JP2001151796A - 新規タキキニン関連ペプチドおよびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子 - Google Patents
新規タキキニン関連ペプチドおよびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子Info
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Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 マダコの脳より単離、精製されるタキキニン
関連ペプチドを提供し、分子レベルでの構造活性相関の
研究を通じて、医薬、農薬への新たなアプローチを与え
る。 【解決手段】 次のアミノ酸配列式（Ｉ）： R1−Phe−Xaa−Yaa−Zaa−Arg−NH2 （Ｉ） （R1はアミノ酸残基数５または６のペプチド、XaaはLe
u、Ile、Met、ValまたはGln、YaaはGlyまたはPro、ZaaはSer
またはThr）のタキキニン関連ペプチドであり、特に以
下のアミノ酸配列式（１）〜（３）： H−Thr−Val−Ser−Ala−Asn−Ala−Phe−Leu−Gly−Se
r−Arg−NH2 （１） H−Leu−Asn−Ala−Asn−Ser−Phe−Met−Gly−Ser−Ar
g−NH2 （２） H−Ala−Ser−Leu−His−Asn−Thr−Phe−Ile−Pro−Se
r−Arg−NH2 （３） の新規ペプチド。
関連ペプチドを提供し、分子レベルでの構造活性相関の
研究を通じて、医薬、農薬への新たなアプローチを与え
る。 【解決手段】 次のアミノ酸配列式（Ｉ）： R1−Phe−Xaa−Yaa−Zaa−Arg−NH2 （Ｉ） （R1はアミノ酸残基数５または６のペプチド、XaaはLe
u、Ile、Met、ValまたはGln、YaaはGlyまたはPro、ZaaはSer
またはThr）のタキキニン関連ペプチドであり、特に以
下のアミノ酸配列式（１）〜（３）： H−Thr−Val−Ser−Ala−Asn−Ala−Phe−Leu−Gly−Se
r−Arg−NH2 （１） H−Leu−Asn−Ala−Asn−Ser−Phe−Met−Gly−Ser−Ar
g−NH2 （２） H−Ala−Ser−Leu−His−Asn−Thr−Phe−Ile−Pro−Se
r−Arg−NH2 （３） の新規ペプチド。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は新規な神経ペプチド
に関し、さらに詳細には、マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ ｖ
ｕｌｇａｒｉｓ）の脳から得られる、軟体動物の心臓の
拍動を増強する活性を有する新規タキキニン関連ペプチ
ド、およびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコ
ードする遺伝子に関する。
に関し、さらに詳細には、マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ ｖ
ｕｌｇａｒｉｓ）の脳から得られる、軟体動物の心臓の
拍動を増強する活性を有する新規タキキニン関連ペプチ
ド、およびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコ
ードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術】無脊椎動物は、神経系の発達に伴って、
神経内分泌系が発達しており、様々な内因性ペプチドが
神経伝達物質、神経修飾物質または神経ホルモンとして
働いていることが知られている。
神経内分泌系が発達しており、様々な内因性ペプチドが
神経伝達物質、神経修飾物質または神経ホルモンとして
働いていることが知られている。
【０００３】また、軟体動物の神経系は、一般に高等動
物に比べて単純であるため、情報処理の機構の解明に利
用することができる。特に、軟体動物より得られた情報
処理機構に関する知見が、細胞下レベルにおける機構に
関するものであれば、高等動物の神経系における情報処
理機構の解明に、その知見が一般化できると考えられる
ことから、軟体動物の神経伝達物質の探索が精力的に行
われている。
物に比べて単純であるため、情報処理の機構の解明に利
用することができる。特に、軟体動物より得られた情報
処理機構に関する知見が、細胞下レベルにおける機構に
関するものであれば、高等動物の神経系における情報処
理機構の解明に、その知見が一般化できると考えられる
ことから、軟体動物の神経伝達物質の探索が精力的に行
われている。
【０００４】例えば、特開平１−２２１３９２号公報に
はムラサキイガイより得られる内因性神経ペプチドが開
示されている。また、特開平２−２８６６９６号公報に
はアフリカマイマイの神経節から得られる内在性神経伝
達物質として、Ｄ−アミノ酸を含む新規ペプチドが開示
されており、さらに特開平６−５６８９０号公報にはハ
ンガリー産マイマイの神経節から得られる神経ペプチド
が開示されている。
はムラサキイガイより得られる内因性神経ペプチドが開
示されている。また、特開平２−２８６６９６号公報に
はアフリカマイマイの神経節から得られる内在性神経伝
達物質として、Ｄ−アミノ酸を含む新規ペプチドが開示
されており、さらに特開平６−５６８９０号公報にはハ
ンガリー産マイマイの神経節から得られる神経ペプチド
が開示されている。
【０００５】この他、軟体動物からは、Ｈ−Ａｌａ−Ｐ
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨ2、ミオモジュリン−ＣＡ
ＲＰ、心筋作動性小ペプチド（ＳＣＰ）、バッカリンな
どの多数の神経ペプチドが単離、同定されている（Ｍ．
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａｎｄＹ．Ｍｕｎｅｏｋａ，Ｚｏ
ｏｌ．Ｓｃｉ．，７，８０１，１９９０；Ｙ．Ｍｕｎｅ
ｏｋａ ａｎｄ Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｅｘｐｅｒ
ｉｅｎｔｉａ ４８，４４８，１９９２；宗岡洋二郎、
日本農薬学会誌 １８，Ｓ１９１，１９９３；Ｙ．Ｍｕ
ｎｅｏｋａ，Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．Ｋｏｂａｙ
ａｓｈｉ，“Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｃｏｍｐ
ａｒａｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ”，Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏ
ｆ Ｃａｎａｄａ １９９４，ｐ１０９）。
ｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−ＮＨ2、ミオモジュリン−ＣＡ
ＲＰ、心筋作動性小ペプチド（ＳＣＰ）、バッカリンな
どの多数の神経ペプチドが単離、同定されている（Ｍ．
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ａｎｄＹ．Ｍｕｎｅｏｋａ，Ｚｏ
ｏｌ．Ｓｃｉ．，７，８０１，１９９０；Ｙ．Ｍｕｎｅ
ｏｋａ ａｎｄ Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｅｘｐｅｒ
ｉｅｎｔｉａ ４８，４４８，１９９２；宗岡洋二郎、
日本農薬学会誌 １８，Ｓ１９１，１９９３；Ｙ．Ｍｕ
ｎｅｏｋａ，Ｔ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｍ．Ｋｏｂａｙ
ａｓｈｉ，“Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ｃｏｍｐ
ａｒａｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ”，Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏ
ｆ Ｃａｎａｄａ １９９４，ｐ１０９）。
【０００６】さらに、外洋性ジャコウダコ（Ｅｌｅｄｏ
ｎｅ ｍｏｓｃｈａｔａおよびＥ．ａｌｄｒｏｖａｎｄ
ｉ）の後部唾腺からエレドイシン（Ｅｒｓｐａｍｅｒ，
Ｖ．＆ Ａｎａｓｔａｓｉ，Ａ．：Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔ
ｉａ，１８，５８，１９６２）が単離され、このペプチ
ドがモルモットの回腸を素早く収縮させる作用を有する
ことから、「タキキニン」という用語が定義された。そ
の後、エレドイシンの構造がもとになって、サブスタン
スＰの構造が明らかにされ、今日では、タキキニンは、
そのＣ末端に共通アミノ酸残基として：−Ｐｈｅ−Ａａ
ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ2をもち、Ａａａは
芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｙｒ）または分枝アミノ酸
（Ｖａｌ，Ｉｌｅ）であり、哺乳類において腸管収縮、
血圧降下、唾液分泌促進作用などを示す生理活性ペプチ
ドの総称とされている。そして、タキキニンには、サブ
スタンスＰ（Ｐ物質）、エレドイシン、フィザラミン、
ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、カシニンなどが
含まれる（生物学辞典（第４版）、岩波書店、１９９
７）。
ｎｅ ｍｏｓｃｈａｔａおよびＥ．ａｌｄｒｏｖａｎｄ
ｉ）の後部唾腺からエレドイシン（Ｅｒｓｐａｍｅｒ，
Ｖ．＆ Ａｎａｓｔａｓｉ，Ａ．：Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔ
ｉａ，１８，５８，１９６２）が単離され、このペプチ
ドがモルモットの回腸を素早く収縮させる作用を有する
ことから、「タキキニン」という用語が定義された。そ
の後、エレドイシンの構造がもとになって、サブスタン
スＰの構造が明らかにされ、今日では、タキキニンは、
そのＣ末端に共通アミノ酸残基として：−Ｐｈｅ−Ａａ
ａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ2をもち、Ａａａは
芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｙｒ）または分枝アミノ酸
（Ｖａｌ，Ｉｌｅ）であり、哺乳類において腸管収縮、
血圧降下、唾液分泌促進作用などを示す生理活性ペプチ
ドの総称とされている。そして、タキキニンには、サブ
スタンスＰ（Ｐ物質）、エレドイシン、フィザラミン、
ニューロキニンＡ、ニューロキニンＢ、カシニンなどが
含まれる（生物学辞典（第４版）、岩波書店、１９９
７）。
【０００７】一方、タキキニンに関連するペプチドが昆
虫より単離されており、ローカスタタキキニンとして報
告されている（Ｓｃｈｏｏｆｓ，Ｌ．，Ｈｏｌｍａｎ，
Ｇ．Ｍ．，Ｈａｙｅｓ，Ｔ．Ｋ．，Ｎａｃｈｍａｎ，
Ｒ．Ｊ．＆ Ｄｅ Ｌｏｏｆ，Ａ．：ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ，２６１，３９７，１９９０）。また、特開平
６−３２７９８号公報には、ユムシ由来のタキキニン関
連神経ペプチドが開示されている。そして、これらのタ
キキニン関連ペプチドは、昆虫の後腸の収縮作用がある
ことが知られている（Ｎａｓｓｅｌ．Ｄ．Ｒ：Ｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ，２０，１４１，１９９９）。
虫より単離されており、ローカスタタキキニンとして報
告されている（Ｓｃｈｏｏｆｓ，Ｌ．，Ｈｏｌｍａｎ，
Ｇ．Ｍ．，Ｈａｙｅｓ，Ｔ．Ｋ．，Ｎａｃｈｍａｎ，
Ｒ．Ｊ．＆ Ｄｅ Ｌｏｏｆ，Ａ．：ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ，２６１，３９７，１９９０）。また、特開平
６−３２７９８号公報には、ユムシ由来のタキキニン関
連神経ペプチドが開示されている。そして、これらのタ
キキニン関連ペプチドは、昆虫の後腸の収縮作用がある
ことが知られている（Ｎａｓｓｅｌ．Ｄ．Ｒ：Ｐｅｐｔ
ｉｄｅｓ，２０，１４１，１９９９）。
【０００８】こうしたタキキニンおよびタキキニン関連
ペプチドの研究を通じ、脊椎動物に作用するタキキニン
と、無脊椎動物に作用するタキキニン関連ペプチドとが
あることが明らかにされ、これらの構造活性相関の研究
も行われている。その研究結果から、ペプチド中のアミ
ノ酸残基の相違が、重要な要素となっていることが明ら
かにされ、Ｃ末端のアミノ酸がＭｅｔ残基か、あるいは
Ａｒｇ残基かの違いにより、脊椎動物に作用するもの
と、無脊椎動物に作用するものとに分類されることが判
明した。すなわち、タキキニン類は、Ｍｅｔ型タキキニ
ンと、Ａｒｇ型タキキニンに分けることができると考え
られている。
ペプチドの研究を通じ、脊椎動物に作用するタキキニン
と、無脊椎動物に作用するタキキニン関連ペプチドとが
あることが明らかにされ、これらの構造活性相関の研究
も行われている。その研究結果から、ペプチド中のアミ
ノ酸残基の相違が、重要な要素となっていることが明ら
かにされ、Ｃ末端のアミノ酸がＭｅｔ残基か、あるいは
Ａｒｇ残基かの違いにより、脊椎動物に作用するもの
と、無脊椎動物に作用するものとに分類されることが判
明した。すなわち、タキキニン類は、Ｍｅｔ型タキキニ
ンと、Ａｒｇ型タキキニンに分けることができると考え
られている。
【０００９】しかしながら、これらタキキニン関連ペプ
チドについての構造−活性相関や、種特異性を明らかに
し、高等動物の神経系にも一般化できる情報を得るため
には、さらに多くの動物種から、タキキニン関連ペプチ
ドやその前駆体ペプチドを見出すことが必要とされてい
る。
チドについての構造−活性相関や、種特異性を明らかに
し、高等動物の神経系にも一般化できる情報を得るため
には、さらに多くの動物種から、タキキニン関連ペプチ
ドやその前駆体ペプチドを見出すことが必要とされてい
る。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】したがって本発明は、
無脊椎動物から新たな無脊椎動物型タキキニン関連ペプ
チドを見出し、その構造を明らかにするとともに、その
タキキニン関連ペプチドを有する動物自身の中での作用
や、他の無脊椎動物に対する作用を解明し、高等動物の
神経系における情報処理機構の解明用の試薬や、農薬ま
たは医薬品開発における基礎化合物として利用可能な新
規タキキニン関連ペプチドを得ることを課題とする。さ
らに本発明は、こうしたタキキニン関連ペプチドの前駆
体ポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子を明らか
にするとともに、かかるタキキニン関連ペプチドを製造
する方法を提供することを課題とする。
無脊椎動物から新たな無脊椎動物型タキキニン関連ペプ
チドを見出し、その構造を明らかにするとともに、その
タキキニン関連ペプチドを有する動物自身の中での作用
や、他の無脊椎動物に対する作用を解明し、高等動物の
神経系における情報処理機構の解明用の試薬や、農薬ま
たは医薬品開発における基礎化合物として利用可能な新
規タキキニン関連ペプチドを得ることを課題とする。さ
らに本発明は、こうしたタキキニン関連ペプチドの前駆
体ポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子を明らか
にするとともに、かかるタキキニン関連ペプチドを製造
する方法を提供することを課題とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】無脊椎動物の代表である
軟体動物のうち、頭足類に分類されるタコ類は、高度に
発達した脳を持ち、他の軟体動物に比べて運動機能や知
覚機能において格段の進化を遂げている。特に循環系
は、軟体動物では唯一、閉鎖血管であり、脳で作られた
物質を血管により末梢組織まで送っていると考えられ
る。
軟体動物のうち、頭足類に分類されるタコ類は、高度に
発達した脳を持ち、他の軟体動物に比べて運動機能や知
覚機能において格段の進化を遂げている。特に循環系
は、軟体動物では唯一、閉鎖血管であり、脳で作られた
物質を血管により末梢組織まで送っていると考えられ
る。
【００１２】本発明者らは、これまでにマダコ（Ｏｃｔ
ｏｐｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の後部唾腺より脊椎動物
型タキキニンを見出し、その生理作用を明らかにしてい
るが、タコ類には無脊椎動物型のタキキニン関連ペプチ
ドも存在するのではないかと考えた。そして今回、本発
明者らはタコ類から新たな神経ペプチドを得るべく検討
を行い、マダコの脳から、その心臓に対する活性を指標
に、マダコの無脊椎動物型タキキニン関連ペプチドを単
離・精製し、本発明を完成した。
ｏｐｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の後部唾腺より脊椎動物
型タキキニンを見出し、その生理作用を明らかにしてい
るが、タコ類には無脊椎動物型のタキキニン関連ペプチ
ドも存在するのではないかと考えた。そして今回、本発
明者らはタコ類から新たな神経ペプチドを得るべく検討
を行い、マダコの脳から、その心臓に対する活性を指標
に、マダコの無脊椎動物型タキキニン関連ペプチドを単
離・精製し、本発明を完成した。
【００１３】また本発明者らは、かくして得られたタキ
キニン関連ペプチドの前駆体ポリペプチド、およびそれ
をコードする遺伝子を明らかにするとともに、かかる遺
伝子を用いた前駆体ポリペプチド、およびタキキニン関
連ペプチドを製造する方法を完成させるに至った。
キニン関連ペプチドの前駆体ポリペプチド、およびそれ
をコードする遺伝子を明らかにするとともに、かかる遺
伝子を用いた前駆体ポリペプチド、およびタキキニン関
連ペプチドを製造する方法を完成させるに至った。
【００１４】したがって、本発明は、次のアミノ酸配列
式（Ｉ）： Ｒ1−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （Ｉ） （式中、Ｒ1はアミノ酸残基数５または６のペプチドを
表わし、ＸａａはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌまた
はＧｌｎを表わし、ＹａａはＧｌｙまたはＰｒｏを表わ
し、ＺａａはＳｅｒまたはＴｈｒを表わす）で表わされ
るタキキニン関連ペプチドを提供する。
式（Ｉ）： Ｒ1−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （Ｉ） （式中、Ｒ1はアミノ酸残基数５または６のペプチドを
表わし、ＸａａはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌまた
はＧｌｎを表わし、ＹａａはＧｌｙまたはＰｒｏを表わ
し、ＺａａはＳｅｒまたはＴｈｒを表わす）で表わされ
るタキキニン関連ペプチドを提供する。
【００１５】より具体的な態様として、本発明は、次の
アミノ酸配列式（ＩＩ）： Ｒ2−Ａａａ−Ｂａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （ ＩＩ） （式中、Ｒ2はアミノ酸残基数３または４のペプチドを
表わし、ＡａａはＡｓｎ、ＴｙｒまたはＬｅｕを表わ
し、ＢａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｓｐを表
わし、ＸａａはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌまたは
Ｇｌｎを表わし、ＹａａはＧｌｙまたはＰｒｏを表わ
し、ＺａａはＳｅｒまたはＴｈｒを表わす）で表わされ
るタキキニン関連ペプチドを提供する。
アミノ酸配列式（ＩＩ）： Ｒ2−Ａａａ−Ｂａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （ ＩＩ） （式中、Ｒ2はアミノ酸残基数３または４のペプチドを
表わし、ＡａａはＡｓｎ、ＴｙｒまたはＬｅｕを表わ
し、ＢａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｓｐを表
わし、ＸａａはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌまたは
Ｇｌｎを表わし、ＹａａはＧｌｙまたはＰｒｏを表わ
し、ＺａａはＳｅｒまたはＴｈｒを表わす）で表わされ
るタキキニン関連ペプチドを提供する。
【００１６】すなわち本発明者らは、無脊椎動物型のタ
キキニン関連ペプチドを得るべく、マダコ（Ｏｃｔｏｐ
ｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の脳から、マダコの心臓に対
する活性を指標に検索を行い、その結果、上記アミノ酸
配列式（Ｉ）または（ＩＩ）のなかでも、次のアミノ酸
配列式（１）、（２）および（３）：
キキニン関連ペプチドを得るべく、マダコ（Ｏｃｔｏｐ
ｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の脳から、マダコの心臓に対
する活性を指標に検索を行い、その結果、上記アミノ酸
配列式（Ｉ）または（ＩＩ）のなかでも、次のアミノ酸
配列式（１）、（２）および（３）：
【００１７】 Ｈ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （１） （以下、このペプチドを化合物（１）と称する。）
【００１８】 Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （２） （以下、このペプチドを化合物（２）と称する。）
【００１９】 Ｈ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒ ｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （３） （以下、このペプチドを化合物（３）と称する。）
【００２０】で表されるペプチドを分離、精製し、その
化学構造を決定すると共に、全合成によりその構造およ
び無脊椎動物に対する生理活性を確認した。
化学構造を決定すると共に、全合成によりその構造およ
び無脊椎動物に対する生理活性を確認した。
【００２１】さらに本発明者らは、上記のアミノ酸配列
をもとにプライマーを作成し、マダコの脳から調製した
ｔｏｔａｌ ＲＮＡに対して、逆転写ポリメラーゼ連鎖
反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法などを用いた遺伝子配列の解析
手段を組み合わせることにより、タキキニン関連ペプチ
ドの前駆体であるポリペプチドの全一次アミノ酸配列
は、配列番号４で示されることを明らかにした。また、
当該前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番
号５に示す塩基配列を有するものであることを明らかに
した。
をもとにプライマーを作成し、マダコの脳から調製した
ｔｏｔａｌ ＲＮＡに対して、逆転写ポリメラーゼ連鎖
反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法などを用いた遺伝子配列の解析
手段を組み合わせることにより、タキキニン関連ペプチ
ドの前駆体であるポリペプチドの全一次アミノ酸配列
は、配列番号４で示されることを明らかにした。また、
当該前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子は、配列番
号５に示す塩基配列を有するものであることを明らかに
した。
【００２２】かくして決定されたタキキニン関連ペプチ
ドの前駆体ポリペプチドの全一次アミノ酸配列をベース
にし、タキキニン関連ペプチドと推定される部分構造の
検索を行ったところ、前駆体ポリペプチドの中には、前
記アミノ酸配列式（１）〜（３）以外に、Ｃ末端がＡｒ
ｇ残基であるタキキニン関連ペプチドに該当する、次式
アミノ酸配列式（４）、（５）および（６）：
ドの前駆体ポリペプチドの全一次アミノ酸配列をベース
にし、タキキニン関連ペプチドと推定される部分構造の
検索を行ったところ、前駆体ポリペプチドの中には、前
記アミノ酸配列式（１）〜（３）以外に、Ｃ末端がＡｒ
ｇ残基であるタキキニン関連ペプチドに該当する、次式
アミノ酸配列式（４）、（５）および（６）：
【００２３】 Ｈ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （４） （以下、このペプチドを化合物（４）と称する。）
【００２４】 Ｈ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （５） （以下、このペプチドを化合物（５）と称する。）
【００２５】 Ｈ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （６） （以下、このペプチドを化合物（６）と称する。）
【００２６】で表わされるペプチドが含まれていること
が明らかになった。そこでこれらペプチドの前駆体の切
り出しおよびＣ末端のアミド化を行い、これらペプチド
の生理活性を検討したところ、先の化合物（１）〜
（３）のタキキニン関連ペプチドと同様の生理活性を有
するものであることを確認した。
が明らかになった。そこでこれらペプチドの前駆体の切
り出しおよびＣ末端のアミド化を行い、これらペプチド
の生理活性を検討したところ、先の化合物（１）〜
（３）のタキキニン関連ペプチドと同様の生理活性を有
するものであることを確認した。
【００２７】さらに本発明者らは、当該前駆体ポリペプ
チドの全一次アミノ酸配列について検討を加え、Ｃ末端
がＡｒｇ残基以外にＬｙｓ残基となった次式アミノ酸配
列式（７）：
チドの全一次アミノ酸配列について検討を加え、Ｃ末端
がＡｒｇ残基以外にＬｙｓ残基となった次式アミノ酸配
列式（７）：
【００２８】 Ｈ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒ ｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＮＨ2 （７） （以下、このペプチドを化合物（７）と称する。）
【００２９】で表わされるペプチドが、活性の強さは若
干低下するもののタキキニン関連ペプチドと同様の生理
活性を有するペプチドであることを確認した。
干低下するもののタキキニン関連ペプチドと同様の生理
活性を有するペプチドであることを確認した。
【００３０】したがって、本発明は別の態様として、配
列番号４で表わされるアミノ酸配列または、その一部が
欠失もしくは置換したアミノ酸配列、あるいは該アミノ
酸配列またはその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸
配列に１個から複数個のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列を有する、タキキニン関連ペプチドの前駆体ポリペプ
チドを提供する。
列番号４で表わされるアミノ酸配列または、その一部が
欠失もしくは置換したアミノ酸配列、あるいは該アミノ
酸配列またはその一部が欠失もしくは置換したアミノ酸
配列に１個から複数個のアミノ酸が付加したアミノ酸配
列を有する、タキキニン関連ペプチドの前駆体ポリペプ
チドを提供する。
【００３１】さらに別の態様として、本発明は、かかる
タキキニン関連ペプチドの前駆体ポリペプチド、および
タキキニン関連ペプチドの製造方法を提供し、また、別
の態様としては、かかるタキキニン関連ペプチドの前駆
体ポリペプチドをコードする遺伝子、およびこの遺伝子
を用いた前駆体ポリペプチド、およびタキキニン関連ペ
プチドの製造方法を提供する。
タキキニン関連ペプチドの前駆体ポリペプチド、および
タキキニン関連ペプチドの製造方法を提供し、また、別
の態様としては、かかるタキキニン関連ペプチドの前駆
体ポリペプチドをコードする遺伝子、およびこの遺伝子
を用いた前駆体ポリペプチド、およびタキキニン関連ペ
プチドの製造方法を提供する。
【００３２】
【発明の実施の形態】本発明が提供するこれらの新規ペ
プチドは、タコの心臓の拍動を増強させるタキキニン関
連ペプチドであり、マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ ｖｕｌｇ
ａｒｉｓ）から、例えば以下の方法により単離、精製す
ることができる。
プチドは、タコの心臓の拍動を増強させるタキキニン関
連ペプチドであり、マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ ｖｕｌｇ
ａｒｉｓ）から、例えば以下の方法により単離、精製す
ることができる。
【００３３】すなわち、マダコの脳を熱水抽出し、その
抽出液に酢酸を３％濃度となるように加え、冷却後遠心
分離して粗抽出物を得る。この粗抽出物を、Ｃ１８カー
トリッジ（例えばＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ
Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ：ウォーターズ社製）に
吸着させた後、０．１％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦ
Ａと略す）を含む６０％メタノールで溶出してペプチド
画分を分取し、この画分をイオン交換クロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィー等に付して、目的とするペ
プチドを分離、精製することができる。
抽出液に酢酸を３％濃度となるように加え、冷却後遠心
分離して粗抽出物を得る。この粗抽出物を、Ｃ１８カー
トリッジ（例えばＳｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａｃ
Ｃ１８ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ：ウォーターズ社製）に
吸着させた後、０．１％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦ
Ａと略す）を含む６０％メタノールで溶出してペプチド
画分を分取し、この画分をイオン交換クロマトグラフィ
ー、逆相クロマトグラフィー等に付して、目的とするペ
プチドを分離、精製することができる。
【００３４】また、本発明のペプチドはアミノ酸残基数
１０または１１残基のペプチドであるため、通常のペプ
チド合成機（例えば、ＰＥバイオシステムズジャパン社
製ペプチド合成機４３３Ａ型）を用いた固相合成法や、
通常の有機合成化学的手法により容易に合成することが
できる。これらの方法で得られた粗ペプチドは、必要で
あれば逆相高速液体クロマトグラフィーや結晶化等の通
常の精製手法によって、精製することができる。
１０または１１残基のペプチドであるため、通常のペプ
チド合成機（例えば、ＰＥバイオシステムズジャパン社
製ペプチド合成機４３３Ａ型）を用いた固相合成法や、
通常の有機合成化学的手法により容易に合成することが
できる。これらの方法で得られた粗ペプチドは、必要で
あれば逆相高速液体クロマトグラフィーや結晶化等の通
常の精製手法によって、精製することができる。
【００３５】一方、タキキニン関連ペプチドの前駆体ポ
リペプチドのアミノ酸配列、および当該ポリペプチドを
コードする遺伝子の塩基配列は、次のようにして決定す
ることができる。すなわち、上記により得られたタキキ
ニン関連ペプチドのアミノ酸配列をもとにプライマーを
作成し、マダコの脳より調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡに
対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を
行い、約６００塩基対の遺伝子配列を解明し、続いて
５’−ＲＡＣＥ法、３’−ＲＡＣＥ法を用いて５’末端
および３’末端側の遺伝子配列を解明することができ
る。本発明においては、この方法によりマダコのタキキ
ニン関連ペプチドの前駆体ポリペプチドは、配列番号４
で示されるアミノ酸配列を有するものであること、ま
た、当該前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子は、配
列番号５に示す塩基配列を有するものであることを明ら
かにした。
リペプチドのアミノ酸配列、および当該ポリペプチドを
コードする遺伝子の塩基配列は、次のようにして決定す
ることができる。すなわち、上記により得られたタキキ
ニン関連ペプチドのアミノ酸配列をもとにプライマーを
作成し、マダコの脳より調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡに
対して逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を
行い、約６００塩基対の遺伝子配列を解明し、続いて
５’−ＲＡＣＥ法、３’−ＲＡＣＥ法を用いて５’末端
および３’末端側の遺伝子配列を解明することができ
る。本発明においては、この方法によりマダコのタキキ
ニン関連ペプチドの前駆体ポリペプチドは、配列番号４
で示されるアミノ酸配列を有するものであること、ま
た、当該前駆体ポリペプチドをコードする遺伝子は、配
列番号５に示す塩基配列を有するものであることを明ら
かにした。
【００３６】したがって、本発明のタキキニン関連ペプ
チドの前駆体ポリペプチドおよびタキキニン関連ペプチ
ドは、遺伝子組換法によっても製造することができる。
すなわち、遺伝子組換法によって製造を行う場合は、例
えば、配列番号５で示される遺伝子を組み込んだベクタ
ーを作成し、当該ベクターによって宿主の形質転換を行
った後、該宿主を培養または成育させ、該宿主から目的
の前駆体ポリペプチドを単離、精製すれば良い。そし
て、前駆体ポリペプチドから目的のタキキニン関連ペプ
チドを得るには、前駆体ポリペプチドから酵素などを用
いて切り出し（プロセッシング）を行った後、Ｃ末端を
アミド化酵素など用いて修飾（アミド化）し、さらに必
要に応じて単離、精製すれば良い。
チドの前駆体ポリペプチドおよびタキキニン関連ペプチ
ドは、遺伝子組換法によっても製造することができる。
すなわち、遺伝子組換法によって製造を行う場合は、例
えば、配列番号５で示される遺伝子を組み込んだベクタ
ーを作成し、当該ベクターによって宿主の形質転換を行
った後、該宿主を培養または成育させ、該宿主から目的
の前駆体ポリペプチドを単離、精製すれば良い。そし
て、前駆体ポリペプチドから目的のタキキニン関連ペプ
チドを得るには、前駆体ポリペプチドから酵素などを用
いて切り出し（プロセッシング）を行った後、Ｃ末端を
アミド化酵素など用いて修飾（アミド化）し、さらに必
要に応じて単離、精製すれば良い。
【００３７】
【作用】本発明が提供するペプチドは、タキキニン関連
の神経ペプチドであり、神経伝達系を解明するための生
化学試薬として有用であるにとどまらず、医薬および農
薬等への開発に、新たなアプローチを与える化合物とし
て利用し得るものである。
の神経ペプチドであり、神経伝達系を解明するための生
化学試薬として有用であるにとどまらず、医薬および農
薬等への開発に、新たなアプローチを与える化合物とし
て利用し得るものである。
【００３８】例えば、本発明のペプチドを有効成分とす
る医薬としては、製剤学的に慣用されている賦形剤と共
にカプセル剤、錠剤、注射剤等の適当な剤形で、経口的
または非経口的に投与することができる。具体的には、
本発明のペプチドを、乳糖、デンプンまたはその誘導
体、セルロース誘導体等の賦形剤と混合したのち、ゼラ
チンカプセルに充填することによりカプセル剤を調製す
ることができる。
る医薬としては、製剤学的に慣用されている賦形剤と共
にカプセル剤、錠剤、注射剤等の適当な剤形で、経口的
または非経口的に投与することができる。具体的には、
本発明のペプチドを、乳糖、デンプンまたはその誘導
体、セルロース誘導体等の賦形剤と混合したのち、ゼラ
チンカプセルに充填することによりカプセル剤を調製す
ることができる。
【００３９】また錠剤は、上記の賦形剤の他に、カルボ
キシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸、アラビ
アゴム等の結合剤と水を加えて練合し、必要により顆粒
として造粒したのち、さらにタルク、ステアリン酸マグ
ネシウム等の滑沢剤を添加して、通常の圧縮打錠機を用
いて錠剤に調製することができる。
キシメチルセルロースナトリウム、アルギン酸、アラビ
アゴム等の結合剤と水を加えて練合し、必要により顆粒
として造粒したのち、さらにタルク、ステアリン酸マグ
ネシウム等の滑沢剤を添加して、通常の圧縮打錠機を用
いて錠剤に調製することができる。
【００４０】さらに、非経口投与に際しては、本発明の
ペプチドを溶解補助剤と共に滅菌蒸留水あるいは滅菌生
理食塩水に溶解し、アンプルに封入して注射用製剤とす
ることができる。この場合、必要により安定化剤、緩衝
物質等を含有させてもよい。また、粉末のままバイアル
充填し、滅菌蒸留水により用時溶解型の製剤とすること
もできる。これらの非経口投与製剤は、静脈内投与、あ
るいは点滴静注により投与することができる。
ペプチドを溶解補助剤と共に滅菌蒸留水あるいは滅菌生
理食塩水に溶解し、アンプルに封入して注射用製剤とす
ることができる。この場合、必要により安定化剤、緩衝
物質等を含有させてもよい。また、粉末のままバイアル
充填し、滅菌蒸留水により用時溶解型の製剤とすること
もできる。これらの非経口投与製剤は、静脈内投与、あ
るいは点滴静注により投与することができる。
【００４１】なお本発明のペプチドを有効成分とする場
合の投与量は、種々の要因、例えば治療すべき病態、患
者の症状、重篤度、患者の年齢、さらには投与経路等を
考慮して、適宜設定すればよい。一般的に経口投与の場
合には、有効成分として通常０．１〜１０００ｍｇ／日
／ヒト、好ましくは１〜５００ｍｇ／日／ヒトの範囲内
で、また非経口投与の場合には、経口投与の場合におけ
る投与量の約１／１００〜１／２程度の範囲内で適宜選
択し投与することができる。
合の投与量は、種々の要因、例えば治療すべき病態、患
者の症状、重篤度、患者の年齢、さらには投与経路等を
考慮して、適宜設定すればよい。一般的に経口投与の場
合には、有効成分として通常０．１〜１０００ｍｇ／日
／ヒト、好ましくは１〜５００ｍｇ／日／ヒトの範囲内
で、また非経口投与の場合には、経口投与の場合におけ
る投与量の約１／１００〜１／２程度の範囲内で適宜選
択し投与することができる。
【００４２】
【実施例】次に実施例によって本発明をさらに説明する
が、本発明の範囲はこれのみに限定されるものではな
い。
が、本発明の範囲はこれのみに限定されるものではな
い。
【００４３】実施例１：マダコからタコの心臓の拍動を
増強させるペプチド類の分離 （a）：粗抽出 マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）１００匹
から脳（視葉を含む）を摘出し、液体窒素にて凍結保存
した。凍結した摘出組織（１８０ｇ）を沸騰した蒸留水
９００ｍｌ中に入れ、１０分間煮沸した。放冷後、酢酸
を３％濃度になるように加え、ホモジナイズした後、４
℃で３０分間、１２，０００×ｇで遠心分離して、上清
を得た。一方、沈殿物に２００ｍｌの３％酢酸を加え、
再度ホモジナイズした後、同じ操作条件で遠心分離をし
て上清を得た。集めた上清を、減圧下に約２００ｍｌに
なるまで濃縮し、粗抽出物とした。
増強させるペプチド類の分離 （a）：粗抽出 マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）１００匹
から脳（視葉を含む）を摘出し、液体窒素にて凍結保存
した。凍結した摘出組織（１８０ｇ）を沸騰した蒸留水
９００ｍｌ中に入れ、１０分間煮沸した。放冷後、酢酸
を３％濃度になるように加え、ホモジナイズした後、４
℃で３０分間、１２，０００×ｇで遠心分離して、上清
を得た。一方、沈殿物に２００ｍｌの３％酢酸を加え、
再度ホモジナイズした後、同じ操作条件で遠心分離をし
て上清を得た。集めた上清を、減圧下に約２００ｍｌに
なるまで濃縮し、粗抽出物とした。
【００４４】（ｂ）：Ｃ１８カートリッジへの吸着 （ａ）で得られた粗抽出物に、６Ｎ−ＨＣｌを５ｍｌ加
え、４℃で３０分間、１２，０００×ｇで遠心分離し
た。得られた上清を、Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａ
ｃ Ｃ１８カートリッジ（１０ｇ、３５ｃｃ、ウォータ
ーズ社製）に通した。カートリッジを０．１％ＴＦＡ２
００ｍｌで洗浄した後、保持物質を６０％メタノール／
０．１％ＴＦＡ１００ｍｌで溶出し、溶出液を減圧濃縮
後、凍結乾燥させ、乾燥物０．１５０ｇを得た。
え、４℃で３０分間、１２，０００×ｇで遠心分離し
た。得られた上清を、Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｖａ
ｃ Ｃ１８カートリッジ（１０ｇ、３５ｃｃ、ウォータ
ーズ社製）に通した。カートリッジを０．１％ＴＦＡ２
００ｍｌで洗浄した後、保持物質を６０％メタノール／
０．１％ＴＦＡ１００ｍｌで溶出し、溶出液を減圧濃縮
後、凍結乾燥させ、乾燥物０．１５０ｇを得た。
【００４５】（ｃ）逆相高速液体カラムクロマトグラフ
ィー（１） （ｂ）で得られた乾燥物を、Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ
Ｃ１８ ＵＧ８０（５μｍ、Φ１０×２５０ｍｍ、資生
堂製）を用いた逆相高速液体カラムクロマトグラフィー
（逆相ＨＰＬＣ）に付し、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、６０分間で０％から
６０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。２
１５ｎｍの紫外吸収のモニターにより、３ｍｌずつに分
画した。
ィー（１） （ｂ）で得られた乾燥物を、Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ
Ｃ１８ ＵＧ８０（５μｍ、Φ１０×２５０ｍｍ、資生
堂製）を用いた逆相高速液体カラムクロマトグラフィー
（逆相ＨＰＬＣ）に付し、流速１．５ｍｌ／ｍｉｎで、
０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、６０分間で０％から
６０％のアセトニトリルの直線濃度勾配で溶出した。２
１５ｎｍの紫外吸収のモニターにより、３ｍｌずつに分
画した。
【００４６】各フラクションを、後記する実施例７に示
す方法に従って生物検定に付したところ、アセトニトリ
ル２６〜３０％濃度で溶出される画分に、マダコの心臓
に対する心拍動増強活性が見られた。
す方法に従って生物検定に付したところ、アセトニトリ
ル２６〜３０％濃度で溶出される画分に、マダコの心臓
に対する心拍動増強活性が見られた。
【００４７】（ｄ）陽イオン交換カラムクロマトグラフ
ィー （ｃ）で得られた活性画分を、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５
ＰＷ（１０μｍ、Φ７．５×７５ｍｍ、東ソー製）を用
いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（陽イオン
交換ＨＰＬＣ）に付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、６０分間で０Ｍ
から０．６ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。
ィー （ｃ）で得られた活性画分を、ＴＳＫｇｅｌ ＳＰ−５
ＰＷ（１０μｍ、Φ７．５×７５ｍｍ、東ソー製）を用
いた陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（陽イオン
交換ＨＰＬＣ）に付し、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、１
０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、６０分間で０Ｍ
から０．６ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。
【００４８】２ｍｌずつの画分を生物検定したところ、
０．０８ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された画分（以下、画
分Ａという）、０．１２ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された
画分（以下、画分Ｂという）および０．１６ＭのＮａＣ
ｌ濃度で溶出された画分（以下、画分Ｃという）に活性
が見られた。
０．０８ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された画分（以下、画
分Ａという）、０．１２ＭのＮａＣｌ濃度で溶出された
画分（以下、画分Ｂという）および０．１６ＭのＮａＣ
ｌ濃度で溶出された画分（以下、画分Ｃという）に活性
が見られた。
【００４９】実施例２：活性画分からのペプチド類の精
製（その１：活性画分Ａからの精製） 実施例１の分離操作により得られた活性画分Ａについ
て、更に以下の操作を行い、ペプチド類を精製した。
製（その１：活性画分Ａからの精製） 実施例１の分離操作により得られた活性画分Ａについ
て、更に以下の操作を行い、ペプチド類を精製した。
【００５０】（ａ）逆相ＨＰＬＣ（１） 実施例１の（ｄ）で得られた活性画分Ａを、Ｃａｐｃｅ
ｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１
５０ｍｍ、資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流
速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．
２）中、４０分間で、１０〜３０％のアセトニトリルの
直線濃度勾配で溶出した。１ｍｌずつ分画し、アセトニ
トリル濃度約１９％に溶出する画分に活性を認めた。
ｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１
５０ｍｍ、資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流
速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．
２）中、４０分間で、１０〜３０％のアセトニトリルの
直線濃度勾配で溶出した。１ｍｌずつ分画し、アセトニ
トリル濃度約１９％に溶出する画分に活性を認めた。
【００５１】（ｂ）逆相ＨＰＬＣ（２） （ａ）で得られた活性画分を、Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ
Ｃ１８ ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１５０ｍｍ、
資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流速０．５ｍ
ｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、アセ
トニトリル１８％で展開した。保持時間１４分に単一の
化合物が得られ、化合物（１）とした。この逆相ＨＰＬ
Ｃの展開図を、図１として示す。
Ｃ１８ ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１５０ｍｍ、
資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流速０．５ｍ
ｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、アセ
トニトリル１８％で展開した。保持時間１４分に単一の
化合物が得られ、化合物（１）とした。この逆相ＨＰＬ
Ｃの展開図を、図１として示す。
【００５２】実施例３：活性画分からのペプチド類の精
製（その２：活性画分Ｂからの精製） 実施例１の分離操作により得られた活性画分Ｂについ
て、更に以下の操作を行い、ペプチド類を精製した。
製（その２：活性画分Ｂからの精製） 実施例１の分離操作により得られた活性画分Ｂについ
て、更に以下の操作を行い、ペプチド類を精製した。
【００５３】（ａ）逆相ＨＰＬＣ（１） 実施例１の（ｄ）で得られた活性画分Ｂを、Ｃａｐｃｅ
ｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１
５０ｍｍ、資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流
速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．
２）中、４０分間で、１０〜３０％のアセトニトリルの
直線濃度勾配で溶出した。１ｍｌずつ分画し、アセトニ
トリル濃度約１８％に溶出する画分に活性を認めた。
ｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１
５０ｍｍ、資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流
速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．
２）中、４０分間で、１０〜３０％のアセトニトリルの
直線濃度勾配で溶出した。１ｍｌずつ分画し、アセトニ
トリル濃度約１８％に溶出する画分に活性を認めた。
【００５４】（ｂ）逆相ＨＰＬＣ（２） （ａ）で得られた活性画分を、Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ
Ｃ１８ ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１５０ｍｍ、
資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流速０．５ｍ
ｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、アセ
トニトリル１６％で展開した。保持時間１６分に単一の
化合物が得られ、化合物（２）とした。この逆相ＨＰＬ
Ｃの展開図を、図２として示す。
Ｃ１８ ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１５０ｍｍ、
資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流速０．５ｍ
ｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、アセ
トニトリル１６％で展開した。保持時間１６分に単一の
化合物が得られ、化合物（２）とした。この逆相ＨＰＬ
Ｃの展開図を、図２として示す。
【００５５】実施例４：活性画分からのペプチド類の精
製（その３：活性画分Ｃからの精製） 実施例１の分離操作により得られた活性画分Ｃについ
て、更に以下の操作を行い、ペプチド類を精製した。
製（その３：活性画分Ｃからの精製） 実施例１の分離操作により得られた活性画分Ｃについ
て、更に以下の操作を行い、ペプチド類を精製した。
【００５６】（ａ）逆相ＨＰＬＣ（１） 実施例１の（ｄ）で得られた活性画分Ｃを、Ｃａｐｃｅ
ｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１
５０ｍｍ、資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流
速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．
２）中、４０分間で、１０〜３０％のアセトニトリルの
直線濃度勾配で溶出した。１ｍｌずつ分画し、アセトニ
トリル濃度約１８％に溶出する画分に活性を認めた。
ｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１
５０ｍｍ、資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流
速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．
２）中、４０分間で、１０〜３０％のアセトニトリルの
直線濃度勾配で溶出した。１ｍｌずつ分画し、アセトニ
トリル濃度約１８％に溶出する画分に活性を認めた。
【００５７】（ｂ）逆相ＨＰＬＣ（２） （ａ）で得られた活性画分を、Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ
Ｃ１８ ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１５０ｍｍ、
資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流速０．５ｍ
ｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、アセ
トニトリル１６％で展開した。保持時間１６．７分にピ
ークがみられたが、他の物質が混入されている可能性が
あったため、再度同じ条件で、逆相ＨＰＬＣを行い、保
持時間１６．７分に単一の化合物を得て、これを化合物
（３）とした。この逆相ＨＰＬＣの展開図を、図３とし
て示す。
Ｃ１８ ＵＧ８０（５μｍ、Φ４．６×１５０ｍｍ、
資生堂製）を用いた逆相ＨＰＬＣに付し、流速０．５ｍ
ｌ／ｍｉｎで、０．１％ＴＦＡ（ｐＨ２．２）中、アセ
トニトリル１６％で展開した。保持時間１６．７分にピ
ークがみられたが、他の物質が混入されている可能性が
あったため、再度同じ条件で、逆相ＨＰＬＣを行い、保
持時間１６．７分に単一の化合物を得て、これを化合物
（３）とした。この逆相ＨＰＬＣの展開図を、図３とし
て示す。
【００５８】実施例５：神経ペプチド類の同定 上記の実施例２で純化した化合物（１）、実施例３で純
化した化合物（２）および実施例４で純化した化合物
（３）の構造を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＰＳＱ−１型気相
シークエンサー（島津製作所製）によって解析した。得
られた各アミノ酸配列を、下記表１に示した。
化した化合物（２）および実施例４で純化した化合物
（３）の構造を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＰＳＱ−１型気相
シークエンサー（島津製作所製）によって解析した。得
られた各アミノ酸配列を、下記表１に示した。
【００５９】
【表１】ペプチドのアミノ酸配列（単位ｐｍｏｌ）
【００６０】化合物（１）、化合物（２）および化合物
（３）の分子量は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（Ｖｏｙ
ａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ，ＰＥバイオシステムズジャパン
社製）によって確認した。その測定値を下記表２に示し
た。
（３）の分子量は、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ（Ｖｏｙ
ａｇｅｒ Ｅｌｉｔｅ，ＰＥバイオシステムズジャパン
社製）によって確認した。その測定値を下記表２に示し
た。
【００６１】
【表２】ペプチドのＭＳデータ
【００６２】以上の機器分析データにより、活性画分Ａ
より単離、精製されたマダコの神経ペプチド類である化
合物（１）は、次のアミノ酸配列式（１）： Ｈ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （１） で表されることが明らかになった。
より単離、精製されたマダコの神経ペプチド類である化
合物（１）は、次のアミノ酸配列式（１）： Ｈ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （１） で表されることが明らかになった。
【００６３】また、活性画分Ｂより単離、精製されたマ
ダコの神経ペプチド類である化合物（２）は、次のアミ
ノ酸配列式（２）： Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （２） で表されることが明らかになった。
ダコの神経ペプチド類である化合物（２）は、次のアミ
ノ酸配列式（２）： Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （２） で表されることが明らかになった。
【００６４】さらに、活性画分Ｃより単離、精製された
マダコの神経ペプチド類である化合物（３）は、次のア
ミノ酸配列式（３）： Ｈ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒ ｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （３） で表されることが明らかになった。
マダコの神経ペプチド類である化合物（３）は、次のア
ミノ酸配列式（３）： Ｈ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒ ｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （３） で表されることが明らかになった。
【００６５】実験例６：固相法によるマダコ神経ペプチ
ド類の合成 各々のマダコ神経ペプチド類の合成は、ＰＥバイオシス
テムズジャパン社の全自動ペプチド合成機４３３Ａ型を
用い、ＦａｓｔＭｏｃ（登録商標）法により合成した。
ド類の合成 各々のマダコ神経ペプチド類の合成は、ＰＥバイオシス
テムズジャパン社の全自動ペプチド合成機４３３Ａ型を
用い、ＦａｓｔＭｏｃ（登録商標）法により合成した。
【００６６】なお、化合物（１）の合成には、Ｆｍｏｃ
−ＮＨ−ＳＡＬ−Ａレジン（渡辺化学工業社製）を担体
とし、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａ
ｌ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍ
ｏｃ−Ｌｅｕ 、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ａ
ｒｇ（Ｐｍｃ）を用いた。
−ＮＨ−ＳＡＬ−Ａレジン（渡辺化学工業社製）を担体
とし、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｖａ
ｌ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、
Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍ
ｏｃ−Ｌｅｕ 、Ｆｍｏｃ−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ａ
ｒｇ（Ｐｍｃ）を用いた。
【００６７】また、化合物（２）の合成には、Ｆｍｏｃ
−ＮＨ−ＳＡＬ−Ａレジン（渡辺化学工業社製）を担体
とし、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒ
ｔ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢ
ｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ
−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）を用いた。
−ＮＨ−ＳＡＬ−Ａレジン（渡辺化学工業社製）を担体
とし、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒ
ｔ）、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢ
ｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ、Ｆｍｏｃ
−ＧｌｙおよびＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）を用いた。
【００６８】さらに、化合物（３）の合成には、Ｆｍｏ
ｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−Ａレジン（渡辺化学工業社製）を担
体とし、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢ
ｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒ
ｔ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ
（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆ
ｍｏｃ−ＰｒｏおよびＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）を用
いた。
ｃ−ＮＨ−ＳＡＬ−Ａレジン（渡辺化学工業社製）を担
体とし、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢ
ｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒ
ｔ）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ
（ｔＢｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ、Ｆ
ｍｏｃ−ＰｒｏおよびＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）を用
いた。
【００６９】ただし、Ｆｍｏｃは９−Ｆｌｕｏｒｅｎｙ
ｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを、ｔＢｕはｔ−Ｂ
ｕｔｙｌを、Ｔｒｔはｔｒｉｔｙｌを、Ｐｍｃは２，
２，５，７，８−ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌ ｃｈｒｏｍ
ａｎ−６−ｓｕｌｆｏｎｙｌを示す。
ｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを、ｔＢｕはｔ−Ｂ
ｕｔｙｌを、Ｔｒｔはｔｒｉｔｙｌを、Ｐｍｃは２，
２，５，７，８−ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌ ｃｈｒｏｍ
ａｎ−６−ｓｕｌｆｏｎｙｌを示す。
【００７０】反応終了後のペプチド樹脂からの粗ペプチ
ドの切離しと脱保護には、フェノール４．３％／１，２
−エタンジチオール２．１％／チオアニソール４．３％
／水４．３％／ＴＦＡ８５％を用いた。反応混合物を濾
過し、濾液にエーテルを加えてペプチドを沈殿させ、沈
殿をエーテルで３回洗浄し、粗ペプチド約１００ｍｇを
得た。このうちの約１０ｍｇの粗ペプチドを逆相ＨＰＬ
Ｃにより精製し、約６ｍｇの精製ペプチドをそれぞれ得
た。
ドの切離しと脱保護には、フェノール４．３％／１，２
−エタンジチオール２．１％／チオアニソール４．３％
／水４．３％／ＴＦＡ８５％を用いた。反応混合物を濾
過し、濾液にエーテルを加えてペプチドを沈殿させ、沈
殿をエーテルで３回洗浄し、粗ペプチド約１００ｍｇを
得た。このうちの約１０ｍｇの粗ペプチドを逆相ＨＰＬ
Ｃにより精製し、約６ｍｇの精製ペプチドをそれぞれ得
た。
【００７１】得られた各精製ペプチドは、Ｃａｐｃｅｌ
ｌ ｐａｋ Ｃ１８を用いる逆相ＨＰＬＣにおいて、保
持時間が化合物（１）、（２）および（３）のそれぞれ
と全く一致した。また、マダコの心臓の心拍動活性にお
いても、合成物はそれぞれの天然物と同様であった。
ｌ ｐａｋ Ｃ１８を用いる逆相ＨＰＬＣにおいて、保
持時間が化合物（１）、（２）および（３）のそれぞれ
と全く一致した。また、マダコの心臓の心拍動活性にお
いても、合成物はそれぞれの天然物と同様であった。
【００７２】実施例７：マダコの心臓の心拍動活性の測
定 マダコの心臓の拍動活性は、森下ら（Ｆｕｍｉｈｉｒｏ
Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４０，３５４−３５
８，１９９７）の方法に準拠して実施した。すなわち、
マダコの心臓を摘出し、両心房を切断して、それぞれの
房室から心室にカニューレを差込み、チャンバー（容量
８０ｍｌ）に木綿の糸で縛って固定した。また、心室内
の溶液が流れ出すのを妨げないように大動脈をはさみ、
張力トランスデューサーにつないで検定の標本とした。
カニューレからは人工海水（１％グルコースを含む）が
１〜２ｍｌ／ｍｉｎ流れるようセットした。検定すべき
検体は、同様の人工海水１ｍｌに溶解して、カニューレ
から心臓内部に到達するよう添加し、心臓の拍動の変化
を記録した。
定 マダコの心臓の拍動活性は、森下ら（Ｆｕｍｉｈｉｒｏ
Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２４０，３５４−３５
８，１９９７）の方法に準拠して実施した。すなわち、
マダコの心臓を摘出し、両心房を切断して、それぞれの
房室から心室にカニューレを差込み、チャンバー（容量
８０ｍｌ）に木綿の糸で縛って固定した。また、心室内
の溶液が流れ出すのを妨げないように大動脈をはさみ、
張力トランスデューサーにつないで検定の標本とした。
カニューレからは人工海水（１％グルコースを含む）が
１〜２ｍｌ／ｍｉｎ流れるようセットした。検定すべき
検体は、同様の人工海水１ｍｌに溶解して、カニューレ
から心臓内部に到達するよう添加し、心臓の拍動の変化
を記録した。
【００７３】その結果を図４ないし図６に示した。各図
に示した結果からも明らかなように、化合物（１）［図
４］、化合物（２）［図５］および化合物（３）［図
６］は、それぞれマダコ心臓の拍動を増強させる。
に示した結果からも明らかなように、化合物（１）［図
４］、化合物（２）［図５］および化合物（３）［図
６］は、それぞれマダコ心臓の拍動を増強させる。
【００７４】実施例８：マデレゴキブリ後腸の収縮活性
の測定 マデレゴキブリ後腸の収縮活性は、クックら（Ｃｏｏｋ
Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６１Ｃ，２９１−２９５，１９９
８）の方法に準拠して実施した。すなわち、マデレゴキ
ブリの腸管を摘出し、後腸の部分の両端を木綿の糸で縛
り、一端をチャンバー（容量２ｍｌ）に固定し、他端を
張力トランスデューサーにつないで検定の標本とした。
検定すべき検体は、生理食塩水に溶解して、チャンバー
に添加し、収縮による長さの変化を記録した。
の測定 マデレゴキブリ後腸の収縮活性は、クックら（Ｃｏｏｋ
Ｂ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ．，６１Ｃ，２９１−２９５，１９９
８）の方法に準拠して実施した。すなわち、マデレゴキ
ブリの腸管を摘出し、後腸の部分の両端を木綿の糸で縛
り、一端をチャンバー（容量２ｍｌ）に固定し、他端を
張力トランスデューサーにつないで検定の標本とした。
検定すべき検体は、生理食塩水に溶解して、チャンバー
に添加し、収縮による長さの変化を記録した。
【００７５】その結果を図７ないし図９に示した。各図
に示した結果からも明らかなように、化合物（１）［図
７］、化合物（２）［図８］および化合物（３）［図
９］は、それぞれマデレゴキブリの後腸を収縮させる。
このことから、本発明のペプチド類、すなわち化合物
（１）、化合物（２）および化合物（３）は、無脊椎動
物に作用するタキキニン関連ペプチドであることが判明
した。
に示した結果からも明らかなように、化合物（１）［図
７］、化合物（２）［図８］および化合物（３）［図
９］は、それぞれマデレゴキブリの後腸を収縮させる。
このことから、本発明のペプチド類、すなわち化合物
（１）、化合物（２）および化合物（３）は、無脊椎動
物に作用するタキキニン関連ペプチドであることが判明
した。
【００７６】実施例９：前駆体ポリペプチドの全アミノ
酸構造およびそれをコードする遺伝子の塩基配列決定 （１）マダコ脳 ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製 マダコの脳約１ｇを液体窒素中で粉砕し、１０ｍｌのＴ
ＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社
製）に溶解した後ホモジナイズした。室温で５分間静置
した後、エッペンドルフチューブに１ｍｌずつ分注し、
２００μｌずつクロロホルムを加えて撹拌後、冷却遠心
機（佐久間製作所社製）で遠心分離（１５，０００ｒｐ
ｍ、１５分間、４℃）した。上層の水層をエッペンドル
フチューブに分取して、０．５ｍｌずつイソプロパノー
ルを加え、室温で１０分静置した。冷却遠心機で遠心分
離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）した後、上
清を除いて１ｍｌの７５％エタノールを加えて再度遠心
分離（１０，０００ｒｐｍ、５分間、４℃）した。上清
を除いて約１０分間風乾し、１０μｌのＤＥＰＣ−処理
水を加え、６０℃で１０分間インキュベートしてＲＮＡ
を溶解した。以上の方法で約２５０μｇのｔｏｔａｌ
ＲＮＡが得られた。
酸構造およびそれをコードする遺伝子の塩基配列決定 （１）マダコ脳 ｔｏｔａｌ ＲＮＡの調製 マダコの脳約１ｇを液体窒素中で粉砕し、１０ｍｌのＴ
ＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社
製）に溶解した後ホモジナイズした。室温で５分間静置
した後、エッペンドルフチューブに１ｍｌずつ分注し、
２００μｌずつクロロホルムを加えて撹拌後、冷却遠心
機（佐久間製作所社製）で遠心分離（１５，０００ｒｐ
ｍ、１５分間、４℃）した。上層の水層をエッペンドル
フチューブに分取して、０．５ｍｌずつイソプロパノー
ルを加え、室温で１０分静置した。冷却遠心機で遠心分
離（１５，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）した後、上
清を除いて１ｍｌの７５％エタノールを加えて再度遠心
分離（１０，０００ｒｐｍ、５分間、４℃）した。上清
を除いて約１０分間風乾し、１０μｌのＤＥＰＣ−処理
水を加え、６０℃で１０分間インキュベートしてＲＮＡ
を溶解した。以上の方法で約２５０μｇのｔｏｔａｌ
ＲＮＡが得られた。
【００７７】（２）ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ３’−ＲＡ
ＣＥ マダコの脳から単離されたペプチドの配列を基に、次の
縮重プライマーを設計し、常法により合成した。 Oct-B-Tac-１： 5'-TIAA(C/T)GCIAA(C/T)(T/A)(C/G)IT
T(C/T)ATGGG-3' Oct-B-Tac-２： 5'-TT(C/T)ATGGGI(T/A)(C/G)I(C/A)GI
GGIAA-3' （各式中の英文字は「ヌクレオチド略語表」による（細
胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」：秀潤
社）；以下の各式において同じ。）
ＣＥ マダコの脳から単離されたペプチドの配列を基に、次の
縮重プライマーを設計し、常法により合成した。 Oct-B-Tac-１： 5'-TIAA(C/T)GCIAA(C/T)(T/A)(C/G)IT
T(C/T)ATGGG-3' Oct-B-Tac-２： 5'-TT(C/T)ATGGGI(T/A)(C/G)I(C/A)GI
GGIAA-3' （各式中の英文字は「ヌクレオチド略語表」による（細
胞工学別冊「バイオ実験イラストレイテッド」：秀潤
社）；以下の各式において同じ。）
【００７８】次に、５’／３’−ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用い
て、以下の手順でｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ３’−ＲＡＣ
Ｅを行った。すなわち、２μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡ、
４μｌのｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅ
ｒ、２μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのｏｌｉｇｏ
ｄＴ−ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ
／μｌ）、１μｌのＡＭＶｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ
−処理水を混合して全量２０μｌにし、５５℃で６０分
間インキュベートした後６５℃で１０分間処理して１ｓ
ｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用い
て、以下の手順でｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ３’−ＲＡＣ
Ｅを行った。すなわち、２μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡ、
４μｌのｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅ
ｒ、２μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのｏｌｉｇｏ
ｄＴ−ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ
／μｌ）、１μｌのＡＭＶｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ
−処理水を混合して全量２０μｌにし、５５℃で６０分
間インキュベートした後６５℃で１０分間処理して１ｓ
ｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。
【００７９】次に、以下の条件で１ｓｔ−３’−ＲＡＣ
Ｅを行った。すなわち、３μｌの１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８
μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌのＯｃｔ−Ｂ−Ｔａｃ
−１（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのＰＣＲ ａｎ
ｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、
０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）
（宝酒造社製）、水を混合して全量５０μｌにし、９４
℃５分間の後、９４℃３０秒間、４８℃３０秒間、７２
℃２分３０秒間で３０サイクル、その後７２℃で５分間
反応させた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、Ｇ
ｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００ ｔｈｅ
ｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社
製）を用いた。
Ｅを行った。すなわち、３μｌの１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８
μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌのＯｃｔ−Ｂ−Ｔａｃ
−１（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのＰＣＲ ａｎ
ｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、
０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）
（宝酒造社製）、水を混合して全量５０μｌにし、９４
℃５分間の後、９４℃３０秒間、４８℃３０秒間、７２
℃２分３０秒間で３０サイクル、その後７２℃で５分間
反応させた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）には、Ｇ
ｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ２４００ ｔｈｅ
ｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社
製）を用いた。
【００８０】続いて、１ｓｔ−ＰＣＲ産物をスピンカラ
ム（ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｓ−４００，Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で精製し、以
下の条件で２ｎｄ−３’−ＲＡＣＥを行った。すなわ
ち、３μｌの１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣ
Ｒ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌ
のＯｃｔ−Ｂ−Ｔａｃ−２（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、
１μｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．
５ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａＥｘ
Ｔａｑ（登録商標）（宝酒造社製）、水を混合して全量
５０μｌにし、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、４
５℃３０秒間、７２℃１分３０秒間で３０サイクル、そ
の後７２℃で５分間反応させた。反応液５μｌを１．５
％アガロースゲルで電気泳動した結果、約６００ｂｐの
ＰＣＲ産物の増幅がみられた。
ム（ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｓ−４００，Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で精製し、以
下の条件で２ｎｄ−３’−ＲＡＣＥを行った。すなわ
ち、３μｌの１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣ
Ｒ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌ
のＯｃｔ−Ｂ−Ｔａｃ−２（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、
１μｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．
５ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａＥｘ
Ｔａｑ（登録商標）（宝酒造社製）、水を混合して全量
５０μｌにし、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、４
５℃３０秒間、７２℃１分３０秒間で３０サイクル、そ
の後７２℃で５分間反応させた。反応液５μｌを１．５
％アガロースゲルで電気泳動した結果、約６００ｂｐの
ＰＣＲ産物の増幅がみられた。
【００８１】（３）ＰＣＲ産物の連結反応（ｌｉｇａｔ
ｉｏｎ） ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製し、そのうち８μｌと
２μｌのＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社製）、１０μｌのＬｉｇａｔｉｏ
ｎ ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を混合して１６℃で１時間
連結反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。
ｉｏｎ） ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製し、そのうち８μｌと
２μｌのＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社製）、１０μｌのＬｉｇａｔｉｏ
ｎ ｈｉｇｈ（東洋紡社製）を混合して１６℃で１時間
連結反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を行った。
【００８２】（４）大腸菌の形質転換 上記（３）で得た２０μｌの連結反応溶液を、コンピテ
ントセルＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５α（東洋紡社製）に混合し、氷中に３０分間静
置した後、４２℃で５０秒間ヒートショックを行った。
氷中で２分間冷却した後、１ｍｌのＳＯＣ ｍｅｄｉｕ
ｍを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。続い
て、ＬＢ／Ａｍｐ．（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ）寒天培地上に３５μｌのＸ−ｇａｌを塗布した
後、１０μｌの形質転換体を蒔いた。残りの形質転換体
も１０，０００ｒｐｍで１分間遠沈して容量を１００μ
ｌ程度に減らし、全量をＬＢ／Ａｍｐ．寒天培地上に蒔
いた。培地は３７℃で一晩培養した。
ントセルＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＨ５α（東洋紡社製）に混合し、氷中に３０分間静
置した後、４２℃で５０秒間ヒートショックを行った。
氷中で２分間冷却した後、１ｍｌのＳＯＣ ｍｅｄｉｕ
ｍを加え、３７℃で３０分間インキュベートした。続い
て、ＬＢ／Ａｍｐ．（５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ）寒天培地上に３５μｌのＸ−ｇａｌを塗布した
後、１０μｌの形質転換体を蒔いた。残りの形質転換体
も１０，０００ｒｐｍで１分間遠沈して容量を１００μ
ｌ程度に減らし、全量をＬＢ／Ａｍｐ．寒天培地上に蒔
いた。培地は３７℃で一晩培養した。
【００８３】（５）コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲ 得られたコロニーを鋳型にして、以下の条件でコロニー
（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲを行った。すなわち、大腸菌の
菌体、５μｌの１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅ
ｒ、５μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌの２５
ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５μｌのＭ１３ＦＷ ｐｒｉｍ
ｅｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＭ１３Ｒ
Ｖ ｐｒｉｍｅｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μ
ｌのｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡
社製）、水を混合して全量５０μｌにし、９０℃１０分
間の後、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分
間で３０サイクル、７２℃でさらに５分間反応させた。
反応液５μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動し
た。なお、この反応に使用したＭ１３ＦＷ ｐｒｉｍｅ
ｒおよびＭ１３ＲＶ ｐｒｉｍｅｒは、常法により合成
した。その配列を以下に示す。
（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲを行った。すなわち、大腸菌の
菌体、５μｌの１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅ
ｒ、５μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘ、３μｌの２５
ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．５μｌのＭ１３ＦＷ ｐｒｉｍ
ｅｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＭ１３Ｒ
Ｖ ｐｒｉｍｅｒ（１００ｐｍｏｌ／μｌ）、０．５μ
ｌのｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡
社製）、水を混合して全量５０μｌにし、９０℃１０分
間の後、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分
間で３０サイクル、７２℃でさらに５分間反応させた。
反応液５μｌを１．５％アガロースゲルで電気泳動し
た。なお、この反応に使用したＭ１３ＦＷ ｐｒｉｍｅ
ｒおよびＭ１３ＲＶ ｐｒｉｍｅｒは、常法により合成
した。その配列を以下に示す。
【００８４】M13FW： 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3' M13RV： 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3'
【００８５】（６）ＤＮＡシークエンス 目的のサイズ（約８００ｂｐ）のコロニー（ｃｏｌｏｎ
ｙ）ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製して、ＤＮＡ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ社製）を用いてシークエンスを行った。シークエン
スには、ＡＢＩＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
を用いた。得られた配列を、遺伝子解析ソフトＧＥＮＥ
ＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエア開発社製）を用いて解析
した結果、約６００ｂｐの部分ｃＤＮＡ配列が解明でき
た。
ｙ）ＰＣＲ産物をスピンカラムで精製して、ＤＮＡ Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ社製）を用いてシークエンスを行った。シークエン
スには、ＡＢＩＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）
を用いた。得られた配列を、遺伝子解析ソフトＧＥＮＥ
ＴＹＸ−ＭＡＣ（ソフトウエア開発社製）を用いて解析
した結果、約６００ｂｐの部分ｃＤＮＡ配列が解明でき
た。
【００８６】（７）５’−ＲＡＣＥ 部分ｃＤＮＡの塩基配列から、以下のプライマーを合成
した。 TKRP-5'-1R：5'-GTAAGATCGTTTAGTTGGGG-3' TKRP-5'-2R： 5'-TTTAGTTGGGGCTTTTCACC-3' TKRP-5'-3R： 5'-TTTCACCGAGTAAGGTAACC-3'
した。 TKRP-5'-1R：5'-GTAAGATCGTTTAGTTGGGG-3' TKRP-5'-2R： 5'-TTTAGTTGGGGCTTTTCACC-3' TKRP-5'-3R： 5'-TTTCACCGAGTAAGGTAACC-3'
【００８７】次に、５’／３’−ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて
以下の手順で５’−ＲＡＣＥを行った。まず、２μｇの
ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、４μｌのｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、２μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１
μｌのＴＫＲＰ−５’−１Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μ
ｌ）、１μｌのＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ−
処理水を混合して全量２０μｌにし、５５℃で６０分間
インキュベートの後、６５℃で１０分間処理して、１ｓ
ｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。次いで、１ｓ
ｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡをスピンカラムで精製した
後、２．５μｌのｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、
２．５μｌの２ｍＭ ｄＡＴＰを加えて９４℃で３分間
処理し、そこに１μｌのｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅ（１０ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加えて３７℃
で２０分間インキュベート後、７０℃で１０分間処理し
てｄＡ−ｔａｉｌｅｄ ｃＤＮＡを合成した。
ｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ社製）を用いて
以下の手順で５’−ＲＡＣＥを行った。まず、２μｇの
ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、４μｌのｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ、２μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１
μｌのＴＫＲＰ−５’−１Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μ
ｌ）、１μｌのＡＭＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔａｓｅ（２０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ−
処理水を混合して全量２０μｌにし、５５℃で６０分間
インキュベートの後、６５℃で１０分間処理して、１ｓ
ｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。次いで、１ｓ
ｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡをスピンカラムで精製した
後、２．５μｌのｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、
２．５μｌの２ｍＭ ｄＡＴＰを加えて９４℃で３分間
処理し、そこに１μｌのｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅ（１０ｕｎｉｔｓ／μｌ）を加えて３７℃
で２０分間インキュベート後、７０℃で１０分間処理し
てｄＡ−ｔａｉｌｅｄ ｃＤＮＡを合成した。
【００８８】次いで、１ｓｔ−ＰＣＲおよび２ｎｄ−Ｐ
ＣＲを、以下の条件で行った。 １ｓｔ−ＰＣＲ：５μｌのｄＡ−ｔａｉｌｅｄ ｃ
ＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌ
のｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＴＫＲＰ−５’−２Ｒ
（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのｏｌｉｇｏ ｄ
Ｔ−ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／
μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登
録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量５０μ
ｌにし、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３
０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７２℃で
７分間反応させた。
ＣＲを、以下の条件で行った。 １ｓｔ−ＰＣＲ：５μｌのｄＡ−ｔａｉｌｅｄ ｃ
ＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌ
のｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＴＫＲＰ−５’−２Ｒ
（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのｏｌｉｇｏ ｄ
Ｔ−ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／
μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登
録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量５０μ
ｌにし、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３
０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７２℃で
７分間反応させた。
【００８９】 ２ｎｄ−ＰＣＲ：３μｌのスピンカラ
ム精製した１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＴ
ＫＲＰ−５’−３Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μ
ｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐ
ｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔ
ａｑ（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全
量５０μｌにし、１ｓｔ−ＰＣＲと同じサイクルで行っ
た。
ム精製した１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＴ
ＫＲＰ−５’−３Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μ
ｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐ
ｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔ
ａｑ（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全
量５０μｌにし、１ｓｔ−ＰＣＲと同じサイクルで行っ
た。
【００９０】以上の方法で得られた２ｎｄ−ＰＣＲ産物
を、１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、約
４００ｂｐのバンドが確認できた。この２ｎｄ−ＰＣＲ
産物を、上記の方法（３）、（４）、（５）および
（６）に記載した方法にしたがってシークエンスを行っ
た。
を、１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、約
４００ｂｐのバンドが確認できた。この２ｎｄ−ＰＣＲ
産物を、上記の方法（３）、（４）、（５）および
（６）に記載した方法にしたがってシークエンスを行っ
た。
【００９１】そのシークエンス解析の結果、５’側が不
完全であったため、以下のプライマーを常法により合成
して、再度５’−ＲＡＣＥを行った。
完全であったため、以下のプライマーを常法により合成
して、再度５’−ＲＡＣＥを行った。
【００９２】 TKRP-5'-4R： 5'-TTCAGCAGATTCTGAGTCGG-3' TKRP-5'-5R： 5'-TCTACTTTCGATAGTGTTGGC-3' TKRP-5'-6R： 5'-GACGTTATTACTGTCCAACTC-3'
【００９３】すなわち、２μｇのｔｏｔａｌ ＲＮＡ、
４μｌのｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅ
ｒ、２μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＴＫＲＰ−
５’−４Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのＡＭ
Ｖ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２
０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ−処理水を混合して全
量２０μｌにし、５５℃で６０分間インキュベートの
後、６５℃で１０分間処理して１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡを合成した。
４μｌのｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅ
ｒ、２μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＴＫＲＰ−
５’−４Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのＡＭ
Ｖ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（２
０ｕｎｉｔｓ／μｌ）、ＤＥＰＣ−処理水を混合して全
量２０μｌにし、５５℃で６０分間インキュベートの
後、６５℃で１０分間処理して１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡを合成した。
【００９４】次いで、１ｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ
をスピンカラムで精製した後、２．５μｌのｒｅａｃｔ
ｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、２．５μｌの２ｍＭ ｄＡＴＰ
を加えて９４℃で３分間処理し、そこに１μｌのｔｅｒ
ｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（１０ｕｎｉｔｓ
／μｌ）を加え３７℃で２０分間インキュベート後、７
０℃で１０分間処理してｄＡ−ｔａｉｌｅｄ ｃＤＮＡ
を合成した。
をスピンカラムで精製した後、２．５μｌのｒｅａｃｔ
ｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ、２．５μｌの２ｍＭ ｄＡＴＰ
を加えて９４℃で３分間処理し、そこに１μｌのｔｅｒ
ｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（１０ｕｎｉｔｓ
／μｌ）を加え３７℃で２０分間インキュベート後、７
０℃で１０分間処理してｄＡ−ｔａｉｌｅｄ ｃＤＮＡ
を合成した。
【００９５】次いで、１ｓｔ−ＰＣＲおよび２ｎｄ−Ｐ
ＣＲを、以下の条件で行った。 １ｓｔ−ＰＣＲ：５μｌのｄＡ−ｔａｉｌｅｄ ｃ
ＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌ
のｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＴＫＲＰ−５’−５Ｒ
（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのｏｌｉｇｏ ｄ
Ｔ−ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／
μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登
録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量５０μ
ｌにし、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３
０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７２℃で
７分間反応させた。
ＣＲを、以下の条件で行った。 １ｓｔ−ＰＣＲ：５μｌのｄＡ−ｔａｉｌｅｄ ｃ
ＤＮＡ、５μｌの１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、８μｌ
のｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＴＫＲＰ−５’−５Ｒ
（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μｌのｏｌｉｇｏ ｄ
Ｔ−ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐｍｏｌ／
μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登
録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全量５０μ
ｌにし、９４℃５分間の後、９４℃３０秒間、５５℃３
０秒間、７２℃２分間で３０サイクル、その後７２℃で
７分間反応させた。
【００９６】 ２ｎｄ−ＰＣＲ：３μｌのスピンカラ
ム精製した１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＴ
ＫＲＰ−５’−６Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μ
ｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐ
ｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔ
ａｑ（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全
量５０μｌにし、１ｓｔ−ＰＣＲと同じサイクルで行っ
た。
ム精製した１ｓｔ−ＰＣＲ産物、５μｌの１０×ＰＣＲ
ｂｕｆｆｅｒ、８μｌのｄＮＴＰ ｍｉｘ、１μｌのＴ
ＫＲＰ−５’−６Ｒ（１２．５ｐｍｏｌ／μｌ）、１μ
ｌのＰＣＲ ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ（１２．５ｐ
ｍｏｌ／μｌ）、０．５μｌのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔ
ａｑ（登録商標）（宝酒造社製）および水を混合して全
量５０μｌにし、１ｓｔ−ＰＣＲと同じサイクルで行っ
た。
【００９７】以上の方法で得られた２ｎｄ−ＰＣＲ産物
を、１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、約
５００ｂｐのバンドが確認できた。この２ｎｄ−ＰＣＲ
産物を上記の方法（３）、（４）、（５）および（６）
に記載した方法にしたがってシークエンスした。
を、１．５％アガロースゲルで電気泳動したところ、約
５００ｂｐのバンドが確認できた。この２ｎｄ−ＰＣＲ
産物を上記の方法（３）、（４）、（５）および（６）
に記載した方法にしたがってシークエンスした。
【００９８】その結果、タキキニン関連ペプチドの前駆
体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのサイズ（約１．
７ｋｂ）と、その推定アミノ酸の数（２６６アミノ酸残
基）と配列を明らかにすることができた。そのアミノ酸
配列を配列番号８に、また、ｃＤＮＡの配列を配列番号
９に示した。
体ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのサイズ（約１．
７ｋｂ）と、その推定アミノ酸の数（２６６アミノ酸残
基）と配列を明らかにすることができた。そのアミノ酸
配列を配列番号８に、また、ｃＤＮＡの配列を配列番号
９に示した。
【００９９】以上のようにして決定した配列番号８で示
されるタキキニン関連ペプチドの前駆体ポリペプチドに
ついて、本発明が提供するタキキニン関連ペプチドに相
当するアミノ酸配列を有する部分の切り出しを行うべく
検討した。その結果、実施例１〜５で単離された化合物
（１）〜（３）に加えて、タキキニン関連ペプチドと推
定される化合物（４）〜（７）が含まれていることが判
明した。それらを、図１０にアンダーラインに該当する
部分で示した。
されるタキキニン関連ペプチドの前駆体ポリペプチドに
ついて、本発明が提供するタキキニン関連ペプチドに相
当するアミノ酸配列を有する部分の切り出しを行うべく
検討した。その結果、実施例１〜５で単離された化合物
（１）〜（３）に加えて、タキキニン関連ペプチドと推
定される化合物（４）〜（７）が含まれていることが判
明した。それらを、図１０にアンダーラインに該当する
部分で示した。
【０１００】前駆体ポリペプチドからこの配列式に基づ
いて切り出し、Ｃ末端の修飾を行った化合物（４）〜
（７）について、実施例７に記載のマダコの心臓の心拍
動活性の測定、および実施例８に記載のマデレゴキブリ
後腸の収縮活性の測定を行ったところ、化合物（１）〜
（３）と同様の活性が認められた。なお、化合物（７）
は化合物（１）〜（３）に比べ活性の強さは１／１，０
００程度であり、これはＣ末端がＬｙｓになっているた
めと思われた。
いて切り出し、Ｃ末端の修飾を行った化合物（４）〜
（７）について、実施例７に記載のマダコの心臓の心拍
動活性の測定、および実施例８に記載のマデレゴキブリ
後腸の収縮活性の測定を行ったところ、化合物（１）〜
（３）と同様の活性が認められた。なお、化合物（７）
は化合物（１）〜（３）に比べ活性の強さは１／１，０
００程度であり、これはＣ末端がＬｙｓになっているた
めと思われた。
【０１０１】 実施例１０：製剤例 錠剤 組成：化合物（１）、（２）または（３） １０ｇ 乳糖 １２５ｇ 微結晶セルロース ２５ｇ トウモロコシデンプン ２５ｇ ５％ヒドロキシプロピルメチルセルロース １００ｍｌ ステアリン酸マグネシウム ５ｇ 上記成分を常法により練合、造粒、乾燥後打錠して、１
錠中有効成分として化合物（１）、化合物（２）または
化合物（３）を１０ｍｇ含有する重量１９０ｍｇの錠剤
を得た。
錠中有効成分として化合物（１）、化合物（２）または
化合物（３）を１０ｍｇ含有する重量１９０ｍｇの錠剤
を得た。
【０１０２】
【発明の効果】本発明のペプチド類は、マダコ心臓の心
拍動を増強させ、マデレゴキブリの後腸を収縮させる作
用を有する神経ペプチドであり、神経伝達系を解明する
ための生化学試薬として有用である。
拍動を増強させ、マデレゴキブリの後腸を収縮させる作
用を有する神経ペプチドであり、神経伝達系を解明する
ための生化学試薬として有用である。
【０１０３】さらに、本発明のペプチド類は軟体動物で
あるマダコから得られたタキキニン関連の神経ペプチド
であり、医薬および農薬等への新たなアプローチを与え
るものである。
あるマダコから得られたタキキニン関連の神経ペプチド
であり、医薬および農薬等への新たなアプローチを与え
るものである。
【０１０４】また、本発明によって得られるタキキニン
関連ペプチドの前駆体ポリペプチドおよびそれをコード
する遺伝子は、本発明のタキキニン関連ペプチドを製造
する際の重要なツールとなる。
関連ペプチドの前駆体ポリペプチドおよびそれをコード
する遺伝子は、本発明のタキキニン関連ペプチドを製造
する際の重要なツールとなる。
【０１０５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> SUNTORY LIMITED <120> TACHYKININ RELATED PEPTIDE <130> SN186 <141> 2000-05-11 <150> JP11-260982 <151> 1999-09-14 <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> OCTOPUS VULGARIS <400> 1 Thr Val Ser Ala Asn Ala Phe Leu Gly Ser Arg 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> OCTOPUS VULGARIS <400> 2 Leu Asn Ala Asn Ser Phe Met Gly Ser Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> OCTOPUS VULGARIS <400> 3 Ala Ser Leu His Asn Thr Phe Ile Pro Ser Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> OCTOPUS VULGARIS <400> 4 Val Asn Pro Tyr Ser Phe Gln Gly Thr Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> OCTOPUS VULGARIS <400> 5 Ser Asp Ala Leu Ala Phe Val Pro Thr Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> OCTOPUS VULGARIS <400> 6 Tyr Ser Pro Leu Asp Phe Ile Gly Ser Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> OCTOPUS VULGARIS <400> 7 Arg Met Asn Ser Leu Ser Phe Gly Pro Pro Lys 1 5 10 <210> 8 <211> 265 <212> PRT <213> OCTOPUS VULGARIS <400> 8 Met Tyr Ala Ile Arg Val Ser Ser Ser Arg Arg Ile Ser Cys Phe Leu 1 5 10 15 Gln Val Ser Leu Leu Phe Ser Gly Leu Leu Asn Thr Leu Gln Trp Gly 20 25 30 Ala Phe Ala Ser Tyr Leu Pro Lys Gln Leu Glu Pro Gln Gln Lys Asn 35 40 45 Tyr Glu Leu Asp Ser Asn Asn Val Asn Ser Ser Arg Tyr Pro Gly His 50 55 60 Glu Glu Ile Met Glu Phe Leu Arg Lys Leu Gly Phe Leu Ala Asn Thr 65 70 75 80 Ile Glu Ser Arg Ala Ser Ile Asp Asp Thr Asp Ser Glu Ser Ala Glu 85 90 95 Arg Met Lys Lys Val Asn Pro Tyr Ser Phe Gln Gly Thr Arg Gly Lys 100 105 110 Arg Leu Asn Ala Asn Ser Phe Met Gly Ser Arg Gly Lys Arg Val Leu 115 120 125 Val Asn Asp Lys Arg Thr Val Ser Ala Asn Ala Phe Leu Gly Ser Arg 130 135 140 Gly Lys Arg Leu Val Thr Leu Leu Gly Glu Lys Pro Gln Leu Asn Asp 145 150 155 160 Leu Thr Gly Val Ile Asp Lys Lys Ser Asp Ala Leu Ala Phe Val Pro 165 170 175 Thr Arg Gly Arg Ser Gln Ser Thr Asn Asp Glu Leu Ala Tyr Thr Gly 180 185 190 Pro Met Leu Leu Arg Glu Gly Arg Arg Met Asn Ser Leu Ser Phe Gly 195 200 205 Pro Pro Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Leu Asp Phe Ile Gly Ser Arg 210 215 220 Gly Lys Lys Ser Thr Phe Glu Asp Tyr Val Leu Asn Thr Gln Asn Asp 225 230 235 240 Ser Pro Lys Glu Asn Tyr Glu Arg Arg Ala Ser Leu His Asn Thr Phe 245 250 255 Ile Pro Ser Arg Gly Lys Arg Ser Thr 260 265 <210> 9 <211> 1660 <212> DNA <213> OCTOPUS VULGARIS <220> <221> CDS <222> (384)..(1178) <400> 9 caactctaat ttctgcagac gatctttttt tccgaacata caagcagtta catttattga 60 aaaaaaaaag atatatatat atagagagag aacaaagaaa aacttaaaca cttttttaaa 120 gaactgcata ttttcatatt tatttaataa ctttcttcac tttcatccct gtctccactt 180 agctctgctt ttcctttgtt ttattctaca tcatctacct atctagctat ctctctacct 240 actcaatgta tctttctgtt tatctgtctg tctgtctgtc tattcaatca acacacacat 300 atatttacgc gcacacacac cccagttttc tttctttcta gcattccttc tttctttctt 360 ttcgtctttc ttcttcttcc ctc atg tat gca att aga gta tca agc tca agg 413 Met Tyr Ala Ile Arg Val Ser Ser Ser Arg 1 5 10 cga ata agc tgt ttt tta caa gta tcc ttg cta ttt tcc gga ctt ttg 461 Arg Ile Ser Cys Phe Leu Gln Val Ser Leu Leu Phe Ser Gly Leu Leu 15 20 25 aac act ttg caa tgg ggt gcg ttt gcc agt tat cta ccc aag caa ttg 509 Asn Thr Leu Gln Trp Gly Ala Phe Ala Ser Tyr Leu Pro Lys Gln Leu 30 35 40 gaa cca cag cag aag aac tat gag ttg gac agt aat aac gtc aac agt 557 Glu Pro Gln Gln Lys Asn Tyr Glu Leu Asp Ser Asn Asn Val Asn Ser 45 50 55 agt agg tac cca ggc cat gaa gaa att atg gaa ttt tta cgc aaa ctg 605 Ser Arg Tyr Pro Gly His Glu Glu Ile Met Glu Phe Leu Arg Lys Leu 60 65 70 ggt ttc ctg gcc aac act atc gaa agt aga gct tca att gac gac acc 653 Gly Phe Leu Ala Asn Thr Ile Glu Ser Arg Ala Ser Ile Asp Asp Thr 75 80 85 90 gac tca gaa tct gct gaa aga atg aaa aaa gtt aac ccc tac agt ttc 701 Asp Ser Glu Ser Ala Glu Arg Met Lys Lys Val Asn Pro Tyr Ser Phe 95 100 105 caa ggt acc aga ggc aaa aga tta aac gca aac agt ttc atg ggt tcc 749 Gln Gly Thr Arg Gly Lys Arg Leu Asn Ala Asn Ser Phe Met Gly Ser 110 115 120 cga ggt aaa aga gtc ctc gtt aat gac aaa cgg act gtc agt gct aac 797 Arg Gly Lys Arg Val Leu Val Asn Asp Lys Arg Thr Val Ser Ala Asn 125 130 135 gct ttc ctc gga tcg agg ggt aaa cgt ctg gtt acc tta ctc ggt gaa 845 Ala Phe Leu Gly Ser Arg Gly Lys Arg Leu Val Thr Leu Leu Gly Glu 140 145 150 aag ccc caa cta aac gat ctt acg gga gtc att gac aaa aaa tca gat 893 Lys Pro Gln Leu Asn Asp Leu Thr Gly Val Ile Asp Lys Lys Ser Asp 155 160 165 170 gct tta gca ttc gtc cca aca aga ggc aga tca caa tca acc aat gac 941 Ala Leu Ala Phe Val Pro Thr Arg Gly Arg Ser Gln Ser Thr Asn Asp 175 180 185 gaa ctt gct tac acg ggt ccg atg tta ttg aga gaa ggc cga aga atg 989 Glu Leu Ala Tyr Thr Gly Pro Met Leu Leu Arg Glu Gly Arg Arg Met 190 195 200 aat tcc tta tcg ttt ggt ccc cca aaa ggc aaa aaa tac agt cca ctt 1037 Asn Ser Leu Ser Phe Gly Pro Pro Lys Gly Lys Lys Tyr Ser Pro Leu 205 210 215 gac ttc att gga tcg cgt ggc aag aaa agt act ttt gaa gat tat gtg 1085 Asp Phe Ile Gly Ser Arg Gly Lys Lys Ser Thr Phe Glu Asp Tyr Val 220 225 230 tta aat acc caa aac gat tca cca aag gag aac tac gaa agg cgg gcg 1133 Leu Asn Thr Gln Asn Asp Ser Pro Lys Glu Asn Tyr Glu Arg Arg Ala 235 240 245 250 tct tta cac aac aca ttc ata cct tcg cga ggt aag cga tcc aca 1178 Ser Leu His Asn Thr Phe Ile Pro Ser Arg Gly Lys Arg Ser Thr 255 260 265 taaagagacc cgagcaacca atcaaaatac ttgagcttga gtgacaataa acgacactga 1238 accattacat tcctcccaac taccactacc actaccactc acatcactat taccaccact 1298 gattaaccaa ttaaccaaac aaactaatca accgtgattg ctgccatctt gcaaattgtc 1358 cagtggttac gaccagatac aatgagattc gaagagattc gacaacatat agtctgcttt 1418 aaaaacgctt cgcgtattaa ctgtttgacg taataatctc atgttacaca aaaacttgtg 1478 cgtgtaattt acagaatgtt tttgtcgttt ttttttaatt ataattttcc agtgttttcc 1538 ataatggatc ctgcgattac tttaggttgt atgacaataa ataaaaaaaa ctgttttctt 1598 ttggaataaa tcattcgtta aggaatcatg aactaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1658 aa 1660
【図１】実施例２における、本発明のペプチドである化
合物（１）の最終溶出パターンを示す逆相ＨＰＬＣの展
開図である。
合物（１）の最終溶出パターンを示す逆相ＨＰＬＣの展
開図である。
【図２】実施例３における、本発明のペプチドである化
合物（２）の最終溶出パターンを示す逆相ＨＰＬＣの展
開図である。
合物（２）の最終溶出パターンを示す逆相ＨＰＬＣの展
開図である。
【図３】実施例４における、本発明のペプチドである化
合物（３）の最終溶出パターンを示す逆相ＨＰＬＣの展
開図である。
合物（３）の最終溶出パターンを示す逆相ＨＰＬＣの展
開図である。
【図４】実施例７における、本発明のペプチドである化
合物（１）について、マダコの心臓の拍動を増強させる
結果を示す図であり、マダコ１匹分に相当する量の化合
物（１）をチャンバーに加えた時の結果を示す。
合物（１）について、マダコの心臓の拍動を増強させる
結果を示す図であり、マダコ１匹分に相当する量の化合
物（１）をチャンバーに加えた時の結果を示す。
【図５】実施例７における、本発明のペプチドである化
合物（２）について、マダコの心臓の拍動を増強させる
結果を示す図であり、マダコ１匹分に相当する量の化合
物（２）をチャンバーに加えた時の結果を示す。
合物（２）について、マダコの心臓の拍動を増強させる
結果を示す図であり、マダコ１匹分に相当する量の化合
物（２）をチャンバーに加えた時の結果を示す。
【図６】実施例７における、本発明のペプチドである化
合物（３）について、マダコの心臓の拍動を増強させる
結果を示す図であり、マダコ１匹分に相当する量の化合
物（３）をチャンバーに加えた時の結果を示す。
合物（３）について、マダコの心臓の拍動を増強させる
結果を示す図であり、マダコ１匹分に相当する量の化合
物（３）をチャンバーに加えた時の結果を示す。
【図７】実施例８における、本発明の化合物（１）につ
いて、マデレゴキブリ後腸の収縮活性を示す図であり、
１×１０-6Ｍの化合物（１）をチャンバーに加えた時の
結果を示す。
いて、マデレゴキブリ後腸の収縮活性を示す図であり、
１×１０-6Ｍの化合物（１）をチャンバーに加えた時の
結果を示す。
【図８】実施例８における、本発明の化合物（２）につ
いて、マデレゴキブリ後腸の収縮活性を示す図であり、
１×１０-6Ｍの化合物（２）をチャンバーに加えた時の
結果を示す。
いて、マデレゴキブリ後腸の収縮活性を示す図であり、
１×１０-6Ｍの化合物（２）をチャンバーに加えた時の
結果を示す。
【図９】実施例８における、本発明の化合物（３）につ
いて、マデレゴキブリ後腸の収縮活性を示す図であり、
１×１０-6Ｍの化合物（３）をチャンバーに加えた時の
結果を示す。
いて、マデレゴキブリ後腸の収縮活性を示す図であり、
１×１０-6Ｍの化合物（３）をチャンバーに加えた時の
結果を示す。
【図１０】本発明のタキキニン関連ペプチドの前駆体ポ
リペプチドについてのアミノ酸配列式において、タキキ
ニン関連ペプチドに該当するアミノ酸配列の部分を説明
するための、アミノ酸を１文字表記により示した図であ
る。
リペプチドについてのアミノ酸配列式において、タキキ
ニン関連ペプチドに該当するアミノ酸配列の部分を説明
するための、アミノ酸を１文字表記により示した図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/435 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:19） 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 宅和 京子 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 財団法人サントリー生物有機科学研究所 内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA07 AA11 BA80 CA04 CA11 DA06 EA04 GA11 GA19 4B064 AG01 BA10 BH09 CA02 CA19 CC24 DA12 DA13 4B065 AA26X AA90Y AB01 BA02 CA24 CA46 CA48 4C084 AA01 AA03 BA17 BA18 BA23 CA51 ZA011 ZA012 4H011 AC01 AC02 AF01 BB06 BC18 BC19 DA03 DC11 DH10 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA15 BA16 CA52 EA06 EA21 EA50 FA34 FA74 GA01 GA15 GA23 GA25 HA03
Claims (15)
- 【請求項１】 次のアミノ酸配列式（Ｉ）： Ｒ1−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （Ｉ） （式中、Ｒ1はアミノ酸残基数５または６のペプチドを
表わし、ＸａａはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌまた
はＧｌｎを表わし、ＹａａはＧｌｙまたはＰｒｏを表わ
し、ＺａａはＳｅｒまたはＴｈｒを表わす）で表わされ
るタキキニン関連ペプチド。 - 【請求項２】 次のアミノ酸配列式（ＩＩ）： Ｒ2−Ａａａ−Ｂａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （ ＩＩ） （式中、Ｒ2はアミノ酸残基数３または４のペプチドを
表わし、ＡａａはＡｓｎ、ＴｙｒまたはＬｅｕを表わ
し、ＢａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｓｐを表
わし、ＸａａはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌまたは
Ｇｌｎを表わし、ＹａａはＧｌｙまたはＰｒｏを表わ
し、ＺａａはＳｅｒまたはＴｈｒを表わす）で表わされ
る、請求項１に記載のタキキニン関連ペプチド。 - 【請求項３】 マダコ（Ｏｃｔｏｐｕｓ ｖｕｌｇａｒ
ｉｓ）の脳から得られる請求項１または２に記載のペプ
チド。 - 【請求項４】 次のアミノ酸配列式（１）〜（６）： Ｈ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （１） Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （２） Ｈ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒ ｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （３） Ｈ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （４） Ｈ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （５） Ｈ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （６） で表わされる請求項１ないし３のいずれかに記載のペプ
チド。 - 【請求項５】 次のアミノ酸配列式（Ｉ）： Ｒ1−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （Ｉ） （式中、Ｒ1はアミノ酸残基数５または６のペプチドを
表わし、ＸａａはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌまた
はＧｌｎを表わし、ＹａａはＧｌｙまたはＰｒｏを表わ
し、ＺａａはＳｅｒまたはＴｈｒを表わす）で表わされ
るタキキニン関連ペプチドを有効成分とする医薬または
農薬。 - 【請求項６】 次のアミノ酸配列式（ＩＩ）： Ｒ2−Ａａａ−Ｂａａ−Ｐｈｅ−Ｘａａ−Ｙａａ−Ｚａａ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （ ＩＩ） （式中、Ｒ2はアミノ酸残基数３または４のペプチドを
表わし、ＡａａはＡｓｎ、ＴｙｒまたはＬｅｕを表わ
し、ＢａａはＡｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＡｓｐを表
わし、ＸａａはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｖａｌまたは
Ｇｌｎを表わし、ＹａａはＧｌｙまたはＰｒｏを表わ
し、ＺａａはＳｅｒまたはＴｈｒを表わす）で表わされ
るタキキニン関連ペプチドを有効成分とする医薬または
農薬。 - 【請求項７】 配列番号８に示すアミノ酸配列、あるい
はそのアミノ酸配列に対して１個または複数個のアミノ
酸の付加、欠失、および／または他のアミノ酸による置
換により修飾されたアミノ酸配列を有するタキキニン関
連ペプチドの前駆体ポリペプチド。 - 【請求項８】 配列番号８に記載のポリペプチドと同一
のアミノ酸配列、あるいはそのアミノ酸配列に対して１
個または複数個のアミノ酸の付加、欠失、および／また
は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配
列を有し、遺伝子組換え技術によって造成された形質転
換細胞の培養物から得られるタキキニン関連ペプチドの
前駆体ポリペプチド。 - 【請求項９】 配列番号１〜３に示すアミノ酸配列のう
ち、少なくとも１つをコードするポリヌクレオチドとハ
イブリダイズするポリヌクレオチドを用いて、遺伝子組
換え技術によって造成された形質転換細胞の培養物から
得られる、請求項１ないし４のいずれかに記載のタキキ
ニン関連ペプチドの前駆体ポリペプチド。 - 【請求項１０】 請求項７に記載のタキキニン関連ペプ
チドの前駆体ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする
遺伝子。 - 【請求項１１】 請求項１０に記載の遺伝子を含んでな
るベクター。 - 【請求項１２】 請求項１１に記載のベクターにより形
質転換された宿主。 - 【請求項１３】 請求項１２に記載の宿主を培養し、ま
たは生育させ、そして該宿主からタキキニン関連ペプチ
ドの前駆体ポリペプチドを採取し、当該前駆体ポリペプ
チドからタキキニン関連ペプチドの前駆体を切り出し、
続いてＣ末端をアミド化することを特徴とするタキキニ
ン関連ペプチドの製造方法。 - 【請求項１４】 請求項１３の方法で得られるタキキニ
ン関連ペプチド。 - 【請求項１５】 次のアミノ酸配列式（１）〜（７）： Ｈ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （１） Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （２） Ｈ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｐｒ ｏ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （３） Ｈ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （４） Ｈ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （５） Ｈ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅ ｒ−Ａｒｇ−ＮＨ2 （６） Ｈ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒ ｏ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ＮＨ2 （７） で表わされる請求項１４に記載のタキキニン関連ペプチ
ド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000138902A JP2001151796A (ja) | 1999-09-14 | 2000-05-11 | 新規タキキニン関連ペプチドおよびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-260982 | 1999-09-14 | ||
| JP26098299 | 1999-09-14 | ||
| JP2000138902A JP2001151796A (ja) | 1999-09-14 | 2000-05-11 | 新規タキキニン関連ペプチドおよびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001151796A true JP2001151796A (ja) | 2001-06-05 |
Family
ID=26544848
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000138902A Pending JP2001151796A (ja) | 1999-09-14 | 2000-05-11 | 新規タキキニン関連ペプチドおよびその前駆体ポリペプチドならびにこれらをコードする遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001151796A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013023482A (ja) * | 2011-07-22 | 2013-02-04 | Hiroshima Univ | 整腸作用組成物 |
| CN113891724A (zh) * | 2019-03-11 | 2022-01-04 | 阿奎诺沃有限公司 | 提高鱼饲料转化率和存活率的方法 |
-
2000
- 2000-05-11 JP JP2000138902A patent/JP2001151796A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013023482A (ja) * | 2011-07-22 | 2013-02-04 | Hiroshima Univ | 整腸作用組成物 |
| CN113891724A (zh) * | 2019-03-11 | 2022-01-04 | 阿奎诺沃有限公司 | 提高鱼饲料转化率和存活率的方法 |
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