JP4170542B2 - 高度不飽和脂肪酸誘導体の製造方法及び高純度エイコサペンタエン酸誘導体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、炭素数が同一で二重結合数が異なる高度不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む混合物を原料として用い、移動相に超臨界二酸化炭素、固定相にシリカゲルを用いた超臨界クロマトグラフィーによる分離精製を効率良く行うことができる、高度不飽和脂肪酸誘導体の製造方法及びこの方法により得られる高純度エイコサペンタエン酸誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、エイコサペンタエン酸誘導体の各種の生理活性が検討されている。この際、炭素数が同一で二重結合数が異なるアラキドン酸誘導体が共存すると、拮抗作用することが知られており、エイコサペンタエン酸誘導体の効果を発揮させる際にはアラキドン酸誘導体が少ない高純度のエイコサペンタエン酸誘導体が求められている。
【０００３】
一方、従来より、通常のガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーなどでは炭素数が同一で二重結合数の異なる不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルが分離し難いことが知られている。
不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルの超臨界クロマトグラフィーによる分離技術としては、以下に示す(1)〜(6)等が知られている。
(1)特開平６−２５６９４号公報には、アミノプロピル基あるいはシアノプロピル基をコートしたシリカゲルを固定相として用い、不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルの分離を行う技術が開示されている。
この方法では、予めシリカゲル担体を被覆する処理が必要となり費用面あるいは工程付加面で不利である。また、この方法により製造された製品を食品や医薬関係に使用する場合には被覆剤の剥離による混入の可能性があり好ましくない。更に、不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルを含んだ混合物をヘキサンで希釈して導入することが必要であり、工業生産においてコストの上昇を招く。更にまた、炭素数が同一で二重結合数のみ異なるアラキドン酸エステルとエイコサペンタエン酸エステルとの分離に関しては具体的な例示がなく、不純成分の除去に関しても充分な検討がなされていない。
(2)J.Chromatography 第648巻 451〜457頁（1993年）には、固定相にシリカゲルとアミノプロピル基で被覆されたシリカゲルとを用いて、魚油由来の高度不飽和脂肪酸のメチルエステルを分離する方法が報告されている。
しかし、この報告においては、アラキドン酸メチルとエイコサペンタエン酸メチルとの分離は示されておらず、同一炭素数で二重結合数の異なる試料の分離に関して具体的な技術を開示していない。更に、運転圧力が２００ｋｇ／ｃｍ2と高圧であり、工業的生産には不向きである。
(3)「化学工業」(284〜290頁、1995年、4月号)には、固定相にシリカゲルを用いた、魚油由来の不飽和脂肪酸のメチルエステルを分離する方法が報告されている。
しかし、この方法では、シリカゲルを用いた超臨界クロマトグラフィーによる分離精製の後に、アミノプロピル基でコートしたシリカゲルカラムでの超臨界クロマトグラフィーを再度行い高純度を達成する方法であるため、安定的に高純度のエイコサペンタエン酸メチルを得ることはできていない。また、炭素数が同一で二重結合数が異なるアラキドン酸メチルとエイコサペンタエン酸メチルの分離について何も言及されておらず、微量不純物の除去に関して具体的な検討が行なわれていない。
(4)Meeting Info．：922頁,5037：PREP 92−9th International Symposium on Preparative and Industrial Chromatography(9225037).Nancy(France)には、固定相にシリカゲルを用いて魚油由来の不飽和脂肪酸エチルエステルの分離方法が報告されている。
しかし、この分離方法で得られるエイコサペンタエン酸エチルの純度は、９５．８％以下と低く、更には炭素数が同一で二重結合数が異なるアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルとの分離は示されていない。
(5)特公昭６３−１１２５３６号公報には、リノレン酸の高純度化に関して超臨界クロマトグラフィーを用いる方法が開示されている。
しかし、この方法は、アルキル基などの修飾シリカゲルを用いる技術であり、工業的には不向きである。
(6)ＬＣ−ＧＣ vol.７,Num 6、p502−507(1989年)には、動植物油由来の種々の不飽和脂肪酸誘導体を、超臨界クロマトグラフィーにより精製する方法が報告されている。しかし、この文献には、工業的に使用できる方法については記載されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、従来は製造が困難であった、炭素数が同一で二重結合数の異なる高度不飽和脂肪酸誘導体を効率よく、特に、熱異性化物の生成を抑制して、高純度の高度不飽和脂肪酸誘導体を工業的に得ることが可能な高度不飽和脂肪酸誘導体の製造方法を提供することにある。
本発明の第２の目的は、天然に存在しない、熱異性化物を実質的に含有せず、炭素数が同一で二重結合数が異なるアラキドン酸又はそのアルキルエステルも実質的に含有しない、医薬品又は食品等として、拮抗作用の少ない高純度エイコサペンタエン酸誘導体を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前述の課題に鑑み、鋭意検討した結果、特定なシリカゲルを使用し、特定な運転条件で超臨界クロマトグラフィーを運転することにより、シリカゲルに化学修飾等をすることなしに、高度不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルを効率よく分離精製して製造することができることを見出し、本発明を完成した。また、このような方法を利用することにより、従来得られていない、熱異性化物を実質的に含有せず、炭素数が同一で二重結合数が異なるアラキドン酸又はそのアルキルエステルも実質的に含有しない、高純度エイコサペンタエン酸誘導体が得られることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明によれば、移動相として超臨界二酸化炭素、固定相としてシリカゲル、カラムとして単カラムを用いた超臨界クロマトグラフィーによって分離精製し、高度不飽和脂肪酸誘導体を製造する方法であって、(ａ)超臨界クロマトグラフィーに供する原料として、炭素数が同一で二重結合数が異なる高度不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む混合物を用い、(ｂ)固定相としてのシリカゲルが、粒径４．０〜２５．０μｍ、細孔径０．００５〜０．０１５μｍ、細孔容積０．６５〜１．１０ｍｌ／ｇ、比表面積２５０〜６５０ｍ2／ｇであり、且つ表面が化学修飾されておらず、(ｃ)超臨界クロマトグラフィーの運転条件が、圧力１００〜１３０ｋｇ／ｃｍ2、温度３０〜６０℃、線速度１０〜７０ｃｍ／分である、ことを特徴とする高度不飽和脂肪酸誘導体の製造方法が提供される。
また本発明によれば、上記方法で得られた、ガスクロマトグラフィーの純度が９７．０質量％以上、かつアラキドン酸／エイコサペンタエン酸の比が０．０１０５以下である高純度エイコサペンタエン酸誘導体が提供される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の製造方法に用いる原料は、(ａ)炭素数が同一で二重結合数が異なる高度不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む混合物である。炭素数が同一で二重結合数が異なる高度不飽和脂肪酸としては、例えば、エイコサペンタエン酸−アラキドン酸、ステアリン酸−オレイン酸−リノール酸−リノレン酸、ドコサペンタエン酸−ドコサヘキサエン酸等が挙げられる。これらのアルキルエステルも同様に使用でき、このようなアルキルエステルとしては、例えば、脂肪酸炭素数１〜８のアルコールエステル、グリセリンエステル等が挙げられる。より好ましくは、炭素数１のメチルエステル、炭素数２のエチルエステルが挙げられる。原料の純度は特に限定されず、例えば、エイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルと、アラキドン酸又はそのアルキルエステルとを含む混合物としては、マイワシ油、アンチョビー油、サンマ油、タラ油等の魚油に代表される海産動物油；植物プランクトンから得られる海産植物油等の海産動植物由来のものを挙げることができる。
【０００７】
本発明において高度不飽和脂肪酸誘導体を高純度で得るためには、海産動植物油のケン化物又はそのエステル化物、あるいは海産動植物油をアルコリシスして得られる脂肪酸エステルを用いることが好ましく、魚油脂肪酸のエステルを用いることが特に好ましい。本発明においては、原料とする高度不飽和脂肪酸誘導体を含有する混合物において、高度不飽和脂肪酸誘導体の量は１０質量％以上含有するものが好ましい。
本発明に用いる上記原料である、高度不飽和脂肪酸誘導体を含む混合物は、溶剤で希釈しなくても良好な分離が可能である。しかし、必要であれば、ヘキサン、クロロホルム等により高度不飽和脂肪酸誘導体を含む混合物を希釈して原料に供しても良い。
【０００８】
本発明に用いる超臨界クロマトグラフィーにおける固定相のシリカゲルは、(ｂ)粒径が４．０〜２５．０μｍであり、細孔径が０．００５〜０．０１５μｍ、好ましくは０．００７〜０．０１０μｍであり、細孔容積が０．６５〜１．１０ｍｌ／ｇ、好ましくは０．８０〜１．００ｍｌ／ｇであり、細孔径と細孔容積から求まる比表面積が２５０〜６５０ｍ2／ｇ、好ましくは４００〜６００ｍ2／ｇである。
シリカゲルの細孔径が０．００５μｍ未満の場合、高度不飽和脂肪酸誘導体を含む混合物とシリカゲルの相互作用が強固となり溶出せず、０．０１５μｍを超える場合には分離が不十分となる。また、シリカゲルの比表面積が２５０ｍ2／ｇ未満の場合、分離が不十分となり、６５０ｍ2／ｇを超える場合には高度不飽和脂肪酸誘導体を含む混合物とシリカゲルとの相互作用が強固となり溶出しない。更に、細孔容積が０．６５ｍｌ／ｇ未満の場合、分離が不十分となり、１．１０ｍｌ／ｇを超える場合、シリカゲルの機械強度が低下し破損する恐れがある。シリカゲルの粒径が４．０μｍ未満の場合、超臨界クロマトグラフィーを運転する上でカラムの圧損が大きくなり、２５０μｍを超える場合には分離が不十分となる。
このようなシリカゲルは、例えば、次の製造法等により得ることができる。まず、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウム、ケイ酸リチウム等のケイ酸アルカリ金属塩水溶液を、硫酸、塩酸、硝酸等の鉱酸と反応させるか、あるいはテトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン等のテトラアルコキシシランを加水分解することによりシリカゾルを生成させる。次に、該シリカゾルを疎水性有機溶媒中に界面活性剤と共に乳化分散後ゲル化させるか、あるいは熱気流中に噴霧することにより球状シリカゲルが得られる。また前記シリカゾルをいったんゲル化させヒドロゲルスラリーとした後に湿式粉砕し、噴霧乾燥することによっても球状シリカゲルを得ることができる。
このような方法において、比表面積、細孔容積、平均細孔径は任意にコントロールすることが可能であるが、特にゲル化時あるいはゲル化後の熟成時のｐＨを制御することにより所望の物性値のシリカゲルを得ることが可能である。粒子径については乳化分散による場合、界面活性剤の種類、乳化時の撹拌速度等により制御できる。また、噴霧乾燥法による場合は、ディスク回転数やノズル圧等により制御できる。
本発明に使用するシリカゲルは上記方法等により得ることができるが、特にこの方法に限定されない。最終的に上記所望の比表面積、細孔容積、平均細孔径、平均粒子径を有するシリカゲルであれば良い。
【０００９】
本発明の製造方法において、超臨界クロマトグラフィーによる条件は、(ｃ)圧力１００〜１３０ｋｇ／ｃｍ2、好ましくは１１０〜１３０ｋｇ／ｃｍ2であり、カラム温度３０〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃であり、線速度１０〜７０ｃｍ／分、好ましくは１５〜３５ｃｍ／分である。
圧力が１００ｋｇ／ｃｍ2未満の場合、高度不飽和脂肪酸誘導体を含む混合物とシリカゲルとの相互作用が強固となり溶出せず、１３０ｋｇ／ｃｍ2を超える場合には分離が不十分となる。カラム温度が３０℃未満の場合、移動相の二酸化炭素が超臨界流体とならず、６０℃を超えると高度不飽和脂肪酸誘導体を含む混合物とシリカゲルとの相互作用が強固となり溶出しない。線速度が１０ｃｍ／分未満の場合、分離に要する時間が長くなり、７０ｃｍ／分を超える場合には分離が不十分となる。
【００１０】
本発明の製造方法において、超臨界クロマトグラフィーに用いる移動相は、超臨界二酸化炭素であり、例えば、液化炭酸ガスが用いられる。ガスボンベ等から分離用機器へ液化炭酸ガスを導入することによって分離精製ができる。好ましくは超臨界二酸化炭素の純度は９９．９％以上である。
必要であれば、二酸化炭素に添加溶剤を加えても良い。添加溶剤としては、水、メタノール、エタノール等の低級アルコールや、アセトニトリル等が挙げられる。前記添加溶媒の添加割合は、炭酸ガスに対して０．１〜１００質量％程度が望ましい。
【００１１】
本発明の製造方法により得られる、高度不飽和脂肪酸誘導体は、特に熱異性化物の生成が抑制されており、高純度の高度不飽和脂肪酸誘導体が工業的に効率よく得ることができる。
特に、原料が、エイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルと、アラキドン酸又はそのアルキルエステルとの混合物である場合、エイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルのガスクロマトグラフィーの純度が、９７．０質量％以上であり、アラキドン酸／エイコサペンタエン酸の比が０．０１０５以下である、従来製造ができなかった、高純度のエイコサペンタエン酸誘導体を得ることができる。
【００１２】
【発明の効果】
本発明の製造方法では、特定の原料を用い、超臨界クロマトグラフィーに用いる移動相及び固定相を限定し、且つ特定の運転条件を設定するので、炭素数が同一で二重結合数が異なる従来は分離が困難であった高度不飽和脂肪酸誘導体を効率よく、分離精製し、製造することができる。特に、熱異性化物の生成を防止若しくは抑制でき、高純度の高度不飽和脂肪酸誘導体を工業的に大量に製造することが可能である。
更に、炭素数が同一で二重結合数が異なる高度不飽和脂肪酸誘導体が、エイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルを含有する混合物を原料とした場合、その原料から、熱異性化物を生成することなく、純度９７．０質量％以上の高純度のエイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルを効率よく製造することが可能である。そして、このような製造方法により得られるエイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルは、天然に存在しない熱異性化物を含有せず、炭素数が同一で二重結合数が異なるアラキドン酸又はそのアルキルエステルも含有しないため、医薬品又は食品として、拮抗作用の少ない高い有用性を有する。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、用いたガスクロマトグラフィーの条件、超臨界クロマトグラフィーの運転条件および評価方法を以下に示す。
1．＜ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸誘導体の測定条件＞
ガスクロマトグラフ本体；Hewlett Packard社製、ＨＰ６８９０、
キャリアガス及び流量；ヘリウム、１ｍｌ／分、
サンプル濃度；８ｍｇ／ｍｌ、ヘキサン溶液、
試料注入量；1μｌ、
試料注入方法；スプリット法（スプリット比１００：１）、
インジェクション温度；２５０℃、
検出器温度；２５０℃、
カラム温度；１４０℃から２１０℃まで昇温、
昇温速度；５℃／分、
検出器；ＦＩＤ（水素炎イオン化検出器）、
カラム；ＤＢ−ＷＡＸ(Ｊ＆Ｗ社製)30×0.25ｍｍ×0.25μｍフィルム
熱異性化物の含有率はガスクロマトグラムの、エイコサペンタエン酸とヘンエイコサペンタエン酸(Ｃ２１：Ｆ；５)のピークの間にある、天然には認められないピークを熱異性化物とした。
【００１４】
2．＜超臨界クロマトグラフィーの運転条件１＞；実施例１〜３、比較例１〜６
ポンプ 日本分光社製 型式８８０−ＰＵ
検出器 日本分光社製 型式８７５−ＵＶ
背圧調整弁 日本分光社製 型式８８０−８１
カラムオーブン ＧＬサイエンス社製 型式ＭＯＤＥＬ ５５６
カラムサイズ ４．６ｍｍ(内径)×１５ｃｍ
運転圧力 １３０ｋｇ／ｃｍ2
カラム温度 ４０℃
線速度 ３０．１ｃｍ／分
試料 原料１
試料量 １０μｌ
＜超臨界クロマトグラフィーの運転条件２＞；実施例４
装置一式 ＮＯＶＡ社製超臨界クロマトグラフィー装置
カラムサイズ ２５ｍｍ(内径)×１００ｃｍ
検出器 日本分光社製 型式９７５−ＵＶ
運転圧力 １３０ｋｇ／ｃｍ2
カラム温度 ４０℃
線速度 ３９．１ｃｍ／分
試料 原料２
試料量 ５００μｌ
＜超臨界クロマトグラフィーの運転条件３＞；実施例５
装置一式 ＮＯＶＡ社製超臨界クロマトグラフィー装置
カラムサイズ １２５ｍｍ(内径)×１００ｃｍ
検出器 日本分光社製 型式９７５−ＵＶ
運転圧力 １３０ｋｇ／ｃｍ2
カラム温度 ４０℃
線速度 １９．４ｃｍ／分
試料 原料２
試料量 ４０ｍｌ
【００１５】
3．分離係数および分離度の測定と算出方法
本発明の超臨界二酸化炭素を用いたクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムから必要な数値を求め、第１３改正日本薬局方の液体クロマトグラフ法に準じて分離係数、分離度を算出した。
【００１６】
4．シリカゲルの物性測定：
本発明の実施例及び比較例に用いたシリカゲルの各物性値はメーカーが求めた値を採用した。なお測定法としては、（株）地人書館、触媒工学講座第４巻、触媒基礎測定法、第５８〜８３頁(昭和３９年発行)参照。
【００１７】
＜原料１＞；実施例１〜３、比較例１〜６では、市販のアラキドン酸エチル(フナコシ（株）、アラキドン酸−エチル純度９９％以上）、エイコサペンタエン酸エチル(フナコシ（株）、エイコサペンタエン酸(ＥＰＡ)−エチル純度９５％以上）を等量混合した基準試料２質量％ヘキサン溶液を原料１として用いた。
＜原料２＞；実施例４及び５では、市販の魚油由来のエチルエステル(ＥＰＡ７５．５７％、アラキドン酸エチル２．９５％、(Ｃ２０：Ｆ４／ＥＰＡ)比＝０．０３９）を原料２として用いた。
【００１８】
実施例１
平均粒径４．７μｍ、平均細孔径０．００７μｍ、細孔容積１．０１ｍｌ／ｇ、比表面積５８２ｍ2／ｇからなるシリカゲルを固定相に用いて超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１の条件で運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００１９】
実施例２
固定相のシリカゲルを、平均粒径４．４μｍ、平均細孔径０．００５６μｍ、細孔容積０．６５ｍｌ／ｇ、比表面積４６４ｍ2／ｇのシリカゲルに変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１に従って運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２０】
実施例３
固定相のシリカゲルを、平均粒径２１．４μｍ、平均細孔径０．００７７μｍ、細孔容積０．９９ｍｌ／ｇ、比表面積５１４ｍ2／ｇに変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１に従って運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２１】
比較例１
固定相のシリカゲルを、アミノプロピルシリル基によリコートされたシリカゲルに変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１に従って運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２２】
比較例２
固定相のシリカゲルを、オクタデシルシリル基によリコートされたシリカゲルに変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１に従って運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。しかし、アラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルとの分離が悪く、分離係数及び分離度を求めることができなかった。シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２３】
比較例３
固定相のシリカゲルを、トリメチルシリル基によリコートされたシリカゲルに変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１の条件で運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。しかし、アラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エルとの分離が悪く分離係数及び分離度を求めることはできなかった。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２４】
比較例４
固定相のシリカゲルを、平均粒径４．２μｍ、平均細孔径０．０２４７μｍ、細孔容積１．０８ｍｌ／ｇ、比表面積１７５ｍ2／ｇのシリカゲルに変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１に従って運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２５】
比較例５
実施例１で用いた運転条件において、圧力を９０ｋｇ／ｃｍ2に変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。しかし、アラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルは溶出せず分離係数及び分離度を求めることは不可能であった。シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２６】
比較例６
実施例１で用いた運転条件において、カラム温度を８０℃に変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】
実施例４
実施例３で用いたシリカゲルを充填したカラムを用いた超臨界クロマトグラフィーを、前述の運転条件２に従って運転し、原料２の分離を行った。試料注入後、９１分経過後から１２９分経過後までの画分を分取し、純度９７．８０質量％、Ｃ２０：４／ＥＰＡ比＝０．００４７でエイコサペンタエン酸エチル１９８ｍｇ(エイコサペンタエン酸エチル回収率５６．３１％)を得た。このエチルエステルのガスクロマトグラフィーによる分析では、熱異性体に相当するピークは認められなかった。精製後の脂肪酸組成を表２示す。
【００２９】
実施例５
実施例３で用いたシリカゲルを充填したカラムを用いた超臨界クロマトグラフィーを、前述の運転条件３に従って運転し、原料２の分離を行った。試料注入後、１５０分経過後から２１０分経過後までの画分を分取し、純度９７．４３質量％、Ｃ２０：４／ＥＰＡ比＝０．００７５でエイコサペンタエン酸エチル２００．５ｇ(エイコサペンタエン酸エチル回収率７４．８１％)を得た。このエチルエステルのガスクロマトグラフィーによる分析では、熱異性体に相当するピークは認められなかった。精製後の脂肪酸組成を表２に示す。
【００３０】
【表２】
【００３１】
以上の結果から、特定のシリカゲルを用い、特定の条件で超臨界クロマトグラフィーを運転する本発明の実施例１〜５は、比較例１〜６に比べて、エイコサペンタエン酸エチルエステルの分離精製の効率がよく、工業的に分離精製ができることが分かる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、炭素数が同一で二重結合数が異なる高度不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む混合物を原料として用い、移動相に超臨界二酸化炭素、固定相にシリカゲルを用いた超臨界クロマトグラフィーによる分離精製を効率良く行うことができる、高度不飽和脂肪酸誘導体の製造方法及びこの方法により得られる高純度エイコサペンタエン酸誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、エイコサペンタエン酸誘導体の各種の生理活性が検討されている。この際、炭素数が同一で二重結合数が異なるアラキドン酸誘導体が共存すると、拮抗作用することが知られており、エイコサペンタエン酸誘導体の効果を発揮させる際にはアラキドン酸誘導体が少ない高純度のエイコサペンタエン酸誘導体が求められている。
【０００３】
一方、従来より、通常のガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーなどでは炭素数が同一で二重結合数の異なる不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルが分離し難いことが知られている。
不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルの超臨界クロマトグラフィーによる分離技術としては、以下に示す(1)〜(6)等が知られている。
(1)特開平６−２５６９４号公報には、アミノプロピル基あるいはシアノプロピル基をコートしたシリカゲルを固定相として用い、不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルの分離を行う技術が開示されている。
この方法では、予めシリカゲル担体を被覆する処理が必要となり費用面あるいは工程付加面で不利である。また、この方法により製造された製品を食品や医薬関係に使用する場合には被覆剤の剥離による混入の可能性があり好ましくない。更に、不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルを含んだ混合物をヘキサンで希釈して導入することが必要であり、工業生産においてコストの上昇を招く。更にまた、炭素数が同一で二重結合数のみ異なるアラキドン酸エステルとエイコサペンタエン酸エステルとの分離に関しては具体的な例示がなく、不純成分の除去に関しても充分な検討がなされていない。
(2)J.Chromatography 第648巻 451〜457頁（1993年）には、固定相にシリカゲルとアミノプロピル基で被覆されたシリカゲルとを用いて、魚油由来の高度不飽和脂肪酸のメチルエステルを分離する方法が報告されている。
しかし、この報告においては、アラキドン酸メチルとエイコサペンタエン酸メチルとの分離は示されておらず、同一炭素数で二重結合数の異なる試料の分離に関して具体的な技術を開示していない。更に、運転圧力が２００ｋｇ／ｃｍ2と高圧であり、工業的生産には不向きである。
(3)「化学工業」(284〜290頁、1995年、4月号)には、固定相にシリカゲルを用いた、魚油由来の不飽和脂肪酸のメチルエステルを分離する方法が報告されている。
しかし、この方法では、シリカゲルを用いた超臨界クロマトグラフィーによる分離精製の後に、アミノプロピル基でコートしたシリカゲルカラムでの超臨界クロマトグラフィーを再度行い高純度を達成する方法であるため、安定的に高純度のエイコサペンタエン酸メチルを得ることはできていない。また、炭素数が同一で二重結合数が異なるアラキドン酸メチルとエイコサペンタエン酸メチルの分離について何も言及されておらず、微量不純物の除去に関して具体的な検討が行なわれていない。
(4)Meeting Info．：922頁,5037：PREP 92−9th International Symposium on Preparative and Industrial Chromatography(9225037).Nancy(France)には、固定相にシリカゲルを用いて魚油由来の不飽和脂肪酸エチルエステルの分離方法が報告されている。
しかし、この分離方法で得られるエイコサペンタエン酸エチルの純度は、９５．８％以下と低く、更には炭素数が同一で二重結合数が異なるアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルとの分離は示されていない。
(5)特公昭６３−１１２５３６号公報には、リノレン酸の高純度化に関して超臨界クロマトグラフィーを用いる方法が開示されている。
しかし、この方法は、アルキル基などの修飾シリカゲルを用いる技術であり、工業的には不向きである。
(6)ＬＣ−ＧＣ vol.７,Num 6、p502−507(1989年)には、動植物油由来の種々の不飽和脂肪酸誘導体を、超臨界クロマトグラフィーにより精製する方法が報告されている。しかし、この文献には、工業的に使用できる方法については記載されていない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、従来は製造が困難であった、炭素数が同一で二重結合数の異なる高度不飽和脂肪酸誘導体を効率よく、特に、熱異性化物の生成を抑制して、高純度の高度不飽和脂肪酸誘導体を工業的に得ることが可能な高度不飽和脂肪酸誘導体の製造方法を提供することにある。
本発明の第２の目的は、天然に存在しない、熱異性化物を実質的に含有せず、炭素数が同一で二重結合数が異なるアラキドン酸又はそのアルキルエステルも実質的に含有しない、医薬品又は食品等として、拮抗作用の少ない高純度エイコサペンタエン酸誘導体を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前述の課題に鑑み、鋭意検討した結果、特定なシリカゲルを使用し、特定な運転条件で超臨界クロマトグラフィーを運転することにより、シリカゲルに化学修飾等をすることなしに、高度不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルを効率よく分離精製して製造することができることを見出し、本発明を完成した。また、このような方法を利用することにより、従来得られていない、熱異性化物を実質的に含有せず、炭素数が同一で二重結合数が異なるアラキドン酸又はそのアルキルエステルも実質的に含有しない、高純度エイコサペンタエン酸誘導体が得られることを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明によれば、移動相として超臨界二酸化炭素、固定相としてシリカゲル、カラムとして単カラムを用いた超臨界クロマトグラフィーによって分離精製し、高度不飽和脂肪酸誘導体を製造する方法であって、(ａ)超臨界クロマトグラフィーに供する原料として、炭素数が同一で二重結合数が異なる高度不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む混合物を用い、(ｂ)固定相としてのシリカゲルが、粒径４．０〜２５．０μｍ、細孔径０．００５〜０．０１５μｍ、細孔容積０．６５〜１．１０ｍｌ／ｇ、比表面積２５０〜６５０ｍ2／ｇであり、且つ表面が化学修飾されておらず、(ｃ)超臨界クロマトグラフィーの運転条件が、圧力１００〜１３０ｋｇ／ｃｍ2、温度３０〜６０℃、線速度１０〜７０ｃｍ／分である、ことを特徴とする高度不飽和脂肪酸誘導体の製造方法が提供される。
また本発明によれば、上記方法で得られた、ガスクロマトグラフィーの純度が９７．０質量％以上、かつアラキドン酸／エイコサペンタエン酸の比が０．０１０５以下である高純度エイコサペンタエン酸誘導体が提供される。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明の製造方法に用いる原料は、(ａ)炭素数が同一で二重結合数が異なる高度不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む混合物である。炭素数が同一で二重結合数が異なる高度不飽和脂肪酸としては、例えば、エイコサペンタエン酸−アラキドン酸、ステアリン酸−オレイン酸−リノール酸−リノレン酸、ドコサペンタエン酸−ドコサヘキサエン酸等が挙げられる。これらのアルキルエステルも同様に使用でき、このようなアルキルエステルとしては、例えば、脂肪酸炭素数１〜８のアルコールエステル、グリセリンエステル等が挙げられる。より好ましくは、炭素数１のメチルエステル、炭素数２のエチルエステルが挙げられる。原料の純度は特に限定されず、例えば、エイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルと、アラキドン酸又はそのアルキルエステルとを含む混合物としては、マイワシ油、アンチョビー油、サンマ油、タラ油等の魚油に代表される海産動物油；植物プランクトンから得られる海産植物油等の海産動植物由来のものを挙げることができる。
【０００７】
本発明において高度不飽和脂肪酸誘導体を高純度で得るためには、海産動植物油のケン化物又はそのエステル化物、あるいは海産動植物油をアルコリシスして得られる脂肪酸エステルを用いることが好ましく、魚油脂肪酸のエステルを用いることが特に好ましい。本発明においては、原料とする高度不飽和脂肪酸誘導体を含有する混合物において、高度不飽和脂肪酸誘導体の量は１０質量％以上含有するものが好ましい。
本発明に用いる上記原料である、高度不飽和脂肪酸誘導体を含む混合物は、溶剤で希釈しなくても良好な分離が可能である。しかし、必要であれば、ヘキサン、クロロホルム等により高度不飽和脂肪酸誘導体を含む混合物を希釈して原料に供しても良い。
【０００８】
本発明に用いる超臨界クロマトグラフィーにおける固定相のシリカゲルは、(ｂ)粒径が４．０〜２５．０μｍであり、細孔径が０．００５〜０．０１５μｍ、好ましくは０．００７〜０．０１０μｍであり、細孔容積が０．６５〜１．１０ｍｌ／ｇ、好ましくは０．８０〜１．００ｍｌ／ｇであり、細孔径と細孔容積から求まる比表面積が２５０〜６５０ｍ2／ｇ、好ましくは４００〜６００ｍ2／ｇである。
シリカゲルの細孔径が０．００５μｍ未満の場合、高度不飽和脂肪酸誘導体を含む混合物とシリカゲルの相互作用が強固となり溶出せず、０．０１５μｍを超える場合には分離が不十分となる。また、シリカゲルの比表面積が２５０ｍ2／ｇ未満の場合、分離が不十分となり、６５０ｍ2／ｇを超える場合には高度不飽和脂肪酸誘導体を含む混合物とシリカゲルとの相互作用が強固となり溶出しない。更に、細孔容積が０．６５ｍｌ／ｇ未満の場合、分離が不十分となり、１．１０ｍｌ／ｇを超える場合、シリカゲルの機械強度が低下し破損する恐れがある。シリカゲルの粒径が４．０μｍ未満の場合、超臨界クロマトグラフィーを運転する上でカラムの圧損が大きくなり、２５０μｍを超える場合には分離が不十分となる。
このようなシリカゲルは、例えば、次の製造法等により得ることができる。まず、ケイ酸ナトリウム、ケイ酸カリウム、ケイ酸リチウム等のケイ酸アルカリ金属塩水溶液を、硫酸、塩酸、硝酸等の鉱酸と反応させるか、あるいはテトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン等のテトラアルコキシシランを加水分解することによりシリカゾルを生成させる。次に、該シリカゾルを疎水性有機溶媒中に界面活性剤と共に乳化分散後ゲル化させるか、あるいは熱気流中に噴霧することにより球状シリカゲルが得られる。また前記シリカゾルをいったんゲル化させヒドロゲルスラリーとした後に湿式粉砕し、噴霧乾燥することによっても球状シリカゲルを得ることができる。
このような方法において、比表面積、細孔容積、平均細孔径は任意にコントロールすることが可能であるが、特にゲル化時あるいはゲル化後の熟成時のｐＨを制御することにより所望の物性値のシリカゲルを得ることが可能である。粒子径については乳化分散による場合、界面活性剤の種類、乳化時の撹拌速度等により制御できる。また、噴霧乾燥法による場合は、ディスク回転数やノズル圧等により制御できる。
本発明に使用するシリカゲルは上記方法等により得ることができるが、特にこの方法に限定されない。最終的に上記所望の比表面積、細孔容積、平均細孔径、平均粒子径を有するシリカゲルであれば良い。
【０００９】
本発明の製造方法において、超臨界クロマトグラフィーによる条件は、(ｃ)圧力１００〜１３０ｋｇ／ｃｍ2、好ましくは１１０〜１３０ｋｇ／ｃｍ2であり、カラム温度３０〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃であり、線速度１０〜７０ｃｍ／分、好ましくは１５〜３５ｃｍ／分である。
圧力が１００ｋｇ／ｃｍ2未満の場合、高度不飽和脂肪酸誘導体を含む混合物とシリカゲルとの相互作用が強固となり溶出せず、１３０ｋｇ／ｃｍ2を超える場合には分離が不十分となる。カラム温度が３０℃未満の場合、移動相の二酸化炭素が超臨界流体とならず、６０℃を超えると高度不飽和脂肪酸誘導体を含む混合物とシリカゲルとの相互作用が強固となり溶出しない。線速度が１０ｃｍ／分未満の場合、分離に要する時間が長くなり、７０ｃｍ／分を超える場合には分離が不十分となる。
【００１０】
本発明の製造方法において、超臨界クロマトグラフィーに用いる移動相は、超臨界二酸化炭素であり、例えば、液化炭酸ガスが用いられる。ガスボンベ等から分離用機器へ液化炭酸ガスを導入することによって分離精製ができる。好ましくは超臨界二酸化炭素の純度は９９．９％以上である。
必要であれば、二酸化炭素に添加溶剤を加えても良い。添加溶剤としては、水、メタノール、エタノール等の低級アルコールや、アセトニトリル等が挙げられる。前記添加溶媒の添加割合は、炭酸ガスに対して０．１〜１００質量％程度が望ましい。
【００１１】
本発明の製造方法により得られる、高度不飽和脂肪酸誘導体は、特に熱異性化物の生成が抑制されており、高純度の高度不飽和脂肪酸誘導体が工業的に効率よく得ることができる。
特に、原料が、エイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルと、アラキドン酸又はそのアルキルエステルとの混合物である場合、エイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルのガスクロマトグラフィーの純度が、９７．０質量％以上であり、アラキドン酸／エイコサペンタエン酸の比が０．０１０５以下である、従来製造ができなかった、高純度のエイコサペンタエン酸誘導体を得ることができる。
【００１２】
【発明の効果】
本発明の製造方法では、特定の原料を用い、超臨界クロマトグラフィーに用いる移動相及び固定相を限定し、且つ特定の運転条件を設定するので、炭素数が同一で二重結合数が異なる従来は分離が困難であった高度不飽和脂肪酸誘導体を効率よく、分離精製し、製造することができる。特に、熱異性化物の生成を防止若しくは抑制でき、高純度の高度不飽和脂肪酸誘導体を工業的に大量に製造することが可能である。
更に、炭素数が同一で二重結合数が異なる高度不飽和脂肪酸誘導体が、エイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルを含有する混合物を原料とした場合、その原料から、熱異性化物を生成することなく、純度９７．０質量％以上の高純度のエイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルを効率よく製造することが可能である。そして、このような製造方法により得られるエイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルは、天然に存在しない熱異性化物を含有せず、炭素数が同一で二重結合数が異なるアラキドン酸又はそのアルキルエステルも含有しないため、医薬品又は食品として、拮抗作用の少ない高い有用性を有する。
【００１３】
【実施例】
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なお、用いたガスクロマトグラフィーの条件、超臨界クロマトグラフィーの運転条件および評価方法を以下に示す。
1．＜ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸誘導体の測定条件＞
ガスクロマトグラフ本体；Hewlett Packard社製、ＨＰ６８９０、
キャリアガス及び流量；ヘリウム、１ｍｌ／分、
サンプル濃度；８ｍｇ／ｍｌ、ヘキサン溶液、
試料注入量；1μｌ、
試料注入方法；スプリット法（スプリット比１００：１）、
インジェクション温度；２５０℃、
検出器温度；２５０℃、
カラム温度；１４０℃から２１０℃まで昇温、
昇温速度；５℃／分、
検出器；ＦＩＤ（水素炎イオン化検出器）、
カラム；ＤＢ−ＷＡＸ(Ｊ＆Ｗ社製)30×0.25ｍｍ×0.25μｍフィルム
熱異性化物の含有率はガスクロマトグラムの、エイコサペンタエン酸とヘンエイコサペンタエン酸(Ｃ２１：Ｆ；５)のピークの間にある、天然には認められないピークを熱異性化物とした。
【００１４】
2．＜超臨界クロマトグラフィーの運転条件１＞；実施例１〜３、比較例１〜６
ポンプ 日本分光社製 型式８８０−ＰＵ
検出器 日本分光社製 型式８７５−ＵＶ
背圧調整弁 日本分光社製 型式８８０−８１
カラムオーブン ＧＬサイエンス社製 型式ＭＯＤＥＬ ５５６
カラムサイズ ４．６ｍｍ(内径)×１５ｃｍ
運転圧力 １３０ｋｇ／ｃｍ2
カラム温度 ４０℃
線速度 ３０．１ｃｍ／分
試料 原料１
試料量 １０μｌ
＜超臨界クロマトグラフィーの運転条件２＞；実施例４
装置一式 ＮＯＶＡ社製超臨界クロマトグラフィー装置
カラムサイズ ２５ｍｍ(内径)×１００ｃｍ
検出器 日本分光社製 型式９７５−ＵＶ
運転圧力 １３０ｋｇ／ｃｍ2
カラム温度 ４０℃
線速度 ３９．１ｃｍ／分
試料 原料２
試料量 ５００μｌ
＜超臨界クロマトグラフィーの運転条件３＞；実施例５
装置一式 ＮＯＶＡ社製超臨界クロマトグラフィー装置
カラムサイズ １２５ｍｍ(内径)×１００ｃｍ
検出器 日本分光社製 型式９７５−ＵＶ
運転圧力 １３０ｋｇ／ｃｍ2
カラム温度 ４０℃
線速度 １９．４ｃｍ／分
試料 原料２
試料量 ４０ｍｌ
【００１５】
3．分離係数および分離度の測定と算出方法
本発明の超臨界二酸化炭素を用いたクロマトグラフィーにより得られたクロマトグラムから必要な数値を求め、第１３改正日本薬局方の液体クロマトグラフ法に準じて分離係数、分離度を算出した。
【００１６】
4．シリカゲルの物性測定：
本発明の実施例及び比較例に用いたシリカゲルの各物性値はメーカーが求めた値を採用した。なお測定法としては、（株）地人書館、触媒工学講座第４巻、触媒基礎測定法、第５８〜８３頁(昭和３９年発行)参照。
【００１７】
＜原料１＞；実施例１〜３、比較例１〜６では、市販のアラキドン酸エチル(フナコシ（株）、アラキドン酸−エチル純度９９％以上）、エイコサペンタエン酸エチル(フナコシ（株）、エイコサペンタエン酸(ＥＰＡ)−エチル純度９５％以上）を等量混合した基準試料２質量％ヘキサン溶液を原料１として用いた。
＜原料２＞；実施例４及び５では、市販の魚油由来のエチルエステル(ＥＰＡ７５．５７％、アラキドン酸エチル２．９５％、(Ｃ２０：Ｆ４／ＥＰＡ)比＝０．０３９）を原料２として用いた。
【００１８】
実施例１
平均粒径４．７μｍ、平均細孔径０．００７μｍ、細孔容積１．０１ｍｌ／ｇ、比表面積５８２ｍ2／ｇからなるシリカゲルを固定相に用いて超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１の条件で運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００１９】
実施例２
固定相のシリカゲルを、平均粒径４．４μｍ、平均細孔径０．００５６μｍ、細孔容積０．６５ｍｌ／ｇ、比表面積４６４ｍ2／ｇのシリカゲルに変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１に従って運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２０】
実施例３
固定相のシリカゲルを、平均粒径２１．４μｍ、平均細孔径０．００７７μｍ、細孔容積０．９９ｍｌ／ｇ、比表面積５１４ｍ2／ｇに変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１に従って運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２１】
比較例１
固定相のシリカゲルを、アミノプロピルシリル基によリコートされたシリカゲルに変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１に従って運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２２】
比較例２
固定相のシリカゲルを、オクタデシルシリル基によリコートされたシリカゲルに変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１に従って運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。しかし、アラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルとの分離が悪く、分離係数及び分離度を求めることができなかった。シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２３】
比較例３
固定相のシリカゲルを、トリメチルシリル基によリコートされたシリカゲルに変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１の条件で運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。しかし、アラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エルとの分離が悪く分離係数及び分離度を求めることはできなかった。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２４】
比較例４
固定相のシリカゲルを、平均粒径４．２μｍ、平均細孔径０．０２４７μｍ、細孔容積１．０８ｍｌ／ｇ、比表面積１７５ｍ2／ｇのシリカゲルに変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを前述の運転条件１に従って運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２５】
比較例５
実施例１で用いた運転条件において、圧力を９０ｋｇ／ｃｍ2に変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。しかし、アラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルは溶出せず分離係数及び分離度を求めることは不可能であった。シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２６】
比較例６
実施例１で用いた運転条件において、カラム温度を８０℃に変更した以外は実施例１と同様に、超臨界二酸化炭素を移動相とした超臨界クロマトグラフィーを運転し、原料１の分離を行った。得られたクロマトグラムからアラキドン酸エチルとエイコサペンタエン酸エチルの分離係数及び分離度を求めた。その結果を表１に示す。併せて、シリカゲルの物性及び運転条件を表１に示す。
【００２７】
【表１】
実施例４
実施例３で用いたシリカゲルを充填したカラムを用いた超臨界クロマトグラフィーを、前述の運転条件２に従って運転し、原料２の分離を行った。試料注入後、９１分経過後から１２９分経過後までの画分を分取し、純度９７．８０質量％、Ｃ２０：４／ＥＰＡ比＝０．００４７でエイコサペンタエン酸エチル１９８ｍｇ(エイコサペンタエン酸エチル回収率５６．３１％)を得た。このエチルエステルのガスクロマトグラフィーによる分析では、熱異性体に相当するピークは認められなかった。精製後の脂肪酸組成を表２示す。
【００２９】
実施例５
実施例３で用いたシリカゲルを充填したカラムを用いた超臨界クロマトグラフィーを、前述の運転条件３に従って運転し、原料２の分離を行った。試料注入後、１５０分経過後から２１０分経過後までの画分を分取し、純度９７．４３質量％、Ｃ２０：４／ＥＰＡ比＝０．００７５でエイコサペンタエン酸エチル２００．５ｇ(エイコサペンタエン酸エチル回収率７４．８１％)を得た。このエチルエステルのガスクロマトグラフィーによる分析では、熱異性体に相当するピークは認められなかった。精製後の脂肪酸組成を表２に示す。
【００３０】
【表２】
以上の結果から、特定のシリカゲルを用い、特定の条件で超臨界クロマトグラフィーを運転する本発明の実施例１〜５は、比較例１〜６に比べて、エイコサペンタエン酸エチルエステルの分離精製の効率がよく、工業的に分離精製ができることが分かる。
Claims (4)
- 移動相として超臨界二酸化炭素、固定相としてシリカゲル、カラムとして単カラムを用いた超臨界クロマトグラフィーによって分離精製し、高度不飽和脂肪酸誘導体を製造する方法であって、(ａ)超臨界クロマトグラフィーに供する原料として、炭素数が同一で二重結合数が異なる高度不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む混合物を用い、(ｂ)固定相としてのシリカゲルが、粒径４．０〜２５．０μｍ、細孔径０．００５〜０．０１５μｍ、細孔容積０．６５〜１．１０ｍｌ／ｇ、比表面積２５０〜６５０ｍ2／ｇであり、且つ表面が化学修飾されておらず、(ｃ)超臨界クロマトグラフィーの運転条件が、圧力１００〜１３０ｋｇ／ｃｍ2、温度３０〜６０℃、線速度１０〜７０ｃｍ／分である、ことを特徴とする高度不飽和脂肪酸誘導体の製造方法。
- 炭素数が同一で二重結合数が異なる高度不飽和脂肪酸又はそのアルキルエステルを含む混合物の原料が、エイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルと、アラキドン酸又はそのアルキルエステルとの混合物であることを特徴とする請求項１に記載の製造方法。
- 分離精製されたエイコサペンタエン酸又はそのアルキルエステルのガスクロマトグラフィーの純度が、９７．０質量％以上であり、アラキドン酸／エイコサペンタエン酸の比が０．０１０５以下であることを特徴とする請求項２に記載の製造方法。
- 請求項３に記載の方法で得られた、ガスクロマトグラフィーの純度が９７．０質量％以上、かつアラキドン酸／エイコサペンタエン酸の比が０．０１０５以下である高純度エイコサペンタエン酸誘導体。
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