JP7061067B2 - クリグラー・ナジャー症候群の処置のための組成物 - Google Patents

Description

本発明は、ＵＧＴ１Ａ１（例えばヒトＵＧＴ１Ａ１を発現する）をコードするポリヌクレオチド配列（例えば遺伝子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）を提供する。本発明はさらに、末端逆位配列、及び１種又はそれ以上の発現制御配列（例えば肝特異的プロモーターを含む発現制御配列）に操作可能に連結されているＵＧＴ１ Ａ１コーディング配列を含むベクターゲノムを有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えばＡＡＶ８）のようなベクターを提供する。これらＡＡＶベクターを含む組成物、並びにクリグラー・ナジャー症候群Ｉ型、クリグラー・ナジャー症候群ＩＩ型及びジルベール症候群の処置方法もまた提供される。

電子形式で提出される資料の引用による組み込み
発明者は、これとともに電子形式で申請される配列表資料を引用することによりここに組み込んだ。該ファイルは「ＵＰＮ＿１６－７６８５ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と表示される。

クリグラー・ナジャー（ＣＮ）症候群は、ウリジン二リン酸グルクロン酸転移酵素１Ａ１（ＵＧＴ１Ａ１）遺伝子のコーディング配列中の多様な変化により引き起こされる、ビリルビン代謝の常染色体劣性障害である。ＵＧＴ１Ａ１活性の全喪失並びに生じる重度の黄疸及び神経学的後遺症（核黄疸）の危険性はＣＮ Ｉ型と関連している。数種の薬物が黄疸をわずかに低下させ得るとはいえ、大部分の現在の医学的管理は１日あたり最低１２時間の光線療法に頼る。しかしながら、光線療法は思春期後に急速に有効性が低下し、核黄疸の危険性を増大させ、及び前記疾患を制御するため肝移植が必要になる。肝移植は、患者に対し危険で、かつ、免疫抑制を必要とするため、最適でない。加えて、これら患者はときに１０～１３歳までに肝移植を必要とするため、複数の移植片が彼らの人生の経過全体で必要とされうる。

天然に存在するＧｕｎｎラット、及び、Ｇｕｎｎラットに存在する同一の突然変異を有する前記疾患のより最近のノックインマウスモデルを含む、前記疾患の多様な動物モデルが存在する（非特許文献１）。Ｇｕｎｎラットは血清中のビリルビンレベルが高く、小脳形成不全を有し、ＣＮマウスははるかにより重度の表現型を有し、及び光線療法又は遺伝子治療で迅速に未処置場合は出生後間もなく死亡する（非特許文献１）。ＣＮのための遺伝子に基づく治療を開発することを目的とされる以前の研究は、治療的有効性が、肝に送達されるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して達成され得ることを示した（非特許文献１；非特許文献２）。上で引用されるＢｏｔｏｌｕｓｓｉらはＣＮ症候群の致死性マウスモデルでの研究を説明し、並びに、ＵＧＴ１Ａ１の正常肝の５ないし８％と同じくらい低い発現及び活性レベルが、ビリルビンレベルを大きく低下させ及び生涯の低血漿ビリルビン濃度を維持するのに十分であったことを報告する。

ＣＮ ＩＩ型は、肝ビリルビングルクロン酸転移酵素の誘導可能な活性低下による非抱合型高ビリルビン血症を特徴とする。同様に、ジルベール症候群は、グルクロン酸転移酵素の活性低下により引き起こされる非抱合型高ビリルビン血症を特徴とする。

ＣＮ症候群Ｉ及びＩＩ型ならびにジルベール症候群の処置のため、並びに／又は肝移植なしでの若しくは肝移植の失敗に加えての被験者の最も早い年齢を遅延させるための治療が当該分野で必要とされる。

Ｂｏｒｔｏｌｕｓｓｉら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、２０１２、２６：１０５２－１０６２ Ｓｅｐｐｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００６、１３（６）：１０８５－１０９２

本発明は、ＵＧＴ１Ａ１（例えば、ＵＧＴ１Ａ１コーディング配列、例えばヒトＵＧＴ１Ａ１を発現するポリヌクレオチド）をコードするポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ分子）を特徴とする。

別の局面において、ベクター（例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えばＡＡＶ８ベクター））が提供される。一部の態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）を有するベクターゲノム及びＵＧＴ１Ａ１コーディング配列（例えばＵＧＴ１Ａ１コーディング配列を含む核酸配列）を含む。ＵＧＴ１Ａコーディング配列は、１種又はそれ以上の発現制御配列（例えば肝特異的プロモーターを含む１又はそれ以上の発現制御配列）に操作可能に連結する場合がある。一部の態様において、ＡＡＶベクター（例えばＡＡＶ８ベクター）は、天然の分泌シグナルの代わりに用いられる異種分泌シグナルを有するベクターゲノムを有する。該ベクターゲノムは複数のエンハンサーを有する場合がある。

一局面において、例えばクリグラー・ナジャー（ＣＮ）症候群Ｉ、ＣＮ ＩＩ及びジルベール症候群を含むＵＧＴ１Ａ１機能の喪失と関連する疾患を処置するための組成物及び方法で有用なＵＧＴ１Ａ１コーディング配列が提供される。該配列は：（ａ）配列番号１２；（ｂ）配列番号１４；（ｃ）配列番号１３；（ｄ）配列番号４；（ｂ）配列番号３；（ｃ）配列番号２；若しくは（ｄ）配列番号１；その相補鎖、対応するＲＮＡ、又はヒトＵＧＴ１Ａ１を発現するそれに９９％同一の配列から選択される。

別の局面において、本発明は、ヒトＵＧＴ１Ａ１の転写及び／又は発現を指図する発現制御配列に操作可能に連結されている、本明細書で同定されるところのＵＧＴ１Ａ１コーディング配列を含むベクターゲノムを有するベクターを提供する。ある態様において、該ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。なお他の態様において、ベクターはＡＡＶ８キャプシドを有する。ある態様において、発現制御配列は肝特異的プロモーターを含む。

なお他の態様において、本明細書に説明されるところのベクターを含む組成物は製剤緩衝液中で提供される。さらなる一局面において、先行する態様のいずれかのＡＡＶベクターを製剤緩衝液（例えばリン酸緩衝生理的食塩水及び界面活性剤を含む製剤緩衝液）中に含む組成物が提供される。一部の場合において、ＡＡＶベクターは、ヒトＵＧＴ１Ａタンパク質をコードする遺伝子及び製薬学的に許容できる賦形剤、担体、緩衝剤又は保存剤を有する。

別の局面において、先行するＡＡＶベクター（例えばＡＡＶ８ベクター）及び／又は組成物のいずれも、クリグラー・ナジャー（ＣＮ）症候群（例えばＣＮ症候群Ｉ型若しくはＣＮ症候群ＩＩ型）又はジルベール症候群を有する（単数又は複数の）患者の処置における使用のための場合がある。一部の場合において、患者は免疫抑制剤及び／又は光線療法で同時処置される。

ある態様において、本明細書に説明されるＵＧＴ１Ａ１コーディング配列でのクリグラ
ー・ナジャー症候群Ｉ若しくはＩＩ型又はジルベール症候群の処置におけるＵＧＴ１Ａ１コーディング配列の使用。さらなる一局面において、ヒトＵＧＴ１Ａタンパク質をコードする遺伝子を運搬するＡＡＶ及び製薬学的に許容できる賦形剤、担体、緩衝剤又は保存剤を含む組成物が提供される。

なお別の局面において、クリグラー・ナジャー症候群Ｉ若しくはＩＩ型又はジルベール症候群の処置のための本明細書に説明されるところのｒＡＡＶベクターを含む組成物が提供される。クリグラー・ナジャー症候群Ｉ若しくはＩＩ型又はジルベール症候群の処置方法もまた説明される。ある態様において、患者は免疫抑制剤及び／又は光線療法で同時処置される。

ＡＡＶ投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスからの肝ホモジェネート中のｈＵＧＴ１Ａ１発現についてのウエスタンブロットの定量である。オス及びメスＣ５７ＢＬ／６マウスに、３×１０¹²ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇの、異なるコドン及び異なるＣｐＧなし（ＣｐＧ ｌｅｓｓ）ヌクレオチド配列を有する多様なベクターからｈＵＧＴ１Ａ１を発現するベクターを、尾静脈を介して静脈内（ＩＶ）注入した。剖検時に肝を回収し及び肝ホモジェネートを作成した。肝ホモジェネートから単離された１μｇのタンパク質を、検出のため使用されるヒトＵＧＴ１Ａ１特異的抗体を用いるウエスタンブロットにより解析した。バンドの画像を、陽性対照サンプルからの同一量のタンパク質に対し定量した。値を平均±ＳＥＭ（ｎ＝５マウス／群）としてプロットした。Ｍ、オス；Ｆ、メス；ＷＰＲＥ、第１世代ベクターＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨを示す。 出生後２４時間以内のＵＧＴ１ノックアウト（ＫＯ）マウス中への試験薬剤のＩＶ注入後の未処置ＵＧＴ１ ＫＯマウス（そのいずれも第７日まで生存しなかった）及びＡＡＶ処置されたＵＧＴ１ノックアウトマウスを示す生存グラフである。未処置ＵＧＴ１ ＫＯマウスを出生時から毎日観察した。死亡してみつかったか臨床徴候のため安楽死されたかのいずれかのマウスを遺伝子型分類した。処置されたＵＧＴ１ ＫＯマウスに１０¹¹ＧＣ／マウスのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨをＩＶ注入した。 出生後２４時間以内のＡＡＶのＩＶ注入後のＵＧＴ１ ＫＯ及び光線療法後のＵＧＴ１ ＫＯマウスにおける血清総ビリルビンレベルを示す。 血清中の総ビリルビンレベルを出生後第２８日に測定した。ＵＧＴ１ ＫＯマウスを、ＡＡＶ処置又は光線療法いずれかにより成体までレスキューした。ＡＡＶ処置されたＵＧＴ１ ＫＯマウスに、出生後２４時間以内に１０¹¹ＧＣ／マウスのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨをＩＶ注入した（ｎ＝５）。光線療法レスキューされたＵＧＴ１ ＫＯマウスは、出生直後に出生後最長２１日までの間１日あたり１２時間光線療法に曝露した（青色蛍光、λ＝４５０ｎｍ；１０～３０μＷ／ｃｍ²／ｎｍ）（ｎ＝５２）。全部のマウスを離乳時に遺伝子型分類した １０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｅＧＦＰ．ＢＧＨのＩＶ注入後のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス、Ｗｉｓｔａｒラット及びＮＨＰにおけるｅＧＦＰ発現を提供する。図４Ａ。肝臓内のｅＧＦＰ発現を領域形質導入のパーセンテージとして定量した。図４Ｂ。ＤＮＡをＧＣの定量のため抽出した。値を平均±ＳＥＭとしてプロットした。ＮＤ、測定されない。 ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨのＩＶ注入後のＧｕｎｎラットにおける血清総ビリルビンレベルの低下を示す線グラフである。４週齢メス及びオスＧｕｎｎラットに、３×１０¹²ＧＣ／ｋｇ（三角）又は３×１０¹³ＧＣ／ｋｇ（正方形）のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨ又はベヒクル対照（リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ））（丸）をＩＶ注入した。総ビリルビンレベルを血清中で測定し、及びベースライン総ビリルビン値のパーセンテージを計算した。値は平均±ＳＥＭとして提示する。 試験又は対照薬剤を注入されたアカゲザル由来肝臓中のｈＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ転写物レベルを示す棒グラフである。アカゲザルに、１．０×１０¹³ＧＣ／ｋｇ及び２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ｍｏｄ．ＢＧＨ（図中でＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏと称される）又は対照薬剤（ベヒクル対照）をＩＶ注入した。剖検時に肝の左、中及び右葉からのサンプルを回収し急速凍結した。ＲＮＡをベクター転写物レベルの定量のため抽出した。図６Ａは１００ｎｇのＲＮＡあたり提示されるｈＵＧＴ１Ａ１ ＲＮＡコピーを示す。図６ＢはｈＵＧＴ１Ａ１ ＲＮＡの補正済み相対発現のレベルを示す。値は平均±ＳＥＭとしてプロットした（ｎ＝３肝サンプル／動物）。 試験又は対照薬剤を注入されたＵＧＴ１ ＫＯマウスにおける総ビリルリンレベル。オス及びメスＵＧＴ１ ＫＯマウスに、２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇ及び２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ｍｏｄ．ＢＧＨ（図中でＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏと称される）又は対照薬剤（１００μｌのベヒクル対照）をＩＶ注入した。総ビリルビンレベルを採取された血清サンプル中で測定した。値は平均±ＳＥＭとして表現した。 試験又は対照薬剤を注入されたＵＧＴ１ ＫＯマウスからの肝ホモジェネート中のｈＵＧＴ１Ａ１発現についてのウエスタンブロットの定量を示す棒グラフである。オス及びメスＵＧＴ１ ＫＯマウスに、２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇ及び２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ｍｏｄ．ＢＧＨ（図中でＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏと称される）又は対照薬剤（１００μｌのベヒクル対照）をＩＶ注入した。剖検時に肝を回収し肝ホモジェネートを作成した。肝ホモジェネートから単離された１μｇのタンパク質を、検出のため使用されるヒトＵＧＴ１Ａ１特異的抗体を用いるウエスタンブロットにより解析した。バンドの画像を陽性対照サンプルからの同一量のタンパク質に対し定量した。値は平均±ＳＥＭとしてプロットした（ｎ＝５マウス／群）。２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇを注入されたオスマウスについてのバンドは検出限界より下であった。 試験又は対照薬剤を注入されたＵＧＴ１ ＫＯマウスからの肝臓内のｈＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ転写物レベルを示す棒グラフである。オス及びメスＵＧＴ１ ＫＯマウスに、２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇ及び２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨ（図中でＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏと称される）又は対照薬剤（１００μｌのベヒクル対照）をＩＶ注入した。剖検時に肝を回収し急速凍結した。ＲＮＡをベクター転写物レベルの定量のため抽出した。（Ａ）１００ｎｇのＲＮＡあたり提示されるｈＵＧＴ１Ａ１ ＲＮＡのコピー。値は平均±ＳＥＭとしてプロットした（ｎ＝マウス５尾／群）。 試験又は対照薬剤を注入されたＵＧＴ１ ＫＯマウスからの肝臓内のｈＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ転写物レベルを示す棒グラフである。オス及びメスＵＧＴ１ ＫＯマウスに、２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇ及び２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨ（図中でＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏと称される）又は対照薬剤（１００μｌのベヒクル対照）をＩＶ注入した。剖検時に肝を回収し急速凍結した。ＲＮＡをベクター転写物レベルの定量のため抽出した。（Ｂ）ｈＵＧＴ１Ａ１ ＲＮＡの補正済み相対発現のレベル。値は平均±ＳＥＭとしてプロットした（ｎ＝マウス５尾／群）。 本明細書に提供される新規ＵＴＧ１Ａ１コーディング配列：Ｕ２０１ＤＰ［配列番号３］、Ｕ００１［配列番号１］、Ｕ０１１ＴＹ［配列番号２］及びＵＧＴ１Ａ１ｃｏ［配列番号４］の、ｖ２．１［配列番号７］及びｖ３［配列番号８］と称される２種の公表されたＵＧＴ１Ａ１配列とのアライメントを提供する。

［発明の詳細な説明］
本発明は、クリグラー・ナジャー（ＣＮ）症候群Ｉ若しくはＩＩ又はジルベール症候群と診断された患者（ヒト被験者）の肝細胞にＵＧＴ１Ａ１遺伝子を送達するための複製欠損アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の使用に関する。ＵＧＴ１Ａ１遺伝子を送達するために使用される組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）（「ｒＡＡＶ．ＵＧＴ１Ａ１」）は、肝に対する指向性を有すべきである（例えばＡＡＶ８キャプシドを担持するｒＡＡＶ）。導入遺伝子は肝特異的発現調節エレメントにより制御されうる。こうしたｒＡＡＶ．ＵＧＴ１Ａ１ベクターは、肝における治療レベルのＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現を達成するため静ＩＶ注入により投与する場合がある。ｒＡＡＶ．ＵＧＴ１Ａ１の治療上有効な用量は２．５×１０¹⁰ないし２．５×１０¹³ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇ患者体重の範囲にわたる。一態様において、ｒＡＡＶ懸濁液は、ＣＮのマウスモデルに投与される最低２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇという用量が総ビリルビンレベルのベースラインレベルへの復帰を提供する効力を有する。別の態様において、ｒＡＡＶ懸濁液は、それの必要なヒト被験者に投与される最低２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇという用量が総ビリルビンレベルの治療上有効な低下を提供する効力を有する。場合によっては、被験者は治療とともに免疫抑制剤を投与される。

「処置する」、「処置する（こと）」及び「処置」という用語は、一部若しくは全部の症状の進行を低下させること、一部若しくは全部の症状の重症度を低下させること、又は一部若しくは全部の症状の発症を予防若しくは遅延させることを指す。

処置の目標は、ｒＡＡＶに基づく肝に向けられる遺伝子治療を介して患者の欠損しているＵＴＧ１Ａ１を機能的に置換してこの疾患を処置し及び現在の処置に対する応答を改良することである。本発明は、部分的に、有効用量の安全な送達を見込む治療組成物及び方法；並びにヒト被験者における有効な投薬のための精製製造要件を満たすための改良された製造方法の開発に基づく。

前記治療の有効性は、処置後例えば投与後に、患者におけるヒトＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子発現についての代理バイオマーカーとして総ビリルビンレベル及び／又は血清ビリルビンレベルを使用して評価する場合がある。例えば、遺伝子治療処置後の総ビリルビンレベル又は血清ビリルビンレベルの低下が機能的ＵＧＴ１Ａ１の成功裏の形質導入を示すとみられる。処置のための候補である患者は、ＣＮ症候群Ｉ又はＩＩと診断された新生児、乳幼児、小児及び成体（１８歳以上の男性又は女性）を含む。処置前に、患者を、ＵＧＴ１Ａ遺伝子を送達するために使用されるＡＡＶ血清型に対する中和抗体（ＮＡｂ）について評価する場合がある。加えて、又は、あるいは、患者を上昇された肝酵素について監視し、それらは一過性免疫抑制療法で処置する場合がある（例えば、ベースラインレベルの最低約２倍のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）又はアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）が観察される場合）。

本明細書で使用される野生型「ＵＧＴ１Ａ１」という用語は、配列番号５に示される野生型ヒトＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ１ファミリー１、ポリペプチドＡ、（ＵＧＴ１Ａ１）ｃＤＮＡ（ＵＧＴ１Ａ１ヒトについてのｍＲＮＡのＣＤＳの参照配列である受託番号ＮＭ ０００４６３．２；ＯＭＩＭ参照１９１７４０）を指す。コードされる酵
素を配列番号６に示す。

ヒト野生型配列すなわち配列番号５に９５％未満同一である配列を有するＵＧＴ１Ａ１酵素をコードする核酸配列が本明細書に提供される。より具体的には、本明細書に提供される配列は、ヒト野生型配列に９０％未満同一、８５％未満同一、８０％未満同一若しくは約６０％と同じくらい低く同一、又は約７０％ないし９５％同一の場合がある。

一態様において、ヒトＵＧＴ１Ａ１コーディング配列は、Ｕ００１［配列番号１］、Ｕ００１ｍｏｄ［配列番号１３］、Ｕ０１１ＴＹ［配列番号２］、Ｕ０１１ＴＹｍｏｄ［配列番号１４］、Ｕ２０１ＤＰ［配列番号３］、Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ［配列番号１２］又は配列番号４の配列から選択される。ある態様において、配列番号１－１４、１２－１４の１つに対する最低９９％の同一性を有する配列、これら配列を本明細書に説明されるのベクター中で使用する場合がある。

ある態様において、ベクターゲノムのため選択される操作されたｈＵＧＴ１Ａ１コーディング配列は配列番号４のものである。この配列は野生型ヒトＵＧＴ１Ａ１遺伝子［配列番号５に再現される］に対する約８０％未満の同一性、及び以前に公表された操作された配列に対しそれぞれ約９５％未満の同一性又は９０％の同一性を有することが適切である。本明細書に提供される配列は、本明細書の実施例に具体的に説明されるＡＡＶ８に媒介される送達及びベクターゲノムからの発現にとりわけ十分に適する。

ある態様において、ＵＧＴ１Ａ１コーディング配列は配列番号１２である。この配列は配列番号３に対する約９９％の同一性を有する。しかしながら、この配列は野生型ヒトＵＧＴ１Ａ１遺伝子［配列番号５に再現される］に対し約８５％未満同一、及び以前に公表された操作された配列に対しそれぞれ約９５％未満の同一性である。本明細書に提供される配列は、本明細書の実施例に具体的に説明されるＡＡＶ８に媒介される送達及びベクターゲノムからの発現にとりわけ十分に適する。

ある態様において、本明細書に提供されるところのベクターゲノムは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、２個のエンハンサー、１個のプロモーター、１個のイントロン、１個のリンカー配列、ＣＮコーディング配列、１個のポリＡ及び１個のＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。ある態様において、ＩＴＲはＡＡＶキャプシド（例えばＡＡＶ８）と異なる供給源であるＡＡＶ２からである。ある態様において、２個のエンハンサーは２コピーの同一エンハンサー例えばαｍｉｃ／ｂｉｋである。ある態様において、プロモーターは肝特異的プロモーター（例えばＴＢＧプロモーターである）。ある態様において、ベクターゲノムはコサック配列をさらに含む。ある態様において、ポリＡはウシ成長ホルモンポリＡである。具体的に説明されるベクターゲノムは、配列番号９のｎｔ １ないし３５５８、配列番号１０のｎｔ １ないし３１５３、配列番号１５［ＡＡＶ．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨ］のｎｔ １ないし３１４０、配列番号１６［ＡＡＶ．ＴＢＧ．Ｕ０１１ＴＹｍｏｄ．ＢＧＨ］のｎｔ １ないし３１４０、配列番号１７［ＡＡＶ．ＴＢＧ．Ｕ００１ｍｏｄ．ＢＧＨ］のｎｔ １ないし３１４０として本明細書に提供される。本明細書に提供されるこれら配列は、ＡＡＶに媒介される送達及び具体的にはＡＡＶ８に媒介される送達にとりわけ十分に適する。例えば、ＡＡＶ８に基づくベクターＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨが第２世代のベクターとして実施例で具体的に説明され（すなわち図６－９の図／図の説明中のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ；）及び配列番号１０のｎｔ １－３１５３のベクターゲノムを有するＡＡＶ８に基づくベクターが図１－５に示される研究で具体的に説明される。

本明細書で使用されるところの「ＮＡｂ力価」という用語は、その標的とされるエピトープ（例えばＡＡＶ）の生理学的影響を中和する中和抗体（例えば抗ＡＡＶ ＮＡｂ）が
どのくらい多く産生されるかの程度を指す。抗ＡＡＶ ＮＡｂ力価は、例えばＣａｌｃｅｄｏ，Ｒ．ら、Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、２００９．１９９（３）：ｐ．３８１－３９０（本明細書に引用することにより組み込まれる）に説明されるとおり測定する場合がある。

核酸配列の文脈における「同一性パーセント（％）」、「配列同一性」、「配列同一性パーセント」又は「同一のパーセント」という用語は、対応のため整列される場合に同一である２本の配列中の塩基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの完全長、遺伝子コーディング配列の完全長、若しくは最低約５００ないし５０００個のヌクレオチドのフラグメント、又は所望のとおりにわたることができる。しかしながら、例えば最低約９個のヌクレオチド、通常は最低約２０ないし２４個のヌクレオチド、最低約２８ないし３２個のヌクレオチド、最低約３６個又はそれ以上のヌクレオチドのより小さいフラグメント間の同一性もまた望ましいことができる。複数配列アライメントプログラムもまた核酸配列について利用可能である。こうしたプログラムの例は、インターネット上のウェブサーバーを通じてアクセス可能である「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」及び「ＭＥＭＥ」を含む。こうしたプログラムの他の供給源は当業者に既知である。あるいはＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。上で説明されるプログラムに含有されるものを含む、ヌクレオチド配列の同一性を評価するために使用する場合がある当該技術分野で既知の多数のアルゴリズムもまた存在する。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１中のプログラムＦａｓｔａ^TMを使用して比較する場合がある。Ｆａｓｔａ^TMはクエリ及び検索配列の間の最良の重なりの領域のアライメント及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、引用することにより本明細書に組み込まれる、ＧＣＧバージョン６．１中に提供されるところのそのデフォルトのパラメータ（６のワードサイズ（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ）及びスコアリングマトリックス（ｓｃｏｒｉｎｇ ｍａｔｒｉｘ）についてのＮＯＰＡＭファクター）を用いてＦａｓｔａ^TMを使用して決定する場合がある。

同一性パーセントは、タンパク質の完全長、ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸若しくはそのペプチドフラグメントにわたるアミノ酸配列、又は対応する核酸配列コーディングシーケンサーについて容易に決定する場合がある。適切なアミノ酸フラグメントは長さが最低約８個のアミノ酸であることができ、及び約７００個のアミノ酸までの場合がある。一般に、２個の異なる配列間の「同一性」、「相同性」又は「類似性」を指す場合、「同一性」、「相同性」又は「類似性」は「整列された」配列に関して決定する。「整列された」配列又は「アライメント」は、参照配列に比較して欠けている又は付加的な塩基又はアミノ酸についての補正をしばしば含む、複数の核酸配列又はタンパク質（アミノ酸）配列を指す。アライメントは、多様な公的に又は商業的に利用可能な複数配列アライメントプログラム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）のいずれかを使用して実施する。配列アライメントプログラム例えば「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」及び「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムはアミノ酸配列について利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれもデフォルトの設定で使用されるとはいえ、当業者はこれらの設定を必要とされるとおり変えることができる。あるいは、当業者は、参照されるアルゴリズム及びプログラムにより提供されるもののような同一性又はアライメントのレベルを少なくとも提供する別のアルゴリズム又はコンピュータープログラムを利用する場合がある。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．、“Ａ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”、２７（１３）：２
６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。

本明細書で使用されるところの「機能的フラグメント」は、ヒト又はノックアウトマウスにおけるＵＧＴ１Ａ１関連疾患の症状を処置するのに十分である、参照されるポリヌクレオチドの一部分又は参照される配列に対する最低９５％（例えば最低９９％）の同一性を有する配列を指す。

発現カセットは典型的に発現制御配列の一部としてプロモーター配列を含む。一態様において、組織特異的プロモーターを選択する。本明細書で使用されるところの「組織特異的プロモーター」は、単一の種類の組織又は細胞型の選択された１サブセットでのみ活性を有するプロモーターである。これは、事実上全部の組織中で発現を指図し並びに環境及び発達因子に完全にではない場合ほとんど依存しない構成的プロモーターとよい対比をなす。プロモーター活性は、最低１種の参照組織と比較した、該プロモーターに操作可能に連結されている遺伝子の転写レベルを評価することにより（例えばＰＣＲ技術を使用してｍＲＮＡレベルを検出することにより）及び／又は最低１種の参照組織と比較した標的組織中の前記遺伝子産物の発現レベルを評価することにより評価する場合がある。従って、所定の１プロモーターが、最低１種の参照組織中の活性のその欠如により及び／又は最低１種の参照組織と比較して選択された組織中のその活性によりのいずれかで組織特異的であることを決定することが可能な場合がある。多様なアッセイが転写及び発現レベルを評価するために当該技術分野で既知である。従って、「肝特異的プロモーター」について、アッセイベースラインより上の活性レベルを肝において検出する場合がある一方、別の参照組織で評価される場合に活性が検出されない。特異性はプロモーター間で変動する場合がある。他の組織中で検出可能な転写又は発現を表さない組織特異的プロモーターが存在する場合がある一方、一部は、最低１種の参照組織に比較して標的組織中でより高い転写並びに／又は発現レベル（例えば最低１０％ないし１００％、最低２５％より高い、最低３０％より高い、最低５０％より高い、最低７５％より高い、最低８０％より高い、最低９０％より高い及びそれらの間の量）を表す場合がある。ある態様において、筋を、疑われる「肝特異的プロモーター」（例えばＴＢＧ）との比較のための参照組織として選択する場合がある。本発明のある態様において、肝特異的プロモーターを選択する。例えば、Ｔｈｅ Ｌｉｖｅｒ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ｈｔｔｐ：／／ｒｕｌａｉ．ｓｃｈｌ．ｅｄｕ／ＬＳＰＤ又はｈｔｔｐｓ：／／ｃｂｌ．ｕｔｄａｌｌａｓ．ｅｄｕ／－ＬＳＰＤ／ｉｎｄｅｘを参照されたい。肝特異的プロモーターは、チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、α１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）；ヒトアルブミン Ｍｉｙａｔａｋｅら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７１：５１２４ ３２（１９９７）、ｈｕｍＡｌｂ；及びＢ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Ｓａｎｄｉｇら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３：１００２ ９（１９９６）］’ ＴＴＲミニマルエンハンサー／プロモーター、αアンチトリプシンプロモーター、及びＬＳＰ（８４５ｎｔ）２５（イントロンなしｓｃＡＡＶを必要とする）、アルコール脱水素酵素１、アルコール脱水素酵素２、アルコール脱水素酵素３、アルコール脱水素酵素４、アルドラーゼＢ、αフィブリノーゲン、α－１－ミクログロブリン／ビクニン（ｍｉｃ／ｂｉｋ）前駆体、α－２－マクログロブリン、α－２－尿グロブリン、αフェトプロテイン、アンジオテンシノーゲン、アンチトロンビン、アンチトロンビンｉｉｉ、アポリポタンパク質Ａ－Ｉ、アポリポタンパク質Ａ－ＩＩ、アポリポタンパク質Ｂ、アポリポタンパク質Ｃ－ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ｅ、アルギナーゼ、芳香族Ｌ－アミノ酸脱炭酸酵素、βフィブリノーゲン、胆汁糖タンパク質。Ｃ反応性蛋白質、Ｃ４ｂ結合タンパク質α鎖、カルバモイルリン酸合成酵素Ｉ、カテコール－Ｏ－メチルトランスフェエラーゼ、補体成分Ｃ６、チトクロームＰ４５０ ２Ｅ１、エリスロポエチン、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、γフィブリノーゲン、グルコース－６－ホスファターゼ、ハプトグロビン、肝リパーゼ、インスリン受容体、インスリン様成長因子結合タンパク質Ｉ、インスリン様成長因子ＩＩ、中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素、多剤耐性
タンパク質２、プロテインＣ阻害剤、プロテインＣ、血清アミロイドＡ、チロキシン結合グロブリン、トランスフェリン並びにビタミンＤ結合タンパク質を含む。あるいは、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば第ＷＯ ２０１１／１２６８０８号明細書及び第ＷＯ ２０１３／０４９４３号明細書を参照されたい］、又は生理学的合図に応答性のプロモーターのような他のプロモーターを、本明細書に説明されるベクター中で利用する場合がある。

プロモーターに加え、発現カセット及び／又はベクターは、他の適切な転写開始、終止、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルのような効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコサックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；並びに所望の場合はコードされる産物の分泌を高める配列を含有する場合がある。適切なポリＡ配列の例は、例えばＳＶ４０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）及びＴＫポリＡを含む。適切なエンハンサーの例は、例えば、とりわけ、αフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲミニマルプロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ結合グロブリンプロモーター／α１ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）を含む。一態様において、発現カセットはウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）をさらに含む。他の態様において、ベクターはＷＰＲＥエレメントを含有しない。なお他の態様において、ベクターはＣｐＧ部位を減少させるよう改変されている。

一態様において、発現カセットはイントロン、例えばプロモーターとコーディング配列の間に配置されるイントロンを含む。イントロンはｍＲＮＡの安定性、５’キャップ形成及びタンパク質の産生を増大させるために導入する場合がある。特定の一態様において、核酸構築物はキメラＰｒｏｍｅｇａイントロンを含む。他のイントロンは、例えばヒトβグロビンｂ２（すなわちＨＢＢ２）イントロン、凝固因子ＩＸ（ＦＩＸ）イントロン、ＳＶ４０イントロン又はニワトリβグロビンイントロンを含む場合がある。

これら制御配列はＵＧＴ１Ａ１遺伝子配列に「操作可能に連結」される。本明細書で使用されるところの「操作可能に連結される」という用語は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列と、目的の遺伝子を制御するためにトランスで又は離れた位置で作用する発現制御配列との双方を指す。

発現カセットはウイルスベクターの製造に使用されるプラスミド上で操作する場合がある。発現カセットをＡＡＶウイルス粒子中にパッケージングするのに必要とされる最小配列は、キャプシドと同一ＡＡＶ起源のものの場合があるか、又は（例えばＡＡＶシュードタイプを製造するため）異なるＡＡＶ起源のものであるＡＡＶの５’及び３’末端逆位配列（ＩＴＲ）である。一態様において、ＡＡＶ２からのＩＴＲ配列又はその欠失バージョン（ΔＩＴＲ）を便宜的に及び規制上の承認の時期を早めるために使用する。あるいは、他のＡＡＶ供給源からのＩＴＲを選択する場合がある。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２からであり及びＡＡＶキャプシドが別のＡＡＶ供給源からである場合、生じるベクターはシュードタイピングされたと呼ぶことができる。典型的に、ＡＡＶベクターのための発現カセットは、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ＵＴＧ１Ａ１コーディング配列及びいずれかの制御配列及びＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。しかしながらこれら要素の他の構成が適する場合がある。Ｄ配列及び末端解離部位（ｔｒｓ）が欠失されているΔＩＴＲと称される短縮されたバージョンの５’ＩＴＲが説明されている。他の態様において、完全長のＡＡＶ ５’及び３’ＩＴＲを使用する。

「ｓｃ」という略語は自己相補性を指す。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列により運搬されるコーディング領域が分子内２本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するよう設計されている発現カセットを有するプラスミド又はベクターを指す。感染に際して、第２鎖の
細胞媒介性の合成を待機するよりむしろ、ｓｃＡＡＶの２本の相補性の半分が会合して、即座の複製及び転写の準備ができている１個の２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することができる。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙら、“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ） ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、（Ａｕｇｕｓｔ ２００１）、Ｖｏｌ ８、Ｎｕｍｂｅｒ １６、１２４８－１２５４ページを参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば米国特許第６，５９６，５３５号明細書；同第７，１２５，７１７号明細書；及び同第７，４５６，６８３号明細書（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）に説明されている。

ｒＡＡＶ．ｈＵＧＴ１Ａ１ベクターは肝に対する指向性を有すべきである（例えばＡＡＶ８キャプシドを担持するｒＡＡＶ）。該ベクターはヒト被験者中の注入に適切な緩衝液／担体中で配合する場合がある。該緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが包装又は注入チューブに付着することを予防するがしかしｉｎ ｖｉｖｏでのｒＡＡＶの結合活性を妨害しない成分を含む場合がある。

ＡＡＶウイルスベクターは、その中に標的細胞への送達のための核酸配列がパッケージングされているＡＡＶタンパク質キャプシドを有するＡＡＶヌクレアーゼ抵抗性粒子である。ＡＡＶキャプシドは、６０個のキャプシドタンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３から構成され、それらは選択されたＡＡＶに依存しておよそ１：１：１０ないし１：１：２０の比で正十二面体の対称に配置される。例えばＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２又はｒｈ８を含むＡＡＶ血清型を、ＡＡＶウイルスベクターのキャプシド（ＤＮアーゼ抵抗性ウイルス粒子）の供給源として選択する場合がある（例えば米国公開第２００７／００３６７６０明細書及び第２００９－０１９７３３８明細書、並びに第ＥＰ １３１０５７１号明細書を参照されたい）。国際公開第ＷＯ ２００３／０４２３９７号明細書（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７，７９０，４４９号明細書及び同第７，２８２，１９９号明細書（ＡＡＶ８）、国際公開第ＷＯ ２００５／０３３３２１号明細書、米国特許第７，９０６，１１１号明細書（ＡＡＶ９）、並びに国際公開第ＷＯ ２００６／１１０６８９号明細書及び第ＷＯ ２００３／０４２３９７号明細書（ｒｈ１０）もまた参照されたい。他の例は、国際公開第ＷＯ ２０１５／０１３３１３号明細書に説明されるもののような１種又はそれ以上のバリアントＶＰキャプシドタンパク質（ＶＰ）、例えば、高い肝指向性を提示するとして説明されているＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４及びＲＨＭ１５－６キャプシドバリアント、並びにその中に引用される文書を含む場合がある。国際公開第ＷＯ ２０１５／０１３３１３号明細書は、「改変されたキャプシド」を、キメラキャプシド、すなわち１種又はそれ以上の野生型ＡＡＶ ＶＰキャプシドタンパク質に由来する１種又はそれ以上のバリアントＶＰキャプシドタンパク質を含むキャプシドと称する。特定の一態様において、ＡＡＶベクターはキメラベクターであり、すなわち、そのキャプシドは最低２種の異なるＡＡＶ血清型に由来するＶＰキャプシドタンパク質を含むか、又はＶＰタンパク質領域若しくは最低２種のＡＡＶ血清型に由来するドメインを結合する最低１種のキメラＶＰタンパク質を含む。前述の文書はＡＡＶを生成するために選択する場合がある他のＡＡＶもまた説明し、それらのそれぞれは引用することにより組み込まれる。一部の態様において、ウイルスベクターでの使用のためのＡＡＶ ｃａｐを、前述のＡＡＶ Ｃａｐの１種又はそのコーディング核酸の突然変異誘発により（例えば挿入、欠失又は置換により）生成する場合がある。一部の態様において、ＡＡＶキャプシドは前述のＡＡＶキャプシドタンパク質の２又は３又は４種又はそれ以上からのドメインを含むキメラである。一部の態様にお
いて、ＡＡＶキャプシドは、２若しくは３種の異なるＡＡＶ又は組換えＡＡＶからのＶＰｌ、ＶＰ２及びＶＰ３単量体のモザイクである。一部の態様において、ｒＡＡＶ組成物は前述のｃａｐの１種以上を含む。

本明細書で使用されるところの「ＡＡＶ８キャプシド」は、本明細書に引用することにより組み込まれ及び配列番号１１にて再現されるＧｅｎＢａｎｋ受託：ＹＰ＿０７７１８０のコードされるアミノ酸配列を有するＡＡＶ８キャプシドを指す。ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＹＰ＿０７７１８０中の参照されるアミノ酸配列に対する約９９％の同一性（米国特許第７，２８２，１９９号明細書、同第７，７９０，４４９号明細書、同第８，３１９，４８０号明細書、同第８，９６２，３３０号明細書、同第８，９６２，３３２号明細書；例えば参照される配列から約１％未満の変動）を有する配列を含む場合がある、このコードされる配列からの若干の変動が本発明により包まれる。別の態様において、ＡＡＶ８キャプシドは国際公開第ＷＯ ２０１４／１２４２８２（本明細書に引用することにより組み込まれる）に説明されるＡＡＶ８バリアントのＶＰ１配列を有する場合がある。キャプシド、そのためのコーディング配列の生成方法、及びｒＡＡＶウイルスベクターの製造方法は説明されている。（Ｇａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００３、１００（１０）、６０８１－６０８６；米国特許第２０１３／００４５１８６号明細書；及び国際公開第ＷＯ ２０１４／１２４２８２号明細書）。

発現カセットをビリオン中にパッケージングするために、ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）が、遺伝子発現カセットと同一の構築物中にシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。適しては、複製（ｒｅｐ）及び／又はキャプシド（ｃａｐ）のためのコーディング配列がＡＡＶゲノムから除去され、及びＡＡＶベクターを生成するためにトランスで又はパッケージング細胞株により供給される。従って、本明細書に提供されるベクターは複製能力がない。ＡＡＶキャプシドの供給源と異なる供給源からのＩＴＲを含むシュードタイピングされたＡＡＶを提供する場合がある。加えて、又は、あるいは、キメラＡＡＶキャプシドを利用する場合がある。なお他のＡＡＶ成分を選択する場合がある。こうしたＡＡＶ配列の供給源は本明細書に説明され、及びまた単離されうるか、又は学術的、商業的若しくは公的供給源（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））、バージニア州マナサス）から得ることもできる。あるいは、ＡＡＶ配列は、文献で、又は例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、ＰｕｂＭｅｄ（登録商標）などのようなデータベース中で利用可能であるような公表された配列への参照により合成又は他の適切な手段により得ることができる。

被験者への送達に適切なＡＡＶウイルスベクターの生成及び単離方法は当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号明細書；米国特許第７２８２１９９号明細書；第ＷＯ ２００３／０４２３９７号明細書；第ＷＯ ２００５／０３３３２１号明細書、第ＷＯ ２００６／１１０６８９号明細書；及び第ＵＳ ７５８８７７２ Ｂ２号明細書を参照されたい］。一系において、産生体細胞株を、ＩＴＲにより隣接されている導入遺伝子をコードする構築物並びにｒｅｐ及びｃａｐをコードする構築物（１種又は複数）で一過性にトランスフェクトする。第２の系において、ｒｅｐ及びｃａｐを安定して供給するパッケージング細胞株を、ＩＴＲにより隣接されている導入遺伝子をコードする構築物で一過性にトランスフェクトする。これらの系のそれぞれにおいて、ＡＡＶビリオンがヘルパーアデノウイルス又はヘルペスウイルスへの感染に応答して産生され、汚染するウイルスからのｒＡＡＶの分離を必要とする。より最近、ＡＡＶを回収するためにヘルパーウイルスへの感染を必要としない系が開発された。必要とされるヘルパー機能（すなわちアデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ及びＥ４又はヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２及びＵＬ２９、並びにヘルペスウイルスポリメラーゼ）もまた前記系によりトランスに供給される。これらのより新しい系において、ヘルパー機能は、必要とされるヘルパー機能をコードする構築物での細胞の一過性トランスフェクションにより供給する場
合があるか、又は、細胞を、ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定に含むよう操作し得、その発現は転写又は転写後レベルで制御する場合がある。なお別の系において、ＩＴＲにより隣接されている導入遺伝子及びｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を、バキュロウイルスに基づくベクターへの感染により昆虫細胞中に導入する。これら産生系に関する総説については、全般として、例えば、Ｚｈａｎｇら、２００９、“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９（そのそれぞれの内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これら及び他のＡＡＶ産生系の作成及び使用方法は以下の米国特許（それらのそれぞれの内容はそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）：第５，１３９，９４１号明細書；同第５，７４１，６８３号明細書；同第６，０５７，１５２号明細書；同第６，２０４，０５９号明細書；同第６，２６８，２１３号明細書；同第６，４９１，９０７号明細書；同第６，６６０，５１４号明細書；同第６，９５１，７５３号明細書；同第７，０９４，６０４号明細書；同第７，１７２，８９３号明細書；同第７，２０１，８９８号明細書；同第７，２２９，８２３号明細書；及び同第７，４３９，０６５号明細書にもまた説明されている。全般として、例えばＧｒｉｅｇｅｒ及びＳａｍｕｌｓｋｉ、２００５、“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５；Ｂｕｎｉｎｇら、２００８、“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３；及び以下に引用される参考文献（それらのそれぞれはそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。本発明のいずれかの態様を構築するのに使用される方法は核酸操作の当業者に既知であり、そして遺伝子工学、組換え工学及び合成技術を含む。例えば、Ｇｒｅｅｎ及びＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（２０１２）を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンの生成方法は公知であり、及び、適切な方法の選択は本発明を限定するものではない。例えばＫ．Ｆｉｓｈｅｒら、（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０：５２０－５３２及び米国特許第５，４７８，７４５号明細書を参照されたい。

ｒＡＡＶ．ｈＵＧＴ１Ａ１ベクターは以下のとおり製造する場合がある。簡潔には、細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞）を適切な細胞培養系中で増殖させ、及びベクター生成のためトランスフェクトする。ｒＡＡＶ．ｈＵＧＴ１Ａ１ベクターをその後回収し、濃縮し及び精製してバルクベクターを製造し、これをその後充填し及び下流の工程で仕上げる。

本明細書に説明される遺伝子治療ベクターの製造方法は、遺伝子治療ベクターの製造のため使用されるプラスミドＤＮＡの生成、該ベクターの生成、及び該ベクターの精製のような当該技術分野で公知の方法を含む。一部の態様において、遺伝子治療ベクターはＡＡＶベクターであり、並びに、生成されるプラスミドはＡＡＶゲノム及び目的の遺伝子をコードするＡＡＶシスプラスミド、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶトランスプラスミド、並びにアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成方法は、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡでの細胞のトランスフェクション、無血清培地へのトランスフェクション後培地交換、並びにベクターを含む細胞及び培地の回収のような方法段階を包み得る。回収されたベクターを含む細胞及び培地を本明細書で粗細胞回収物（ｃｅｌｌ ｈａｒｖｅｓｔ）と称する。

前記粗細胞回収物をその後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物のダイアフィルトレーション、ベクター回収物の顕微溶液化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィーによる精製、限外濾過による精製、接線流濾過による緩衝液交換、並びにバルクベクターを製造するための配合及び濾過のような方法段階にかけることができる。

ある態様において、本明細書に説明されるのと類似の方法を他のＡＡＶ産生細胞とともに使用する場合がある。トランスフェクション、安定細胞株産生、並びにアデノウイルス－ＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルス－ＡＡＶハイブリッド及びバキュロウイルス－ＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス産生系を含む多数の方法が、ｒＡＡＶベクターの製造のため当該技術分野で既知である。例えば、Ｇ Ｙｅら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ、２５：２１２－２１７（Ｄｅｃ ２０１４）；ＲＭ
Ｋｏｔｉｎ、Ｈｕ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ、２０１１、Ｖｏｌ．２０、Ｒｅｖ Ｉｓｓｕｅ １、Ｒ２－Ｒ６；Ｍ．Ｍｉｅｔｚｓｃｈら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２５：２１２－２２２（Ｍａｒ ２０１４）；Ｔ Ｖｉｒａｇら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０：８０７－８１７（Ａｕｇｕｓｔ ２００９）；Ｎ．Ｃｌｅｍｅｎｔら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０：７９６－８０６（Ａｕｇ ２００９）；ＤＬ
Ｔｈｏｍａｓら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２０：８６１－８７０（Ａｕｇ ２００９）を参照されたい。ｒＡＡＶウイルス粒子の製造のためのｒＡＡＶ産生培養物は全部必要とし；例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９若しくは２９３細胞のようなヒト由来細胞株、又はバキュロウイルス産生系の場合にＳＦ－９のような昆虫由来細胞株を含む適切な宿主細胞；２）野生型若しくは変異体アデノウイルス（温度感受性アデノウイルスのような）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルスにより提供される適切なヘルパーウイルス機能、又はトランス若しくはシスでヘルパー機能を提供する核酸構築物；３）機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子、機能的ｃａｐ遺伝子及び遺伝子産物；４）ＡＡＶ ＩＴＲ配列により隣接されている導入遺伝子（治療的導入遺伝子のような）；並びに５）ｒＡＡＶ産生を支援する適切な培地及び培地成分。

多様な適切な細胞及び細胞株がＡＡＶの製造における使用について説明されている。該細胞それ自身は、原核生物（例えば細菌）細胞、並びに昆虫細胞、酵母細胞及び哺乳動物細胞を含む真核生物細胞を含むいずれの生物からも選択する場合がある。とりわけ望ましい宿主細胞は、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ
１、ＣＯＳ ７、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０、ＢＭＴ １０、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＨｅＬａ、ＨＥＫ ２９３細胞（機能的アデノウイルスＥ１を発現する）、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、並びにヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ及びハムスターを含む哺乳動物由来の初代線維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のような細胞を含むが、これらに限られない、いずれかの哺乳動物種のなかから選択する。ある態様において、細胞は懸濁に適合された細胞である。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明を限定するものではでなく；哺乳動物細胞の型すなわち線維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞なども本発明を限定するものではない。

空のキャプシドを、患者に投与するＡＡＶ．ｈＵＧＴ１Ａ１の用量から除去することを確実にするために、空のキャプシドを、例えば塩化セシウム勾配超遠心を使用してベクター精製過程中にベクター粒子から分離する。一態様において、パッケージングされたゲノムを含むベクター粒子を、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６５９７６号明細書、２０１６年１２月９日出願、並びにその優先権書類米国特許出願第６２／３２２，０９８号明細書、２０１６年４月１３日出願、並びに２０１５年１２月１１日に出願され及び“Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ８（ＡＡＶ８のスケーラブル精製方法）”という発明の名称の米国特許出願第６２／２６６，３４１号明細書（本明細書に引用することにより組み込まれる）に説明される方法を使用して、空
のキャプシドから精製する。国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６５９７４号明細書、２０１６年１２月９日出願、並びにその優先権書類米国特許出願第６２／３２２，０８３号明細書、２０１６年４月１３日出願及び同第６２／２６６，３５１号明細書、２０１５年１２月１１日出願（ＡＡＶ１）；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３号明細書、２０１６年１２月９日出願、並びにその優先権書類米国仮出願第６２／３２２，０５５号明細書、２０１６年４月１３日出願及び同第６２／２６６，３４７号明細書、２０１５年１２月１１日出願（ＡＡＶｒｈ１０）；並びに国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６５９７０号明細書、２０１６年１２月９日出願、並びにその優先出願米国仮出願第６２／２６６，３５７号明細書及び同第６２／２６６，３５７号明細書（ＡＡＶ９）（本明細書に引用することにより組み込まれる）に説明される精製方法もまた参照されたい。簡潔には、ゲノムを含むｒＡＡＶベクター粒子をｒＡＡＶ産生細胞培養物の澄明にされた濃縮された上清から選択的に捕捉及び単離する２段階精製スキームが説明されている。該方法は、高塩濃度で実施される親和性捕捉法、次いでｒＡＡＶ中間体を実質的に含まないｒＡＡＶベクター粒子を提供するため高ｐＨで実施される陰イオン交換樹脂法を利用する。

ある態様において、前記方法は薬理学的に活性のゲノム配列を含むＤＮＡを含む組換えＡＡＶ８ウイルス粒子をゲノム欠損（空）ＡＡＶキャプシド中間体から分離する。前記方法は、（ａ）粒子及び中間体を生成したＡＡＶ産生体細胞培養物からＡＡＶ以外の物質を除去するために精製されている組換えＡＡＶ８ウイルス粒子及び空のＡＡＶ８キャプシド中間体；並びに２０ｍＭビストリスプロパン（ＢＴＰ）及び約１０．２のｐＨを含む緩衝液Ａを含む負荷懸濁液を形成すること；（ｂ）（ａ）の懸濁液を強陰イオン交換樹脂に負荷すること；（ｃ）負荷された陰イオン交換樹脂を、約１０．２のｐＨを伴う１０ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ ＢＴＰを含む緩衝液１％Ｂで洗浄すること；（ｄ）負荷され及び洗浄された陰イオン交換樹脂に増大する塩濃度勾配を適用すること；及び（ｅ）ｒＡＡＶ粒子を溶離液から回収すること、を含み、前記樹脂は懸濁液及び／又は溶液の流れのための入口並びに容器からの溶離液の流れを許容する出口を有する容器中にあり、前記塩勾配は１０ｍＭから終点を含む約１９０ｍＭ ＮａＣｌまたは同等物までの範囲にわたり、前記ｒＡＡＶ粒子は中間体から精製されている。

一態様において、使用されるｐＨは１０から１０．４まで（約１０．２）であり、及びｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ８中間体から最低約５０％ないし約９０％精製されるか、又は、１０．２のｐＨ及びＡＡＶ８中間体から約９０％ないし約９９％精製されている。一態様において、これはゲノムコピーにより決定される。ｒＡＡＶ８粒子（パッケージングされたゲノム）のストック又は製剤は、ストック中のｒＡＡＶ８粒子が、ストック中のｒＡＡＶ８の最低約７５％ないし約１００％、最低約８０％、最低約８５％、最低約９０％、最低約９５％又は最低９９％であり、並びに「空のキャプシド」が、ストック又は製剤中のｒＡＡＶ８の約１％未満、約５％未満、約１０％未満、約１５％未満である場合に、ＡＡＶ空キャプシド（及び他の中間体）を「実質的に含ま」ない。

一態様において、該製剤は、１又はより少ない、好ましくは０．７５未満、より好ましくは０．５、好ましくは０．３未満の「一杯（ｆｕｌｌ）」に対する「空」の比を有するｒＡＡＶストックを特徴とするである。

さらなる一態様において、ｒＡＡＶ粒子の平均収率は最低約７０％である。これは、カラム上に負荷された混合物中の力価（ゲノムコピー）及び最終溶離中の量の存在を測定することにより計算する場合がある。さらに、これらは、本明細書に説明されるもの又は当該技術分野で説明されているもののようなｑ－ＰＣＲ分析及び／又はＳＤＳ－ＰＡＧＥ技術に基づいて決定する場合がある。

例えば、空の粒子及び中身が詰まった粒子の含量を計算するため、選択されたサンプル
についてのＶＰ３のバンド容量（例えばイオジキサノール勾配精製される製剤、ここでＧＣの数＝粒子の数）を、負荷されたＧＣ粒子に対しプロットする。生じる一次方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を使用して、試験薬剤のピークのバンド容量中の粒子の数を計算する。負荷された２０μＬあたりの粒子（ｐｔ）の数に５０を掛け算して粒子（ｐｔ）／ｍＬを与える。ＧＣ／ｍＬにより除算されるｐｔ／ｍＬはゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を与える。ｐｔ／ｍＬ－ＧＣ／ｍＬが空のｐｔ／ｍＬを与える。ｐｔ／ｍＬにより除算され及び１００倍される空のｐｔ／ｍＬが空の粒子のパーセンテージを与える。

前記ベクターのＡＡＶ／８血清型の確認は、質量分析（ＭＳ）によるＶＰ３キャプシドタンパク質のペプチドの分析に基づくアッセイにより達成する場合がある。前記方法は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルから切り出されるＶＰ３タンパク質バンドの多酵素消化（トリプシン、キモトリプシン及びエンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ）、次いでキャプシドタンパク質を配列決定するためのＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計でのＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳでの特徴付けを含む。タンデム質量スペクトル（ＭＳ）法は、質量スペクトルからのある種の汚染物質タンパク質及び派生するペプチド配列の同定を見込む。

一般に、空のキャプシド及びパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子のアッセイ方法は当該技術分野で既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０；Ｓｏｍｍｅｒら、Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性されたキャプシドについて試験するため、前記方法は、処理されたＡＡＶストックを、前記３種のキャプシドタンパク質を分離することが可能ないずれかのゲル、例えば緩衝液中に３－８％トリス酢酸を含む勾配ゲルよりなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけること、その後サンプル物質が分離されるまでゲルを泳動すること、及びゲルをナイロン又はニトロセルロースメンブレン、好ましくはナイロン上にブロッティングすることを含む。抗ＡＡＶキャプシド抗体をその後、変性されたキャプシドタンパク質に結合する一次抗体、好ましくは抗ＡＡＶキャプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体（Ｗｏｂｕｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）として使用する。二次抗体、一次抗体に結合し及び一次抗体との結合を検出するための手段を含むもの、より好ましくはそれに共有結合されている検出分子を含む抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくはワサビペルオキシダーゼに共有結合されているヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体をその後使用する。結合の検出方法、好ましくは放射活性同位体の放射、電磁放射又は比色的変化を検出することが可能な検出法、最も好ましくは化学発光検出キットを使用して、一次及び二次抗体の間の結合を半定量的に測定する。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥについて、カラム画分からのサンプルを採取し及び還元剤（例えばＤＴＴ）を含むＳＤＳ－ＰＡＧＥ負荷緩衝液中で加熱し得、並びにキャプシドタンパク質をプレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えばＮｏｖｅｘ）上で分離した。銀染色を、製造元の説明書に従ってＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州）を使用して実施する場合がある。一態様において、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度を、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）により測定する場合がある。サンプルを希釈し及びＤＮアーゼＩ（又は別の適切なヌクレアーゼ）で消化して外因性ＤＮＡを除去する。ヌクレアーゼの不活性化後に、サンプルをさらに希釈し、並びにプライマー及びプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ^TM蛍光性プローブを使用して増幅する。定義されたレベルの蛍光に達するのに必要とされるサイクルの数（閾値サイクル、Ｃｔ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出装置上で各サンプルについて測定する。ＡＡＶベクターに含有されるものに同一の配列を含むプラスミドＤＮＡを使用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を生成する。サンプルから得られるサイクル閾値（Ｃｔ）値を使用して、それをプラスミドの標準曲線のＣｔ値に対し正規化することによりベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づく終点アッセイもまた使用する場合がある。

一局面において、広範な範囲のセリンプロテアーゼ例えばプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能であるような）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ法が本明細書に提供される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮアーゼＩ消化後にサンプルをプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し及びプロテイナーゼＫで処理し、次いで熱不活性化することを除き、標準アッセイに類似である。適しては、サンプルをサンプルの大きさに等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈する。プロテイナーゼＫ緩衝液は２倍又はそれ以上に濃縮する場合がある。典型的に、プロテイナーゼＫ処理は約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、しかし０．１ｍｇ／ｍＬから約１ｍｇ／ｍＬまで変動する場合がある。前記処理段階は一般に約５５℃で約１５分間実施するが、しかしより低い温度（例えば約３７℃ないし約５０℃）でより長い時間（例えば約２０分ないし約３０分）にわたり、又はより短い時間（例えば約５ないし１０分）より高温（例えば約６０℃まで）で実施する場合がある。同様に、熱不活性化は一般に約９５℃で約１５分間であるが、しかし温度を低下させ（例えば約７０ないし約９０℃）及び時間を延長（例えば約２０分ないし約３０分）する場合がある。サンプルをその後希釈し（例えば１０００倍）、及び標準アッセイに説明されるところのＴａｑＭａｎ分析にかける。

加えて、又は、あるいは、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を使用する場合がある。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価の測定方法が説明されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋら、Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。

本明細書に説明される製薬学的組成物は、いずれかの適切な経路又は異なる経路の組合せによるそれの必要な被験者への送達のため設計される。肝への直接送達（場合によっては、静脈を介して、肝動脈を介して、又は移植により）、経口、吸入、髄腔内、鼻内、気管内、動脈内、眼内（例えば硝子体内）、静脈内、筋肉内、皮下、皮内及び他の投与経路。

本発明は、本発明の核酸、又は本発明のベクター、又は本発明の細胞を含む製薬学的組成物もまた提供する。こうした組成物は治療上有効な量のＵＧＴ１Ａ１を含む。ある態様において、野生型の発現レベルの約５％と同じくらい低い発現レベルに達することが治療的利益を提供する場合がある。他の態様において、発現レベルは、野生型の発現レベルの５％より高い、例えば野生型の発現レベルの１０％以上、２０％以上、３０％以上又は約１００％までである。

前記複製欠損ウイルスは、遺伝子移入及び遺伝子治療の応用における使用のため生理学的に許容できる担体と配合する場合がある。ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）の定量を製剤中に含有される用量の尺度として使用する場合がある。当該技術分野で既知のいずれの方法も、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定するのに使用する場合がある。ＡＡＶ ＧＣ数滴定の一実施方法は後に続くとおりである：精製されたＡＡＶベクターサンプルを最初にＤＮアーゼで処理して、キャプシド形成されないＡＡＶゲノムＤＮＡ又は汚染するプラスミドＤＮＡを製造工程から排除する。ヌクレアーゼ抵抗性粒子をその後熱処理にかけてキャプシドからゲノムを放出させる。放出されたゲノムをその後、ウイルスゲノムの特定の領域（通常はポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブ組を使用するリアルタイムＰＣＲにより定量する。ゲノムコピーの別の適切な決定方法は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、具体的には最適化されたｑＰＣＲ又はデジタルドロップレットＰＣＲ［Ｌｏｃｋ Ｍａｒｔｉｎら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｐｒｉｌ ２０１４、２５（２）：
１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１、２０１３年１２月１３日編集の前にオンライン公開される］である。

ｒＡＡＶ．ＵＧＴ１Ａ１ベクター組成物は、ヒト患者について約１．０×１０⁹ＧＣないし約１．０×１０¹⁴ＧＣ（体重が７０ｋｇの平均的成体被験者を処置するため）、及び好ましくは１．０×１０¹²ＧＣないし１．０×１０¹⁴ＧＣの範囲にあるｒＡＡＶの量を含むように投薬量単位に配合する場合がある。別の態様において、用量は約１×１０¹³ＧＣ／ｋｇ未満である。例えば、ＡＡＶウイルスの用量は、約１×１０⁹ＧＣ、約５×１０⁹ＧＣ、約１×１０¹⁰ＧＣ、約５×１０¹⁰ＧＣ又は約２．５×１０¹²ＧＣの場合がある。別の例において、バリアントは約０．００１ｍｇないし約１０ｍｇ／ｋｇの量で送達する場合がある。

上述された組換えベクターは公表された方法に従って宿主細胞に送達する場合がある。好ましくは生理学的に許容できる担体に懸濁されているｒＡＡＶをヒト又はヒト以外の哺乳動物被験者に投与する場合がある。「製薬学的に許容できる」という用語は、連邦又は州政府の規制当局により承認される、或いは動物及びヒトでの使用について米国若しくは欧州薬局方又は他の一般に認識される薬局方に列挙されるを意味している。「担体」という用語は、それとともに治療薬が投与される希釈剤、補助物質、賦形剤又はベヒクルを指す。こうした製薬学的担体は、水、及び、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などのような石油、動物、植物又は合成起源のものを含む油のような無菌液体の場合がある。水は、製薬学的組成物を静脈内で投与する場合に好ましい担体である。食塩水溶液並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液もまた、とりわけ注入可能な溶液のための液体担体として使用する場合がある。適切な製薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、乳糖、ショ糖、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどを含む。組成物は、所望の場合、少量の湿潤若しくは乳化剤又はｐＨ緩衝剤もまた含む場合がある。これら組成物は、懸濁剤、乳剤、徐放製剤などの形態を取る場合がある。適切な製薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に説明されている。一態様において、ベクターはリン酸緩衝生理的食塩水を含む組成物中に配合される。別の特定の態様において、ベクターは乳酸リンゲル液及びＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８のような非イオン性界面活性剤を含む組成物中に、０．００１総組成物の重量％の濃度でのような０．０１～０．０００１％の最終濃度で配合される。典型的に、静脈内投与のための組成物は無菌等張水性緩衝液の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤、及び注入の部位での疼痛を和らげるためのリドカインのような局所麻酔薬もまた含む場合がある。担体の選択は本発明を限定するものではない。

場合によっては、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び担体（１種又は複数）に加え、保存剤又は化学的安定化剤のような他の慣習的製薬学的成分を含有する場合がある。適切な例示的保存剤は、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化イオウ、没食子酸プロピル、パラベン類、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールを含む。適切な化学的安定化剤はゼラチン及びアルブミンを含む。

１クールの処置は、同一ウイルスベクター（例えばＡＡＶ８ベクター）又は異なるウイルスベクター（例えばＡＡＶ８、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶｈｕ．３７及びＡＡＶｒｈ１０）の反復投与を場合によっては含む場合がある。なお他の組合せは本明細書に説明されるウイルスベクターを使用して選択する場合がある。

例えば、ｒＡＡＶ．ＵＧＴ１Ａ１及びそれを含む組成物での処置は免疫抑制レジメンとの同時療法を含む場合がある。免疫抑制剤は、第１のベクターの投与前、それと実質的に
同時に投与する場合があるか、又は第１のベクターの投与後に投与する場合がある。場合によっては、免疫抑制レジメンを、１日～１４日間、又は、必要とされる若しくは所望のとおりその間のより短い期間例えば３日、７日、１０日若しくはより長い期間、含有する場合がある。適切な免疫抑制剤は当業者により容易に選択されることができ、並びにステロイド、代謝拮抗薬、Ｔ細胞阻害剤及びアルキル化剤を含む場合がある、例えば含むがこれらに限られないことができる。ある態様において、患者を上昇された肝酵素について監視し、及び場合によっては一時的な免疫抑制療法で処置する（例えば、ベースラインレベルの最低約２倍のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）又はアラニントランスアミラーゼ（ＡＬＴ）が観察される場合）。

場合によっては、本明細書に説明される組成物は、例えば光線療法を含む他の療法を含む投与計画で組み合わせる場合がある。

現在の光線療法は、治療灯（発光範囲：４００～５２５ｎｍ、ピーク発光：４５０～４６０ｎｍ）への曝露を含む場合がある。本明細書に提供されるところの処置を受けないとき、患者は最低約１０時間ないし約１２時間／日又はより長い間の光線療法セッションを受ける。患者の生存はこの療法の無期限の継続に依存する。当初は非常に有効とはいえ、光線療法は不便であり、並びにこの処置の有効性は、皮膚の厚さの増大と、体表面／重量比とにより加齢とともに低下し；従って、患者は思春期の時期あたりに再度核黄疸の危険性がある。光線療法の有効性を改良するため、ランプを約１，０００～１，５００時間の使用（およそ４ないし６か月ごと）後に交換する、光源を身体近く（約１５～２０センチメートル、６～８インチ）に保つ、光への皮膚曝露を最大にする、白一色のシーツを使用する、及びベッドの周囲に反射表面（鏡及び緊急用毛布）を置くことが推奨される。

ある態様において、クリグラー・ナジャー症候群Ｉ型を有する患者を遺伝子治療及び光線療法の組合せで処置する。例えば、光線療法処置は遺伝子治療での処置前に開始する場合がある。光線療法は、加えて、又は、あるいは、ＡＡＶ．ＵＧＴ１Ａ１組成物の投与後２４時間までないし約４週又はその間の時点（例えば約１０日、約２週、約３週）の間投与する場合がある。適しては、ＡＡＶ．ＵＧＴ１Ａ１組成物の投与後約４週又はそれ未満後に、１日あたり１患者での光線療法に必要とされる時間の長さが、最低約３０％ないし約１００％、又は最低約５０％、最低約７５％、最低約８０％だけ短縮される。一部の態様において、患者は連続しない日の光線療法のみを必要とする場合がある。別の態様において、光線療法はビリルビンレベルを許容できるレベルに低下させるためにもはや必要とされない。

ある他の態様において、患者はその後、クリグラー・ナジャー症候群ＩＩ型患者のための慣習的標準治療に従って処置する。こうした患者において、フェノバルビタールを、ビリルビンレベル及びいずれかのＣＮＳ関連症状を制御するために使用する。

ある態様において、クリグラー・ナジャー症候群ＩＩ型患者を、本明細書に説明されるところのＡＡＶ．ｈＵＧＴ１Ａ１組成物で処置する場合がある。フェノバルビタール又は他の療法を、加えて、又は、あるいは、ＡＡＶ．ＵＧＴ１Ａ１組成物の投与後２４時間ないし約４週又はその間の点（例えば約１０日、約２週、約３週）の間投与する場合がある。適しては、ＡＡＶ．ＵＧＴ１Ａ１組成物の投与後約４週又はそれ未満後に、１日あたり１患者で必要とされるフェノバルビタールの用量が、最低約３０％ないし約１００％、又は最低約５０％、最低約７５％、最低約８０％だけ低下する。別の態様において、フェノバルビタールはもはや必要とされない。

ある態様において、本明細書に説明されるところのＡＡＡＶ．ｈＵＧＴ１Ａ１組成物で処置された、欠損しているＵＧＴ１Ａ１発現レベルを伴うすなわちクリグラー・ナジャー
症候群Ｉ又はＩＩ型患者は、ジルベール症候群を有する患者で見出されるような上昇されたビリルビンレベルを有するが、しかしさらなる継続している処置は必要とされない。

「ある（ａ）」又は「ある（ａｎ）」という用語は１又はそれ以上を指すことが注目されるべきである。であるから、「ある（ａ）」（または「ある（ａｎ）」）、「１又はそれ以上」及び「最低１」という用語は本明細書で互換性に使用される。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（こと）（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、排他的よりはむしろ包括的に解釈されるべきである。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（こと）（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という語及びその変形は、包括的よりはむしろ排他的に解釈されるべきである。本明細の多様な態様が「含む（こと）」言語を使用して提示される一方、他の状況下で、関連する一態様は「からなる（こと）（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」又は「から本質的になる（こと）（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」言語を使用して解釈及び説明されることもまた意図している。

本明細書で使用されるところの「約」という用語は、別の方法で明記されない限り、示される参照からの１０％の変動性を意味している。

本明細書で使用されるところの「調節」という用語又はその派生物は、生物学的経路の１又はそれ以上の成分を阻害するある組成物の能力を指す。

「被験者」は、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、乳牛、ブタ、又はサル、チンパンジー、ヒヒ若しくはゴリラのようなヒト以外の霊長類である。

本明細書で使用されるところの「疾患」、「障害」及び「状態」は、被験者における異常な状態を示すために互換性に使用する。

以下の実施例は具体的説明のみであり、及び本発明の範囲を限定するものではない。本明細書で使用される略語の一覧を下に表１に提供する。

ベクター生成及び比較
５種のｈＵＧＴ１Ａ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する一連のベクターを構築した。下の表２を参照されたい。簡潔には、前記５種のｈＵＧＴ１Ａ１ ＯＲＦ（表１）のそれぞれについてＡＡＶ８ベクターのロットの収量に統計学的に有意の差は存在しなかった。

ＨＥＫ２９３細胞が増殖するときに、細胞を３種のプラスミド：ＡＡＶ血清型特異的パッケージング（トランス）プラスミド、ａｄヘルパープラスミド、及びＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）に挟まれているＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子のための発現カセットを含むベクターシスプラスミドのそれぞれでトランスフェクトする。トランスフェクションはリン酸カルシウム法を使用して実施する。ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨを運搬するシスプラスミドの完全長配列を配列番号９に提供する（ベクターゲノムは５’から３
’ＩＴＲまで配列番号９のｎｔ １－３５５８にわたる）。ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＢＧＨを運搬するシスプラスミドの完全長配列を配列番号１０に提供する（ベクターゲノムは５’から３’ＩＴＲまで配列番号１０のｎｔ １－３１５２にわたる）。他のプラスミドを構築するため、配列番号１２（ＵＧＴ１Ａ１ Ｕ２０１ＤＰ）、配列番号１３（ＵＧＴ１Ａ１ Ｕ００１）、配列番号１４（ＵＧＴ１Ａ１ Ｕ０１１ＴＹ）又は配列番号１８（Ｕ３Ｇ）のコーディング配列を配列番号１０のｎｔ １０９２－２６９０の代わりに用いる。他の態様において、アンピシリン耐性遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子により置換されているプラスミドを使用する。使用されるトランスプラスミドは、配列番号１１の配列を有するＡＡＶ８キャプシドＶＰ１タンパク質をコードするＡＡＶ８遺伝子を運搬する。これらベクターを、尾静脈を介する３×１０¹²ＧＣ／ｋｇのベクターのＩＶ注入後にオス及びメス野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスで評価した。血液を、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ及び総ビリルビンの評価のため剖検時の心穿刺により採取した。肝を回収し、肝葉の１つを固定及びパラフィン包埋のため採取し、残部を急速凍結して－８０℃で保存した。発現を、肝ホモジェネートのウエスタンブロットにより測定されるｈＵＧＴ１Ａ１タンパク質レベルにより評価し、ヒトＵＧＴ１Ａ１特異的抗体を検出に使用した。ウエスタンブロット画像を、陽性対照サンプルからの同一量のタンパク質に対し定量化した。

肝サンプルをドライアイス上で凍結させ及び－６０℃以下で保存した。組織ホモジェネートを作成し、及びｈＵＧＴ１Ａ１発現を測定するためのウエスタンブロットを後に続くとおり実施した。マウス肝サンプルを、製造元の説明書に従ってＱＩＡＧＥＮ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ、ドイツヒルデン）を使用してＲＩＰＡ溶解及び抽出緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）並びにプロテアーゼ阻害剤中で均質化した。タンパク質レベルを、製造元の説明書に従って、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）により定量化した。ホモジェネートは１μｇのタンパク質がゲル上で泳動されることを可能にするよう希釈した。サンプルを９５℃で５分間加熱し、ＮｕＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘ １０％ビストリスプロテインゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）上で分離し、及びＴｒａｎｓ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ ＰＤＶＦメンブレン（ＢｉｏＲａｄ、米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）に転写した。メンブレンを５％脱脂粉乳、トリス緩衝生理的食塩水、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳ－Ｔ）中室温で１時間ブロッキングした。メンブレンを０．５％脱脂粉乳及びＴＢＳ－Ｔ中で洗浄し、その後、０．５％脱脂粉乳及びＴＢＳ－Ｔ中１：２００の抗体希釈した抗－ＵＧＴ１Ａ抗体（Ｈ－３００［ｓｃ－２５８４７］、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国テキサス州ダラス）と、４℃で一夜インキュベートした。メンブレンをＴＢＳ－Ｔでそれぞれ５分間３回洗浄し、その後、０．５％脱脂粉乳及びＴＢＳ－Ｔ中１：５０００の抗体希釈したヤギ抗ウサギＨＲＰ結合抗体（ｓｃ－２０５４、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国テキサス州ダラス）と室温で１時間インキュ
ベートした。メンブレンをＴＢＳ－Ｔでそれぞれ５分間３回洗浄し、ＨＲＰを、製造元の説明書に従ってＰｉｅｒｃｅ ＥＣＬウエスタンブロッティング基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を使用して検出した。バンドの画像を陽性対照サンプルからの同一量のタンパク質に対して定量化した。

ベクターの２種（ＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ０１１ＴＹ．ＢＧＨおよびＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ３Ｇ．ＢＧＨ）についてタンパク質発現について評価されるとき、多様なコドン最適化された配列の使用が、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨベクターに比較して発現を有意に低下させた。メスマウスにおけるｈＵＧＴ１Ａ１の発現はオスマウスで見られるものに比較して低下した。オス又はメスいずれか一方の群全部にわたるＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ及び総ビリルビンレベルの有意の差違は存在しなかった。臨床化学値及びウエスタンブロットによるｈＵＧＴ１Ａ１発現の比較を、オス又はメスいずれか一方のテューキーの多重事後比較検定（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｐｏｓｔ－ｔｅｓｔ）を用いる一元配置分散分析を使用して実施した。

ｈＵＧＴ１Ａ１の発現は、オスマウスにおいてＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨベクター並びに第２世代のベクターの２種（ＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ００１．ＢＧＨ及びＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰ．ＢＧＨ）間で有意に異ならなかった（図１）。これら第２世代ベクターの双方は、導入遺伝子発現を高めるとして以前に説明されているウッドチャック調節後エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｐｏｓｔ－ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）を欠く。しかしながら、既存の肝疾患を伴う患者にＷＰＲＥを送達することの安全性に関し規制上の懸念が呈されている。ＣＮ１は肝疾患であるため、このエレメントを欠くベクターをさらなる研究を進めるために選択する。

新生仔における全身投与後のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ｂＧＨの有効性のｉｎ ｖｉｖｏ評価
Ａ．概要
この概念実証（ＰＯＣ）研究の目的は、ＣＮの処置のため設計された最初のベクターＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨを評価することであった。このベクターを新生ＵＧＴ１ノックアウト（ＫＯ）マウスに投与して、ヒトＵＧＴ１Ａ１（ｈＵＧＴ１Ａ１）の発現、及びＵＧＴ１ ＫＯマウスモデル（ＣＮの動物モデル）の生存を増大させるための遺伝子治療アプローチの能力を評価した。

ヘテロ接合個体×ヘテロ接合個体マウスの交尾後に出生した３腹仔のマウス（ＵＧＴ１
ＫＯ；ｎ＝５；ヘテロ接合個体：ｎ＝９；野生型［ＷＴ］：ｎ＝４）に、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨ（マウスあたり１０¹¹ゲノムコピー［ＧＣ］）を表在性側頭顔面静脈を介し出生後２４時間以内に静脈内（ＩＶ）注入した。全部のマウスを出生後第２１日の離乳時に遺伝子型分類した。血液サンプルを、血清総ビリルビンレベルの評価のため、出生後第２８日から前記研究の生存期間を通して２週ごとに回収した。マウスを試験薬剤投与後第２７０日に剖検した。肝を剖検時に回収し、１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、ＵＧＴ１Ａ１についての免疫組織化学的染色のため処理した。

ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨを用いる新生仔遺伝子治療は、出生直後期間の致死性高ビリルビン血症からＵＧＴ１ ＫＯマウスを保護し、未処置ＵＧＴ１ ＫＯマウスにおける５日から試験薬剤投与後２７０日まで、生存を有意に増大させた（研究終了時、未処置ＵＧＴ１ ＫＯマウスに比較してｐ＜０．０００１）。図２を参照されたい。レスキューされたＵＧＴ１ ＫＯマウスは、血清総ビリルビンレベルの
上昇を伴ってではあるが、それらのヘテロ接合個体及びＷＴ同腹仔と表現型上同一にみえた。ＡＡＶ処置されたＵＧＴ１ ＫＯマウスにおける血清総ビリルビンレベルはヘテロ接合個体及びＷＴ動物に比較して５．７倍だけ上昇したが、しかし光線療法により成体期までレスキューされたＵＧＴ１ ＫＯマウスと比較した場合に１５．２倍低下した（ｐ＜０．０００１ スチューデントのｔ検体による比較）。肝細胞の増殖による肝臓内のベクターＧＣの希釈が、ヘテロ接合個体及びＷＴ同腹仔に比較して上昇された血清総ビリルビンレベルに基づく若干の導入遺伝子発現の低下及び不完全な長期是正をもたらした。

Ｂ．方法
マウスはヘテロ接合個体×ヘテロ接合個体の交尾後に生成した。３腹仔からの全部の仔に出生２４時間以内に試験薬剤を投与した。マウスは、出生後２１日の離乳時に耳タグを付けて遺伝子型分類した。

表在性側頭顔面静脈を介する静脈内（ＩＶ）経路を使用のため選択したが、それは、ヒトにおいて前記疾患の臨床部位である肝を標的とするために使用される最も効率的な経路であるためであった。

試験薬剤の有効性を血清中の総ビリルビンレベルにより決定した。加えて、免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析を実施して肝臓内のｈＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現のレベルを測定した。

動物の血清総ビリルビンレベルの変化を分析した。マウスを麻酔し、及び、血液を前記研究の生存中期中に後眼窩若しくは顎下技法により又は剖検時の心穿刺により回収した。血液をラベル貼付された血清ゲル状分離剤褐色蓋管に回収し、凝固させ、及びその後血清を単離した。

生存曲線の比較を、ログランク（マンテル－コックス）検定を使用して実施した。血清総ビリルビンデータについて、コホート平均および平均の標準誤差（ＳＥＭ）を計算し報告した。スチューデントのｔ検定を血清総ビリルビンレベルデータで実施して、光線療法により成体期までレスキューされたマウスと比較して試験薬剤に関連するなんらかの影響があるかどうか決定した。

Ｃ．結果
マウスは前記研究の経過中に死亡しなかった。１０¹¹ゲノムコピー（ＧＣ）／マウスのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨを用いる新生仔遺伝子治療は、未処置ＵＧＴ１ ＫＯマウスでの５日間の生存期間からベクター処置されたマウスでの２７０日の生存期間までの有意に増加し（図２、ｐ＜０．０００１ ログランク（マンテル－コックス）検定による生存曲線の比較）、ＵＧＴ１ ＫＯマウスを出生直後期間の致死性高ビリルビン血症から保護した。

マウスは出生後第２８日から前記研究の最初の生存中（ｉｎ－ｌｉｆｅ ｐｈａｓｅ）を通して体重を測定した。全部の動物が前記研究期間中体重を増加し続けた。レスキューされたＵＧＴ１ ＫＯマウスは、それらのＷＴ及びヘテロ接合個体同腹仔に表現型上同一で体重も違いがないようである。

血清総ビリルビンレベルを出生後第２８日から前記研究の生存中期を通して分析した。ＡＡＶ処置されたＵＧＴ１ ＫＯマウスにおける血清総ビリルビンレベルは、ヘテロ接合及びＷＴ動物と比較して５．７倍だけ上昇したが、しかし、光線療法により成体期までレスキューされたＵＧＴ１ ＫＯマウスと比較して１５．２倍有意に低下した（ｐ＜０．０００１ スチューデントのｔ検定による比較）。肝細胞の増殖による肝臓内のベクターＧ
Ｃの希釈が総ビリルビンレベルに基づく若干の導入遺伝子発現の低下と不完全な長期是正とをもたらすが、該総ビリルビンレベルはヘテロ接合及びＷＴの同腹仔に比較して上昇している。従って、新生仔遺伝子治療は、出生直後期間の致死性高ビリルビン血症からＵＧＴ１ ＫＯマウスを保護し、生存率を有意に増大させた。レスキューされたＵＧＴ１ ＫＯマウスは、総ビリルビンレベルは上昇するがそれらのヘテロ接合及びＷＴの同腹仔と表現型上同一にみえる。

新生仔として試験薬剤を投与されたＵＧＴ１ ＫＯマウスをベクター投与後第２７０日に剖検し、肝を回収し、１０％ＮＢＦ中で固定し、ＵＧＴ１Ａ１についてのＩＨＣ染色のため処理した。染色は、前記マウスの生涯を通して持続的にＵＧＴ１Ａ１を発現する肝細胞を示す。

Ｄ．結論
ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨでの新生仔遺伝子治療は、出生直後期における致死性高ビリルビン血症からＵＧＴ１ ＫＯマウスを保護し、生存率を、未処置ＵＧＴ１ ＫＯマウスにおける５日から試験薬剤投与後２７０日まで有意に増大させた（未処置ＵＧＴ１ ＫＯマウスと比較してｐ＜０．０００１）。レスキューされたＵＧＴ１ ＫＯマウスは、総ビリルビンレベルが上昇するがそれらのヘテロ接合及びＷＴの同腹仔と表現型上同一なようであった。ＡＡＶ処置されたＵＧＴ１ ＫＯマウスにおける血清総ビリルビンレベルはヘテロ接合個体及びＷＴ動物と比較して５．７倍だけ上昇したが、しかし光線療法により成体期までレスキューされたＵＧＴ１ ＫＯマウスと比較した場合に１５．２倍低下した（ｐ＜０．０００１ スチューデントのｔ検定による比較）。肝細胞の増殖による肝臓内のベクターＧＣの希釈は、ヘテロ接合個体及びＷＴ同腹仔に比較して上昇された血清総ビリルビンレベルに基づき若干の導入遺伝子発現の低下及び不完全な長期是正をもたらした。

光線療法研究
Ａ．概要
この概念実証（ＰＯＣ）研究の目的は、ＣＮについての現在の処置戦略をモデル化するための試みにおいてＵＧＴ１ノックアウト（ＫＯ）マウスにおける光線療法の有効性を評価することであった。光線療法は、冒されたマウスを出生直後期間の致死性高ビリルビン血症から保護することによりＵＧＴ１ ＫＯマウスの成体期までの生存を可能にすることが以前に報告されている。

ヘテロ接合個体×ヘテロ接合個体の交尾後に出生したマウスの腹仔を、出生後２１日までの間、１日あたり１２時間青色蛍光（λ＝４５０ｎｍ；１０～３０μＷ／ｃｍ²／ｎｍ）に曝露した。離乳の時点（出生後第２１日）で全部の子孫を遺伝子型分類した。

本研究はこの執筆の時点で現在継続中であるが、６３尾のＵＧＴ１ ＫＯマウスが光線療法後に離乳した。これら動物は離乳後に光線療法の維持を必要とせず、前記マウスの大多数は正常な生存期間を示す。光線療法によりレスキューされたＵＧＴ１ ＫＯマウスは、ＡＡＶ遺伝子治療を受けたＵＧＴ１ ＫＯマウスと比較して有意に総ビリルビンレベルが上昇した（ｐ＜０．０００１ スチューデントのｔ検定による比較）。

ＵＧＴ１ ＫＯマウスモデルでは、出生直後期間の光線療法は動物を核黄疸から保護し；３～４週後に光線療法を中止でき、前記動物は生存するがしかし持続的高ビリルビン血症を伴う。光線療法を用いる前処置は、蓋然性のある臨床シナリオのシミュレーションである、肝臓の増殖停止まで遺伝子治療ベクター投与を遅らせることを可能にする。

Ｂ．材料及び方法
マウスはヘテロ接合個体×ヘテロ接合個体の交尾後に生成した。出生した全部の仔を出生から試験薬剤に曝露した。離乳（出生後第２１日）にマウスに耳タグを付け、遺伝子型分類し、及び試験薬剤への曝露から除去した。

ヘテロ接合個体×ヘテロ接合個体マウスの交尾後出生した全部の仔を、出生後２１日までの間、１日あたり１２時間青色蛍光（λ＝４５０ｎｍ；１０～３０μＷ／ｃｍ²／ｎｍ）に曝露した。

試験薬剤の有効性を生存により決定した。未処置のＵＧＴ１ ＫＯマウスは、出生直後期間の致死性高ビリルビン血症のため出生の５日以内に死亡する。

動物の血清総ビリルビンレベルの変化が契約施設Ａｎｔｅｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃにより分析された。マウスを麻酔し、血液を前記研究の生存中の顎下法により又は剖検時の心穿刺により回収した。血液はラベル貼付された血清ゲル状分離剤褐色蓋管中に回収し、凝固させ、その後血清を単離した。

スチューデントのｔ検定を血清総ビリルビンレベルデータについて実施し光線療法により成体期までレスキューされたマウスに比較してなんらかの試験薬剤関連の影響があるかどうか決定した。

Ｃ．結果
図３を参照されたい。ＵＧＴ１ ＫＯマウスモデルにおいて、出生直後期間における光線療法は動物を核黄疸から保護し；３ないし４週後、光線療法を中止でき、前記動物は生存するがしかし持続的高ビリルビン血症を伴う。光線療法を用いる前処置は、蓋然性のある臨床シナリオのシミュレーションである、肝臓の増殖停止まで遺伝子治療ベクター投与を遅らせることを可能にする。

ＵＧＴ１ ＫＯマウスモデルにおけるベクターの全身投与後のｈＵＧＴ１Ａ１の有効性
有効性試験のため、新生仔を出生後１４日までの間１日あたり１２時間青色蛍光に曝露する。離乳の時点で全部の子孫を遺伝子型分類し、ＵＧＴ１－／－（ノックアウト）動物のみを前記試験に登録する。

オス及びメスＵＧＴ１ ＫＯマウス（６～１２週齢）に、５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇないし５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ（１０⁹ないし１０¹²ＧＣ／マウスに同等）完全対数単位（ｆｕｌｌ ｌｏｇ ｕｎｉｔ）で増大する４種の用量の１種のＩＶ注入により組換えベクターを投与する。コホートあたり７尾のオス及び７尾のメスマウスを用いて、ベクター投与後第２８日及び第９０日に剖検する。ベヒクルのみ（リン酸緩衝生理的食塩水［ＰＢＳ］）を投与されるマウスのコホートをベヒクル対照として含む。従って合計１４０尾のマウスをこの試験に使用する。

ベクター投与後に動物を全般的観察のため毎日監視する。定期的静脈切開をベクター投
与後に実施し、回収された血清を総、直接及び間接ビリルビンレベルについて評価する。加えて、血清アルブミン、ＡＬＴ及びＡＳＴレベルもまた評価する。屠殺の時点で、血液を、総、直接及び間接ビリルビンレベルに加えて全血球計算（ＣＢＣ）及び臨床化学のため回収する。完全剖検を、動物の内臓及び屍体の徹底的及び全身的検査及び解剖を伴い、タイムポイント毎に群あたり７尾（予期されない死亡がない場合）で実施する。組織を、ｑＰＣＲ及びＲＴ－ｑＰＣＲによるそれぞれベクター生体分布及び転写物発現のため剖検時に回収する。ＤＮＡ及びＲＮＡを、最高のベクター用量を投与されたマウス及びベヒクル対照を投与されたマウスから抽出する。

非臨床薬理／毒性試験
ＣＮ１の天然に存在する疾患モデルＧｕｎｎラットはＷｉｓｔａｒがバックグラウンドである。ＧｕｎｎラットでのＡＡＶ遺伝子治療を用いる従前の研究は、このモデルにおいてＡＡＶ８は肝を形質導入する効率がより低く、ＡＡＶ１は形質導入レベルがより高いことを示唆した（Ｓｅｐｐｅｎら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１３、１０８５－９２（２００６））。本ラット疾患モデルにおけるわれわれの遺伝子治療製品の評価の前に、野生型ＷｉｓｔａｒラットでのＡＡＶベクター形質導入比較研究を実施した。この研究は野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスでもまた実施した。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスがＵＧＴ１ ＫＯマウスのバックグラウンド系統であるためである。

簡潔には、この薬理／毒性試験のため、オス及びメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６～８週齢、重量２０～２８ｇ）に、以下のベクター：ＡＡＶ８．ＴＧＢ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨ（配列番号１５のベクターゲノムをその中にパッケージングしているＡＡＶ８キャプシド、２９３細胞中で三重トランスフェクション技術を使用して生成される）を投与する。この臨床候補ベクターを、５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇから５×１０¹³ＧＣ／ｋｇまで（１０¹⁰ないし１０¹²ＧＣ／マウスに同等）の完全又は半対数単位で増大する３用量の１種のＩＶ注入により投与する。ベヒクルのみ（リン酸緩衝生理的食塩水［ＰＢＳ］）を受領するマウスのコホートをベヒクル対照として含む。マウスを、コホートあたり７尾のオス及び７尾のメスマウスを用い第３、１４、９０及び１８０日に剖検する。従って合計２２４尾のマウスをこの試験に使用する。

ベクター投与後に動物を全般的観察のため毎日監視する。屠殺の時点で血液をＣＢＣ及び臨床化学のため回収する。多重ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）による炎症性サイトカインの存在の評価を、第３日に剖検されたマウスからのサンプルで実施し、ベースラインレベルと比較する。脾細胞をベクター投与後第１４日に剖検されるマウスから単離して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を評価する。ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴをＡＡＶ８キャプシド及びｈＵＧＴ１Ａ１特異的Ｔ細胞の存在を評価するため実施する。ＡＡＶ８中和抗体（ＮＡｂ）力価をベクター投与後第２８日に測定する。

完全剖検を、動物の内臓及び屍体の徹底的及び全身的検査及び解剖を伴いタイムポイントあたり群あたり７動物（予期されない死亡がない場合）で実施する。組織を、肉眼所見及び組織病理学検査、ベクターの生体分布並びに転写物発現レベルのため剖検時に回収する。ＤＮＡ及びＲＮＡを最高のベクター用量を投与されたマウス及びベヒクル対照を投与されたマウスから抽出する。

Ａ．概要
オス及びメスＷｉｓｔａｒラット並びにオス及びメスＣ５７ＢＬ／６マウス（全部６～８週齢）に、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現するＡＡＶ１、ＡＡＶ５及びＡＡＶ８ベクターの２用量を、尾静脈を介するＩＶ注入により投与した（１０¹²ＧＣ／ｋｇ及び１０¹³ＧＣ／ｋｇ）。ベクターの形質導入効率を、ベクター投与後第７日の肝臓内
のｅＧＦＰ発現の評価により比較した。最初の結果に基づき、前記試験をオス及びメスＷｉｓｔａｒラットの２個のさらなる群を含むよう拡大した。これらの群は、１０¹⁴ＧＣ／ｋｇのより高用量のＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｅＧＦＰベクターを受領し及びベクター投与された後第７日に剖検されたか、又は１０¹³ＧＣ／ｋｇの用量を受領し及びベクター投与後第１４日に剖検されたかのいずれかであった。

Ｗｉｓｔａｒラットにおいて、形質導入効率の差違は、同一用量のベクターのＩＶ投与後にＡＡＶキャプシド全部にわたり見られなかった。オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において、肝におけるＡＡＶ８形質導入効率は、１０¹³ＧＣ／ｋｇの用量で極めて高い導入遺伝子発現を伴い肝細胞の９７％で見られた。対照的に、同一ベクター用量で、ＡＡＶ８でのＷｉｓｔａｒラットにおける形質導入効率は実質的に低下した。また、ＡＡＶ８によるラット肝臓内への遺伝子移入の効率はマウスにおけるものと比較して実質的により低かった。具体的には、オスマウスは二倍体ゲノムあたり平均３０．６ＧＣのベクターを有し、及び、オスＷｉｓｔａｒラットは、肝で検出される二倍体ゲノムあたり平均１．７ＧＣのベクターを有した。

従って、マウスと比較してラットでは形質導入及び遺伝子移入効率が低いため、この種でのさらなる研究はＣＮ遺伝子治療の応用のための最小有効量の甚だしい過小評価につながるとみられる。しかしながら、ラットは若干の小レベルのＡＡＶ８遺伝子治療をなお受け入れる力があったため、ＣＮラット疾患モデルすなわちＧｕｎｎラットは、前記臨床候補が機能的であるという追加のエビデンスを提供するためになお使用する場合がある。さらに、Ｇｕｎｎラットは形質導入と有効性の間の関係を確立するのに有用であるとみられる。

Ｂ．材料及び方法
試験薬剤：ＡＡＶ１．ＴＢＧ．ｅＧＦＰ．ＢＧＨ
ＡＡＶ５．ＴＢＧ．ｅＧＦＰ．ＢＧＨ
ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｅＧＦＰ．ＢＧＨ
対照薬剤：リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）
試験薬剤の有効性を肝臓内の高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）発現により決定した。ｅＧＦＰ発現は可視化する場合と、画像をｅＧＦＰを発現する面積パーセントとして定量する場合との両方がある。組織を、ｅＧＦＰ発現を可視化するため以前に説明されたとおり（Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１８、１２６－３４（２０１０）、Ｗａｎｇら、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、２２、１３８９－４０１（２０１１）処理した。画像を撮影し、肝臓内のｅＧＦＰ発現を、以前に説明された（Ｗａｎｇら、２０１０、Ｗａｎｇら、２０１１）とおりｅＧＦＰを発現する面積のパーセンテージとして定量化した。組織サンプルを剖検の時点で急速凍結し、ＤＮＡをＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、米国カリフォルニア州バレンシア）を使用して抽出した。抽出されたＤＮＡ中のベクターＧＣの検出及び定量は、以前に説明された（Ｂｅｌｌら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ、１４、３４－４４（２００６）リアルタイムＰＣＲにより実施した。簡潔には、ゲノムＤＮＡを単離し、ベクターＧＣを、前記ベクターのＢＧＨポリＡ配列に対し設計されたプライマー／プローブを使用して定量した。

Ｃ．結果
肝臓内のｅＧＦＰ発現：Ｗｉｓｔａｒラットにおいて、形質導入効率の差違は、ベクター投与後第７日に剖検された動物において、同一用量のＩＶ注入投与後にＡＡＶキャプシド全部に見られなかった。評価された３種のキャプシド全部についてベクター形質導入レベルは非常に低く、ｅＧＦＰ肝細胞の数個のみが視野あたりに見られた。ＡＡＶ８ベクターの用量を１０¹⁴ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇに増大させること又は試験の持続期間をベクター投与後第１４日まで増大させることは、形質導入を増大させたが、しかし全体とし
てレベルは低いままであった。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、形質導入効率は、評価された３種のベクターのキャプシド全部について、Ｗｉｓｔａｒラットにおいて見られたものと比較して実質的に増大した。

ｅＧＦＰ発現及び遺伝子移入の定量：ＡＡＶ８を投与された動物について肝臓内の形質導入領域パーセンテージ及びベクターゲノムコピーを測定した（図４Ａ－４Ｂ）。オスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいて、肝臓内のＡＡＶ８形質導入効率は、１０¹³ＧＣ／ｋｇの用量で極めて高い導入遺伝子発現を伴い肝細胞の９７％で見られた（図４Ａ）。同一ベクター用量で、ＡＡＶ８でのＷｉｓｔａｒラットにおける形質導入効率は有意に低下した（図４Ｂ）。比較のため、図４Ａは、ラット（Ｗａｎｇら、２０１０、上で引用される）に比較して大きく上昇された形質導入効率を示したベクター投与後７日のアカゲザルでのわれわれの以前に公表された研究からの画像もまた包含し、及び、ラットにおける低い形質導入効率の理由を決定し、ＤＮＡを、回収された肝から抽出し及びベクターＧＣをｑＰＣＲにより定量した。興味深いことに、ＡＡＶ８によるラット肝臓内への遺伝子移入もまたマウスと比較して大きく低下し、ここでオスマウスは二倍体ゲノムあたり平均３０．６ＧＣを有し、及びオスＷｉｓｔａｒラットは肝臓内で検出される二倍体ゲノムあたり平均わずか１．７ＧＣを有する（図４Ｂ）。第７日のＮＨＰにおけるわれわれの以前に公表された研究から、肝臓内に存在する二倍体ゲノムあたり平均２３．２ＧＣが存在した。

４．結論
ラットにおける低下した形質導入及び遺伝子移入効率により、この種でのさらなる研究はＣＮ遺伝子治療の応用のための最小有効量の甚だしい過小評価につながるとみられることがありそうである。しかしながら、ラットは若干の小レベルのＡＡＶ８遺伝子治療をなお受け入れたため、ＣＮラット疾患モデルすなわちＧｕｎｎラットを、前記臨床候補が機能的であるという追加のエビデンスを提供するためになお使用する場合がある。さらに、Ｇｕｎｎラットは形質導入と有効性の間の関係を確立するのに有用であるとみられる。

比較のため、ベクター投与後７日のアカゲザルでのわれわれの以前に公表された研究は、肝臓内に存在する二倍体ゲノムあたり２３．２ＧＣで、ラットに比較して形質導入効率が大きく上昇した。

Ｇｕｎｎラットにおけるベクター投与の評価
Ａ．概要
この概念実証（ＰＯＣ）研究の目的は、クリグラー・ナジャー症候群（ＣＮ）の処置のため設計された最初のベクターＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨを評価することであった。このベクターをＧｕｎｎラットに投与して、ヒトＵＧＴ１Ａ１（ｈＵＧＴ１Ａ１）発現、及び総ビリルビンレベルを低下させる遺伝子治療アプローチの能力を評価した。ＧｕｎｎラットはＣＮの天然に存在する動物モデルである。

オス及びメスＧｕｎｎラットに、４週齢時に３×１０¹²若しくは３×１０¹³ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨ又はベヒクル対照（リン酸緩衝生理的食塩水［ＰＢＳ］）を静脈内（ＩＶ）注入した。ラットは総ビリルビンレベルの評価のため定期的に血を抜き取った。全部のパラメータがベヒクル対照を注入されたＧｕｎｎラットと比較された。

Ｇｕｎｎラットへの３×１０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨの全身投与は高ビリルビン血症（５．４ｍｇ／ｄｌ）を正常レベル（０．１～０．３ｍｇ／ｄｌ）に低下させた。従って、ＣＮのための第１世代遺伝子治療ベクターの全身投与はＧｕｎｎラットに特徴的な高ビリルビン血症を軽減した。

Ｂ．材料及び方法
この概念実証（ＰＯＣ）研究の目的は、クリグラー・ナジャー（ＣＮ）の処置のため設計された第１世代ベクター、ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨを、ＧｕｎｎラットでのｈＵＧＴ１Ａ１発現及び総ビリルビンレベルに関して評価することであった。リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）を対照として使用した。尾静脈を介する静脈内（ＩＶ）経路を使用のために選択したが、それはヒトにおいて前記疾患の臨床部位である肝臓を標的とするために使用される最も効率的な経路であるためであった。試験薬剤の有効性を血清中の総ビリルビンレベルにより決定した。加えて、免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析を実施して、肝臓内のｈＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現のレベルを測定した。動物の血清総ビリルビンレベルの変化を分析した。ラットを麻酔し、血液を、前記研究の生存中に後眼窩法により又は剖検時の心穿刺により回収した。血液はラベル貼付された血清ゲル状分離剤褐色蓋管中に回収し、凝固させ、その後血清を単離した。剖検の時点で組織を導入遺伝子発現のため回収した。肝サンプルを１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）中で固定し、ＩＨＣによる導入遺伝子発現の測定のため処理した。

Ｃ．結果－血清総ビリルビンレベルに対する試験薬剤の影響
血清総ビリルビンレベルを分析した。血清総ビリルビンレベルを、ベースライン値の範囲のため、ベースライン総ビリルビンのパーセンテージとしてプロットした。ベースライン値は、メスでの３．３～８．１ｍｇ／ｄｌから、及びオスでの３．０～７．２ｍｇ／ｄｌまでの範囲にわたった。ＡＡＶベクターのＩＶ投与後に、メス及びオス双方のＧｕｎｎラットにおいて総血清ビリルビンが用量依存的に減少した（図５Ａ－５Ｂ）。ベクター投与後第７日に、３×１０¹³ＧＣ／ｋｇの用量でメスＧｕｎｎラットにおいて総ビリルビンが平均９０％低下した。３×１０¹²ＧＣ／ｋｇのより低用量で、メスにおいて総ビリルビンが７０％低下した。オスＧｕｎｎラットにおいて、高用量のベクターの影響が強く、総ビリルビンが９３％低下した。しかしながら、１０倍より低い用量の試験薬剤では、血清総ビリルビンはわずか３９％低下した。従って、３×１０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨのＩＶ投与は、Ｇｕｎｎラットに存在する高ビリルビン血症を正常総ビリルビンレベルに低下させた。

免疫組織化学によるｈＵＧＴ１Ａ１発現：試験及び対照薬剤を投与されたＧｕｎｎラットをベクター投与後第９８～１３３日に剖検し、並びに肝を回収し、１０％ＮＢＦ中で固定し及びＵＧＴ１Ａ１についてのＩＨＣ染色のため処理した。染色はＵＧＴ１Ａ１を発現する肝細胞を示し、それは前記ラットの生涯を通して持続した）。

Ｃ．結論
３×１０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＷＰＲＥ．ＢＧＨのＧｕｎｎラットへの全身投与は、高ビリルビン血症（５．４ｍｇ／ｄｌ）を正常レベル（０．１～０．３ｍｇ／ｄｌ）に低下させた。従って、ＣＮのための第１世代遺伝子治療ベクターの全身投与はＧｕｎｎラットに特徴的な高ビリルビン血症を軽減させた。

ヒト以外の霊長類における非臨床試験薬理／毒性試験
Ａ．概要
この試験の目的は、アカゲザルでの静脈内（ＩＶ）投与後のＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨ（ＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏと称される）の潜在的毒性及び忍容性を評価することであった。この非臨床薬理／毒性試験のため、アカゲザルは末梢静脈中へのＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏの２種の用量の１種を注入投与された。この試験に使用された２種の用量は１．０×１０¹³及び２．５×１０¹³ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇであった。動物の１つのコホートはベヒクル対照としてのベヒクルのみ
（１×ダルベッコリン酸緩衝生理的食塩水［ＤＰＢＳ］＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８）を注入投与された。

ベクター投与後、動物を全般的観察のため毎日監視した。ヒト以外の霊長類（ＮＨＰ）は、包括的臨床病理学（白血球百分率（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｓ）を含む細胞数、臨床化学及び凝固パネル）について週１回、並びに遺伝子移入ベクターに対する免疫反応（ＡＡＶ８キャプシドに対する中和抗体［ＮＡｂ］、並びにＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価されるキャプシド及び導入遺伝子双方に対する末梢細胞傷害性Ｔリンパ球［ＣＴＬ］応答）について２週に１回監視した。

ベクター投与後第２８日に小開腹術処置を実施して肝組織を単離した。肝組織は、肝臓内のｈＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現のレベルを測定するための免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析によるを含む多様な方法により、導入遺伝子発現を評価した。

動物を試験又は対照薬剤投与後第５６日に屠殺した。血液を包括的臨床病理学及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）単離のため剖検時に回収した。屠殺された動物を剖検し、組織を包括的組織病理学的検査のため回収した。組織病理学スライドを盲検的なやり方で評価し及び専門家により相互評価した。リンパ球を肝、脾及び骨髄から回収して、剖検の時点のこれらの器官中のＣＴＬの存在を検査した。剖検時に採取された肝のサンプルは、肝臓内のｈＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現のレベルを測定するためのＩＨＣ分析、並びにそれぞれｑＰＣＲ及びＲＴ－ＰＣＲによるゲノムコピー及び導入遺伝子発現分析のためのＤＮＡ及びＲＮＡ抽出によるを含む多様な方法により、導入遺伝子発現についてもまた評価した。

動物は、いかなる明らかな長期又は短期臨床的後遺症も伴わず試験薬剤の注入によく耐えた。肝臓内のベクターＧＣのレベルはアカゲザルにおいて同一キャプシド（ＡＡＶ８）で以前に見られたものと同様であった。従って、有効性の標的器官、これは肝臓であるが、はまた毒性の最もありそうな起源かもしれないことが予測された。試験薬剤又は対照薬剤投与後第５６日の剖検時に回収された組織の詳細な精査が、肝における一部の最低限ないし軽度の所見を明らかにした。肝における所見は、門脈領域の最低限ないし軽度の単核細胞浸潤物、軽度被膜下線維症、最低限ないし軽度の胆管肥厚化、最低限の伊東細胞増生、及び１件の最低限の異物反応を含んだ。他の軽度の組織病理学所見は、心筋における単核細胞浸潤物、結腸の粘膜におけるリンパ形質細胞及び単核細胞浸潤物、直腸におけるリンパ球浸潤物、胃の粘膜におけるリンパ形質細胞浸潤物、並びに気管における単核細胞浸潤物を含んだ。胃腸所見はコホート全部にわたり認められ、及び試験薬剤の用量に無関係であった。低用量コホートからの１頭の動物において心外膜での単核細胞浸潤物の１件の中程度所見が存在した。

臨床病理学はトランスアミナーゼの異常に焦点を当てた。高用量の試験薬剤群（２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ）の１頭のサルを除き、ＡＬＴの上昇はベースラインの６倍未満及びＡＳＴについてベースラインの４倍未満であった（ベースラインレベルを上回る倍数変化は各サルについて個別に決定した）。投与コホートの動物間の変動により、唯一の統計学的に有意の差違は、線形混合モデル化を使用して全タイムポイントにわたって分析された場合の対照群に対する高用量の試験薬剤群の間のＡＳＴ値においてであった。ＡＬＴ又はＡＳＴレベルの上昇は、キャプシド又は導入遺伝子のＴ細胞応答と相関しなかった。サルＲＱ９２０１及びＲＡ１２６１におけるＣＴＬ応答は前記試験の終了まで持続した一方、ＡＬＴ及びＡＳＴ上昇は試験薬剤投与後第５６日までにベースラインレベルに向かって下方に傾いていたためである。興味深いことに、サルＲＡ１８４６で見られたｈＵＧＴ１Ａ１ペプチドプールＡに対する高度に特異的なＴ細胞応答の観察結果は、ベースラインレベルからのＡＬＴ又はＡＳＴ値のいかなる逸脱も存在しないのに発生した。これは、発現が臨床病理学の異常又はＴ細胞の出現により影響されないことを強く示唆する。

この試験からの使用された野生型アカゲザルは高ビリルビン血症を示さないため、このモデルにおける試験薬剤の有効性を確認することは不可能である。従って、最小有効量（ＭＥＤ）をＣＮのマウスモデルで決定した。

従って、臨床試験のデザインの情報を与えることができるこの薬理／毒性試験からの重要な知見は：
ＤＬＴは、この毒性試験で、アカゲザルで２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇであった試験された最高用量で観察されなかった。これは、実際のＭＴＤがこの用量より高いことを示唆する、
ことである。

これら試験から与えられるデータは、アカゲザルにおけるクリグラー・ナジャーの処置のためのＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨの安全性の一例を示す。

Ｂ．材料及び方法
ＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨ（あるいはＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏと称される）を無菌１×ダルベッコリン酸緩衝生理的食塩水（ＤＰＢＳ）＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８で希釈した。対照動物には試験薬剤を含有しないベヒクル緩衝液を注入することができる。これはこの試験のためのベヒクル対照としてはたらくことができる。ベヒクル対照（１×ダルベッコリン酸緩衝生理的食塩水［ＤＰＢＳ］；ｐＨ７．０～７．３；無カルシウム、無マグネシウム、無フェノールレッド）＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８）（一級ヒドロキシル基で終端する二官能性ブロックコポリマー非イオン性界面活性剤）。

オス及びメスアカゲザルをこの試験で使用した。試験薬剤群に割り当てられたＮＨＰは、１０ｍｌの容量中の体重１キログラム（ｋｇ）あたり１．０×１０¹³ゲノムコピー（ＧＣ）又は２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇいずれかのＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨを投与された。対照薬剤コホートに割り当てられたＮＨＰは１０ｍｌのベヒクル対照を投与された。試験及び対照薬剤は末梢静脈中に投与した。末梢静脈を介する静脈内（ＩＶ）経路は、それが前記疾患の臨床部位の肝を標的とするのに使用される最も効率的な経路であるため、使用のために選択されたが、それは、前記疾患の臨床部位の肝を標的とするのに使用される最も効率的な経路であるためであった。

１．０×１０¹³ＧＣ／ｋｇ及び２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨの用量をこの試験のため選んだ。われわれが臨床試験で投与することを提案する最高用量は１．０×１０¹³ＧＣ／ｋｇである。従って、この試験のため、臨床試験の最高用量である用量（１．０×１０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨ）及び臨床試験のため計画されている最高用量より２．５倍より高い用量（２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨ）を反映する用量を選択した。

ベースラインレベルと比較したＡＬＴ及びＡＳＴレベルの差違をウィルコクソン順位和検定により、及び全タイムポイントにわたるＡＬＴ及びＡＳＴ値の全体的差違を線形混合モデルを使用して、統計学的に解析した。２群間の比較は対応のないスチューデントのｔ検定を使用して実施し、複数の群間の比較は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後多重比較検定）を使用して実施した。全部の値は、別の方法で述べられない限り平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。野生型アカゲザルについての正常値の範囲は、試験動物についてベクター投与前に回収された全部の値の平均を取ること、及び標準偏差（ＳＤ）を計算することにより生成した。範囲は平均±ＳＤとして提示することがで
きる。平均の２ＳＤの外側の値は極値であるとみなすことができる。＜０．０５のｐ値を有意とみなした。

Ｃ．結果
全部のアカゲザルは、試験又は対照薬剤投与後第５６日のそれらの予定された剖検のタイムポイントまで生存した。全部のアカゲザルをそれらが麻酔された各時点に目視検査した。全部の変化又は異常を試験ファイルに書き留めた。前記試験の経過中に書き留められた異常は存在しなかった。前記試験を通して、動物の体重を試験プロトコルに列挙された各タイムポイントで監視した。全動物は前記試験の経過にわたりその体重を維持したか、又は徐々に体重を増やしし続けたかのいずれかであった。

アルカリホスファターゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベルに重点を置く肝機能検査（ＬＦＴ）を監視した。総ビリルビンのような肝の病態を反映する他のパラメータはずっと正常限界内にあった。

アカゲザルについての正常値の範囲は、ベクター投与前の試験動物について回収された全部の値の平均を取ること、及び標準偏差（ＳＤ）を計算することにより生成した。

ベクター投与前に、前記試験の動物全部にわたりＡＬＴのベースラインレベルの若干の変動が存在し、ＲＡ１２６０について第－１６日に１７Ｕ／ｌからＲＡ１２６１について第－７日に１１０Ｕ／ｌまでの範囲にわたった。ベクター投与後のＡＬＴ及びＡＳＴ値を平均ベースライン値（ベクター投与前第－１６、－７及び０日の平均）と比較した有意の変化について評価した。ベースラインレベルと比較してのＡＬＴ及びＡＳＴレベルの差違をウィルコクソン順位和検定により統計学的に解析した。同一用量の試験薬剤を投与された動物間の変動により、試験又は対照薬剤投与後のいずれの試験日の間にも有意の差違は存在しなかった。加えて、全部のタイムポイントにわたるＡＬＴ及びＡＳＴ値の全体的な差違を線形混合モデル化を使用して解析した。再度、同一用量の試験薬剤を投与された動物間の変動により、対照群に対し高用量の試験薬剤群（２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ）について（ｐ値＝０．１４２）、及び対照群に対し低用量の試験薬剤群（２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ）について（ｐ値＝０．５６４）ＡＬＴ値の、又は対照群に対し低用量の試験薬剤群について（ｐ値＝０．２５５）ＡＳＴ値の有意の差違は存在しなかった。対照群に対し高用量の試験薬剤からのＡＳＴ値の統計学的に有意の差違が存在した（ｐ値＝０．０１０）。

前記試験の開始前に、全部のアカゲザルを、ＧＴＰの免疫学コア（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｅ）によりＡＡＶ８キャプシドに対する中和抗体（ＮＡｂ）についてスクリーニングした。前記試験のため選択された全８頭の動物は血清陰性であった（ＮＡｂ力価＜１：５）。試験薬剤投与後に全動物がＡＡＶ８特異的ＮＡｂ応答を発生した。ベクター後第８日に、ＡＡＶ８ ＮＡｂの力価は＜１：５から１：４０～１：１２８０まで増加した。ＮＡｂ力価に対する試験薬剤の用量依存性の影響は存在しなかった。１．０×１０¹³ＧＣ／ｋｇ又は２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇいずれの試験薬剤の投与後第８日にもＮＡｂ力価の同様の及び重なる広がりが存在したためである。ベクター投与後第８日後に、ＡＡＶ８
ＮＡｂの力価はベクター投与後第１４及び２１日に徐々に低下した。興味深いことに、ＮＡｂ応答はベクター投与後第２８及び３５日に増大し、並びに前記試験の終了まで同様
のレベルに留まった。対照薬剤注入された動物は前記試験を通して血清陰性のままであったか又は１：５の力価を有した。注入されない動物におけるＡＡＶ８ ＮＡｂ力価の自然の変動は前に説明されている（Ｃａｌｃｅｄｏら、２０１６ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．）。

ＲＮＡを肝サンプルから抽出した。高用量の試験薬剤を投与された動物は肝臓内で平均してより高レベルのベクターＧＣを有した（図６Ａ及び６Ｂ）。試験薬剤投与群全部にわたる肝臓内の平均補正済み相対発現の比較後に、試験薬剤投与された群間で有意の差違は存在しなかった（スチューデントのｔ検定、ｐ＝０．４０８）。

Ｄ．概要
アカゲザルは、末梢静脈中にＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨ（配列番号１５のゲノムすなわちＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲ、２コピーのαｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＢＧプロモーター、配列番号１２のｈＵＧＴ１Ａ１、ＢＧＨポリＡを伴うＡＡＶ８キャプシド）の２種の用量の１種の注入を投与された。この試験のため使用された２種の用量は１．０×１０¹³及び２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇであった。動物の追加の１つのコホートはベヒクル対照として対照薬剤を投与された。血液を包括的臨床病理学のため示されるタイムポイントで回収した。動物を試験又は対照薬剤投与後第５６日に剖検し、組織を包括的組織病理学的検査のため回収した。試験の生存中期中及び剖検時双方の付加的評価は、抗ＡＡＶ８ ＮＡｂの分析、ＡＡＶ８キャプシド特異的及びｈＵＧＴ１Ａ１特異的末梢ＣＴＬ応答、肝、脾及び骨髄でのＣＴＬ応答、肝臓内のｈＵＧＴ１Ａ１発現についてのＩＨＣ、並びにベクターＧＣ及び導入遺伝子ｍＲＮＡ発現の測定を含んだ。

動物は、試験薬剤の注入をいかなる明白な長期又は短期臨床的後遺症も伴わず耐えた。肝でのベクターＧＣのレベルは、アカゲザルにおいて同一キャプシド（ＡＡＶ８）で以前に見られたものと同様であった。従って、有効性のための標的臓器、それは肝臓であるが、はまた毒性の最もありそうな供給源かもしれないことが予測された。試験又は対照薬剤投与後第５６日の剖検時に回収された組織の詳細な精査は、肝における若干の最低限ないし軽度の所見を明らかにした。肝における所見は、門脈領域における最低限ないし軽度の単核細胞浸潤物、軽度被膜下線維症、最低限ないし軽度の胆管肥厚化、最低限の伊東細胞増生及び１件の最低限の異物反応を包含した。他の軽度の組織病理学所見は、心筋における単核細胞浸潤物、結腸の粘膜におけるリンパ形質細胞及び単核細胞浸潤物、直腸におけるリンパ球浸潤物、胃の粘膜におけるリンパ形質細胞浸潤物、並びに気管における単核細胞浸潤物を含んだ。胃腸所見はコホート全部にわたり発生し、及び試験薬剤の用量に無関係であった。低用量コホートからの１頭の動物で、心外膜における単核細胞浸潤物の１件の中程度所見が存在した。

臨床病理学はトランスアミナーゼの異常に焦点を当てた。高用量の試験薬剤群（２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ）の１頭のサルを除き、ＡＬＴの上昇はベースラインの６倍未満及びＡＳＴについてベースラインの４倍未満であった（ベースラインレベルを上回る倍数変化は各サルについて個別に決定した）。投与コホートの動物間の変動により、唯一の統計学的に有意の差違は、線形混合モデル化を使用して全タイムポイントにわたって分析された場合の対照群に対する高用量の試験薬剤群の間のＡＳＴ値においてであった。ＡＬＴ又はＡＳＴレベルの上昇はキャプシド又は導入遺伝子のＴ細胞応答と相関しなかった。サルＲＱ９２０１及びＲＡ１２６１におけるＣＴＬ応答は前記試験の終了まで持続した一方、ＡＬＴ及びＡＳＴの上昇は、試験薬剤投与後第５６日までにベースラインレベルに向かって下方に傾いていたためである。興味深いことに、サルＲＡ１８４６で見られたｈＵＧＴ１Ａ１ペプチドプールＡに対する高度に特異的なＴ細胞応答の観察結果は、ベースラインレベルからのＡＬＴ又はＡＳＴ値のいかなる逸脱も非存在下で発生した。これは、発現が臨床病理学の異常又はＴ細胞の出現により影響されないことを強く示唆する。

この試験から使用された野生型アカゲザルは高ビリルビン血症を示さないため、このモデルにおいて試験薬剤の有効性を確認することが不可能である。従って、最小有効量（ＭＥＤ）をＣＮのマウスモデルで決定した。

観察される用量制限毒性は存在せず、最大耐用量が２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇに等しい又はより大きいことを意味している。

ＵＧＴ１ノックアウトマウスにおけるＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏ．ＢＧＨの非臨床有効性試験
Ａ．概要
この試験の目的は、ＣＮマウスモデルＵＧＴ １ノックアウト（ＫＯ）マウスにおける最小有効量（ＭＥＤ）を決定することであった。ＵＧＴ１ ＫＯマウスは、ベクターＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ｍｏｄ．ＢＧＨ（図及び図の説明中でＡＡＶ８．ＴＢＧ．ｈＵＧＴ１Ａ１ｃｏと称される）の４用量の１種の尾静脈を介する静脈内（ＩＶ）注入を投与された。この試験のため使用される用量は２．５×１０¹⁰、２．５×１０¹¹、２．５×１０¹²及び２．５×１０¹³ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇであった。動物の１つのコホートはベヒクル対照としてベヒクルのみ（１×ダルベッコリン酸緩衝生理的食塩水［ＤＰＢＳ］＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８）を投与された。

群の投与日はＵＧＴ１ ＫＯマウスの利用可能性に基づきずらした。前記試験の開始時に、投与齢範囲内の利用可能なマウスを、最初に高用量ベクター群（２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ）及びベヒクル対照群にランダムに割り当てた。その後、マウスを以下の順序：２．５×１０¹²、２．５×１０¹⁰及び２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇでベクター投与群に割り当てた。ベクター投与後、動物を全般的観察のため毎日監視した。血液を、血清総ビリルビンレベルを把握するため示されるタイムポイントで動物から回収した。

動物を試験又は対照薬剤投与後第５６日に屠殺した。血液を血清化学パネル及び血液学パネルのため剖検時に回収した。屠殺された動物を剖検し、及び組織を包括的組織病理学的検査のため回収した。組織病理学スライドを盲検化された様式で評価し、及び専門家により相互評価した。所見が最高のベクター用量で観察された場合、その後のより低いベクター用量での同一組織を所見が存在しなくなるまで評価するか、又は全用量群を評価した。

試験薬剤の有効性を血清中の総ビリルビンレベルにより決定した。加えて、ウエスタンブロット及び免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析を実施して肝臓内のｈＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現のレベルを測定した。

いずれの群にも明らかな臨床的後遺症は存在せず、臨床病理学における異常は、ＡＬＴについてベースラインの１～９．１倍からの範囲にわたり及び最高用量の試験薬剤のベクター投与後第２８日にオスマウスで主に見出された、肝トランスアミナーゼＡＬＴ及びＡＳＴの上昇に限定された。前記異常は用量依存性であり、より低用量の試験薬剤を投与された動物では本質的に所見が存在しなかった。対照薬剤を投与されたオスマウスで組織病理学的所見は存在しなかった一方、所見の大多数は、最高用量の試験薬剤（２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ）を投与されたオスマウスにおいてであったが、しかし全部の所見が最低限ないし軽度であった。従って、見られる用量制限毒性は存在しなかったことが結論づけられ、最大耐用量は２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇの試験最高用量より大きいかこれに等しかったことを意味している。この用量での肝臓の病態の増加（最低限ないし軽度）の存在は、それが試験薬剤に関連することを示唆し、無作用量が２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇという次
のより低い用量であることを示す。

ＣＮの動物モデルにおけるこの試験の実施はＭＥＤが推定されることを可能にした。２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇより大きい試験薬剤の用量で、総ビリルビンレベルが０．１～０．３ｍｇ／ｄｌのベースラインレベルへ完全に復帰した。２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇの投与はベクター投与後第１４日にオスマウスにおいて血清総ビリルビンレベルの７９％低下をもたらし、それは第２８日に５７％低下に徐々に増大し、及び第４２日までにベースラインの高ビリルビン血症に戻り、並びに、単一のメスＵＧＴ１ ＫＯマウスにおける同一用量の投与はベースライン値からの逸脱をもたらさなかった。ＵＧＴ１ ＫＯマウスにおけるｈＵＧＴ１Ａ１の発現に関する性差が存在した一方、これがヒト以外の霊長類に適用されることは見られていない。従って、ＭＥＤは２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇに等しい。

Ｂ．方法
ＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨを無菌１×ダルベッコリン酸緩衝生理的食塩水（ＤＰＢＳ）＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８で希釈した。ベヒクル対照（１×ダルベッコリン酸緩衝生理的食塩水［ＤＰＢＳ］＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８）
６ないし２０週齢のオス及びメスＵＧＴ１ ＫＯマウス（ｎ＝５０、２５尾のオス及び２５尾のメス）をこの試験で使用し、ベクター投与後第５６日に剖検した。動物は耳タグを付けて５つのコホートのうちの１つに割り当てた。

尾静脈を介するＩＶ経路を使用のために選択したが、それは、尾静脈がヒトにおいて前記疾患の臨床部位である肝を標的とするのに使用される最も効率的な経路であるためであった。

ＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨの複数の用量レベルを検査した。最高用量は２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇであり、これは提案されている臨床試験の最高用量より２．５倍高い。選択された用量は１対数ずつ異なり、２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇ及び２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇであった。各群はオス及びメスそれぞれ５尾の動物を含んだ。群あたり５尾の動物は試験結果の統計学的解析を可能にするための最小数である。

試験薬剤の有効性を血清中の総ビリルビンレベルにより決定した。加えて、ウエスタンブロット及び免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析を実施して、肝臓内のｈＵＧＴ１Ａ１タンパク質発現のレベルを測定した。

体重、飼料消費量、ＡＬＴ、ＡＳＴ、総ビリルビン、ウエスタンブロット定量、ベクターＧＣ及びｈＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ転写物のデータについて、コホートの平均及び平均の標準誤差（ＳＥＭ）を計算し報告した。ベースラインレベルと比較したＡＬＴ、ＡＳＴ及び総ビリルビンレベルの差違をウィルコクソン順位和検定により、全タイムポイントにわたるＡＬＴ、ＡＳＴ及び総ビリルビン値の全体的差違を線形混合モデルを使用して、統計学的に解析した。２群間の比較は対応のないスチューデントのｔ検定を使用して実施し、及び、複数群間の比較は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後多重比較検定）を使用して実施した。全部の値は別の方法で述べられない限り平均±ＳＥＭとして表した。＜０．０５のｐ値を有意とみなした。

Ｃ．結果
前記試験の経過中に、マウスＩＤ ５２０５を臨床徴候（瀕死の状態を表し従って人道的理由上安楽死を必要とする）が認められたためベクター投与後第８日に安楽死させた。完全な剖検を実施し及び組織を回収した。試験薬剤又は対照薬剤投与後に動物を全般的観
察のため毎日監視した。全部の変化又は異常を試験ファイルに書き留めた。剖検タイムポイントの前に安楽死させたマウスＩＤ ５２０５を除き、前記試験に登録した４１尾のマウスからの１０尾について記録された観察結果が存在し、それは試験結果に影響を及ぼさなかった。これら１０尾のマウスの７尾が前記試験の生存中期中に支持療法での処置を必要とした。

血液化学の結果を、各タイムポイントで対照薬剤（１００μｌのベヒクル対照）を投与されたマウスと比較した統計学的変化（ｐ＜０．０５）について評価した。興味深いのは３種の別個のパラメータ；総ビリルビン、ＡＬＴ及びＡＳＴであった。群間に一貫した実質的差違が存在したからである。

肝機能検査（ＬＦＴ）における異常は試験薬剤の用量の増大とともに増大し、及び、ベースラインの４倍（橙及び赤に色を付けられる）より大きい上昇は、第１４日の最低用量群（２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇ）の１尾のオスマウス及び試験薬剤投与後第２８日の２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇの用量を投与された１尾のオスマウスを除き、最高用量群（２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ）に限定された。ＡＳＴの上昇は類似のパターンを示したが、しかし前記上昇は、試験薬剤投与後第５６日の２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇの用量を投与された１尾のメスマウスを除き、ベースラインの４倍未満（緑及び青に色を付けられる）に限定された。

全部のコホートにわたるＡＬＴ及びＡＳＴレベルの比較を線形混合モデル化を使用して実施し、性により層別化した。ＡＬＴについて、試験薬剤の最高用量２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇを投与されたオス及びメス双方のマウスで観察された、対照群と比較して有意の上昇が存在した（オスにつきｐ＝０．０１５、メスにつきｐ＝０．０４９）。ＡＳＴの有意の上昇は、最高の試験薬剤用量を投与されたメスマウスでのみ、対照群に比較して観察された（ｐ＝０．０４２）。

対照薬剤（ベヒクル対照）を注入されたＵＧＴ１ ＫＯマウスにおける総ビリルビンレベルは全タイムポイントにわたり同様であり、オスとメスの間にレベルの変動はなかった（図６）。期待されたとおり、われわれは、試験薬剤の全部の用量（２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇ、２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇ及び２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇのＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨ）で処置されたオス及びメス双方のマウスにおいて、ベクター投与後第１４日までに総ビリルビンの急速かつ有意の低下を観察した。２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇより大きい試験薬剤の用量で、総ビリルビンレベルの０．１～０．３ｍｇ／ｄｌのベースラインレベルへの完全な復帰が存在した（図７）。２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇの投与はベクター投与後第１４日のオスマウスにおける血清総ビリルビンレベルの７９％低下をもたらし、これは第２８日に５７％低下まで徐々に増大し、第４２日までにベースラインの高ビリルビン血症に戻った（図７）。単一のメスＵＧＴ１ ＫＯマウスでの同一用量の投与はベースライン値からの逸脱をもたらさなかった。

全部のコホートにわたる総ビリルビンレベルの比較を線形混合モデル化を使用して実施し、性により層別化した。対照群に比較した総ビリルビンの有意の低下は、全用量群についてオスと、２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇ及び２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇを投与されたメスマウスとについて観察された（ｐ＜０．０５）。

剖検の時点で、肝をｈＵＧＴ１Ａ１導入遺伝子発現の測定のため回収した。肝サンプルを急速凍結し使用前は－８０℃で保存した。発現は、肝ホモジェネートでのウエスタンブロットによるｈＵＧＴ１Ａ１タンパク質レベルの検出により評価した。ヒトＵＧＴ１Ａ１特異的抗体を検出のため使用し、及びウエスタンブロット画像を陽性対照サンプルからの
同一量のタンパク質に対し定量した。オスマウスにおけるｈＵＧＴ１Ａ１の発現は、２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇから２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇまでの試験薬剤の用量とともに有意に増大した（ｐ＜０．０５、図８）。２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇを注入されたオスマウスについてのバンドは検出限界より下であった。

ＲＮＡを肝サンプルから抽出した。ＴａｑＭａｎ ｑＰＣＲ反応を実施した。オスマウスの肝臓内のｈＵＧＴ１Ａ１ ｍＲＮＡ転写物の発現は、２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇから２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇまでの試験薬剤の用量で有意に異ならなかった（図９Ａ－９Ｂ）。

Ｄ．結果の概要
６～２０週齢のオス及びメスＵＧＴ１ ＫＯマウスにＡＡＶ８．ＴＢＧ．Ｕ２０１ＤＰｍｏｄ．ＢＧＨの４種の用量［２．５×１０¹⁰、２．５×１０¹¹、２．５×１０¹²及び２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ］の１種をＩＶ投与した。選ばれた用量は、臨床試験の提案されている投与レジメンの範囲を反映するためであった。動物の１つ追加コホートはベヒクル対照として対照薬剤を投与された。血液を、総ビリルビンレベルを把握するため、示されたタイムポイントで動物から回収した。動物を試験又は対照薬剤投与後第５６日に剖検し、組織を包括的組織病理学的検査のため回収した。加えて、血液を血清化学パネル及び血液学パネルのため回収した。

多数の因子を本試験のデザインにおいて考慮した。最初に、われわれは２つの理由で、（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいてよりむしろ）ＵＧＴ１ ＫＯマウスにおいて実験を実施することを選択した。第１に、この系統のマウスを使用することはわれわれが毒性と同時に有効性を評価することを可能にするであろう。第２に、われわれは、ＵＧＴ１Ａ１の欠損と関連するいずれかの病態並びに関連する高ビリルビン血症及びその後遺症の状況においてベクター関連の毒性を評価することを欲した。われわれは前記モデルに肝の病態が存在することを期待しなかった一方、われわれは、何らかのレベルの慢性重度高ビリルビン血症がベクターに対する宿主肝の応答に影響する場合があるとみられることを懸念した。

重要な所見は以下のとおりである：
・臨床的後遺症なし
・有効性
・２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇより大きい試験薬剤の用量で、総ビリルビンレベルの０．１～０．３ｍｇ／ｄｌのベースラインレベルへの完全な復帰が存在した。
・対照群と比較した総ビリルビンの有意の低下が、全４用量群（２．５×１０¹⁰～２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ）についてオスで、並びに２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇ及び２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇを投与されたメスマウスについて観察された（ｐ＜０．０５）。
・２．５×１０¹⁰ＧＣ／ｋｇの投与はベクター投与後第１４日にオスマウスにおいて血清総ビリルビンレベルの７９％低下をもたらし、これは第２８日に５７％低下まで徐々に増大し、及び第４２日までにベースラインの高ビリルビン血症に戻った。
・単一のメスＵＧＴ１ ＫＯマウスにおける同一用量の投与はベースライン値からの逸脱をもたらさなかった。
・マウスでの発現で見られる性差はヒト以外の霊長類に適用されることが認められなかった。従って、ＭＥＤは２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇに等しい。
・臨床病理学
・トランスアミナーゼ：異常は、ＡＬＴについてベースラインの１～９．１倍の範囲にわたり、主に最高用量の試験薬剤のベクター投与後第２８日にオスマウスで見出された、肝機能検査ＡＬＴ及びＡＳＴの上昇に限られた。前記異常は用量依存性であり、より低用量の試験薬剤を投与された動物で本質的に所見が存在しなかった。従って、われわれは、こ
れらの基準に基づく無作用量が２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇであることを結論する。
・病理学：３つの巨視的観察結果が存在し、そのいずれも肝（この遺伝子治療アプローチの標的臓器）を関与させなかった。組織病理学は、後に続くとおり肝における最低限又は軽度の所見に限定された：
・対照薬剤を投与されたオス及びメスマウスは、１尾のオスマウスにおける小葉中心性単一細胞肝細胞壊死／変性及び毛細胆管内胆汁うっ滞の最低限の所見を除き、検出された異常を有しなかった。
・全体として、メスマウスの肝において所見より少なかった。高用量の試験薬剤（２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ）を投与された１尾のマウス及び２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇを投与された１尾のマウスにおいて、小葉中心性単一細胞肝細胞壊死／変性及び単核細胞浸潤の最低限の所見のみが観察された。加えて、２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇを投与されたメスマウスは肝細胞有糸分裂像及び胆汁うっ滞もまた有った。
・最低限の小葉中心性単一細胞肝細胞壊死／変性はオスＵＧＴ１ ＫＯマウスの全コホートで見られた。しかしながら、高用量の試験薬剤コホート（２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ）において、小葉中心性単一細胞肝細胞壊死／変性の２件の軽度所見もまた存在した。このコホートは、単核細胞浸潤、肝細胞有糸分裂像及び胆汁うっ滞の最低限の所見もまた示した。
・肝以外の組織は、高用量の試験薬剤（２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ）及び対照薬剤投与されたマウスについてのみ精査した。唯一の他の観察結果は、肺（対照薬剤を投与されたオス及びメスマウスにおける肺胞マクロファージ中の好酸性物質の最低限及び軽度の蓄積）、子宮（対照薬剤を投与された１尾のメスマウスにおける最低限の限局性亜急性炎症）並びに注入部位の皮膚（高用量の試験薬剤を投与された１尾のメスマウスにおける皮膚線維症）における所見であった。

見られた用量制限毒性は存在せず、最大耐用量が、２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇであった試験最高用量より大きい又はこれに等しかったことを意味している
最高用量（２．５×１０¹³ＧＣ／ｋｇ）での肝の病態の軽度所見に基づき、われわれは、無作用量が２．５×１０¹²ＧＣ／ｋｇという次のより低い用量であることを提案する。

ＭＥＤは２．５×１０¹¹ＧＣ／ｋｇに等しい。

以下の情報は数字見出し＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列について提供される。

本出願で引用される全部の刊行物、特許、特許出願、及び本明細書で参照される配列表、ならびに米国仮出願第６２／３４８，０２９号、２０１６年６月９日出願及び同第６２／２６６，９６９号、２０１５年１２月１４日出願は、各個々の刊行物又は特許出願が引用することにより組み込まれることをとりわけ及び個別に示されたかのようにそっくりそのまま引用することによりここに組み込まれる。前述の発明は理解の明快さの目的上具体的説明及び実施例によって若干詳細に説明されたとはいえ、ある種の変更及び改変を、付属として付けられる請求の範囲の技術思想又は範囲から離れることなくそれに対しする場合があることが、本発明の教示に照らして当業者に容易に明らかであることができる。

Claims (19)

1. 肝臓に対する指向性を有するＡＡVキャプシド及びベクターゲノムを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記ベクターゲノムが、
   （ａ）５’末端逆位（ＩＴＲ）配列；
   （ｂ）チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター配列；
   （ｃ）ＵＧＴ１Ａ１コーディング配列が配列番号１２であるか又はヒトＵＧＴ１Ａ１をコードしそれに最低９９％同一の配列である、ヒトＵＧＴ１Ａ１の転写及び／又は発現を指図する発現制御配列に操作可能に連結されているＵＧＴ１Ａ１コーディング配列；及び、
   （ｄ）３’ＩＴＲ配列、
   を含んでなる、
   ベクター。
2. 前記ＡＡＶキャプシドがＡＡＶ８キャプシド又はＡＡＶｈｕ．３７キャプシドである、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
3. 前記ＵＧＴ１Ａ１コーディング配列が配列番号１２又は配列番号３である、請求項１又は２に記載のＡＡＶベクター。
4. 前記ベクターゲノムが、天然の分泌シグナルの代わりに用いられる異種分泌シグナルを含む、請求項１ないし３のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
5. 前記ベクターゲノムが複数のエンハンサーを含む、請求項１ないし４のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
6. 前記複数のエンハンサーが、２コピーのα－１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーを含む、請求項５に記載のＡＡＶベクター。
7. 前記キャプシドがＡＡＶ８キャプシドであり、前記ＵＧＴ１Ａ１コーディング配列が配列番号１２の核酸配列を含み、及び前記ベクターゲノムがウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリAシグナルを更に含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
8. 前記ベクターゲノムが、配列番号１５の核酸配列を含む、請求項１ないし７のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
9. 前記ＡＡＶキャプシドがＡＡＶ８キャプシド又はＡＡＶｈｕ．３７キャプシドである、請求項８に記載のＡＡＶベクター。
10. 前記ベクターが、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質を含むＡＡＶ８キャプシドを有するＤＮＡｓｅ抵抗性粒子であり、ＡＡＶ８ ＶＰ１が配列番号１１のアミノ酸配列を有する、請求項１ないし９のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター。
11. 製剤緩衝液中に請求項１ないし１０のいずれか１つに記載のＡＡＶベクターを含む組成物。
12. 前記製剤緩衝液がリン酸緩衝生理的食塩水及び界面活性剤を含む、請求項１１に記載の組成物。
13. クリグラー・ナジャー症候群Ｉ若しくはＩＩ型又はジルベール症候群を有する患者の処置における使用のための、請求項１ないし１０のいずれか１つに記載のＡＡＶベクター又は請求項１１若しくは１２に記載の組成物。
14. 患者が免疫抑制剤及び／又は光線療法で同時処置される、請求項１３に記載の使用のためのＡＡＶベクター。
15. 配列番号１２のＵＧＴ１Ａ１コーディング配列か、又はヒトＵＧＴ１Ａ１をコードしそれに最低９９％同一の配列か、又はそれらの機能的フラグメント、を含む核酸。
16. 配列番号３、１２又は１５の核酸配列を含む、請求項１５に記載の核酸。
17. 請求項１５又は１６に記載の核酸を含む、プラスミド。
18. 請求項１５ないし１７のいずれかに記載の核酸と、製薬学的に許容できる担体、希釈剤及び／又は賦形剤とを含む、組成物。
19. クリグラー・ナジャー症候群Ｉ若しくはＩＩ型又はジルベール症候群の処置のための、請求項１５又は１６に記載の核酸か、または請求項１８に記載の組成物を含んでなる、医薬組成物。

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