JP4131569B2 - インシュリン様成長因子ｉ（ｉｇｆ−ｉ）発現系及び使用法 - Google Patents

Description

発明の背景
本発明は、安定なメッセンジャーRNA（mRNA）をコードするベクター及びかかるベクターを使用する方法に関する。特に、本発明は、遺伝子治療及び他の用途に有用なレベルで、組織内での組換え遺伝子の発現調節を確立するベクターに関する。さらに、本発明は、インシュリン様成長因子I（IGF-I）を発現し得るベクターに関する。
IGF-I及びIGF-IIは、筋芽細胞、神経細胞、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、内皮細胞及びケラチノサイトなどの多くの種類の細胞の成長及び分化を刺激する、低分子量ポリペプチドホルモン類である（Daughaday & Rotwein,1989,Endocrine Reviews 10:68-91）。IGF-Iの発現は、通常、成長ホルモンにより誘導され、成長ホルモンの増殖-促進能の多くは、（以前は、ソマトメジンと称されていた）IGF-Iにより媒介される。IGFは、半減期の循環を増加させ、インシュリン類似作用を阻害し、タイプIIGFレセプターへの結合を介して媒介された生物学的活性を調節するように機能する、高分子量結合蛋白質に結合して循環する。IGF-Iは、骨格筋の分化及び成長の促進において主たる役割を有する。IGFは、筋芽細胞の分裂及び融合を推進し、並びに末期段階での筋肉増殖及び肥大を刺激する重要な筋原性進行（myogenic progression factor）因子である。Florini（Florini & Magri,1989,Am.J.Physiol.（Cell Physiol）256:C701-C711）の研究により、筋発生は、IGFにより刺激されることが示されている。融合開始時、IGF/II及びIGF結合蛋白質の生合成及び分泌は、自然に、筋芽細胞中で増加する（Tollesfsenら.,1989,J.Biol.Chem.264:13810-13817）。これは、筋肉-特異性遺伝子産物の様子と一致する。
C2C12筋芽細胞培地中の筋原性発現ベクターにより誘導された、IGF-Iの生合成及び分泌が増加すると、筋原性ヘリックス-ループ-ヘリックス因子、MyoD、筋発生（myogenis）、デズミン、及び骨格アクチンmRNAの発現を強く刺激することが示されている（Colemanら.,1995,J.Biol.Chem.270:12109-12116）。逆に、IGF-IまたはIGF-II mRNAの5’配列に相補的なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドは、筋原性細胞列における同時分化及び筋発生（myogenin）の誘導を抑制することが知見された（Floriniら.,1991,Molecular Endocrinology 5:718-724）。
ネズミIGF-I遺伝子の１回のコピーを相同組換えにより不活化すると、IGF-Iが筋肉成長において役割を有する直接的証拠が知見された（Powell-Braxtonら.,1993,Genes Dev.7:2609-2617;Liuら.,1993,Cell 75:59-72）。IGF-I遺伝子を破壊すると、これらのIGF-I変異株の骨格筋の筋原線維の組織化が大きく減少し、深刻な筋ジストロフィーが発生した。呼吸不全により誕生時に死亡したネズミの多くは、おそらく、横隔膜及び肋間筋の成熟不全によるものであったろう。これらの観察から、IGF-Iは、胚の筋肉発達及び成長に必要な、中枢神経の栄養に関する（central trophic）成長因子であることが示唆される。
近年の研究でも、生後の筋肉成長及び肥大におけるIGF-Iの役割が論証されている。鳥類の筋繊維の一次培地の保存液中にIGF-Iを含ませると、未処理培地と比較して、繊維径が顕著に増大し、ミオシン含量が約2倍となり、蛋白質安定性及び合成が増加したことが知見された（Vandenburgら.,1991,Am.J.Physiol.260:C475-C484）。成長ホルモンを下垂体切除したラットに投与すると、IGF-I mRNAが顕著に増加し、特定の筋肉の質量が50%増加した（Englemannら.,1989,Mol.Cell.Endocrin.63:1-14）。IGF-I遺伝子の発現が、受動的な機械的ストレッチ及び急激なエクササイズにより増加したときには、筋肉肥大で対応する増加が知見された（Elginら.,1987,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 84:3254-3258）。
研究によっても、IGF-Iは、筋肉再生及び治療において重要であることが示唆されている。再生の特徴はけがによって変動するが、常に筋肉前駆体細胞（MPC）の増殖、筋管への融合、及び筋肉の神経再殖法を包含する。筋肉再生時、IGF-IはMPC増殖及び分化の強力な刺激剤として作用する（Grounds,1991,Path.Res.Pract.187:1-22）。研究から、IGF-Iは、筋肉損傷後24時間以内にサテライト細胞及び神経内で産生され、数週間にわたって増加したままであることが示されている。ネズミの筋肉再生において、損傷を受けた筋肉内のIGF-I mRNAのパターンは、開始（18〜24時間）からピーク（5日）までの、筋肉前駆体の複製と匹敵する。
反応性神経の急速な成長は、神経系では一般的である。神経の急速な成長は、因子を局所的に活性化することにより開始するものと考えられている。筋肉内神経の急速な成長は、粉砕して除神経することによる筋肉不活化後、約4日で検出することができる。Caroni及びSchneider,1994,J.Neurosci.14:3378-3388の近年の研究は、IGF-Iは、神経の急速な成長の誘導に必要であることを示している。研究から、in vivoでのIGF-Iの過発現は、神経の急速な成長を増進させるのに十分であろうことも示唆されている。
発明の概要
本発明は、一部において、都合の良い組織標的、発現、及び分泌特性を与える、特定の拡散配列の同定に基づく。かかる配列は、IGF-Iをコードする配列の運搬及び発現のため、IGF-Iをコードするプラスミドベクターの構築で使用する。
これらのベクターの発現は、組織特異性であってもよい。これらのベクターは、組織内での強化発現の促進、並びに組織特異性を有する発現を標的化するのに有用である。ベクター上にコードされた遺伝子の発現を標的化組織に制限することにより、これらのベクターを、遺伝子治療による疾病の治療に使用することができる。かかる配列を含有するベクターは、遺伝子運搬及び組織内での組換え遺伝子の規制発現を提供することができ；かかる発現は、遺伝子治療及び他の用途に有用な特定のレベルで行うことができる。これらのベクターは、研究または家畜改良のためのトランスジェニック動物を作るのにも使用することができる。
発現ベクターの産生物分泌を強化し、並びに特定の組織へ直接発現するという能力により、ベクターを多くの疾病の治療に使用することができる。上記ベクターは、組織が治療用産物を発現するように、治療用産物をコードするベクターを組織内に導入する遺伝子治療において使用することができる。例えば、組織に特定の栄養に関する因子（trophic factor）を発現させることにより、上記ベクターを、神経学的、筋肉的または全身性の疾病若しくは老化に付随する筋肉萎縮症の治療に使用することができる。上記ベクターは、組織に特定の凝集因子を発現させ、これらの因子を循環内で分泌させることにより、血友病の治療に使用することができる。さらに、上記ベクターは、組織に脂質代謝に含まれる特定の因子を発現させることにより、じゅく腫形成及びアテローム性動脈硬化症の心血管、脳血管、または辺縁-血管の疾病の予防または治療に使用することができる。
さらに、上記ベクターは、遺伝した遺伝子欠陥若しくは後天的ホルモン欠如（例えば、糖尿病）の遺伝子置換に、免疫応答を誘導させるためにヒト若しくは動物に予防接種するために、またはトランスジェニック動物を作り出すために、使用することができる。トランスジェニック動物は、化学的及び物理的発ガン性物質の作用を評価するため、並びに種々の遺伝子及び遺伝子調節成分の作用を研究するため、ヒトの疾病を研究するため、新規治療法を評価及び調査するためのモデルとして使用することができる。さらに、トランスジェニック動物は、市場的に重要な家畜種を開発するのに使用することができる。上記ベクターは、特定の蛋白質及びRNAをin vitroで産生するために細胞を形質転換させるのにも使用することができる。
脊椎動物、例えば、ヒトの体内で、IGF-Iをコードする配列を有するかかるベクターが発現すると、直接的及び間接的効果のいずれをも発生し得る。IGF-Iは、IGF-Iポリペプチドの直接作用により、直接的効果を発生する。しかしながら、他の遺伝子の発現におけるIGF-I誘導または転換の効果により、間接的効果も発生し得る。
第１の態様では、本発明は、安定なmRNAをコードすることによる、組織内での核酸配列の発現のためのベクターを特徴とする。ベクターは、アクチン遺伝子プロモーター配列由来のプロモーター配列を包含する、核酸カセットを発現させるために必要な配列を包含する5’フランキング配列を包含する。ベクターは、核酸カセットから発現された産物の分泌を促進する、成長ホルモン遺伝子の3’領域由来の3’UTR及び／または3’NCRを包含する、3’フランキング領域をも包含する。3’UTRは、成長ホルモン遺伝子由来であるのが好ましい。或いは、関連ベクターにおいて、分泌を促進させるよりも、組織内、例えば、筋肉組織内で高レベルの産生物を保持するために3’配列を選択することができる。例えば、かかる配列は、骨格α-アクチン遺伝子由来のものであってもよい。ベクターは、5’フランキング配列を核酸に結合するリンカーをも包含する。リンカーは、該リンカーが本来的に結合する遺伝子のコード配列を含まない。即ち、リンカーは、5’及び3’領域のついた通常の遺伝子ではない。リンカーは、IGF-I遺伝子をコードする配列を包含するのが好ましく、ヒトIGF-Iをコードする配列を包含するのがより好ましい。3’フランキング領域は、核酸カセットを挿入するための位置の3’側にある。
本明細書で使用する「フランキング領域」なる用語は、結合した遺伝子のいずれかの側の上にあるヌクレオチド配列を指す。フランキング領域は、当該特定の遺伝子の3’側または5’側のいずれかであり得る。通常、フランキング配列は、特定の遺伝子の発現を調節するのに必要な成分（element）を含む。かかる成分は、効率的な発現並びに組織特異的発現に必要な配列を包含するが、これらに限定されない。効率的な発現に必要な配列の例としては、DNAの蛋白質コード領域に隣接するか、またはこの中の特異的な調節配列若しくは成分であり得る。遺伝子に隣接して存在するこれらの成分は、cis-作用成分とも称される。シグナルは、転写活性を変更させるために、transで他の拡散可能な生体高分子により認識される。これらの生体高分子は、trans-作用因子と称される。trans-作用因子及びcis-作用成分は、遺伝子の発生発現パターン及びタイミングに寄与することが示されている。cis-作用成分は、通常、転写を調節すると考えられており、通常、プロモーター領域内及び上流（5’）または下流（3’）DNAフランキング領域内に見られる。
組織内で遺伝子の発現を調節する調節成分のついたフランキングDNAは、特異的因子、例えば、グルココルチコイド、アンドロゲン、プロゲスチン、アンチプロゲスチン（PCT US 93/04399;PCT US 96/04324）、ビタミンD₃及びその代謝物、ビタミンA及びその代謝物、レチノール酸、カルシウム並びに他のものにより調節される、調節または制御配列をも包含する。
本明細書で使用する「調節」または「制御」配列とは、3’または5’フランキング領域にある配列を指し、かかる配列は、関連する遺伝子の転写の活性化及び／または抑制を促進し得る。
本明細書で使用する「応答性」または「応答する」なる用語は、以下に述べる遺伝子の転写の活性化及び／または抑制の強化を指す。
本明細書で使用する「代謝産物」なる用語は、遺伝子発現を調節する調節因子の代謝由来の任意の産物を指す。
上記の他に、3’または5’フランキング配列のいずれかまたはその両方は、組織特異性の原因となり得る。かかる組織特異性により、特定の細胞または組織において、優位に発現がもたらされる。
本明細書で使用する「優位に」なる用語は、3’または5’フランキング領域に結合した遺伝子が、非特異的組織においては発現が低いか、または全く発現しないのと比較して、特異的組織においてのみ高度に発現することを意味する。本明細書中で使用する3’または5’フランキング領域は、単独または一緒に、他の組織で結合遺伝子の発現を提供し得るが、その程度は、発現が優位である組織または細胞における発現より低い。発現は、特異的な組織で優先的である。かかる優位な発現は、他の非特異的組織または細胞と比較して、特定の組織または細胞型における遺伝子の自然発現（即ち、in vivoで細胞内に知見される）で知見されるのと同一規模の差異と匹敵し得る。かかる差異は、mRNAレベルの分析または自然の遺伝子産物、組換え遺伝子産物若しくはレポーター遺伝子の発現により観察することができる。さらに、本明細書中で述べ且つ当業界で公知のノーザン分析、X gal蛍光抗体法またはCATアッセイを使用して、かかる差異を検出することができる。
3’フランキング領域は、例えば、それが結合した核酸配列の発現を調節する3’UTR及び／または3’NCRなどの、配列または領域を含有する。3’フランキング領域は、結合した遺伝子に組織-特異的発現を提供することができる。3’フランキング領域は、転写末端シグナルをも含有する。
本明細書で使用する「3’フランキング領域」なる用語は、mRNAプロセシング及び／または組織-特異的発現の原因である自然の配列3’の部分から遺伝子の転写部分を包含する。かかる部分は、公知の方法により容易に規定することができる。例えば、mRNA安定性及び／または組織-特異的発現の原因である3’フランキング領域の部分は、選択されたベクター系での所望の3’フランキング領域活性を規定するために作り出された突然変異体分析または種々のクローンによりマップ化することができる。
3’フランキング領域は、3’UTR及び／または3’NCRを含有することができる。「3’非翻訳領域」即ち「3’UTR」なる用語は、DNAから転写されたが、蛋白質に翻訳されていない、構造遺伝子の3’末端の配列を指す。この3’UTR領域は、ポリ（A）配列を含有しないが、通常、ポリ（A）配列が付加される部位を含有する。ポリ（A）配列は、翻訳プロセスの後でのみ付加される。
筋原性-特異的3’UTR配列を使用して、筋肉細胞または他の組織で特異的に安定化させることができる。上述の如く、筋原性-特異的配列とは、筋肉細胞、例えば、骨格、心臓及び平滑筋細胞で通常発現される遺伝子配列を指す。筋原性-特異的mRNA安定性により、筋原性細胞内でmRNA安定性が増加する。安定性が増加すると、発現が増加する。3’UTR及び3’NCR配列は、単独または一緒に、高いmRNA安定性により高レベルのmRNAを蓄積することができる。かくして、mRNAの安定性及び／または発現が増加すると、蛋白質産生レベルが増加する。
「3’非-コード領域」即ち「3’NCR」なる用語は、構造遺伝子の3’UTR領域に隣接する領域を指す。3’NCR領域は、通常、転写末端シグナルを含有する。一度転写が起きたら、翻訳前に、3’NCRによりコード化されたRNA配列は、通常、ポリ（A）配列がmRNAに付加され得るように除去される。3’NCR配列も、上述の如く、mRNAを安定化させるために使用することができる。3’NCRは、核酸カセットの転写速度をも増加させることができる。
3’UTR及び3’NCR配列のいずれかまたはその両方を、筋原性-特異的遺伝子の一群から選択することができる。筋原性-特異的遺伝子の例としては、骨格α-アクチン遺伝子、耐性ミオシン-軽鎖1/3遺伝子、ミオシン-重鎖遺伝子、トロポニンT遺伝子、アセチルコリンレセプターサブユニット遺伝子及び筋肉クレアチニンキナーゼ遺伝子が挙げられる。
本発明の3’フランキング配列に関して、「成長ホルモン」なる用語は、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモンまたはウシ成長ホルモンとして同定される遺伝子産物を指す。相同の遺伝子配列は、種々の脊椎動物に関して当業界では公知である。別の態様では、ベクターは、かかる成長ホルモン遺伝子由来の3’UTR配列を包含する、3’配列を包含することができる。3’配列は、例えば、ヒト成長ホルモン3’UTRからALU反復配列を除去することによって、動物で自然に知見される配列から修飾し得る。ALU反復配列またはALU反復-様配列の除去は、種々の3’配列で実施することができ；かかる除去は、通常、相同の組換え速度を低下させる。種々の他の修飾は、組織標的化、安定化及び3’配列の分泌特性を損なわずに実施することができる。
5’フランキング領域は、5’から発現すべき結合遺伝子または核酸配列に存在する。3’フランキング領域と同様に、5’フランキング領域は、公知の方法により規定することができる。例えば、5’フランキング領域の活性部分は、選択されたベクターの所望の活性を規定するために作られた5’フランキング領域の種々のクローンまたは突然変異体分析によりマッピングすることができる。5’フランキング領域としては、上記調節配列または成分の他に、結合遺伝子の発現に関して、配列的及び位置的に好適な関係にある、プロモーター、TATAボックス、及びCAP部位が挙げられる。
本発明において、「発現に必要な配列」とは、核酸カセット内で遺伝子の発現を制御する、配列的及び位置的に好適な関係にある5’フランキング領域の成分である。発現遺伝子が、遺伝子治療及び遺伝子運搬を含む他の用途で有用であるように、発現は、組織内で特定のレベルに制御される5’配列は、組織-特異的発現を調節する成分を包含することができるか、または組織-特異的発現の原因である自然の5’成分の一部を包含することができる。
本明細書で使用する「プロモーター」なる用語は、RNAポリメラーゼが結合するDNA鎖上の認識部位を指す。プロモーターは、通常、転写開始部位またはCAP部位の5’フランキングDNA上流の約100〜約200塩基対（真核生物遺伝子における）のDNAフラグメントである。プロモーターは、転写活性を開始且つ作動させるために、RNAポリメラーゼと「開始複合体」を形成する。複合体は、「エンハンサー」と称される配列または「サイレンサー」と称される阻害配列を活性化することにより修飾することができる。プロモーターは、5’フランキング領域と自然に（即ち、in vivoで細胞内にあるかの如く結合）または非-自然に結合したものであってもよい。
種々のプロモーターを使用することができる。幾つかの例としては、チミジンキナーゼプロモーター、筋原性-特異的プロモーター、例えば、骨格α-アクチン遺伝子プロモーター、耐性（fast）ミオシン軽鎖1プロモーター、ミオシン重鎖プロモーター、トロポニンTプロモーター、及び筋肉クレアチニンキナーゼプロモーター、並びに非-特異的プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（immediateearly）プロモーター、Rous SarcomaウイルスLTRが挙げられる。本発明で使用するこれらのプロモーターまたは他のプロモーターは、結合遺伝子の発現を増加させるために突然変異させることができる。さらに、プロモーターは、それ自体または他のプロモーター、並びに種々のエンハンサー、転写安定剤、またはベクターの機能を増加させ得る他の配列と組み合わせて使用することができる。
本明細書で使用する「突然変異」とは、通常、遺伝子の機能特性を変化させる遺伝子材料の配列における変化を指す。これには、自然の遺伝子プロモーター配列でたった1個の塩基が変化した場合や、複数の塩基が変化した場合の遺伝子突然変異が含まれる。
本明細書で使用する「イントロン」なる用語は、前駆体RNAに含まれているが、翻訳前に、転写RNAのプロセシング時には切り落とされる、遺伝子の転写部位のDNA区分を指す。従って、イントロン配列は、mRNAにも見られず、蛋白質にも翻訳されない。本明細書で使用する「エキソン」なる用語は、遺伝子の転写に含まれ、成熟mRNAの一部となるために細胞内でRNAのプロセシングに残存する遺伝子の部分を指す。エキソンは、通常、RNA転写の３つの別個の機能性領域をコードする。5’非-翻訳領域（5’UTR）と称される、蛋白質に翻訳されない5’末端にある第１のものは、RNA転写の開始信号を出し、mRNAをリボソームに誘導する配列を包含し、mRNAを蛋白質合成が起きるようにリボソームと結合させる。第２のものは、蛋白質のアミノ酸配列に翻訳される情報を含有するか、生物活性RNA分子として機能する。第３の、蛋白質に翻訳されない3’末端、即ち、3’UTRにあるものは、翻訳の終止及びポリアデニル化末端（ポリ（A））の付加の信号を出す。特に、上記定義の如く、3’UTRは、mRNAを安定化することができる。イントロン/エキソン境界は、イントロン区分がエキソン部分と結合する特定の遺伝子にある部分であろう。本明細書で使用する「TATAボックス」及び「CAP部位」なる用語は、当業者に公知である。
本明細書で使用する「リンカー」なる用語は、特異的な制限エンドヌクレアーゼに関する認識部位を含有するDNAを指す。リンカーは、幾つかの他の酵素による開裂で製造されるDNAフラグメントの末端に連結することができる。特に、リンカーは、発現すべき特異的核酸配列を含有する核酸カセットを挿入するための認識部位を提供する。この認識部位は、リンカーのエンドヌクレアーゼ部位であってもよく、例えば、Cla-I、Not-I、Xmal、Bgl-II、Pac-I、Xhol、Nhel、Sfi-Iがあるが、これらに限定されない。リンカーは、唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位が開始コドン（例えば、AUG）または終止コドン（例えば、TAA、TGA、TCA）を含有し、これらの重要なコドンが、蛋白質をコードする配列がリンカーに連結するときに再構築されるように設計することができる。このようなリンカーは、通常、NcoIまたはSphI部位を包含する。
本明細書で使用する「リーダー」なる用語は、遺伝子に沿って転写され翻訳される構造遺伝子の5’末端のDNA配列を指す。通常、リーダーにより、時折プロ-シークエンスと称されるn-末端ペプチド延長を有する蛋白質となる。細胞外培地または膜に分泌が予定される蛋白質に関しては、このシグナル配列は、そこから好適な目的に放出されるエンドプラスミン組織（reticulum）に蛋白質を誘導する。通常、リーダー配列は、所望の核酸によりコードされ、種々の遺伝子配列から合成により誘導されるか単離される。種々の蛋白質由来の種々のリーダー配列を本発明のベクターに使用することができる。幾つかの非-限定的な例としては、ゲルソリン、アルブミン、フィブリノーゲン及び他の分泌血清蛋白質が挙げられる。
本明細書で使用する「ベクター」なる用語は、核酸、例えば、プラスミド、コスミド、ファスミド（phasmid）若しくはバクテリオファージから誘導されるか、または、核酸の１つ以上のフラグメントが挿入若しくはクローン化されて、特定の遺伝子をコードする、化学的若しくは酵素的手段により合成されるDNAを指す。ベクターは、この目的に関して１つ以上の特徴的な（unique）制限部位を含有することができ、クローン化配列が複製されるように、特定の宿主または有機体で自動複製（autonomous replication）することができる。ベクターは、線状、環状または超コイル配置を有することができ、特定の目的に関して他のベクターまたは他の物質と複合体形成することができる。ベクターの成分としては、これらに限定されないが、（1）治療または所望の産物をコードする配列；及び（2）転写、翻訳、RNA安定性及び複製に関する制御成分を包含するDNA分子が挙げられる。
ベクターを使用して、組織内に核酸配列を発現させることができる。本発明において、この発現は、治療用蛋白質の分泌及び／または核酸配列由来のmRNA転写情報に安定性を与えることにより増進される。発現は、ベクター内に挿入された遺伝子または核酸配列の効率的な転写を包含する。発現産物としては、純粋な蛋白質（ポリペプチド）、糖蛋白質、リポ蛋白質、リン蛋白質、または核蛋白質などの蛋白質があり得るが、これらに限定されない。発現産物は、RNAであってもよい。核酸配列は、核酸カセット内に含有される。核酸の発現は、連続であるか、または内因性若しくは外因性刺激により制御され得る。
本明細書で使用する「制御」または「制御された」なる用語は、治療効果が得られるように、十分に高いレベルでの遺伝子産物（蛋白質またはRNA）の発現に関する。治療効果に十分なレベルは、毒性レベルよりも低い。選択された組織内における治療効果のための発現レベルは、摂取の再現可能な反応速度論、細胞からの排除、ポスト-翻訳プロセシング、及び遺伝子発現レベル、並びに特定の場合には、特定の内因性若しくは外因性刺激（例えば、ホルモン、薬物）に応答する発現調節に対応する。
本明細書で使用する「核酸カセット」なる用語は、蛋白質またはRNAをコードする、重要な遺伝子材料を指す。核酸カセットは、カセット内の核酸がRNAに転写されて、必要により形質転換された組織または細胞内の蛋白質に翻訳されるように、ベクター内の適当な位置に順に配列されている。好ましくは、カセットは、ベクター内に直ちに挿入するためにつけられた3’と5’末端を有する、例えば、各端部に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。本発明のベクターにおいて、核酸カセットは、インシュリン-様成長因子I（IGF-I）、例えば、ヒトIGF-Iをコードする配列を含有する。
本明細書で使用する「組織」なる用語は、特定の機能を発するように分化された細胞の集合体を指すか、または単一細胞を包含してもよい。細胞は、同一種であっても、異なる種類であってもよい。
本明細書で使用する「遺伝子」、例えば、「筋原性遺伝子」なる用語は、本明細書中に例示された遺伝子及び他の種類の動物または他の組織内の等価物を指す。相同配列（即ち、同一上科の構成員の共通の進化源を有する配列）または類似配列（即ち、別個の進化源ではあるが共通の特性を有する配列）は、これらが同等の特性を本明細書に記載されるものに提供する限り、含まれるものとする。本発明において、選択された配列が、強化レベルの発現、好適な産物の発現及び／または、本明細書中に記載された組織-特異性発現を提供するという点で重要である。当業者は、かかる機能に必要な最小の配列は、上記定義により包含されることを理解するだろう。これらの最小配列は、本明細書中に例示される標準的な方法により容易に決定される。
「筋源性（myogenic）」なる用語は、筋肉組織または細胞を指す。筋肉組織または細胞は、in vivo、in vitro、またはin vitro組織培地であってもよく、筋肉組織に分化することができる。筋源性細胞としては、骨格、心臓及び平滑筋細胞が挙げられる。遺伝子が筋源性細胞で発現または優先的に発現される場合には、遺伝子は、「筋源性」または「筋源性-特異性（myogenic-specific）」と称される。ベクターが筋源性筋肉組織または細胞で優先的に機能する場合には、ベクターは、「筋原性」または「筋原性-特異性」と称される。ベクターの筋原性活性は、これらのベクターの培地内筋原性細胞へのトランスフェクションにより決定され、無傷の筋肉組織に注入され、または筋原性細胞で重要な蛋白質若しくはRNAを発現するトランスジェニック動物を作るためにゲノム内にしっかりと取り込まれるべき哺乳類卵母細胞に注入することができる。
「非-筋源性」なる用語は、筋肉以外の組織または細胞を指す。組織または細胞は、in vivo、in vitroまたはin vitro組織培地であってもよい。
好ましい態様では、上記ベクターは、筋原性遺伝子、特に骨格α-アクチン遺伝子、例えば、ニワトリ骨格α-アクチン遺伝子由来のその5’フランキング領域を有していてもよい。特に、イントロンを包含する、他の5’UTR配列と結合し得るプロモーター配列を包含していてもよい。ニワトリ骨格α-アクチンプロモーター及び／または他の5’フランキング配列を有するベクターを本明細書で例示するが、α-アクチン遺伝子の5’フランキング配列も高度に保存されるので、そのような5’α-アクチン配列は、例えば、ヒトを含む他の脊椎動物種から利用することができる。
3’UTRは、成長ホルモン遺伝子、好ましくはヒト成長ホルモン遺伝子由来であり、好ましくはポリ（A）シグナルを包含する。この配列は、発現すべき蛋白質またはRNAをコードするcDNAの自然の翻訳終止コドンの直後に結合することができる。上述の如く、これらの領域は、日常的な方法、例えば、欠失若しくは突然変異分析またはその等価物によってさらに且つより詳細に規定することができる。
5’または3’配列は、自然に知見される配列と同一配列を有してもよいが、かかる5’または3’配列が取り込まれるベクターに等しく機能する変性配列を有していてもよい。例えば、そのような変化は、上記領域の任意の10個のヌクレオチドの変化であってもよい。特に、そのような変化には、3’UTR由来のALU反復配列の欠失を包含することができる。これは単なる例示であり、非-限定的である。
好ましい態様では、IGF-Iをコードする配列は、合成のIGF-Iコード配列である。そのような合成配列は、自然のヒトIGF-Iコード配列と異なるヌクレオチド配列を有する。配列が最適コドン法（usage）を利用するのが好ましく、好ましくは、コドンの少なくとも50%、70%または90%が最適化される。かくして、好ましい態様において、合成DNA配列は、SEQ ID NO.1の配列と少なくとも80、90、95または99%の配列同一性である。特に好ましい態様において、合成DNA配列は、SEQ ID NO.4の配列と少なくとも95%の同一性、より好ましくは少なくとも99%の同一性、最も好ましくは100%の同一性を有する。
さらに、上記ベクターの別の態様は、核酸カセットの発現を調節するための調節系を含有することができる。本明細書で使用する「調節系（制御系）」なる用語は、幾つかの特性において、重要な核酸の発現を調節する、上記ベクター内に取り込まれたcis-作用またはtrans-作用配列、並びに上記ベクターと共に細胞内で同時-発現するtrans-作用遺伝子産物を指す。調節系は、調節の際、通常の発現レベルまたは現行の発現レベルから発現を上向きに調節（up-regulation）または下向きに調節（down regulation）することができる。この系により、核酸の発生の発現パターン及びタイミングに寄与することができる。
制御系の１つの構築物としては、細胞内でベクターの発現を調節することができる血清応答因子の成分を取り込むキメラのtrans-作用調節因子がある。キメラのtrans-作用調節因子は、血清応答因子の通常のDNA結合ドメイン配列をレセプターのDNA結合ドメイン配列で置き換えることにより構築する。血清応答因子は、不変のトランス作用ドメインを有する。トランス作用ドメインは、レセプター結合部位に特異的な薬剤またはリガンドがレセプターに結合する際に、転写を活性化させることができる。
キメラのtrans-作用調節因子に取り込まれる、レセプターのDNA結合ドメイン配列は、ビタミン、ステロイド、甲状腺、孤児（orphan）ホルモン、レチノール酸、サイロキシン、またはGAL4レセプターなどの種々のレセプター群から選択され得るが、これらに限定されない。キメラのtrans-作用調節因子は、通常、プロモーターの配列内に存在する。好ましい一態様では、ベクター内に使用するプロモーターは、α-アクチンプロモーターであり、レセプターは、ビタミンDレセプターである。
本明細書で使用する「レセプター」なる用語は、自然のレセプター（即ち、in vivoで細胞内に知見されるもの）並びに同様に結合し、細胞内で区画化変化（compartmentalization）を与える任意のものを包含する。
調節系の別の態様では、2つの機能性ユニットをもつベクターの構築物を包含する。1つの機能性ユニットはレセプターを発現する。この機能性ユニットは、プロモーター、レセプターをコードする核酸配列、及び3’UTR及び／または3’NCRを包含する発現に必要な成分を含有する。第２の機能性ユニットは、治療用蛋白質またはRNAを発現し、さらに、レセプターに対応する応答成分、プロモーター、核酸カセット及び、3’UTR及び／または3’NCRを含有する。これらの機能性ユニットは、同一または別個のベクター内にあってもよい。
第１の機能性ユニットは、レセプターを発現する。標的組織内で高レベルでは知見されないレセプターを使用するのが好ましい。レセプターは、薬剤またはリガンドがレセプターと結合する前、結合と同時または結合後に、第２の機能性ユニット上の応答成分と、例えば、イオン性、非-イオン性、疎水性、H-結合などの相互作用を形成する。この相互作用により、核酸カセット発現を調節することができる。レセプターは、上記と同一の非-限定的な群から選択することができる。さらに、ベクターは、筋源性特異的3’UTR及び／または3’NCR配列を使用することにより、筋原性特異的であってもよい。
例示的に好ましい態様において、プラスミドは、pIG0552またはpIG0552の配列と同一のヌクレオチド配列を含むプラスミドであってもよい。これは単なる例示であり、非-限定的な意味である。かくして、配列変化または変形を、5’及び3’フランキング領域などの、１つ以上の配列成分に製造することができる。この例示的なベクターに関して使用した配列は、筋肉及び他の多くの組織内に自然に知見される形態と等しい長さのシグナル配列を有するポリペプチドを産生するIGF-I RNAスプライシング産物を与えるという好都合な点を有する。
この点において、「同一」なる用語は、配列が機能的に等価であり、高度の配列同一性を有することを意味する。しかしながら、配列は、例えば、置換、欠失または１個以上のヌクレオチドの付加によって、低レベルの配列差（sequence difference）を有していても良い。そのような配列は、好ましくは、全配列の10%未満であるのが好ましく、5%未満であるのがより好ましく、1%未満であるのがさらに好ましい。
好ましい態様において、上記態様のベクターは、記載の成分若しくは配列を含んでいてもよく、これらから本質的になっていてもよく、またはこれらからなっていてもよい。
「含む」とは、「含む」なる用語の前のものを全て包含することを意味するが、これらに限定されない。かくして、「含む」なる用語を使用することは、列記された成分が必要または必須であることを意味するが、他の成分は、任意であって、存在しても存在しなくても良いことを示す。「からなる」とは、「からなる」の成句の前のものを全て包含することを意味し、これらに限定される。かくして、「からなる」なる成句は、列記された成分が必要または必須であることを意味し、他の成分は存在しないことを示す。「から本質的になる」とは、当該成句の前に列記された全ての成分を包含することを意味し、列記された成分に関して明細書で特定した活性若しくは作用に寄与またはこれらと抵触しない他の成分に限定されることを意味する。かくして、「から本質的になる」なる成句は、列記された成分が必要または必須であることを意味するが、他の成分は任意であり、列記された成分の活性若しくは作用に作用してもしなくてもいずれにしても、存在しても存在しなくても良い。
本発明の関連する態様では、細胞内にIGF-I遺伝子、好ましくはヒトIGF-I遺伝子を運搬し発現させるための配合物（formulation）を提供する。この配合物は、例えば、ベクターを安定化させたり、トランスフェクション効率を増加させるように作用し得るが、他の機能をも提供し得る１つ以上の他の成分と共に、上記ベクターを包含する。好ましい態様において、配合物は、約0.5%〜50%ポリビニルピロリドン（PVP）、好ましくは約5%PVPを有する水溶液中にベクターを包含する。好ましくは、PVPは、約50,000g/molの重量平均分子量を有する。詳細な情報は、PCT US 95/17038号に開示されている。しかしながら、配合物の他の例では、（例えば、米国特許第4,897,355号、1990年1月30日発行に記載の如く）カチオン性脂質を有するベクターを含み得、例えば、中性の副-脂質（co-lipid）などの副-脂質をも包含することができる。
本発明の配合物に関しては、「約」なる用語は、好ましい態様において、特定のパラメーターに関する実際の値が、記載の値の50%〜200%の範囲内であることを示す。
本発明の別の関連する態様では、トランスジェニック動物、本発明の第１の態様のベクターを含有する少なくとも幾つかの細胞を特徴とする。これらの細胞には、胚または身体細胞を包含する。トランスジェニック動物は、化学的及び物理的発ガン性物質の作用を評価し、種々の遺伝子及び遺伝子調節成分の作用を研究するために、ヒトの疾病を研究し、新規治療法を評価及び探求するためのモデルとして使用することができる。さらに、トランスジェニック動物は、市場で重要な家畜種の開発にも使用することができる。
本発明の第４の関連する態様は、IGF-I核酸配列、好ましくはhIGF-I核酸配列の発現に関する、本発明のベクターで形質転換させた細胞を特徴とする。
本明細書で使用する「形質転換」とは、遺伝子産物を発現させる遺伝子の作用による、細胞内の表現型の特徴での変化である。表現型の特徴の変化を引き起こす遺伝子を細胞内にトランスフェクトした。
本明細書で使用する「トランスフェクション」なる用語は、細胞または有機物によってDNAを摂取することを含む遺伝子運搬のメカニズムを指す。細胞内に入った後、形質転換DNAは、宿主細胞の染色体内に物理的に組込むことにより宿主の染色体を組換えるか、複製されずにエピソーム成分として瞬間的に保持されるか、またはプラスミドとして独立して複製することができる。形質転換DNAは、組込まないのが好ましい。
トランスフェクションは、以下に記載したようなin vivo方法、または細胞を選択可能なマーカーを含有するベクターで同時トランスフェクトするex vivo方法により実施することができる。この選択可能なマーカーは、形質転換した細胞を選択するのに使用する。トランスフェクション/形質転換研究で使用すべき選択可能なマーカーの種類は、当業者には公知である。そのようなマーカーの一例としては、ネオマイシン/カナマイシン耐性を提供するneo遺伝子がある。
トランスフェクション/形質転換は、組織-特異性であり得、即ち、選択した組織内で優位に核酸カセットを発現させる筋原性特異性ベクターの使用を包含する。特に、組織特異性は、筋原性組織発現に関して特異的なプロモーター及び／または3’UTR及び／または3’NCR配列を使用することにより、筋原性細胞に誘導することができる。
本発明の第５の関連する態様は、本発明のベクターで細胞をトランスフェクトする方法を特徴とする。これらの方法は、細胞をトランスフェクトするのに十分な時間、細胞をin situで本発明のベクターと接触させる段階を含む。上述の如く、トランスフェクションは、in vivoまたはex vivoであってもよい。
本発明の第６の関連する態様は、IGF-I遺伝子、好ましくはhIGF-I遺伝子の運搬及び発現方法を提供する。本方法は、第１の態様のベクターで複数の細胞をトランスフェクトし、次いでIGF-Iをコードするベクターの核酸配列を発現させる条件下で、上記細胞を培養することを含む。「発現させる条件」とは、in vivo及びin vitro条件といった、種々の任意の条件であってもよい。そのような条件下で、細胞は、ベクターDNAから検出可能な量の遺伝子産物を産生する。
本発明の第７の関連する態様は、上記参照ベクターで細胞をトランスフェクトすることにより、疾病または症状を治療する方法を特徴とする。そのような疾病の症状は、局所的または全身的であってもよい。疾病の例としては、筋肉萎縮症、じゅく腫形成、アテローム性動脈硬化症の心血管の、脳血管の、または辺縁-血管の疾病、糖尿病、神経障害、成長異常症及び血友病が挙げられるが、これらに限定されない。これらのベクターは、インシュリン-様成長因子Iをコードする核酸配列を含有する。
治療すべき筋肉萎縮症は、どんな種々の原因によるものであってもよい。例えば、筋肉虚弱は、主に、例えば、間接置換術などの条件で通常発生する、不使用による萎縮症（disuse atrophy）によるものであってもよい。同様に、筋肉虚弱及び萎縮は、低運動ニューロン損傷（lower motor neuron injury）に従属的であってもよい。そのような低運動ニューロン損傷は、例えば、肘トンネル症候群、Bell麻痺、手根骨トンネル症候群、脊椎破砕または糖尿病性神経障害などの多くの原因を有することがある。原因としては、例えば、筋ジストロフィーといった、筋肉萎縮症の遺伝的原因をも包含することができる。これらの原因及び症状は、単なる例示であって、本発明を限定するものではない。
かくして、「局所的」疾病または症状とは、身体の特定または限定された部分に特異的な神経または筋肉損傷または萎縮症がある疾病または症状を指す。特定例としては、不使用による萎縮症がある。「全身的」疾病の症状とは、有機体全体に関連するものを指すか、または体内の種々の場所に広く分散している症状を指す。例としては、糖尿病、成長異常症、神経障害及び筋ジストロフィーが挙げられる。
本発明の疾病を治療する方法は、ベクターを適用することにより、組織内にIGF-Iの発現を確立する方法を特徴とする。これらの上記ベクターを使用する方法は、ヒト、動物または組織培地に有効量のベクターを適用する段階を含む。
本明細書で使用する「適用（投与）する」または「適用（投与）」なる用語は、体内にDNAのキャリヤーまたはベクターを導入する経路を指す。上記方法及び以下に記載する方法のベクターは、種々の経路で適用することができる。特に、治療に好ましい標的細胞は、骨格筋細胞である。
本明細書で使用する「骨格筋」なる用語は、身体の筋肉組織、即ち、横紋筋のバルクを含むこれらの細胞を指す。
適用は、標的組織に直接してもよいし、全身投与後の標的化運搬を含んでも良い。好ましい態様は、筋肉に直接注射するか、または静脈注射後、筋肉に標的化摂取によるものである。
「運搬（輸送）」なる用語は、適用後、ベクターを好ましい標的細胞と接触させることによるプロセスを指す。適用としては、細胞、組織、流体空間若しくは血管への注射、エレクトロポレーション、トランスフェクション、ハイポスプレー、イオン導入法、パーティクルボンバードまたはex vivoで遺伝子的に修飾した細胞の移植がある。適用例としては、静脈内、筋肉内、エーロゾル、経口、局所、全身、眼上、腹膜内及び／または鞘内が挙げられる。
上記ベクターを適用する好ましい手段としては、遺伝子発現が発生し得る標的細胞の核にベクターの導入を促進する成分、例えば、脂質、蛋白質、炭水化物、合成有機化合物または無機化合物とベクターが結合する標的細胞に運搬するための配合物の使用がある。特定例としては、PVPが挙げられる。
本明細書で使用する「配合物」なる用語は、ベクターの組織への運搬、組織内での細胞による摂取、膜、エンドソーム若しくは細胞質を介する核内への細胞間運搬（trafficking）、細胞外若しくは細胞間区画でのベクターの安定性、及び／または細胞による遺伝子材料の発現を促進する、溶液、懸濁液またはコロイド内でベクターと混合した非-遺伝子材料を指す。
本発明の好ましい態様において、ベクター及び配合物は、懸濁液またはコロイドとして適用するナノ粒子を含む。配合物は、脂質、蛋白質、炭水化物、合成有機化合物または無機化合物を包含してもよい。配合物に包含される成分の例としては、リポソームを形成し得る脂質、カチオン性脂質、親水性ポリマー、ポリカチオン（例えば、プロタミン、ポリブレン（polybrine）、スペルミジン、ポリリシン）、標的細胞の表面のレセプターを認識するペプチド若しくは合成リガンド、エンドソーム-分解を誘導し得るペプチド若しくは合成リガンド、核、ゲル、遅延放出マトリックス、塩、炭水化物、栄養素、または溶解性若しくは不溶性粒子に材料を標的化し得るペプチド若しくは合成リガンド、並びにかかる成分の類似体または誘導体が挙げられる。これは、運搬、摂取、安定性及び／または遺伝子材料の細胞内での発現を促進する配合物成分を包含する。このリストは単なる例示であり、如何なる方法でも限定するものではない。
本発明の別の態様では、発現並びに細胞による摂取を促進するコーティング成分のついた上記ベクターを特徴とする。本明細書で使用する「コーティング」なる用語は、細胞摂取を促進するためにベクターと結合させるのに使用した成分、蛋白質または分子を指す。特に、コーティングとは、DNA開始複合体及びヒストンを包含する。コーティングは、ベクターの安定性、核内への導入、及び転写効率を促進する。
本明細書で使用する「DNA開始複合体」なる用語は、血清応答因子、転写開始因子及びトランスレギュレーション因子を含有する複合体である。血清応答因子は、ベクターのプロモーター領域内で血清応答成分に結合しているか、またはこれと作用する。次いで、転写開始因子及びトランスレギュレーション因子は、血清応答因子及びプロモーター、特に、プロモーター内のTATAボックスと作用して、安定なDNA複合体を形成する。本明細書で使用する「ヒストン」なる用語は、DNA例えば、ベクターと会合及び／または結合する核蛋白質を指す。ヒストンは、DNAに特異的または非-特異的に結合することができる。
本明細書で使用する「有効量」なる用語は、好適レベルの蛋白質またはRNAを産生させるために、ヒト、動物または組織培地に適用した十分量のベクターを指す。当業者は、蛋白質またはRNAの好適レベルは、特定のベクターの使用に依存することを認識している。これらのレベルは、投与及び治療または予防接種の型に依存して異なる。
本明細書で開示した疾病を治療する方法としては、生物学的産物（上記定義の特異的蛋白質）による治療があり、治療すべき疾病は、蛋白質に通常の循環から体内を循環させるように要求する。例えば、本発明により治療することができる疾患としては、IGF-Iの発現またはその結合蛋白質による骨粗鬆症が挙げられる。種々の疾病を治療するために蛋白質を適当に選択することは、当業者には明らかである。
疾病の治療において、本発明は、
（1）治療的効果を得るために十分に高レベルの特定の蛋白質；
（2）治療的効果に十分であり、且つ毒性レベルよりも低いレベルでの産物の発現調節；
（3）再現可能な薬物動力学及び遺伝子発現レベルを得るための特定の組織内での発現調節；及び
（4）遺伝子的に製造され選択された細胞の移植よりも、適用及び配合物の臨床学的及び医薬的に許容可能な手段を使用する運搬
を達成する手段を提供する。
この実施において、本発明は、従来技術よりも顕著に進歩している。第１に、組織内で高レベルの発現を得るために使用したウイルス性ゲノム及びウイルス性ベクター由来のプロモーターは、発現調節できなかった。第２に、遺伝子治療のトランスジェニック動物及び動物モデルで発現調節を得るために使用した種々の組織-特異性遺伝子由来のプロモーターは、治療的効果を得るのに十分な高レベルの発現を有していなかった。さらに、本発明の疾病を治療する際に、蛋白質産物に対して抗体を高める能力は、治療範囲の蛋白質の発現調節を達成する能力には反映しない。
本発明の第８の関連する態様は、筋肉の遺伝による遺伝子疾病のための遺伝子置換方法を特徴とする。この方法は、上記参照のベクターとの筋肉細胞のトランスフェクションを包含する。
上記ベクター由来の細胞内に取り込まれる遺伝子材料は、自然または合成核酸のいずれであってもよい。例えば、核酸は、（1）細胞の組織内で通常知見されない；（2）特異的な組織内に通常知見されるが、生理学的に顕著なレベルでは発現しない；（3）特異的な組織に通常知見され、生理学的に望ましいレベルで発現する；（4）骨格筋細胞内で発現を調節し得る任意の他の核酸；及び（5）上記の任意の組み合わせであってもよい。組織内に取り込まれる遺伝子材料の他に、上記参照は、細胞内に取り込まれる遺伝子材料にも適用可能である。
本発明の他の特徴及び好都合な点は、付記図面及び請求項と共に、以下の本発明の詳細な説明より明らかである。
【図面の簡単な説明】
図１は、ニワトリ骨格α−アクチン遺伝子の概略図であり、ある種のユニーク制限部位の位置を含む。
図２は、筋原性ベクター系の概略図である。
図３は、１組の骨格α−アクチン／インスリン様成長因子−Ｉ／骨格α−アクチンハイブリッド遺伝子の概略図である。
図４は、例示的プラスミドｐＩＧ０５５２の概略図である。
図５は、プラスミドｐＩＧ０５５２中に取り込まれた例示的発現ユニットの概略図である。機能的要素は次のように表記される：ＳｋＡプロモーター−ニワトリ骨格α−アクチン遺伝子に由来する５’プロモーター領域（Ｂｅｒｇｓｍａ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２４６２−２４７５）；ＳｋＡ第１イントロン−ニワトリ骨格α−アクチン遺伝子に由来する５’ＵＴＲ（エクソン１）、第１イントロン、エクソン２の開始ＡＴＧまで（Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１２１０９−１２１１６）；ｈＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡ−ヒトＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡ（Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０６（８）：６０９−６１１；Ｐｏｗｅｌｌ−Ｂｒａｘｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．７（１２Ｂ）：２６０９−２６１７）；ｈＧＨ３’ＵＴＲ−ヒト成長ホルモン遺伝子に由来する３’非翻訳領域およびポリＡ付加シグナル。
図６−８は、ｐＩＧ０５５２の構築スキームの概略図を提供し、その構築プロセスにおいて用いられた出発プラスミドおよび中間プラスミドの一般化された構造を示す。
図９は、高度に発現されるヒト遺伝子についてのコドン用法頻度を示す図表である。
図１０Ａおよび１０Ｂは、神経挫傷（ｎｅｒｖｅ ｃｒｕｓｈ）のマウスモデルから得られた結果を示すグラフである。示されるデータは、ｎ＝４から５（擬）およびｎ＝７から８（挫傷／対照および挫傷／ｈＩＧＦ−Ｉプラスミド）動物／群／時点についての平均＋／−ＳＥＭである。図１０Ａは、神経伝導速度（ｎｅｒｅ ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ ｖｅｌｏｃｉｔｙ）に及ぼすｈＩＧＦ−ＩプラスミドのＩＭ投与の影響を示す。図１０Ｂは、筋電活性（ｅｌｅｃｔｒｏｍｙｏｇｒａｐｈ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（ＥＭＧ）に及ぼすｈＩＧＦ−ＩプラスミドのＩＭ投与の影響を示す。
図１１は、ｐＩＧ０５５２に取り込まれた、ｈＩＧＦ−Ｉをコードする配列（配列番号１）を提供する。
図１２は、最適化されたコドン用法を有する、ｈＩＧＦ−Ｉをコードする配列（配列番号４）を提供する。
図１３は、配列番号１および４の両方によりコードされるアミノ酸配列を提供する。
図１４は、ｈＩＧＦ−Ｉコード配列（配列番号１および４）のアライメントであり、２つの配列の間で相違するヌクレオチドの位置を示す。示されるように、配列は、約８０％の同一性を有する。
図１５は、トランスジェニックマウスにおいて用いられた、ｈＩＧＦ−Ｉをコードする導入遺伝子を図解する。
図面は必ずしも一定の比率で拡大されたものではなく、明確性および簡潔性のために、本発明のある種の特徴は誇張した比率で図解形式で示されている。
発明の詳細な説明
本発明のベクターおよび方法は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞中におけるＩＧＦ−Ｉの輸送および発現を提供する。ＩＧＦ−Ｉは、正常筋肉の発達、筋肉成長および肥大、筋肉再生および末梢神経の維持／再生において重要な役割を果たすことが示されている。
以下は、本発明の好ましい態様の特定の例であり、本発明を限定することを意図したものではない。これらの例は、本発明の発現ベクター系を種々の細胞または動物モデルの構築においてどのように用いることができるか、およびそのようなベクター中の配列により遺伝子をどのようにして制御することができるかを示す。そのようなベクターおよび関連するベクターの記述および用途は本明細書において議論されており、”Ｍｙｏｇｅｎｉｃ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ”と題するＳｃｈｗａｒｔｚらの米国特許第５，２９８，４２２号および”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｕｓｅ”と題するＳｃｈｗａｒｔｚらの継続中の出願第０８／４７２，８０９号（図面を含め、本明細書の一部として特にここに引用する）にしたがって拡充される。
以下に、ある種の機能性を発現ベクターに、したがってそのようなベクターを含む形質転換された細胞または動物内に与えるために用いることができる、筋原性遺伝子の５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲおよび／または３’ＮＣＲ領域の特定の領域の例が提供される。当業者は、これらの領域の特定の部分を、望ましい特性を提供する機能的核酸配列を含むものとして同定することができ、そのような領域は、日常的な欠失または変異導入技術またはそれらの同等物を用いて、容易に規定することができることを認識するであろう。そのような領域には、プロモーター、エンハンサーおよび制御可能な系のシス作用要素およびトランス作用要素が含まれる。本明細書に記載されるように、核酸のそのような調節セグメントはベクターの任意の位置に挿入することができるが、本明細書に記載されるように、好ましい部位があるかもしれない。
ニワトリ骨格筋αアクチン遺伝子の単離
骨格筋αアクチン遺伝子の核酸配列は、ニワトリ、ラット、マウスおよびヒトで特性決定されている。Fornwaldら，1982,Nucl.Acids Res.10:3861-3876;R.Zakut,1982,Nature 298:857-859；Frenchら，1990,Gene（Amst.）88:173-180；Huら，1986,Mol.Cell.Biol.6:15-25；Mintyら，1986,Mol,Cell.Biol.6:2137-2148。骨格筋αアクチン遺伝子は、アクチン多重遺伝子族のメンバーであり、これは、脊椎動物の場合、成体組織における細胞分布および発現パターンに基づいて「細胞質」、「平滑筋」および「横紋筋」と称されるアクチンアイソフォームの３種類の異なったクラスから構成されている。横紋筋アクチン、α心筋アクチンおよびα骨格筋アクチンは、心筋細胞および骨格筋線維で特異的に同時発現される。α心筋およびα骨格筋アクチン遺伝子の発現は、心筋および骨格筋の発生において、成体骨格筋中で支配的である骨格筋アイソフォームで逐次的にアップレギュレーションされる。（Vandekerckhove & Weber,1984,J.Mol.Biol.179:391-413;McHughら，1991,Dev.Biol.148:442-458；Hayward & Schwartz,1986,J.Cell Biol.102:1485-1493。）ニワトリ骨格筋αアクチン遺伝子は、約８％のポリ（Ａ）ＲＮＡを含むニワトリ成体骨格筋において最も高度に発現される遺伝子である。
多数のin vitroおよびin vivo実験は、骨格筋αアクチン遺伝子に対して制限された細胞種類および発生によって調節された発現を与える調節配列が、主として即時型５’プロモーター領域に集中していることを確認した。（Bergsmaら，1986,Mol.Cell.Biol.6:2462-2475；Taylerら，1988,Genomics.3（4）:323-36；Petropoulosら，1989,Mol.Cell.Biol.9:3785-3792；Carsonら，1995,Am.J.Physiol.268:C918-24。）
これら調節配列は、鳥類からヒトに至る既知の脊椎動物骨格筋αアクチン遺伝子全てのプロモーター領域で高度に保存されている。ニワトリ骨格筋αアクチン遺伝子に由来する調節配列は、ＩＧＦ−１発現カセットの構築で用いられたが、他の実施態様は、他のアクチンまたはαアクチン遺伝子を利用することがありうる。
様々な種の骨格筋αアクチン遺伝子の一次配列は、重複ｃＤＮＡクローンから推論された。完全な遺伝子を得るために、ｃＤＮＡクローンを用いてゲノムＤＮＡをスクリーニングした。例えば、λシャロン４Ａベクターから単離されたニワトリゲノムＤＮＡの２５Ｋｂ ＥｃｏＲＩフラグメントは、図１で示されているｐＢＲ３２２の一つのＨｉｎｄIII部位上に６．２ｋｂ骨格筋αアクチン遺伝子を含有している。Changら，Mol.Cell.Biol.4:2948-2508（1984）。核転写ランオフを用いて、骨格筋αアクチン遺伝子の転写ドメインの地図を作成した。ニワトリ骨格筋αアクチン制御配列も特性決定された（Bergsmaら，1986,Mol.Cell.Biol.6:2462-2475）。５’非コーディング、プロモーターコーディングおよび隣接した３’非コーディング領域の一部分を包含したＤＮＡプローブを、センスおよびアンチセンスプローブを与えたＭ１３ベクター中にクローン化した。線維芽細胞、筋芽細胞および１９日目胚筋細胞から単離された核をin vitro転写検定で用いて、放射性標識されたヌクレオチドを含むＲＮＡ転写物を伸長させた。ドット検定されたＤＮＡプローブに対してハイブリッド形成された標識ＲＮＡは、転写が、骨格筋αアクチン遺伝子のポリＡ付加部位から約１ｋｂ下流で終結することを示した。これは、転写の出発点から＋２８００〜＋３６００ヌクレオチドの８００ｂｐ ＰｖｕIIフラグメントの範囲内である。
３’ＵＴＲおよび／または３’ＮＣＲは、翻訳終結コドンＴＡＡから３０ｂｐ上流を切断するブラントカッターＮａｅＩを用いる６．２Ｋｂアクチン遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ消化によって単離することができる。ＨｉｎｄIIIは、ベクターｐＢＲ３２２からアクチン遺伝子の３’の大部分を放出させる（図２）。３’ＵＴＲおよび３’ＮＣＲを用いて、ＤＮＡ構築物を製造した。骨格筋αアクチンプロモーターおよびＤＮＡフランキング配列（ｍＲＮＡキャップ部位から少なくとも４１１ヌクレオチド）並びに骨格筋５’非コーディングリーダー、第一イントロンを介しおよび＋１９６でＮｃｏＩクローニング部位に変換された翻訳開始ＡＴＧまで伸長したＤＮＡ配列は、Ｍ１３二本鎖ＤＮＡからＸｂａＩおよびＮｃｏＩ消化によって遊離した。クレノウをフィルインした後、pBluescript II KSのＸｂａＩおよびブラントＳｍａＩ部位に結合した。ＮｃｏＩ部位は、このクローニング工程で再生される。
Schwartzらの出願第08/472,809号で記載されたいくつかのベクターについては、２．３ｋｂのＮａｅＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメント上の３’ＵＴＲおよび３’ＮＣＲを、pBluescript II KSのブラントＥｃｏＲＶ部位および隣接したＨｉｎｄIII部位中に直接的にクローン化した。ＥｃｏＲＶおよびＮａｅＩ部位は破壊される。修復されたＮｃｏＩ部位を用いて、ポリペプチドをコードしているｃＤＮＡ配列を挿入した。もう一つのクローニングベクターは、骨格筋αアクチンプロモーターを３’ＵＴＲおよび３’ＮＣＲに隣接した−４１１〜−１１に挿入することによって構築された。この発現ベクターは、第一イントロンおよび骨格筋アクチン５’リーダー配列を脱離している。これら２種類のベクターをＤＮＡ構築物の製造において用いて、３’ＵＴＲおよび３’ＮＣＲの効力を調べた。
骨格筋αアクチン／ＩＧＦ−Ｉ／骨格筋αアクチン発現カセットを有するベクターを用いて得られた結果を下に記載し、ベクター構築物からのＩＧＦ−Ｉの細胞内発現およびこのような発現のいくつかの結果を詳しく説明する。
本発明の典型的なベクターでは、骨格筋αアクチンプロモーターおよび第一イントロンを含めた配列を、ＩＧＦ−Ｉコーディング配列およびｈＧＨ ３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナルと連結して用いた。更に下に結果を示すが、ＩＧＦ−Ｉ発現の作用および骨格筋αアクチン／ＩＧＦ−Ｉ／骨格筋αアクチン含有ベクターとのいくつかの比較結果が示されている。
ヒトＩＧＦ−Ｉ遺伝子を含有する発現ベクター構築
骨格筋αアクチンプロモーターを含有する構築物を、当該技術分野において知られている標準的な組換えＤＮＡ技術によってヒトＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡ（配列番号１）に対して結合した。骨格筋αアクチン５’および３’配列を利用した一般的な発現ベクター構造の例を図２で示す。ＩＧＦ−Ｉを含む若干の独特のベクター構築物を図３で示す。
最初の構築（ＳＫ２０２ ＳＶａ）は、ＳＶ４０ポリＡ付加部位および小さいｔイントロンがＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡの３’ＵＴＲに対して結合しているように行った。ＳＶ４０配列を加えて、核ＩＧＦ−Ｉ ＲＮＡ転写物の安定性を増加させた。ＳＶ４０ ｔイントロンは、筋細胞中でのＩＧＦ−Ｉの発現に全く適さないかもしれないので、５種類の他のベクターを製造した。
ＳＫ７３３ ＮｃｏＩベクターは、骨格筋αアクチンプロモーターの約４１１ヌクレオチド、天然キャップ部位、５’非翻訳リーダーおよび第一イントロンを含有する。ＮｃｏＩ部位を遺伝子操作して、ＩＧＦ−１ ｃＤＮＡを含有するカセットの独特の挿入クローニング部位を作成したが、ここにおいて、開始ＡＴＧもＮｃｏＩ部位に変換された。
ＳＫ７３３ＩＧＦ−Ｉ構築は、それ自体のポリＡ部位を利用する。骨格筋αアクチン３’ＵＴＲ、ポリＡ付加部位および終結配列を包含したＮａｅＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントを、ＳＫ２０２、ＳＫ７３３ ＮｃｏＩ、ＩＧＦ−Ｉに対しておよびＩＧＦ−ＩポリＡ部位を欠失し且つ骨格筋αアクチンのそれで置換されているＳＫ７３３ＩＧＦ−Ｉに対して結合した。この方法では、骨格筋αアクチン３’ＵＴＲを含有するＩＧＦ−Ｉ ＲＮＡは安定化され、骨格筋細胞中に蓄積する。更に、隣接した３’ＮＣＲを与えることにより、ＩＧＦ−Ｉは、外部ゲノム配列に対して緩衝されるので、ゲノム中に組込まれた場合に位置効果から一層保護される。更に、天然終結配列を与えることにより、骨格筋αアクチンの転写ドメインを標識している追加の調節配列は、転写による読取りを妨げ、組織特異性、発生のタイミングおよび転写活性を改善する。３’ＮＣＲ配列の存在は、組込まれたベクターの単コピーが内因性配列の転写活性の４０〜１００％を生じることを可能にする。
ＳＫ７３３ ＩＧＦ−ＩＳＫ２プラスミド構築物（ｐＩＧ０１００Ａ）は、上で論評されたSchwartzらの出願で開示されている。出願第08/472,809号。このプラスミドは、アンピシリン耐性主鎖を有し、ＩＧＦ−Ｉをコードしている。プラスミド構築物ｐＩＧ０３３５は、ｐＩＧ０１００Ａに似ているが、カナマイシン耐性主鎖を含有し、Schwartzらの出願第08/472,809号でも開示されている。
典型的なプラスミドベクターｐＩＧ０５５２を、ｐＩＧ０１００ＡおよびｐＩＧ０３３５Ｂおよび更に別の構築物（ｐＩＧ０３７６ＡおよびｐＶＣ０２８９Ａ）を用いて構築した。ｐＩＧ０５５２の模式図を図４で示す。ｐＩＧ０５５２Ｂ発現プラスミドは、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）遺伝子を含有するプラスミド主鎖中にｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子発現カセット（図５）を含有する。ｐＩＧ０５５２ＢのｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子発現カセットは、（１）ニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターおよび第一イントロンに由来するプロモーター、（２）ヒトインスリン様成長因子Ｉ（ｈＩＧＦ−Ｉ）ｃＤＮＡ、および（３）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）からの３’ＵＴＲ／ポリ（Ａ）シグナルを含有する。そのプラスミド主鎖は、（１）アンピシリン耐性遺伝子（ｂｌａ）に代わるカナマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）および原核性プロモーター（ｐＮＥＯ，Pharmacia）の置換および（２）ｆ１複製起点の欠失を含むpBluescript KS＋（Stratagene）に由来する。
したがって、上記の発現カセットは、元のｐＩＧ０１００発現系とは具体的に３’ＵＴＲが異なる（ｐＩＧ０１００は、骨格筋アクチン３’ＵＴＲを含有し、ｐＩＧ０５５２は、ｈＧＨ３’ＵＴＲを含有する）。ｈＧＨ３’ＵＴＲは、骨格筋から体循環への組換えタンパク質の供給を増加させるので、骨格筋アクチン３’ＵＴＲの代わりに置換えられた。この結果は、トランスジェニック動物でも非ウイルス遺伝子治療例（すなわち、組込まれた鋳型およびエピソーム鋳型両方）でも認められている。
ｐＩＧ０５５２Ｂの実際の構築は、主として、３種類の出発プラスミドｐＩＧ０１００Ａ、ｐＩＧ０３７６ＡおよびｐＶＣ０２８９Ａを必要とした。その工程を、図６、７および８で図示する。
ニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターおよび第一イントロンおよびｈＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡは、プラスミドｐＩＧ０１００Ａ（R.Schwartz,Baylor College of Medicine）から入手した。ｈＧＨ ３’ＵＴＲは、プラスミドｐＩＧ０３７６Ａ（R.Schwartz,Baylor College of Medicine）から入手した。ｐＩＧ０１００Ａは、ニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターおよび第一イントロン、ヒトｈＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡ、およびpBluescript KS＋中のニワトリ骨格筋αアクチン３’非翻訳領域および３’フランキング配列を含有する。ｐＩＧ０３７６Ａは、ニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターおよび第一イントロン、ｈＧＨリーダー配列、ｈＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡ、およびpBluescript KS＋中のｈＧＨ ３’ＵＴＲを含有する。上記のように、プラスミド主鎖ｐＶＣ０２８９Ａは、カナマイシン耐性遺伝子、ｐＵＣ複製起点および多クローニング部位を含む。
ｐＩＧ０１００Ａ、ｐＩＧ０３７６ＡおよびｐＶＣ０２８９ＡからｐＩＧ０５５２Ｂを製造するのに用いられた構築スキームは、数種類の中間体プラスミドの構築を必要とした。ｐＩＧ０５５２Ｂの構築での第一段階は、ｐＩＧ０１００ＡおよびｐＩＧ０３７６Ａから遺伝子発現カセットをｐＶＣ０２８９Ａ中へ転移させて、それぞれｐＩＧ０３３５ＢおよびｐＩＧ０３３６Ａを製造することを行った。ｐＩＧ０３３５Ｂは、ニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターおよび第一イントロン、ｈＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡ、およびｐＩＧ０１００Ａからのニワトリ骨格筋αアクチン３’ＵＴＲを含有する３４７２塩基対（ｂｐ）ＮｏｔＩ／Ａｃｃ６５Ｉフラグメントを、ｐＶＣ０２８９ＡのＮｏｔＩ／Ａｃｃ６５Ｉ部位中に連結することによって製造された。ｐＩＧ０３３６Ｃは、ニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターおよび第一イントロン、ｈＧＨリーダー配列、ヒトＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡ、およびｐＩＧ０３７６ＣからのｈＧＨ ３’ＵＴＲを含有する１９１８ｂｐ ＮｏｔＩ／Ａｃｃ６５Ｉフラグメントを、ｐＶＣ０２８９ＡのＮｏｔＩ／Ａｃｃ６５Ｉ部位中に連結することによって製造された。ｐＩＧ０５２６Ａは、ニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターおよび第一イントロン、およびｐＩＧ０３３５ＢからのｈＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡを含有する１１３２ｂｐ ＢａｍＨＩフラグメントを、ｋａｎＲ主鎖中のｈＧＨ ３’ＵＴＲを含有する３３９７ｂｐ ＢａｍＨＩフラグメントおよびニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターのフラグメントに対して連結することによって構築された。ｐＩＧ０５２６Ａは、ニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターの重複部分を含有する。ニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターの重複部分を欠失させるために、ｐＩＧ０５２６ＡをＳｔｕＩで消化し、そしてニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターおよび第一イントロン、ｈＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡ、およびＫａｎＲ主鎖中のｈＧＨ３’ＵＴＲを含有する４０５７ｂｐフラグメントを再度連結して、ｐＩＧ０５３３Ａを作成した。
ｐＩＧ０５３３Ａは、ｈＧＨ３’ＵＴＲの下流のヒトＡＬＵ反復配列を含有する。ｐＩＧ０５３３Ａ中のヒトＡＬＵ反復配列を欠失させて、プラスミドｐＩＧ０５５２Ｂを作成した。ｈＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡの３’部分、およびｐＩＧ０５３３ＡからＡＬＵ反復体を除外したｈＧＨ ３’ＵＴＲを含有する３９５ｂｐＥｃｏ０１０９１（Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼでブラント末端付きにされた）／ＢｓｐＥＩフラグメントを、ＫａｎＲ主鎖、ニワトリ骨格筋αアクチンプロモーターおよび第一イントロン、およびｐＩＧ０５３３ＡからのｈＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡの５’部分を含有する３１７５ｂｐ ＸｈｏＩ（ブラント末端付き）／ＢｓｐＩフラグメントに対して連結して、最終プラスミドｐＩＧ０５５２Ｂを製造した。ＡＬＵ反復体の欠失は、ヒト染色体中へのベクターの組込み頻度を大きく減少させる。しかしながら、ｐＩＧ０５５２もｐＩＧ０５５３も、ほぼ同量の分泌ＩＧＦ−Ｉを生産することが判明した。
プラスミドｐＩＧ０５５２の実際のヌクレオチド配列は、標準法によって確認された。予想のヌクレオチド配列は、ベクターＮＴバージョン１．２（InforMax,Inc.,ゲイサーズバーグ，ＭＤ）を電子工学によって用いて、予め確認された部分配列から組み立てるかまたはGenBankから次のように回収された。（１）ｂｌａ（Ａｍｐ^r）遺伝子がトランスポゾンｔｎ５からのｎｅｏ（Ｋａｎ^r）遺伝子で置換えられたpBluescript（Stratagene）の誘導体であるプラスミド主鎖（ヌクレオチド１〜２２６１）；（２）骨格筋αアクチンプロモーター（ヌクレオチド２２６２〜２６８８）；（３）骨格筋αアクチン５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および第一イントロン（ヌクレオチド２６８９〜２８８４）；（４）ヒトＩＧＦ−Ｉコーディング配列およびｈＩＧＦ−Ｉ ３’ＵＴＲの一部分（ヌクレオチド２８８５〜３３９２）；（５）pBluescript多重クローニング部位（ＭＣＳ，ヌクレオチド３３９３〜３４０９）；および（６）ヒト成長ホルモン３’ＵＴＲ（ヌクレオチド３４１０〜３５０９）および３’フランキング配列（ヌクレオチド３５１０〜３６００；GenBank受託番号J03071,HUMGHCSA）。ｐＩＧ０５５２の予想および実際のヌクレオチド配列を、下の表Ｉで並べて示す。
プラスミド主鎖配列の最初の塩基を、独断でヌクレオチド＃１と称する。並んだ配列間の配列同一性を「｜」で示す。選択された配列要素を標識し、参照のために下線を引いている。それぞれの配列について一本の鎖だけを示しているが、ｐＩＧ０５５２の４７％以上（ヌクレオチド１８８４〜３５９９）を、両鎖についての多重読取りで配列決定した。ｐＩＧ０５５２のヌクレオチド２２６８〜３５９９は、予想配列と一致した。プラスミドのこの部分は、骨格筋αアクチンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、完全なｈＩＧＦ−Ｉコーディング配列（太字）、ｈＧＨ ３’ＵＴＲおよびフランキング配列を実質的に全部含む。これは、このプラスミドが、天然のヒトＩＧＦ−Ｉタンパク質の一次アミノ酸配列に匹敵する配列のタンパク質をコードしていることを確証する。
プラスミドの他の部分において、実際および予想の配列間で合計８ヌクレオチドの差（「★」で示された）が認められた。予想配列中の２１位には、１個のヌクレオチド欠失がある。この位置は、pBluescript MCSの残っている最後の部位であるＫｐｎＩ制限部位から１塩基下流である。予想配列中の９１５位には、１個のヌクレオチド差がある。この位置は、細菌の複製起点の非臨界的部分内である。最後に、予想配列中の２２６２位〜２２６８位には、６個のヌクレオチド差がある。これらの位置は、pBluescript MCSと、骨格筋αアクチンプロモーター配列の５’末端との間のクローニング結合の位置である。この非臨界的部分での違いは、クローニングによる人工産物の結果であると考えられる。認められた差のいずれかが、ｐＩＧ０５５２の適当な生物学的性質に影響を与えるという証拠はない。

上記した通り、ｐＩＧ０５５２の正確な配列の評価により、少数の配列の変化が、利用した配列成分の配列に基づいて予測により得られる配列と比較して生じていることが実証された。これらの変化は不可欠な配列には生じていないことが判明した。非常に機能的なベクター中にそのような変化が存在することは、ベクターが同一の主要な配列要素を利用しつつ多様な異なる配列を取り込むことができることをさらに確証する。即ち、開示した配列は例示にすぎない。
ＩＧＦ−Ｉをコードする天然配列の代わりに、ＩＧＦ−Ｉをコードする合成配列を利用することが有利である。そのような合成配列は天然配列とは別のコドン利用を有し、従って天然配列とは劇的に異なるヌクレオチド配列を有している。特に、ヒトにおける発現を少なくとも部分的には最適化したコドン利用を有する合成配列を使用することができる。天然配列はそのような最適コドン利用を有していない。好ましくは、実質的に全てのコドンが最適化される。
ヒトにおける最適コドン利用は、図９に示されるように、高度に発現したヒト遺伝子のためのコドン利用頻度によって示される。コドン利用チャートは、Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8.1,Genetics Computer Group,Madison,WIからのプログラム「Human High.cod」からのものである。高度に発現したヒト遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンはヒト宿主細胞での発現のための最適コドンであると仮定でき、合成コード配列を構成するための基礎を形成する。
しかし、十分に最適化したコドン利用を有する配列よりは、同一のアミノ酸が互いに近接しすぎているか多すぎるために均一なコドン利用を最適化できない領域以外では、最適化されたコドン利用を有するＩＧＦ−Ｉコード配列を利用することが望ましいかもしれない。
さらに、例えば少なくとも５０％、７０％、８０％または９０％の最適化コドンを有する最適化されたコドン利用の実質的部分を有する他の合成配列を使用することができる。ＩＧＦ−Ｉの他の具体的合成配列は図９のコドン利用チャートを参照して選択することができる。ポリペプチド配列の各アミノ酸のコドンを選択することによって配列が選択される。次いで、ポリペプチドの各々に対応するＤＮＡ分子を通常の化学合成法によって構築することができる。例えば、より短いオリゴヌクレオチドを合成し、適切な関係でライゲートし、全長のコード配列を構築することができる。
特に好ましい合成ＩＧＦ−Ｉコード配列は配列番号４に示される。
ＩＧＦ−Ｉプラスミドの調製および精製
Ａ．元となる細胞バンクの調製
コンピテント細胞を上記したＩＧＦ−ＩプラスミドｐＩＧ０５５２でトランスフェクトした。形質転換に利用した細胞はMAX Efficiency DH５α（商標）コンピテント細胞（GIBCO BRL/Life Technologies）であった。細胞に添付された分析証明書は、細胞がLac^-表現型（Lacオペロン欠失により付与される）を示し、ニトロフラントインで阻害され（recA1遺伝子型を示す）、プラスミド安定性のために通常使用される抗生物質（アンピシリン、カナマイシン及びテトラサイクリン）に対して選択性であることを示している。E.coli DH５αの公開された遺伝子型はF^-φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hsdR17(r_K ^-m_k ^-)deoR thi-1 supE44 λ^-gyrA96 relA1である。
元となる細胞バンク（ＭＣＢ）の作製前に、２個のロットのｐＩＧ０５５２ＤＮＡを作製した（ｐＩＧ０５５２Ｂ．１６ＳおよびｐＩＧ０５５２Ｂ．１００）。プラスミド収量が低く発酵時間が長いために、クローンの選択はＭＣＢの成長中に含めた。
クローン選択を始めるために、３つのコロニーを新しい形質転換プレートから取り、クローンＸ、ＹおよびＺと命名した。これらのコロニーをＬＢ−Ｋａｎ寒天プレート上に同時にストリークし、５０ｍｌのＬＢ−Ｋａｎ液体培地に接種した。対照として、２０μｌのｐＩＧ０５５２Ｂも５０ｍｌのＬＢ−Ｋａｎに接種し、これをクローンＢと命名した。寒天プレートを３７℃で一晩インキュベートし、パラフィルムで包み、４℃で保存した。液体培養物を３７℃で２５０ｒｐｍで１７時間振盪し、次いで氷浴に置いた。
液体培養物の各々についてプラスミド収量を測定した。具体的収量（ｍｇ／ｇＤＣＷ）は、クローンＢ、Ｘ、Ｙ、およびＺの各々について５．１、＜１、２．８、および６．２であった。未希釈の細胞ライセートの各々につきエタノール沈殿を行った。
クローンＺは収量の改善を示した；従って、ｐＩＧ０５５２Ｚ寒天プレートからの５個の単離したコロニーを取り、泡およびチーズクロスストッパーを備えた整流装置付きのFernbachフラスコ中の５００ｍＬのＬＢ−Ｋａｎ液体培地に接種した。培養物を１６時間、３７℃で３００ｒｐｍで振盪しながらインキュベートし、冷却のために氷水浴中に置いた。培養物の光学濃度は３．４であった。滅菌５０％グリセロールを氷上で冷却し、１２０ｍＬを培養物に添加した。培養物を撹拌しながら氷上に置き、約１ｍＬを予め標識した低温バイアルに分配した。バイアルを−２０℃の冷凍庫に移した。翌日、バイアルを−８０℃に移し、次いで翌週長期間貯蔵のために液体窒素に移した。
ＭＣＢの収量を試験するために、１個のバイアルを融解し、５０μｌを使用して５０ｍＬのＬＢ−Ｋａｎ液体培地に接種した。３７℃で２５０ｒｐｍで１６時間生育させた後、培養物をプラスミド収量につき分析した。具体的収量（ｍｇ／ｇＤＣＷ）は５．２であり、これは寒天プレートではなくバイアルから出発した培養物についての予測された限界値の範囲内であった。
Ｂ．バルク調製
バルクｈＩＧＦ−Ｉプラスミドは宿主生物としてEscherichia coli（E.coli,DH5-α）を用いバッチ発酵を用いて産生される。発酵およびそれに続く回収プロセス工程を下記に述べる。以下の説明に関し、このプロセスは以下を基本として記載される：１リットルのブロス、８３の濃度（Ａ_600nm）、３９．９ｇ／Ｌ乾燥細胞重量（ＤＣＷ）、および５ｍｇ／ｇＤＣＷの特異的収量の粗プラスミド、前精製の時に測定。これらは概算である。実際の量は発酵の生産性に依存して変化するであろう。
１． このプロセスで用いた溶液
緩衝液、培地および溶液の注：
１）範囲のない量は全て名目上にすぎない
２）範囲を有する量は特定された範囲に限定される。
３）トリスＨＣｌを含有する多くの緩衝液は、ｐＨ調整のためにＨＣｌを用いてトリス塩基で調製される。
硫酸カナマイシン − ２０ｍｇ／ｍＬの硫酸カナマイシンをＷＦＩに溶解し、０．２ミクロンで濾過し、−２０℃の冷凍庫で保存
第一の種培地（ＬＢ） − トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、水
第二の種培地（ＬＢ） − ソイトン１５ｇ／Ｌ、酵母エキス１５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、水
発酵培地（２部分） − （１）滅菌部分（９０％）：グリセロール５０ｍｌ／リットル、酵母エキス５０ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ４〜６ｇ／Ｌ、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄６ｇ／Ｌ；（２）濾過部分（１０％）：チアミン塩酸塩０．１５ｇ／Ｌ、ビタミン溶液（下記参照）１０００×３ｍＬ／Ｌ、Ｋ₂ＨＰＯ₄６ｇ／リットル、ＫＨ₂ＰＯ₄３〜５ｇ／リットル、微量金属溶液（下記参照）１０００×１〜２ｍＬ／Ｌ、０．４ｍＬ／Ｌの泡止め剤および００２５〜０．５ｍｇ／カナマイシン。示した全濃度は全容量に基づく。
微量金属溶液 １０００× − ＦｅＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ １００ｇ／Ｌ、洗浄用の滅菌洗浄液中
ビタミン溶液 １０００× − リボフラビン０．４２ｇ／Ｌ、パントテン酸５．４０ｇ／Ｌ、ニアシン６．１ｇ／Ｌ、ピリドキシン１．４ｇ／Ｌ、ビオチン０．０６ｇ／Ｌ、葉酸０．０４ｇ／Ｌ、洗浄用滅菌水、アルミ箔で包み、２〜８℃で保存。
水酸化ナトリウム − 脱イオン水中４〜５ＭのＮａＯＨ、発酵ｐＨの調節用
リン酸 − 脱イオン水中２０％ｖ／ｖの濃リン酸、発酵ｐＨの調節用
洗浄／再懸濁緩衝液 − ５０ｍＭトリスＨＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、pH8.0
溶解緩衝液 − ２００ｍＭ NaOH、１％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）
中和緩衝液 − ３５：１３：８．７５の比率の３ＭのＫＯＡｃ（ｐＨ５．５）、５ＭのＮａＣｌおよび７．５ＭのＮＨ₄ＯＡｃ
ＲＮａｓｅ（１００×）ストック溶液 − ５ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅＡ、１０ｍＭ トリスＨＣｌ、１５ｍＭ ＮａＣｌ
洗浄用水 − バッグ中のＷＦＩ、資格のある業者から購入
Ｑコンディショニング緩衝液 − ２Ｍ NaCl、２０ｍＭ トリス HCl、ｐＨ８．０、ＷＦＩで調製
Ｑ平衡緩衝液 − ０．６２５Ｍ NaCl、１０ｍＭ トリス HCl、１ｍＭ EDTA、ｐＨ８．０、ＷＦＩで調製
Ｑ洗浄緩衝液 − Ｑ平衡液と同じ
Ｑ溶出緩衝液 − ０．７５Ｍ NaCl、１０ｍＭ トリス HCl、１ｍＭ EDTA、ｐＨ８．０
Ｑ再生溶液（１、２および３） − （１）ＱおよびＤＥＡＥコンディショニング緩衝液と同じ、（２）１Ｍ NaOH、および（３）１Ｍ 酢酸
アルカリ加水分解溶液 − ０．１Ｍ NaOH、ＷＦＩで調製
アルカリ加水分解中和溶液 − ０．１Ｎ HCl、ＷＦＩで調製
DEAEコンディショニング緩衝液 − Ｑコンディショニング緩衝液と同じ
DEAE平衡緩衝液 − ０．３３Ｍ NaCl、２０ｍＭ トリス HCl、ｐＨ７．５、ＷＦＩで３３ １ｍＳ／ｃｍの伝導率に調製
DEAE洗浄緩衝液 − DEAE平衡液と同じ
DEAE溶出緩衝液 − ０．４ｍＭ NaCl、２０ｍＭ トリス HCl、ｐＨ７．５、３９±１ｍＳ／ｃｍの伝導率に調製
DEAE再生溶液（１、２および３） − （１）ＱおよびＤＥＡＥコンディショニング緩衝液と同じ、（２）０．１Ｍ NaOH、および（３）０．１Ｍ HCl
HICコンディショニング溶液 − ３．０Ｍ硫酸アンモニウム、ＷＦＩで調製
HIC平衡溶液 − １．５Ｍ硫酸アンモニウム、ＷＦＩで調製
HIC洗浄溶液 − HIC平衡溶液と同じ
HIC再生溶液（１、２および３） − （１）ＷＦＩ、（２）７０％（ｖ／ｖ）エタノール、（３）０．１Ｎ NaOH、ＷＦＩで調製：注：ＷＦＩは２回使用する（フロー図を参照）
ＵＦ／ＤＦ濾過溶液（１−２） − （１）１Ｍ NaCl、ＷＦＩで調製、（２）ＷＦＩ
最終生成物希釈 − ＷＦＩ
２． 発酵プロセスおよび単離
培地の調製。接種工程用の培地を、約２リットルの量で予め滅菌したPyrex容器中で調製し、スチーム滅菌する。次いで、予め滅菌した０．２ミクロンのフィルターで濾過した後に、抗生物質を添加する。この滅菌種培地は必要になるまで４℃で保存する。発酵培地は使用直前に調製される。基礎培地をその場で（in situ）で滅菌し、０．２ミクロンで濾過滅菌した抗生物質を無菌移動手段で発酵器に添加する。
発酵プロセス。このプロセスは元となる細胞バンク（ＭＣＢ）からの種バイアルを用いて開始する。
生物的に安全なフード中で種培養物を調製することによって、２工程の種プロセスは開始する。１０〜２５ｍＬの滅菌種培地を予め滅菌したフラスコに無菌的に添加する。フィルター滅菌した抗生物質溶液を適当な最終濃度（２０〜１００μｇ／ｍＬ）になるよう添加する。次いで、培養物にＭＣＢバイアルからの２００μＬ以上の細菌培養物を接種する。フラスコに蓋をし、インキュベーター振盪器に置く。種培養物は２から６時間約２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートし、次の工程のための接種物を成長させた。次の種工程は、同一の抗生物質濃度、発酵工程で用いた容量の１〜１０％の容量を有し、２から８時間同様にインキュベートする。
発酵培地は２５〜１００μｇ／ｍＬの濾過滅菌抗生物質を含有し、これは培地の滅菌後に無菌的に添加され、プラスミド損失に対して選抜する。
種子由来の接種物を無菌的に発酵槽に移すと、発酵が始まる。細胞密度が増すため、その過程で発酵物に100μg/mLまでの抗生物質を追加して選択的な圧力を維持する。溶存酸素の増加量が養分の枯渇を示すまで発酵を続け、その時点で攪拌を弱め、培養物を冷却する。温度が15℃以下に下がったら、単離段階を始める。発酵の後、培養物のサンプルを粗プラスミド収量分析用に取り、それを後でこの過程の精製段階の準備に用いる。
単離。発酵培養物を遠心する。細菌の細胞沈渣を遠心皿からかき取り、再懸濁および混合するために、滅菌済みの450mLポリプロピレン瓶または再封可能なポリエチレン袋に移す。細胞を等量の洗浄バッファーにて一回洗い、再び遠心して、2から8℃にて24時間以内の間保存するか、あるいは使用する時まで-20℃にて保存する。
D．精製
前精製。細胞を洗うのに用いたのと同じバッファーにて、全容量約7-12mL/g湿細胞重量（WCW）とするのに十分な量で、細胞を穏やかに再懸濁する。再懸濁した細胞をより大きな瓶または容器に穏やかに移し、出発の細胞グラム（WCW）あたり約7-12mLの可溶化溶液を加え、細胞を破壊して細胞のタンパク質および染色体DNAを変性させる。可溶化溶液を加えた後、内容物を穏やかに混ぜ、約5分間、室温（20-25℃）に保つ。氷冷した中和溶液を約11-19mL/gWCW加え、pHを下げて細胞の核酸、タンパク質と、可溶化バッファー由来のカオトロピック剤とを沈殿させる。残った懸濁液を、最低1/2時間冷却する間おいておく。
本段階および他の段階のために準備したバッファーおよび溶液は、0.2ミクロン濾過し、滅菌済みのパイレックス瓶あるいは無菌かつエンドトキシンのない使い捨ての袋のいずれかに保存する。使用した水は潅注用の滅菌水（WFI）である。
固-液分離を、最初は遠心分離により行う。遠心分離は0-8℃にて行う。細コロイド粒子を含む上清を0.3ミクロン濾過して、残っている粒子を除き、固-液分離を完了する。用いた最終的な容器をあらかじめ滅菌し、0.5N水酸化ナトリウムにて再び洗い、それからWFIにて3回すすぐ。純粋な大量保管に用いた容器を除き、この時点より後に使用したすべての生成物の容器および移動用の管に対して同じ処理を適用する。
100倍濃度のRNaseAストック溶液を-20℃にて保存する。濾過したアルカリ可溶化物のプールを室温と平衡にさせて0.01 v/vのRNaseストック溶液を加えたあと、RNAを消化する。溶液を最低6分間、30-45℃の温度でインキュベートする。得られた溶液をただちにクロマトグラフィーにすすめるか、あるいは滅菌したパイレックス容器内で2から8℃にて一晩おく。
精製。材料を、クロマトグラフィーの前に0.2ミクロンフィルターで濾過する。プラスミド、細胞の他の核酸およびタンパク質を含む上清を、2倍量のWFIにて3倍希釈する。
Q陰イオン交換の段階では、予防策としてカラム内で樹脂（Pharmacia Q highperformance）を1N NaOHにて30-35分間処理する。約5カラム容量（CV）のQおよびDEAE条件付けバッファーにてカラムを条件付け、それから約5CVのQ平衡化バッファーにて平衡化する（pHおよび伝導率により許容可能であると確定したならば、容量はさらに少なくてもよい）。カラム注入速度は、すべての段階に関して約155cm/hrの直線速度である。mLの樹脂あたり最大1mgの粗プラスミドまで、希釈したものをロードする。ロード後、出力がベースラインに近い水準になったことをカラム検出器が示してからさらに1CV、Q洗浄バッファーにてカラムを洗う。生成物を約5CVの溶出バッファーにて溶出し、その際クロマトグラム上の実際のピークが、溶出回収が始まり、終わった時点を示す。カラムを各約5CVの3つのQ再生バッファーにて再生する。5-10CVの0.01N NaOHをカラムに注入した後、次の使用まで樹脂をカラム内で保存するか、あるいは再びサイクルにかける。Q溶出物は2から8℃にて保存し得る。
粗プラスミド解析を用いてRNAをチェックする。もしはじめのRNAを含むピークと二番目の生成物を含むピークの比が、あらかじめ設定した限界を超えているなら、臨時にアルカリ加水分解および中和を行う。それから、穏やかに混ぜながらQ溶出物に0.1N NaOHをゆっくりと加え、最終pHが11.2-11.3となるようにする。処理した溶液のサンプルのpHを測定し、記録する。溶液を約10分間、20-25℃におく。その後、穏やかに混ぜながら0.1N HClをゆっくりと加え、溶液を中和し、基準pH（7.5-8.0の間）を測定し記録する。
二番目の精製段階のために適した塩濃度となるように、プールを約2倍量のWFIにて希釈する。DEAE陰イオン交換の段階における予防策として、樹脂（Tosohaas DEAE 650S）をカラム内で0.1N NaOHにて30-35分間処理する。約5カラム容量（CV）のQおよびDEAE条件付けバッファーにてカラムを条件付け、それから約5CVのDEAE平衡化バッファーにて平衡化する。カラムの流速は、すべての段階に関して約155cm/hrの直線速度である。mLの樹脂あたり最大0.7mgの粗プラスミドまで、ロードする。ロード後、出力がベースラインに近い水準になったことをカラム検出器が示してからさらに1CV、DEAE洗浄バッファーにてカラムを洗う。溶出は約5CVのDEAE溶出バッファーにて行い、その際ピーク回収の始まりおよび終わりをクロマトグラムにより決定する。カラムを各約5CVの3つの再生溶液にて再生する。5-10CVの0.01N NaOHをカラムに注入した後、次の使用まで樹脂をカラム内で保存するか、あるいは再びサイクルにかける。DEAE溶出物は2から8℃にて保存する。
DEAE溶出物を、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）条件付け溶液にて2倍希釈する。予防策としてカラム内でHIC樹脂（Tosohaas Phenyl 650S）を0.1N NaOHにて30-35分間処理する。約5CVのHIC平衡化バッファーにて平衡化する。カラムの注入速度は、すべての段階に関して約75cm/hrの直線速度である。mLの樹脂あたり最大0.5mgの粗プラスミドまでロードし、素通りを回収する。ロード後、出力がベースラインに近い水準になったことをカラム検出器が示してからさらに1CV、HIC平衡化バッファーにてカラムを洗い、素通りと共に洗いを回収する。カラムを各約5-10CVの3つの再生溶液にて再生する。5-10CVの20%（v/v）エタノールをカラムに注入した後、樹脂を再びサイクルにかけるか、あるいは次の使用までカラム内で保存する。HIC溶出物は2から8℃にて保存する。
あるいは、精製過程はアメリカ合衆国特許出願60/022,157に記載の通りであり得る。
筋原細胞培養
11日齢の白色レグホン鶏胎児胸筋由来のトリ筋芽細胞初代培養を、この技術分野で記載されているプロトコールにしたがって発生させた。Grichnik et al.,Nucleic Acids Research 14:1683-1701（1986）。コラーゲン化した60mm組織培養シャーレあたり2 x 10⁵細胞の密度で、濃縮した筋芽細胞をまいた。
ほ乳類筋原C₂C₁₂およびSol 8細胞（1 x 10⁵）を、トランスフェクションの1日前に60mmシャーレに継代した。
DNAトランスファー
この技術分野で知られている通りのリン酸カルシウム沈殿-グリセロールショックプロトコールにて、組織培養細胞にプラスミドDNAをトランスフェクトした。Wigler et al.,Cell 14:725-731（1978）。各60mmシャーレの組織培養細胞にトランスフェクトするのに、計10μgのDNAを用いた。トランスフェクションは4重で、DNAの質および細胞の培養密度の変動のコントロールのために3つの異なるMVS-CAT-MLCプラスミド調製物を用いて行った。
CATアッセイ
2集団の細胞のトランスフェクションの後、複製と同時に筋芽細胞および融合後の筋管を回収し、この技術分野で記載の通りにCAT活性をアッセイした。Gorman et al.,Molec. Cell.Biol.2:1044-1051（1982）。50μlの250mM Tris-HCl pH7.5中で凍結融解サイクルを繰り返すことにより、細胞沈渣を可溶化した。アセチル化された［¹⁴C］クロラムフェニコール（アッセイあたり0.5μCi、57.8mCi/mMol）の生成を90分間、37℃にてアッセイした。アセチル化されたクロラムフェニコールを、シリカゲルプレート上の薄層クロマトグラフィー後のオートラジオグラフィーによりモニターした。分離されたアセチル化クロラムフェニコールのスポットを、Betagen phosphoimager screen上をスキャンすることにより定量した。データは、μg細胞タンパク質あたりの変換された［¹⁴C］クロラムフェニコールのパーセンテージとして表した。アッセイにおける均一性を保証するために、各時点で細胞抽出物のタンパク質濃度をBradford,Anal.Biochem.72:254-258（1976）の方法により求めた。
TIG-I構築物のスプライシング
上記のように、トリ骨格のアクチンプロモーターおよびイントロン（5’および3’スプライシング部位を含む）、ヒトIGF-I 48アミノ酸シグナルペプチド、70アミノ酸成熟タンパク質およびEペプチドを含むようにpIG0100構築物をクローン化した。この発現系から生成したRNAはアクチン3’スプライシング部位を用いず、そのかわりにIGF-Iシグナルペプチド配列内の部位にスプライシングする。スプライシングはRT-PCR産物の配列を決定することにより確認した。得られたポリペプチドは、筋肉および他の多くの組織に天然に存在する型である25アミノ酸シグナル配列を有していると考えられている。Adamo et al.,1994,Adv.Exp.Med.Biol.343:1-11。
pIG0552構築物はトリ骨格α-アクチン3’UTRではなくヒト成長ホルモン3’UTRを有し、pIG0100構築物と同じ上流配列を含む。pIG0552産物のスプライシングはpIG0100産物と同一であると考えられている。そのことは、両構築物由来の産物が同じサイズであるというRT-PCR産物のアガロースゲル解析により確認した。
発現ベクター構築物の活性
マウス筋原細胞内におけるアクチンプロモーター/遺伝子IGF-Iハイブリッド遺伝子の効率を求めるために、安定トランスフェクタントしたC₂C₁₂筋芽細胞の集団を作製することにより、ほ乳類C₂C₁₂筋芽細胞という背景でこれらの遺伝子を用いて発現ベクターを調べた。改変されたIGF-I発現量を、これらの安定筋芽細胞株において直接評価した。図3に示す各IGF-I構築物を、薬剤選択ベクターEMSV-HygromycinとマウスC₂C₁₂細胞に共トランスフェクトした。2週間の選択の後、安定筋芽細胞の集団を選択した。EMSV-Hygromycinのみにて安定にトランスフェクトしたC₂C₁₂筋芽細胞の集団を対照として用いた。トランスフェクトされた筋芽細胞を視覚的に調べると、トランスジェニックマウスでは明らかにはならなかったであろう、筋肉細胞の分化に対するIGF-Iの役割がいくつか洞察された。概して、IGF-I遺伝子を含むすべての筋原細胞株は、増殖培地（10%ウシ胎児血清）中で筋芽細胞を、対照よりも大幅に複製させた。培地を2%ウマ血清にかえると、分化過程が始まる。この過程で、C₂C₁₂筋芽細胞は融合し、4日間という期間を通して多核の筋管を形成する。培養シャーレあたり同じ細胞密度で、SK733IGF-I、SK202IGF-I-SK、SK733IGF-I-SK1およびSK733IGF-I-SK2を含む筋芽細胞は、C₂C₁₂またはEMSV-Hygromycin対照筋芽細胞よりも少なくとも2から3日早く融合した。
C₂C₁₂筋芽細胞におけるIGF-I MRNAの定常状態の蓄積を調べるために、増殖培地（”G”）あるいは分化培地（”D”）中で培養した、安定にトランスフェクトされたC₂C₁₂筋芽細胞から等量の総細胞RNAを単離した。RNAを変性アガロースゲル上の電気泳動で分離し、ナイロンフィルターにトランスファーし、標準的なハイブリッド形成の手法にしたがって、均一に³²P標識した全長ヒトIGF-I cDNAにて探査した。X線フィルム上のオートラジオグラフのシグナルの強度により、相対的なmRNA蓄積の程度、つまり発現ベクターの転写活性およびmRNA安定性が合わさった全体的な指標が提供される。ベクターに入ったIGF-I mRNAであるSK202IGF-I-3’SVaは、筋管において筋芽細胞の程度以上には蓄積しなかった。これは典型的な発現活性である。SK733IGF-IベクターはIGF-I 3’UTRを含む。このベクター由来のIGF-I mRNAは筋管に蓄積したが、SK202IGF-I-SKまたはSK733IGF-I-SK2よりも十分に低い程度であった。これら後の2つのベクターは骨格アクチン3’UTRおよび3’NCRを含む。これらのベクターの第一の違いは3’UTRであるから、骨格の3’UTRによるRNA転写産物の安定化の上昇は、RNA含量が約100倍違うことを説明する。
同様のアッセイにおいて、IGF-IはC₂C₁₂細胞においてpIG0552からも高程度に産生された。
発現ベクターによるIGF-I遺伝子放出に由来する、IGF-Iの分泌量の測定
合成され、培地中に分泌されるIGF-Iの量を測定するために、分化させた筋管培養を最小培地（DMEMおよび0.05%ウシ胎児血清、RIAグレード）中にて培養した。SK733IGF-I-SK2は、筋肉細胞においてIGF-Iを発現する最も効果的な構築物である。IGF-Iを、組織培養培地のラジオイムノアッセイおよび細胞のイムノペルオキシダーゼ染色の両方によりアッセイした。いくつかの筋肉培養が融合する間にIGF-I量の上昇が見出された。別々の発現ベクター由来の量の比較を表IIに示す。対照の培養においては、IGF-Iの量は0.2-0.5ng/mlの範囲にあった。比較して、ベクターSK733IGF-I-SK2（pIG0100AまたはpIG0335）は少なくとも100倍多いIGF-I量である。

同様に、筋原培養のイムノペルオキシダーゼ染色により、安定トランスフェクトされた筋芽細胞において免疫反応性のあるIGF-Iの産生量の上昇が明らかになったが、対照のEMSV-Hygromycinトランスフェクトされた筋芽細胞または融合前のC₂C₁₂細胞においては上昇しなかった。AおよびD領域に対する抗体を1:1000の希釈で用いた。SK202I GF-Iを含むトランスフェクトされたすべての株は、イムノペルオキシダーゼで陽性に染色された。したがって、増加した量のIGF-Iが安定な筋芽細胞から合成され放出されているということは明らかである。
トランスジェニックマウスへの発現ベクターの挿入
hIGF-Iを含むベクターを保有するトランスジェニックマウスを、標準的な卵母細胞注入により作出し（Brinster,et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:4438-4442（1958））、続く世代に導入遺伝子が安定に伝達されるように交配した。トランスジェニックは、断尾したDNAからポリメラーゼ連鎖反応またはサザンゲノムDNAブロッティング解析により同定した。いくつかの組織から単離した全RNAのRNAブロッティングにより、導入したIGF-Iベクターの筋特異的な発現に関してトランスジェニックを調べた。SV40 3’イントロンおよびポリA付加配列を含むSK202IGF-I-3’SVaにより、独立なトランスジェニックマウス系統5484、5496、5832、5834を作出した。これらの系統由来のマウスは、第一に心臓組織において弱い発現が見出されたが、骨格筋および腎や脳のような非筋原組織においては非常に低い程度で見出された。独立なトランスジェニックマウス系統3357、3359を、SK733IGF-I-3’SK2（pIG0100AまたはpIG0335）にて作出した。これらの系統由来のマウスは、IGF-Iの発現量が上昇していることが見出された。これらの量は内在性α-アクチン遺伝子活性に匹敵する。SK733IGF-I-3’SK2（pIG0100AまたはpIG0335）に由来するこれらの量は、SK202IGF-I-3’SVaベクターから産生される量と比較して少なくとも100-1000倍多いIGF-I mRNAの蓄積を示す。骨格のα-アクチン3’UTRおよび3’フランキング領域を加えると、心臓よりもむしろ骨格筋においてIGF-I RNAが選択的に増加された。したがって、骨格のα-アクチンの3’UTRおよび3’NCRは筋特異的な遺伝子発現を増強する。
これらの系統由来のマウスは、親の型と比較して筋重量が増加し、体脂肪のパーセンテージが減少した。マウスにおいてヒトIGF-Iを用いることにより、この特定の遺伝子を種交差適用できることが示されている。
加えて、隣接する3’NCRを提供することにより、ゲノムに統合された際に、IGF-Iはゲノム配列外に対して緩衝され、それゆえ位置効果からより保護される。さらに、天然の終止配列を提供することにより、骨格のa-アクチンの転写ドメインを区分するさらなる調節配列が、転写を介した読みとりを阻害し、組織特異性、発生の時間的調節および転写活性を改善する。3’NCR配列の存在により、統合されたベクターに内在性の配列の40-50%の転写活性を生み出させる。
In vivoにおける骨格筋への体細胞遺伝子移入
in vivo遺伝子治療に用いた時のIGF-Iをコードするベクターの効果を評価するために、特定のポリペプチドを発現させるために特に、成体の筋肉にベクターを注入した。成長ホルモン欠失マウス系統であるlittleをこれらの研究に用いた。ベクターSK733IGF-I-SK2（pIG0100AまたはpIG0335）、あるいは対照ベクターSKSKを沈降分離により沈渣にし、減圧下乾燥して、6匹のlittleマウス2組の大腿四頭筋内に刺した（20μg/沈渣-3沈渣/筋肉）。接種を受けた各動物個体由来の全筋肉を、DNAの導入後2週間で除き、組織におけるIGF-Iタンパク質に関してアッセイした。放射性同位体アッセイを用いて各組織におけるIGF-Iの量をアッセイした。ベクターだけ（IGF-Iなし）を持ったマウス対ベクターSK733IGF-1-3’SKを持ったマウスに関して、4.2ngから6.9ng IGF-I/筋肉可溶化物の100μgの総タンパク質という、わずかではあるが有意な（p>0.05）IGF-I発現の上昇（表III）が観察された。

糖尿病ラットにおけるIGF-I筋原ベクターの筋肉内注入
糖尿病による体重および筋重量、血漿グルコース量の変化に対する、ヒトインスリン様成長因子-I（”IGF-I”）を運ぶ筋肉特異的なDNAベクターの筋肉内注入の効果および、注入したIGF-IベクターからのmRNA量を調べた。組み換えIGF-Iの注入が悪液質の多数のモデルにおいて同化効果を有することが示されていたので、この仕事のためにIGF-Iを発現するベクターを選択した。
オスのSprague-Dawleyラット（175200g）に、クエン酸ナトリウムバッファー（0.05M、pH4.5）に溶解したストレプトゾトシン（STZ；55mg/kg）を静脈内注入することにより糖尿病を誘発させた。対照の非糖尿病動物個体は、齢、体重および性別を合わせ、等量の媒体を注入した。糖尿病であることは、高血糖、糖尿、および成長速度の減少といった兆候により確認した。STZ投与後3日目に、絶食しなかった動物個体をペントバルビタール（50mg/kg）により麻酔し、心臓に穴をあけることにより血液試料を得た。EDTAを含むチューブに血液を移し、3000xgにて15分間遠心し、-70℃で保存した。皮膚切開により筋肉を直接露出させたあと、腓腹筋の両側に注入した。個々のラットの右腓腹筋に、それぞれ0、50、200、あるいは800μgのIGF-Iベクターを200μlの等張の生理食塩水溶液にて注入した。反対側の（左）腓腹筋に等張の生理食塩水を200μl注入した。この一連の実験に用いたIGF-Iベクターは、上記のSk-733-IGF-I-Sk2であった。筋肉特異的なベクターの筋肉内注入後6日目に、動物個体に餌を与えないようにし（12-16時間）、続いて断頭により安楽死させた。その後、血液を回収し、腓腹筋全体を除く（腱から腱へと切開する）。
体重および筋重量に対するベクターの効果を解析するために、用量の集団はベクター注入前の体重を合わせ、解析には糖尿病の動物個体のみを含めた。解析に含めた血漿グルコースの基準は、300mg/100ml以上の、非絶食の血漿グルコース量であった。ベクター注入前の体重は、単に175-195gmの間の体重の動物個体を含めることにより合わせた。血漿グルコース量に対するベクターの効果の解析のために、その集団はベクター注入前の血漿グルコース量を合わせた。IGF-Iベクターの筋肉内注入の結果、体重が増加した（平均±SD；媒体のみ=181.37±6.17；50μg=193.43±5.71；200μg=186.6±8.01；800μg=191.14±7.54）。この体重増加は、用量50および800μgにおいては統計的に有意であるが、200μgでは有意ではない（priori t-検定：対照対50μg、t=3.57、df=12；対照対200μg、t=1.17、df=10、対照対800μg、t=2.29、df=12）。
体重の増加に加えて、IGF-Iベクター注入により、ベクターを注入した腓腹筋の重量も増加する（平均±SD；媒体のみ=1.00±0.08；50μg=1.10±0.07；200μg=1.07±0.03；800μg=1.09±0.05）。このベクター注入した腓腹筋の重量増加は、用量50および800μgにおいては統計的に有意であるが、200μgでは有意ではない（priori t-検定：対照対50μg、t=2.32、df=12；対照対200μg、t=1.75、df=10、対照対800μg、t=2.32、df=12）。反対側の腓腹筋の重量も増加したが、この増加は統計的に有意なところまで届かなかった（平均±SD；媒体のみ=1.00±0.07;50μg=1.07±0.06;200μg=1.05±0.01;800μg=1.08±0.06;priori t-検定：対照対50μg、t=1.72、df=12；対照対200μg、t=1.43、df=10、対照対800μg、t=2.11、df=12）。
注入したIGF-I構築物の発現量を、IGF-I特異的なmRNAの量を求めることにより評価した。注入したおよび対照の、反対側の、腓腹筋から単離した全細胞RNAを、DNAaseにて処理し、mRNAのcDNAレプリカを作製するためにオリゴ-dTをプライマーとして用いた逆転写にかけた。それから、ポリメラーゼ連鎖反応においてcDNAをIGF-I特異的プライマーと反応させ、元の筋肉試料におけるmRNAの発現量を見積もった。IGF-I特異的プライマーにより増幅された産物に対応するバンドを検出した。データにより、注入された筋肉においてIGF-IベクターIGF-I構築物が有意な量で発現していることが示された。対照の筋肉はヒトIGF-Iの発現は全く示さなかった。
対照集団と比較して、50μg IGF-Iベクター用量集団における絶食血漿グルコース量は有意に低かった（平均±SD；媒体のみ=277.14±113.65；50μg=155.42±37.54；200μg=224.06±89.21；800μg=216.57±100.55mg/100ml）。（priori t-検定：対照対50μg、t=3.23、df=12；対照対200μg、t=1.04、df=17、対照対800μg、t=1.09、df=16）。
これらの知見は、IGF-Iベクター（SK-7331-IGF-I-SK2）の筋肉内注入により糖尿病の高血糖が減少し、体重および筋重量が増加することを示しており、IGF-I発現量が同化効果を刺激するのに十分であることを示唆している。反対側ではなく、ベクターを注入した方の腓腹筋が有意に増加するという知見は、2つの筋肉内の局所IGF-I濃度が違うことを示唆している。
骨格アクチン−ＩＧＦ−Ｉ導入遺伝子におけるｈＧＨ３’ＵＴＲによる骨格アクチン３’ＵＴＲの置換がトランスジェニックマウス中のｈＩＧＦ−Ｉの循環濃度に及ぼす影響
図１５に記載される骨格アクチン−ＩＧＦ−Ｉ導入遺伝子を含むトランスジェニックマウスを発生させた。血清試料を得て、ｈＩＧＦ−Ｉについてアッセイした。結果（表ＩＶ）は、ｈＧＨ３’ＵＴＲを含む導入遺伝子は骨格アクチン３’ＵＴＲを含む導入遺伝子と比較して、循環中のｈＩＧＦ−Ｉの濃度の増加を引き起こすことを明らかに示す。他の変数、例えば、イントロンの存在／非存在または起源、および５’ＵＴＲの起源は、ほとんどまたは全く影響を及ぼさないようである。

表のデータに示されるように、ＧＨ３’ＵＴＲ配列は、３’配列、例えば骨格アクチン３’ＵＴＲの使用と比較して、コードされるポリペプチドの非常に高められた血清濃度（すなわち、高められた分泌）を引き起こし、これは組織における生成物のより高い保持を与える。すなわち、適切な分泌または保持促進特性を有する３’ＵＴＲ配列の選択は、コードされる産物の局在化を調節する能力を提供する。
無傷の筋肉におけるベクター発現の増強
滅菌20％スクロース溶液（wt/vol）中の無傷のプラスミドDNAを成熟したトリまたはほ乳類の筋肉中に注入することができる。単回注入の後ベクターDNAは、筋肉核内の非融合染色体外環状DNAとして、少なくとも30日間安定であり、そして転写活性が存在する（Wolf et al.,Science,vol.247,pp.1465-1468（1990））。しかしながら、Wolffのプロトコル（Wolff et al.,BioTechniques 11:4374-485（1991））の下では、99％以上の注入DNAが筋肉内で分解される。このプロトコルは、筋肉中へのプラスミドDNAの取り込みを増加し、そしてベクター分解を減少させることにより改良することができる。本発明の手順は、適切な転写調節因子、ヒト血清応答因子およびヒストンなどのその他のヒト関連核タンパク質でコートされた発現ベクターDNAおよび転写開始因子を使用して、取り込みを増加させそして安定性を増加させることができる。調節タンパク質は、筋肉のヌクレアーゼから当該DNAを保護し、そして筋原細胞核中へのタンパク質コートされたDNAの取り込みを容易にする。
発現ベクターは、血清応答因子が血清応答要素の内部コアであるCCXXXXXXGG（ここでXはAまたはTのいずれでもよい；SEQ ID NO:6）に対して配列特異的に結合することにより、そしてヒストンの添加により、タンパク質／DNA複合体を形成する。プロモーターの内部コアとの相互作用により、骨格のα-アクチン遺伝子の筋原細胞型限定的発現が容易になる。血清応答因子、転写開始因子、転写調節因子およびヒストンをin vitro結合反応により発現ベクターに添加し、再構成タンパク質／DNA複合体を形成する。
発現ベクター系のコーティング
特定の製剤（フォーミュレーション）は、転写開始複合体及びヒストンという要素でベクターをコーティングすることに関わる。この製剤は、ベクターの細胞への輸送を強化すること及び細胞内でのベクターの発現を高めることのために利用される。
以下のプロトコールは、ヒト血清反応因子（ＳＲＦ）を細菌内で発現させて精製するために使用された。プラスミドｐＡＲＳＲＦ−ＮｄｅはＴ７ポリメラーゼベクターであり（Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．とＭｏｆｆａｔ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３〜１３０（１９８６））、これはＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）誘導時に完全な長さのＳＲＦタンパク質を産生した（Ｍａｎａｋ等、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ４：９５５−９６７（１９９０））。このプラスミドが潜伏している大腸菌ＢＬ２１を３７℃でＯＤ₆₀₀が０．４になるまで、アンピシリン添加（５０μｇ／ｍＬ）ＴＹＰ培養液で生育させた。その後、１ｍＭのＩＰＴＧで２時間、ＳＲＦの合成を誘導した後に、細胞をスピンダウンさせ、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）で１回洗浄し、圧縮された細胞の４０倍量の緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ［Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸、ｐＨ７．４］、６０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホン酸及び１０％グリセロール）で再懸濁し、透析した。細胞は氷の上で音波処理によって破砕された。溶解液を遠心分離（１５，０００ｘｇ、２０分間）によって澄明化し、過剰に発現したＳＲＦを含む高速上澄み液を−８０℃で保存した。ＳＲＦの部分精製は以下の様にして行った。１０ｍＬ量の溶解液を、カラム緩衝液（上記の透析緩衝液と同じ）及び０．０５％ノニデート（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０で平衡化した１０ｍＬのホスホセルロース・カラムにかけた。流出分画を回収し、５ｍＬのヘパリンアガロース・カラムにかけた。このカラムを０．３５Ｍの塩化カリウムで洗浄した後、０．５Ｍの塩化カリウムでＳＲＦを溶出させた。ＳＲＦは透析後−８０℃で保存した。
重量比約５：１の割合で、ＳＲＦタンパク質と発現ベクターＤＮＡを混合し、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、５％グリセロール、１００ｍＭ塩化カリウムを含む溶液で保温した。ＳＲＦのアクチン・プロモーターへの結合は、本技術分野で知られているＤＮＡ結合アッセイ及びヌクレアーゼ・フットプリント保護アッセイによって証明された。ＴＡＴＡボックスタンパク質（ＴＢＰ）のような転写開始因子やＴＦＩＩＢ、Ｅ及びＦのような他の開始因子は、Ｄｉｇｎａｍ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：５８２〜５９８（１９８３）のプロトコールによれば、上記の透析液で０．４２Ｍの塩化カリウムによって、精製されたヒーラ細胞核から溶出される。転写開始因子を含む核の溶解液をＳＲＦ−ＤＮＡプラスミドと、ＳＲＦ−ＤＮＡ１部に対してタンパク質１０部の割合で混合し、前開始複合体の形成を促し、これを２４時間透析する。最後に、ヒーラ細胞核から６Ｍ尿素、２Ｍ塩化ナトリウムで分離した粗ヒストン調製物を低塩透析緩衝液で透析する。この完全量のヒストンを、最終濃度で（ヒストンとＳＲＦ−タンパク質ＤＮＡ複合体の比が）１：１になるようにゆっくり加え、保護されていないＤＮＡの上にヌクレオソーム粒子を形成させる。ＤＮＡ領域は、ヒストンの添加によって、裸のＤＮＡよりも細胞ヌクレアーゼからより十分に護られるようになる。
この核タンパク質複合体は、次いで、筋肉への直接注射用に、脂質基剤、非水性基剤及び／又はリポソームで製剤化される。核の標的配列を含む、特定の転写因子が豊富にあるので、発現ベクターＤＮＡは容易に輸送され、筋肉の細胞核に取り込まれる。
ベクターはまた他のＤＮＡ結合性化合物を有する製剤でも製造され得る。例えば、ベクターはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を用いて製造され得る。ＰＶＰは直鎖の１−ビニル−２−ピロリドン基から成る合成ポリマーである。様々な重合度と分子量のＰＶＰが市販されている。医薬グレードのＰＶＰはプラスドン（インターナショナル・スペシャルティ・プロダクツ社、ＩＳＰ）及びコリドン（ＢＡＳＦ社）の商品名で販売されている。ＩＳＰはプラスドンＣ−３０の特性をその製品文献に記載している。プラスドンＣ−３０の平均分子量は、５０，０００ｇ／モルである。
ＰＶＰはＤＮＡと水素結合によって反応することが見出されている。ＰＶＰはまた、インビトロでヌクレアーゼ（ＤＮＡアーゼ１）による分解からＤＮＡを護ることが見出されている。レポーター遺伝子（ＣＭＶ−ＣＡＴ又はＣＭＶ−β−ｇａｌ）がＰＶＰ溶液で製剤化され、外科的曝露を施したラット脛骨筋へ注入された。試験結果は、５％ＰＶＰ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液１ｍＬ当り３ｍｇの濃度で製剤化したＤＮＡが、生理食塩水において製剤化したＤＮＡに比較して最も遺伝子発現を高めることを示した。より分子量が小さいＰＶＰ（プラスドンＣ−１５）を用いた遺伝子発現のレベルは、プラスドンＣ−３０を用いた製剤の遺伝子発現レベルの約１／２であった。生理食塩水又は５％ＰＶＰ（プラスドンＣ−３０）で製剤化したＤＮＡをラット脛骨筋に注射したとき、β−ガラクトシダーゼに対する免疫化学染色は、この染色が製剤化されたＤＮＡで処置した筋肉においてより広く分布していることを明らかにした。またこの染色は、ＰＶＰ製剤化によってβ−ガラクトシダーゼを発現する細胞の数が増加すること、及びこれらの細胞が、生理食塩水に溶けたＤＮＡを注射した場合と比較して、より広範囲に分布していることを示した。ＰＶＰ製剤を用いることでＤＮＡの組織分散が高まるのは、筋肉における高浸透圧効果によるものと示唆されている。５％ＰＶＰ（プラスドンＣ−３０）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム溶液のＤＮＡ（３ｍｇ／ｍＬ）は、３４１±１ｍＯｓｍ／ｋｇＨ₂Ｏの浸透圧を有する。
ｈＩＧＦ−Ｉプラスミドの典型的な製剤は３−バイアル・システムであり、製品の成分は使用直前に混ぜ合わされる。製品成分は以下の通り：
１．滅菌水に溶かしたヒトＩＧＦ−Ｉプラスミド
２．凍結乾燥したＰＶＰ（ポリビニルピロリドン；プラスドンＣ−３０、ポビドンＵ．Ｓ．Ｐ．）；化学式（Ｃ₆Ｈ₉ＮＯ）_n
３．５％塩化ナトリウムの１１５ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）
発現ベクターは以下に記載するようなやり方でも輸送できる。
投与
ここで用いる投与とはベクター又はＤＮＡの運搬体を体内へ導入する経路のことを指す。投与は標的組織へ直接なされるか、又は全身投与後に標的輸送によって標的組織へなされる。特に、本発明は、ある特定の核酸配列が遺伝子治療に有用であるレベルで組織内部においてコントロールされて発現されることを確立するために、ベクターを体内へ投与することによって疾患を治療するために利用される。
ベクターの好ましい投与手段及び輸送用製剤の使用は上記に記載されている。好ましい実施例は注射針又はハイポスプレイを用いた直接注入である。
選択されるベクター構築体の投与経路は、発現ベクターの特殊使用に依存する。一般に、用いる各ベクター構築体に特定の製剤は、特有の標的組織に関するベクターの取り込みと効果の実証に注目するものである。取り込み試験は、細胞によるベクターの取り込みと選択された組織特異的ＤＮＡの発現を評価する取り込みアッセイを含む。このようなアッセイはまた取り込み後の標的ＤＮＡの局在化を決定し、発現されたタンパク質の定常濃度を維持するための必要条件を確立する。さらに、効果及び細胞毒性が試験され得る。毒性は細胞の生存能力だけでなく細胞の機能をも含む。
筋肉細胞には、溶液、懸濁液又はコロイド状態のＤＮＡ粒子を筋肉へ直接注射した後に、細胞外スペースからＤＮＡを取り込むという独自の能力がある。この方法によるＤＮＡ発現は数ヶ月の間維持され得る。
製剤化されたＤＮＡベクターの輸送は、標的細胞によってエンドサイトーシスされる高分子複合体へＤＮＡを取り込むことに関わる。このような複合体には、脂質、タンパク質、炭水化物、合成有機化合物又は無機化合物がある。ベクターと結合した複合体の特性（サイズ、電荷、表面特性、組成）がベクターの体内におけるバイオアベイラビリティを決める。この製剤の有する他の要素は細胞表面又は細胞内部に存在する特定のレセプターと相互反応するリガンドとして機能する。この製剤の有する他の要素は細胞内へのエントリー、エンドソームからのリリース及び核へのエントリーを促進するように機能するのである。
輸送はまたＤＮＡトランスポーターの利用を介しても可能である。ＤＮＡトランスポーターとはＤＮＡベクターに結合する分子を指し、表皮細胞によって取り込まれ得る。ＤＮＡトランスポーターは、ＤＮＡと非共有的に結合して細胞膜を介してＤＮＡを効率的に輸送することのできる分子複合体を含む。このトランスポーターはまた、好ましくは、核膜を介してＤＮＡを輸送する。例えば、ここに援用する以下の出願を全て（図表も含め）参照せよ：（１）Ｗｏｏ等、アメリカ特許出願番号０７／８５５，３８９、名称「ＤＮＡトランスポーターシステムと使用方法」、１９９２年３月２０日出願、現在放棄；（２）Ｗｏｏ等、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０２７２５、国際公開ＷＯ９３／１８７５９、名称「ＤＮＡトランスポーターシステムと使用方法」、（アメリカ及び他国指定）１９９３年３月１９日出願；（３）Ｗｏｏ等、一部継続出願、名称「核酸トランスポーターシステムと使用方法」、１９９３年１２月１４日出願、アメリカ特許出願番号０８／１６７，６４１；（４）Ｓｚｏｋａ等、アメリカ特許出願番号０７／９１３，６６９、名称「自己構築的ポリヌクレオチド輸送システム」、１９９２年７月１４日出願、及び（５）Ｓｚｏｋａ等、ＰＣＴ／ＵＳ９３／０３４０６、国際公開ＷＯ９３／１９７６８、名称「自己構築的ポリヌクレオチド輸送システム」、（アメリカ及び他国指定）１９９３年４月５日出願。
遺伝子の筋肉への直接転移はきわめて有効である。実験は、筋肉細胞へＤＮＡを直接注射して投与すると注射部位で遺伝子発現をもたらすことを示している。ＩＧＦ−Ｉを含むプラスミドを注射すると数ヶ月にわたって比較的一定のレベルで遺伝子が発現される。注入されたＤＮＡは、染色体外で組み込まれない状態で存在し続けるようである。この転移方法は好ましい実施例にある。
他の好ましい輸送方法は、ＤＮＡトランスポーターシステムに関わる。ＤＮＡトランスポーターシステムは、独立的及び非共有的にＤＮＡと結びつくいくつかの要素を含む粒子より構成される。各要素は、特定のレセプター又はＤＮＡと結合するカチオン基が複合したタンパク質のような他の機能群を認識するリガンドより構成される。使用され得るカチオンの例に、スペルミン、スペルミン誘導体、ヒストン、カチオン性ペプチド及び／又はポリリジンがある。第一の要素は、ＤＮＡベクターと標的細胞上の細胞表面レセプターの両方と結合することが可能である。このような要素の例に、アシアロ糖タンパク質レセプター、葉酸レセプター、マンノース−６−リン酸レセプター又はカルニチンレセプターと相互作用する有機化合物がある。第二の要素は、ＤＮＡベクターと核膜上のレセプターの両方と結合することが可能である。この核リガンドは、トランスポーターシステムを認識して核膜を介して輸送することができる。このようなリガンドの例に、ＳＶ４０Ｔ抗原由来の核標的配列又はヒストンがある。第三の要素は、ＤＮＡベクターとエピソーム溶解を誘発する要素の両方と結合することが可能である。この例には、アデノウィルスのような不活化ウィルス粒子、インフルエンザウィルスの血球凝集素に関連したペプチド、又は上記に引用したＳｔｏｋａの特許に記載されたＧＡＬＡペプチドがある。
投与はまた脂質に関わる場合がある。脂質は中空の球状胞であるリポソームを形成し得るが、それは、単層、二層又は多層式に配列された脂質と、ＤＮＡのような水溶性化合物を取り込む内部の水性スペースより構成され、直径０．０５〜数ミクロンの範囲の大きさである。脂質はリポソームを形成せずとも有用であるかもしれない。特殊な例に、ＤＮＡ及び標的細胞の膜と相互反応して細胞へのＤＮＡエントリーを促進する、カチオン性脂質及びＤＯＰＥ含有複合体の使用がある。
遺伝子輸送はまた遺伝子工学的に処理された細胞を移植することによっても達成し得る。例えば、筋芽細胞と呼ばれる未熟な筋肉細胞は遺伝子を筋肉繊維へ運搬するのに利用され得る。組換えヒト成長ホルモンを発現するような遺伝子工学的処理を施された筋芽細胞は、成長ホルモンを動物の血液へ分泌する。組み込まれた遺伝子の分泌は３ヶ月にわたって維持される。
筋芽細胞は最終的に分化して既存の筋肉組織へ融合する。既存の構造体へ組み込まれるのだから、この細胞は寛容されるばかりでなく養成されるわけである。筋芽細胞は遺伝子治療の必要がある患者の筋肉組織から容易に採取でき、遺伝子工学的に処理された細胞も、患者の筋肉を損傷することなく、容易に戻すことができる。同様に、ケラチノサイトも遺伝子を組織へ輸送するのに利用できる。わずかの生検材料を培養することで大量のケラチノサイトが産生される。培養物は層状シートのように調製され、ヒトに移植したときに、表皮を産生するが、これは多年の間組織特有の性質を保って生育しつづける。この遺伝子工学的に処理されたケラチノサイトは、培養の間に適切なベクターでトランスフェクトされている。ケラチノサイトは上皮を真皮から分かつ基底膜によって血液循環から分離されているが、ヒト・ケラチノサイトは産生されたタンパク質を循環へ分泌する。
輸送はまたウィルス・ベクターの使用に関わる場合がある。例えば、アデノウィルスのベクターは、ウィルスゲノムのＥ１領域を、プロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ及び核酸カセットを含む本発明で記載したベクター要素で置換して、この組換えゲノムを、この遺伝子を感染力のあるウィルス粒子へパッケージする２９３細胞へ導入することによって構築し得る。従って、この細胞由来のウィルスは、組織を体外又はインビボで感染し、ベクターを組織へ導入し、核酸カセット中の遺伝子の発現を導くのに利用し得る。
選択される輸送方法は、核酸カセット内部にコードされた遺伝子産物が適切な生物学的効果を発揮するレベルでの発現を生じるべきである。発現の速度は、疾患、ベクター及び遺伝子産物の薬物動態、及び投与経路に依存するが、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重／日であるべきである。このレベルは標準的な方法によって容易に決定される。それは、最適な投与方法に多かれ少なかれ依存している。治療期間は疾患症状の認められる経過を通して、ほぼ連日であろう。投与回数は、疾患用輸送ベクター及び臨床試験の有効性データ次第である。
動物の安全性／毒性試験
Ａ．急性７日及び亜慢性２８日毒性試験
急性７日及び亜慢性２８日毒性試験が、アメリカ食品医薬局の定める医薬品の安全性試験の実施に関する基準（ＧＬＰ）規制（５８部２１章）に準じ、イヌを用いて実施された。本試験で用いた被験物質及び担体（ｖｅｈｉｃｌｅ）はｃＧＭＰ基準工程のもとで製造された。イヌを用いたのは、プラスミドによって発現される成熟したヒトＩＧＦ−Ｉ（ｈＩＧＦ−Ｉ）がイヌのＩＧＦ−Ｉと同一だからである。
７日急性試験の目的はイヌに単回静脈注射した後のｈＩＧＦ−Ｉプラスミドの潜在的な急性毒性を調べることにあった。各群２匹の雄と２匹の雌から構成される４群のビーグル犬に対し、被験物質であるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）で製剤化したｈＩＧＦ−Ｉプラスミドを、０．１、１．０及び１２．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで静注した。最高用量レベルは、担体に対する被験物質の最大溶解度とイヌへの注射の許容量に基づいて選択された。低用量はげっ歯類を用いた前臨床動物試験における最小有効量に相当する。
対照群には、被験物質の最高用量レベルで用いられる担体（ＰＶＰ）だけを投与した。最高用量の被験物質で処置した動物と対照動物から成る回復群（各群雄２匹、雌２匹）を２群追加して、さらに１週間飼育した。イヌは注射後８日目に屠殺し、回復群は注射後１５日目に屠殺した。
静脈という投与経路を用いたのは、被験物質の全身曝露という「最悪ケース」のシナリオを模倣するためである。試験期間を通して１日２回致死性チェックをし、臨床徴候の詳細検査は、投与後最初の４時間は毎時間、観察期間中は毎日実施した。体重測定は馴化期間の最終週に２度、観察期間中は連日実施した。実験検査（血液学、臨床生化学及び尿分析）は、前処置期間中及び投与後２、７及び１４日目に生存動物より採取したサンプルに対して実施した。全動物に対して全剖検を実施して、筋肉を含め選択した臓器の重量を測定した。
異常な臨床徴候は認められなかったし、体重、食餌消費量、血液学、臨床生化学及び尿分析パラメーターに対する効果も認められなかった。さらに、臓器重量や病理所見においてもｈＩＧＦ−Ｉプラスミドに関連した差異を認めなかった。ヒスタミン放出に一致する臨床徴候が対照群及び高用量群の動物に観察された。この徴候は約２時間続き、イヌで観察されたＰＶＰへの反応時のヒスタミン放出を伝える以前の報告に一致していた。従って、この徴候は製剤中に存在するＰＶＰによるものであってｈＩＧＦ−Ｉプラスミドによるものではなかった。
亜慢性試験の目的は、ビーグル犬に毎週筋肉内注射する４週間及びその後の４週間の回復期間におけるｈＩＧＦ−Ｉプラスミドの潜在的な毒性を調べることにあった。筋肉内注射という経路はヒトでの想定投与経路である。週１回４週間、０．１、１．０及び６．０ｍｇ／ｋｇの用量でイヌに筋肉内注射した。各群は雌雄各３匹で構成された。高用量及び対照動物の追加的な回復群（雌雄各２匹）はさらに２８日間観察された。試験期間中、１日少なくとも２回致死性チェックを実施し、不健康又は処置への反応を示す臨床徴候の検査は、処置開始後毎日少なくとも２回実施した。各動物の体重は、処置及び回復期間中、毎週不定期日に測定した。食餌消費量は処置及び回復期間中毎日測定した。検眼鏡検査は処置開始前に１回、処置の最終週（第４週）及び回復期間の最終週（第８週）に再度実施した。心臓血管系の検査（心電図及び収縮期血圧測定）及び実験検査（血液学、臨床生化学及び尿分析）は処置開始前に１回、第４週及び第８週に再度実施した。さらに、血清サンプルを同時期に採取して、将来の分析に備えて保存した。処置期間の最後に屠殺した全動物に対して全剖検を実施した。選択した臓器の体重を測定し、完全な組織リストを作成し、顕微鏡で評価した。
ｈＩＧＦ−Ｉプラスミドに関連すると考えられる異常な臨床徴候は認められなかったし、体重、食餌消費量、血圧、心電図、血液学、臨床生化学、尿分析パラメーター又は眼球の変化に対する効果も認められなかった。急性試験と同じように、ヒスタミン放出に一致する臨床徴候が、対照薬及び被験物質の投与後、対照群及び高用量群の動物に観察された。稀に起こった（１６匹中４匹）重篤な反応に対しては、エピネフリンを静注して死なないようにした。前と同じように、この反応は被験物質に存在するＰＶＰによるものであって、ｈＩＧＦ−Ｉプラスミドによるものではなかった。
２匹のイヌに実施した試験的な探索研究によって、観察された臨床徴候がヒスタミン放出によるものであることが確認された。ヒスタミン放出の臨床徴候を引き起こす高用量（６ｍｇ／ｋｇ）の担体をイヌに筋肉内注射した。イヌの１匹はＨ₁ヒスタミンレセプター拮抗薬である塩酸ジフェンヒドラミン（ベナドリル^R、１ｍｇ／ｋｇ）で前処置した。２匹のイヌはいずれもこの臨床徴候を発現し、ヒスタミン拮抗薬による前処置はこの徴候を排除しなかった。血液サンプルのヒスタミン濃度を分析したところ、いずれのイヌにおいても前処置レベルの約１００倍又はそれ以上高くなっていた。これらの結果はヒスタミン拮抗薬の投与量が不充分であったことを示唆する。イヌで見られた効果は種特異的で、イヌに特有なものであると我々は考える。血液増量剤としてＰＶＰを使った経験では人間が同様の臨床徴候を示したことはないからである。臓器重量及び全体又は組織病理所見においては、ｈＩＧＦ−Ｉプラスミドに関連すると考えられる差異はなかった。
従って、ｈＩＧＦ−Ｉプラスミドを４週間毎週筋肉内注射で投与しても、６ｍｇ／ｋｇ／回の用量までは毒性を示す証拠はなかった。対照群及び高用量群の動物で観察されたヒスタミン放出に一致する臨床徴候は、投与製剤中に存在するポリビニルピロリドンに起因するものであって、ｈＩＧＦ−Ｉプラスミドによるものではなかった。
Ｂ．抗−ｈＩＧＦ−Ｉ及び抗−ＤＮＡ抗体に対するイヌ血清のアッセイ
亜慢性（２８日）毒性試験においてｈＩＧＦ−Ｉプラスミドで処置したイヌから採取した血清サンプル中に、ｒｈＩＧＦ−Ｉ及び２本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに対する抗体が存在しているかをアッセイした。ｈＩＧＦ−Ｉプラスミドを０（担体対照）、０．１、１．０及び１２．０ｍｇ／ｋｇ、７日ごとに２８日間、イヌに筋肉内注射した。血清サンプル（表Ｖの概略を参照）は、投与開始前（前飼育期）、投与終了時（第２７日）及び２８日間の回復期後（第５５日）に採取した。全７６サンプルがアッセイされた。

ｒｈＩＧＦ−Ｉに対する抗体は標準的なＥＬＩＳＡ法によってアッセイされた。測定結果は、処置されたイヌから採取した血清サンプルは検出し得るｒｈＩＧＦ−Ｉ抗体を含んでいないことを示した。ｄｓＤＮＡに対する抗体は、ヒト血清中に存在するｄｓ抗体を定量するように設計され、イヌ血清中の抗体を定量化するように変更されたＥＬＩＳＡキット（バインディングサイト社、バーミンガム、イギリス）を用いてアッセイした。抗−ヒトＩｇＧ・ＨＲＰ結合体を、第二抗体としてウサギの抗−イヌＩｇＧ・ＨＲＰ結合体に置き換えた。測定結果は、処置されたイヌから採取したいずれの血清サンプルも、検出し得るｄｓＤＮＡ抗体を含んでいないことを示した。
薬物動態／生体分布試験
Ａ．ラット骨格筋におけるｒｈＩＧＦ−Ｉ発現の経時変化
ｈＩＧＦ−Ｉプラスミドの筋肉内注射した後のラットの脛骨腹側筋におけるｒｈＩＧＦ−Ｉの発現を経時的に決定した。ポリビニルピロリドンで製剤化したヒトｈＩＧＦ−Ｉプラスミドを雄のフィッシャー３４４ラット（体重約１２５ｇ）の脛骨腹側筋へ左右相称に注射（１５０μｇＤＮＡ／筋肉）した。ラットはランダムに２つの群に分け、１群の動物の臀筋へ、実験期間中隔日、免疫抑制剤のシクロスポリンＡを注射（５ｍｇ／ｋｇ体重）した。各群のラットはｈＩＧＦ−Ｉプラスミド注射後２４時間、４８時間、７日、１４日及び２８日の時点で屠殺した（５〜６匹のラット／群／時点）。各時点で脛骨腹側筋を採取し、免疫放射性測定アッセイ（ジアグノスティックシステムズ・ラボラトリーズ社、ウェブスター、テキサス）によってｒｈＩＧＦ−Ｉの発現を分析した。
注射された筋肉由来の全ＲＮＡを逆転写酵素ＰＣＲで分析したところ、注射後２４及び４８時間の時点では、ｈＩＧＦ−ＩのｍＲＮＡの発現は示されなかった。ｈＩＧＦ−ＩのｍＲＮＡの発現が観察されたのは、７、１４及び２８日後である。注射後７、１４及び２８日の時点でのｒｈＩＧＦ−Ｉの筋内含有量の結果は、ｒｈＩＧＦ−Ｉの筋内含有量は注射後７及び１４日の間は約１．５〜２．５ｎｇ／ｇ筋肉と同様だが、注射後２８日の時点では７日後の数値の約３５％まで減少したことを示している。免疫応答を抑制するシクロスポリンＡによる処置は筋内ｒｈＩＧＦ−Ｉ含有量に影響を与えなかったし（ｐ＞．１０）、シクロスポリンＡ処置を受けていないラットの血清には、注射後２８日の時点でｈＩＧＦ−Ｉに対する抗体は検出されなかった。まとめると、以上の結果は筋内ｒｈＩＧＦ−Ｉの減少が宿主の免疫応答によるものではないことを示唆している。ヒトＩＧＦ−Ｉは、注射されたラットの血清サンプルにいかなる時点でも検出されなかった。
Ｂ．ｈＩＧＦ−Ｉプラスミドの薬物動態及び組織分布の決定
上記試験の目的は、ｈＩＧＦ−Ｉプラスミド投与後の薬物動態及び組織分布を決定することであった。イヌのＩＧＦ−Ｉのように、成熟モルモットのＩＧＦ−ＩポリペプチドはヒトＩＧＦ−Ｉと同一であり、モルモットをｈＩＧＦ−Ｉプラスミドの薬物動態及び生体分布の試験に好適な生物種としている。２群のハートレーモルモットに、５％ＰＶＰで製剤化したｈＩＧＦ−Ｉプラスミドを低用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）又は高用量（１．５ｍｇ／ｋｇ）、筋注又は静注（各投与経路につき雄５０匹、雌５０匹）により１回注射した。
各処置群より各性につき５匹の動物を以下の時期に屠殺した：３０分、１時間、６時間、１２時間、１日、２日、１週間、４週間及び３ヶ月。対照として、各投与経路につき１群１０匹の雄及び１０匹の雌モルモットに高用量処置群と同じ用量／体重比で担体を投与した。
精巣、リンパ節、肝臓、膵臓、腎臓、肺、心臓、脳、骨髄、筋肉及び血液を各屠殺時点で採取した。血液は５℃で保存し、組織は液体窒素で凍らせて、−７０℃で保存した。血液サンプル由来のＤＮＡに対してヒトＩＧＦ−Ｉプラスミドの存在を高感度のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイを利用して分析した。血液中にプラスミドが検出されれば、選択された組織も陽性と推定され、分析されなかった。プラスミドが血液サンプルに検出されなければ、組織サンプル由来のＤＮＡは全く同一に増幅した。各複製物の１つのサンプルは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）阻害のないことを実証するために、検出限界に近いコピー数の被験プラスミドでスパイク（ｓｐｉｋｅ）した。高用量の筋注及び静注経路を用いて処置した動物のサンプルはまだ分析されていない。どんな陽性の組織も、遺伝子発現を決定するために、ヒトＩＧＦ−ＩのメッセンジャーＲＮＡを分析し得る。
被験物質投与後２日目までに屠殺された動物より採取した血液サンプルのＰＣＲ評価試験は、ＤＮＡプラスミドの存在を示した。投与後７日目では、プラスミドは血液から消失していた。低用量のｈＩＧＦ−Ｉプラスミド（０．１ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射して３ヶ月後に屠殺した動物から採取したサンプル（精巣、腎臓、肝臓、心臓及び筋肉組織）のＰＣＲ分析は、注射部位及び末梢の全身域で被験プラスミドの大部分が消失していることを示した。
試験期間中、両性のいかなる動物にも毒性の臨床徴候は観察されなかった。全動物が予定された屠殺の時まで生存した。最終体重が記録された動物（１日目以降に屠殺された動物）は、投与時から屠殺時に至る間、体重が増えた。体重に対する化学薬品に関連した明らかに有意な効果はなかった。選択された組織の剖検時の全体検査ではどの時点でも異常所見を認めなかったが、１つ例外があった。１匹の低用量投与の雌で、肺の全葉に褐色の病巣が観察されたのである。しかしながら、この所見は被験物質の処置に関連するとは考えられなかった。
全体に、データはｈＩＧＦ−Ｉプラスミドが３ヶ月後には消失することを示した。低用量のプラスミドを筋肉内注射された１０匹の動物から分析されたのべ５０の組織のうち、陽性シグナルが認められたのは、卵巣１、肝臓１、筋肉１の３つだけであった。このシグナルは散発的であって、組織特異的ではなかった。陰性対照の組織はすべて陰性の結果であった。
以上より、被験物質に関連した死亡、毒性の臨床徴候、体重への効果又は曝露後３ヶ月時点における病変が全くなかったことに基づけば、本被験物質は（投与されるとき）試験された用量で毒性を示さない。
細胞の形質移入と形質転換
本発明のある観点には、上記ベクターで形質移入した細胞がある。細胞を形質移入すると、形質転換した細胞は核酸カセット（nucleic acid cassette）によって、タンパク質またはそれをコードするＲＮＡを発現する。タンパク質の例にはポリペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、または核タンパク質があるが、それらに限定されるものではない。
興味のある遺伝物質を含有する核酸カセットを然るべき位置および配列でベクター内に配し、形質転換した細胞においてカセット中の核酸をＲＮＡに転写させ、必要により、タンパク質またはポリペプチドに翻訳できるようにする。
核酸カセット中の配列により、種々のタンパク質を形質転換した細胞において発現させることができる。発現させることができるタンパク質は、細胞質、核、膜（原形質膜、核膜、小胞体、または他の内膜コンパートメント（internal membrane compartment）を含む）、細胞器官（ミトコンドリア、ペルオキシソーム、リソソーム、エンドソーム、または他の細胞器官を含む）、あるいは分泌物に存在しうる。それらのタンパク質は、細胞内もしくは細胞外構造要素、リガンド、ホルモン、神経伝達物質、成長調節因子、分化因子、遺伝子発現調節因子、ＤＮＡ結合タンパク質、酵素、血清タンパク質、受容体、低分子量の有機もしくは無機化合物のキャリアー、薬剤、免疫調節薬、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、毒、腫瘍抗原、または抗原として機能しうる。これらのタンパク質は、その生物学的活性を向上、阻害、調節、または除去する、天然の配列、または変異した配列を有しうる。発現されるタンパク質の具体例はｈＩＧＦ−Ｉである。
更に核酸カセットはＲＮＡをコードすることができる。ＲＮＡは、翻訳の鋳型として、遺伝子発現のアンチセンス阻害剤として、遺伝子発現の３本鎖形成阻害剤として、酵素（リボザイム）として、または細胞構造に対する特定の構造決定因子をその活性を変更する目的で認識するリガンドとして機能する。具体例には、プロスタグランジン合成酵素、lipooxenganse、組織適合性抗原（クラスＩまたはクラスII）、細胞接着分子、亜酸化窒素合成酵素、β₂ミクログロブリン、癌遺伝子、および成長因子の発現もしくは機能を阻害するＲＮＡ分子がある。
組み込める化合物は、組み込まれるべきタンパク質もしくはポリペプチドの核酸配列の入手の可能性によってのみ制限される。当業者は、より多くのタンパク質およびポリペプチドが同定されれば、それらを本発明のベクターシステムに組み込み、動物もしくはヒトの組織で発現させることができることを容易に認識するであろう。
形質移入はin vivoまたはex vivo技術のいずれによっても行うことができる。例えば、筋肉細胞を培養液中で培養して形質転換遺伝子を形質移入し、その後筋肉組織に移植することができる。あるいはまた、上記の方法でベクターを細胞に投与することができる。
使用法
Ａ．成長ホルモンによる治療
通常、成長ホルモンは、前思春期の子供において、下垂体前葉から生成および分泌され、身長の成長を促進する。成長ホルモンは肝臓および他の組織に作用して、インシュリン様成長因子Ｉの生成を誘導する。in turn、この因子が成長ホルモンの成長促進効果の原因である。更に、この因子は総成長ホルモン分泌を示すものである。血清ＩＧＦ−Ｉ濃度は、内生の成長ホルモンおよび外から投与した成長ホルモンに応じて上昇する。成長ホルモン欠乏症では、この濃度が低い。
インシュリン様成長因子は、筋肉の発生および筋肉の成長を強化する鍵となる因子の一つである。筋原細胞は本来、融合の初期にＩＧＦ−Ｉ／ＩＧＦ−IIやそれと同種の結合タンパク質を分泌する。この過程は、筋肉特異的遺伝子産物の出現と同時に起こる。最終分化筋肉において、受動伸長によって誘導された肥大から伝達されるシグナルがＩＧＦ遺伝子の発現を誘導する。筋肉に対するＩＧＦの作用の多くはＩＧＦ−Ｉ受容体との相互作用によるものである。
ＩＧＦ−Ｉ（例えばｐＩＧ０５５２）の配列を含む発現ベクターの筋肉内注射を使用して成長異常を治療することができる。１００〜４００ｎｇ／ｍｌの範囲でＩＧＦ−Ｉの発現を制御できるようにベクターを設計する。ベクターの筋肉内発現により数カ月間、核酸カセットでコードされた産物が発現するため、この方法は、成長ホルモン欠乏症の患者においてＩＧＦ−Ｉの全身血中濃度を増加させるための長期的かつ安価な方法を提供する。
Ｂ．非活動性萎縮に対するＩＧＦ−Ｉベクター発現の効果
後肢懸垂法は、子ウシ筋肉の萎縮を誘導するのに使用される一般的な実験方法である。後肢懸垂法の効果は、ギプス固定および長期間の無重力状態によって誘導されるものと同様である。
マウス（１２／群）の腓腹筋および前脛骨筋に、ＩＧＦ−Ｉ含有ベクター（ＩＧＦ−Ｉ）または対照プラスミド（ＰＬＡＳ）のいずれかを、懸垂段階０および７日目に注射した。ベクターを調製して３ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）溶液とし、前脛骨筋には２５μｌ（７５μｇ ＤＮＡ）、腓腹筋には５０μｌ（１５０μｇ ＤＮＡ）の量を投与した。これは約１μｇ ＤＮＡ／ｍｇ筋肉湿重量の投与量に相当する。
後肢懸垂の停止後１〜２日に、収縮力（筋力）測定および筋肉の計量を行った。比較のために、後肢懸垂を行わなかった動物（ＮＯＲＭ）を含めた。
表VIに示す結果は、後肢懸垂により筋肉量および筋力が約２０〜２５％低下し、ＩＧＦ−Ｉベクター製剤での治療によりこれらの作用が減少する（ｐ＜．１０）ことを示している。

Ｃ．圧挫除神経後のＩＧＦ−Ｉベクター発現の効果
坐骨神経の圧挫は、外傷後の神経筋機能の変性および再生に伴う過程を解明するために一般に使用される特徴的なモデルである（M.Jaweed、1994、リハビリテーションの生理学的原理（The Physiological Basis of Rehabilitation）、Downeyら編、p543-561）。坐骨神経への圧挫損傷により、損傷までの軸索末端が速やかに変性し、神経伝達が喪失し、除神経筋が萎縮する。
げっ歯動物では、神経再生の初期事象は圧挫損傷後、数時間以内に始まり、順序だった一連の再生過程が開始され、１４〜２１日後に神経筋シナプスが再確立され、そして約６週間後に正常な神経筋の伝達に回復する。除神経の結果、損傷した筋線維の約４０〜５０％の萎縮およびこれに伴う等尺収縮力の低下が１４日後に観測され、最終的に正常の８０〜９０％まで回復する。筋肉量を損傷前の状態まで取り戻すには数カ月を要する。
げっ歯動物における従前の研究で、ｒｈＩＧＦ−Ｉタンパク質を毎日投与することにより、坐骨神経圧挫後の神経筋機能の回復を向上することができることが示されている。
ＩＣＲ系成熟マウスに片側疑似（ＳＨＡＭ）手術または坐骨神経圧挫のいずれかを施与した。ＩＧＦ−Ｉ含有ベクター製剤（ＩＧＦ−Ｉ）または対照プラスミド（ＰＬＡＳ）を手術した肢の前脛骨筋または腓腹筋に注射した。次いで、それぞれの群のマウスにＩＧＦ−Ｉ製剤または対照プラスミド製剤のいずれかをその後７日毎に注射した。
ベクターを調製して３ｍｇ／ｍｌのポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）溶液とし、前脛骨筋には２５μｌ（７５μｇ ＤＮＡ）、腓腹筋には５０μｌ（１５０μｇ ＤＮＡ）の量を投与した。これは約１μｇ ＤＮＡ／ｍｇ筋肉湿重量の投与量に相当する。
収縮力、筋重量、筋電図（ＥＭＧ）活性、および神経伝達速度（ＮＣＶ）の分析を、神経圧挫後１４日間隔で実施した。Dantec Neuromatic 2000 EMG/EPシステムを使用してＥＭＧ活性およびＮＣＶを測定した。
坐骨神経圧挫は、神経伝達およびＥＭＧ活性の損失を伴う顕著な筋萎縮を誘発する（図１０ＡおよびＢ）。圧挫後２週間のｈＩＧＦ−Ｉプラスミド処理動物および対照動物の間には、これらのパラメーターに有意な差異は見られなかった。しかしながら、ｈＩＧＦ−Ｉプラスミド処理により、圧挫後３週間で腓腹筋量がわずかに向上し、圧挫後初めの３週間でＥＭＧ活性およびＮＣＶは著しく向上した。これらのデータはｈＩＧＦ−Ｉプラスミドの有益な効果は、再生過程の比較的初期に（すなわち３週間より前に）明白になることを示唆する。
これらの結果は、ＩＧＦ−Ｉ含有ベクター製剤からの発現が坐骨神経圧挫からの回復を向上することを示す。
Ｄ．老齢による筋萎縮の治療
成長ホルモンの濃度は加齢に伴って低下する。５５歳より上の健康な男女の濃度は、１８〜３３歳の男女の濃度より約３分の１低い。これはＩＧＦ−Ｉの濃度の低下と関連する。成長ホルモンおよびＩＧＦ−Ｉ生成の低下は、老人性筋萎縮と呼ばれる筋肉量の低下、そして健康なヒトに起こる肥満の増加と関係がある。より若い男性より血清濃度が低い６１〜８１歳の健康な男性に１週間に３回成長ホルモンを投与すると、血清ＩＧＦ−Ｉ濃度が、若い健康な成人に見られる範囲内にまで増加した。この濃度増加により、筋肉量および筋力が増加し、体脂肪が減少した。成長ホルモンの分泌は刺激（成長ホルモン放出ホルモン）および抑制（ソマトスタチン）視床下部ホルモンによって調節される。
本発明の発現ベクターにおける好適なクローニング部位を使用して、ヒト成長ホルモンＣＤＮＡ配列、ヒト成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、またはＩＧＦ−Ｉを含有するベクターを構築する。ＧＨＲＨ、ＧＨ、およびＩＧＦ−Ｉは筋肉量に対する同等の好適な効果を有する一方、異なる副作用、またはその作用に影響する速度論を有し得るため、この多様性は重要である。成長因子放出ホルモンの発現は、ＩＧＦ−Ｉまたは成長ホルモンベクターの転写産物の発現より有利でありうる。年配者はＧＨＲＨが低下しているので、下垂体前葉の成長ホルモン合成能よりむしろＧＨ分泌の欠乏の原因と考えられ、従って筋肉からのＧＨＲＨの発現の増加により全身の血液系におけるＧＨＲＨが増加し、下垂体前葉からのＧＨの本来の日内分泌パターンが可能となる。このようにＧＨＲＨは自然の分泌促進因子として作用し、年配者の視床下部からのＧＨの分泌または放出を増加させうる。
従って、ここに記載するベクターシステムを適用し、ｐＩＧ０５５２もしくは関連するベクター、ＳＫ ７３３ ＩＧＦ−Ｉ Ｓｋ２ ベクター、ＨＧを発現するベクター、またはＧＨＲＨを年配者の成熟筋肉（adult muscle）に注射してインシュリン様成長因子を発現させることは、年配者においてＩＧＦ−Ｉの全身血中濃度を増加させるための長期的かつ安価な方法である。
ベクターの投与は静脈内注射、筋肉への直接注射、または上記の方法のいずれかで行うことができる。投与（dosages）は疾病の重症度に依存し、投与量（theamount of dosage）は標準的な方法によって容易に決定することができる。治療期間は病気の症状のあるうちは継続し、連続的であってもよい。
Ｅ．神経性機能不全によって誘発されたヒト筋萎縮症の治療
インシュリン様成長因子は神経栄養性因子として知られ、神経変性条件下で筋肉のニューロンシナプス、ニューロンの恒常性、および神経細胞周期を維持し、神経再生に明らかに影響を及ぼす。発現ベクターから誘導される遺伝子は筋肉の神経支配状態に対して比較的非感受性なので、ヒトのある種の脊髄損傷による筋萎縮、および、薬剤、糖尿病、Ｉ型疾患（Type I disease）、II型糖尿病、シャルコー・マリー・ツース病（CHACOT-marie-tooth disease）のような遺伝病、または他のある種の疾病による神経筋疾患の治療に、直接的でかなり広域に適用される。更に、ＩＧＦ−Ｉ分泌は神経突起の生成を誘導する。この治療では、ベクターの産物が、注射した筋肉から分泌される神経栄養性因子および肥大性因子として作用し、筋肉の恒常性を維持する。
ベクターの投与は静脈内注射、直接注射、または上記の方法のいずれかで行うことができる。投与は疾病の重症度に依存し、投与量は標準的な方法によって容易に決定することができる。治療期間は病気の症状のあるうちは継続し、連続的であってもよい。
Ｆ．糖尿病の治療
インシュリンは炭水化物、脂質、およびタンパク質の代謝の調整において、中心的役割を果たす。糖尿病に対しては、インシュリンでの治療によりインシュリン耐性となる可能性があり、その場合インシュリン治療では十分な代謝制御が得られない。この耐性は、血中インシュリンもしくはインシュリン受容体抗体またはインシュリン受容体異常の存在下で、あるいは、時折は典型的なインシュリン依存性糖尿病の既往歴がある患者で見出される。治療の選択は、重度のインシュリン耐性患者に限定される。
ＩＧＦ−Ｉをインシュリン耐性の治療に使用することができる。本発明のベクターを使用するＩＧＦ−Ｉでの治療により、高血糖およびケトアシドーシスを逆転させて糖血を制御する。またＩＧＦ−Ｉによる治療でインシュリン感受性が向上する。本発明の発現ベクターにおける好適なクローニング部位を使用して、ＩＧＦ−Ｉ ｃＤＮＡ配列を含有するベクターを構築する。ＩＧＦ−Ｉの発現によりインシュリン様代謝効果が得られる。ＩＧＦ−Ｉはインシュリンと配列相同性および生物学的特性を共有する。
ベクターの投与は静脈内注射、直接注射、または上記の方法のいずれかで行うことができる。投与は疾病の重症度に依存し、投与量は標準的な方法によって容易に決定することができる。治療期間は病気の症状のあるうちは継続し、連続的であってもよい。
Ｇ．末梢神経疾患の治療
末梢神経疾患は知覚神経および運動神経の変性過程であり、しばしば糖尿病、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、シャルコー・マリー・ツース病のような遺伝病、ＡＩＤＳ、炎症、および抗ガン剤や抗ウィルス剤による副作用に起因する。現在の治療は疼痛処理に限定されており、細胞要因に向けられる治療はない。組み換えＩＧＦ−Ｉを使用して末梢神経疾患の変性過程を回復させ、関連する機能障害を緩和することが提案されてきた。
ＩＧＦ−Ｉをコードするベクターを、直接注射または皮下スプレーによって末梢神経疾患に罹患した局所筋肉に投与することにより、神経の再生が促進され、痛覚が低下し、罹患した部位の運動性が向上する。ＩＧＦ−Ｉのベクター投与の明らかな利点は、必要な部位の濃度が増加され、投与回数が減らされることである。糖尿病患者では、投与計画により末梢神経疾患の症状緩和の併用効果が得られ、インシュリンの効果が向上する。
ベクターの投与は静脈内注射、直接注射、または上記の方法のいずれかで行うことができる。投与は疾病の重症度に依存し、投与量は標準的な方法によって容易に決定することができる。治療期間は病気の症状のあるうちは継続し、連続的であってもよい。
Ｈ．骨粗鬆症の治療
骨粗鬆症は一般に骨量の低下を促進し、しばしば加齢と共に起こる。骨粗鬆症に伴う骨密度の低下により骨折の罹患性が上昇する。ＩＧＦ−Ｉでの治療は骨密度の上昇と関連する。ＩＧＦ−Ｉをコードするベクターを直接注射または皮下スプレーによって筋肉に投与することにより、骨の再沈着が促進され、骨折の危険が低下する。
ベクターの投与は静脈内注射、直接注射、または上記の方法のいずれかで行うことができる。投与は疾病の重症度に依存し、投与量は標準的な方法によって容易に決定することができる。治療期間は病気の症状のあるうちは継続し、連続的であってもよい。
トランスジェニック・ブタ
本発明の更なる態様は５世代の改良型家畜である。つまり、ｐＩＧ０５５２ベクター、またはブタ、ウシ、もしくはovine derivationのＩＧＦ−Ｉを発現するベクターを、トランスジェニックマウスについて上に記載した方法で家畜ブタの卵母細胞に導入し、筋原組織にＩＧＦ−Ｉを発現するブタを生む。このトランスジェニックブタは、筋肉量が増加し脂肪が低下した、好ましい家畜特性を有する。
更に、ゲノムに組み込まれた場合、３’ＮＣＲを隣接させることによってＩＧＦ−Ｉは外側のゲノム配列に対する緩衝を受け、位置効果からより保護される。更に、天然型終結配列を提供することにより、骨格α−アクチンの転写ドメインに特徴的な更なる調節配列が転写の通読を阻害し、組織特異性、発生のタイミング、および転写活性が向上する。３’ＮＣＲ配列の存在により、組み込まれたベクターが単独で複製され、内在性配列の転写活性が４０〜５０％となる。
家畜の改良
本発明の更なる態様は、ＩＧＦ−Ｉベクター構築物、または成長ホルモンもしくは成長ホルモン放出ホルモンのような他の成長ホルモンをコードする同様の構築物の注射による家畜の改良である。ＩＧＦ−Ｉをコードするベクターを皮下注射または皮下スプレー投与によって筋肉に注射することにより、牛、羊、豚、ウサギ、鹿、魚、そして七面鳥、鶏、アヒル、およびガチョウなどの鳥のような重要な家畜において、筋肉量の増加および脂肪の減少が促進される。また、ベクターの投与は上記の方法のいずれで行ってもよい。
当業者は、本発明が目的を達成し、それらに固有のものと同様、記載した目的および利点を獲得するのに十分適合することを容易に理解するであろう。ここに記載するベクターシステムは、方法、治療法、およびワクチン接種法と共に、現在の好ましい態様の代表例であり、例証であって本発明の範囲を制限することを意図するものではない。当業者はここにおける変更および他の使用法を考えつくだろうが、それらは本発明の意図に含まれるか、あるいは請求項と共にこの範囲によって定義される。
種々の代替および修飾を、本発明の範囲および意図から逸脱することなく、ここに開示する本発明に施しうることは、当業者に明白である。
本明細書に記載する特許および出版物は全て、本発明の属する分野に精通する者の水準を示す。全ての特許および出版物は、それぞれの出版物が明確かつ個別に参照により組み込まれるのと同程度まで、参照によりここに組み込まれる。

Claims (31)

1. 細胞における核酸配列の発現のためのベクターであって、
   IGF-Iをコードするヌクレオチド配列を含む核酸カセット；
   前記核酸カセットの発現に必要な1つまたはそれ以上の配列を含む5’フランキング領域、ここで前記配列は骨格α-アクチン遺伝子に由来するプロモーターを含み；
   前記5’フランキング領域を核酸に接続するリンカー、ここで前記リンカーは前記核酸カセットを挿入するための位置を有し、前記リンカーは、それが天然に関連している遺伝子のコード配列を欠失しており；および
   3’UTRまたは3’NCRまたはその両方を含む3’フランキング領域、ここで前記3’フランキング領域は前記核酸カセットの挿入のための前記位置の3’側にあり、前記3’フランキング領域は成長ホルモン3’-UTRに由来する配列を含む、
   を含むことを特徴とするベクター。
2. 前記IGF-IがヒトIGF-Iである、請求項1記載のベクター。
3. ヒトIGF-Iをコードする前記ヌクレオチド配列が合成配列である、請求項2記載のベクター。
4. ヒトIGF-Iをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号4の配列を有する、請求項3記載のベクター。
5. 骨格α-アクチン遺伝子に由来する前記プロモーターがニワトリ由来のものである、請求項1記載のベクター。
6. 骨格α-アクチン遺伝子に由来する前記プロモーターがヒト由来のものである、請求項1記載のベクター。
7. 前記成長ホルモン3’-UTRが、ヒト成長ホルモン遺伝子由来のものである、請求項1記載のベクター。
8. 前記3’UTRからALU反復またはALU反復様配列が欠失されている、請求項1記載のベクター。
9. 前記IGF-IがヒトIGF-Iであり、骨格α-アクチン遺伝子に由来する前記プロモーターがニワトリ由来のものであり、前記成長ホルモン3’-UTRがヒト成長ホルモン遺伝子由来のものである、請求項1記載のベクター。
10. 前記5’フランキング領域または前記3’フランキング領域またはその両方が、筋原性組織において支配的に前記核酸カセットの発現を制御する、請求項1または2に記載のベクター。
11. 前記5’フランキング領域が、プロモーター、TATAボックス、Cap部位、および第1イントロンおよびイントロン／エクソン境界を、前記核酸カセットの発現に適した関係で含む、請求項1記載のベクター。
12. 前記5’フランキング領域が、前記プロモーターと前記核酸カセットとの間に挿入された5’mRNAリーダー配列をさらに含む、請求項11記載のベクター。
13. 前記ベクターが、ニワトリ骨格α-アクチン遺伝子に由来するイントロン／5’UTRをさらに含む、請求項1記載のベクター。
14. 前記ベクターが抗生物質耐性遺伝子をさらに含む、請求項1記載のベクター。
15. 前記ベクターが、プラスミドpIG0552のヌクレオチド配列（配列番号3）と同じヌクレオチド配列を含む、請求項1記載のベクター。
16. 細胞においてヒトIGF-I遺伝子を送達および発現するための製剤であって、請求項1記載のベクターを0.5％-50％のPVPを有する溶液中に含むことを特徴とする製剤。
17. 前記溶液が約5％のPVPを含む、請求項16記載の製剤。
18. 請求項1記載のベクターを含む複数の細胞を有する非ヒトトランスジェニック動物。
19. 前記細胞が生殖細胞または体細胞である、請求項18記載の非ヒトトランスジェニック動物。
20. 請求項1記載のベクターで形質転換された細胞。
21. 前記細胞が筋原性である、請求項20記載の形質転換された細胞。
22. 非ヒト動物体内で細胞をトランスフェクトする方法であって、前記細胞を請求項1記載のベクターと、前記細胞をトランスフェクトするのに十分な時間接触させる工程を含む方法。
23. 前記細胞のトランスフェクションがin vivoで行われる、請求項22記載の方法。
24. 前記接触が、約5％のPVPの溶液の存在下で行われる、請求項23記載の方法。
25. 細胞をex vivoでトランスフェクトする方法であって、前記細胞のトランスフェクションが行われ、前記細胞を請求項1記載のベクターと、前記細胞をトランスフェクトするのに十分な時間接触させ、前記ベクターを選択マーカーとともにコトランスフェクトし、そして形質転換された細胞を選択する工程を含む方法。
26. 複数の細胞においてヒトIGF-I遺伝子を送達および発現させるためのin vitroでの方法であって、
    （a）前記複数の細胞を請求項1記載のベクターでトランスフェクトし；そして
    （b）前記ベクター中の核酸配列の発現を可能とする条件下で前記複数の細胞をインキュベートし、ここで前記核酸配列はIGF-Iをコードしている、
    の各工程を含む方法。
27. 前記IGF-IがhIGF-Iであり、前記細胞がヒト細胞である、請求項26記載の方法。
28. 前記接触が、約5％のPVPの溶液の存在下で行われる、請求項27記載の方法。
29. 筋肉萎縮症、骨粗鬆症、糖尿病、神経障害および成長疾患からなる群より選択される疾患または病状を治療するための、請求項1記載のベクターを含む医薬組成物。
30. 下位運動ニューロン障害または非活動の続発性の筋肉萎縮症を治療するための、請求項1記載のベクターを含む医薬組成物。
31. 疾患または病状が筋肉萎縮症である、請求項29に記載の医薬組成物。

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