DE10032538A1

DE10032538A1 - Vakzine gegen Helicobacter pylori

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Publication number: DE10032538A1
Application number: DE10032538A
Authority: DE
Inventors: Anton Aebischer; Dirk Bumann; Bernadette Lucas; Thomas F Meyer
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften
Priority date: 2000-07-05
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2002-01-17
Also published as: WO2002002141A2; WO2002002141A3; EP1299117A2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs insbesondere gegen Helicobacter pylori auf Basis von T-Zell-stimulierenden Peptidsequenzen sowie durch das Verfahren identifizierte T-Zellepitope auf H. pylori-Antigenen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs insbesondere gegen Helicobacter pylori auf Basis von T-Zell-stimulierenden Peptidsequenzen sowie durch das Verfahren identifizierte T-Zellepitope, insbesondere auf H. pylori-Antigenen.

Es ist bekannt, dass eine Impfung gegen H. pylori einer Induktion spezifischer MHC Klasse II-restringierter T-Zellen bedarf (zelluläre Antwort des Immunsystems). Die Induktion erfolgt durch Antigen-präsentierende Zellen, die MHC Klasse II-Moleküle auf der Oberfläche exprimieren. Die T-Zellen erkennen über ihren spezifischen T-Zellrezeptor das von dem MHC- Molekül gebundene Epitop. Natürlicherweise kommt die Bindung des Epitops an MHC-Moleküle wie folgt zustande: Das Antigen wird von der Antigen präsentierenden Zelle phagozytiert und im Phagosom prozessiert (d. h. in Oligopeptide gespalten). Die Oligopeptide binden an die MHC-Moleküle und die Komplexe werden an die Zelloberfläche transportiert. Jede Antigen präsentierende Zelle exprimiert einen Typ von MHC-Molekülen mit besonderer Spezifität. Es können nur diejenigen prozessierten Oligopeptide binden (d. h. Epitope), die der Spezifität dieses MHC-Typs entsprechen.

Es ist ferner bekannt, welche Aminosäuresequenzen in der Lage sind, als T-Zell-Epitope zu fungieren. Diese Informationen sind in Form von Datenbanken zugänglich. Es handelt sich um Sequenzen von 15 bis 20 Aminosäuren. Hierbei ist jedoch nicht die vollständige Sequenz entscheidend. Für die Bindung an ein gegebenes MHC-Allel sind bestimmte Aminosäuren an definierten Positionen entscheidend, die als Ankerreste bezeichnet werden. Die Ankerreste liegen innerhalb der Bindungsstelle des MHC. Die zwischenliegenden Aminosäuren tragen wenig zur Bindung an das MHC-Molekül bei, sind aber entscheidend für die Struktur, die vom T- Zellrezeptor erkannt wird. Es können also T-Zellen von sehr unterschiedlicher Spezifität induziert werden durch Oligopeptide, deren Ankersequenzen übereinstimmen, deren restliche Sequenz aber unterschiedlich ist. Generell lässt sich sagen, dass die MHC-Moleküle eine geringere Spezifität aufweisen als die T-Zellrezeptoren. Funktionelle Epitope im Kontext einer Vakzine gegen H. pylori müssen also von möglichst vielen MHC-Molekülen gebunden und von entsprechend restingierten T-Zellen erkannt werden können, sowie möglichst spezifisch für den Erreger sein.

Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung einer Untereinheitenvakzine gegen Helicobacter gehen von einer Applikation eines protektiven Antigens aus, z. B. eines Virulenzfaktors, entweder als rekombinantes Protein oder über einen lebenden Träger, der den Virulenzfaktor vorzugsweise auf der Oberfläche exprimiert oder sezerniert. Ein solcher Impfstoff erlaubt keine gezielte Auswahl der Epitope, die nach erfolgter Impfung von T-Zellen erkannt werden. Die Zahl der Epitope einschränken zu können, ist wünschenswert, um ein erhöhtes Maß an Impfverträglichkeit zu erreichen, indem beispielsweise Epitope ausgeschlossen werden, die möglicherweise eine Kreuzreaktion gegen organismuseigene Proteine hervorrufen.

Es wurde ein Verfahren entwickelt, das die Identifizierung potentieller Epitope in antigenen Proteinen von z. B. Helicobacter pylori, den Ausschluss möglicher kreuzreaktiver Epitope durch Sequenzabgleich mit humanen Proteinen oder Proteinen anderer Organismen, den Test der ausgewählten Epitope in vitro oder/und im Tiermodell und die Formulierung erfolgreich getesteter Epitope in einer Vakzine erlaubt. Außerdem wird es auf Basis der Vorhersage möglich, künstliche, d. h. nicht in der Natur vorkommende Epitope zu generieren und zu testen, die zu einer stärkeren Immunisierung als natürliche Epitope führen und damit einen besseren Impfschutz gewähren.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs auf Basis T-Zell-stimulierender Peptidsequenzen, umfassend die Schritte:

a) Identifizieren von möglichen T-Zell-reaktiven Epitopen in einem Zielprotein, die an einen vorbestimmten Typ von MHC-Molekülen binden,
b) Ausschließen von kreuzreaktiven Epitopen, und
c) Verifizieren der MHC-bindenden Epitope durch Bestimmen der Wirksamkeit in vitro oder/und in vivo.

Der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff kann eine erhöhte Immunoreaktivität oder alternativ eine erhöhte Immunotoleranz bewirken. Die Art der Immunreaktion hängt von dem verwendeten MHC-bindenden Epitop und der Verabreichungsart ab. Zum Beispiel kann eine orale Verabreichung der immunogenen Epitopsequenz ohne ein Adjuvans die orale Toleranz erhöhen. Im Gegensatz dazu kann eine orale Verabreichung zusammen mit einem Adjuvans zu einer erhöhten Immunogenität führen.

Das T-Zell-reaktive Epitop wird bevorzugt von einem Pathogen oder einem Tumor abgeleitet. Pathogen-assoziierte Epitope stammen insbesondere von einem Virus, einem Bakterium oder einem Protozoon. Solche Epitope können insbesondere zur Erhöhung der Immunität herangezogen werden. Es ist erfindungsgemäß aber auch möglich, die Epitopsequenz von einem mit einer Autoimmunerkrankung verbundenen Polypeptid abzuleiten. Daraus hergestellte Impfstoffe können insbesondere zur Erhöhung der Toleranz verwendet werden.

Besonders bevorzugt wird ein Impfstoff gegen Helicobacter pylori hergestellt, wobei in Schritt (a) mögliche MHC-bindende und T-Zell-reaktive Epitope in einem Helicobacter-Protein identifiziert werden.

Die Zielproteine, die zur Vorauswahl möglicher T-Zell-reaktiver Epitope verwendet werden können, sind bevorzugt Proteine, die aus Pathogenen stammen oder/und mit Tumoren oder Autoimmunerkrankungen assoziiert sind und insbesondere beliebige Helicobacter-Proteine, wie sie sich beispielsweise aus den bereits sequenzierten Genomen der Helicobacter pylori-Stämme 26695 und J99 ergeben (Tomb et al., Nature 388 (1997), 539-547 und Alm et al., Nature 397 (1999), 176-180). Vorzugsweise werden die Epitope aus Pathogenitäts- und Virulenzfaktoren, wie etwa Urease A (HP0073; Nomenklatur nach Tomb et al., supra), Urease B (HP0072), Cag26 (HP0547), VacA (HP0887), Cag8 (HP0528), Katalase (HP0857), SodB (HP0389), HpaA (HP0410), GroES (HP0011), HP0231 und HP1098 ausgewählt.

Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Identifizierung möglicher T-Zell-reaktiver Epitope aus einer bekannten Peptidsequenz, die an einen vorbestimmten Typ von MHC-Molekülen, insbesondere MHC Klasse II-Molekülen binden und von T-Zellen erkannt werden können. Hierzu werden ausgehend von experimentellen Daten Sequenzeigenschaften ermittelt, die typisch für T-Zellepitope sind, die an das vorbestimmte MHC- Molekül binden. Mit Hilfe dieser Sequenzeigenschaften wird die bekannte Peptidsequenz auf mögliche T-Zellepitope abgesucht. Die experimentell identifizierten T-Zellepitope werden vorzugsweise aus allgemein zugänglichen Sammlungen, z. B. der Epitopdatenbank MHCPEP (Brusic et al., Nucleic Acids Res. 26 (1998), 368-371) oder SYFPEITHI (H.-G. Rammensee, Universität Tübingen, http: / / www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/database.html) entnommen. Überlappende und redundante Epitope werden nur einmal berücksichtigt. Die Peptidsequenzen der einzelnen Epitope werden als N-terminaler Ankerrest ausgerichtet (Position 1), vorzugsweise anhand einer großen hydrophoben Seitenkette (Abb. 1a-c). Die Sequenzeigenschaften der ausgerichteten Epitope werden in einer Matrix zusammengefasst, die für jede Epitop-Position angibt, wie häufig eine bestimmte Aminosäure vorkommt. Es werden Matrizen für vorzugsweise 15 bis 19 Aminosäuren lange Epitope, besonders bevorzugt über 16 bis 18 und am meisten bevorzugt für 17 Aminosäuren lange Epitope aufgestellt. Der Beginn der Peptidsequenz wird vorzugsweise bei Position -3 oder -4, insbesondere bei Position -3 bezüglich des N-terminalen Ankerrestes ausgerichtet, da zusätzlich zu den 9 Kernpositionen eines Epitopes auch die jeweils benachbarten 4 Aminosäuren die Prozessierung und Präsentation beinflussen können.

Um mögliche T-Zellepitope aus einer bekannten Sequenz eines Proteins vorherzusagen, wird die Sequenz nach Bereichen abgesucht, die besonders gut mit den in der Matrix zusammengefassten Sequenzeigenschaften für ein vorbestimmtes MHC-Molekül, z. B. MHC Klasse II HLA-DR1 übereinstimmen. Hierzu kann z. B. der Algorithmus von Davenport et al. (Immunogenetics 42 (1995), 392-397) benutzt werden. Der Algorithmus von Davenport et al. zeichnet sich durch die Vorhersage der Wahrscheinlichkeit aus, dass eine gegebene Sequenz natürlicherweise prozessiert und präsentiert wird.

Die Häufung vorhergesagter Epitope in bestimmten Sequenzabschnitten der entsprechenden Proteine wird vorzugsweise zur Einschränkung der Epitopanzahl verwendet. Besonders gute Ergebnisse werden mit 17 Aminosäuren langen Matrizen erhalten, die sowohl individuell gute Übereinstimmungen mit Datenbankepitopen besitzen als auch in Bereichen mit hoher Epitophäufigkeit liegen. Vorzugsweise erfolgt das Einschränken der Epitope nach Meister et al. (Vaccine 13 (1995), 581-591) beschrieben. Hierzu wird die Häufung von wahrscheinlichen Epitopen innerhalb von bis zu fünfzig Startpositionen entlang der Aminosäuresequenz ermittelt und graphisch aufgetragen.

Die Erstellung der Matrix erfolgt vorzugsweise für MHC Klasse II-bindende Epitope, beispielsweise für Epitope, die an murine oder humane MHC Klasse II-Moleküle binden. Beispiele für murine MHC Klasse II-Moleküle sind H-2^d und I-A^b, Beispiele für humane MHC Klasse II-Moleküle sind HLA-DR1, DR2- 18, DR-51-53 und DQ1-9.

Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das Ausschließen von kreuzreaktiven Epitopen, vorzugsweise von Epitopen, die eine vollständige Identität oder eine Ähnlichkeit (Identität auf Aminosäureebene ≧ 80%, vorzugsweise ≧ 90%) mit Epitopen in Proteinen anderer Organismen, insbesondere in Säugerproteinen und am meisten bevorzugt in menschlichen Proteinen aufweisen. Hierzu werden die vorausgewählten Epitope gegen Sequenzen anderer Organismen, die in allgemein zugänglichen Datenbanken, wie etwa Genbank, SwissProt etc., enthalten sind, abgeglichen. Epitope, die eine hohe Ähnlichkeit zu solchen Sequenzen besitzen, werden ausgeschlossen.

Schritt (c) des Verfahrens umfasst die Verifizierung der vorausgewählten theoretisch vorhergesagten Epitope in vitro oder/und in vivo, insbesondere im Tiermodell. Hierbei werden die Epitope vorzugsweise auf ihre Fähigkeit getestet, solche T-Zellen zu aktivieren, die normalerweise nur durch prozessiertes natives Protein aktiviert werden können bzw. die spezifisch für das Protein sind, aus dem das Epitop abgeleitet ist. In diesem Schritt können auch gegenüber den natürlichen Sequenzen modifizierte, d. h. im ursprünglichen Protein nicht vorkommende Epitope getestet werden, wobei vorzugsweise Epitope mit einer Identität von mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90% auf Aminosäureebene gegenüber der natürlichen Sequenz eingesetzt werden.

Die ausgewählten Epitope eines Proteins können als Oligopeptide mit einer Länge von vorzugsweise 10-25 Aminosäuren nach bekannten Methoden (z. B. Merrifield-Synthese) synthetisiert und anschließend zur Verifizierung ihrer Wirksamkeit verwendet werden. Hierzu können proteinspezifische T- Zelllinien erzeugt werden, die natürlich prozessierte Oligopeptide auf dem entsprechenden MHC Klasse II-Allel erkennen. Diese T-Zelllinien können beispielsweise aus transgenen Mäusen gewonnen werden, die ein entsprechendes menschliches MHC Klasse II-Molekül sowie das humane CD4-Molekül exprimieren (Taneja und David, J. Clin. Invest. 101 (1998), 921-926) und gegen das entsprechende Protein immunisiert wurden. Diese Mäuse erlauben Tests humaner Epitope unabhängig von Humanversuchen. Ein entsprechendes Verfahren kann angewendet werden, um Epitope zu identifizieren, die im Mausmodell wirksam sind.

Anschließend können die spezifischen T-Zelllinien in vitro mit den verschiedenen synthetischen Peptiden stimuliert werden, um funktionelle Epitope zu identifizieren. Funktionelle Epitope führen zur Aktivierung dieser T-Zellen, die in der Folge proliferieren bzw. Lymphokine sezernieren.

In einer zweiten Stufe des Verfizierungsschritts (c) wird vorzugsweise das Epitop verwendet, um epitopspezifische T-Zellen zu erzeugen. Dann wird getestet, ob diese T-Zellen auch durch solche Antigen präsentierenden Zellen stimuliert werden können, die das Protein, aus dem das Epitop abgeleitet wurde, prozessieren, z. B. aus einem Helicobacter- Antigengemisch, z. B. infolge einer Helicobacter-Infektion.

Weiterhin können funktionell aktive Epitope in einem entsprechenden Tiermodell, z. B. in einer gegebenenfalls transgenen Maus, auf ihre Impfeigenschaft geprüft werden. Die Verabreichung der Epitope kann in Form von synthetischen Oligopeptiden, gegebenenfalls in derivatisierter Form, z. B. als Lipopeptide, oder in Kombination mit Adjuvanzien, wie etwa Choleratoxin oder Al₂O₃, gekoppelt an einen Träger, z. B. ein Protein, oder in Form von Salmonellen, die entsprechende Fusionsproteine rekombinant, z. B. mit dem Autotransportersystem AIDA (z. B. WO97/35022) exprimieren, erfolgen. Vorzugsweise werden die Versuchstiere zuerst immunisiert und dann mit Helicobacter infiziert. Die protektive Wirksamkeit der Impfung wird durch das Ausmaß bestimmt, mit dem z. B. eine Besiedelung des Magens der Versuchstiere durch Helicobacter verhindert wird.

Alternativ oder zusätzlich können Epitope in einem in vitro-System, welches das menschliche Immunsystem nachstellt, auf ihre Eigenschaft zur Stimulierung humaner T-Zellen untersucht werden. Dazu werden dendritische Zellen aus dem Blut von Spendern ausdifferenziert, die dieselben MHC Klasse II-Allele besitzen, die in den transgenen Mäusen exprimiert worden sind. Diese dendritischen Zellen sind in vivo für die Aufnahme von Antigenen verantwortlich, prozessieren diese und rufen eine T-Zellaktivierung hervor. Kultivierte dendritische Zellen werden mit den selektionierten Epitopen inkubiert, wobei diese aufgenommen werden und als MHC-Epitopkomplexe an der Oberfläche der dendritischen Zellen präsentiert werden. So beladene dendritische Zellen werden benutzt, um T-Zellen aus dem Blut desselben Spenders in vitro zu stimulieren. Der Grad der Stimulation wird als zusätzlicher Parameter genützt, um die besten Epitope für einen humanen Impfstoff zu identifizieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann weiterhin das Formulieren der als wirksam identifizierten Epitope oder davon abgeleiteter Sequenzen zusammen mit einem geeigneten Träger sowie gegebenenfalls Hilfs- und Zusatzstoffen in eine pharmazeutische Zubereitung umfassen. Die pharmazeutische Zubereitung kann ein injizierbares oder auf andere Weise verabreichbares, z. B. orales oder transdermales Präparat sein. Die Epitope können in Form von Oligopeptiden, z. B. in derivatisierter oder trägergekoppelter Form, als Bestandteil von Fusionsproteinen gegebenenfalls in einem Lebendvakzin, z. B. einem attenuierten Bakterium wie etwa Salmonella, oder als DNA-Vakzine verabreicht werden. Die Verabreichung kann entsprechend Standardprotokollen erfolgen. Die Dosierung hängt im Einzelfall von der jeweiligen Art des Impfstoffs und der Verabreichung ab. Beispielsweise sind Dosierungen geeignet, die der Menge von 100 µg-1,5 mg Peptid entsprechen. Vorzugsweise erfolgt eine mehrfache Verabreichung des Impfstoffes, z. B. in Intervallen von 2-8 Wochen.

Ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein Impfstoff insbesondere gegen Helicobacter-Infektionen auf Basis von T-Zell-stimulierenden Peptidsequenzen, der durch das Verfahren wie zuvor beschrieben erhalten wurde. Beispiele für solche Impfstoffe, deren Wirksamkeit bereits experimentell verifiziert wurde, sind Peptide aus den Bereichen der Aminosäuren 28 bis 44, 32 bis 48, 35 bis 51, 74 bis 90 und 209 bis 295 von Urease A.

Die erfindungsgemäßen Peptid-Impfstoffe können als einzelne Peptidsequenzen verabreicht werden. Alternativ können auch Peptidgemische verabreicht werden. Diese Peptidgemische können verschiedene Epitope eines Proteins, Epitope aus verschiedenen Proteinen oder/und gleiche Epitope aus einem Protein, aber aus verschiedenen Stämmen, insbesondere aus verschiedenen Helicobacter-Stämmen, umfassen.

Weiterhin wird die Erfindung durch die nachfolgenden Figuren und Beispiele erläutert. Es zeigen:

Abb. 1 Matrizen mit der Länge von 17 Aminosäuren (d. h. für jede der 17 Positionen entlang der T-Zellepitope ist die Häufigkeit der 20 verschiedenen Aminosäuren angegeben) zur Vorhersage von MHC-spezifischen T-Zell-reaktiven Epitopen.

a) Matrix für H-2d (I-A^d und I-E^d) (Mausstamm Balb/c) aus 79 natürlichen Epitopen der Brusic-Datenbank
b) Matrix für I-A^b (Mausstamm C57/B6) aus 37 natürlichen Epitopen der Brusic-Datenbank
c) Matrix für HLA-DR1 (human) aus 26 natürlichen Epitopen der Brusic-Datenbank
d) Matrix für HLA-DR4 (human) aus 41 natürlichen Epitopen der Brusic-Datenbank bzw. der Datenbank von H.-G. Rammensee

Abb. 2 die Vorhersagen von T Helferzell-Epitopen
Vorhersagen von T Helferzell-Epitopen für die MHCII-Gene H-2^d und I-A^b (Maus) sowie HLA-DR1 (Mensch) aus folgenden H. pylori Proteinen: Ovalbumin (a), Urease A (b), Urease B (c), HP0231 (d), HP0410 (e), HP1098 (f). Als Beispiel für die Aussagekraft des Verfahrens wird auch die Vorhersage von H-2^d Epitopen aus Ovalbumin (f) gezeigt. Abb. 2 zeigt die Vorhersagen für die genannten Helicobacter-Proteine für das menschliche HLA-DR4.

Für jede Sequenz und jedes MHCII-Allel wurden für alle Positionen entlang der jeweiligen Sequenz ein Immunogenitätswert ermittelt, der angibt, wie gut das jeweilige 17mer voraussichtlich T Helferzellen aktivieren kann. Dieser Immunogenitätswert wurde mit Hilfe eines Programmes von Davenport et al. (1995) für jede Position entlang der Sequenz als die Übereinstimmung der jeweiligen Matrix (siehe Abb. 1) berechnet. Ein Epitop wurde als "wahrscheinlich" bezeichnet, wenn es zu den 20% der Epitope gehört, die die größte Ähnlichkeit zu den empirischen Aminosäuremustern aufweisen, bezogen auf die Gesamtheit aller theoretisch möglichen Epitope des Proteins. Der dargestellte Immunogenitätswert ist der Anteil wahrscheinlicher Epitope (17mere) innerhalb der folgenden 49 (Abb. 2a, c und g ureB), 21 (Abb. 2b und g ureA) bzw. 29(Abb. 2d-f, g HP0231, g HP0410 und g HP 1098) Startpositionen.

Das Beispiel Ovalbumin zeigt, dass auf diese Weise ein bekanntes H- 2^d-restringiertes Epitop (As323-339, durch Pfeil markiert) erfolgreich in einem besonders immunogenen Proteinbereich vorhergesagt werden kann.

Für Proteine mit Signalpeptiden sollten die N-terminalen Regionen mit dem jeweiligen Signalpeptid nicht berücksichtigt werden, da diese Sequenzen in vivo vermutlich abgespalten und schnell abgebaut werden.

Abb. 3 den Vergleich von Urease A-Sequenzen unterschiedlicher Herkunft (N- und C-Termini fehlen jeweils)
PA4: Sequenz aus www.TIGR.org (Herkunft: USA)
pYZ97: Sequenz aus Salmonella Expressionsplasmid (Herkunft: Frankreich)
P76: challenge Stamm für die Maus (Herkunft: Niederlande)
TA2: challenge Stamm für Gerbil (Herkunft: Japan)
P92: challenge Stamme für die Maus (Herkunft: Australien)

Abb. 4 die Identifizierung von funktionellen Urease-A Epitopen mittels spezifischer CD4⁺ T-Zellen.
Urase A-spezifische T-Zellen wurden mit den angegebenen Peptiden von Urease A in Gegenwart von syngenen Milzzellen stimuliert. Die Peptide wurden in Konzentrationen von 10 µg/ml, 1 µg/ml, 0,1 µg/ml und 0,01 µg/ml eingesetzt (schwarz bis weisse Schattierung). T-Zellstimulierung wurde indirekt über die Bestimmung von freigesetztem IFN-y gemessen. Als Negativkontrolle wurden die Zellen in Gegenwart von Milzzellen nur in Medium kultiviert. Restimulierung durch Zugabe eines Urease A enthaltenden Lysats von H. pylori Stamm Hp49 wurde als Positivkontrolle eingesetzt.

Abb. 5 Peptid-immunisierte Mäuse zeigen eine erniedrigte Besiedlung mit H. pylori
BALB/c Mäuse wurden mit 120 µmol PAM-3CSS gekoppeltem Peptid intranasal immunisiert. Die Tiere wurden nach 10 Tagen mit mausadaptiertem H. pylori Hp76 infiziert und nach weiteren fünf Wochen wurde die H. pylori Last im Magen mittels spezifischer Anzucht bestimmt.

Beispiele Beispiel 1 Vorhersage von T-Zell-Epitopen von H, pylori Urease A (Stamm 26695, TIGR), die von MHC Klasse II lad-Molekülen der Maus präsentiert werden

Anhand der öffentlich zugänglichen Epitop-Datenbank MHCPEP von Brusic et al. (1998), supra wurden für Balb/c-Mäuse mit dem Haplotyp H-2^d alle bekannten MHC Klasse II-Epitope identifiziert, die spezifische T-Zellen aktivieren können. Redundante und überlappende Epitope wurden nicht berücksichtigt. Insgesamt wurden 79 unabhängige Epitope identifiziert.

Die erhaltenen Epitope wurden anhand der ersten Anker-Position 1 mit einer großen, hydrophoben Aminosäure I, L, V, F, Y oder W ausgerichtet. Die effiziente Prozessierung MHC II-restringierter Epitope in Endosomen hängt von den 3-4 N-terminalen Aminosäuren ab. Deshalb wurden zusätzlich zum bindenden 9mer auch die jeweils 4 benachbarten Aminosäuren berücksichtigt (ergibt zusammen ein 17mer). Für die Positionen -3 bis 14 wurde für jede Aminosäure die absolute Häufigkeit ermittelt, mit der sie in den Epitopen an der jeweiligen Position vorkommt. Es wurde die Matrix in Abb. 1a erhalten (Häufigkeit jeder Aminosäure von Position -3 bis 14 in aktiven T-Zell-Epitopen).

Die erhaltene Matrix wurde mit einem Programm von Davenport et al. (1995), supra auf die Sequenz von Urease A aus Helicobacter pylori angewendet und potentielle T-Zell-Epitope aufgrund ihrer Ähnlichkeit zu den empirischen Aminosäure-Mustern identifiziert. Eine graphische Auftragung der bis zu fünfzig 17mere mit den höchsten Übereinstimmungen zu Epitopen aus der Datenbank ergab eine Häufung in bestimmten Sequenzregionen (um Aminosäure 30, Aminosäure 100, Aminosäure 190; siehe Abb. 2b).

Wirklich erkannte Epitope liegen besonders häufig in Sequenzregionen mit hoher Dichte von vorhergesagten Epitopen. Deshalb wurden 17mere, die sowohl individuelle gute Übereinstimmungen mit den Datenbank-Epitopen besaßen als auch in Bereichen mit hoher Epitophäufigkeit lagen, ausgewählt und entsprechende Peptide synthetisiert. Folgende zehn Oligopeptide wurden synthetisiert:

Die Abb. 1b und 1c zeigen Matrizen für I-A^b (z. B. Mausstamm C57/B6) und HLA-DR1 (human), mit denen Vorhersagen für Urease A und B und Ovalbumin als Kontrolle gerechnet wurden (Abb. 2a, b und c). Die Sequenzen von Urease A sind in den verschiedenen H.pylori-Stämmen hoch konserviert, sodass die Vorhersagen auch für andere Isolate als 26695 gelten (siehe Abb. 3).

Zusätzlich zu Urease A und Urease B wurden stark exprimierte Oberflächen- Proteine ausgewählt. Zur Auswahl dieser Proteine wurden lebende H. pylori mit membranimpermeablem Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoat markiert. Kurz zusammengefasst wurden die markierten Zellen gewaschen und durch Behandlung mit der French press aufgebrochen. Die Gesamtmembranfraktion wurde mit Zwittergent 3-14 solubilisiert und über eine Affinitätschromatographie mit einer Biotin reversibel bindenden Avidin- Agarose aufgereinigt. Die erhaltenen biotinylierten Oberflächenproteine wurden über zweidimensionale Gelelektrophorese getrennt und anhand von MALDI-MS-Fingerprints tryptische Fragmente identifiziert. Drei der identifizierten Proteine (HP0231, HP0410, HP1098) wurden laut Proteinfärbung des gesamten Proteoms von H. pylori relativ stark im Vergleich zu anderen Proteinen exprimiert (Abb. 2d-f).

Beispiel 2 Gewinnung einer protektiven, H. pylori Urease A-spezifischen Helfer-T- Zelllinie (zur ersten Stufe des funktionellen Screeings)

BALB/c-Mäuse wurden mit rekombinanten, Urease A/B exprimierenden Salmonellen (Gomez-Duarte et al., Vaccine 16 (1998) 460) immunisiert. Helfer T-Zellen wurden 6 Wochen nach Immunisierung aus den Milzen dieser Tiere gewonnen und mit einem Lysat von H. pylori in vitro restimuliert in Gegenwart von syngenen Milzzellen als Antigen-präsentierende Zellen. Die Antigen-Spezifität der stimulierten T-Zellen wurde mit SDS-PAGE gereinigter Urease A, rekombinanter Urease B, Lysaten von Urease A/B positiven oder negativen H. pylori Stämmen bestimmt. Die gewonnenen T-Zellen reagierten ausschließlich mit den Urease A enthaltenden Antigenpräparationen. Adoptive Transferexperimente zeigten, dass diese T-Zelllinie vor einer Infektion mit H. pylori schützt. Dazu wurden 4 × 10⁶ T-Zellen in native BALB/c-Mäuse injiziert und die Tiere am Tag danach mit 10⁹ CFU des Streptomycin-resistenten Helicobacter pylori-Stammes Hp76 infiziert. Kontrolltiere wurden ebenfalls mit derselben Dosis infiziert. Nach fünf Wochen wurden die Tiere getötet und die Mägen präpariert. Eine Magenhälfte wurde für die Bestimmung der Urease-Aktivität in 500 ml Harnstoffpuffer (330 mM Harnstoff, 350 µM Na₂HPO₄, 650 mM KH₂PO₄, 0,001% (w/v) Phenolrot, pH 6,9) für 4 h bei Raumtemperatur inkubiert. Der Farbumschlag von Phenolrot wurde dann bei 560 nm gemessen. Die andere Magenhälfte wurde gewogen, homogenisiert und die Keimdichte durch Ausplattieren des Homogenats auf Helicobacter-Agarplatten in Gegenwart von 400 mg/ml Streptomcycin bei unter mikroaeroben Bedingungen bestimmt. Die Urease-Aktivität (OD_560nm) lag bei:

Die entsprechenden Keimzahlen lagen bei:

Dies entspricht im Mittel einer Protektion von 77%. Das bedeutet, dass die Urease A abgeleitete T-Zelle protektive Wirkung hat und T-Zell-Epitope, die von dieser Linie erkannt werden, potentiell protektiv sein müssen.

Beispiel 3 Epitop-Screening mit Hilfe der Urease A-spezifischen T-Zelllinie (zur ersten Stufe des funktionellen Screenings)

Die in Beispiel 2 gewonnene T-Zelllinie sezerniert Interferon-y (IFN-y), wenn sie antigen-spezifisch stimuliert wird. Interferon-y Sekretion nach in vitro Stimulierung der T-Zellen (10⁵ pro Ansatz) mit den synthetischen Peptiden in Gegenwart von 2,5 × 10⁵ syngenen Milzzellen als Antigen-präsentierende Zellen wurde als Maß für die Funktionalität der Oligopeptide gewählt. Die Peptide wurden dazu in vier verschiedene Konzentrationen (10 µg/ml, 1 µg/ml, 0,1 µg/ml, 0,01 µg/ml) eingesetzt. Die Ansätze wurden in 200 ml T-Zellmedium (Aebischer et al., Int. Immunol. 6 (1994), 1535-1543) stimuliert und die Kulturüberstände nach 24 Stunden Inkubation bei 37°C abgenommen. Die Interferon-y Sekretion in die Kulturüberstände wurde mittels eines Bioassays (nach Aebischer et al., 1994) bestimmt.

Abb. 4 zeigt, dass fünf von den vorhergesagten und ausgewählten Epitopen funktionell sind und von den T-Zellen erkannt werden. Es handelt sich dabei um folgende Peptide:

Das Experiment zeigt, dass 50% der synthetisierten Oligopeptide erkannt werden und funktionelle Epitope beinhalten.

Beispiel 4 Protektive Immunisierung von BALB/c-Mäusen mit synthetischen Epitopen (zur zweiten Stufe des funktionellen Screenings)

Ausgehend von den Peptiden, die durch Urease A-spezifische, protektive T-Helfer-Zelllinie erkannt werden, wurde ein Lipopeptid synthetisiert, das die Aminosäuren 28-52 der Urease umfasst und an N-Palmitoyl-S-[2,3- bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-(R)-cysteinyl-serylserin (P3CSS) gekoppelt (Deres et al., Nature 342 (1989), 561-564). BALB/c-Mäuse wurden mit 120 pmol des Lipopeptids intranasal immunisiert, da Vorversuche gezeigt hatten, dass diese Applikation am wirksamsten ist. Diese Tiere und Kontrolltiere (nur mit PBS behandelt) wurden 10 Tage später mit H. pylori P76 infiziert. Nach weiteren fünf Wochen wurden die Tiere getötet und die Kolonisierung mittels Kultur und Urease-Test wie oben beschrieben analysiert. Die Keimzahl in den immunisierten Tieren war im Mittel von 44.000 ± 22.000 (SEM) auf 22.000 ± 12.000 (SEM) CFU reduziert. Die Resultate weisen auf eine Wirksamkeit einer Peptid-Vakzinierung hin (Abb. 5).

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs auf Basis von T-Zell stimulierenden Peptidsequenzen umfassend die Schritte:

a) Identifizieren von möglichen MHC-bindenden und T-Zell reaktiven Epitopen in einem Zielprotein,
b) Ausschließen von kreuzreaktiven Epitopen, und
c) Verifizieren der nach Schritt (b) verbleibenden Epitope durch Bestimmen der Wirksamkeit in vitro oder/und in vivo.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Impfstoff gegen Helicobacter-Infektionen herstellt und in Schritt (a) mögliche MHC-bindende und T-Zell-reaktive Epitope in einem Helicobacter-Protein identifiziert.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass Epitope aus Pathogenitäts- und Virulenzfaktoren von Pathogenen, insbesondere von Helicobacter ausgewählt werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Epitope aus den Helicobacter-Proteinen Urease A, Urease B, Cag26, VacA, Cag8, Katalase, SodB, HpaA, GroES, HP0231 und HP1098 ausgewählt werden.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Identifizieren in Schritt (a) umfasst:
Erstellen einer Matrix für Oligopeptide, die von definierten Allelen von MHC Klasse II-Molekülen erkannt werden, und Abgleichen der Matrix mit der Aminosäuresequenz eines Zielproteins.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Abgleichen mittels eines Algorithmus erfolgt, umfassend die Berechnung der Wahrscheinlichkeit, dass eine gegebene Sequenz natürlicherweise prozessiert und präsentiert wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix eine Länge von 15 bis 19 Aminosäuren aufweist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Matrix eine Länge von 16 bis 18 Aminosäuren aufweist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass Matrix eine Länge von 17 Aminosäuren aufweist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Identifizieren in Schritt (a) weiterhin umfasst:
Einschränken der vorausgewählten Epitope auf Epitope in Sequenzabschnitten, in denen gehäuft Epitope auftreten.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass MHC Klasse II-bindende Epitope ausgewählt werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, dass Epitope ausgewählt werden, die an humane oder murine MHC Klasse II-Moleküle binden.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (b) das Abgleichen der in Schritt (a) identifizierten Epitope mit Sequenzen anderer Organismen umfasst.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (b) das Abgleichen mit humanen Sequenzen umfasst.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (b) kreuzreaktive Epitope ausgeschlossen werden, die eine Identität von mindestens 80% bezüglich einer durch den Abgleich identifizierten Sequenz besitzen.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (c) das Bestimmen der Fähigkeit der Epitope oder davon abgeleiteter Sequenzen zur Stimulation von T-Zellen umfasst, die spezifisch für das Protein sind, aus dem das Epitop abgeleitet ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die T-Zellen aus transgenen Mäusen stammen, die ein humanes MHC Klasse II-Molekül und ein humanes CD4 Molekül exprimieren.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (c) das Erzeugen von epitopspezifischen T-Zellen und das Testen dieser T-Zellen auf ihre Stimulierbarkeit durch Antigen präsentierende Zellen, die das Protein, aus dem das Epitop abgeleitet ist, prozessieren, umfasst.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Erzeugen von epitopspezifischen T-Zellen durch Verabreichung der Epitope oder davon abgeleiteter Sequenzen an Versuchstiere erfolgt.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (c) das Testen der Epitope oder davon abgeleiteter Sequenzen auf ihre Fähigkeit zur Stimulierung von T-Zellen in einem in vitro-System umfasst.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend das Formulieren der als wirksam identifizierten Epitope oder davon abgeleiteter Sequenzen zusammen mit einem geeigneten Träger sowie gegebenenfalls Hilfs- und Zusatzstoffen in eine pharmazeutische Zubereitung.

22. Impfstoff auf Basis von T-Zell-stimulierenden Peptidsequenzen, erhalten durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20.

23. Impfstoff nach Anspruch 22 gegen Helicobacter-Infektionen.

24. Impfstoff auf Basis von T-Zell-stimulierenden Peptidsequenzen, erhältlich durch

a) Identifizieren von möglichen MHC-bindenden und T-Zell reaktiven Epitopen in einem Zielprotein durch Abgleich der Proteinsequenz mit einer 17 Aminosäuren langen Oligopeptidmatrix,
b) Ausschließen von kreuzreaktiven Sequenzen, die eine Identität von mindestens 80% bezüglich einer humanen Sequenz besitzen und
c) Verifizieren der nach Schritt (b) verbleibenden Epitope durch Bestimmung ihrer Fähigkeit oder der Fähigkeit davon abgeleiteter Sequenzen (i) zur Stimulation von T-Zellen, die spezifisch für das Protein sind, aus dem das Epitop abgeleitet ist, oder/und (ii) zur Erzeugung von epitopspezifischen T- Zellen, die durch Antigen-präsentierende Zellen stimulierbar sind, die das Protein, aus dem das Epitop abgeleitet ist, prozessieren.

25. Impfstoff nach Anspruch 24 gegen Helicobacter-Infektionen, wobei in Schritt (a) ein Helicobacter-Protein als Zielprotein eingesetzt wird.

26. Impfstoff gegen Helicobacter-Infektionen auf Basis von T-Zell stimulierenden Peptidsequenzen, ausgewählt aus Peptiden aus den Bereichen der Aminosäuren 28 bis 44, 32 bis 48, 35 bis 51, 74 bis 90 und 209 bis 225 von Urease A.