JP4166408B2

JP4166408B2 - 新規タキキニンペプチドおよびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子

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Publication number: JP4166408B2
Application number: JP2000086236A
Authority: JP
Inventors: 宏之南方; 栄子岩越; 京子宅和
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Ltd
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 2000-03-27
Publication date: 2008-10-15
Anticipated expiration: 2020-03-27
Also published as: EP1213297B1; AU773969B2; WO2001009171A1; US7371810B1; CN1332977C; ATE393777T1; JP2001103979A; DE60038741D1; AU773969C; AU6023900A; EP1213297A4; KR100724331B1; US20090023184A1; DE60038741T2; CN1376162A; EP1213297A1; CA2380354A1; KR20020016929A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脊椎動物の腸管を収縮する活性を有する新規なタキキニンペプチドおよびその前駆体ポリペプチドに関し、さらに詳細には、マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）の後部唾腺から得られる、脊椎動物の腸管を収縮する活性を有する新規なタキキニンペプチドおよびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
外洋性ジャコウダコ（ＥｌｅｄｏｎｅｍｏｓｃｈａｔａおよびＥ．ａｌｄｒｏｖａｎｄｉ）の後部唾腺のアセトン抽出物がイヌに対し強力な血圧降下作用をもつことから単離されたエレドイシンは、アミノ酸残基１１からなる生理活性ペプチドである（Ｅｒｓｐａｍｅｒ，Ｖ．＆Ａｎａｓｔａｓｉ，Ａ．：Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，１８，５８，１９６２）。このエレドイシンは、血圧降下作用のほかにモルモット回腸収縮作用を表わし、また、静注した場合にイヌの唾液分泌を促進するという特異な作用も有していることが明らかにされた。その後、同様の作用をもつペプチドがカエルの皮膚から単離されており、これはフィザラミンと名付けられている（Ｅｒｓｐａｍｅｒ，Ｖ．，Ａｎａｓｔａｓｉ，Ａ．，Ｂｅｒｔａｃｃｉｎｉ，Ｇ．＆Ｃｅｉ，Ｊ．Ｍ．：Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，２０，４８９，１９６４）。これらのペプチドは、モルモットの回腸を素早く収縮させるため、ブラジキニン（ｂｒａｄｙ（緩徐に）ｋｉｎｉｎ（動かすもの））に対して、タキキニン（ｔａｃｈｙ（＝ｆａｓｔ）ｋｉｎｉｎ、早く収縮させるもの）と命名された。また、これらのペプチドの構造がもとになって、サブスタンスＰの構造が明らかにされた。
【０００３】
タキキニンペプチドはその後、両生類（Ｙａｓｕｈａｒａ，Ｔ．，Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｔ．，Ｅｒｓｐａｍｅｒ，Ｇ．Ｆ．＆Ｅｒｓｐａｍｅｒ，Ｖ．：Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．，２，６１３，１９８１）や、鳥類（Ｃｏｎｌｏｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｋａｔｓｏｕｌｉｓ，Ｓ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅ．＆Ｔｈｉｍ，Ｌ．：ＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＰｅｐｔｉｄｅｓ，２０，１７１，１９８８）などの脊椎動物から次々と単離されたが、無脊椎動物からはエレドイシンの他に、黄熱病を媒介する蚊から、シアロキニンが発見されただけである（Ｃｈａｍｐａｇｎｅ，Ｄ．Ｅ．＆Ｒｉｂｅｉｒｏ，Ｊ．Ｍ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１３８，１９９４）。
【０００４】
今日では、タキキニンは、Ｃ末端に共通アミノ酸残基として：−Ｐｈｅ−Ｙａａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂をもち、Ｙａａには芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ）や分枝アミノ酸（Ｖａｌ、Ｉｌｅ）が入り、腸管収縮、血圧降下、唾液分泌促進作用などを示す生理活性ペプチドの総称とされている。そして、前記サブスタンスＰ（Ｐ物質）、エレドイシン、フィザラミンの他に、ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、カシニンなどが含まれている（生物学辞典（第４版）、岩波書店、１９９７）。そしてタキキニンペプチドは新しい医薬品開発の基礎化合物として活用が期待されており、特にサブスタンスＰは一次知覚神経の伝達物質として痛みの伝達に関与していると考えられることから、鎮痛薬としての開発が期待され、研究が行われている。また、高等動物の神経系における情報処理機構解明用の試薬としての活用も期待されている。
【０００５】
ところで、タコの後部唾腺は前記のエレドイシンの他、甲殻類をしびれさせる効果をもつ糖タンパク、セファロトキシン、フグ毒として知られるテトロドトキシンなどの毒物質を含んでいるものがあり、毒腺といわれている。さらにオクトパミン、セロトニン、チラミン、ノルアドレナリン、ヒスタミン、アセチルコリンなどの生体アミン類や、タンパク分解酵素、ヒアルロニダーゼなどの酵素類を含んでいるものがあることが知られている（Ｂｏｕｃａｕｄ−Ｃａｍｏｕ，Ｅ．＆Ｂｏｕｃｈｅｒ−Ｒｏｄｏｎｉ，Ｒ．１９８３．ＦｅｅｄｉｎｇａｎｄｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｎＣｅｐｈａｌｏｐｏｄｓ．Ｉｎ “Ｔｈｅｍｏｌｌｕｓｃａ”，（Ｓａｌｅｕｄｄｉｎ，Ａ．Ｓ．Ｍ．＆Ｗｉｌｂｕｒ，Ｋ．Ｍ．），ＡｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓａｎｄＮｅｗＹｏｒｋ．）。しかし、エレドイシン以外のタキキニンペプチドが見出されたとの報告はない。また、エレドイシンは、哺乳類に対しては平滑筋収縮作用や血管拡張作用、血圧降下作用を有することが明らかにされたが、タコにおける役割についてはほとんどわかっていない。
【０００６】
こうしたことから、タキキニンペプチドについての個々の動物種における役割や、種特異性を明らかにし、構造−活性相関の研究などにより高等動物の神経系における情報処理機構の解明や医薬品の開発に結びつく情報を得るためには、さらに多くの動物種から、タキキニンペプチドを見出すことが必要とされている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
したがって本発明は、新たなタキキニンペプチドを見い出し、その構造を明らかにするとともに、その生理活性を解明し、高等動物の神経系における情報処理機構の解明用の試薬や、農薬または医薬品開発における基礎化合物として利用可能な、新規タキキニンペプチドを得ることを課題とする。
さらに本発明は、こうしたタキキニンペプチドの前駆体ポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子を明らかにするとともに、こうしたタキキニンペプチドを製造する方法を提供することを課題とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
かかる課題を解決するために、本発明は、次の特性：
▲１▼ アミノ酸残基数が１２であり；
▲２▼ Ｎ末端がＬｙｓであり；
▲３▼ Ｃ末端から５つのアミノ酸が次のアミノ酸配列式（Ｉ）、
−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂ （Ｉ）
（式中、ＸａａはＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒを表わす）で表わされるタキキニンペプチドを提供する。
【０００９】
そのなかでも本発明は特に、次のアミノ酸配列式（ＩＩ）：
Ｈ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂ （ＩＩ）
（式中、ＸａａはＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒを表わす）で表わされるタキキニンぺプチドを提供する。
【００１０】
すなわち、本発明者らはマダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）の後部唾腺から新たなタキキニンペプチドを得るべく、マダコの後部唾腺から、魚類（コイ）の直腸の収縮を指標に探索を行い、上記アミノ酸配列式（ＩＩ）のなかでも次のアミノ酸配列式（１）および（２）：
【００１１】
Ｈ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂ （１）
（以下、このペプチドを化合物（１）と称する。）
【００１２】
Ｈ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂ （２）
（以下、このペプチドを化合物（２）と称する。）
【００１３】
で表されるペプチドを分離、精製し、その化学構造を決定すると共に、全合成によりその構造および生理活性を確認した。
（なお、本明細書中においては、アミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣおよびＩＵＢの定める３文字表記により表記する。）
【００１４】
さらに本発明者らは、上記のアミノ酸配列をもとにプライマーを作成し、マダコの後部唾腺から調製したｔｏｔａｌＲＮＡに対して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法などを用いた遺伝子配列の解析手段を組み合わせることにより、タキキニンペプチドの前駆体であるポリペプチドの全一次アミノ酸配列は、配列番号３で示されることを明らかにした。また、当該前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号４に示す塩基配列を有するものであることを明らかにした。
【００１５】
したがって、本発明は別の態様として、配列番号３で表わされるアミノ酸配列または、その一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列またはその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸配列に１個から複数個のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有する、タキキニンペプチドの前駆体ポリペプチドを提供する。
【００１６】
さらに別の態様として、本発明は、かかるタキキニンペプチドの前駆体ポリペプチド、およびタキキニンペプチドの製造方法を提供し、また、別の態様としては、かかるタキキニンペプチドの前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子、およびこの遺伝子を用いた前駆体ポリペプチド、およびタキキニンペプチドの製造方法を提供する。
【００１７】
【発明の実施の形態】
本発明が提供する新規ペプチドは、脊椎動物の腸管収縮作用を有するタキキニンペプチドであり、マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）から、例えば以下の方法により単離、精製することができる。
【００１８】
すなわち、マダコの後部唾腺を熱水抽出し、その抽出液に酢酸を３％濃度になるように加え、冷却後遠心分離して粗抽出物を得る。この粗抽出物をＣ１８カートリッジ（例えばＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ：ウォーターズ社製）に吸着させた後、０．１％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと略す）を含む６０％メタノールで溶出してペプチド画分を分取し、この画分をイオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等に付して、目的とするペプチドを分離、精製することができる。
【００１９】
また、本発明のペプチドはアミノ酸残基数１２のペプチドであるため、通常のペプチド合成機（例えばＰＥバイオシステムズジャパン社製ペプチド合成機４３３Ａ型）を用いた固相合成法や、通常の有機合成化学的手法により容易に合成することができる。これらの方法で得られた粗ペプチドは、必要であれば逆相高速液体クロマトグラフィーや結晶化等の通常の精製手法によって、精製することができる。
【００２０】
一方、マダコのタキキニンペプチドの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列、および当該ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列は、次のようにして決定することができる。
すなわち、上記により得られたタキキニンペプチドのアミノ酸配列をもとにプライマーを作成し、マダコの後部唾腺より調製したｔｏｔａｌＲＮＡに対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行い、約５００塩基体の遺伝子配列を解明し、続いて５’−ＲＡＣＥ法、３’−ＲＡＣＥ法を用いて５’末端および３’末端側の遺伝子配列を解明することができる。本発明においては、この方法によりマダコのタキキニンペプチドの前駆体ポリペプチドは、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するものであること、当該前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番号４に示す塩基配列を有するものであることを明らかにした。
【００２１】
したがって、本発明のタキキニンペプチドの前駆体ポリペプチドおよびタキキニンペプチドは、遺伝子組み換え法によっても製造することができる。すなわち、遺伝子組み換え法によって製造を行う場合は、例えば、配列番号４で示される遺伝子を組み込んだベクターを作成し、当該ベクターによって宿主の形質転換を行った後、該宿主を培養または成育させ、該宿主から目的の前駆体ポリペプチドを単離、精製すれば良い。そして、前駆体ポリペプチドから目的のタキキニンペプチドを得るには、前駆体ポリペプチドから酵素などを用いて切り出し（プロセッシング）を行ない、必要に応じて単離、精製すれば良い。
【００２２】
【作用】
本発明のペプチドは、脊椎動物において平滑筋収縮や血管拡張作用、血圧降下作用をもたらすタキキニンペプチドであるため、神経伝達系研究用の試薬としてだけでなく、医薬への新たなアプローチを与える有用な化合物として利用することができる。
【００２３】
例えば、本発明のペプチドを有効成分とする医薬としては、製剤学的に慣用されている賦形剤と共にカプセル剤、錠剤、注射剤等の適当な剤形で、経口的または非経口的に投与することができる。具体的には、本発明のペプチドを、乳糖、デンプンまたはその誘導体、セルロース誘導体等の賦形剤と混合したのち、ゼラチンカプセルに充填することによりカプセル剤を調製することができる。
【００２４】
また錠剤は、上記の賦形剤の他に、カルボキシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸、アラビアゴム等の結合剤と水を加えて練合し、必要により顆粒として造粒したのち、さらにタルク、ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤を添加して、通常の圧縮打錠機を用いて錠剤に調製することができる。
【００２５】
さらに、非経口投与に際しては、本発明のペプチドを溶解補助剤と共に滅菌蒸留水あるいは滅菌生理食塩水に溶解し、アンプルに封入して注射用製剤とすることができる。この場合、必要により安定化剤、緩衝物質等を含有させてもよい。また、粉末のままバイアル充填し、滅菌蒸留水により用時溶解型の製剤とすることもできる。これらの非経口投与製剤は、静脈内投与、あるいは点滴静注により投与することができる。
【００２６】
なお本発明の有効成分であるペプチドの投与量は、種々の要因、例えば治療すべき病態、患者の症状、重篤度、患者の年齢、さらには投与経路等を考慮して、適宜設定すればよい。一般的に経口投与の場合には、有効成分として通常０．１〜１０００ｍｇ／日／ヒト、好ましくは１〜５００ｍｇ／日／ヒトの範囲内で、また非経口投与の場合には、経口投与の場合における投与量の約１／１００〜１／２程度の範囲内で適宜選択し投与することができる。
【００２７】
【実施例】
次に実施例によって本発明をさらに説明するが、本発明の範囲はこれのみに限定されるものではない。
【００２８】
実施例１：マダコからコイ直腸の収縮増強作用を有するペプチド類の分離
（ａ）：粗抽出
マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）１００匹から後部唾腺を摘出し、液体窒素にて凍結保存した。凍結保存した摘出組織（２２１ｇ）を３等分し、その１／３量を沸騰した蒸留水８００ｍｌ中に入れ、１０分間煮沸した。放冷後、酢酸を３％濃度になるように加え、ホモジナイズした後、４℃で３０分間、１０，４４７×ｇで遠心分離して、上清を得た。一方、沈殿物に２００ｍｌの３％酢酸を加え、再度ホモジナイズした後、同様に遠心分離をして、上清を得た。さらに、沈殿物に２００ｍｌの３％酢酸を加えた後、同様に処理し、上清を得た。残りの摘出組織を２回に分けて、上記と同様の各３回の抽出操作を行い、上清を得た。得られた上清を集め、減圧下に約２００ｍｌになるまで濃縮し、粗抽出物とした。
【００２９】
（ｂ）：Ｃ１８カートリッジへの吸着
（ａ）で得られた粗抽出物に、１．０Ｍ−ＨＣｌを２０ｍｌ加え、４℃で３０分間、３０,０００×ｇで遠心分離した。得られた上清を、Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）ＶａｃＣ１８カートリッジ（１０ｇ、３５ｃｃ、ウォーターズ社製）に通した。カートリッジを０．１％ＴＦＡ２００ｍｌで洗浄した後、保持物質を６０％メタノール／０．１％ＴＦＡ１００ｍｌで溶出し、溶出液を減圧濃縮後、凍結乾燥させ、乾燥物０．３６３ｇを得た。
【００３０】
（ｃ）：陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（１）
（ｂ）で得られた乾燥物を１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）１５０ｍｌに溶かし、ＴＳＫｇｅｌＳＰトヨパールパック６５０Ｓ（２０〜５０μｍ、Φ２２×２００ｍｍ，東ソー製）を用いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（陽イオン交換ＨＰＬＣ）に付し、流速３．０ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、６０分間で０Ｍから０．６ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。２１５ｎｍの紫外線吸収のモニターにより６ｍｌずつに分画し、各フラクションを後記する実施例６に示す方法に従って生物検定したところ、０ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された画分に直腸収縮増強活性が見られた。
【００３１】
（ｄ）：逆相高速液体カラムクロマトグラフィー（１）
（ｃ）で得られた活性画分を、ＣａｐｃｅｌｌｐａｋＣ１８ＵＧ８０（５μｍ、Φ１０×２５０ｍｍ、資生堂製）を用いた逆相高速液体カラムクロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）に付し、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、６０分間で０％から６０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。３ｍｌずつの溶出画分を生物検定に付したところ、アセトニトリル３０〜３６％に溶出される画分に活性が見られた。
【００３２】
（ｅ）：陽イオン交換ＨＰＬＣ（２）
（ｄ）で得られた画分を、ＴＳＫｇｅｌＳＰ−５ＰＷ（１０μｍ、Φ７．５×７５ｍｍ、東ソー製）を用いた陽イオン交換ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．７）中、６０分間で０Ｍから０．６ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。２ｍｌずつの溶出画分を生物検定したところ、０．１３〜０．１５ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された画分に活性が見られた。
【００３３】
（ｆ）：逆相ＨＰＬＣ（２）
（ｅ）で得られた画分を、ＣａｐｃｅｌｌｐａｋＣ１８ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１５０ｍｍ、資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、４０分間で、２０〜４０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。１ｍｌずつ分画し、アセトニトリル濃度約２３％に溶出する画分（以下、画分Ａという）、およびアセトニトリル濃度約２５％に溶出する画分（以下、画分Ｂという）に活性を認めた。
【００３４】
実施例２：活性画分からペプチド類の精製（その１：活性画分Ａからの精製）
実施例１の分離操作（ｆ）で得られた活性画分Ａを、ＣａｐｃｅｌｌｐａｋＣ１８ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１５０ｍｍ、資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、アセトニトリル濃度２２％で展開した。保持時間１４．５分に単一のピークを示す化合物が得られた。この化合物を化合物（１）とした。
この逆相ＨＰＬＣの展開図を、図１として示す。
【００３５】
実施例３：活性画分からペプチド類の精製（その２：活性画分Ｂからの精製）
実施例１の分離操作（ｆ）で得られた活性画分Ｂを、ＣａｐｃｅｌｌｐａｋＣ１８ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１５０ｍｍ、資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、アセトニトリル濃度２４％で展開した。保持時間１３分に単一のピークを示す化合物が得られた。この化合物を、化合物（２）とした。
この逆相ＨＰＬＣの展開図を、図２として示す。
【００３６】
実施例４：ペプチド類の同定
上記の実施例２および３で純化した、化合物（１）および化合物（２）の構造を、ＳｈｉｍａｄｚｕＰＳＱ−１型気相シークエンサー（島津製作所製）によって解析した。得られた各アミノ酸配列を、下記表１に示した。
【００３７】
【表１】
ペプチドのアミノ酸配列（単位：ｐｍｏｌ）

【００３８】
化合物（１）および化合物（２）の分子量は、ＭＡＬＤＩＴＯＦ−ＭＳ（ＶｏｙａｇｅｒＥｌｉｔｅ，ＰＥバイオシステムズジャパン社製）によって確認した。その測定値を下記表２に示した。
【００３９】
【表２】
ペプチドのＭＳデータ

【００４０】
以上の機器分析データにより、活性画分Ａより単離、精製されたマダコの神経ペプチド類である化合物（１）は、次のアミノ酸配列式（１）
Ｈ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂ （１）
で表されることが明らかになった。
【００４１】
また、活性画分Ｂより単離、精製されたマダコの神経ペプチド類である化合物（２）は、次のアミノ酸配列式（２）
Ｈ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂ （２）
で表されることが明らかになった。
【００４２】
実験例５：固相法によるペプチド類の合成
ペプチド類の合成は、ＰＥバイオシステムズジャパン社製の全自動ペプチド合成機４３３Ａ型を用い、ＦａｓｔＭｏｃ（登録商標）法により合成した。
【００４３】
なお、化合物（１）の合成には、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−Ａレジン（渡辺化学工業社製）を担体とし、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−ＬｅｕおよびＦｍｏｃ−Ｍｅｔを用いた。
【００４４】
また、化合物（２）の合成には、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−Ａレジン（渡辺化学工業社製）を担体とし、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ、Ｆｍｏｃ−ＬｅｕおよびＦｍｏｃ−Ｍｅｔを用いた。
【００４５】
（ただし、Ｆｍｏｃは９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを、Ｂｏｃはｔ−Ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを、ｔＢｕはｔ−Ｂｕｔｙｌを示す。）
【００４６】
反応終了後のペプチド樹脂からの粗ペプチドの切離しと脱保護には、フェノール４．３％／１，２−エタンジチオール２．１％／チオアニソール４．３％／水４．３％／ＴＦＡ８５％を用いた。反応混合物を濾過し、濾液にエーテルを加えてペプチドを沈殿させ、沈殿をエーテルで３回洗浄し、粗ペプチド約１００ｍｇを得た。このうちの約１０ｍｇの粗ペプチドを逆相ＨＰＬＣにより精製し、約６ｍｇの精製ペプチドを得た。
【００４７】
精製ペプチドは、ＣａｐｃｅｌｌｐａｋＣ１８を用いる逆相ＨＰＬＣにおいて、保持時間がそれぞれマダコ由来の化合物（１）および（２）と全く一致した。また、コイの直腸収縮活性においても、合成物はそれぞれの天然物と同様であった。
【００４８】
実施例６：コイの直腸収縮活性の測定
コイの直腸収縮活性の測定は、次のとおり実施した。すなわち、コイの腸管を摘出し、その両端を木綿の糸で縛り、一端を試料添加用のチャンバー（容量２ｍｌ）に固定し、他端をトランスデューサーにつないで検定の標本とした。検定すべき検体は、生理食塩水に溶解してチャンバーに添加し、収縮による張力の変化を記録した。
【００４９】
その結果を、図３および図４に示した。
図中の結果からも明らかなように、化合物（１）［図３］および化合物（２）［図４］は、コイの腸管を強く収縮させている。
【００５０】
実施例７：モルモット回腸収縮活性の測定
モルモット回腸の収縮活性の測定は、シャンパーニュら（ＣｈａｍｐａｇｎｅＤ．Ｅ．ｅｔａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９１，１３８−１４２，１９９４）の方法に従って実施した。
【００５１】
モルモットの回腸を摘出し、その両端を木綿の糸でしばり、一端を試料添加用のチャンバー（容量５ｍｌ）に固定し、他端をトランスデューサーにつないで検定の標本とした。また、チャンバー内は常に３７℃の生理食塩水で一定に保たれており、検定すべき検体は、生理食塩水に溶解してチャンバーに添加し、収縮による張力の変化を記録した。
【００５２】
その結果を、図５および図６に示した。
図中の結果からも明らかなように、化合物（１）［図５］および化合物（２）［図６］は、それぞれ１×１０^-8 Ｍの濃度で、モルモットの回腸を強く収縮させている。
【００５３】
実施例８：前駆体ポリペプチドの全アミノ酸構造およびそれをコードする遺伝子の塩基配列決定
（１）マダコ後部唾腺ｔｏｔａｌＲＮＡの調製
マダコの後部唾腺約１ｇを液体窒素中で粉砕し、１０ｍｌのＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製）に溶解した後ホモジナイズした。室温で５分間静置した後、エッペンチューブに１ｍｌずつ分注し、２００μｌずつクロロホルムを加えて撹拌後、冷却遠心機（佐久間製作所社製）で遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）した。上層の水層をエッペンチューブに分取して，０．５ｍｌずつイソプロパノールを加え、室温で１０分静置した。冷却遠心機で遠心分離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）した後、上清を除いて１ｍｌの７５％エタノールを加えて再度遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、５分間、４℃）した。上清を除いて約１０分間風乾し、１０μｌのＤＥＰＣ−処理水を加え、６０℃で１０分間インキュベートしてＲＮＡを溶解した。以上の方法で約３ｍｇのｔｏｔａｌＲＮＡが得られた。
【００５４】
（２）ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ３’−ＲＡＣＥ
マダコの後部唾腺から単離されたペプチドの配列を基に、次の縮重プライマーを設計し、常法により合成した。
Oct-TK-M-1： 5'-AA(A/G)CCICCII(C/G)II(C/G)II(C/G)IGA(A/G)TT(C/T)AT-3'
Oct-TK-M ： 5'-GA(A/G)TT(C/T)AT(A/T/C)GGI(C/T)TIATGGG-3'
（各式中の英文字は「ヌクレオチド略語表」による（細胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」：秀潤社）；以下の各式において同じ。）
【００５５】
次に、５'／３'−ＲＡＣＥＫｉｔ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて、以下の手順でｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ３’−ＲＡＣＥを行なった。すなわち、２μｇのｔｏｔａｌＲＮＡ、４μｌのｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｕｆｆｅｒ、２μｌのｄＮＴＰｍｉｘ、１μｌのｏｌｉｇｏｄＴ−ａｎｃｈｏｒｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのＡＭＶｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ−処理水を加えて全量２０μｌにし、５５℃で６０分間インキュベートの後、６５℃で１０分間処理して１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを合成した。
【００５６】
次に、以下の条件で１ｓｔ−３’−ＲＡＣＥを行った。すなわち、５μｌの１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰｍｉｘ、３μｌのＯｃｔ−ＴＫ−Ｍ−１（１００ｐｍｏｌ／μｌ)、１μｌのＰＣＲａｎｃｈｏｒｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（登録商標）（宝酒造社製）、水を混合して全量５０μｌにし、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、４５℃３０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７２℃で７分反応させた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ２４００ｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いた。
【００５７】
続いて、１ｓｔ−ＰＣＲ産物をスピンカラム（ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｓ−４００，ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ社製）で精製し、以下の条件で２ｎｄ−３’−ＲＡＣＥを行った。すなわち、３μｌの１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰｍｉｘ、３μｌのＯｃｔ−ＴＫ−Ｍ（１００ｐｍｏｌ／μｌ)、１μｌのＰＣＲａｎｃｈｏｒｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（登録商標）（宝酒造社製）、水を混合して全量５０μｌにし、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、４５℃３０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７２℃で７分間反応させた。
反応液５μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動した結果、約３００ｂｐのＰＣＲ産物の増幅がみられた。
【００５８】
（３）ＰＣＲ産物の連結反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）
ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製し、そのうち３μｌと２μｌのＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社製）、５μｌのＬｉｇａｔｉｏｎｈｉｇｈ（東洋紡社製）を混合して１６℃で１時間連結反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行なった。
【００５９】
（４）大腸菌の形質転換
上記（３）で得た１０μｌの連結反応溶液を、コンピテントセルＣｏｍｐｅｔｅｎｔｈｉｇｈＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α（東洋紡社製）に混合し、氷中に３０分間静置した後、４２℃で５０秒間ヒートショックを行なった。氷中で２分間冷却した後、１ｍｌのＳＯＣｍｅｄｉｕｍを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、ＬＢ／Ａｍｐ．（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ）寒天培地上に３５μｌのＸ−ｇａｌを塗布した後、１０μｌの形質転換体をまいた。残りの形質転換体も１０，０００ｒｐｍで１分間遠沈して容量を１００μｌ程度に減らし、全量をＬＢ／Ａｍｐ．寒天培地にまいた。培地は３７℃で一晩培養した。
【００６０】
（５）コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲ
得られたコロニーを鋳型にして、以下の条件でコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲを行った。すなわち、大腸菌の菌体、５μｌの１０×ｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ、５μｌの２ｍＭｄＮＴＰｓ、３μｌの２５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．５μｌのＭ１３ＦＷｐｒｉｍｅｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＭ１３ＲＶｐｒｉｍｅｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのｒＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）および水を混合して全量５０μｌにし、９０℃にて１０分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間で３０サイクル、７２℃でさらに５分間反応させた。反応液５μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動した。
なお、この反応に使用したＭ１３ＦＷｐｒｉｍｅｒおよびＭ１３ＲＶｐｒｉｍｅｒは常法により合成した。その配列を以下に示す。
【００６１】
M13FW： 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3'
M13RV： 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'
【００６２】
（６）ＤＮＡシークエンス
目的のサイズ（約５００ｂｐ）のコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製して、ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてシークエンスを行った。シークエンスには、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０ＧｅｎｅｔｉｃＡｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。
得られた配列を、遺伝子解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエア開発社製）を用いて解析した結果、約５００ｂｐの部分ｃＤＮＡ配列が解明できた。
【００６３】
（７）５’−ＲＡＣＥ
部分ｃＤＮＡの塩基配列から、以下のプライマーを合成した。
TK-M-5'-1R： 5'-TTCAGGTTTCAGTTCATTGGG-3'
TK-M-5'-2R： 5'-TTTCGGTGGACCTCTCTTAC-3'
TK-M-5'-3R： 5'-TTCAGACATAGAACCAGGATG-3'
【００６４】
次に、５’／３’−ＲＡＣＥＫｉｔ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて以下の手順で５’−ＲＡＣＥを行った。まず、２μｇのｔｏｔａｌＲＮＡと１μｌのＴＫ−Ｍ−５’−１Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）を混合して、７０℃で１０分間処理した後、氷中で冷却した。そこに、４μｌのｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｕｆｆｅｒ、２μｌのｄＮＴＰｍｉｘ、１μｌのＡＭＶｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ−処理水を混合して全量２０μｌにし、５５℃で６０分間インキュベートした後、６５℃で１０分間処理して、１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを合成した。次いで、１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡをスピンカラムで精製した後、２．５μｌのｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ、２．５μｌの２ｍＭｄＡＴＰを加えて９４℃で３分間処理し、そこに１μｌのｔｅｒｍｉｎａｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（１０ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加えて３７℃で２０分間インキュベートした後、７０℃で１０分間処理してｄＡ−ｔａｉｌｅｄｃＤＮＡを合成した。
【００６５】
次いで、１ｓｔ−ＰＣＲおよび２ｎｄ−ＰＣＲを、以下の条件で行った。
▲１▼ １ｓｔ−ＰＣＲ：
５μｌのｄＡ−ｔａｉｌｅｄｃＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰｍｉｘ、１μｌのＴＫ−Ｍ−５’−２Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのｏｌｉｇｏｄＴ−ａｎｃｈｏｒｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量５０μｌにし、９４℃で５分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７２℃で７分間反応させた。
【００６６】
▲２▼ ２ｎｄ−ＰＣＲ：
３μｌのスピンカラム精製した１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰｍｉｘ、１μｌのＴＫ−Ｍ−５’−３Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのＰＣＲａｎｃｈｏｒｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量５０μｌにし、１ｓｔ−ＰＣＲと同じサイクルで行った。
【００６７】
以上の方法で得られた２ｎｄ−ＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、約３００ｂｐのバンドが確認できた。
この２ｎｄ−ＰＣＲ産物を上記の方法（３）、（４）、（５）および（６）に記載した方法にしたがってシークエンスを行なった。
【００６８】
その結果、タキキニンペプチドの前駆体ペプチドをコードするｃＤＮＡのサイズ（約４６０ｂｐ）と、その推定アミノ酸の数（８７アミノ酸残基）と配列を明らかにすることができた。そのアミノ酸配列を配列番号３に、またｃＤＮＡの配列を配列番号４に示した。
【００６９】

上記成分を常法により練合、造粒、乾燥後打錠し、１錠中有効成分として化合物（１）または化合物（２）を１０ｍｇ含有する重量１９０ｍｇの錠剤を得た。
【００７０】
【発明の効果】
本発明のマダコ神経ペプチドは、低濃度でコイの直腸をすばやく収縮させ、それに続く持続的な収縮をもたらす作用を有する神経ペプチドであり、このような効果はサブスタンスＰの平滑筋収縮に特徴的な二相の収縮に類似している。
【００７１】
また本発明のマダコ神経ペプチドは、Ｃ末端側に哺乳類において平滑筋収縮や血管拡張作用、ならびに血圧降下作用をもたらすタキキニンペプチドに特有の構造である：
−Ｐｈｅ−Ｙａａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂
（Ｙａａは、前記と同義である）
を有している。これらのことから、本発明のマダコ神経ペプチドは、タキキニンペプチドに分類される。
【００７２】
したがって本発明のマダコ神経ペプチドは、神経伝達系を解明するための生化学試薬として有用なものであり、また、分子レベルでの構造活性相関の研究を通じて、医薬および農薬等への新たなアプローチを与えるものである。
さらに、本発明によって得られるタキキニンペプチドの前駆体ポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子は、本発明のタキキニンペプチドを製造する際の重要なツールとなる。
【００７３】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例２における、本発明のペプチドである化合物（１）の最終溶出パターンを示す逆相ＨＰＬＣの展開図である。
【図２】実施例３における、本発明のペプチドである化合物（２）の最終溶出パターンを示す逆相ＨＰＬＣの展開図である。
【図３】実施例６における、本発明の化合物（１）について、コイの直腸を収縮させる活性結果を示す図であり、マダコ１匹分に相当する量の化合物（１）をチャンバーに加えたときの結果を示す。
【図４】実施例６における、本発明の化合物（２）について、コイの直腸を収縮させる活性結果を示す図であり、マダコ１匹分に相当する量の化合物（２）をチャンバーに加えた時の結果を示す。
【図５】実施例７における、本発明の化合物（１）について、モルモットの回腸を収縮させる活性結果を示す図であり、１×１０^-8 Ｍの化合物（１）をチャンバーに加えた時の結果を示す。
【図６】実施例７における、本発明の化合物（２）について、モルモットの回腸を収縮させる活性結果を示す図であり、１×１０^-8 Ｍの化合物（２）をチャンバーに加えた時の結果を示す。

Claims

次のアミノ酸配列式（１）または（２）：
Ｈ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂ （１）
Ｈ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ₂ （２）
で表わされるタキキニンペプチド。
マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）の後部唾腺から得られる請求項１に記載のタキキニンペプチド。
配列番号３に示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のアミノ酸配列式（２）に記載のタキキニンペプチドの前駆体ポリペプチド。
配列番号３に記載のポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有し、遺伝子組換え技術によって造成された形質転換細胞の培養物から得られる、請求項１に記載のアミノ酸配列式（２）に記載のタキキニンペプチドの前駆体ポリペプチド。
配列番号４に示されたポリヌクレオチドとストリンジェントの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを用いて、遺伝子組み換え技術によって製造された形質転換細胞の培養液から得られる、請求項１のアミノ酸配列式（１）または（２）に記載のタキキニンペプチドの前駆体ポリペプチド。
請求項３に記載のタキキニンペプチドの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子。
請求項６に記載の遺伝子を含んでなるベクター。
請求項７に記載のベクターにより形質転換された宿主。
請求項８に記載の宿主を培養し、または生育させ、そして該宿主からタキキニンペプチドの前駆体ポリペプチドを採取し、当該前駆体ポリペプチドからタキキニンペプチドを切り出すことを特徴とするタキキニンペプチドの製造方法。