ読み取り形態
（A）媒体：フロッピーディスク
（B）コンピュータ：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル
（C）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ
（D）ソフトウェア：PatentIn リリース＃1.0、バージョン＃1.30（EPO）
（vi）先出願データ
（A）出願番号：ＧＢ 9524934.8
（B）出願日：1995年12月６日
（1）配列番号：１（SEQ ID NO:1）に関する情報
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：１
（i）配列の特徴：
（A）長さ：１５アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：２
（i）配列の特徴：
（A）長さ：７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：３
（i）配列の特徴：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：４
（i）配列の特徴：
（A）長さ：７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：５
（i）配列の特徴：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：６
（i）配列の特徴：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：７
（i）配列の特徴：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：８
（i）配列の特徴：
（A）長さ：７アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：９
（i）配列の特徴：
（A）長さ：８アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：10
（i）配列の特徴：
（A）長さ：６アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：11
（i）配列の特徴：
（A）長さ：９アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：12
（i）配列の特徴：
（A）長さ：４アミノ酸
（B）型：アミノ酸
（C）鎖の数：
（D）トポロジー：不明
（xi）配列の記述：配列番号：12
Claims (14)
- ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼの検出方法、またはヘリコバクター・ピロリによる感染のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける検出方法における、ｕｒｅＡ由来のＬＴＰＫＥＬＤ（配列番号：３）、ならびにｕｒｅＢ由来のＦＩＳＰ（配列番号：６）、ＰＴＡＦ（配列番号：１３）、ＥＶＧＫＶＡ（配列番号：１１）およびＳＩＰから成る群より選ばれるエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントの使用方法。
- 抗体またはその抗原結合性フラグメントがウレアーゼの活性を抑制することを特徴とする請求項１に記載の方法。
- ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼの検出方法であって、ｉ）被検サンプルを請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントと反応させる工程；
ii）結合反応を検出する工程；さらにiii）該結合反応の検出結果をヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼの存在と相関させる工程；
を含むことを特徴とする方法。 - ヘリコバクター・ピロリ感染を調べるためのものであり、サンプルが患者からの血清であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
- 抗体またはその抗原結合性フラグメントが、ｕｒｅＡに特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合性フラグメントおよびｕｒｅＢに特異的に結合する少なくとも１つの抗体またはその抗原結合性フラグメントから成ることを特徴とする請求項３または４に記載の方法。
- 間接ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイおよびラテックス凝集アッセイから成る群より選ばれることを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の方法。
- 請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合性フラグメントの少なくとも１つを含む、請求項３〜６のいずれかに記載の検出方法を実施するためのキット。
- ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼを検出するための方法であって、ｕｒｅＡ由来のＬＴＰＫＥＬＤ（配列番号：３）、ならびにｕｒｅＢ由来のＦＩＳＰ（配列番号：６）、ＰＴＡＦ（配列番号：１３）、ＥＶＧＫＶＡ（配列番号：１１）およびＳＩＰから成る群より選ばれるエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを用いることを特徴とする方法。
- ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼの検出方法、またはヘリコバクター・ピロリによる感染のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける検出方法における、ｕｒｅＡ由来のＬＴＰＫＥＬＤ（配列番号：３）、ならびにｕｒｅＢ由来のＦＩＳＰ（配列番号：６）、ＰＴＡＦ（配列番号：１３）、ＥＶＧＫＶＡ（配列番号：１１）およびＳＩＰから成る群より選ばれるエピトープの使用方法。
- ヘリコバクター・ピロリ感染の検出方法であって、ｉ）患者からの血清を請求項９に記載の少なくとも１つのエピトープと反応させる工程；
ii）抗体−抗原結合反応を検出する工程；さらにiii）該抗体−抗原結合反応の検出結果をヘリコバクター・ピロリによる感染と相関させる工程、を含むことを特徴とする方法。 - 患者血清が、患者血清のＩｇＭまたはＩｇＡ画分を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
- エピトープが、ｕｒｅＡ由来の少なくとも１つのエピトープとｕｒｅＢ由来の少なくとも１つのエピトープを含むことを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
- 請求項９に記載のエピトープを含む請求項１０〜１２のいずれかに記載の検出方法を実施するためのキット。
- ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼを検出し、またはヘリコバクター・ピロリによる感染をｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて検出するための方法であって、ｕｒｅＡ由来のＬＴＰＫＥＬＤ（配列番号：３）、ならびにｕｒｅＢ由来のＦＩＳＰ（配列番号：６）、ＰＴＡＦ（配列番号：１３）、ＥＶＧＫＶＡ（配列番号：１１）およびＳＩＰから成る群より選ばれるエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメントを用いることを特徴とする方法。
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