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KR102000141B1 - 간상세포 유래 원추세포 생존능 인자를 인코딩하는 벡터 - Google Patents

간상세포 유래 원추세포 생존능 인자를 인코딩하는 벡터 Download PDF

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KR102000141B1
KR102000141B1 KR1020147011857A KR20147011857A KR102000141B1 KR 102000141 B1 KR102000141 B1 KR 102000141B1 KR 1020147011857 A KR1020147011857 A KR 1020147011857A KR 20147011857 A KR20147011857 A KR 20147011857A KR 102000141 B1 KR102000141 B1 KR 102000141B1
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Abstract

본 발명은 간상세포 유래 원추세포 생존능 인자(RdCVF)를 코딩하고 발현할 수 있는 핵산들 및 상기 핵산들을 포함하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 핵산들 및 벡터들을 포함하는 조성물들 및 약학적 제제들, RdCVF를 생산 또는 분비하는 방법들, 및 치료 방법에 관한 것이다.

Description

간상세포 유래 원추세포 생존능 인자를 인코딩하는 벡터{VECTORS ENCODING ROD-DERIVED CONE VIABILITY FACTOR}
본 발명은 미합중국 보건 복지부, 국립보건원에서 승인된 SBIR 등록 제EY016262호 하의 정부 지원으로 이루어졌다.
RdCVF는 망막에서 간상 광수용 세포(rod photoreceptor cell)들에 의해 특이적으로 발현되는 티오레독신 유사 단백질(thioredixin-like protein)이다(Leveillardet al . (2004) Nature Genetics 36:755-759 and the supplemental information). 2개의 상이한 RdCVF 유전자들은 사람에서 발견되고 이들을 RdCVF1 및 RdCVF2라고 명명한다. 2개의 RdCVF 유전자들은 선택적 접합(alternative spilcing)을 통해 2개의 산물들을 인코딩한다: 각각 RdCVF-장(long) 및 RdCVF-단(short)으로 알려진, 전체 길이 단백질 및 C-말단 후-전사 절단 단백질(C-terminal post-transcriptionally truncated protein).
RdCVF-단은 원추세포의 생존을 촉진하는 분비 영양 인자(secreted trophic factor)로 설명되고 RdCVF-장은 세포내 단백질들과 상호작용하는 산화환원(redox)-활성 효소로 설명된다(Leveillardet al . (2010) SciTransl Med.2(26):26ps16). 예를 들어 tau는 RdCVF-L에 대한 결합 파트너로 설명되고 tau는 전적으로 세포내에 있다(Fridlichet al . (2009) Molecular & Cellular Proteomics8(6):1206-18).
일부 망막 이영양증(retinal dystrophies)을 앓는 개인들은 망막 이영양증을 앓지 않는 개인과 비교하여 그들의 눈에서 더 낮은 RdCVF 농도를 갖는 것으로 밝혀졌다(PCT 국제공개공보 WO02/081513).
상이한 형태의 RdCVF 단백질들이 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 원추(cone) 광수용 세포 생존을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 단형(short form) 인간 RdCVF1(RdCVF1S) 단백질의 안구 내(intraocular) 주입은 원추 세포를 변성(degeneration)으로부터 구조(rescue)할 뿐만 아니라, 유전적 망막 변성의 동물 모델에서 그들의 기능을 보존하였다(Yang et al . (2009) Mol Therapy 17:787-795). 그러나 이러한 단백질의 생체 내 원추 세포 보호 효과의 설명은 다중 안구 내 주입을 사용하는 것을 요구하였다.
큰 규모로 그리고 유전 치료 벡터들로부터의 RdCVF의 유의적인 수준의 발현은 도전이 되고 있다. 예컨대 미국공개특허 제20110034546호의 단락[0004]을 참조한다.
본 명세서에서 참조문헌을 인용 또는 언급하는 것은 이들을 본 발명의 선행기술로서 인정하는 것으로 여겨지지 않을 것이다.
본 발명은, 부분적으로는, RdCVF를 인코딩하는 핵산들, RdCVF 발현 구조체들, RdCVF 벡터들, RdCVF를 발현하는 방법들, 광수용 세포(예컨대, 원추세포 및/또는 간상세포)의 사멸을 늦추거나, 예방하거나, 억제하는 방법들, 망막 이영양증과 같은 눈 질환들을 치료하는 방법, 및 신경병증 질환, 예를 들어 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨 병 또는 후각 질환(olfactory disease) 을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 RdCVF 단백질을 세포로부터 발현하는 조성물들, 방법들 및 치료 방법들을 제공한다.
본 발명의 일부 실시형태는 RdCVF 단백질에 대한 코딩 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산들을 제공하고,상기 RdCVF 코딩 서열은 재코딩된(recoded) 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 핵산을 포함하는 바이러스 벡터들을 포함하고, 상기 핵산은 RdCVF 단백질에 대한 코딩 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 RdCVF 코딩 서열은 재코딩된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태는 본 발명의 핵산을 포함하는 분리된 세포에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시형태는 본 발명의 세포에 의해 또는 본 발명의 핵산으로부터 생산된 RdCVF 단백질에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, RdCVF 단백질은 천연 발생(naturally occurring) RdCVF 아미노산 서열이 아니다.
(ⅰ) 약학적 허용되는 담체 및 (ⅱ) 본 발명의 핵산, 본 발명의 바이러스 벡터, 본 발명의 RdCVF 단백질 또는 이들의 조합을 포함하는 약학적 조성물이 본 발명에 또한 포함된다.
RdCVF 단백질을 발현하고 분비하기 위해 허용되는 조건들 하에서 본 발명의 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포 배양물에서 RdCVF 단백질을 분리하는 단계를 포함하는 RdCVF 단백질을 생산하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 일부 실시형태는 본 발명의 핵산, 본 발명의 바이러스 벡터, 본 발명의 RdCVF 단백질 또는 이들의 조합을 포유동물의 눈에 투여하는 단계를 포함하는, 안구 간상 세포들을 보존하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 망막 이영양증, 스타르카르트병(Stargardt's disease), 망막색소변성증(retinitis pigmentosa), 건성 노화 관련 황반변성(dry age-related macular degeneration, 건성 AMD), 지도상 위축증(geographic atrophy), 습성 노화 관련 황반변성(wet age-related macular degeneration, 습성 AMD), 안내압 항진이 있거나 없는 녹내장, 당뇨망막병증(diabetic retinopathy), 바르데-비들 증후군(Bardet-Biedel syndrome), 바센코르츠바이크 증후군(Bassen-Kornzweig symdrome), 베스트 질환(Best disease), 맥락막 결여(choroidema), 우곡상 위축증(gyrate atrophy), 선천성 흑암시(congenital amaurosis), 레프섬 증후군(refsun syndrome), 어셔 증후군(Usher syndrome), 갑상선 관련 눈 질환(thyroid related eye disease), 그레이브스 병(graves disease), 망막 색소 상피 세포 관련 질환, 전안부 세그먼트 질환(anterior segment disease), 수정체 질환/백내장(lens disease/cataracts), 안배 장애(eye cup disorder), 포도막염(uveitis), 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병 또는 후각 질환(olfactory disease)과 같은 질환들을 치료하는 방법들을 제공한다.
본 발명의 일부 실시형태들은 본 발명의 핵산 및/또는 바이러스 벡터를 포유동물의 눈에 투여하는 단계를 포함하는 안구 간상 세포들을 보존하는 방법에 관한 것으로서, 상기 핵산 및/또는 바이러스 벡터는 망막하 주입(subretinal injection)으로 투여되고, 망막하 주입 부위와는 상이한 부위에서 간상 세포들이 보존된다.
본 발명의 일부 실시형태들은 본 발명의 핵산 및/또는 바이러스 벡터를 포유동물의 눈에 투여하는 단계를 포함하는 안구 원추 세포들을 보존하는 방법에 관한 것으로서, 상기 핵산 및/또는 바이러스 벡터는 망막하 주입으로 투여되고 망막하 주입 부위와는 상이한 부위에서 원추 세포들이 보존된다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 또는 바이러스 벡터를 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포로부터 RdCVF 단백질을 분비하는 방법을 제공한다.
RdCVF 단백질은 RdCVF1 또는 RdCVF2 단백질 또는 길거나 짧은 형태일 수 있다.
본 명세서에서 기술된 임의의 방법 또는 조성물은 본 명세서에서 기술된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 실시될 수 있다. 청구항 및/또는 발명의 상세한 설명에서 용어 "포함하는(comprising)"과 함께 사용되는 경우, 단어 "a" 또는 "an"는 "하나(one)"을 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 그 이상"의 의미도 갖는다 용어/구 "및/또는"이 하나 이상의 열거된 대상들의 열거 수단들과 함께 사용되는 경우, 유용할 수 있지만, 예컨데 요소들 중 하나 또는 전부로 제한되지 않는다.
본 발명의 이 요약은 본 발명의 모든 특징들 또는 필수 특징들을 필수적으로 기술하지 않는다. 본 발명은 또한 기술된 특징들의 하위 조합물에 있을 수 있다.
본 발명을 설명하기 위한 목적으로, 본 발명의 도시된 특정 실시형태들이 설명된다. 그러나 본 발명은 도면에서 도시된 실시형태들의 정확한 배열 및 수단들로 제한되지 않는다.
도 1은 정제된 재조합 AAV-RdCVF1L 및 AAV-GFP 벡터 조각(particle)들의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. rAAV-GFP 제조물(레인(lane) 1) 및 2개의 rAA-RdCVF1L 제조물들(레인 2 및 레인 3)의 단백질들은 SDS-PAGE로 분리되었고 은 염색 분석(silver stain analysis)으로 가시화(visualize)되었다.
도 2는 rAAV-RdCVF1L 벡터 형질도입된 ARPE-19 세포들에서 RdCVF1L 발현의 웨스턴 블랏 분석을 나타낸다. rAAV 형질도입된 ARPE-19 세포들의 세포 용해물(도 2a) 및 상청액(도 2b)은 SDS-PAGE로 분리되었고, 웨스턴 블랏이 RdCVF1L 단백질에 대해 수행되었다. 레인 1은 형질도입되지 않은 ARPE-19 세포 용해물(도 2a) 및 대조군인 상청액(도 2b)이고, 레인 2 및 레인 3은 rAAV-GFP 및 rAAV-RdCVF1L 형질도입된 ARPE-19 세포의 세포 용해물들(도 2a) 및 상청액(도 2b)을 각각 나타낸다.
도 3은 벡터 주입 6주 후에 웨스턴 블랏에 의하여, 정상 Balb/C 마우스의 rAAV-RdCVF1L 대(versus) rAAV-GFP 주입 눈들 및 미처리 눈들에서 증가된 RdCVF 발현의 확인을 보여준다. rAAV-RdCVF1L-형질도입된 ARPE-19 세포들의 단백질 추출물이 양성 대조군(레인 14 및 레인 17)으로 사용되었지만, 형질도입되지 않은 세포 추출물은 음성 대조군(레인 15)으로 사용되었다. RdCVF 단백질은 rAAV-RdCVF1L 주입 눈에서 검출되었지만(레인 6, 8, 10 및 12), 동일한 동물에서 처리되지 않은 반대쪽 눈들(레인 7, 9, 11 및 13)뿐만 아니라 rAVV-GFP 주입 눈들(레인2-5)에서는 RdCVF-대응 밴드들이 없거나 희미하게 관찰되었다. 레인 1은 단백질 표준 마커이다. 레인 16은 야생형 정상 마우스 눈에서의 단백질 추출물이다.
도 4는 RPE-맥락막-공막 플랫마운트(RPE-choroid-scleral flatmount)의 RPE 세포들에서 RdCVF의 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 강한(robust) RdCVF 발현이 벡터 주입 후 6주에 정상 Balb/C 마우스의 rAAV-RdCVF1L 주입 눈에서 관찰되었지만(도 4a), 주입하지 않은 반대쪽 눈에서는 관찰되지 않았다(도 4b). 1차 항체 없이 처리된 샘플에서는 면역반응성(immunoreactivity)이 관찰되지 않았다(도 4c). 플랫마운트는 DAPI로 대비염색(counterstaine)되어 세포 핵을 푸른색으로 나타내었다.
도 5는 신경망막 플랫마운트의 RdCVF1L의 면역조직화학적 염색을 나타낸다. 강한 RdCVF1L의 발현이 벡터 주입 후 6주에 정상 Balb/C 마우스의 rAAV-RdCVF1L 주입 눈의 광수용 세포들에서 관찰되었다(도 5A). 염색의 대부분은 광수용 세포들의 외부 세그멘트들에 있었다. 반대로, 주입하지 않은 반대쪽 눈에서는 광수용 세포들에서 배경 염색만이 관찰되었다(도 5B). 1차 항체 없이 가공된 샘플에서는 면역반응성이 관찰되지 않았다(도 5C).
도 6은 rd10 마우스에서 AAV-RdCVF1L의 망막하 주입 후 5주 경과 후에 광수용 세포들와 RPE에서의 RdCVF1L 발현을 보여주는 연구 결과들을 나타낸다. RdCVF-발현 RPE 세포들은 rAAV-RdCVF1L 벡터 주입된 눈의 RPE-맥락막-공막 플랫마운트의 대략 절반이 나타났지만(A), 주입되지 않은 반대쪽 눈에서는 없었다(B). 광수용 세포들(C)은 또한 RdCVF-발현 세그먼트들이 동일 눈의 플랫-마운팅 망막에서 관찰될 때 형질도입되었다(transduce). 대조적으로, 주입되지 않은 반대쪽 눈에서는 RdCVF-발현을 찾을 수 없었다(D). (D)에서 암녹색 세포들은 아마도 망막에 부착된 자가형광 마크로파지들이다. 전형적인 6각형 형태학을 유지하는, 형질도입된 RPE 세포들(E), 및 RdCVF-발현 광수용체 세그먼트들(F)의 고배율도.
도 7은 rd10 마우스에서 AAV-RdCVF1L의 망막하 주입에 의한 광수용 구조(rescue)를 보여준다. 생후 3일에 오른쪽 눈에 rAVV-RdCVF1L을 주입받고(A 및 C) 왼쪽 눈은 처리되지 않은 대조군으로 제공되는(B 및 D), 2 마리의 마우스 유래 대표적인 망막 부분들의 광현미경 사진들. rd10 마우스는 5 주령에 치사시켰다. 처리된 눈(쌍촉 화살)과 미처리 눈(단일촉 화살) 사이의 외부 핵층(outer nuclear layer, ONL) 두께의 차이에 주목하라. AAV-RdCVF 처리 눈들에서는 2~4개의 줄(A 및 C)이 있는 반면에, 미처리된 눈들에서는 1개의 줄(row)이 있다(B 및 D). 광수용체의 내부 및 외부 세그먼트들은 보존된 망막의 일부 영역에 잔존하였다(E). IS, 내부 세그먼트들; OS, 외부 세그먼트들; ONL, 외부 핵층.
도 8은 한쪽 눈에 rAVV-RdCVF1L을 망막하 주입을 받고(패널 A, 도 8), 반대쪽 눈에 처리를 받지 않은(패널 B, 도 8), 대표적인 5 주령 rd10 마우스의 안배(eye cup)의 광학현미경 사진(light photomicrograph)이다. 나타난 것처럼, 더 많은 광수용 세포들이 처리된 눈에서 보존되었다.
도 9는 rAAV-RdCVF1L의 해석된 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 10A: rAAV-RdCVF1L 전달은 rd10 마우스에서 망막 기능을 개선한다. ERG들은 rAAV-RdCVF1L 주입 후 약 5주에 실시되었다. 우리가 시험한 8 마리의 마우스 모두에 대한 ERG 반응의 측정은, 처리된 눈의 평균 b-파(wave) 진폭들이 처리되지 않은 다른쪽 눈들의 진폭들보다 약 3배 더 크다는 것을 보여주고, 이는 통계학적으로 유의하다(p=0.025).
도 10B: rAAV-RdCVF1L 전달은 rd10 마우스에서 망막 기능을 개선한다. ERG들은 rAAV-RdCVF1L 주입 후 약 5주에 실시되었다. 오른쪽 패널: 처리된 눈(검은 선, n=8)과 처리되지 않은 다른쪽 눈들(붉은 선, n=8)에서 평균 8개의 파형들이 있고, 이들은 어두운 배경 하에서 단일 섬광(light flash)들이 25 cd.s/m2의 강도를 기록하였다. 분명히, 처리된 눈들은 다른쪽 눈들(fellow eyes)보다 훨씬 더 큰 반응을 나타냈다. 왼쪽 패널: 우리가 시험한 8 마리의 마우스 모두에 대한 ERG 반응의 측정은, 처리된 눈의 평균 b-파(wave) 진폭들이 처리되지 않은 다른쪽 눈들의 진폭들보다 약 3배 더 크다는 것을 보여주고, 이는 통계학적으로 유의하다(p=0.025).
도 11a 및 11b: rd10 마우스에서 rAAV-RdCVF1L의 망막하 주입에 의한 광수용체 보존. 생후 3일에 오른쪽 눈에 rAAV-RdCVF1L을 주입받고(A), 왼쪽 눈(B)은 처리되지 않은 대조군으로 제공된, 마우스의 대표적인 망막 부분들의 광현미경 사진들. 처리된 눈과 처리되지 않은 눈 사이의 ONL 두께의 차이에 주목하라. 처리된 눈(A)에는 약 4개의 줄이 있는 반면에, 처리되지 않은 눈에는 1개의 줄이 있다. 광수용체 외부 세그먼트들이 보호된 망막의 일부 영역들(onl, 외부 핵층)에 남아있다.
도 12: rd10 마우스에서 rAAV-RdCVF1L 처리된 눈 대비 처리되지 않은 눈에서의 외부 핵층(ONL)의 두께 비교. 처리된 눈들(붉은 막대)의 ONL의 평균 두께는 처리되지 않은 눈들(검은 막대)의 평균 두께보다 유의적으로 더 크다(p=0.006). 숫자들은 평균 +SD를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 전이 용어 "포함하는(comprising)"은 확장가능하다(open-ended). 이 용어를 사용하는 청구항은 이러한 청구항에서 언급된 것들에 추가 요소들을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 언급된 요소들 또는 그들의 등가물이 존재하는 한, 청구항들은 거기에서 특별히 언급되지 않은 추가 단계들을 또한 포함하는 방법들로 해석될 수 있다.
용어 "동일성(identity)" 또는 "동일한(identical)"은, 2개의 서열들, 예를 들어 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열들을 비교하는 문맥에서 사용될 때, 2개의 서열들 사이에서 배열시킨(align) 서열들의 퍼센트를 가리킨다. 동일성 퍼센트는 본 기술분야의 당업자들이 통상적으로 사용하는 알고리즘에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 동일성 퍼센트는 미국 국립 생물정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)와 그들의 웹사이트 상에서 입수할 수 있는 도구들 및 프로그램들을 이용하여 측정될 수 있다. 2개의 뉴클레오타이드 서열들의 동일성 퍼센트는, 예를 들어, NCBI/BLAST/blastn suite를 사용하여 측정될 수 있다. Blastn은 다음의 파라미터 설정을 이용할 수 있다: 예상 임계값:10; 단어 크기:28, 질의 범위에서의 최대 매치(max matches in a query range)=0; 매치/미스매치 점수=1, -2; 갭 값(gap costs)=existence:5 extension:2.
PCT 국제공개공보 WO2002/081513, WO2008/148860 및 WO2009/146183은 RdCVF와 관련된 다양한 조성물들 및 방법들을 개시한다. 일부 경우들에서, PCT 국제공개공보 WO2002/081513, WO2008/148860 및 WO2009/146183에 개시된 RdCVF 관련 조성물들 및 방법들을 사용할 수 있으며, 예를 들어 본 발명의 RdCVF 인코딩 핵산, 벡터 또는 단백질을 공보의 것들, 예컨대 야생형 RdCVF 코딩 서열을 포함하는 핵산들 및 벡터들로 대체하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태들은 RdCVF 프로단백질 아미노산 서열들, 예를 들어 서열번호 2 및 4를 제공한다. 본 발명은 또한 RdCVF 프로단백질들을 인코딩하는 핵산 서열들, 예를 들어 서열번호 1, 3 및 11을 제공한다.
본 발명은 또한 RDCVF1 또는 RDCVF2 단백질 또는 관련 단백질 또는 그들의 단편 또는 부분을 인코딩하는 핵산 및 벡터의 치료 유효량을 대상에게 투여함으로써, RdCVF1 또는 RdCVF2 유전자 발현의 변화(change)에 의해 매개되거나 상기 유전자 발현의 변화와 관련된 질병(예컨대, 눈에서 RDCVF1 또는 RDCVF2 폴리펩타이드의 존재가 감소)을 앓는 대상을 치료하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명의 RdCVF 단백질, 핵산, 벡터 또는 조성물을, 예를 들어 본 명세서에서 언급된 질환들을 치료하기 위한, 약품의 제조에 사용할 수 있다.
본 발명의 제품들, 조성물들, 공정들 및 방법들은, 그 중에서도(inter alia), 연구, 생물학적, 임상학적 또는 치료학적 목적을 위하여 사용될 수 있다.
RdCVF
RdCVF 단백질은 시험관 내 및 생체 내에서 원추(cone) 광수용 세포 생존을 촉진할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 예를 들어 인간 RdCVF1(RdCVF1S) 단백질의 단형태(short form)의 안구 내 주입은 원추 세포의 퇴화(degeneration)를 막을 뿐만 아니라 유전적인 망막 퇴화를 갖는 동물 모델들에서 그들의 기능을 보전하였다(Yang et al . (Mol Therapy (2009) 17:787-795 and the supplemental material). RdCVF는 망막에서 간상 광수용 세포들을 포함하는 다수의 세포 형태들에서 발현된다(Leveillardet al . (2004) Nature Genetics 36:755-759).
2개의 상이한 RdCVF 유전자들이 사람 및 다른 포유동물들에서 발견되는데 이들을 RdCVF1 및 RdCVF2라 한다. 2개의 RdCVF 유전자들은 선택적 접합(alternative splicing)을 통해 2개의 산물들을 인코딩한다: 각각 RdCVF-장(long) 및 RdCVF-단(short)로 알려진, 전체 길이(full length) 단백질 및 C-말단 절단 단백질.
일부 실시형태들에서, 본 발명은 재코딩된(recoded) RdCVF 코딩 서열을 포함한다. 재코딩된 RdCVF 코딩 서열은 본 명세서에서 기술된 임의의 것들을 포함하는 임의의 RdCVF 단백질에 대해 인코딩할 수 있다. 다양한 RdCVF 단백질들에 대한 서열들은 PCT 국제공개공보 WO2002081513 및 WO2010029130; 찰멜 등(Chalmel et al ., BMC Molecular Biology (2007) 8:74 pp1-12 and the supplemental information); 리베일라드 등(Leveillard et al ., Nature Genetics (2004) 36:755-759 and the supplemental information); 양 등(Yang et al ., Mol Therapy (2009) 17:787-795 and the supplemental material) 및 진뱅크 승인번호(GenBank Accession) 제 NP_612463, AAH14127, Q96CM4, EAW84608, CAD67528, Q5VZ03, NP_001155097, NP_660326, CAM24748, CAM14247, AAH22521 및 CAD67531에서 찾을 수 있다(명확하게 위하여, 본 명세서에 논의되는 다른 특허들 및 비특허 문헌들과 이들 진뱅크 서열들 모두는 본 발명에 전체가 참조로서 포함된다).
일부 실시형태들에서, RdCVF 단백질은 원추 세포 및/또는 간상 세포 생존 활성 또는 보존 효과를 보유한 RdCVF 단백질의 단편 또는 유사체이다. 이들 활성 또는 효과를 측정하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들어, 리베일라드 등(Leveillard et al ., Nature Genetics (2004) 36:755-759 and the supplemental information)은 관련된 마우스 모델들 및 RdCVF 활성을 검출하기 위한 시험관 내(in vitro) 방법들을 기술한다. RdCVF 단백질 또는 핵산에 의해(for by) 코딩된 RdCVF는 천연 발생 아미노산 서열 이외의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 천연 발생이 아닌 RdCVF 단백질은 천연 발생 RdCVF 단백질에서 발견되는 아미노산들(예컨대, 아미노 말단 또는 카복시 말단)에 더하여 아미노산들을 포함할 수 있고/있거나, 천연 발생 RdCVF 아미노산 서열과 비교하여 단일 또는 다중 아미노산 치환들(예컨대, 보존성 또는 비보존성 아미노산 치환들)을 포함할 수 있다. 일반적으로 보존성 아미노산 치환(substitution)은 모 서열(parent sequence)의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다(예컨대, 교체(replacement) 아미노산은 모 서열에서 발생하는 나선(helix)을 파괴하거나, 모 서열을 특징짓는 2차 구조의 기타 형태들을 파괴하는 경향이 없어야 한다). 기술분야에서 인식되고 있는(art-recognized) 폴리펩타이드 2차 및 3차 구조들은 문헌[Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984))]; 문헌[Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991))]; 및 문헌[Thornton et al. Nature 354:105 (1991)]에 기술되어 있다. 보존성 치환들은 제한되지 않지만, 다음의 그룹들에서 유래한 것들을 포함한다:산성 잔기(Acidic Residues) Asp (D) 및 Glu (E); 염기성 잔기(Basic Residues) Lys (K), Arg (R), 및 His (H); 친수성 비전하 잔기(Hydrophilic Uncharged Residues) Ser (S), Thr (T), Asn (N), 및 Gln (Q); 지방족 비전하 잔기(Aliphatic Uncharged Residues) Gly (G), Ala (A), Val (V), Leu (L), 및 Ile (I); 비극성 비전하 잔기(Non-polar Uncharged Residues) Cys (C), Met (M), 및 Pro (P); 방향족 잔기(Aromatic Residues) Phe (F), Tyr (Y), 및 Trp (W); 알콜기 함유 기(Alcohol group-containing residues) S 및 T; 지방족 잔기(Aliphatic residues) I, L, V 및 M; 시클로알케닐 관련 잔기(Cycloalkenyl-associated residues) F, H, W 및 Y; 소수성 잔기(Hydrophobic residues) A, C, F, G, H, I, L, M, R, T, V, W 및 Y; 음으로 하전된 잔기(Negatively charged residues) D 및 E; 극성 잔기(Polar residues) C, D, E, H, K, N, Q, R, S 및 T; 양으로 하전된 잔기(Positively charged residues) H, K 및 R; 소 잔기(Small residues) A, C, D, G, N, P, S, T 및 V; 극소 잔기(Very small residues) A, G 및 S; 회전 형성에 참여하는 잔기(Residues involved in turn formation) A, C, D, E, G, H, K, N, Q, R, S, P 및 T; 및 유연성 잔기(Flexible residues) Q, T, K, S, G, P, D, E 및 R. 본 발명의 일부 실시형태들에서 비 천연 발생 RdCVF 단백질은 아미노 말단에 추가 아미노산들, 예컨대 이형(heterologous) 신호 펩타이드 유래 추가 아미노산들을 갖는다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 RdCVF 단백질은 신호 펩타이드를 갖는 뉴클레오타이드 코딩 서열로부터 처음에 번역되고, 일부 경우에 신호 펩타이드의 아미노산들 전부 또는 일부는 발현 및/또는 분비된 본 발명의 RdCVF 단백질 상에 보유되어 있다.
재코딩된 RdCVF 코딩 서열들
"재코딩(recoded)" 또는 "재코딩된 뉴클레오타이드 서열"은 적어도 하나의 선천성(native) 코돈이 선천성 코돈과 동일한 아미노산을 인코딩하는 상이한 코돈으로 변화되는 것을 의미한다. 일부 실시형태들에서 재코딩된 RdCVF 코딩 영역은 재코딩된 코돈들을 적어도 2.5%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 약 20~50%, 35~45%, 38~42%, 39~41% 또는 코돈들이 재코딩된다. 일부 실시형태들에서, 재코딩된 코돈은 사람에서 보다 일반적으로 사용되는 코돈으로 치환된다. 일부 실시형태들에서, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50% 또는 적어도 55%의 코돈들이 인간에서 보다 일반적으로 사용되는 코돈으로 치환된다.
일부 실시형태들에서, 재코딩된 서열은 상응하는 천연 코딩 서열과 약 70~90%, 약 75~85%, 약 80~85%, 약 82~85% 사이의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태들에서, 재코딩된 뉴클레오타이드 서열은 상응하는 천연 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 적어도 15%의 뉴클레오타이드 차이를 갖는다. 일부 실시형태들에서, 재코딩된 뉴클레오타이드 서열은 상응하는 천연 뉴클레오타이드 서열과 90% 미만의 동일성을 갖는다.
재코딩은 DNA 및/또는 RNA 코딩 서열의 화학적 조성(make-up), 예를 들어 구아닌/시토신(GC) 퍼센트를 변화시키는데 사용될 수도 있다. 일부 실시형태들에서, RdCVF 코딩 영역의 재코딩은 GC 함량을 적어도 60%까지 증가시킨다. 일부 실시형태들에서, 재코딩된 RdCVF 코딩 영역은 60~64% 사이 또는 60.4~63.5% 사이의 GC 퍼센트를 갖는다.
재코딩은 mRNA의 2차 구조를 변화시키는데 사용될 수 있다. 재코딩은 또한 코딩 서열 또는 핵산 분자에 특정 모티프(motif)들 또는 부위(site)들, 예를 들어 원핵생물(procarya) 억제 모티프들, 컨센서스 스플라이스 도너 부위들(consensus splice donor site), 크립틱(cryptic) 스플라이스 도너 부위들 또는 이들의 조합을 제거하거나 부가하는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 재코딩된 RdCVF 코딩 서열은 원핵생물 억제 모티프들, 컨센서스 스플라이스 공여 부위들, 크립틱 스플라이스 공여 부위들 또는 이들의 조합을 천연 서열들보다 적게 함유한다. 일부 실시형태들에서, 재코딩된 RdCVF 코딩 서열은 원핵생물 억제 모티프들, 컨센서스 스플라이스 도너 부위들 및/또는 크립틱 스플라이스 도너 부위들을 함유하지 않는다.
후버 등(Hoover et al ., Nucleic Acids Res. (2002) 30:e43, pp1-7); 패스 등(Fath et al ., PLoS ONE (2011) 6:e17596 pp 1-14); 그라프 등(Graf et al .,J Virol (2000) 74:10822-10826; Raabet al . Syst Synth Biol (2010) 4:215-225; 및 미국 특허출원공개 제20070141557호는 재코딩 영역들을 기술한다.
본 발명의 일부 실시형태들에서, 재코딩된 RdCVF 코딩 서열은 개시(initial) RdCVF ATG 코돈 및/또는 RdCVF 정지 코돈(예, TAG)을 포함하지 않는다. 예를 들어, RdCVF 재코딩 서열은 또 다른 코딩 서열로 5' 또는 3'에서 작동적으로(operatively) 연결될 수 있고 이종(heterologous) 아미노산 서열, RdCVF 아미노산 서열에 대한 N-말단 및/또는 C-말단을 각각 포함하는 단백질을 산출한다. 이들 실시형태들 중 일부는, 개시 RdCVF ATG 코돈 및/또는 RdCVF 정지 코돈이 결실되거나 또는 RdCVF 코딩 영역에 존재할 수 있다. 예를 들어 서열번호 1 및 서열번호 3을 참조하라. 또 다른 코딩 서열이 RdCVF 코딩 영역의 3' 말단에서 프레임에 융합되고, 이어서 천연(native) RdCVF 정지 코돈은 RdCVF 코딩 서열의 말단에서 일반적으로 존재하지 않을 것이다.
일부 실시형태들에서, 재코딩된 RdCVF 코딩 영역은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 106 내지 741, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 106 내지 429, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 106 내지 432, 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 106 내지 744를 포함한다.
일부 실시형태들에서 재코딩된 RdCVF 코딩 서열은 서열번호 2의 아미노산 36-246을 코딩하는 재코딩 서열이다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 코딩 서열은 신호 서열을 함유하는 단백질을 코딩한다.
신호 펩타이드들 /분비 신호들
신호 서열들은 일반적으로 선택된 폴리펩타이드의 아미노 말단에 부착된 펩타이드로서 프레임에서 번역된다. 분비 신호 서열은 숙주 세포의 조직(machinery)과 상호작용하여 세포로부터 폴리펩타이들을 분비시킬 것이다. 분비 과정의 일부로서, 이 분비 신호 서열은 일반적으로 잘리거나(cleave off) 적어도 부분적으로 잘릴 것이다. 용어 "신호 서열"은 또한 신호 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 가리킨다. 일부 실시형태들에서, 신호 서열은 특정 RdCVF와 비교하여 비상동(heterologous)이다.
전형적인 신호 펩타이드의 구조는 3개의 개별 영역들을 포함할 수 있다:(ⅰ) 양으로 하전된 다수의 아미노산들(예컨대, 라이신 및 아르기닌)을 함유하는 N-말단 영역; (ⅱ) 중심 소수성 코어 영역(h-영역); (ⅲ) 신호 펩티다아제에 의해 인식되는 서열 모티프들을 함유하는 친수성 절단(cleavage) 영역(c-영역)(예컨대, von Heijne, G. (1983) Eur. J. Biochem., 133:17-21; von Heijne, G. (1985) J. Mol. Biol., 184:99-105; von Heijne, G. (1997) Protein Engineering (10):1-6, 참조). 본 발명에서 사용될 수 있는 신호 펩타이드를 갖는 단백질들의 예시는, 제한되지 않지만. 인간 성장 호르몬(HGH), 뼈형성단백질 7(bone morphogenetic protein 7, BMP7), 뼈형성단백질 2(BMP2), 모양체 신경영양인자(ciliary neurotrophic factor, CNTF), 뇌 유도 신경영양인자(brain derived neurotrophic factor, BDNF), 인슐린 성장인자 1(IGF-1), β-글루코로니다제(GUSB), 신경아교세포 유도 신경영양인자(glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 백혈병 억제인자(leukemia inhibitory factor, LIF), 면역글로불린 단백질들, 소 성장 호르몬(bovine growth hormone), 소 프로알부민(bovine proalbumin), 인간 프로인슐린, 인간 인터페론-감마, 인간 알파-피브리노겐, 인간 IgG 중쇄, 랫트 아밀라아제, 뮤린 알파-태아단백질(murine alpha-fetoprotein), 닭 라이소자임, 인간 태반 알칼리성 포르파타아제(human placental alkaline phosphatase) 및 제아 메이즈 레인 단백질(Zea mays rein protein) 22.1을 포함한다. 이들 신호 펩타이드는 본 발명과 일치하게 사용될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 본 발명과 일치하게 사용된 신호 펩타이드는 HGH, BDNF, IGF-1 및 GUSB로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시형태들에서, 신호 펩타이드는 IgK와 같은 면역글로불린 유래이다.
신호 서열은 포유동물, 뮤린 또는 인간 신호 서열이다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 핵산 또는 벡터는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1-105 또는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 4-105를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 신호 서열은 서열번호 2의 아미노산 2-34를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하거나 서열번호 15를 포함한다. 신호 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 야생형 서열이거나 재코딩된 서열일 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태들에서, 신호 펩타이드 서열은 RdCVF의 N-말단 또는 C-말단을 위하여 인코딩된다. 일부 실시형태들에서 신호 펩타이드는 예컨대 소포체(endoplasmic reticulum, ER)와 같은 분비 경로(secretory pathway)로 단백질의 수송이 되게 한다. 일부 실시형태들에서 신호 펩타이드는 세포질로부터 세포 외부의 목적지로의 단백질 수송을 용이하게 한다. 신호 펩타이드 서열들은 천연 발생 신호 펩타이드 서열들, 그들의 유도체들, 또는 합성 설계된 서열에서 선택될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 설계된 신호 펩타이드 서열들에 대한 비제한적인 파라미터들은 3~40개의 잔기들(residues)을 포함하고, 이들은 측면에 상대적으로 친수성인 여러개의 잔기들을 갖는 3- 내지 20-잔기 소수성 코어를 포함한다.
일부 실시형태들에서, 신호 펩타이드 서열은 소수성 코어가 없다. 본 발명에서 사용될 수 있는 전형적인 소수성 신호 서열이 없는(lack) 포유동물 분비 단백질의 비제한적인 실시예들은, 인간 IL-1α, IL1β, bFGF, aFGF, PDEGF, 혈액응고방지 단백질, 렉틴 L-14, ATL-유도 인자(ATL-derived factor), 인자 ⅩⅢa, 앤커링(Anchorin) CⅡ, 리포코르틴 Ⅰ, 파라타이모신(parathymosin), α-프로타이모신(prothymosin), 및 로덴트 트랜스글루타미나아제(rodent transglutaminase), 파라타이모신 및 MDGI를 포함하고, 이에 제한되지 않는다.
핵산들
본 발명은 RdCVF를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산들을 포함하고 이들 핵산들을 포함하는 벡터들을 포함한다.
관심있는 핵산의 국소 및/또는 장기간 발현을 보장하기 위하여, 본 발명의 일부 실시형태들은 세포에 RdCVF를 인코딩하는 핵산 또는 벡터의 형질도입(transduce)을 고려한다. 본 발명은 임의의 특정한 핵(nucleic) 전달 방법에 제한되어 구성되지 않고, 생체 내 또는 시험관 내 핵산 전달 전략 또는 조작된 세포들의 사용 중 어느 하나를 갖는 임의의 유용한 핵산 전달 비히클(예를 들어 the technology of Neurotech, Lincoln, RI, 예, 미국특허 제6,231,879호; 제6,262,034호; 제6,264,941호; 제6,303,136호; 제6,322,804호; 제6,436,427호; 제6,878,544호, 참조) 및 RdCVF 등을 인코딩하는 본 발명의 핵산들(예, "네이키드 DNA") 자체(per se)가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 벡터와 같은 다양한 전달 비히클들이 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터들, 양성영양성 지질들(amphitrophic lipid), 양이온성 고분자들, 예를 들어 폴리에틸렌이민(PEI) 및 폴리라이신, 덴드리머, 예를 들어 빗살모양 분자들(combburst molecules) 및 별모양 분자들(starburst molecules), 비이온성 지질들, 음이온성 지질들, 소낭들(vesicles), 리포좀들 및 기타 합성 핵산 전달 수단들(예컨대, 미국특허 제6,958,325호 및 제7,098,030호; Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in "Liposomes" in "The Therapy of Infectious Disease and Cancer"; 및 Lopez-Berestein&Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 317-327 및 353-365 (1989); "네이키드" 핵산들 등은 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 핵산 분자는 RdCVF 코딩 서열들 및 임의의 바람직한 서열들이 게놈의 원하는 위치에서 상동 재조합을 촉진하는 영역들 측면에 위치하는 곳에서 사용되고, 그 결과 RdCVF 핵산의 염색체 내 발현을 위해 제공된다(Kolleret al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935; Zijlstraet al . (1989) Nature 342:435-38). 환자에게 핵산을 전달하는 것은 직접적으로(이 경우에 환자는 핵산 또는 핵산-수송 벡터에 직접적으로 노출된다), 또는 간접적으로(이 경우에 세포들이 시험관 내에서 핵산을 이용하여 먼저 형질전환되고, 이어서 환자에게 이식된다) 이루어질 수 있다.
벡터는 관심있는 핵산(예컨대, 치료 단백질을 인코딩할 수 있는 치료 핵산)을 관심있는 목표 세포에 도입하기 위한 수단이다. 관심있는 벡터를 입수하거나 구성하는 방법들은, 제한되지 않지만, 본 기술분야에서 공지된 바, 표준 유전자 조작 기술들, 시퀀싱 반응들, 제한 효소 절단(restriction enzymes digest), 폴리머라아제 반응들, PCR, PCR SOEing, 라이게이션, 재조합효소 반응들(예컨대, 인비트로겐의 GATEWAY® 기술) 핵산에서 활성인 기타 효소, 박테리아 및 바이러스 증식 물질들 및 방법들, 화학물질들 및 시약들, 위치 지정 돌연변이생성 프로토콜(site directed mutagenesis protocol) 등을 포함한다. 예를 들어 Maniatiset al. text, "Molecular Cloning" 참조하라.
본 발명의 핵산들은 일반적으로 RdCVF 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함할 것이다. 프로모터는 예를 들어, 조직 특이적 프로모터, 세포 특이적 프로모터, 유도 프로모터(inducible promoter), 억제 프로모터(repressible promoter), 구성 프로모터(constitutive promoter), 합성 프로모터 또는 하이브리드 프로모터일 수 있다. 본 발명의 구성물(construct)에 유용한 프로모터들의 예시는, 제한되지 않지만, 파아지 람다(PL) 프로모터; SV40 초기 프로모터; 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 프로모터; 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예를 들어 인간 CMV 전초기 프로모터(immediate early promoter); CMV 인핸서와 닭 베터-액틴 프로모터를 갖는 하이브리드 프로모터; 테트라사이클린 제어 트랜스-활성화제-반응 프로모터(tet) 시스템; 긴 말단 반복(LTR) 프로모터, 예를 들어 MoMLV LTR, BIV LTR 또는 HIV LTR; 몰로니 뮤린 육종 바이러스(Moloney murine sarcoma virus)의 U3 영역 프로모터; 그랜자임 A 프로모터(Granzyme A promoter); 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(들); CD34 프로모터; CD8 프로모터; 티미딘 키나아제(thymidine kinase, TK) 프로모터; B19 파보바이러스 프로모터; PGK 프로모터; 글루코코르티코이드 프로모터; 열충격(heat shock) 단백질(HSP) 프로모터, 예를 들어 HSP65 및 HSP70 프로모터들; 면역글로불린 프로모터; MMTV 프로모터; 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus); lac 프로모터; CaMV35S 프로모터; 및 노팔린 합성효소 프로모터(nopalinesynthetase promoter)를 포함한다. 일부 실시형태들에서, 프로모터는 MND 프로모터(Robbins et al., 1997, J. Virol. 71:9466-9474), 또는 MND 프로모터의 유도체이고 MND 프로모터에서 LTR 인핸서들은 최소 CMV 프로모터와 조합되는, MNC 프로모터(Habermanet al., J. Virol. 74(18):8732-8739, 2000)이다. 일부 실시형태들에서, RdCVF 코딩 서열은 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 150-812를 포함하는 프로모터 서열과 작동적으로 연결(link)된다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 벡터 또는 핵산은 RdCVF 단백질을 위한 코딩 서열과 작동적으로 연결된, 인트론(intron)을 포함한다. 인트론은 RdCVF 유전자 유래일 수 있고 비상동(heterologous) 인트론일 수 있다. 이종 인트론들은 알려져 있고 제한되지 않는 실시예들은 인간 β-글로빈 유전자 인트론 및 베타-액틴 인트론을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 인트론 서열은 인간 β-글로빈 유전자 인트론 서열이다. 일부 실시형태들에서 인트론 서열은 서열번호 11의 뉴클레오타이드 820-1312: 서열번호 11의 뉴클레오타이드 908-1307을 포함한다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 핵산은 RdCVF 단백질에 대한 코딩 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 RdCVF 코딩 서열은 재코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 핵산은 RdCVF1 단백질 및/또는 RdCVF2 단백질을 인코딩할 수 있다. 일부 실시형태들에서, RdCVF 단백질은 짧은 형태(version) RdCVF 단백질이다. 일부 실시형태들에서, RdCVF 단백질은 장 형태(version) RdCVF 단백질이다. 명확하게 하기 위해, RdCVF 단백질은 RdCVF1-단(short), RdCVF1-장(long), RdCVF2-단 또는 RdCVF2-장 단백질 수 있다. 일부 실시형태들에서, RdCVF 단백질은 인간 RdCVF 단백질이다.
일반적으로 포유동물 뉴클레오타이드 코딩 영역은 뉴클레오타이드 서열 ATG(개시 메티오닌 코돈)로 시작하고, 예를 들어 인간 RdCVF 코딩 영역에서 발견된다. 본 명세서에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 일부 실시형태들은 재코딩된 RdCVF 코딩 영역을 제공하고 일부 추가 실시형태들에서 코딩 영역은 제2 코딩 영역, 예컨대 신호 서열을 위한 코딩 서열을 갖는 프레임에서, 융합된다. 이들 경우 중 일부에서, ATG 뉴클레오타이드 서열은 RdCVF 코딩 영역의 시작에 필수적이지 않고, 예컨대 RdCVF 코딩 영역은 특정 RdCVF 단백질의 제2 아미노산에 대한 코딩으로 시작한다. 그러나 RdCVF 코딩 영역이 RdCVF 코딩 영역으로 또 다른 코딩 영역 5'을 작동적으로 연결하는 경우에도, ATG 뉴클레오타이드 서열은 RdCVF 코딩 영역의 시작점일 수 있다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 핵산은 서열번호 1, 3, 또는 11을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 핵산은 서열번호 11의 뉴클레오타이드 150-812, 820-1312, 및 1340-2080을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 핵산은 서열번호 11의 뉴클레오타이드 150-812, 908-1307 및 1340-2080을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 추가로 서열번호 11의 뉴클레오타이드 2130-2608을 포함한다.
일부 실시형태들에서 본 발명의 핵산은 RdCVF에 대한 코딩 영역을 포함하고, 상기 RdCVF 코딩 서열은 재코딩된다.
본 발명의 일부 실시형태들에서, 본 발명의 핵산은 바이러스 벡터와 같은 벡터 내에 있다.
바이러스 벡터들
본 발명은 본 발명의 RdCVF 코딩 영역을 포함하는 바이러스 벡터들을 포함한다. 본 발명에서 유용한 바이러스 벡터들의 예시는 PCT 국제공개공보 WO08/106644 및 미국 특허출원 공개 제20100120665에 개시되어 있다. 일부 실시형태들에서, 본 발명은 특정 바이러스 벡터로 제한되지 않는다. 바이러스 벡터들은 제한되지 않지만, 레트로바이러스 벡터들, 렌티바이러스 벡터들, 아데노바이러스 벡터들(예를 들어, 미국특허 제7,045,344호, 참조), AAV 벡터들(예를 들어, 미국 특허 제7,105,345호, 참조), 헤르페스 바이러스 벡터들(예를 들어, 미국특허 제5,830,727호 및 제6,040,172호, 참조), 헤파티티스(예를 들어, 헤파티티스 D) 바이러스 벡터들(예를 들어, 미국특허 제5,225,347호, 참조). SV40 벡터들, EBV 벡터들(예를 들어, 미국특허 제6,521,449호 참조) 및 뉴캐슬병 바이러스 벡터들(예를 들어, 미국특허 제6,146,642호, 제7,442,379호, 제7,332,169호 및 제6,719,979호)을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 렌티바이러스 벡터는 HIV, EIAV, SIV, FIV 또는 BIV 벡터이다. 일부 실시형태들에서, 벡터는 AAV 벡터 또는 아데노바이러스 벡터에서 선택된다. 본 발명은 또한 본 발명의 바이러스 벡터를 생산하는 세포를 제공한다.
본 발명의 벡터 비리온(virion)들은 생체 내 또는 시험관 내에서 세포들(예를 들어 포유동물 세포들)에 투여될 수 있다. 벡터들(바이러스성 또는 비바이러스성)은 제한되지 않지만, 미분화 세포들, 분화 세포들, 체세포들, 원시 세포들 및/또는 즐기 세포들을 포함하는 세포들을 형질도입 또는 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 줄기 세포들은 인간에게 투여되도록 구성되고, 유아로 분화시키거나 발달시키기 위해 적절한 가임신(pseudopregnant) 여성에게 이식하도록 구성되지는 않는다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 분해 촉진 인자(decay accelerating factor, DAF)를 포함한다. 예를 들어, 외피성 바이러스 벡터(enveloped viral vector)는 바이러스 막 상에 DAF를 포함한다. 일부 실시형태들에서, DAF는 야생형 DAF이다. 일부 실시형태들에서, DAF는 외피(envelope) 단백질을 갖는 융합 단백질의 일부이다. 예를 들어, Guibingaet al .MolTher. 2005 11(4):645-51을 참조하라.
아데노바이러스는 일반적으로 약 36 kb의 게놈을 갖는 비외피성, 핵 DNA 바이러스이다. 인간 아데노바이러스는 다수의 혈청형(serotype)들로 나뉜다(대략 47, 번호가 부여되고 이어서 6개의 그룹(A, B, C, D, E 및 F)으로 분류됨).
재조합 아데노바이러스 벡터들은 분할 및 비분할 세포들 양자에 대한 친화성(tropism), 최소 병원성, 벡터 스톡(stock)들의 제조시 높은 역가(titer)로 복제되는 능력 및 상대적으로 큰 뉴클레오타이드 서열의 삽입(insert)을 수행하는 능력을 갖는다(Berkner, (1992) Curr. Top.Micro.Immunol. 158:39-66; Jolly, (1994) Cancer Gene Therapy 1:51-64). 다양한 아데노바이러스 유전자 서열들이 결실된 아데노바이러스 벡터들은 핵산들을 세포들로 전달하기에 적절한 비히클로 만들어진다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 협력자 의존(helper dependent) 또는 "유전자 없는(gutless)" 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스 벡터들은 다음의 유전자들을 하나 이상 결실시켜 사용될 수 있다: E1a, E1b,E2a, E2b 및 E3. 아데노바이러스계 핵산을 전달하는 방법은 예를 들어 미국특허 제5,824,544호; 제5,868,040호; 제5,871,722호; 제5,880,102호; 제5,882,877호; 제5,885,808호; 제5,932,210호; 제5,981,225호; 제5,994,106호; 제5,994,132호; 제5,994,134호; 및 제6,001,557호에 개시되어 있다.
AAV 벡터들은 단일 가닥(single-stranded, ss) DNA 파보바이러스들에서 유래된다. 단일 AAV 입자는 ssDNA 5 kb까지 수용하고, 이식 유전자(transgene) 및 조절 요소들을 위해 약 4.5 kb를 남겨놓는다. 예를 들어 미국특허 제6,544,785호에 기술된 바와 같이, 트랜스-스플라이싱 시스템들은 이러한 제한들을 거의 두 배로 만들고 이러한 형태의 벡터들은 또한 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명과 관련하여, 임의의 혈청형(serotype)의 AAV가 필수적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 일부 실시형태들에서, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9 혈청형이 사용될 수 있지만(예를 들어, 미국특허 제5,173,414호, 제5,252,479호, 제5,552,311호, 제5,658,776, 5,658,785, 5,763,416, 5,773,289, 5,843,742, 5,869,040, 5,942,496, 5,948,675호, 제6,001,650호 및 제7,790,449호; PCT 국제공개공보 WO2009134681; Kassimet al ., PLoS ONE (2010) 5(10)e13424:1-10; Kotin, Hum Mol Genet (2011) 20(R1):R2-6, 참조), 본 발명은 이들 혈청형에 제한되지 않는다(예를 들어, Gao et al. (2002) PNAS 99:11854-11859; and Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003, 참조)
본 발명의 AAV 벡터는 또한 위형(pseudotyped)일 수 있다. 위형 AAV 벡터들은 제2 AAV 혈청형의 캡시드(capsid)에 하나의 AAV 혈청형의 게놈을 포함한다(예를 들어, Auricchio et al., (2001) Hum. Mol. Genet., 10(26):3075-81, 참조). 본 발명의 AAV 벡터는 돌연변이된 캡시드를 포함하고/포함하거나 변경(retarget)될 수 있다. 예를 들어 Griegeret al . (AdvBiochemEngBiotechnol. (2005) 99:119-45); Goncalveset al . (MolTher.(2006) 13(5):976-86); 및 Warrington et al . (J Virol. (2004) 78(12):6595-609)을 참조하라.
본 발명의 일부 실시형태들에서, AAV 벡터는 폴리머들, 예를 들어 반응성 폴리머들로 코팅되어 AAV 벡터의 선천성 친화성(tropism) 또는 선천성 결합을 감소시고; AAV 벡터를 목표를 바꾸고(retarget)/바꾸거나 중화 항혈청(neutralizing antisera)에 대한 내성을 제공한다. 예를 들어, Carlisleet al ., J Gene Med. (2008) 10(4):400-11)을 참조하라.
레트로바이러스들은 RNA 바이러스들이고, 바이러스 게놈은 RNA이다. 숙주 세포가 레트로바이러스로 감염되면, 게놈 RNA는 DNA 중간체로 역전사되고, DNA 중간체는 감염된 세포들의 염색체 DNA로 효과적으로 통합된다. 렌티바이러스들은 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자들을 함유한다. 유전자 전달을 위한 레트로바이러스 벡터들의 사용은 예를 들어, 미국특허 제6,013,516호, 및 미국특허 제5,994,136호에 개시되어 있다. BIV 시스템들의 예시는 예를 들어 문헌[Matukoniset al., 2002 Hum. Gene Ther . 13, 1293-1303; Molina et al., 2002 Virology . 304, 10-23; Molina et al., 2004 Hum. Gene Ther., 15, 65-877]; 미국특허 제6,864,085호, 제7,125,712호, 제7,153,512호; PCT 국제공개공보 WO08/106644 및 미국특허출원공개 제20100120665호에 개시되어 있다.
DNA 바이러스 벡터는 DNA 기반 게놈을 갖는 바이러스 계통 또는 상기 바이러스에서 유래된 바이러스 벡터이다. 비외피성 바이러스 벡터는 지질-이중층 막이 없는 바이러스 계통이거나 상기 바이러스에서 유래된 바이러스 벡터이다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 소(bovine) 면역결핍 바이러스 벡터가 아니거나 렌티바이러스 벡터가 아니다. 일부 실시형태들에서, 바이러스 벡터는 DNA 바이러스 벡터, 비외피성 바이러스 벡터 및 아데노바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택된다.
캡슐화된 세포들을 포함하는, RdCVF 의 세포 전달
유전자 치료 또는 단백질 전달의 또 다른 접근은 유전자를 시험관 내 또는 생체 외에 있는 세포로 도입(transfer)하고 이어서 상기 세포들을 포유동물 또는 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 핵산을 세포들에 도입하는 것은 임의의 방법, 예를 들어, 형질주입(transfection), 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 세포융합(cell-fusion), 염색체 매개 유전자 도입, 마이크로셀 매개 유전자 도입, 스페로플라스트 융합(spheroplast fusion), 리포펙션(lipofection), 극미립자 충격(microparticle bombardment), 칼슘 인 매개 형질주입, 바이러스 벡터 또는 박테리오파지 형질도입(transduction) 등일 수 있다. 선택적으로, 선별 마커(selectable marker)가 또한 세포로 도입될 수 있다. 만일 선별 마커가 사용되면, 이어서, 세포들은 선별(selection)되는 상태에 놓여서, 예를 들어 발현을 강화하고/강화하거나, 도입된 코딩 영역을 발현하는 그 세포들을 분리/선별한다(예를 들어, Loeffler& Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); and Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92 (1985), 참조). 이후, 그 세포들은 환자에게 직접 또는 캡슐화 후 전달될 수 있다.
일부 실시형태들에서, 핵산은 결과물인 재조합 세포의 생체 내 투여 이전에 세포에 도입된다. 일부 실시형태들에서, 기술은 핵산을 세포로 안정적으로 도입하기 위하여 제공되고, 핵산이 세포에 의해 발현될 수 있고 일부 경우들에서는 유전될 수 있고 그 세포 자손(cell progeny)에 의해 발현될 수 있다. 재조합 세포들은 다양한 방법으로 환자에게 전달될 수 있다. 일부 실시형태들에서, RdCVF 단백질은, 조절가능하고, 유도가능하고 및/또는 억제가능한 프로모터를 통하여 세포로부터 발현된다.
일부 실시형태들에서, 사용된 세포는 환자와 관련하여 자가조직(autologous), 동종이계(allogeneic) 또는 이종(xenogenic)이다. 일부 실시형태들에서, 자가조직 세포들은 생체 외(ex vivo)에서 조작되어 세포들이 본 발명의 핵산에 함유되게 되고, 상기 핵산은 세포가 RdCVF 단백질을 생산 또는 분비하게 하고, 세포들은 환자에게 다시 도입된다.
일부 실시형태들에서, 세포들은 국소적으로(예를 들어, 관절, 유리체내(intravitreal), 망막내, 두개내(intracranially) 등), 또는 전신적으로(예를 들어, I..V.) 투여된다.
일부 실시형태들에서, 재조합 혈액 세포들(예를 들어, 조혈모세포 및/또는 간세포(progenitor cell))은 정맥내로 투여된다. 일부 실시형태들에서, 눈 세포들 및/또는 다능성 세포들은 눈에 직접 주입될 수 있다.
분리되어 시험관 내에서 유지될 수 있는 줄기세포 및/또는 간세포는 본 발명의 일부 실시형태들에 따라 잠재적으로 사용될 수 있다. 이러한 줄기 세포들은 제한되지 않지만, 조혈모세포들(HSC), 피부 및 내장(gut)의 내벽과 같은 상피 조직의 줄기세포들, 배아 심장 근육 세포들, 간 줄기세포들(예를 들어 WO 94/08598 참조), 및 신경 줄기세포들(예를 들어, Stemple and Anderson (1992) Cell 71:973-985)을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 투여된 세포는 본 발명의 핵산을 포함하는 줄기 세포이고 RdCVF를 발현 및 분비할 수 있다.
캡슐화된 세포들은 생체 내에서, RdCVF와 같은 단백질을 조절 및/또는 연속적으로 전달할 수 있게 한다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 핵산을 포함하고 RdCVF를 발현 및/또는 분비하는 세포들은 캡슐화된다. 일부 실시형태들에서, 세포들은 막을 통해 RdCVF의 확산을 가능하게 하는 반투막(semipermeable membrane) 내에 캡슐화된다. 캡슐화된 세포들 및 캡슐화된 세포 이식물들에 관한 추가 정보들은 문헌[Sieving et al , ProcNatlAcadSciUSA, (2006) 103(10):3896-901)]; 미국특허 제7,115,257호 및 제7,820,195호; 및 PCT 국제공개공보 WO2011044216에서 확인된다. 본 발명의 일부 실시형태들에서, RdCVF 단백질을 발현하는 캡슐화된 세포들은 동물에게 전달된다.
일부 실시형태들에서, 캡슐화된 세포들은 포유동물에게 이식되는데, 예를 들어 눈, 뇌 또는 후부(olfactory region)에 이식된다. 일부 실시형태들에서, 캡슐화된 세포들은 망막 색소 상피 세포들, 예를 들어 ARPE-19(ATCC, Manassas, VA로부터 입수가능함)이다. 일부 실시형태들에서, 캡슐화된 세포들은 RdCVF를 눈, 예를 들어 눈의 후면에 전달하는데 사용된다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 캡슐화된 세포 이식물은 반투성 중공 섬유 막의 부분에 캡슐화된 세포들로 구성되고, 상기 세포들은 RdCVF를 생산하도록 유전적으로 변형(modify)되어 있다. 일부 실시형태들에서, 캡슐화된 세포 이식물은 하나의 단부에 봉합 루프(suture loop)를 갖고 있어, 눈 내부의 유리-망막체(vitreo-retinal body)에 캡슐화된 세포 이식물을 고정한다. 일부 실시형태들에서, 캡슐화된 세포 이식물은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mm의 길이를 갖는다.
RdCVF 단백질 분비 및 생산
본 발명의 핵산들 및 바이러스 벡터들은 세포로부터 RdCVF를 발현, 생산 및/또는 분비하는데 사용될 수 있다. 이러한 발현, 생산 및/또는 분비는 시험관 내(in vitro), 생체 내(in vivo) 또는 생체 외(ex vivo)에서 발생할 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태들은, 본 발명의 핵산 및/또는 바이러스 벡터를 세포에 투여하는 단계를 포함하는, RdCVF 단백질을 세포로부터 분비하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 세포는 포유동물 세포, 인간 세포, 안구(ocular) 세포, 망막 색소 상피(RPE) 세포, 간상 세포 또는 원추 세포일 수 있다.
본 발명의 일부 실시형태들은 척추동물 또는 포유동물 세포들을 이용한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예시들로는, SV40에 의해 형질전환(transform)된 원숭이 신장 CVI 세포주(예, COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 주(human embryonic kidney line)(예, 현탁 배양액에서 성장을 위해 서브클론된 세포주 중 어느 하나를 포함하는 293 또는 293 T 세포들, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977), 예를 들어 293 Freestyle(Invitrogen, Carsbad, CA)) 또는 293FT; 아기 햄스터 신장 세포들(예, BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포들(CHO 세포들); 중국 햄스터 난소 세포들/-DHFR(예, CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리(sertoli) 세포들(예,TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포들 (예, CVI ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포들(예, VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암 세포들(예, HELA, ATCC CCL 2); 개(canin) 신장 세포들(예, MOCK, ATCC CCL 34); CF2TH 세포들; 버팔로 랫트 간 세포들(예, BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포들(예, W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포들(예, Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 세포들(예, MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포들(Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1983)); MRC 5 세포들; ARPE-19 세포들(ATCC) 및 FS4 세포들이 있다.
일부 실시형태들에서, 세포는 293 세포, CHO 세포, PerC6 세포, Vero 세포, BHK 세포, HeLa 세포, COS 세포, MDCK 세포, 3T3 세포 또는 WI38로 이루어진 그룹에서 선택된다.
본 발명의 일부 실시형태들은 본 발명의 핵산을 포함하는 분리된 세포를 제공한다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 세포성 게놈/DNA에 통합된다.
본 발명은 또한 RdCVF 단백질의 발현 및 분비를 허용하는 조건하에서 세포를 배양하는 단계, 및 세포 배양물로부터 RdCVF 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, RdCVF 단백질 생산 방법을 포함하고, 상기 세포는 RdCVF 단백질을 코딩하고 RdCVF 단백질 발현, 예컨대 RdCVF 단백질의 분비를 가능하게 하는 본 발명의 핵산을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 핵산은 RdCVF 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, RdCVF 코딩 서열은 재코딩된 서열을 포함한다. RdCVF 단백질은 RdCVF 1 또는 RdCVF 2 단백질일 수 있고 장(long) 형태 또는 단(short) 형태일 수 있다. 일부 실시형태들에서, 이들 방법은 세포 및/또는 배양 상청액으로부터 RdCVF 단백질을 정제하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산으로부터 세포에 의해 발현되는 RdCVF 단백질을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 RdCVF 단백질의 분비된 형태와, 본 발명의 분비된 RdCVF 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 실시형태들에서, 세포에서 발현된 RdCVF 단백질은 총 단백질에 대하여 적어도 90%, 적어도 93%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9%의 순도로 정제된다.
조성물들, 제형들 및 제제들
본 발명의 일부 실시형태들은, 본 발명의 핵산, 본 발명의 벡터, 본 발명의 RdCVF 단백질, 또는 이들의 임의의 조합을 함유하는, 조성물들, 제형들 또는 제제들, 예를 들어, 약학적 조성물을 제공한다.
제형들(예, 주입용)은 일반적으로, 필수적은 아니지만, 예를 들어 행크 용액(Hank's solution), 링거 용액(Ringer's solution) 또는 인산염 완충 식염수를 포함하는, 활성 성분의 생체적합성 용액들이다. 일부 실시형태들에서, 제형 또는 약학적 조성물은 다음 성분을 하나 이상 포함한다: 시트레이트, NaCl, 염화칼륨(KCl), 염화칼슘 2수화물(CaCl2·2H2O), 염화마그네슘 6수화물(MgCl2·6H2O), 아세트산 나트륨 3수화물(CH3CO2Na·3H2O), 시트르산 나트륨 2수화물(C6H5O7Na3·2H2O), 수크로오스, 수산화나트륨 및/또는 염산(pH 조정을 위하여) 및 물. 상기 리스트는 특정 수화물, 예를 들어 2수화물, 3수화물, 6수화물 등으로 열거된 일부 분자들을 포함한다. 이들 화합물의 다양한 수화물들이 본 발명에서 사용될 수 있고, 본 발명은 이들 열거된 분자들의 특정 수화물 형태들로 한정되지 않는다. 일부 실시형태들에서, 제형 및 약학적 조성물은, 히스티딘, MgCl2, 트레할로스, 폴리솔베이트, 폴리솔베이트 20, NaCl, 수크로오스, 아르기닌 및 프롤린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 성분들을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 제형은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 히스티딘; α,α-트레할로스 무수물; MgCl2; 폴리솔베이트 20과 같은 폴리솔베이트; 및 NaCl. 일부 실시형태들에서, 제형 및 약학 조성물은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 인산염 완충 식염수(PBS) 및 플루로닉(pluronic) F-68. 일부 실시형태들에서, 플루로닉 F-68 농도는 0.0001%, 0.001%, 0.005%, 0.01% 또는 0.1%일 수 있다.
적절한 제형들과, 바람직한 투여 방식을 위한 제형화 방법들의 예시는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, latest edition, Mack Publishing Co., Easton, PA] 및 미국특허 제7,208,577호에서 찾을 수 있다.
일부 실시형태들에서, 생체 내 사용을 위한 조성물은 "담체(carrier)" 또는 "약학적으로 허용되는 담체"를 함유한다. 용어 "담체"는, 본 발명의 핵산, 벡터, 단백질과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제, 또는 비히클을 가리킨다. 용어 "담체"는 제한되지 않지만, 고체 또는 액체 물질 중 어느 하나를 포함하고, 상기 물질은 무기성 또는 유기성일 수 있고, 합성 또는 천연 기원일 수 있고, 조성물의 활성 성분(들)과 함께 혼합 또는 제형화되어 대상에게 투여하기 용이하게 한다. 약물을 제형화하는데 관습적으로 사용되는 임의의 다른 물질들이 적절하다. 약학적 담체들은 일반 용액들 및 현탁액들과 다를 수 있는데, 그들이 특별히 생체 내 용도로 제조되어 조성물을 투여받는 숙주에게 해로울 수 있는 성분들은 배제된다는 점에서 그러하다(예, 박테리아 독성의 제거).
적절한 액체 담체들의 예시들은 에탄올과 같은 산소화된(oxygenated) 유기화합물들을 함유하는 수용액 및 물을 포함한다. 버퍼들 및 약학적 제제들에 일반적으로 존재하는 기타 물질들, 예를 들어 향료 및 현탁화제들이 또한 존재할 수 있다. 일반적으로, 적절한 오일(들), 식염수, 수성 덱스트로오스(글루코오스), 및 관련 당 용액들 및 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜들이 일반적으로 비경구 용액들을 위한 적절한 담체들이다. 일부 실시형태들에서, 비경구 투여용 용액들은 활성 성분들의 수용성 염들, 적절한 안정화제들, 및 바람직하거나 필요하다면, 완충 성분들을 함유한다. 항산화제, 예를 들어 아황산수소나트륨(sodium bisulfite), 아황산나트륨(sodium sulfite) 및 아스코르브산이 단독으로 또는 조합되어, 안정화제로 사용될 수 있다. 시트르산 및 그 염 및 나트륨 EDTA도 사용될 수 있다. 또한, 비경구 용액들은 보존제들, 예를 들어 염화 벤즈알코늄, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올을 함유할 수 있다.
담체들은 탄수화물들, 예를 들어 트레할로스, 만니톨, 글루타티온, 자일리톨, 수크로오스, 락토오스 및 솔비톨을 포함할 수 있다. 제형에 사용되는 기타 성분들은, 예를 들어, DPPC(1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린)(1,2-Didecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine), DOPE (1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민)(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DSPC (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜리네즈)(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholinez 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 및 DOPC (1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포콜린)(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)을 포함할 수 있다. 천연 또는 합성 계면활성제들이 사용될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜이 사용될 수 있다(단백질의 유도체 합성에 사용되는 것과는 별개로). 덱스트란들, 예를 들어 사이클로덱스트란이 사용될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 사이클로덱스트린, 3급 아민 및/또는 베타-사이클로덱스트린이 사용될 수 있다. 담즙산염(bile salt) 및 기타 관련 강화제(enhancer)가 사용될 수 있다. 셀룰로오스 및 셀룰로오스 유도체들이 사용될 수 있다. 아미노산들이 사용될 수 있고, 예를 들어 완충액 제형에서 사용된다. 또한 리포좀들, 마이크로캡슐들 또는 마이크로스피어들, 포접 화합물들(inclusion complexes), 또는 기타 담체 유형들의 사용이 이루어진다.
조성물은 바람직하게는 습윤제 및/또는 에멀젼화제, 및/또는 pH 완충제들을 또한 함유할 수 있다. 필요한 경우, 조성물은 가용화제 및/또는 주입 부위의 통증을 완화하기 위한 국소 마취제 예를 들어, 리그노카인을 또한 포함할 수 있다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 약학적 제제 또는 조성물은 (ⅰ) 약학적으로 허용되는 담체 및 (ⅱ) 본 발명의 핵산, 본 발명의 바이러스 벡터, 및 본 발명의 RdCVF 단백질 또는 이들의 조합을 포함한다.
투여, 전달 및 치료
RdCVF 단백질을 인코딩하는 핵산 또는 벡터의 도입 및 투여가 논의될 때, 본 발명은 RdCVF 단백질 자체의 도입 및 투여도 고려하는 것으로 이해된다. RdCVF 단백질의 도입이 논의될 때, 본 발명은 RdCVF 단백질을 인코딩하는 핵산 또는 벡터의 도입도 고려하는 것으로 이해된다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 조성물은 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 유용한 투여 경로는 본 명세서에서 기술되고 본 기술분야에서 공지되어 있다. 도입 및 투여 방법들은 제한되지 않지만, 피내(intradermal), 근육내, 복강내(intraperitoneal), 정맥내, 피하(subcutaneous), 비강내, 기관내(intratracheal), 국소(topical), 흡입으로, 경피(transdermal), 직장, 비경구 경로들, 경막외(epidural), 두개내(intracranial), 뇌 속으로(into the brain), 뇌실내(intraventricular), 경막하(subdural), 관절내(intraarticular), 척추강내(intrathecal), 심장내(intracardiac), 관상동맥내(intracoronary), 유리체내(intravitreal), 망막하(subretinal), 눈의 전실내(intraanterior chamber of the eye), 각막 위 국소(locally on the cornea), 결막하(subconjunctival), 서브테논 주입(subtenon injection), 점안 적용(by applying eyedrops), 구강 경로(oral routes), 풍선 카테터(balloon catheter) 경유(via), 스텐트(stent) 경유또는 이들의 조합을 포함한다. 전신적인 투여는 제한되지 않지만, 정맥내 또는 동맥내 주입에 의해, 또는 점막 관통(transmucosal), 피하, 경피 및/또는 복강내 전달에 의해 것일 수 있다.
일부 실시형태들에서, 예를 들어 눈에 투여하는 것을 포함하는, 본 발명의 RdCVF 인코딩 벡터 또는 핵산을 투여하는 것은 1주, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 9개월, 1년, 18개월, 2년, 30개월, 3년, 5년, 10년에 약 1번 또는 필요한 만큼 투여된다. 일부 실시형태들에서, 예를 들어, 눈에 본 발명의 RdCVF 인코딩 벡터 또는 핵산을 투여하는 것은 약 1주 내지 4주 마다, 약 4주 내지 8주 마다, 약 1개월 내지 4개월 마다, 약 3개월 내지 6개월 마다, 약 4개월 내지 8개월 마다, 약 6개월 내지 약 12개월 마다, 약 9개월 내지 15개월마다, 약 12개월 내지 18개월 마다, 약 15개월 내지 21개월 마다, 약 18개월 내지 24개월 마다, 약 1 내지 2년 마다, 약 1.5 내지 3년 마다, 약 2 내지 4년 마다, 약 3 내지 5년 마다, 약 5 내지 7년 마다, 약 7 내지 10년 마다 또는 약 10 내지 20년 마다 투여된다. RdCVF 단백질을 코딩하는 벡터의 투여는 RdCVF 단백질 자체의 투여보다는 빈도가 낮을 것이다. 본 발명의 일부 실시형태들에서, 약학적 제제는 본 발명의 RdCVF 단백질을 인코딩하는 벡터를 포함하고, 약학적 제제는 환자에게 1번만 투여된다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 RdCVF 단백질은 인간의 눈에 유리체내 또는 망막하 주입으로 투여된다. 일부 실시형태들에서, 약 15 ㎍ 내지 약 5 mg; 약 15 ㎍ 내지 500 ㎍; 약 100 ㎍ 내지 900 ㎍; 약 300 ㎍ 내지 약 700 ㎍; 약 500 ㎍ 내지 약 1 mg; 약 1 mg 내지 약 5 mg; 약 1 mg; 약 500 ㎍의 RdCVF 단백질이 유리체내 또는 망막하 주입으로 인간의 눈에 투여된다.
일부 실시형태들에서, RdCVF 단백질은 RdCVF를 인코딩하는 AAV 벡터를 망막하 주입 또는 유리체내 주입하는 것에 의하여 투여된다. 일부 실시형태들에서, 약 5x108 내지 약 1x109; 약 5x108 내지 약 7.5x108; 약 7.5x108 내지 약 1x109; 약 6x108 내지 약 9x108; 약 7x108 내지 약 8x108; 약 5x108; 약 6x108; 약 7x108; 약 8x108; 약 9x108; 또는 약 1x109 의 벡터 게놈 복제(GC) 수의 AAV 벡터가 망막하 주입으로 투여된다. 일부 실시형태들에서, 약 5x108 내지 약 1x1010; 약 5x108 내지 약 5x109; 약 5x108 내지 약 2x109; 약 2x109 내지 약 5x109; 약 5x109 내지 약 1x1010; 약 5x108 내지 약 1x109; 약 1x109 내지 약 3x109; 약 3x109 내지 약 6x109; 약 6x109 내지 약 1x1010; 약 1x109 내지 약 1x1010; 약 1x1010 내지 약 1x1011; 또는 1x1011 내지 약 1x1012 GC의 AAV 벡터가 유리체내 주입으로 투여된다. AAV 벡터의 양은 때때로 형질도입 단위(transducing unit) 또는 GC 수(number)로 측정된다. GC 수는, 동일한 AAV 벡터 샘플을 형질도입 단위에 대해 측정한 것보다 일반적으로 25~300 배 더 크다.
일부 실시형태들에서, 항염증제가 본 발명의 RdCVF 단백질, 벡터 또는 핵산과 조합하여 전달될 수 있다. 항염증제는 본 발명의 분자 또는 벡터의 투여 이전, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 전달될 수 있다. 일부 실시형태들에서, 항염증제는 본 발명의 RdCVF 단백질, 벡터 또는 핵산과 동일한 용액 및/또는 동일한 주사기로 투여된다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 RdCVF 단백질, 벡터 또는 핵산과 항염증제는 눈에 병용투여된다.
많은 항염증 약물들이 본 기술분야에서 공지되어 있고, 제한되지 않지만, 덱사메타손, 덱사메타손 소듐 메타설포벤조에이트(dexamethasone sodium metasulfobenzoate), 덱사메타손 소듐 포스페이트, 플루오로메톨론(fluorometholone), 브롬페낙, 프라노프로펜, 사이클로스포린, 옵탈믹 에멀젼(예, RESTASISTM), 나프록센, 글루코코르티코이드, 케토로락, 이부프로펜, 톨메틴, 비스테로이드성 항염증 약물, 스테로이드성 항염증 약물, 디클로페낙, 플로비프로펜, 인도메타신(indomethacin), 및 서프로펜(suprofen)을 포함한다.
본 발명의 일부 실시형태들은 RdCVF 단백질 및 이를 인코딩하는 벡터 모두를 투여하는 것을 포함한다. RdCVF 단백질은 본 발명의 벡터의 투여 이전에, 투여와 동시에, 및/또는 투여 후에 전달될 수 있다. 일부 실시형태들에서, RdCVF 단백질은 본 발명의 벡터와 동일한 용액 및/또는 동일한 주사기로 투여된다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 벡터 및 RdCVF는 눈에 병용투여된다.
본 발명의 일부 실시형태들에서, 유전자 전달 시스템은 형질도입 및/또는 유전자 또는 RdCVF에 대한 코딩 영역이 목표 세포에 안정하게 통합(integration)되게 할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 목표 세포들은 포유동물 세포들 예를 들어, 영장류 세포들 또는 인간 세포들이다. 일부 실시형태들에서, 목표 세포들은 눈 세포들, 예를 들어 망막 색소 상피 세포들, 간상 광수용 세포들, 원추 광수용 세포들, 이극성(bipolar) 세포들, 수평 세포들(horizontal cell), 무축삭 세포들(amacrine cell), 신경절 세포들(ganglion cell), 망막 세포들 및 다능(pluripotential) 세포들이다. 목표 세포들은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에 있을 수 있다. 일부 실시형태들에서, 목표 세포들은 줄기 세포이다. 줄기 세포들은 제한되지 않지만, 다능 줄기세포들, 전분화능(totipotent) 줄기세포들, 조혈모세포들, 암 줄기세포들 및 배아 줄기세포들을 포함한다. 일부 실시형태들에서, 본 명세서에서 고려된 다능 세포들은 접합자(zygote) 또는 할구(blastomere)로부터 살아있는 완전체로 증식하는 것들은 아니다. 본 발명은 또한 치료, 예를 들어 눈의 세포들을 재생하기 위하여 환자의 눈에 이식하기 위한, 부분적으로 미분화된 세포의 이용을 고려한다.
본 발명의 또한 치료 방법을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 본 발명은, 포유동물의 눈에 본 발명의 핵산, 본 발명의 바이러스 벡터, 본 발명의 RdCVF 단백질, 본 발명의 약학적 조성물 또는 이들의 조합을 투여하는 단계를 포함하는, 안구의 간상 세포들을 보존하는 방법들을 제공한다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 바이러스 벡터 및/또는 핵산은 망막하 주입, 유리체내 주입, 눈의 전실내 주입, 결막하 주입, 서브테논 주입 또는 이들의 임의의 조합으로 투여된다. 일부 실시형태들에서, 인간이 치료된다. 일부 실시형태들에서, 치료될 포유동물은, 망막 이영양증, 스타르카르트병, 망막색소변성증, 건성 노화 관련 황반변성(건성 AMD), 지도상 위축증(건성 AMD의 진행단계), 습성 노화 관련 황반변성(습성 AMD), 녹내장/안내압 항진, 당뇨망막병증, 바르데-비들 증후군, 바센-코르츠바이크 증후군, 베스트 질환, 맥락막 결여, 우곡상 위축증, 선천성 흑암시, 레프섬 증후군, 어셔 증후군, 갑상선 관련 눈 질환, 그레이브스 병, 망막 색소 상피 세포 관련 질병, 전안부 세그먼트 질환, 수정체 질환/백내장, 세안컵 장애, 또는 포도막염으로 이루어진 군에서 선택된 눈 질환을 앓는다. 일부 실시형태들에서, 보존된 안구 간상 세포는 본 발명의 핵산 및/또는 바이러스 벡터를 함유하지 않는다. 예를 들어, 보존된 안구 세포는 보존된 안구 세포 자체의 형질도입을 통하여 보존되지 않는다.
본 발명의 일부 실시형태들은, 포유동물의 눈에 본 발명의 핵산 및/또는 바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 안구의 간상 세포를 보존하는 방법을 제공하고, 핵산 및/또는 바이러스 벡터는 망막하 주입으로 투여되고 간상 세포들 및/또는 원추 세포들은 망막하 주입 부위로부터 적어도 1 mm, 적어도 2 mm, 적어도 3 mm, 적어도 5 mm, 적어도 7 mm, 적어도 10 mm, 적어도 15 mm, 적어도 20 mm, 적어도 25 mm인 위치에서 보존된다. 예로서 이론에 구속받지 않고, 망막하 주입 부위에서 핵산 또는 바이러스 벡터로 형질도입된 세포들은 RdCVF-장 및/또는 RdCVF-단 단백질을 발현 및/또는 분비하고, RdCVF-장 및/또는 RdCVF-단 단백질은 형질도입 세포 또는 주입 부위와 떨어진 부위에서 안구 간상세포 및 원추세포 보존 효과를 제공할 수 있다.
눈에서의 발현에 더하여, RdCVF 단백질은 다른 조직들에서도 자연적으로 발현된다. 프로테오믹스 접근법을 사용하여 90개의 단백질들이 미세관 결합(microtubule-binding)단백질 tau를 포함하는 RdCVFL과 상호작용하는 것이 밝혀졌다(Fridlich et al .Mol Cell Proteomics (2009) 8(6):1206-1218). 프리드리히 등(Fridlich et al)은, 아마도 일부 경우에 산화성 스트레스를 통하여, 알츠하이머 병을 앓는 환자들의 뇌에서 과인산화(hyperphosphorylated)되기 때문에, TAU의 인산화 수준이 Nxnl1 -1- (RdCVF1-/-) 마우스의 망막에서 증가하는 것을 보여주었다. 프리드리히 등은 또한 RdCVFL이 TAU 인산화를 억제한다는 것을 보여주었다. 크로닌 등(Cronin et al ., Cell Death and Differentiation (2010) 17:1199-1210)은 알츠하이머 병을 앓는 환자들의 뇌에서 발견된 바, Nxnl1 -1- (RdCVF1-/-) 망막들이 응집된 TAU 단백질을 함유한다는 것을 밝혔다.
RdCVF2가 결핍된 마우스는 시력(vision) 및 후각(olfaction)이 손상되었다. 정상 마우스는 후각 상피에서 RdCVF2를 발현한다. 자일라드 등(Jaillard et al ., ARVO meeting (2009) program#/poster#491/D636)은 후각 신경들이 RdCVF2 존재하에서 배양될 때 더 높은 비율로 생존하는 것으로 밝혀졌다고 보고하였다. 자일라드 등은 또한, 후각 식별 학습 테스트(olfactory discrimination learning test)를 실시하여, RdCVF2 -/-를 대조군 마우스와 비교하였다. 12 개월령까지 RdCVF2 -/- 마우스는 자극에 대해 올바르게 반응하는데 실패했다.
RdCVF 단백질들은 신경보호 활성을 갖고 원추세포 또는 간상세포 생존을 위한 인자일 뿐만 아니라 일반 신경 생존 인자들이다.
상기한 내용에 근거하여, 본 발명의 RdCVF 인코딩 핵산, 바이러스 벡터 또는 RdCVF 단백질은 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병 및 후각 질환들을 치료 또는 개선하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 포유동물에게 본 발명의 핵산, 본 발명의 바이러스 벡터, 본 발명의 RdCVF 단백질, 본 발명의 약학적 조성물 및 이들의 조합을 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법들을 포함하고, 상기 질병은 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병 및 후각 질환으로 이루어진 군에서 선택된다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다.
실시예
본 발명은 다음의 실시예들을 참조하여 기술된다. 이 실시예들은 단지 예시의 목적으로 제공되는 것이고, 본 발명이 이러한 실시예들로 제한되는 것은 아니며, 본 명세서에서 제공되는 교시의 결과로 명백히 나타난 임의 및 모든 변형들을 포함하도록 해석되어야 한다.
본 발명의 특정 실시예들은 본 명세서에서 설명의 목적으로 기술되지만, 상세한 설명의 수많은 변형들이 청구항들에서 기술된 본 발명의 범위를 벗어나지 않게 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 이해될 것이다.
공보, 특허 또는 특허 출원이 각각 독립적으로 본 명세서에 참조로 통합되는 것이 명확하고 개별적으로 나타내는 것처럼, 본 발명의 상세한 설명에서 언급한 모든 문헌들, 특허들 및 특허 출원들은 동일한 범위로 그것의 전부가 발명의 상세한 설명에 참조로 본 명세서에 통합된다. 또한, 상기 언급한 문헌들, 특허들 및 특허 출원들과 함께 게시된 임의의 추가 정보도 참조로 포함된다. 예를 들어, 몇몇 학술 논문들(journal article)은 전형적으로 온라인으로 이용할 수 있는 추가 정보로 게시된다.
실시예 1 - RdCVF1-장 형태 및 RdCVF1-단 형태의 재코딩된 코딩 서열
재코딩된 인간 RdCVF1S 및 RdCVF1L 뉴클레오타이드 코딩 영역들을 설계하였다(예를 들어, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 106~741, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 106~44, 서열번호 12 또는 14). 진아트(GENEART)®(Regensburg, Germany)는 핵산 서열들을 합성했는데, 그 중에서 RdCVF1S 및 RdCVF1L에 대한 코돈 최적화 뉴클레오타이드 코딩 서열들(codon optimized nucleotide coding sequence)을 포함한다. 이 코딩 서열들은 또한 원핵생물 억제 모티프들(procarya inhibitory motif)과 같은 모티프들, 컨센서스 스플라이스 도너 부위들(consensus splice donor site) 및 크립틱 스플라이스 도너 부위들(cryptic splice donor site)을 최소화하기 위해 재코딩되었다.
인간 RdCVF1L 코딩 서열의 재코딩은 재코딩된 RdCVF1S 코딩 영역, 3' 앤드(end)에서 종결 코돈(stop codon)을 갖는 서열번호 12의 뉴클레오타이드 1-327을 제공한다.
천연 RdCVF1L 코딩 영역의 재코딩된 코딩 영역으로의 배열
RdCVF1L (1-639): 동일성 = 529/639 (82.8%) 89/213 상이한 코돈 (41.7%)
RdCVF1S (1-327): 동일성 = 274/327 (83.8%) 44/109 상이한 코돈 (40.4%)
RdCVF1S (1-327 & TGA) 동일성 = 277/330 (83.9%) 44/110 상이한 코돈 (40.0%)
ATGGCCTCCCTGTTCTCTGGCCGCATCCTGATCCGCAACAATAGCGACCAGGACGAGCTG 60
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ATGGCCAGCCTGTTCAGCGGCCGGATCCTGATCAGGAACAACAGCGACCAGGACGAGCTG 60
GATACGGAGGCTGAGGTCAGTCGCAGGCTGGAGAACCGGCTGGTGCTGCTGTTCTTTGGT 120
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GACACCGAGGCCGAAGTGAGCAGGAGGCTGGAGAACAGACTGGTGCTGCTGTTCTTTGGC 120
GCTGGGGCTTGTCCACAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTCAAGGACTTCTTCGTGCGG 180
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GCCGGAGCCTGCCCTCAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTGAAGGATTTCTTTGTGAGG 180
CTCACAGATGAGTTCTATGTACTGCGGGCGGCTCAGCTGGCCCTGGTGTACGTGTCCCAG 240
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CTGACCGACGAGTTCTACGTGCTGAGAGCCGCCCAGCTGGCCCTGGTGTATGTGAGCCAG 240
GACTCCACGGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTCAAGGACATGCCAAAGAAATGGCTTTTC 300
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GACAGCACCGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTGAAGGACATGCCCAAGAAGTGGCTGTTC 300
단(short)← →장(long)
CTGCCCTTTGAGGATGATCTGAGGAGG GACCTCGGGCGCCAGTTCTCAGTGGAGCGCCTG 360
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CTGCCCTTCGAGGACGACCTGAGAAGA GACCTGGGCAGGCAGTTCAGCGTGGAGAGACTG 360
CCGGCGGTCGTGGTGCTCAAGCCGGACGGGGACGTGCTCACTCGCGACGGCGCCGACGAG 420
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CCCGCCGTGGTGGTGCTGAAGCCTGATGGCGACGTGCTGACCAGAGATGGCGCCGACGAG 420
ATCCAGCGCCTGGGCACCGCCTGCTTCGCCAACTGGCAGGAGGCGGCCGAGGTGCTGGAC 480
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ATCCAGAGACTGGGCACCGCCTGCTTCGCCAACTGGCAGGAGGCCGCCGAGGTCCTGGAC 480
CGCAACTTCCAGCTGCCAGAGGACCTGGAGGACCAGGAGCCACGGAGCCTCACCGAGTGC 540
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AGAAACTTCCAGCTGCCCGAGGATCTGGAGGATCAGGAGCCCAGATCCCTGACCGAGTGC 540
CTGCGCCGCCACAAGTACCGCGTGGAAAAGGCGGCGCGAGGCGGGCGCGACCCCGGGGGA 600
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CTGAGGCGGCACAAGTACAGAGTGGAGAAGGCCGCCAGAGGCGGCAGAGACCCTGGCGGC 600
GGGGGTGGGGAGGAGGGCGGGGCCGGGGGGCTGTTCTGA 639 (서열번호 7)
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GGAGGAGGAGAGGAGGGCGGAGCCGGCGGACTGTTCTGA 639 (서열번호 12)
천연 RdCVF1L 코딩 서열을 서열번호 12로 재코딩하는 것은 2개의 원핵생물 억제 모티프들, 1개의 컨센서스 스플라이스 도너 부위 및 3개의 크립틱 스플라이스 도너 부위들을 제거하여, 재코딩된 서열(서열번호 12)에서 이 요소들을 하나도 남기지 않는다. 재코딩은 또한 평균 GC 함량을 65%에서 63%로 변하게 했다.
또한, 서열번호 12의 뉴클레오타이드들 1-327은 TGA와 같은 종결 코돈은 없지만, RdCVF1S에 대한 재코딩된 코딩 서열을 제공한다.
천연 RdCVF1S 코딩 영역의 재코딩된 코딩 영역으로의 배열
동일성 = 278/330 (84.2%) 43/110 상이한 코돈 (39.1%)
ATGGCCTCCCTGTTCTCTGGCCGCATCCTGATCCGCAACAATAGCGACCAGGACGAGCTG 60
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ATGGCCAGCCTGTTCAGCGGCCGGATCCTGATCAGGAACAACAGCGACCAGGACGAGCTG 60
GATACGGAGGCTGAGGTCAGTCGCAGGCTGGAGAACCGGCTGGTGCTGCTGTTCTTTGGT 120
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GACACCGAGGCCGAAGTGAGCAGGAGGCTGGAGAACAGACTGGTGCTGCTGTTCTTTGGC 120
GCTGGGGCTTGTCCACAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTCAAGGACTTCTTCGTGCGG 180
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GCCGGAGCCTGCCCTCAGTGCCAGGCCTTCGTGCCCATCCTGAAGGATTTCTTTGTGCGG 180
CTCACAGATGAGTTCTATGTACTGCGGGCGGCTCAGCTGGCCCTGGTGTACGTGTCCCAG 240
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CTGACCGACGAGTTCTACGTGCTGAGAGCCGCCCAGCTGGCCCTGGTGTATGTGAGCCAG 240
GACTCCACGGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTCAAGGACATGCCAAAGAAATGGCTTTTC 300
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GACAGCACCGAGGAGCAGCAGGACCTGTTCCTGAAGGACATGCCCAAGAAGTGGCTGTTC 300
CTGCCCTTTGAGGATGATCTGAGGAGGTGA 330 (SEQ ID NO:13)
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CTGCCCTTCGAGGACGACCTGCGGAGATGA 330 (SEQ ID NO:14)
천연 RdCVF1S 코딩 서열의 서열번호 14로의 1개의 원핵생물 억제 모티프, 1개의 컨센서스 스플라이스 도너 부위 및 2개의 크립틱 스플라이스 도너 부위들을 제거하여, 재코딩은 재코딩된 서열(서열번호 14)에서 이 요소들을 하나도 남기지 않았다. 재코딩은 또한 평균 GC 함량을 58%에서 61%로 변하게 했다.
실시예 2 - 아데노(adeno) 관련 바이러스 벡터에 의해 변형된 장(long) 형태 간상세포-유래 원추세포 생존능 인자의 시험관 내 발현
플라스미드 클로닝
RdCVF 단백질의 단(short) 형태 cDNA는 진아트®에 의해 합성된 핵산으로부터 PCR로 증폭되고, Igk 신호 펩타이드 DNA 서열이 5개의 프라임(prime)을 RdCVFS 코딩 서열로 향하도록 마우스 Igk 신호 펩타이드 서열을 통합하는 pSecTag2a 플라스미드(Invitrogen, Catalog No. V900-20)로 클로닝되었다. 최종 플라스미드(resulting plasmid)는 pAVTrRd034이라 한다. pAVTrRd034의 크기와 방향(orientation)은 제한 효소 절단(restriction enzyme digest)을 이용하여 확인되었다. Igk-RdCVFS 서열은 pAVTrRd034로부터 PCR로 증폭되고, 아데노 관련 바이러스 벡터 플라스미드 pAAV-MCS(셀 바이오랩스, 샌디에고, CA)에 삽입된다. 코돈에 최적화된 RdCVF의 장(long) 형태는 PCR로 증폭되고 플라스미드 pAVTLrRd055(서열번호 9)를 생성하는, 인-하우스 클로닝 플라스미드 pAVT001에 삽입되어 플라스미드 pAAV-SRd269(서열번호 8)를 생성하였다. 플라스미드들 pAVTLrRd055 및 pAAV-SRd269은 Bg1 Ⅱ와 Stu Ⅰ으로 이중 절단된다. pAAV-SRd269의 4.8 kb 밴드와 pAVTLrRd055의 540 bp 밴드가 결합되어 장(long) RdCVF에 대한 재코딩된 코딩 서열을 포함하는 pAAV-LRd268(서열번호 10)을 생성하였다. pAAV-LRd268의 크기와 방향은 제한 효소 절단을 이용하여 확인되었다.
RdCVF 단백질의 단(short) 및 장(long) 형태의 N-말단 서열들이 동일하기 때문에, pAVTrRd034의 단(short) RdCVF DNA 서열의 말단은 플라스미드 pAVTLrRd055로부터 코돈 최적화 장(long) RdCVF DNA 서열의 말단과 교환되며, 그로 인해 AAV-ITR들 사이에서 다음의 기능들을 포함하는, rAAV 플라스미드 pAAV-LRd268을 생성하였다:
CMV 프로모터 - β-글로빈 인트론 - Igk-RdCVF1L - 폴리 A
재조합 AAV - RdCVF1L 및 AAV - GFP 벡터들의 생산 및 정제
플라스미드들 pAAV-LRd268, pHELPER(Cell BioLabs, Catalog No. 340202), 및 pRC2(Cell BioLabs, Catalog No. 340201)은 DH10B 수용성(competent) 박테리아 세포들(Invitrogen, Catalog No. 18297-010)로 형질전환되었고, 제조사의 지시에 따라 퀴아젠 엔도프리 플라스미드 맥시 키트(QiagenEndoFree Plasmid Maxi Kit) 또는 엔도프리 플라스미드 메가 키트(EndoFree Plasmid Mega Kit)를 이용하여 증대되었다. 플라스미드 농도는 벡크만(Beckman) DU-600 분광 광도계를 사용하여 측정되었다. 각 플라스미드들의 동일성은 제한 절단 및 분석에 의해 확인되었다.
rAAV-RdCVF1L 벡터를 제조하기 위해, 293AAV 세포들(Cell BioLabs, Catalog No. AAV-100)은 cDMEM(10% FBS, 1% 글루타민, 1% 비필수 아미노산, 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 DMEM)에서 15 cm 접시(dish) 당 4백만개 세포들에 시딩(seed)되었다. 다음날, 배지를 25 mL의 새로운(fresh) cDMEM으로 대체하였다. 2시간 후에, 형질주입(transfection)을 수행하였다. 물(57.4 mL)은 1.3 mg pHELPER, 650 ㎍ pRC2, 650 ㎍ pAAV-LRd268, 및 8.1 mL 2 M CaCl2 와 혼합되었다(물/플라스미드/CaCl2 혼합물). 2xHBS(Lonza, Sku:RR07005)의 12.5 mL 부피는 각각 5개의 50 mL 코니칼 튜브들(conical tube)로 이동되었다. 볼텍싱(vortexing)하는 동안, 12.5 mL의 물/플라스미드/CaCl2 혼합물은 2xHBS를 포함하는 각각의 코니칼 튜브들에 천천히 첨가되었다. 5분간 배양 후, 2.5 mL의 현탁액(suspension)은 293AAV 세포들을 포함하는 각각의 세포 배양 접시에 첨가되었다.
다음날, 배지는 접시마다 25 mL의 새로운 cDMEM 배지로 대체된다. 2일 후, 세포들은 셀 리프터(cell lifter)를 이용하여 채취하고, 세포/배지 혼합물은 250 mL 코니칼 튜브들에 이동시켰다. 샘플들을 4℃에서 15분간 3,000 rpm으로 원심분리하였고, 상청액을 버리고 세포 펠렛들을 110 mL DMEM에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포 샘플들을 50 mL 코니칼 튜브들에 분취시켰고(30 mL) 동결/융해/동결 단계는 에탄올/드라이아이스 욕조(bath)와 37℃ 수조(water bath)를 이용하여 수행되었다. 튜브들은 재료의 다음 과정까지 -80℃에서 저장되었다. 동일한 과정은 플라스미드 pAAV-LRd268가 플라스미드 pAAV-GFP(Cell BioLabs Catalog No. AAV-400)로 치환된, rAAV-GFP를 제조하기 위해 사용되었다.
rAAV-RdCVF1L 벡터를 정제하기 위해, 동결/융해/동결 단계의 벡터를 포함하는 4개의 50 mL 코니칼 튜브들를 37℃ 수조에서 융해시켰다. 40 마이크로리터의 벤조네이즈(BENZONASE)®(시그마, Catalog No. E8263-25kU)를 37℃에서 각각의 튜브에 첨가하고 30분 동안 배양하였다. 튜브들을 10분 동안 3,000 rpm으로 원심분리시키고, 상청액을 500 mL 병으로 이동시켰다. 6 밀리리터의 10% 소듐 디옥시콜레이트 용액(82 mL 물에 8.2 g)을 첨가하였다. 샘플을 잠시 혼합하였고 37℃에서 30분 동안 배양시켰다. 상청액은 5 μm 필터들을 이용하여 여과시켰다. 그 후에, 0.8 μm 필터들을 이용한 또 다른 여과 단계를 수행하였다. 헤파린 아가로오스 컬럼(8 mL)(시그마, Catalog No. H6508-25mL)을 준비하고, 컬럼을 48 mL의 인산 완충 식염수(phosphate buffer saline; PBS)(인비트로겐, Catalog No. 10010-049)로 평형을 맞추었다. 여과된 세포 용해물(cell lysate)을 컬럼에 채웠고 그 컬럼을 40 mL 세척 버퍼(20 mL 5 M NaCl, 980 mL PBS)로 세척하였다. 벡터는 15 mL 용리 버퍼(80 mL 5 M NaCl, 920 mL PBS)로 용리시켰고, 새로운 50 mL 코니칼 튜브에 수집하였다.
벡터는 원심분리에 의해 농축되었다. 아미콘 울트라-15(Amicon Ultra-15) 원심분리 필터 유닛(Millipore, Catalog No. UFC910024)을 PBS로 1회 헹궜고, 용리된 샘플을 디바이스에 첨가하였다. 원심분리는 샘플이 1 내지 2 mL 부피로 농축될 때까지, 벡크만 알레그로 6KR 원신분리기(Beckman Allegro 6KR centrifuge)에서 2,200 rpm, 22℃에서 수행되었다. 15 mL 부피의 PBS가 첨가되었고 원심분리는 샘플 부피가 1 mL 이하가 될 때까지 반복되었다. 정제된 벡터를 수집하였고, 필터 벽들을 100 μL의 PBS로 헹구었다. 샘플을 혼합하였고 30 μL의 벡터 표본들(aliquot)은 사용할 때까지 -80℃의 600 μL 코니칼 튜브들에서 저장하였다.
이 과정은 rAAV-GFP 벡터를 정제하기 위해 반복되었다.
도 9와 서열번호 11은 rAAV-RdCVF1L 벡터의 핵산 서열을 나타낸다.
정제된 재조합 AAV 벡터들의 게놈 역가 분석( Genomic Titer Assay )
정제된 rAAV-RdCVF1L와 rAAV-RdCVF1L 벡터들의 게놈 역가를 측정하기 위해, 5 μL의 적정 벡터(appropriate vector)를 5 μL의 10X DNase 버퍼, 1 μL의 DNase Ⅰ 효소(Roche, Catalog No. 04716728001) 및 물과 총 부피 50 μL가 되도록 혼합하였다. 37℃에서 30분 동안 배양한 후에, 효소를 65℃에서 10분 동안 배양하여 불활성화시켰다. 프로테이나제 K(0.5 μL)(Roche, Catalog No, 03115887001)를 첨가하였다. 샘플을 잠시 혼합하였고 50℃에서 60분 동안 배양하였다. 프로테이나제 K는 20분 동안 95℃로 처리하여 불활성화되었다. 동시에(in parallel), 5 μL의 스파이크 표준(pAAV-GFP의 2x109 단일 가닥의 DNA)을 반응에 추가하는 경우, 스파이크 컨트롤(spike control)을 사용하였다. 바이오래드 PCR 유전자 증폭장치(BioRad PCR thermo-cycler)에서, 8-플랫 캡 스트립들(BioRad, Catalog No. TCS-0803)을 사용하여, 캡들(cap)이 없는 0.2 mL의 8-튜브 스트립들(Biorad, Catalog No. TBS-0201)에서 이 반응들을 수행하였다.
qPCR을 위한 마스터 믹스(master mix)는 825 μL의 물, 1.875 μL의 iQ SYBR 그린 슈퍼 믹스(BioRad, Catalog No. 170-8882)와 337.5 μL의 각 프라이머들(QPCR CMV 1 (서열번호 5) 및 QPCR CMV 2 (서열번호 6))을 포함하도록 설정되었다. 45 μL 부피의 혼합물은 96-웰(well) PCR 플레이트로 웰마다 첨가되고, 5 μL의 절단 벡터(digested vector), 스파이크 절단 벡터, 비절단 벡터(40 μL의 물과 함께 5 μL의 정제된 벡터와 5 μL의 DNase 버퍼), 비절단 스파이크 벡터(35 μL의 물과 함께 5 μL의 정제된 벡터, 5 μL의 DNase 버퍼, 및 5 μL의 스파이크 표준)를 첨가하여 혼합하였다. PCR 과정이 수행되었고 사이클 3의 샘플들은 용융 곡선 분석(melting curve analysis)에 사용되었다.
이 단일-가닥 DNA 게놈들의 농도는 상기에서 기술한 바와 같이 정량적 PCR에 의해 분석되었다. rAAV-RdCVF1L 벡터 입자들의 농도는 밀리리터당 2x1011 벡터 게놈 복제(copy)들인 것(GC/mL)으로 측정되었고, rAAV-GFP 벡터 입자들의 농도는 2x1011 GC/mL인 것으로 측정되었다.
정제된 재조합 AAV 벡터의 은 염색법( silver stain )
정제된 rAAV-RdCVF1L과 rAAV-GFP 벡터들의 순도(purity)를 검사하기 위해, 벡터 용해물들에 대해 은 염색 분석법을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 구체적으로, 20 μL의 용해 버퍼(8.4 mL 물, 500 μL의 1 M 트리스(pH 8.0), 1 mL의 글리세롤, 300 μL의 5 M NaCl, 50 μL의 NP-40, 40 μL의 EDTA, 100 μL의 PMSF, 1 정제(tablet) 프로테아제 억제제(Roche, Catalog No. 11836170001))를 20 μL의 정제된 재조합 AAV 벡터 각각에 첨가하였고 , 차가운 상태(in ice)로 20분 동안 유지하였다. 반응물을 4℃, 13,000 rpm에서 2분 동안 탁상형 원심분리기(tabletop centrifuge)로 원심분리하였다. 상청액을 새로운 튜브로 옮기고, 10 μL의 5x 환원 샘플 버퍼(Pierce, Catalog No. 39000)를 첨가하였고, 샘플들을 95℃에서 10분 동안 배양하였다.
제조사의 지시에 따라 전기영동을 수행하였다. 4 내지 15%의 SDS-PAGE 겔을 물로 헹구고 겔 챔버에 위치시켰다. 런닝 버퍼(10X 트리스/글라이신/SDS 런닝 버퍼(BioRad, Catalog No. 161-0732)를 물로 희석하여 만든 1X 트리스/글라이신/SDS)를 위쪽 및 아래쪽 버퍼 챔버에 첨가하였다. 웰들을 200 μL의 런닝 버퍼로 2회 헹구고 샘플들을 로딩시켰다. 대조군으로서, 1 μL 부피의 벤치마크(BENCHMARK)™ 단백질 사다리(protein ladder)(Invitrogen, Catalog No. 10747-012)를 외부 웰(outer well)에 첨가하였다. 게놈 역가 분석법에 의해 측정된 바와 같이, 벡터들은 동일한 농도로 로딩되었다. 겔은 염료(dye)가 겔의 바닥에 도달할 때까지 200V로 작동하였다. 겔은 고정되었고 제조사의 지시(Biorad Silver Stain Plus, Catalog No. 161-0449)에 따라 은으로 염색되었다.
오직 3개의 AAV 바이러스 단백질들, VP1 (90 kDa), VP2 (72 kDa), 및 VP3 (60 kDa)이 표시되었다(도 1). 다른 단백질 밴드들이 은 염색 분석법에 의해 표시되지 않으므로, 벡터 제제들이 고순도 벡터 입자들의 산물이라는 것이 확인되었다.
ARPE -19의 AAV 벡터 형질도입에 의해 매개된 RdCVF1L 의 시험관 내 발현
세포들
rAAV-RdCVF1L 벡터에 의해 매개된 RdCVF1L 발현과 분비(secretion)를 검사하기 위해, ARPE-19 인간 망막 색소 상피 세포들(ATCC, Manassas, VA)은 6-웰 플레이트의 웰마다 3 mL의 cDMEM에서 200,000개의 세포들에 시딩되었다. AAV 형질주입 후 이식 유전자 발현에 대해, 시간이 제한되는 단계(time limiting step)는 단일 가닥의 DNA 게놈을 2차-가닥으로 합성(second-strand synthesis)시키는 단계이고, 이것은 몇 주 동안 일어날 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Ferrari et al. (1996). J Virol. 70:3227-3234]을 참조한다. 그러나, 세포 배양에서 rAAV 벡터의 형질도입 후, 단백질들의 발현을 촉진시키기 위해, 형질도입 전에 방사선(radiation)을 사용할 수 있으며, 예를 들어 문헌[Alexander et al. (1994) J Virol. 68:8282-8287]을 참조한다.
24시간 후에, 세포들은 셰퍼드 & 어쏘시에이트(Shepherd & Associates)의 방사선 조사장치(모델: Mark I-68 Self-shielded irradiator)로 175 Gy의 137Cs를 조사하였다. 2시간 후에, 배지는 1.5 mL의 새로운 cDMEM으로 대체되었고, 3 μL의 정제된 재조합 AAV 벡터를 첨가하였다. 하나의 플레이트는 대조군으로서 형질도입시키지 않았고(AAV 없음), 하나의 플레이트는 rAAV-GFP 벡터로 형질도입시켰고, 하나의 플레이트는 rAAV-RdCVF1L 벡터로 형질도입시켰다.
형질도입 이틀 후, 형질도입되거나 형질도입되지 않은 세포들의 상청액들을 채취하여 0.45 μm 필터에 여과시켰다. 동일한 부피의 용해 버퍼(9.4 mL 물, 200 μL의 1 M 트리스(pH 8.0), 40 μL의 0.5 M EDTA, 300 μL의 5 M NaCl, 100 μL의 NP-40, 100 μL의 PMSF, 1 정제 프로테아제 억제제)를 첨가하였고, 사용할 때까지 -80℃에 저장하였다. 각 플레이트로부터의 세포들을 PBS로 세척하였고, 세포 리프터를 사용하여 긁어내고(scraped off), 모아져서 15 mL 코니칼 튜브들에 옮겨졌다. 세포들을 벡크만 알레그로 6KR 원신분리기에서 4분 동안 4℃에서 1,200 rpm으로 원심분리시키고, 상청액을 버렸다. 세포 펠렛들을 1 mL의 용해 버퍼(상기 참조)에서 재현탁시키고, 1.5 mL의 튜브들에 옮기고, 차가운 상태(in ice)에서 10분 동안 배양하였다. 세포 용해물들을 4℃, 13,000 rpm에서 2분 동안 탁상형 원심분리기로 원심분리하였다. 투명해진(cleared) 세포 용해물들을 1.5 mL 튜브들에 200 μL 부피로 분취시키고, 사용할 때까지 -80℃에 저장하였다.
RdCVFlL 발현에 대한 형질도입된 세포 상청액들과 세포 용해물들의 웨스턴 블랏 분석
표준 기술들을 사용하여 RdCVF1L 발현을 검출하기 위해 4 내지 20%의 SDS-PAGE 겔을 사용하는 웨스턴 블랏 분석을 사용하였다. 대조군으로서, 5 μL 부피의 매직마크(MAGICMARK)™ XP 표준(Invitrogen, Catalog No. LC5602)을 외부 웰들에 첨가하였다. 겔은 염료가 겔의 바닥에 도달할 때까지 200V로 작동하였다. 제조사 지시들의 변형된 형태에 따른, 벡터 레보라토리스(Vector Laboratories)에 의해 벡타스테인 ABC-Amp 웨스턴 블랏 분석 키트(Vectastain ABC-Amp Western blot analysis kit)로 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. SDS-PAGE는 20분 동안 이동 버퍼(transfer buffer)로 평형을 맞추었고, SDS-PAGE에 의해 분리된 단백질들은 트랜스 블랏 세미-드라이 트랜스퍼 셀(Trans Blot Semi-Dry Transfer Cell)을 사용하여 20 V에서 40분 동안 니트로셀룰로오스 세포막 위로 이동시켰다. 이동이 완료되면, 상청액에 대해서는 실온(RT)에서 적어도 2시간 동안, 세포 용해물에 대해서는 4℃에서 밤새 그리고 실온(RT)에서 1시간 동안, 락커 플랫폼(rocker platform)에서 부드럽게 교반된(with gentle agitation) 200 mL의 1X 카세인(casein) 용액에서 세포막(membrane)이 차단되었다. 각각 4℃에서 밤새 또는 실온(RT)에서 2시간 동안 부드럽게 교반된 1X 카세인 용액에서, 1:2000(상청액) 또는 1:10,000(세포 용해물)로 희석된 토끼 항-RdCVF 단백질 특이적 단일클론 항체(E. coli에서 생산된 정제된 His-Tag RdCVF1L 단백질(Protein One, Rockville, MD)을 사용하여 코반스(Covance)(Denver, PA)에 의해 생성된, 1차 항체) 50 mL로 세포막을 배양시켰다. 부드럽게 교반하며 실온(RT)에서 각각 5분 동안 4회 1X 카세인 용액 30 mL로 세포막을 세척하였다. 실온(RT)에서 1시간 동안 부드럽게 교반하며 1X 카세인 용액에서, 1:24,000으로 희석된 비오틴화된(biotinylated) 염소(goat) 항-토끼 IgG(2차 항체) 30 mL로 세포막을 배양시켰다. 부드럽게 교반하며 실온(RT)에서 각각 5분 동안 3회 1X 카세인 용액 30 mL로 세포막을 세척하였다. 100 μL의 시약 A와 100 μL의 시약 B를 포함하는 1X 카세인 50 mL에서 벡타스테인(Vectastain) ABC-AmP에서 45분 동안 막을 배양시켰다. 부드럽게 교반하며 실온(RT)에서 각각 5분 동안 3회 1X 카세인 용액 30 mL로 세포막을 세척하였다.
pH9.5, 트리스에서 막을 배양시켰다. 6 mL의 듀오록스 서브스트레이트(Duolox Substrate)(Vector Laboratories, Catalog No. SK 6605)를 사용하고, 10초 내지 5분 동안 필름 카세트(cassette)에서 세포막을 코닥 바이오맥스 MS X-선 필름(Kodak BioMax MS X-ray film)(Kodak Carestream Health, Catalog No. 8572786)에 노출시키고, 코닥 인화 용액(Kodak Developer solution)(Kodak GBX, Catalog No. 1900984)과 코닥 고정 용액(Kodak Fixer soltion)을 사용하여 필름을 인화하여 화학 발광 신호를 얻었다.
세포 용해물에서 발현된 RdCVF1L 단백질의 수준(도 2a)은 rAAV-RdCVF1L 벡터가 ARPE 세포들에 효율적으로 형질도입되는 것을 나타내었다. 보다 중요하게는, RdCVF1L 단백질이 세포에 형질도입되는 벡터의 세포 배양 배지로 효율적으로 분비되었다(도 2b). 그러나, 예상된 분자량을 갖는 2개의 RdCVF1L 단백질 양성 밴드들(positive band)이 rAAV-RdCVF1L 벡터 형질도입된 세포 용해물 샘플에서 관찰되었고(도 2a, 레인 3), 3개의 이러한 밴드들은 세포 상청액 샘플들에서 검출되었다(도 2b, 레인 3). 이론에 제한되지 않고, 세포 용해물의 분자량과 동일한 분자량을 갖는 세포 상청액의 2개의 낮은 분자량 밴드들(도 2b, 레인 3)은 배양시 일부 죽은 세포들로부터 방출될 수 있다. 상청액에서 약간 높은 분자량을 갖는 세 번째 밴드는 세포 용해물이 없는 RdCVF1L의 분비된 형태가 나타난 것일 것이다. 또한, 데이터는 RdCVF1L의 분비된 형태를 포함하는, RdCVF1L의 3가지 형태가 후-번역적으로(post-translationally) 변형되는 경향이 있음을 나타내었다.
요약
RdCVF1L AAV 벡터는 인간 망막 색소 상피(APRE-19) 세포들에 효율적으로 형질도입될 수 있으므로, 웨스턴 블랏에 의해 검출된 것과 같이 장(long) RdCVF 단백질의 발현과 분비를 일으켰다. 2개의 별개 RdCVFL 단백질들의 밴드들은 더 높은 밴드뿐아니라, rAAV-RdCVF1L 벡터 형질도입된 세포 용해물 샘플들에서 관찰되었다. 3개의 RdCVFL 단백질 밴드들은 벡터 형질도입된 세포 상청액에서 검출되었다. 이 단백질 밴드들 중 2개는 세포 용해물에서 볼 수 있는 분자량과 동일한 분자량을 갖고, 이것들은 세포 배양시 죽은 세포들에 있었을 것이다. 약간 높은 분자량을 갖는 세 번째 밴드는 RdCVF1L의 분비된 형태가 나타난 것일 것이다. 또한, 이들 데이터는 RdCVF1L이 RdCVF1L의 분비된 형태를 포함하고, RdCVF1L이 후-번역적으로 변형되는 경향을 나타내었다.
실시예 3 - 마우스의 눈들에서 AAV 벡터에 의한 RdCVF1과 GFP의 생체 내 발현
본 연구의 목적은 rAAV-RdCVF1L의 망막하 투여가 마우스 눈의 망막에서 RdCVF 수준을 증가시킬 수 있는지 여부를 측정하는 것이다. 재조합 AAV 혈청형(serotype) 2 벡터 rAAV-RdCVF1L과 대조군 벡터 rAAV-GFP를 실시예 2에서 기술된 바와 같이 준비하였다.
5 주령 내지 6 주령된, 암컷 BALB/C 마우스들은 잭슨 라보레토리(Jackson Laboratory)(Bar Harbor, ME)에서 구입하여 본 연구에서 사용되었다. 동물들은 연구에 사용되기 전에 최소 1 주의 환경적응(acclimation) 기간을 가졌다. 동물들은 우리(cage)에서 50 lux 미만의 빛 세기를 갖는 12시간의 명암(light-dark) 주기에서 지냈다. 음식물과 물은 무제한으로(ad lib) 제공되었다. 실험 설계는 표 1에 개략적으로 서술하였다.
실험 설계
마우스 (BALB/c) 눈 망막하 주입 평가
N=7 오른쪽 눈 (OD) rAAV-RdCVF1L 웨스턴 블랏
면역조직화학(Immunohistochemistry)
왼쪽 눈 (OS) 없음
N=7 양쪽 눈 (OU) rAAV-GFP
망막하 주입은 마취 상태에서 수행되었다. 동물들은 5 내지 6 μg/gram의 자일라진과 조합된 25 내지 30 μg/gram의 케타민의 복강내 주입으로 마취되었다. 마취제 투여량들은 심부면(deep plane) 마취를 위해 조절될 수 있다. 눈들은 국소(local) 마취를 위해 0.5% 프로파라카인 하이드로클로라이드(Bausch & Lomb Inc. Rochester, NY)를, 그리고 과정 직전에, 살균을 위해 0.3% AK-Tob(Bausch & Lomb Inc.)를 국소적으로 도포하였다. 동공들은 1% 트로피카마이드(tropicamide)(Akorn, Inc., Buffalo Grove, IL)로 확장되었다.
요약하면, 시야(약 10X 배율) 아래에(under view) 주입될 눈이 위치하도록 자이스 수술용 현미경(Zeiss operating microscope) 아래에 마취된 마우스를 위치시켰다. 앞쪽으로 전체 안구(globe)를 돌출시키기 위해 정밀 기구의 겸자들(jeweler's forcep)을 이용하여 눈꺼풀에 부드럽게 압력을 가하였다. 공막(sclera)을 노출시키기 위해 상부 이측 결막(superior temporal conjunctiva)을 조심히 해부하였다. 30-게이지 바늘을 사용하여 대략 11시(우안)와 1시(좌안) 방향에서 연곽(limbus) 0.5 mm 뒤에서 공막, 맥락막(choroid) 및 망막에 경사진 구멍을 만들었다. 고낙(Gonak)(2.5%, Akorn, Inc)의 액적(drop)은 각막에 스며들었고, 커버슬립(coverslip)은 기저부의 관찰을 돕기 위해 각막 표면에 적당히 위치하였다. 5 μL 헤밀턴 실린지(Hamilton syringe)에 부착된 33-게이지 블런트 바늘을 공막 절개술(sclerotomy)을 통해 렌즈와 접촉없이 후극(posterior pole)을 향하는 접선 방향(tangential direction)으로 주입하였고, 바늘의 끝(tip)을 망막 안쪽 표면에 위치시켰다. 망막에 구멍을 뚫고, 1 μL의 벡터를 망막하 공간에 주입하였다. 주입 후, 바늘을 조심히 빼내고, 결막을 재위치시켰다. 각 주입의 성공은 망막 박리(retinal detachment)의 신호에 대해 안저(fundus)를 평가함으로써 확인되었다. 망막하 또는 유리체내 출혈이 나타난 눈들뿐 아니라 망막 박리(또는 물집(bleb))이 나타나지 않은 눈들을 제외하였다. 네오마이신(Neomycin)과 폴리마이신 B 설페이트(polymycin B sulfate)와 바키트라신 징크 안과 연고(Bacitracin Zinc ophthalmic ointment)(Bausch & Lomb Inc.)는, 동물이 따뜻한 담요를 덮고 마취에서 회복하는 동안, 각막 조직의 건조를 최소화하기 위해 각막에 도포되었다.
웨스턴 블랏 분석
웨스턴 블랏들은 rAAV-RdCVF1L 벡터 주입 눈으로부터 얻어진 단백질 추출물로 생성하였고, 반대쪽의 주입되지 않은 대조군 눈들은 rAAV-RdCVF1L 벡터의 투여 6주 후 얻어졌다. 요약하면, 안구(eyeball)를 적출하고, 안구외 조직들(extraocular tissue)과 전안부 세그먼트(anterior segment)를 제거하였다. 남아있는 후면부 세그먼트들(posterior segment)은 액체 질소로 빠르게 동결시켰다. 이 샘플들은 단백질 추출에 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. 각 안배(eyecup)에 대해, 프로테아제 억제제 칵테일(Protease Inhibitor Cocktail)(Roche Diagnostics, Cat. No. 11836170001)을 갖는 200 μL의 얼음처럼 차가운(ice-cold) T-PER 조직 단백질 추출 시약(Pierce, Cat. No. 78510)을 첨가하였다. 샘플들은 소닉 디스멤브레이터(Sonicdismembrator)(Fisher Scientific Model 100, Pittsburgh, PA)를 이용하여 차가운 상태에서(on ice) 5초 동안 초음파 처리하였다. 초음파 처리된 샘플들은 15분간 차가운 상태를 유지하였고, 4℃에서 5분 동안 10,000 g을 원심분리하여 세포 파괴물(cell debris)을 제거하였다. 상청액들을 수집하였고, 단백질 농도는 브레드포드 단백질 분석기(Bradford protein assay)를 사용하여 측정하였다. RdCVFL 대조군에 대해, rAAV-RdCVF1L 형질도입된 ARPE-19 세포 용해물은 양성 대조군(positive control)으로, 형질도입되지 않은 세포 용해물은 음성 대조군(negative control)로 제공되었다. 단백질들은 겔 전기영동에 의해 분리되었다. 각 레인에 대해, 36 μg의 총 단백질은 4 내지 20% 크라이테리온(Criterion)™ TGX™ 프리캐스트 겔(Precast Gel)(Bio-Rad, Cat. No. 567-1094)에 로딩되었고, 200 볼트에서 70분 동안 전기영동되었다. 단백질들은 트랜스 블랏 세미-드라이 트랜스퍼 셀을 사용하여 0.2 μm 니트로셀룰로오스 블랏팅 세포막 쪽으로 일렉트로블랏팅되었다. 블랏들은 1X 카세인 용액(Vector Laboratories, Cat. No. SP-5020)을 사용하여 실온에서 2시간 동안 차단되었고, 1:2,000으로 희석된 토끼 항-RdCVFL 1차 항체(Covance Research Products, Denver, PA), 또는 1:500으로 희석된 레드/그린 다중클론 항체(Millipore, Temecura, CA), 토끼 항-옵신(opsin)으로 배양시켰다. 1X 카세인 용액으로 3회 세척 후에, 각 블랏은 1:3,000으로 희석된 알칼리성 포스파타아제 염소 항-토끼 IgG 항체(Vector Laboratories, Cat. No. AP-1000)로 배양시켰다. 단백질 밴드들은 화학 발광 기질 검출 키트를 사용하여 시각화되었다. 베타-튜블린(50-kD)은 동일한 단백질 로딩 대조군으로 사용되었다. 블랏은 리스톨 플러스 웨스턴 블랏 스트립핑 버퍼(Restore Plus Western Blot Stripping Buffer)(Thermo Scientific, Cat. No. 46430)로 스트리핑되었고, 1:500으로 희석된 항-β-튜블린 단일클론 항체(Sigma-Aldrich, Cat. No. T4026)로 재검출하고(re-probed), 그 다음 1X 카세인 용액에서 1:3,000으로 희석된 알칼리성 포스파타아제와 결합한 말(horse) 항-마우스 IgG 항체(Vector Laboratories, Cat. No. AP-2000)로 재검출하였다.
코닥 이미징 스테이션(Kodak Imaging Station)으로 수행한, 단백질 농도계의 방사능 사진(autoradiograph)은, 동일한 블랏에서 베타-튜블린 수준에 대해 정상화되는, 스캔된 단백질 밴드들을 정량화하는데 사용되었다.
RdCVF1L 단백질의 존재는 대략 30 kDa의 분자 크기를 갖는 현저한 이중 면역반응성 밴드들(prominent double immunoreactive band)로서 rAAV-RdCVF1L 주입을 받은 눈들에서 명확하게 검출되었다(도 3). 양성 대조군으로 기능하는, rAAV-RdCVF1L에 의해 형질도입된 ARPE-19 세포들로부터의 세포 용해물들의 웨스턴 블랏은 또한 동일한 크기들을 갖는 2개의 개별적인 단백질 밴드들을 산출하였다. 망막 하 주입을 받지 않는 반대쪽(contra lateral) 눈들 및 rAAV-GFP가 주입된 눈들로부터 추출된 단백질들은 항-RdCVFL 항체에 의해 검출된 단백질 밴드들과 유사한 단백질 밴드들을 제공하지 않았다(도 3). 이중 면역 반응성 밴드들은 rAAV-RdCVF1L에 의해 형질도입된 ARPE-19 세포들에서 시험관 내 관찰된 이중 밴드들과 유사하였다. 세 번째 밴드(RdCVF1L의 분비되 형태로 추정됨)의 부재는 이 생체 내 샘플들이 망막 세포들의 단백질 추출물들이기 때문이다.
면역조직화학 분석
신경망막과 RPE-맥락막-공막(RPE-choroida-sclera)의 홀마운트를 제조(wholemount preparation)에서, RdCVF1L 면역염색법(immunostaining)을 수행하였다. 마지막에 동물들을 마취시켰고, 눈들을 적출하여 밤새 4℃에서 인산 완충 식염수(PBS) 7.4(1X), 액체(Gibco, Cat. No. 10010-031) 중의 4% 파라포름알데하이드에 즉시 고정시켰다. 적출하기 전에, 각 마우스의 눈은 인디아 잉크를 이용하여 각막의 하위 사분면(inferior quadrant)을 표시하였다. 안배들은 레이카(Leica) 해부 현미경 하에서 전안부 세그먼트를 제거하기 위해 준비되었다. 방향을 결정하기 위해 하위 사분면에 작은 자국(nick)을 새겼다. 시신경이 끊어진, RPE에서 떨어져서 신경망막을 조심히 해부하였다. 홀마운트들을 1X PBS로 3회 헹구었고, 실온(RT)에서 2시간 동안 PBS의 2% 트리톤(Triton) X-100 중의 5% 당나귀 혈청(donkey serum)으로 차단하였다. 차단 용액(blocking solution)을 제거한 후에, 홀마운트들을 밤새 4℃에서 차단 용액의 1:1,000의, 1차 항체-토끼 항-RdCVF로 연속하여 배양시켰고, 실온에서 2시간 동안 PBS 중의 2% 트리톤 X-100의 1:1,000, 2차 항체-ALEXA FLUOR® 488 당나귀 항-토끼로 배양시켰다. PBS로 최종 세척 후에, 각 홀마운트는 신경망막의 위쪽을 향하는 광수용체(photoreceptor)와 RPE-맥락막-공막의 위쪽을 향하는 RPE를 갖는 글래스 슬라이드(glass slide)에 평면으로 마운팅되었다. 그 다음, 플랫마운트들(flatmount)은 디지털 카메라가 장착된 올림푸스(Olympus) BX51 현미경(Spot RT Color 2.2.1, Diagnostic Instruments, Inc)과 형광현미경(epifluorescence)으로 측정되었다.
rAAV-RdCVF1L 벡터 주입 눈들에서 RdCVF1L 단백질의 증가된 발현을 면역조직화학법으로 확인하였다. rAAV-RdCVF 벡터 주입 눈에서 RPE 세포들은 강한(robust) RdCVF1L 면역염색으로 관찰되었으나(도 4A), 주입되지 않은 반대쪽 눈들(도 4)에서는 관찰되지 않았다(도 4). RdCVF1L의 증가된 발현은 각 눈의 대략 1 사분면을 커버하는, 초점 영역(focal area)에서만 발견되며, 이는 발현이 망막하 주입으로부터 물집 영역에만 한정되는 것을 가리킨다. 1차 항체 없이 염색된 샘플들은 어떠한 면역반응성도 나타내지 않았다(도 4C). 단백질 발현의 뚜렷한 증가는 rAAV-RdCVF1L 주입 눈의 광수용 세포들(도 5A)에서 관찰되었다. 강한(strong) RdCVF1L 염색은 평면으로 마운팅된 신경망막의 광수용cp 외부 세그먼트들에서 나타났다. 다시 말해, 양성 염색은 10 내지 30%의 망막을 커버하는, 망막의 초점 영역에만 국한되었다. 주입을 받지 않은 반대쪽 눈들에서는 오직 배경만 염색되었다(도 5B). 1차 항체없이 처리된 샘플들에서는 면역반응성이 나타나지 않았다(도 5C).
마우스의 눈들에서 GFP 발현
테스트된 AAV 벡터들이 마우스의 눈들에서 RPE와 광수용 세포들을 효율적으로 형질도입시키는지 여부를 측정하기 위해, 마우스들의 그룹(n=7)은 rAAV-GFP를 망막하로 주입하였고, 6주 후에 치사시켰다. RPE-맥락막-공막과 신경망막은 분리되어 글래스 슬라이드들에 평면으로 마운팅되었다. 형광 현미경(Fluorescent microscopy)은 RPE와 광수용체 층에서 강한 GFP 발현을 나타냈다(데이터 도시하지 않음). GFP를 발현하는 RPE 세포들은 최대 수를 갖는 평면마운트의 1 내지 2 사분면들에 펼쳐졌고, 가장 강한 GFP-발현 세포들은 주입 부위에 존재한다. 형질도입된 RPE 세포들은 세포들의 육각형 형태(hexagonal morphology)를 유지하는 것과 같이 건강한 것으로 나타났다. 평면으로 마운팅된 신경망막들에서, GFP 발현은 광수용 외부 세그먼트들에서 식별되었다. 망막하 주입 후에 유리체(vitreous)로 벡터가 누설될 수 있기 때문에, 때때로 내부 망막 세포들, 예를 들어 결정종(ganglion) 세포들은 GFP 양성이였다.
요약
본 연구는 성공적인 망막하 주입 후에, rAAV-RdCVF1L 벡터에 의한 RPE와 광수용 세포들의 효율적인 형질도입을 입증하였다. 벡터에 의해 전달되는 RdCVF1L 발현 양상(expression construct)은 마우스 눈들에서 RdCVF1L 단백질 수준을 유의적으로 증가시켰다.
실시예 4 - rd10 마우스 눈들에서 광수용체 생존(survival)에 대한 아데노 관련 바이러스 벡터에 의해 매개된 장(long) 형태 RdCVF 발현의 효과
본 연구의 목적은 RdCVF1L을 인코딩하는 AAV-기반 유전자 치료 벡터의 망막하 투여가 rd10 마우스들(인간의 유전적 망막 퇴화(degeneration)가 자연적으로 발생하는 동물 모델)에서 광수용체의 생존을 촉진하는지를 측정하는 것이다. Rd10 마우스들은 상염색체 열성 망막색소변성증(RP)이 자연적으로 발생하는 동물 모델이다. Rd10 마우스들은 간상 cGMP 포스포디에스테라제 유전자(phosphodiesterase gene)에서 미스센스 점 돌연변이(missense point mutation)를 갖으며, 광수용 세포의 세포자살(apoptosis)을 발생시킨다(Chang et al. (2007) Vision Res 47:624-633). 간상 광수용체 세포들은 P25에서 피크(peak) 광수용체 사멸이 발생하며, 18 일령부터 퇴화가 시작된다(Gargini et al. (2007) J Comp Neurol 500:222-238). 5주가 지나면, 대부분의 광수용 세포들이 퇴화된다(Chang et al. (2002) Vision Res 42:517-525; Chang et al. (2007) Vision Res 47:624-633; Gargini et al. (2007) J Comp Neurol 500:222-238). 흥미롭게도, 암조건에서 사육된 rd10 마우스들은 광수용체 퇴화가 4주 정도 느린 것을 알게 되었고(Chang et al.(2007) Vision Res 47:624-633), 이것은 빛 노출이 광수용체의 사멸을 촉진할 수 있다는 것을 암시한다. 반면에, 암조건으로 유지한 마우스들에 의해 지연된 광수용체 퇴화는 치료 이식 유전자의 발현을 위해 필요한 시간들인(예를 들어, AAV로부터 충분한 이식 유전자 발현은 통상 약 3주가 소요됨), 벡터들에 대한 치료 시간 기회(window)를 연장할 수 있다.
4 주령 내지 5 주령인, rd10 마우스들의 유사유전자 근교계(congenic inbred strain)의 교배 쌍들(breeding pair)은 잭슨 라보레토리(Bar Harbor, ME)에서 구입하였고, 동물 시설(animal facility)에서 사육하였다. 동물들은 우리에서 50 lux 미만의 빛 세기를 갖는 12시간의 명암 주기에서 지냈다. 음식과 물은 무제한으로(ad lib) 제공되었다. 수술 후, 아래에서 기술된 바와 같이, 새끼들과 그 어미들을 3 주령에 젖을 땔 때까지 암조건에 두었다. 그 다음, 모든 동물들은 12시간의 명암 주기를 갖는 예전 방으로 다시 이동되었다. 실험 설계는 표 2에 있다.
실험 설계
마우스
(rd10)		 눈 망막하 주입 평가
N=12 OD rAAV-RdCVF1L 망막 조직학(Retinal histology)
원추 세포 형태/수(Cone morphology/number)
OS 없음
동물들(생후 3 일령)은 저체온 마취법(hypothermia)으로 마취시켰다. 이 저체온 마취 방법은 최대 5일령인 신생아 마우스들과 쥐들(rat)에 대해 잘 확립되어 있는, 이 동물들의 짧고 작은 외과 수술 절차들(5 내지 15분)에 적합하다(Gaertner et al. Anesthesia and Analgesia 2nd ed. pages 277-278). 새끼를 3 내지 4분 동안 깨진 얼음 위에 놓았다. 이 시간 동안, 새끼의 색깔은 분홍색에서 창백하게 변하였다. 이런 형태의 마취 하에서 망막하 주입들을 수행하였다.
시야(대략 10X 배율) 아래에(under view) 주입될 눈이 위치하도록 자이스 수술용 현미경 아래에 마취된 마우스를 위치시켰다. 눈꺼풀들과 주변 영역을 5% 프로비돈-아이오딘(providone-iodine)으로 소독하였다. 눈은 안과 가위(Iris scissor)를 사용하여 안검열(palpebral fissure)을 분리시켜 노출되었다. 앞쪽으로 전체 안구를 돌출시키기 위해 정밀 기구의 겸자들을 이용하여 눈꺼풀에 부드럽게 압력을 가하였다. 0.3%의 토브로마이신(Tobromycin)(Bausch & Lomb Inc.)의 액적으로 소독하였다. 대략 11시(우안) 위치에서 연곽(limbus) 0.5 mm 뒤에 공막, 맥락막 및 망막의 경사진 구멍을 만들기 위해 30-게이지의 날카로운 바늘을 사용하였다. 5 μL 헤밀턴 실린지에 부착된 33-게이지 블런트 바늘을, 공막 절개술(sclerotomy)을 통해 후극을 향하는 접선 방향으로 주입하였다. 바늘의 끝은 망막하 영역에 위치되었고, 1 μL의 AAV 벡터를 망막하 공간으로 주입하였다. 주입 후, 바늘을 천천히 빼내었다. 망막하 또는 유리체내 출혈이 나타난 일부 눈들은 본 연구에서 제외되었다. 네오마이신과 폴리마이신 B 설페이트와 바키트라신 징크 안과 연고(Bausch & Lomb Inc.)는 각막 조직의 형질주입을 막고 건조를 최소화하기 위해 각막에 도포되었다. 동물들은 따뜻한 전기 담요(heating pad)에서 회복되었다.
망막 조직학
마우스들을 깊이 마취시키고 방향을 결정하기 위해 적색 조직 염료(red tissue dye)로 마우스들의 눈의 상부 사분면(superior quadrant)을 표시하였다. 그 다음, 마우스들을 치사시켰고, 즉시 적출하여 약 24시간 동안 실온에서 다비드손 고정제(Davidson’s fixative)에 고정시켰다. 에탄올과 클리어-라이트(Clear-rite)에서 순차적으로 탈수(dehydration)시킨 후, 눈들을 파라핀(Fisher Sci., Houston, TX)에 임배딩하였다. 상부(superior) 및 하부(inferior) 망막의 검사를 위해 수직 날줄(vertical meridian)을 따라, 5 μm의 두께로 망막 단면을 잘랐다. 단면들을 헤마톡시린과 에오신으로 염색하였고, 광학 현미경(Olympus BX51)으로 검사하였다. 외부 핵층(outer nuclear layer; ONL)의 두께는 망막 중심과 주변에서 핵의 줄들(row)의 수를 세면서 측정하였다. 광수용체 형태도 검사되었다.
처리된 rd10 마우스 눈들은 5주령에 조직적 구조(structural rescue) 정도에 대해 평가되었다. 광학 현미경은 AAV-RdCVF1L 처리되지 않은 반대쪽 눈들과 비교할 때 AAV-RdCVF1L 처리된 눈들에서 외부 핵층(ONL)이 명백하게 보존되는 것을 나타냈다. 전형적으로, RdCVF1L 벡터로 처리된 망막은 동일한 위치들에서 처리되지 않은 반대쪽 눈들에서의 1 내지 2개의 줄들과는 반대로, 상부 및/또는 하부 영역들에서 2 내지 5개 줄들의 광수용체 핵들을 갖는다(도 7). 구조(rescue)는 주입된 영역, 상부 사분면에 제한되지 않았고, 보호(protection)는 하부 사분면에서도 발견되었다. 형태학적 분석은 처리되지 않은 눈들의 34%와 비교할 때, 벡터로 처리된 눈들에서 망막의 대략 75%가 보호되는 것을 나타내었다. 일부 보존된 광수용체들은 내부 및 외부 세그먼트들도 보유한다(도 7E). 구조된 광수용체들이 간상 세포들과 원추 세포들 모두를 포함한다는 것은 주목할 만 하다.
원추 광수용체 염색 및 계수( counting )
간상 세포 특이적 마커인 땅콩 응집소(PNA)는 망막의 홀마운트 제조물을 염색하는데 사용되었다. 적출되기 전에, 마우스의 눈들은 이측 사분면(temporal quadrant)에서 인디안 잉크와 적색 염료로 각막의 상부 사분면에 표시되었다. 눈들은 최소한 밤새 4℃에서 4% 파라포름알데하이드에 즉시 고정되었다. 안배들은 레이카 해부 현미경으로 전안부 세그먼트를 제거하기 위해 제조되었다. 방향을 결정하기 위해 상부 사분면에 작은 자국(nick)을 새겼다. 방사선으로 원주를 따라 4개로 자른 후, 전체 신경망막을 안배로부터 조심히 해부하였다. 망막들을 1X PBS로 3회 헹궜고, 실온에서 30분 동안 0.2% 트리톤-X 100를 갖는 PBS(Gibco, Cat. No. 10010-031)에서 6%의 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단하였다. 차단 용액을 제거한 후에, 망막들은 4℃에서 밤새 렉틴 PNA 콘쥬게이츠 알렉사 플루오르 594(Lectin PNA Conjugates Alexa Fluor 594)(1:250 in PBS, Invitrogen Corp, Chicago, IL)로 배양되었다. PBS로 최종적으로 헹군 후, 각 망막들은 위쪽으로 향하는 광수용체들을 갖는 글래스 슬라이드에 평면으로 마운팅되었다. 그 다음, 망막 홀마운트들은 디지털 카메라(Spot RT Color 2.2.1, Diagnostic Instruments, Inc)을 장착한 올림푸스 BX51 현미경과 형광현미경으로 검사되었다.
망막 홀 마운트들에서 원추 세포 밀도를 측정하기 위해, 시신경 머리의 가장자리에서 1 내지 2 mm 위치의 각 망막 사분면에서 60X 대물렌즈로 2개의 이미지를 각각 측정하였다. 각 이미지(390 X 293 μm)에 존재하는 원추 세포들의 수는 이미지 프로 플러스 소프트웨어(Image Pro Plus software)(Media Cybernetics, Inc. Bethesda, MD)를 이용하여 계수되었다.
일부 눈들에 대해, 망막 저온유지(cryostat) 부분들(12 μm 두께)은 레이카 저온유지 박편제조기(microtome)(Leica Microsystems, Model CM 1850, Leica, Bannockburn, IL)로 절단되었고, PNA로 염색되었고, 상기 언급한 형광 현미경으로 측정되었다.
원추 광수용 세포들은 평면 마운팅된 신경망막에서, 원추형 내부 및 외부 세그먼트들을 선택적으로 염색하는, PNA 라벨링으로 식별되었다. 형광 현미경은 처리되지 않은 눈, 특히 후면부 중심 망막, 예를 들어 시신경 헤드 주변에서 원추 세포들의 심각한 퇴화를 보여주었다. 원추 세포들은 외부 세그먼트들을 잃었고, 세포들의 내부 세그먼트들은 짧고, 블런트되고(blunted) 불규칙적이다. 반대로, 벡터로 처리된 눈들은 원추 세포 밀도가 더 크고, 파괴된 원추 세그먼트들이 훨씬 적고, 더 균일한 원추 세포 염색을 갖는다(데이터 도시하지 않음). 고배율에서, PNA-양성 원추 세포들은 시신경 머리에서 1 내지 2 mm 위치의 4개의 사분면 전부에서 계수되었다. 원추 세포 밀도의 정량화는 처리되지 않은, 반대쪽 눈들에 비해 벡터로 처리된 눈에서 원추 광수용체들에서 유의적으로 더 높은 수인 것을 나타낸다:181+/-46.4 대 50+/-25.2 cones/0.114 mm2, p=0.001.
RdCVF 면역조직화학
신경망막과 RPE-맥락막-공막의 홀마운트 제조에서, RdCVF 면역염색법을 수행하였다. 홀마운트들을 1X PBS로 3회 헹구었고, 실온에서 2시간 동안 PBS 내에서 5% 당나귀 혈청과 2% 트리톤 X-100으로 차단하였다. 차단 용액을 제거한 후, 실온에서 2시간 동안, PBS 중의 2% 트리톤 X-100과 1:1,000으로 1차 항체-토끼 항-RdCVF, 및 PBS 중의 2% 트리톤 X-100과 1:1,000으로 2차 항체-알렉사 플루오르® 488 당나귀 항-토끼를 이용하여 홀마운트들을 연속적으로 배양시켰다. PBS로 최종적으로 헹군 후에, 각 홀마운트는 신경망막의 위쪽을 향하는 광수용체들과 RPE-맥락막-공막의 위쪽을 향하는 RPE를 갖는 글래스 슬라이드에 평면으로 마운팅되었다. 그 다음, 디지털 카메라가 장착된 올림푸스 BX51 현미경(Spot RT Color 2.2.1, Diagnostic Instruments, Inc)와 형광현미경으로 평면마운트들을 검사하였다.
rAAV-RdCVF1L이 주입된 6개의 눈들 중 5개의 RPE 세포들에서 강한 RdCVF 면역반응성이 관찰되었지만(하나의 눈에 대한 대표적인 실시예는 (도 6A)에 나타남), 주입되지 않은 반대쪽 눈들에서는 관찰되지 않았다(도 6B). rAAV-RdCVF1L 주입을 받은 하나의 눈은 소안구증(microphthamia)으로 인해 분석에서 제외되었다. RdCVF1L의 효율적인 발현이 초점 영역에서 나타났고, 각 눈의 대략 1.5 내지 3 사분면에 펼쳐졌다. RdCVF1L이 발현되는 RPE 세포들은 전형적인 육각형 형태를 유지하였고(도 6E), 벡터 투여 또는 RdCVF1L 발현으로부터 RPE에 대한 명백한 부정적(negative) 효과가 없는 것을 나타내었다. RdCVF1L의 RPE 발현과 유사하게, 이 단백질의 면역반응성의 효율적인 발현은 또한 rAAV-RdCVF1L이 주입된 눈의 신경망막에서 관찰되었다(도 6C). 주입되지 않은, 반대쪽 눈들은 염색되지 않았다(도 6D). 강한 RdCVF1L 염색은 5개 중 3개의 눈들, 특히 내부/외부 세그먼트들에서 광수용 세포들을 명확하게 나타내었다(도 6F). 다른 2개의 눈들에서의 RdCVF 면역 반응성의 부족은 광수용체 퇴화의 결과이다. 다시 말해, 양성 염색법은 망막의 초점 영역에만 국한된다. 주입되지 않은 반대쪽 눈들에서 RdCVF1L의 발현이 검출되지 않는 관찰은 내생의(endogenous) RdCVF1L의 수준이 면역조직화학 염색법에 의한 검출의 한계보다 낮을 수 있는 것을 나타낸다.
요약
본 연구는 rAAV-RdCVF1L 벡터들의 망막하 주입이 RPE와 광수용 세포들의 효율적인 형질도입과 rd10 마우스 눈들에서 강한 RdCVF1L 단백질 발현을 가져온다는 것을 보여준다. 보다 중요하게는, 이 벡터는 간상 및 원추 광수용체 모두의 생존을 연장시켰고, 망막색소변성증(RP)과 임상적으로 관련있는 동물 모델에서 원추 세포 형태를 개선시켰다.
실시예 5 - rAAV-RdCVF1L의 망막하 주입은 rd10 마우스들의 주입 부위에서 떨어져서 광수용 세포를 보존했다
rAAV-RdCVF1L에 의한 광수용 세포들의 구조(rescue)가 주입 부위와 떨어진 영역들로 확장할 수 있는지 여부를 검사하기 위해, 대조군으로서 주입되지 않은 반대쪽 눈을 갖는, 생후 3일된 rd10의 오른쪽 눈들의 상부 사분면으로 rAAV-RdCVF1L(1 μL, 2x108 GC)를 망막하 주입하였다. 마우스들을 5주령에 치사시켰다. 전체 안배로부터 망막 조직학을 검사하였다. 도 8은 하나의 눈(패널 A, 도 8)은 rAAV-RdCVF1L의 망막하 주입을 받고 반대쪽 눈(패널 B, 도 8)은 처리되지 않은, 대표적 5 주령 rd10 마우스의 안배에 대한 광학현미경 사진(light photomicrography)을 보여준다. 처리된 눈과 처리되지 않은 눈 사이의 ONL 두께 차이를 주목하라. rAAV-RdCVF1L 처리된 눈들(패널 A, 도 8)의 전체 망막에서 광수용체가 보존되는 것이 명확하게 나타났다. 상부 망막의 주입 부위를 라벨링하였다. 반면에, 처리되지 않은 반대쪽 눈(패널 B, 도 8)에서 하부 주변 망막을 제외하고는 대부분의 광수용 세포들을 잃었다.
실시예 6 - rAAV-RdCVF1L의 망막하 주입은 간상 광수용 세포들을 보존했다
간상 광수용 세포들(또한 원추 광수용 세포들)이 rAAV-RdCVF1L에 의해 구조될 수 있는지 여부를 검사하기 위해, 대조군으로서 주입되지 않은 반대쪽 눈들을 갖는 생후 3일된 rd10 마우스의 오른쪽 눈들에 rAAV-RdCVF1L(1 μL, 2x108 GC)를 망막하 주입하였다. 마우스들을 5주령에 치사시켰다. 망막 조직을 로돕신(rhodopsin) 면역조직화학 염색법으로 처리하였다. 단면들은 망막층들의 식별을 돕기 위해 DAPI(디아미디노-2-페닐인돌(diamidino-2-phenylindole), 푸른색)으로 대조염색하였다.
rAAV-RdCVF1L 처리된 눈에서는 광수용 세포들의 세그먼트층과 핵층 모두에서 로돕신의 강한 발현이 관찰되었다(데이터 도시하지 않음). 그러나, 처리되지 않은 눈에서는 단지 몇몇 세포들에서만 로돕신 염색이 나타났다(데이터 도시하지 않음).
실시예 7 - Rd10 마우스들에서 아데노 관련 바이러스 벡터들에 의해 매개된 RdCVFL에 의한 광수용체들의 기능적 구조
본 연구의 목적은 rd10 마우스들의 망막 기능과 구조에 대해 AAV 벡터에 의해 전달된 RdCVF의 보호 효과를 평가하는 것이다. 3 일령 또는 4 일령의, 신생아 rd10 마우스들은 하나의 눈에 rAAV-RdCVFL 벡터를 망막하 주입하였지만, 반대쪽 눈에는 처리하지 않았다. 망막하 주입 5주 후에, 마우스들은 망막 기능들을 평가하기 위해, 망막전도(electroretinogram, ERG)를 테스트하였다. ERG 후에, 마우스들을 치사시켰고, 그들의 눈을 망막의 조직학적 평가를 위해 처리하였다.
재조합된 AAV 혈청형 2 벡터 rAAV-RdCVF1L과 대조군 벡터 rAAV-GFP를 실시예 2에서 기술한 바와 같이 준비하였다.
4주령 내지 5주령의, rd10 마우스들의 유사유전자 근교계(congenic inbred strain)의 교배 쌍들(breeding pair)은 잭슨 라보레토리(Bar Harbor, ME)에서 구입하였고, 동물 시설에서 사육하였다. 동물들은 우리에서 50 lux 미만의 빛 세기를 갖는 12시간의 명암 주기에서 지냈다. 음식과 물은 무제한으로 제공되었다. 수술 후, 새끼들과 그 어미들을 3주령에 젖을 땔 때까지 암조건에 두었다. 그 다음, 모든 동물들은 12시간의 명암 주기를 갖는 예전 방으로 다시 이동되었다. 실험 설계는 표 3에 개략적으로 서술하였다.
마우스
(rd10)		 눈 망막하 주입 평가
N=13 OD rAAV-RdCVF1L ERG
망막 조직학
OS 없음
동물들을 마취시켰고 실시예 4에서 기술된 바와 같이 망막하 주입을 수행하였다.
마우스들을 실험하기 전에 밤새(적어도 14 시간) 암조건에 두었고, 마우스들의 동공들을 0.5% 트로피카마이드(Alkorn) 점안액들로 확장시켰다. 마취는 케타민과 자일라진의 복강내 주입으로 유도되었다. 은침 전극들(silver needle electrode)은 참조(이마)와 그라운드(꼬리)로 기능하고, DTL 링 전극들은 활성 전극들로 기능하였다. 우수한 전기 접점(electrical contact)을 확보하고, 전체 과정 동안 눈을 탈수된 상태로 유지하기 위해 고네솔(Gonesol)을 도포하였다. 기록 설비(recording setup)는 간즈펠트 볼(Ganzfeld bowl), DC 증폭기, 및 에스피온(Espion) E3 망막전기측정 시스템(Diagnosys LLC, Lowell,MA)의 기록 유닛과 컴퓨터-기초 컨트롤을 특히 포함하였다. ERG들은 마우스들이 간즈펠트 볼에 위치된 후에, 양쪽 눈을 동시에 기록하였다. 단일 플래쉬(single-flash)와 플리커(flicker) 기록들은 암순응된(암소시(scotopic)) 조건과 명순응된(주간시(photopic)) 조건에서 모두 얻어졌다. 단일 플래쉬 자극들은 10-2 내지 25 cds/m2에 도달할 때까지, 강도의 증가가 유지되었다. 5개의 반응들은 5 또는 17 초의 자극간 간격으로 평균을 냈다. 플리커 자극들은 2, 5, 10, 15 및 30 Hz의 주파수를 갖는 3 cds/m2의 강도를 갖는다. 주간시 반응들의 안정한 수준에 도달하기 위해, 10 분 동안 30 cds/m2의 배경 조명에서 명순응을 수행하였다. 평균 진폭과 비교를 위해, 스튜던트 페어-t 테스트(student pair-t-test)를 사용하였다.
마우스들을 깊이 마취하였고, 적색 조직 염료로 상부 사분면을 마우스들의 눈에 표시하였다. 그 다음, 마우스들을 치사시켰고, 즉시 적출하여 약 24시간 동안 실온에서 다비드손 고정제에 고정시켰다. 에탄올과 클리어-라이트에서 순차적인 탈수 후, 눈들은 파라핀(Fisher Sci., Houston, TX)에 임배딩되었다. 상부 및 하부 망막의 검사를 위해 수직 날줄에 따라, 5 μm의 두께의 망막 단면들로 잘랐다. 단면들을 헤마톡시린과 에오신으로 염색하였고, 광학 현미경(Olympus BX51)으로 검사하였다. 외부 핵층(ONL)의 두께는 망막 중심과 주변에서 핵의 줄들의 수를 세어 측정하였다. 광수용체 형태도 검사되었다.
결론
rAAV - RdCVF1L 처리된 눈들에서 망막 기능의 구조( rescue )
기대된 바와 같이, 5 주령에서, rd10 마우스들은 연령을 맞춘(age-matched), 야생형의 C57BL/6 마우스들과 비교하여 ERG 기록에서 암소시와 주간시 반응들의 유의적인 감소를 나타냈다(도시하지 않음). 그러나, rd10 마우스들(n=8)에서, rAAV-RdCVF1L로 처리된 눈들은 주간시 조건의 25 cd의 플래시 강도하에서, 처리되지 않은 동종의 눈들(11.5±8.4 μV)에 비해 b-파 진폭들(33.6±14 μV)에서 대략 3배 증가를 나타내었다(도 10A 및 10B). 이 조건하에서, 간상 세포와 원추 세포 반응들 모두가 기록되었다. 통계 분석들은 rAAV-RdCVF1L 처리된 눈들과 대조군 눈들 사이의 ERG 진폭에서 유의적인 차이를 나타내었다(p=0.025). 일부 동물들(n=5)은 신생아 기간에 안구내 수술로 발생될 가능성이 있는, 각막 혼탁(corneal opacity), 백내장 또는 소안구증으로 인해 ERG 테스팅에서 배제하였다(ERG 테스팅 전에 배제).
rAAV - RdCVF1L 처리된 눈들에서 광수용체들의 구조적 보전( structural preservation )
rAAV-RdCVF1L 처리된 눈들에서 증가된 ERG 반응들이 rd10 마우스들의 광수용 세포들의 구조적 보전과 관련이 있는지 여부를 측정하기 위해, 동물들을 ERG 직후 치사시켰다. 마우스들의 눈은 조직학적 평가를 위해 처리되었다. 광학 현미경은 AAV-RdCVF1L 처리되지 않은 반대쪽 눈들에 비해, AAV-RdCVF1L 처리된 눈들에서 외부 핵층(ONL)의 보전을 명백히 나타내었다. 전형적으로, 처리되지 않은 반대쪽 눈들의 1 내지 2개의 줄들과는 대조적으로, 벡터로 처리된 망막은 상부 및/또는 하부 영역들에서 광수용체 핵들의 2 내지 4개의 줄들을 갖는다(도 11a 및 11b). 광수용체 보전은 주입된 영역-하부 사분면도 보호가 관찰되므로 상부 사분면-에 제한되지 않는다. 일부 보전된 광수용체들은 심지어 내부 및 외부 세그먼트들을 갖는다. 형태학 분석들은 대조군 눈들(1.2+0.2)(p=0.006)과 비교하여, 처리된 눈들(2.5+1.0)에서 ONL의 줄들의 수가 유의적으로 증가되는 것을 나타낸다(도 12).
요약
ERG는 rAAV-RdCVF1L가 처리되지 않은 동종의 눈들(11.5±8.4 μV)에 비하여 rAAV-RdCVF1L가 처리된 눈들(33.6±14 μV)에서 b-파 진폭들의 유의적인 증가를 보여주었다. ERG 진폭들의 증가는 망막 구조(structure)의 개선과 관련이 있었다. 본 연구는 rAAV-RdCVF1L 벡터들의 망막하 주입이 망막 기능을 유의적으로 개선시키고, Rd10 마우스들에서 광수용체 퇴화를 지연시키는 것을 증명하였다.
<110> Wellstat Ophthalmics Corporation Luo, Tianci <120> VECTORS ENCODING ROD-DERIVED CONE VIABILITY FACTOR <130> WOC-018PCT <140> PCT/US2012/062106 <141> 2012-10-26 <150> US 61/552,155 <151> 2011-10-27 <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Igk signal peptide sequence and recoded rdCVF1L coding sequence (-ATG) <400> 1 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggccag gcgcgccgta cgaagcttgg tacccgccag cctgttcagc 120 ggccggatcc tgatcaggaa caacagcgac caggacgagc tggacaccga ggccgaagtg 180 agcaggaggc tggagaacag actggtgctg ctgttctttg gcgccggagc ctgccctcag 240 tgccaggcct tcgtgcccat cctgaaggat ttctttgtga ggctgaccga cgagttctac 300 gtgctgagag ccgcccagct ggccctggtg tatgtgagcc aggacagcac cgaggagcag 360 caggacctgt tcctgaagga catgcccaag aagtggctgt tcctgccctt cgaggacgac 420 ctgagaagag acctgggcag gcagttcagc gtggagagac tgcccgccgt ggtggtgctg 480 aagcctgatg gcgacgtgct gaccagagat ggcgccgacg agatccagag actgggcacc 540 gcctgcttcg ccaactggca ggaggccgcc gaggtcctgg acagaaactt ccagctgccc 600 gaggatctgg aggatcagga gcccagatcc ctgaccgagt gcctgaggcg gcacaagtac 660 agagtggaga aggccgccag aggcggcaga gaccctggcg gcggaggagg agaggagggc 720 ggagccggcg gactgttctg a 741 <210> 2 <211> 246 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recoded RdCVF1L with Igk signal peptide sequence (-Met) <400> 2 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Val Arg Ser 20 25 30 Leu Val Pro Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn Asn 35 40 45 Ser Asp Gln Asp Glu Leu Asp Thr Glu Ala Glu Val Ser Arg Arg Leu 50 55 60 Glu Asn Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro Gln 65 70 75 80 Cys Gln Ala Phe Val Pro Ile Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu Thr 85 90 95 Asp Glu Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr Val 100 105 110 Ser Gln Asp Ser Thr Glu Glu Gln Gln Asp Leu Phe Leu Lys Asp Met 115 120 125 Pro Lys Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe Glu Asp Asp Leu Arg Arg Asp 130 135 140 Leu Gly Arg Gln Phe Ser Val Glu Arg Leu Pro Ala Val Val Val Leu 145 150 155 160 Lys Pro Asp Gly Asp Val Leu Thr Arg Asp Gly Ala Asp Glu Ile Gln 165 170 175 Arg Leu Gly Thr Ala Cys Phe Ala Asn Trp Gln Glu Ala Ala Glu Val 180 185 190 Leu Asp Arg Asn Phe Gln Leu Pro Glu Asp Leu Glu Asp Gln Glu Pro 195 200 205 Arg Ser Leu Thr Glu Cys Leu Arg Arg His Lys Tyr Arg Val Glu Lys 210 215 220 Ala Ala Arg Gly Gly Arg Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly 225 230 235 240 Gly Ala Gly Gly Leu Phe 245 <210> 3 <211> 744 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Igk signal peptide sequence and recoded RdCVF1L coding sequence (+ATG) <400> 3 atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggccag gcgcgccgta cgaagcttgg tacccatggc cagcctgttc 120 agcggccgga tcctgatcag gaacaacagc gaccaggacg agctggacac cgaggccgaa 180 gtgagcagga ggctggagaa cagactggtg ctgctgttct ttggcgccgg agcctgccct 240 cagtgccagg ccttcgtgcc catcctgaag gatttctttg tgaggctgac cgacgagttc 300 tacgtgctga gagccgccca gctggccctg gtgtatgtga gccaggacag caccgaggag 360 cagcaggacc tgttcctgaa ggacatgccc aagaagtggc tgttcctgcc cttcgaggac 420 gacctgagaa gagacctggg caggcagttc agcgtggaga gactgcccgc cgtggtggtg 480 ctgaagcctg atggcgacgt gctgaccaga gatggcgccg acgagatcca gagactgggc 540 accgcctgct tcgccaactg gcaggaggcc gccgaggtcc tggacagaaa cttccagctg 600 cccgaggatc tggaggatca ggagcccaga tccctgaccg agtgcctgag gcggcacaag 660 tacagagtgg agaaggccgc cagaggcggc agagaccctg gcggcggagg aggagaggag 720 ggcggagccg gcggactgtt ctga 744 <210> 4 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recoded RdCVF1L with Igk signal peptide sequence (+Met) <400> 4 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly Asp Ala Ala Gln Pro Ala Arg Arg Ala Val Arg Ser 20 25 30 Leu Val Pro Met Ala Ser Leu Phe Ser Gly Arg Ile Leu Ile Arg Asn 35 40 45 Asn Ser Asp Gln Asp Glu Leu Asp Thr Glu Ala Glu Val Ser Arg Arg 50 55 60 Leu Glu Asn Arg Leu Val Leu Leu Phe Phe Gly Ala Gly Ala Cys Pro 65 70 75 80 Gln Cys Gln Ala Phe Val Pro Ile Leu Lys Asp Phe Phe Val Arg Leu 85 90 95 Thr Asp Glu Phe Tyr Val Leu Arg Ala Ala Gln Leu Ala Leu Val Tyr 100 105 110 Val Ser Gln Asp Ser Thr Glu Glu Gln Gln Asp Leu Phe Leu Lys Asp 115 120 125 Met Pro Lys Lys Trp Leu Phe Leu Pro Phe Glu Asp Asp Leu Arg Arg 130 135 140 Asp Leu Gly Arg Gln Phe Ser Val Glu Arg Leu Pro Ala Val Val Val 145 150 155 160 Leu Lys Pro Asp Gly Asp Val Leu Thr Arg Asp Gly Ala Asp Glu Ile 165 170 175 Gln Arg Leu Gly Thr Ala Cys Phe Ala Asn Trp Gln Glu Ala Ala Glu 180 185 190 Val Leu Asp Arg Asn Phe Gln Leu Pro Glu Asp Leu Glu Asp Gln Glu 195 200 205 Pro Arg Ser Leu Thr Glu Cys Leu Arg Arg His Lys Tyr Arg Val Glu 210 215 220 Lys Ala Ala Arg Gly Gly Arg Asp Pro Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu 225 230 235 240 Gly Gly Ala Gly Gly Leu Phe 245 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggcggagttg ttacgacat 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gggactttcc tacttggca 19 <210> 7 <211> 639 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atggcctccc tgttctctgg ccgcatcctg atccgcaaca atagcgacca ggacgagctg 60 gatacggagg ctgaggtcag tcgcaggctg gagaaccggc tggtgctgct gttctttggt 120 gctggggctt gtccacagtg ccaggccttc gtgcccatcc tcaaggactt cttcgtgcgg 180 ctcacagatg agttctatgt actgcgggcg gctcagctgg ccctggtgta cgtgtcccag 240 gactccacgg aggagcagca ggacctgttc ctcaaggaca tgccaaagaa atggcttttc 300 ctgccctttg aggatgatct gaggagggac ctcgggcgcc agttctcagt ggagcgcctg 360 ccggcggtcg tggtgctcaa gccggacggg gacgtgctca ctcgcgacgg cgccgacgag 420 atccagcgcc tgggcaccgc ctgcttcgcc aactggcagg aggcggccga ggtgctggac 480 cgcaacttcc agctgccaga ggacctggag gaccaggagc cacggagcct caccgagtgc 540 ctgcgccgcc acaagtaccg cgtggaaaag gcggcgcgag gcgggcgcga ccccggggga 600 gggggtgggg aggagggcgg ggccgggggg ctgttctga 639 <210> 8 <211> 5035 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression vector <400> 8 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180 ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300 ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420 tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480 ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 540 agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 600 ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660 caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720 cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780 ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840 gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata 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cctgcccttc gaggacgacc tgcggagatg acgagatcta cgggtggcat ccctgtgacc 1800 cctccccagt gcctctcctg gccctggaag ttgccactcc agtgcccacc agccttgtcc 1860 taataaaatt aagttgcatc attttgtctg actaggtgtc cttctataat attatggggt 1920 ggaggggggt ggtatggagc aaggggcaag ttgggaagac aacctgtagg gcctgcgggg 1980 tctattggga accaagctgg agtgcagtgg cacaatcttg gctcactgca atctccgcct 2040 cctgggttca agcgattctc ctgcctcagc ctcccgagtt gttgggattc caggcatgca 2100 tgaccaggct cagctaattt ttgttttttt ggtagagacg gggtttcacc atattggcca 2160 ggctggtctc caactcctaa tctcaggtga tctacccacc ttggcctccc aaattgctgg 2220 gattacaggc gtgaaccact gctcccttcc ctgtccttct gattttgtag gtaaccacgt 2280 gcggaccgag cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc 2340 tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc 2400 ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagggg cgcctgatgc ggtattttct 2460 ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc 2520 tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 2580 gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 2640 ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 2700 cggcacctcg accccaaaaa acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 2760 tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 2820 ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt 2880 ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 2940 tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat 3000 gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct 3060 tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt 3120 cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta 3180 tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg 3240 ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 3300 ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 3360 attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 3420 gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 3480 ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa 3540 cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt 3600 gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag 3660 tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt 3720 gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga 3780 ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt 3840 tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta 3900 gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg 3960 caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc 4020 cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt 4080 atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg 4140 gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg 4200 attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa 4260 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ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tggagctcca 660 ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggg atcccgtagt tattaatagt 720 aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 780 cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 840 cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 900 tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta 960 ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg 1020 actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 1080 tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1140 accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1200 gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1260 atataaacca tatcttcact ctgtacttca gctcgtgtag ctcattagct ccgagctccc 1320 caacctacag cctgagaggc actggctcgg ttgggtagcc agcctttcgg gtaataaagg 1380 cttgttggca ttcggcatct acccgtgcct cctgtcttgt cttactcgag cgaacccaca 1440 actccgtcct gctgagctca cagctcgcgg ggcggtgaag aacacccaac agttggcgcc 1500 caacgtgggg ctgagtaaga gagactcggc tcgagtaaaa gaagacccag ctcgaacgag 1560 aagactccgg acaggtgagt agttgcgtgt tttccccggg gtgaagagaa gggagttaga 1620 aaagaagctt cgtaaggtta gggtgacacc ccaacaggat aaatattata ctatagggaa 1680 tcttcaatgg gccattagaa 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ccctgtgcct tatttgaact aaccaatcag ttcgcttctc 2580 gcttctgttc gcgcgcttct gctccccgag ctctatataa gcagagctcg tttagtgaac 2640 cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgactc 2700 tagaggatcc accggtcgcc acttaaggcc tgcagctagc gccaccatgg ccagcctgtt 2760 cagcggccgg atcctgattc gcaacaacag cgaccaggac gagctggaca ccgaggccga 2820 ggtgtccagg agactggaga acaggctggt gctgctgttc tttggcgccg gagcctgccc 2880 tcagtgccag gccttcgtgc ccatcctgaa ggatttcttt gtgaggctga ccgacgagtt 2940 ctacgtgctg agagccgccc agctggccct ggtgtatgtg agccaggaca gcaccgagga 3000 gcagcaggac ctgttcctga aggacatgcc caagaagtgg ctgttcctgc ccttcgagga 3060 cgacctgaga agagacctgg gcaggcagtt cagcgtggag agactgcccg ccgtggtggt 3120 gctgaagcct gatggcgacg tgctgaccag agatggcgcc gacgagatcc agagactggg 3180 caccgcctgc ttcgccaact ggcaggaggc cgccgaggtc ctggacagaa acttccagct 3240 gcccgaggat ctggaggatc aggagcccag atccctgacc gagtgcctga ggcggcacaa 3300 gtacagagtg gagaaggccg ccagaggcgg cagagaccct ggcggcggag gaggagagga 3360 gggcggagcc ggcggactgt tctgatgagc tagcaccggt tgtacaagtc aagcggccaa 3420 ccctccctag atctgttaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta 3480 ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc 3540 atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt 3600 ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg 3660 ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt 3720 tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct 3780 ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aagctgacgt 3840 cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct 3900 acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc 3960 ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct 4020 ccccgcctgt ttcgccttct aggaaactcc tttgggacat cttccgccac gctcctattt 4080 taaacttaaa agggtggact gtggggcagg gtgggacctc aggacaacag cagcccccgg 4140 acttcccata tgtgtttatt tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaatctgta 4200 cttcagctcg tgtagctcat tagctccgag ctccccaacc tacagcctga gaggcactgg 4260 ctcggttggg tagccagcct ttcgggtaat aaaggcttgt tggcattcgg catctacccg 4320 tgcctcctgt cttgtcttac tcgagcgaac ccacaactcc gtcctgctga gctcacagct 4380 cgcggggcgg tgaagaacac ccaacagata tatactgtca acatcccatt tggtagctta 4440 tgttctagac aagattctca acaaattctt ccccctgaat gtttatttaa aaaaaaaaaa 4500 caactactag ggctctgtgc atatgtaagt gagatcctta ttagcaggag aacagcaata 4560 agatattatt acattacaat attatatcct agggtattat aatgcaaggc cattatcaca 4620 tacttggcta acagggtcca tactgttgta atgtattaaa accagactga gtaataaaat 4680 tgacaacaat ataatcatca tctttgttat aggtgggggc atttttcaga tgaggtctca 4740 gagcacctgc caagcatgga cctcgagggg gggcccggta cccagctttt gttcccttta 4800 gtgagggtta attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 4860 ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccgggagc ataaagtgta aagcctgggg 4920 tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 4980 gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 5040 gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 5100 gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 5160 taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 5220 cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 5280 ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 5340 aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 5400 tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 5460 gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 5520 cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 5580 ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 5640 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 5700 gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 5760 cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 5820 tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 5880 ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 5940 aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 6000 atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 6060 ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 6120 tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 6180 agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 6240 taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 6300 tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 6360 cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 6420 ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 6480 tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 6540 tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 6600 cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 6660 tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 6720 gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 6780 tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 6840 atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 6900 tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 6960 cacatttccc cgaaaagtgc cac 6983 <210> 10 <211> 5385 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression vector <400> 10 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180 ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300 ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420 tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480 ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 540 agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 600 ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660 caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720 cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780 ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840 gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata 900 ggcccacaaa aaatgctttc ttcttttaat atactttttt gtttatctta tttctaatac 960 tttccctaat ctctttcttt cagggcaata atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc 1020 attctaaaga ataacagtga taatttctgg gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata 1080 aatatttctg catataaatt gtaactgatg taagaggttt catattgcta atagcagcta 1140 caatccagct accattctgc ttttatttta tggttgggat aaggctggat tattctgagt 1200 ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc atacctctta tcttcctccc acagctcctg 1260 ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat cactttggca aagaattggg attcgaacat 1320 cgattgaatt cgagccacca tggagacaga cacactcctg ctatgggtac tgctgctctg 1380 ggttccaggt tccactggtg acgcggccca gccggccagg cgcgccgtac gaagcttggt 1440 acccgccagc ctgttcagcg gccggatcct gatcaggaac aacagcgacc aggacgagct 1500 ggacaccgag gccgaagtga gcaggaggct ggagaacaga ctggtgctgc tgttctttgg 1560 cgccggagcc tgccctcagt gccaggcctt cgtgcccatc ctgaaggatt tctttgtgag 1620 gctgaccgac gagttctacg tgctgagagc cgcccagctg gccctggtgt atgtgagcca 1680 ggacagcacc gaggagcagc aggacctgtt cctgaaggac atgcccaaga agtggctgtt 1740 cctgcccttc gaggacgacc tgagaagaga cctgggcagg cagttcagcg tggagagact 1800 gcccgccgtg gtggtgctga agcctgatgg cgacgtgctg accagagatg gcgccgacga 1860 gatccagaga ctgggcaccg cctgcttcgc caactggcag gaggccgccg aggtcctgga 1920 cagaaacttc cagctgcccg aggatctgga ggatcaggag cccagatccc tgaccgagtg 1980 cctgaggcgg cacaagtaca gagtggagaa ggccgccaga ggcggcagag accctggcgg 2040 cggaggagga gaggagggcg gagccggcgg actgttctga tgagctagca ccggttgtac 2100 aagtcaagcg gccaaccctc cctagatcta cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt 2160 gcctctcctg gccctggaag ttgccactcc agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt 2220 aagttgcatc attttgtctg actaggtgtc cttctataat attatggggt ggaggggggt 2280 ggtatggagc aaggggcaag ttgggaagac aacctgtagg gcctgcgggg tctattggga 2340 accaagctgg agtgcagtgg cacaatcttg gctcactgca atctccgcct cctgggttca 2400 agcgattctc ctgcctcagc ctcccgagtt gttgggattc caggcatgca tgaccaggct 2460 cagctaattt ttgttttttt ggtagagacg gggtttcacc atattggcca ggctggtctc 2520 caactcctaa tctcaggtga tctacccacc ttggcctccc aaattgctgg gattacaggc 2580 gtgaaccact gctcccttcc ctgtccttct gattttgtag gtaaccacgt gcggaccgag 2640 cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc 2700 actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg 2760 agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagggg cgcctgatgc ggtattttct ccttacgcat 2820 ctgtgcggta tttcacaccg catacgtcaa agcaaccata gtacgcgccc tgtagcggcg 2880 cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc 2940 tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc 3000 gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg 3060 accccaaaaa acttgatttg ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg 3120 tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg ttccaaactg 3180 gaacaacact caaccctatc tcgggctatt cttttgattt ataagggatt ttgccgattt 3240 cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa 3300 tattaacgtt tacaatttta tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt 3360 taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc 3420 cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt 3480 caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg 3540 ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 3600 gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 3660 aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 3720 tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 3780 aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 3840 aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 3900 tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc 3960 aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag 4020 tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa 4080 ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc 4140 taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg 4200 agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa 4260 caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa 4320 tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg 4380 gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag 4440 cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg 4500 caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt 4560 ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt 4620 aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac 4680 gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag 4740 atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg 4800 tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca 4860 gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga 4920 actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca 4980 gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc 5040 agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca 5100 ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa 5160 aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc 5220 cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc 5280 gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg 5340 cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgt 5385 <210> 11 <211> 2788 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression vector <400> 11 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggagc tagttattaa tagtaatcaa 180 ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa 240 atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg 300 ttcccatagt aacgtcaata gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt 360 aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg 420 tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc 480 ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc 540 agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca 600 ttgacgtcaa tgggagtttg ttttgcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa 660 caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag 720 cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct 780 ccatagaaga caccgggacc gatccagcct ccgcggattc gaatcccggc cgggaacggt 840 gcattggaac gcggattccc cgtgccaaga gtgacgtaag taccgcctat agagtctata 900 ggcccacaaa aaatgctttc ttcttttaat atactttttt gtttatctta tttctaatac 960 tttccctaat ctctttcttt cagggcaata atgatacaat gtatcatgcc tctttgcacc 1020 attctaaaga ataacagtga taatttctgg gttaaggcaa tagcaatatt tctgcatata 1080 aatatttctg catataaatt gtaactgatg taagaggttt catattgcta atagcagcta 1140 caatccagct accattctgc ttttatttta tggttgggat aaggctggat tattctgagt 1200 ccaagctagg cccttttgct aatcatgttc atacctctta tcttcctccc acagctcctg 1260 ggcaacgtgc tggtctgtgt gctggcccat cactttggca aagaattggg attcgaacat 1320 cgattgaatt cgagccacca tggagacaga cacactcctg ctatgggtac tgctgctctg 1380 ggttccaggt tccactggtg acgcggccca gccggccagg cgcgccgtac gaagcttggt 1440 acccgccagc ctgttcagcg gccggatcct gatcaggaac aacagcgacc aggacgagct 1500 ggacaccgag gccgaagtga gcaggaggct ggagaacaga ctggtgctgc tgttctttgg 1560 cgccggagcc tgccctcagt gccaggcctt cgtgcccatc ctgaaggatt tctttgtgag 1620 gctgaccgac gagttctacg tgctgagagc cgcccagctg gccctggtgt atgtgagcca 1680 ggacagcacc gaggagcagc aggacctgtt cctgaaggac atgcccaaga agtggctgtt 1740 cctgcccttc gaggacgacc tgagaagaga cctgggcagg cagttcagcg tggagagact 1800 gcccgccgtg gtggtgctga agcctgatgg cgacgtgctg accagagatg gcgccgacga 1860 gatccagaga ctgggcaccg cctgcttcgc caactggcag gaggccgccg aggtcctgga 1920 cagaaacttc cagctgcccg aggatctgga ggatcaggag cccagatccc tgaccgagtg 1980 cctgaggcgg cacaagtaca gagtggagaa ggccgccaga ggcggcagag accctggcgg 2040 cggaggagga gaggagggcg gagccggcgg actgttctga tgagctagca ccggttgtac 2100 aagtcaagcg gccaaccctc cctagatcta cgggtggcat ccctgtgacc cctccccagt 2160 gcctctcctg gccctggaag ttgccactcc agtgcccacc agccttgtcc taataaaatt 2220 aagttgcatc attttgtctg actaggtgtc cttctataat attatggggt ggaggggggt 2280 ggtatggagc aaggggcaag ttgggaagac aacctgtagg gcctgcgggg tctattggga 2340 accaagctgg agtgcagtgg cacaatcttg gctcactgca atctccgcct cctgggttca 2400 agcgattctc ctgcctcagc ctcccgagtt gttgggattc caggcatgca tgaccaggct 2460 cagctaattt ttgttttttt ggtagagacg gggtttcacc atattggcca ggctggtctc 2520 caactcctaa tctcaggtga tctacccacc ttggcctccc aaattgctgg gattacaggc 2580 gtgaaccact gctcccttcc ctgtccttct gattttgtag gtaaccacgt gcggaccgag 2640 cggccgcagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc 2700 actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg 2760 agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagg 2788 <210> 12 <211> 639 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recoded coding region <400> 12 atggccagcc tgttcagcgg ccggatcctg atcaggaaca acagcgacca ggacgagctg 60 gacaccgagg ccgaagtgag caggaggctg gagaacagac tggtgctgct gttctttggc 120 gccggagcct gccctcagtg ccaggccttc gtgcccatcc tgaaggattt ctttgtgagg 180 ctgaccgacg agttctacgt gctgagagcc gcccagctgg ccctggtgta tgtgagccag 240 gacagcaccg aggagcagca ggacctgttc ctgaaggaca tgcccaagaa gtggctgttc 300 ctgcccttcg aggacgacct gagaagagac ctgggcaggc agttcagcgt ggagagactg 360 cccgccgtgg tggtgctgaa gcctgatggc gacgtgctga ccagagatgg cgccgacgag 420 atccagagac tgggcaccgc ctgcttcgcc aactggcagg aggccgccga ggtcctggac 480 agaaacttcc agctgcccga ggatctggag gatcaggagc ccagatccct gaccgagtgc 540 ctgaggcggc acaagtacag agtggagaag gccgccagag gcggcagaga ccctggcggc 600 ggaggaggag aggagggcgg agccggcgga ctgttctga 639 <210> 13 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 atggcctccc tgttctctgg ccgcatcctg atccgcaaca atagcgacca ggacgagctg 60 gatacggagg ctgaggtcag tcgcaggctg gagaaccggc tggtgctgct gttctttggt 120 gctggggctt gtccacagtg ccaggccttc gtgcccatcc tcaaggactt cttcgtgcgg 180 ctcacagatg agttctatgt actgcgggcg gctcagctgg ccctggtgta cgtgtcccag 240 gactccacgg aggagcagca ggacctgttc ctcaaggaca tgccaaagaa atggcttttc 300 ctgccctttg aggatgatct gaggaggtga 330 <210> 14 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recoded coding region <400> 14 atggccagcc tgttcagcgg ccggatcctg atcaggaaca acagcgacca ggacgagctg 60 gacaccgagg ccgaagtgag caggaggctg gagaacagac tggtgctgct gttctttggc 120 gccggagcct gccctcagtg ccaggccttc gtgcccatcc tgaaggattt ctttgtgcgg 180 ctgaccgacg agttctacgt gctgagagcc gcccagctgg ccctggtgta tgtgagccag 240 gacagcaccg aggagcagca ggacctgttc ctgaaggaca tgcccaagaa gtggctgttc 300 ctgcccttcg aggacgacct gcggagatga 330 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp 1 5 10 15

Claims (57)

  1. N-말단 신호 서열을 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 RdCVF 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산으로서,
    상기 RdCVF 코딩 서열은 재코딩된 핵산 서열로서, 적어도 하나의 선천성 코돈이 선천성 코돈과 동일한 아미노산을 코딩하는 상이한 코돈으로 변경되며,
    상기 RdCVF 단백질은 인간 RdCVF 단백질이고,
    상기 N-말단 신호 서열은 Igk 신호 서열인, 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 상기 RdCVF 단백질은 RdCVF1 단백질인, 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 상기 RdCVF 단백질은 RdCVF2 단백질인, 핵산.
  4. 제1항에 있어서, 상기 RdCVF 단백질은 단(short) 형태의 RdCVF 단백질인, 핵산
  5. 제1항에 있어서, 상기 RdCVF 단백질은 장(long) 형태의 RdCVF 단백질인, 핵산.
  6. 제1항에 있어서, 상기 RdCVF 단백질은 인간 RdCVF1-장인, 핵산.
  7. 제1항에 있어서, 상기 재코딩된 뉴클레오타이드 서열은 개시 메티오닌 코돈이 없는 것인, 핵산.
  8. 제1항에 있어서, 상기 RdCVF 단백질에 대한 코딩 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 106 내지 741, 서열번호 1의 뉴클레오타드 106 내지 429; 서열번호 3의 뉴클레오타이드 106 내지 432; 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 106 내지 744를 포함하는, 핵산.
  9. 제1항에 있어서, 상기 신호 서열은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 105를 포함하는, 핵산.
  10. 제1항에 있어서, 상기 신호 서열은 서열번호 15를 포함하는 아미노산 서열; 서열번호 2의 아미노산 2 내지 34; 서열번호 2의 아미노산 7 내지 21을 코딩하는, 핵산.
  11. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 또는 서열번호 3인, 핵산.
  12. 제1항에 있어서, 상기 재코딩된 뉴클레오타이드 서열은 재코딩된 코돈들을 적어도 40% 갖는, 핵산.
  13. 제1항에 있어서, 상기 재코딩된 뉴클레오타이드 서열은 상응하는 천연 뉴클레오타이드 서열과 비교하여 상이한 뉴클레오타이드들을 적어도 15%를 갖는, 핵산.
  14. 제1항에 있어서, 상기 재코딩된 뉴클레오타이드 서열은 상응하는 천연 뉴클레오타이드 서열과 90% 미만의 동일성을 갖는, 핵산.
  15. 제1항에 있어서, 상기 재코딩된 뉴클레오타이드 서열은 원핵생물(procarya) 억제 모티프들 없음, 컨센서스 스플라이스 도너 부위들(consensus splice donor site) 없음, 크립틱(cryptic) 스플라이스 도너 부위들 없음 및 GC 함량이 60 내지 65%인 것으로 이루어진 특징들 중 하나 이상을 갖는, 핵산.
  16. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 서열번호 11, 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 150 내지 2080 또는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 150 내지 812, 820 내지 1312 및 1340 내지 2080을 포함하는, 핵산.
  17. 제1항의 핵산을 포함하는 바이러스 벡터.
  18. 제17항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터인, 바이러스 벡터.
  19. 제18항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV 혈청형(serotype) 2에 기초한 것인, 바이러스 벡터.
  20. 제18항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV 혈청형 8에 기초한 것인, 바이러스 벡터.
  21. 제1항의 핵산을 포함하는 분리된 세포로서, 상기 세포는 RdCVF 단백질을 분비하는, 분리된 세포.
  22. 포유동물의 눈에서 안구 간상 세포를 보존하는 약학적 제제로서,
    상기 포유동물은 망막 이영양증, 스타르카르트병, 망막색소변성증, 건성 노화 관련 황반변성(건성 AMD), 지도상 위축증(건성 AMD의 발달 단계), 습성 노화 관련 황반변성(습성 AMD), 녹내장/안내압 항진, 당뇨망막병증, 바르데-비들 증후군, 바센-코르츠바이크 증후군, 베스트 질환(Best disease), 맥락막 결여, 우곡상 위축증, 선천성 흑암시, 레프섬 증후군(refsun syndrome), 어셔 증후군(Usher syndrome), 갑상선 관련 눈 질환, 그레이브스 병, 망막 색소 상피 세포 관련 질병, 전안부 세그먼트 질환, 수정체 질환/백내장, 안배 장애(eye cup disorder) 및 포도막염으로 이루어진 군에서 선택된 눈 질환을 앓으며,
    상기 약학적 제제는 (ⅰ)약학적으로 허용되는 담체 및 (ⅱ)제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산, 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터 또는 이들의 조합을 포함하는 약학적 제제.
  23. 제22항에 있어서, 상기 바이러스 벡터 또는 상기 핵산은 유리체내 주입, 눈의 전실 내 주입, 결막하 주입 또는 서브테논 주입을 위해 제제화 된 것인, 약학적 제제.
  24. 제22항에 있어서, 상기 포유동물은 인간인, 약학적 제제.
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