JP4029896B2 - キャピラリアレイ - Google Patents

Description

本発明はＤＮＡ，蛋白質等の試料を分離分析するキャピラリアレイ電気泳動装置に用いられるキャピラリアレイに関する。

複数のキャピラリを組み合わせてアレイを構成し、各キャピラリに電気泳動媒体と分析又は分離すべき試料を供給，移動させて、対象となる試料を分離・分析などに利用する技術はよく知られている。蛍光物質で標識されたＤＮＡ，蛋白質などの試料をキャピラリに供給する。このような技術は、米国特許第５３６６６０８，同５５２９６７９，同
５５１６４０９，同５７３０８５０，同５７９０７２７，同５５８２７０５，同5439578，同５２７４２４０などに記載されている。分離・分析のスループットの観点からすると、平板ゲルを用いた電気泳動法よりもマルチキャピラリを用いた方が、多くの利点がある。

特開平９−９６６２３号公報には、マルチキャピラリアレイを用いて、蛍光標識された試料を電気泳動により分離・分析する技術が開示されている。キャピラリアレイ電気泳動装置の基本構成は、キャピラリアレイ，レーザ光源等からなる励起光学系，蛍光を検出する受光光学系及び電気泳動させるための電圧印加部等より構成される。キャピラリアレイは、キャピラリを平面状に配列した構造で、キャピラリの配列面と平行方向から、蛍光体で標識された試料（蛍光試料）が満たされたキャピラリにレーザを照射し、キャピラリのレンズ作用によってレーザを集光させることにより、すべてのキャピラリ内の蛍光試料にレーザを照射する。レーザが照射させられた蛍光試料は蛍光を発光する。レーザの照射方向とほぼ垂直方向に発光する蛍光試料からの蛍光を受光光学系で検出することにより、試料測定を行う装置である。

この公報においてはアレイの検知部は概略図で記載されているが、電気泳動装置に組み込むための具体的なキャピラリアレイの全体構成は記載されていない。

米国特許第５３６６６０８ 米国特許第５５２９６７９ 米国特許第５５１６４０９ 米国特許第５７３０８５０ 米国特許第５７９０７２７ 米国特許第５５８２７０５ 米国特許第５４３９５７８ 米国特許第５２７４２４０ 特開平９−９６６２３号公報

本発明の目的は、上記キャピラリアレイ電気泳動装置に好適な具体的なキャピラリアレイの構成を提供することである。

本発明は、光検知部，緩衝液注部，電極内蔵キャピラリヘッドを備えたキャピラリアレイを提供する。本発明のキャピラリアレイは電気泳動装置に必要な機能を備えたものである。

本発明をより具体的に説明すると、表面にポリマー保護膜を有し、一端が束ねられ他端が広げられた複数のキャピラリと、該キャピラリが近接してほぼ平面上に整列されて上記ポリマー保護膜が除去された光検知部と、上記広げられたキャピラリを一体に保持し、電極を内蔵したヘッドと、該ヘッドに電気的に接続され、試料液中に浸漬される電極と、上記束ねられたキャピラリに設けられた他方の電極とを有するキャピラリアレイに関する。

また、他の実施態様によれば、保護被覆を有する複数のキャピラリの一端を束ねて、その端部を平滑に揃えて緩衝液注入口を形成し、該キャピラリの他端は電極を内蔵したキャピラリヘッドを貫通して、該電極と電気的に接続された金属管に挿入され、該キャピラリの中間部に光検知部を形成し、該光検知部はキャピラリの保護被覆を除去して、第１の支持基板と第２の支持基板とにより積層されて、該基板の一方に形成された窓から蛍光を発するように構成され、該支持基板の蛍光発射側とは反対側の面に黒塗を形成したキャピラリアレイが提供される。

該キャピラリアレイの光検知部の支持基板の一方にレーザ光が通過する溝を設け、その底面が蛍光の反射を減少するように加工してもよい。該キャピラリヘッドのキャピラリが切り揃えられて管に密に挿入され固定されている。固定の方法は接着剤を注入して硬化するなどの方法がある。該試料注入口を保護するキャップを取り付けることにより、キャピラリアレイの輸送，取り扱い，管理が安心して行える。また、使用中断中のキャピラリアレイの開放端の乾燥を防ぐことができる。該試料注入口におけるキャピラリを該金属管からわずかに突出させる。

光検知部においては、蛍光を発生する窓とは反対側に反射光遮蔽膜を設けてノイズを減らすようにしてある。キャピラリアレイの試料供給部にはアレイヘッドの電極に電気的に接続した金属管電極が設けてあり、この中にキャピラリが挿入され、かつ金属管内で接着剤等により固定されている。

試料供給部の先端には、緩衝液を入れることができるキャップが取り付けられるようになっており、運搬中は試料供給部の先端を保護する。キャピラリアレイを電気泳動装置に組み込んで分離・分析に使用した後、分析を中断するときは、上記キャップに緩衝液を入れて、キャピラリ先端の乾燥を防止することによって、キャピラリがいつでも再使用できる状態に保持することができる。

本発明によれば、取り扱い性がよく、機械的な保護が十分確保され、しかも電気泳動装置に取り付け，取り外しが容易なキャピラリアレイを提供することができる。

以下、本発明の実施形態を図を参照して詳細に説明する。

図１は、本発明のキャピラリアレイを電気泳動システムに適用したときの概略図である。複数のキャピラリたとえば１６本をまとめて１つのアレイにする。光検知部２９には下部支持板ａ（ガラス基板）と上部支持板ｂ（シリコン基板）が設けられ、キャピラリのポリイミド被覆を除去して透明にした部分が、窓に設けられる。図２には本発明のキャピラリアレイの全体構造が示され、キャピラリ１，光検知部２９，キャピラリヘッド３０及び電極内蔵ロードヘッダ３１を備えている。キャピラリの先端は、電極管３２に挿入され、固定されている。電気泳動の電圧はキャピラリヘッド３０とロードヘッダ３１の間に掛けられる。

図１において、レーザ光源２０により発生するレーザ３３はビームスプリッター２２により２分割され、ミラー２１により進行方向が変更される。集光レンズ２３によりレーザ３３は集光され、キャピラリ１が配列する平面と平行方向から、キャピラリ１を照射する。キャピラリ１の内部は蛍光標識された試料（蛍光試料３４）で満たされており、レーザ３３を蛍光試料３４に照射することにより、蛍光試料３４が蛍光３５を発光する。蛍光
３５の検出は、キャピラリ１が配列する平面とほぼ垂直方向に発光する蛍光３５を、第１レンズ２４により平行光にし、光学フィルタ及び像分割プリズム２５により像分割をした後、第２レンズ２６によりＣＣＤカメラ２７に結像し、ＣＣＤカメラ２７により検出することにより行い、検出する測定データは処理演算装置２８により処理する。

なお、図１においては、レーザ３３は光検出部２９の両側から照射しているが、片側のみ照射させる構成でもよく、受光光学系においても、図１に示す構成に限るものではない。また、キャピラリ１の構成本数は１６本に限るものではなく、緩衝液注入口３０や導電性蛍光試料注入口３２の構成などについても図１に示す構成に限るものではない。

続いてキャピラリアレイ電気泳動装置の操作手順を説明する。緩衝液容器１７に入っている緩衝液３６を、緩衝液注入口３０からキャピラリ１内に注入する。次に蛍光試料３４で満たされた蛍光試料容器１８に導電性蛍光試料注入口３２を入れ、キャピラリ１内に蛍光試料３４を注入する。その後、導電性蛍光試料注入口３２を緩衝液の入った緩衝液容器（図では省略）に入れ、緩衝液注入口３０と蛍光試料注入口３１との間に高電圧電源１９により高電圧を印加することにより、電気泳動を生じさせる。電気泳動の移動速度は分子の電荷の大きさに比例し、分子の大きさに逆比例するので、蛍光試料３４は分離される。高電圧を長時間印加し続けることにより電気泳動を長時間生じさせ、この時に発光する蛍光３５を連続的に測定するものである。

光検出部の詳細構造が図３に示されている。図３においては、ガラス基板３とシリコン基板２との間に、ポリイミド被覆１０の除去部９を設けたキャピラリアレイ１を挟んでいる。ガラス基板にはレーザ光が通過する溝が形成され、その溝の底面はすりガラス１１になっている。なお、ガラス基板の溝部以外はレーザ非照射部５である。

シリコン基板２には蛍光を取り出すための窓６を有する窓枠７が設けられる。ガラス基板の外側には黒塗４６が形成され、蛍光の反射によるノイズを減少させる。

図４は、図３のレーザ非照射部５における断面を示す。

ポリイミド被覆が接触するガラス基板３表面は干渉縞が観察される程度に高精度に加工されており、平面度が高い。複数本のキャピラリはポリイミド樹脂１０を介して前述の高平坦面に接触させ、配列させてある。これにより複数本のキャピラリはガラス基板３に倣うことになり精度良く且つ簡単に配列することができる。シリコン基板２にはＶ溝８が形成され、キャピラリをこの溝内で整列する。

図５は、図３のレーザ照射部４における断面を示す。（ａ）は黒塗４６が無いときの説明図で、（ｂ）は黒塗４６が有るときの説明図である。

まず黒塗４６が無い（ａ）の時、レーザ４７は前述の精度良く配列された複数本のキャピラリを串刺しするように通過する。この時溶融石英管９の表面から散乱光５１がガラス基板３を通過し、ガラス基板３と対面する対面部材４９の表面の蛍光発生物質に照射され、その時発生する発光５２が溶融石英に戻り、さらに貫通窓６を通過して、第一レンズ
２４に向かい、ノイズを拾うことになる。また、ガラス基板３の裏面に蛍光発生物資５０が付着している場合でも同様で、ノイズとなる。

しかし、（ｂ）のように、ガラス基板３の裏に黒塗４６を施しておくと、対面部材に蛍光発生物質５０があっても、さらに黒塗４６を施した後に蛍光発生物質が付着しても、散乱光５１は黒塗４６に吸収され、ノイズの原因が取り除かれる。

もちろん、黒塗４６の物性は蛍光を発生しない塗料を使用する。代表的な塗る作業はシルクスクリーンなどが用いられる。もちろんその他の印刷方法でもかまわないし、手塗りでも十分である。

図６は、図３を上から見た代表的平面図で概略を示している。シリコン基板２は２点鎖線で示す。シリコン基板２に設けられている貫通窓６も２点鎖線で示してある。複数本のキャピラリが並んでいる状態を示してある。

図６によりキャピラリの整列を説明する。光検出部のキャピラリはその部分だけ、溶融石英管９を被覆しているポリイミド樹脂１０が除去されている。従来、この除去は１本毎に別々に所定の寸法だけ除去された後、その除去部分を整列させていた。この時１本毎のため所定の除去幅に加工誤差が生じ、除去幅がまちまちとなる。またその除去部の特に境界（ポリイミド樹脂１０が切れている境界）を合わせる様に整列させるが、この時にも合わせ誤差が生じ多くの作業時間が掛かる。通常、境界部分が合っていないことですぐに確認できる。最悪の場合は、ポリイミド樹脂が貫通窓６から見えることになり、検出に大きな影響を及ぼすことになる。

そこで、１本毎の被覆除去はやらないで、まずキャピラリを整列させた後、一括してポリイミド樹脂を除去すれば、複数本のキャピラリのポリイミド樹脂１０の除去部がきれいに整列される。前述の境界部が揃っていることですぐに確認できる。除去部の所定の幅、所定の位置は複数本のキャピラリを一緒に自由に変えられる。

図７は本発明の実施形態であるロードヘッダ部の説明図である。ロードヘッダ部は、キャピラリ２１１，金属管として電極ＳＵＳパイプ２１２，ホルダ２１４，ホルダカバー
２１５，電極２１６などから構成される。ホルダ内部は、燐青銅製の電極板２１６にSUSパイプ２１２を通して溶接したものが組込まれている。図７に示すように、キャピラリ
２１１は、ホルダカバー２１５の穴を経由して、ＳＵＳパイプの中を通し、ＳＵＳパイプの反対側端面に１mm弱突き出している。

キャピラリヘッドと蛍光検出部が組まれた１６本のキャピラリのロードヘッダ側の先端を、蛍光検出部の中心からＬ＋１０mmの長さに切り揃える。ここでＬは、ロードヘッダが組立完成後における蛍光検出部の中心からロードヘッダ先端までのキャピラリ長さで、シーケンサーの分離性能と泳動時間などから所定の長さが要求され、例えば、２２０，360，５００，８００mmなどに設計される。次に、キャピラリ２１１をロードヘッダカバー
２１５の穴から各キャピラリに対応したＳＵＳパイプ２１２を通す。そして、各キャピラリ２１１がＳＵＳパイプ２１２の先端から１０mmだけ出るように調整した状態で、ロードヘッダカバー２１５の穴に接着剤を注入し、各キャピラリ２１１をロードヘッダカバー
２１５に固定する。

次にロードヘッダ先端部の加工を説明する。図８はその説明図を示す拡大断面図である。図に示すように、ＳＵＳパイプ２１２とキャピラリ２１１の間に接着剤２１７を注入し、ＳＵＳパイプ２１２とキャピラリ２１１の隙間を封じる。その後、ブレードを用いた切断装置で、キャピラリ２１１の先端をＳＵＳパイプ２１２の端面から０.５〜１.０mmの長さに切断する。以上の方法により、ロードヘッダ先端から蛍光検出部までの各キャピラリ２１１の長さを一定に揃えることが可能で、１６本のキャピラリ２１１の泳動時間を均一に出来る。また、ＳＵＳパイプ２１２とキャピラリ２１１の隙間を封じた構造は、サンプル液が隙間に入るのを防止し、別サンプルを測定する場合のキャリーオーバーを防止するのに不可欠である。

次に、キャピラリ２１１のＳＵＳパイプ２１２先端からの長さは、ＤＮＡ分子をキャピラリ内に導入するための最適電場形成に０.５mm 以上が必要である。一方、図８に示すように、マイクロリッター程度の微量サンプルを測定するためには、キャピラリ２１１の先端長さは１.０mm 以下にする必要がある。０.５〜１.０mmの長さは、ＳＵＳパイプ２１２先端の接着剤封入作業と、キャピラリ先端の切断作業にも適切な長さである。

本発明の他の実施形態であるロードヘッダのＳＵＳパイプ２１２の先端形状を説明する。全体の構造は上記実施形態と同じであるが、ホルダに内蔵される側の先端を、円錐上に広げた形状のＳＵＳパイプ２１２を使用する。その結果、ロードヘッダカバー２１５の穴からキャピラリ２１１をＳＵＳパイプ２１２に挿入する時、両者の穴の同心度が多少ずれていても、容易に挿入でき、作業性が向上できる効果がある。

図９は本発明におけるキャピラリアレイの試料注入部とその保護キャップとの関係を示す斜視図である。キャピラリアレイのロードヘッダ３１の先端にある試料注入部をキャップ３４１にはめ込む様に構成する。これにより、キャピラリアレイの運搬時の保護を図ることができ、しかもキャピラリアレイを使用して電気泳動装置の運転を一次中断する場合、あるいは何らかの理由でキャピラリアレイを電気泳動装置から取り外して保管する場合、キャピラリ先端が乾燥しないように緩衝液などをキャップに入れてこの中にキャピラリアレイを浸しておく事でキャピラリアレイを保護できる。キャップ３４１のつば部１３４はロードヘッダ３１との密着を図る。

図１０は本発明におけるキャピラリヘッドとそ保護キャップとの関係を示す図である。３０にシリコンゴム製のキャップ１１１をはめ込む構成になっている。これにより、図９の保護キャップ３４１と同様、キャピラリアレイの運搬時の保護を図ることができる。また、キャピラリアレイを電気泳動装置から取り外して保管する場合、キャピラリヘッド先端の乾燥を防ぐことができる。

なお以上説明したキャピラリアレイにおいて使用しているキャピラリ１は、内径５０±１０μｍ，外径３４０±２０μｍの溶融石英チューブを使用する。溶融石英チューブはそれ自体だと非常に折損し易いので、１５±５μｍ厚さのポリイミド被覆をつける。キャピラリの内径は蛍光試料３４の微量化を考慮すると細い方が望ましいが、蛍光試料３４と溶融石英の屈折率差による凹レンズ効果を抑えるためには内径が細すぎない方が良い。溶融石英管内径を５０〜１００μｍが好ましい。また、外径は上記屈折率差による影響を抑えるためには、細い方が良いが、細くなると逆に静電気により組立てしづらくなるため、溶融石英管外径を２５０〜３５０μｍが好ましい。

また、キャピラリ１の被覆材としてはポリイミド樹脂１０に限る必要はなく、ポリイミド樹脂１０と同等の電気絶縁性、およびその他諸特性を持つ部材を用いてもよい。

以上のように、本発明のキャピラリアレイは、電気泳動装置に組み込むのに必要な光検知部，電圧印加部及び緩衝液ゲル供給部が一体となっており、電気泳動に必要な基本機能を備えたキャピラリアレイである。

本発明のキャピラリアレイが適用される電気泳動システムを示す概略図である。 本発明によるキャピラリアレイの構成を示す斜視図である。 本発明によるキャピラリアレイの光検知部の構成を示す分解図である。 本発明によるキャピラリアレイの光検知部の非照射部の構成を示す概略断面図である。 図３における黒塗の作用を説明する図である。 図３の平面図である。 ロードヘッダ近傍の構成を示す一部切り欠き斜視図である。 キャピラリ先端具体構成を説明する断面図である。 ロードヘッダと保護キャップとの関係を説明する斜視図である。 キャピラリヘッド部の構造を示す斜視図である。

符号の説明

１…キャピラリ、２…シリコン基板、３…ガラス基板、４…レーザ照射部、５…レーザ非照射部、６…貫通窓、７…貫通窓枠、８…Ｖ溝、９…除去所、１０…ポリイミド樹脂、１１…すりガラス面、４６…黒塗、２１２…ＳＵＳパイプ。

Claims (1)

1. 試料を注入できる試料注入端と、電気泳動媒体を注入できる他端と、を備える複数のキャピラリと、複数のキャピラリにおける試料注入端を広げて保持する試料供給部と、励起光が照射される複数のキャピラリの一部を整列する光検知部と、を含み電気泳動装置に取り付け，取り外しできるキャピラリアレイの保管方法であって、
   前記キャピラリアレイを電気泳動装置に取り付けて分離・分析に使用した後、キャピラリアレイを電気泳動装置から取り外し、
   緩衝液を入れたキャップを前記試料供給部に取り付け、前記試料注入端を前記緩衝液に浸して乾燥を防止し、キャピラリアレイを再使用できる状態に保持することを特徴とするキャピラリアレイの保管方法。

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