JP3996416B2 - 核酸ハイブリダイゼーションにおけるｂ／ｆ分離方法 - Google Patents
核酸ハイブリダイゼーションにおけるｂ／ｆ分離方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハイブリダイゼーション反応終了後の効率的なＢ／Ｆ分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸ハイブリダイゼーション法は、特定の遺伝子を特異的に検出する手段として広く利用されている。そのうち、プローブとして核酸プローブ固定化粒子を用い、反応容器中で液体サンプル中の標的核酸と核酸プローブ固定化粒子とをハイブリダイゼーションさせ、次いで固／液分離（Ｂ／Ｆ分離）した後、当該粒子上にハイブリダイズした標的核酸量を測定するハイブリダイゼーション法は、簡便かつ迅速なハイブリダイゼーション法であることから、特に注目されている。
【０００３】
Ｂ／Ｆ分離の簡便性等の点から、最近、核酸プローブ固定化用の粒子として磁性粒子が注目されている。当該磁性粒子を用いた場合のＢ／Ｆ分離手段としては、（１）反応容器の外側側面に磁力体を配し、磁性粒子を反応容器の内側面に吸着保持することにより、行う方法（特許第３１１５５０１号）、（２）反応容器の外側側面に回転する磁力体を配し、磁性粒子を反応容器の内側面に吸脱着させることにより、行う方法（特開平１１−１５６２３１号）、（３）溶液と隔てられたスリーブ中の磁気デバイスを用い、磁気デバイスを回転および／または昇降させることにより、スリーブの外壁に磁性粒子を吸着させて磁気回収、再懸濁する方法（特開平８−２９４２５号）等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記（１）〜（３）の方法でＢ／Ｆ分離を行った場合、反応容器やスリーブは通常プラスチックで作製されており、磁性粒子の種類によってはそれ自体がプラスチックに吸着しやすい特性をもっているため、磁力をオフにしても反応容器の内壁やスリーブに吸着したままになってしまい、その後測定する磁性粒子がうまく回収されず粒子数が減ることから、測定の感度（精度）が落ちてしまうことが判明した。また、測定の際には別の測定容器に移し替える手間が必要であった。
従って、本発明の目的は、もれなく磁性粒子を集めることができ、高感度で迅速なＢ／Ｆ分離手段を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、核酸ハイブリダイゼーション反応終了後のＢ／Ｆ分離について検討したところ、磁力制御することによりプローブ固定化磁性粒子を反応容器の底部のみに不動化するようにすれば、上清の吸引により容易に液体部が除去でき、さらに不動化状態で、又は磁力制御により磁性粒子を可動化後に洗浄液を注入して洗浄した後、磁性粒子をもれなく集めることができること、さらに洗浄液注入後磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返すと磁性粒子が動くので洗浄が効率的かつ容易にできることから、高い感度の測定ができ、さらにＢ／Ｆ分離後の測定にそのまま（反応容器を他の容器に移し替えることなく）移行できることを見出し本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、プローブとして核酸プローブ固定化磁性粒子を用いた核酸ハイブリダイゼーション反応終了後のＢ／Ｆ分離方法であって、次のＢ／Ｆ分離工程（１）、（２）及び（３）を行い、磁性粒子を反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御することを特徴とするＢ／Ｆ分離方法を提供するものである。
（１）当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御して上清を吸引除去する工程、（２）当該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御して当該磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入する工程、（３）磁石保持棒の貫通しない穴に永久磁石を挿入して永久磁石の一部の端面が突出するように永久磁石を保持し、磁石保持棒の外側には磁力を及ぼさない磁性体棒であって、反応容器の下部に配置した該磁性体棒を回転させて磁束の向きを変えることにより、磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返して洗浄液中の当該磁性粒子を動かす工程。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のＢ／Ｆ分離方法においては、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化されるように磁力制御すればよい。具体的には反応容器の下部に磁力発生源を配置し、反応容器下部の磁力をＯＮ、ＯＦＦすることにより、磁力制御すればよい。より具体的には、（１）反応容器下部に配置した永久磁石を鉛直方向にずらすことにより磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段（図１）、（２）反応容器下面で永久磁石を水平方向に例えば半ピッチあるいは、完全に取り除くようにずらすことにより、磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段、（３）永久磁石を備えた強磁性体を回転制御する手段、例えば反応容器下部に配置した永久磁石を埋め込んだ鉄などの磁性体丸棒を回転させ、磁束の向きを変えることにより磁力をＯＮ−ＯＦＦする手段（図２）、また、反応容器下部に配置した、磁石の一部の端面が突出するように磁石を保持した磁性体棒を回転させ、磁力をＯＮ−ＯＦＦする手段（図３）、（４）永久磁石のシールド材を水平方向にずらし、磁石のＯＮ−ＯＦＦをする手段、（５）丸型電磁石により磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段、（６）馬蹄型電磁石により磁力がＯＮ−ＯＦＦをする手段、（７）コアなしの電磁石を使って磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段等が挙げられる。
これらの磁力のＯＮ−ＯＦＦ手段のうち、（１）、（２）及び（３）の手段が簡便であることから好ましい。例えば、図３の手段を採用すると、磁束が磁石保持棒内部に引き寄せられることなく端面延長方向に伸びる為、磁石が有する磁力を効果的に反応容器へ向けることが可能となる。磁石を挿入する穴は貫通せず、磁力が漏洩しない十分な厚みを有する。これにより保持側端面の磁束は磁石保持棒内部を通り、保持棒の外側には磁力を及ぼさない為、磁力遮断時には反応容器への磁力を完全に遮断することが可能となる。
【０００８】
本発明のＢ／Ｆ分離工程は、ハイブリダイゼーション反応終了後、次の工程（１）及び（２）を所定回数繰り返すことにより行われる（手段ａ）。
（１）当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御して上清を吸引除去する工程、
（２）当該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御して当該磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入する工程。
【０００９】
また、本発明のＢ／Ｆ分離工程は、ハイブリダイゼーション反応終了後、次の工程（１）、（２）及び（３）を行ってもよい（手段ｂ）。
（１）当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御して上清を吸引除去する工程、
（２）当該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御して当該磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入する工程、
（３）磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返して洗浄液中の当該磁性粒子を動かす工程。
【００１０】
ここで、上記工程（１）において、反応容器下部の磁力をＯＮにすることにより磁性粒子を反応容器底部にのみ不動化した状態は、図１、図２及び図３の右側に示されている。通常、ハイブリダイゼーション用反応容器、例えば２４ウェル〜９６ウェルマイクロプレートは、底面が小さくなっているので、磁性粒子を底部のみに不動化すれば、磁性粒子として磁性細菌がつくる磁性ビーズのようなプラスチックに吸着しやすい粒子を用いた場合でも吸着がほとんどない。
【００１１】
工程（２）において、反応容器下部の磁力をＯＦＦしても磁性粒子は容器底に集まった状態を保持するが、洗浄液を注入することによりある程度拡散する。その後再度磁力をＯＮにして磁性粒子を底に不動化した状態で洗浄液を吸引・廃棄してもよいが、はじめから磁力をＯＮ状態で洗浄することも可能である。それにより、更に洗浄が迅速かつ効率的に行われる。
【００１２】
手段ａにおいて、工程（１）及び工程（２）は、１回以上、例えば１〜３回繰り返せばよい。
【００１３】
手段ｂの工程（３）は、反応容器への洗浄液の注入を１回だけとしたにもかかわらず、十分な洗浄を可能とし、磁性粒子に対する非特異的吸着物質を除去する手段である。手段ｂによれば、工程（１）及び工程（２）を２回繰り返す必要がないため、洗浄液注入後の上清吸引除去工程が省略できる。従って、上清吸引操作による磁性粒子を誤って吸引してしまうという危険性が低減できる。
【００１４】
反応容器下部の磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返すことにより洗浄液中の磁性粒子が動く原理は次の如くである。すなわち、自発磁化をもつ磁性粒子は、下から与える磁場がゼロのときには、それぞれのビーズのＮ極−Ｓ極が接触するように横たわっている。下から大きなＮ極の磁場を与えると、磁性粒子間の磁力相互作用を上回り、その場でちょうど９０度回転するようにして磁性粒子はＳ極側が下を向く。磁性粒子間の磁力相互作用は、お互いに反発しあう極同士が向き合うことになる。この状態から少しずつ強制磁場を小さくしていくと、磁性粒子間の磁力相互作用が上回る時点で、磁性粒子は”穂立ち”と呼ばれる倒立現象を起す。このように、強制的に磁場を制御して強→弱→切断というサイクルを繰り返すと、磁性粒子が洗浄液中で動き回ることになり、磁性粒子表面の非特異吸着物質を解放することが可能となる。
【００１５】
工程（２）又は工程（３）終了後磁力をＯＦＦにすれば、反応容器中にはＢ／Ｆ分離の終了した被測定用固相が残存する。また、Ｂ／Ｆ分離を行った反応容器を図示しない測定部にそのまま移行することにより、底に集められた磁気粒子の発光量あるいは蛍光量を測定することが可能となる。
【００１６】
本発明に使用される磁性粒子としては、水溶液中で不溶性であり且つ磁性を示すものであるならば特に限定されるものではない。例えば、FeO、γ-FeO、Co-γ-FeO、(NiCuZn)O・FeO、(CuZn)O・FeO、(MnZn)O・FeO、(NiZn)O・FeO、SrO・6FeO、BaO・6FeO、SiO2で被覆したFeO（粒径約200Ａ）〔Enzyme Microb.Tecnol.,vol2,p.2-10(1980)参照〕、各種の高分子材料（ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン等）とフェライトとの複合微粒子及び磁性細菌が菌体内に合成する磁性細菌粒子等が挙げられる。当該磁性細菌粒子は、磁区が粒子内で一定方向にあるシングルドメイン領域にあるため、磁石を反応容器の下部に配置することで反応容器底部の狭い領域に集めることができるため、特に好ましい。
【００１７】
尚、磁性細菌は、１９７０年代、アメリカで発見され、菌体内に５０〜１００nmの程度の粒径のマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）単結晶の微粒子が１０〜２０個ほど連なったマグネトソームと呼ばれるチェイン状の粒子を保持している。磁性細菌はこのマグネトソームを保持することで地磁気を感知し、磁力線の方向を認識することができる。磁性細菌は微好気性の細菌であり、地磁気を感知することで好気的な水面から微好気的な沈殿物表層へ磁力線に沿って泳ぐことができる。
斯かる磁性細菌は、ANALYTICAL CHEMISTRY,VOL. 63,No. 3,FEBRUARY 1,1991 P268-P272に示されるように、単菌分離され、大量培養が可能となっている。
この磁性細菌中の磁性粒子は、六角柱で粒径、形状が非常に均一であり、純度も高く、粒子を含む菌体の磁化を微粒子当りに換算すると約５０emu/gである。
また、保磁力は２３０ Oe で、単磁区構造をとっていることが確かめられている。また、この磁性粒子は、粒子表面が有機薄膜で覆われていることから金属の溶出がほとんど起こらず安定に存在し、水溶液中での分散性にも優れているといった特性を有している。
【００１８】
磁性細菌からの磁性細菌粒子の抽出方法には、フレンチプレスを用いた物理的圧力破砕、アルカリ煮沸、酵素処理、超音波破砕処理等が知られており、磁性細菌粒子を大量に得る場合には、フレンチプレスによる破砕が適している。抽出後、磁石等により磁性細菌粒子を分離すればよい。
【００１９】
核酸プローブ固定化磁性粒子としては、上記磁性粒子に標的遺伝子のプローブとなるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡが固定化されているものであれば制限されない。また、ＤＮＡの配列に対して特異的に結合能を有する物質であれば、これら以外でも使用することができる。標的遺伝子のプローブとなり得るＤＮＡは、それ自体公知のものを用いることができる。プローブの磁性粒子への固定化は、通常の架橋剤を利用した共有結合による固定化が好ましい。
【００２０】
本発明のＢ／Ｆ分離手段は、自動化されたハイブリダイゼーション装置を用いたハイブリダイゼーションに用いるのが好ましい。当該ハイブリダイゼーション装置としては、図４に示すように、少なくとも（ａ）反応容器保持具及び加温・冷却装置を備えてなるディネーチャー部５、（ｂ）反応容器保持具及び加温・冷却装置を備えてなるアニーリング部６、（ｃ）反応容器保持具及び磁力制御装置を備えてなり、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御できるＢ／Ｆ分離部７、（ｄ）チップラック１５を備えてなるチップラック収納部８、（ｅ）洗浄液収容容器を備えてなる洗浄液部１０、（ｆ）廃液収容容器を備えてなる廃液部９及び（ｇ）複数本のチップノズル１４を装備し、該チップノズルにチップを装着・脱着させる機構と、装着されたチップが処理液を吸引・注入する機構と、反応容器の把持及び離脱を自由に行わせることが可能なロボットハンド機構１３とを有し、Ｘ−Ｚ軸方向へ自在に移動可能なアームユニットを備えてなるヘッド部１２、より構成される自動核酸ハイブリダイゼーション装置が挙げられる。
【００２１】
このハイブリダイゼーション装置を用いれば、下記工程（１）〜（１０）を自動で行い、次いで反応容器中の標識核酸量を測定することにより、サンプル中の核酸が検出できる。
（１）核酸プローブ固定化磁性粒子と標識されたサンプル核酸が注入・混合された反応容器をディネーチャー部５に設置し、加温・冷却装置により反応容器中の温度を核酸のディネーチャー温度に設定し、当該温度を所定時間保持してサンプル核酸を一本鎖化する。このとき、反応容器中の磁性粒子は、磁力制御により可動化されている。
（２）アームユニットを稼働してディネーチャー部５の反応容器をアニーリング部６に移送する。
（３）アニーリング部６の加温・冷却装置により反応容器中の温度を核酸のアニーリング温度に設定し、当該温度を所定時間保持してアニーリングを行なう。
（４）アームユニットをアニーリング部６に移動し、反応容器をＢ／Ｆ分離部７に移送する。
（５）磁力制御装置を稼働して磁性粒子に結合したサンプル核酸を反応容器底部に不動化させる。
（６）アームユニットをチップラック収納部８に移動し、チップノズル１４にチップ１６を装着する。
（７）アームユニットをＢ／Ｆ分離部７に移動し、反応容器中の上清をチップノズル１４にて吸引する。
（８）アームユニットを廃液部９に移動し、チップノズル内の吸引上清を廃液部９の廃棄収容容器に排出する。
（９）アームユニットを洗浄液部１０に移動し、洗浄液収容容器から洗浄液を吸引し、Ｂ／Ｆ分離部７の反応容器中に洗浄液を注入する。
（１０）（７）〜（９）の洗浄操作を所定回数繰り返し、最後に反応容器に洗浄液を注入する。
【００２２】
さらに、ハイブリダイゼーションにおけるすべての反応、すなわち、ディネイチャー、アニーリング及びＢ／Ｆ分離のすべてが、一の反応容器中において行なわれるようにしたハイブリダイゼーション装置がより好ましい。このような装置としては、反応容器保持具、加温・冷却装置及び磁力制御装置を備えた反応部を有するハイブリダイゼーション装置が挙げられる。より具体的には、少なくとも（Ａ）反応容器保持具、加温・冷却装置及び磁力制御装置を備えてなる反応部１７、（Ｂ）チップラック及び廃液収容容器を備えてなるチップラック・廃液部１８、（Ｃ）洗浄液収容容器及び加温・冷却装置を備えてなる洗浄液部１９、及び（Ｄ）複数本のチップノズルを装備し、該チップノズルにチップを装着・脱着させる機構と、装着されたチップが処理液を吸引・注入する機構とを有し、Ｘ−Ｚ軸方向へ自在に移動可能なアームユニットを備えてなるヘッド部１２、より構成される自動核酸ハイブリダイゼーション装置（図５）である。ここで、（Ａ）の反応部における磁力制御装置は、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部にのみ不動化するように磁力制御可能である。
【００２３】
このハイブリダイゼーション装置を用いて、下記工程（１）〜（８）を自動で行い、次いで反応容器中の標識核酸量を測定すれば、サンプル中の核酸が検出できる。
（１）核酸プローブ固定化磁性粒子と標識されたサンプル核酸が注入・混合された反応容器を反応部に設置し、加温・冷却装置により反応容器中の温度を核酸のディネーチャー温度に設定し、当該温度を所定時間保持してサンプル核酸を一本鎖化する。このとき、反応容器中の磁性粒子は、磁力制御により可動化されている。
（２）反応容器中の温度を核酸のアニーリング温度に変更し、当該温度を所定時間保持してアニーリングを行なう。
（３）磁力制御装置を稼働して磁性粒子に結合したサンプル核酸を容器の底部に不動化させる。
（４）アームユニットを稼働してチップラック・廃液部に移動し、チップノズルにチップを装着する。
（５）アームユニットを反応部に移動し、反応容器中の上清をチップノズルにて吸引する。
（６）アームユニットをチップラック・廃液部に移動し、チップノズル内の吸引上清を廃棄収容容器に排出する。
（７）アームユニットを洗浄液部に移動し、洗浄液収容容器から予め加温・冷却装置によりアニーリング温度に温度調節された洗浄液を吸引し、反応部の反応容器中に洗浄液を注入する。
（８）（５）〜（７）の洗浄動作を所定回数繰り返し、最後に反応容器に洗浄液を注入する。
【００２４】
以下、図面に基づいて、本発明Ｂ／Ｆ分離方法に用いるハイブリダイゼーション装置の具体例を説明する。
図５は、自動核酸ハイブリダイゼーション装置の内部構成を示す概念図である。
図５中の反応部１７はサンプル核酸を一本鎖（ディネーチャー）化し、次いで一本鎖化されたサンプル核酸と特定の核酸プローブとのハイブリダイゼーション（アニーリング）を行い、次いでＢ／Ｆ分離を行う反応部であって、反応容器を収納保持するための保持具２０と、ディネーチャー及びアニーリングの各温度を調節する加温・冷却装置及び磁力制御装置２５で構成される（図６）。
【００２５】
図６に示すように、加温・冷却装置は、反応容器保持具２０を加温するヒータ２１と、これを冷却するチラー２２と、温度を制御するセンサー２３と、温度を制御する温度制御装置２４とを備えるものである。
温度制御装置２４は、ディネーチャーでは反応容器内部でディネーチャー反応を進行させる温度（一般的には９５℃前後であるが、サンプル核酸の長さが短い場合はこれよりも低くてもよい。）にコントロールされるように固定され、アニーリングでは、アニーリング温度（通常４０〜７０℃）にコントロールされるように固定される。また、温度制御装置のタイマー機能により反応時間もコントロールされる。
【００２６】
磁力制御装置２５は、前記の如く、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化されるように磁力制御できる装置であればよい。図６では、反応容器下部に配置した永久磁石を鉛直方向にずらすことにより磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段（図１）による磁力制御装置が示されている。磁力制御装置としては、永久磁石を備えた強磁性体を回転制御する磁力制御装置、例えば図２又は図３のように、反応容器下部に配置した永久磁石を埋め込んだ磁性体棒を回転させることで磁力をＯＮ−ＯＦＦする手段による磁力制御装置を用いることが好ましい。
【００２７】
ディネーチャー及びアニーリング反応時は、図１、図２及び図３の左側のように反応容器下部の磁力をＯＦＦにしておく。アニーリング反応終了後、前記の手段ａ、又は手段ｂにより洗浄、Ｂ／Ｆ分離を行う。
【００２８】
図５における１８は、チップラック・廃液部であって、洗浄液や試薬を分注するためのディスポチップを保持するチップラックと、Ｂ／Ｆ分離／洗浄時に反応部から吸い上げた廃液を排出し、留めておくための廃液収容容器をその下部に備えるものである。このように、チップラックと廃液収容容器をヘッド部の移動平面に対して垂直に配置することで省スペース化が図れる。
チップラックには、ディスポーザブルチップ（以下、ディスポチップ）のテーパ部を支えるよう穴が空けてあり、測定を開始する前はそこにディスポチップがささっている。
【００２９】
図５における１９は、洗浄液部であって、洗浄液収容容器と加温・冷却装置を備えるものである。洗浄液は、洗浄時に反応容器内の核酸が、温度変化によって非特異吸着や解離をしないよう、加温・冷却装置によりアニーリング温度と同じ温度にコントロールされる。
洗浄液部は必要に応じて複数設けることができる。例えばハイブリダイズされた核酸を検出するために免疫反応を行う場合は２つの洗浄液部が必要となる。
【００３０】
図５の１２は、ヘッド部であり、Ｘ−Ｚ軸方向へ移動自在のアームユニットを有し、当該アームユニットは、チップノズルと、ヘッド部を移動させる機構と、該ヘッド部を移動させることにより該チップノズルにチップを装着・脱着させる機構と、装着されたチップから処理液（廃液や洗浄液）を吸引・注入する機構、より構成されている。
【００３１】
このハイブリダーゼーション装置には、必要に応じて更に試薬収容容器を備えてなる試薬部（Ｅ）を設けることができる。例えば、ハイブリダイズされた核酸を検出するための標識が必要な場合は、当該標識試薬（例えばアルカリフォスファターゼ標識アンチ−ＤＩＧ Ｆａｂ'フラグメント（ａｎｔｉ−ＤＩＧ−ＡＰ）等）や酵素発色基質（例えば、アルカリフォスファターゼ発光基質等)を収納するための試薬部を設ける必要がある。
一方、予めサンプル核酸を標識したものを用いた場合には、本試薬部を設ける必要はない。
【００３２】
ここで用いられる核酸ハイブリダイゼーション法は、サンプル中の核酸と核酸プローブ固定化磁性粒子のハイブリダイゼーションを利用するものであれば、ハイブリダイゼーション法が１ステップ法であっても２ステップ法（サンドイッチ法）であってもよい。また、用いる核酸プローブも一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡのいずれであってもよい。
【００３３】
【実施例】
上記のハイブリダイゼーション装置（図５参照）を用いた核酸の検出法の具体例を以下に示す。
１．準備工程
（１）磁性細菌粒子の作製
磁性細菌粒子の生産のため、単菌分離された磁性細菌 Magnetopsirillum sp.AMB-1 (Matsunaga et al. 1991)をＭＳＧＭ培地（Blakemore et al. 1979）(100L)を用いて室温で約７日間、嫌気条件下で培養した。培養３日後にキナ酸鉄溶液を培養液１Ｌに対し４ｍＬ添加した。培養した菌体は１００００ｇ、４℃で連続遠心機を用いて回収した。１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）を用いて懸濁した。この菌体を、１５００ｋｇ／ｃｍ2の条件下でフレンチプレス（大岳製作所、５５０１Ｍ）を用いて破砕し、ネオジウム−ボロン（Ｎｄ−Ｂ）磁石を用いて破砕菌体から磁性細菌粒子を磁気回収した。得られた磁性細菌粒子は、超音波洗浄器（Kaijo Denki Co. Ltd., CA4481）を用いて、ＰＢＳ中で３回以上洗浄された後、ＰＢＳに懸濁され４℃で保存した。
【００３４】
（２）検出用プローブの合成
シアノバクテリアの１６ＳｒＤＮＡの領域において属特異的領域を検索し、１５〜２０塩基内において各属間で２〜３以上の塩基の差異が見られる領域を見出し、その領域からMicrocystis属特異的検出用プローブＤＮＡをデザインした。デザインしたプローブＤＮＡについて、５'末端にビオチン標識された合成オリゴＤＮＡを作製した。
【００３５】
（３）ＤＮＡ固定化磁性細菌粒子の作製
磁性細菌粒子への修飾は、磁性細菌膜上に存在すると考えられるアミノ基を利用した。まず、磁性細菌ＡＭＢ−１株より抽出・精製された磁性細菌粒子（ＢＭＰｓ）１ｍｇを２．５％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ１ｍＬ中に懸濁し、室温で３０分間反応させることにより、磁性細菌粒子膜上のアミノ基に対してアルデヒド基の導入を行った。反応後、磁気回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。
洗浄後、修飾ＢＭＰｓ １ｍｇに対して、ストレプトアビジン(New England Bio Labs.)１００μｇをＰＢＳ １ｍＬ中に懸濁し、室温で２時間反応させることによりＢＭＰｓとストレプトアビジンを架橋した。架橋後、ＰＢＳで３回磁気回収、及び洗浄を行った後、ＤＮＡの非特異吸着を押さえるためにＮａＢＨ4で未反応のアルデヒド基を還元し、ストレプトアビジン固定化ＢＭＰｓ（ＳＡ−ＢＭＰｓ）とした。作製したＳＡ−ＢＭＰｓ ３００μｇに対して５′末端にビオチン標識したオリゴＤＮＡ ３００ｐｍｏｌをＰＢＳ ３００μｌ中でアビジン・ビオチン反応を行わせ、オリゴＤＮＡ固定化磁性細菌粒子（ＤＮＡ−ＢＭＰｓ）を作製した。
【００３６】
（４）サンプルＤＮＡの調製
シアノバクテリアからのゲノムＤＮＡの抽出は、MagExtractor-genome-の抽出法を改良した方法により抽出を行った。抽出された全ゲノムＤＮＡに対して、原核微生物を１６ＳｒＤＮＡ増幅用プライマーＲＳＦ−１、ＲＳＲ−２（E.coli 1523-1542ntのアンチセンス）(Kawaguchi et al.1992)を用い、ＰＣＲによって遺伝子増幅を行った。
尚、遺伝子増幅の際に、蛍光、発光若しくは電気化学的シグナルによって検出可能な蛍光色素、アルカリフォスファターゼ、フェロセン等のマーカーで標識したｄＵＴＰを用いてＰＣＲを行うことで標識されたサンプル核酸を調製することができる。例えば、ＦＩＴＣ標識された１６ＳｒＤＮＡを合成する場合には、蛍光物質であるＦＩＴＣ標識されたｄＵＴＰを用いてＰＣＲを行えばよい。
【００３７】
（５）装置への試薬等の設置
▲１▼１００μｇのプローブＤＮＡ固定化磁性粒子と、１００μｌのサンプルＤＮＡをクイクロプレート等の反応容器で混合し、十分に攪拌した後、本装置の反応部に設置する。
▲２▼チップノズルを保持したチップラックを滅菌後、チップラック・廃液部に設置する。
▲３▼洗浄液を収容する洗浄液収容容器を、洗浄部に設置する。
【００３８】
２．ディネーチャー工程
装置の始動スイッチを投入し、反応部１の加温・冷却装置の温度制御機能を稼働させ、反応容器を９５℃に温める。このまま５分間保持することにより、反応容器中のサンプル核酸の一本鎖化を行う。
【００３９】
３．アニーリング工程
温度を６０℃に冷却し、このまま１０分間保持することにより、容器中の核酸プローブ固定化磁性細菌粒子とサンプル核酸のアニーリングを行う。
【００４０】
４．Ｂ／Ｆ分離
アニーリング終了後、容器真下に設置された磁気制御装置を稼働して磁気吸引力を発生させ、磁性粒子を容器底面に集める。磁気制御装置を動作させてから約３分間そのまま待機する。この時、反応容器は６０℃に維持される。
【００４１】
５．洗浄工程
チップラック・廃液部上に移動させたアームユニットを下方へ移動させ、チップノズルとディスポチップを嵌合させることで、チップラック・廃液部に保持されたチップノズルを装着する。アームユニットを反応部へ移動させ、そのまま降下させて、適当な位置で停止後、チップノズルにて反応容器中の上清を吸引し、廃液部に移動して排出させる。
その後、アームユニットを洗浄液部へ移動させ、洗浄液収容容器より６０℃に維持された洗浄液を吸引し、再びアームユニットを反応部へ移動させ、反応容器中にこれを注入する。約３分間の待機後、再びチップノズルで反応容器中の上清を吸引し、チップラック・廃液部に排出する。この洗浄動作を３回繰り返し、最後に洗浄液を注入し動作を終了する。
【００４２】
動作終了後も反応部の磁気吸引力は維持させ、温度は０〜１５℃、好ましくは４℃で維持するように制御する。これにより、反応溶液中の磁性体が容器底部に凝集した状態を保ち、溶液の性質が変質することを防ぐことができる。尚、洗浄液部の温度制御は切断する。また、反応容器には、装置外からの光を遮断するためのカバーを装着することにより、核酸中に取り込んだ蛍光物質の劣化を防ぐことができる。
【００４３】
６．検出
反応容器を装置から取出し、容器を移し替えることなく、蛍光プレートリーダ（ＦＬＵＯstarTM）によって反応容器内に生じる光の変化を測定する。
この結果、Microcystis aeruginosa NIES-98のＰＣＲ産物試料から最も強い発光が観察され、Microcystis属を特異的に検出できることが明らかとなった。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のＢ／Ｆ分離方法によれば、磁性粒子が反応容器に吸着したままになることがなく、磁性粒子をもれなく集めることによって高い感度の測定ができ、さらにＢ／Ｆ分離後の測定にそのまま（反応容器を他の容器に移し替えることなく）移行でき、ハイブリダイゼーションの自動化された装置によるハイブリダイゼーションが迅速かつ容易に実施可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】反応容器下部に配置した永久磁石を鉛直方向にずらすことにより磁力のＯＮ−ＯＦＦをする磁力制御の例を示す図である。
【図２】磁性粒子下部に配置した永久磁石を埋め込んだ磁性体丸棒を回転させ、磁束の向きを変えることにより磁力のＯＮ−ＯＦＦをする磁力制御の例を示す図である。
【図３】磁性粒子下部に配置した、磁石の一部の端面が突出するように磁石を保持した磁性体棒を回転させ、磁力をＯＮ−ＯＦＦする磁力制御の例を示す図である。
【図４】ハイブリダイゼーション装置の例の内部構成を示す図である。
【図５】ハイブリダイゼーション装置の例の内部構成を示す図である。
【図６】図５のハイブリダイゼーション装置の反応部の内部構成を示す図である。
【符号の説明】
１：反応容器
２：溶液
３：磁性粒子
４：磁石
５：ディネーチャー部
６：アニーリング部
７：Ｂ／Ｆ分離部
８：チップラック収納部
９：廃液部
10：洗浄液部
11：試薬部
12：ヘッド部
13：ロボットハンド機構
14：ノズル
15：チップラック
16：チップ
17：反応部
18：チップラック・廃液部
19：洗浄液部
20：反応容器保持具
21：ヒーター
22：チラー
23：温度センサー
24：温度制御装置
25：磁力制御装置
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハイブリダイゼーション反応終了後の効率的なＢ／Ｆ分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸ハイブリダイゼーション法は、特定の遺伝子を特異的に検出する手段として広く利用されている。そのうち、プローブとして核酸プローブ固定化粒子を用い、反応容器中で液体サンプル中の標的核酸と核酸プローブ固定化粒子とをハイブリダイゼーションさせ、次いで固／液分離（Ｂ／Ｆ分離）した後、当該粒子上にハイブリダイズした標的核酸量を測定するハイブリダイゼーション法は、簡便かつ迅速なハイブリダイゼーション法であることから、特に注目されている。
【０００３】
Ｂ／Ｆ分離の簡便性等の点から、最近、核酸プローブ固定化用の粒子として磁性粒子が注目されている。当該磁性粒子を用いた場合のＢ／Ｆ分離手段としては、（１）反応容器の外側側面に磁力体を配し、磁性粒子を反応容器の内側面に吸着保持することにより、行う方法（特許第３１１５５０１号）、（２）反応容器の外側側面に回転する磁力体を配し、磁性粒子を反応容器の内側面に吸脱着させることにより、行う方法（特開平１１−１５６２３１号）、（３）溶液と隔てられたスリーブ中の磁気デバイスを用い、磁気デバイスを回転および／または昇降させることにより、スリーブの外壁に磁性粒子を吸着させて磁気回収、再懸濁する方法（特開平８−２９４２５号）等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記（１）〜（３）の方法でＢ／Ｆ分離を行った場合、反応容器やスリーブは通常プラスチックで作製されており、磁性粒子の種類によってはそれ自体がプラスチックに吸着しやすい特性をもっているため、磁力をオフにしても反応容器の内壁やスリーブに吸着したままになってしまい、その後測定する磁性粒子がうまく回収されず粒子数が減ることから、測定の感度（精度）が落ちてしまうことが判明した。また、測定の際には別の測定容器に移し替える手間が必要であった。
従って、本発明の目的は、もれなく磁性粒子を集めることができ、高感度で迅速なＢ／Ｆ分離手段を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、核酸ハイブリダイゼーション反応終了後のＢ／Ｆ分離について検討したところ、磁力制御することによりプローブ固定化磁性粒子を反応容器の底部のみに不動化するようにすれば、上清の吸引により容易に液体部が除去でき、さらに不動化状態で、又は磁力制御により磁性粒子を可動化後に洗浄液を注入して洗浄した後、磁性粒子をもれなく集めることができること、さらに洗浄液注入後磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返すと磁性粒子が動くので洗浄が効率的かつ容易にできることから、高い感度の測定ができ、さらにＢ／Ｆ分離後の測定にそのまま（反応容器を他の容器に移し替えることなく）移行できることを見出し本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、プローブとして核酸プローブ固定化磁性粒子を用いた核酸ハイブリダイゼーション反応終了後のＢ／Ｆ分離方法であって、次のＢ／Ｆ分離工程（１）、（２）及び（３）を行い、磁性粒子を反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御することを特徴とするＢ／Ｆ分離方法を提供するものである。
（１）当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御して上清を吸引除去する工程、（２）当該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御して当該磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入する工程、（３）磁石保持棒の貫通しない穴に永久磁石を挿入して永久磁石の一部の端面が突出するように永久磁石を保持し、磁石保持棒の外側には磁力を及ぼさない磁性体棒であって、反応容器の下部に配置した該磁性体棒を回転させて磁束の向きを変えることにより、磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返して洗浄液中の当該磁性粒子を動かす工程。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のＢ／Ｆ分離方法においては、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化されるように磁力制御すればよい。具体的には反応容器の下部に磁力発生源を配置し、反応容器下部の磁力をＯＮ、ＯＦＦすることにより、磁力制御すればよい。より具体的には、（１）反応容器下部に配置した永久磁石を鉛直方向にずらすことにより磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段（図１）、（２）反応容器下面で永久磁石を水平方向に例えば半ピッチあるいは、完全に取り除くようにずらすことにより、磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段、（３）永久磁石を備えた強磁性体を回転制御する手段、例えば反応容器下部に配置した永久磁石を埋め込んだ鉄などの磁性体丸棒を回転させ、磁束の向きを変えることにより磁力をＯＮ−ＯＦＦする手段（図２）、また、反応容器下部に配置した、磁石の一部の端面が突出するように磁石を保持した磁性体棒を回転させ、磁力をＯＮ−ＯＦＦする手段（図３）、（４）永久磁石のシールド材を水平方向にずらし、磁石のＯＮ−ＯＦＦをする手段、（５）丸型電磁石により磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段、（６）馬蹄型電磁石により磁力がＯＮ−ＯＦＦをする手段、（７）コアなしの電磁石を使って磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段等が挙げられる。
これらの磁力のＯＮ−ＯＦＦ手段のうち、（１）、（２）及び（３）の手段が簡便であることから好ましい。例えば、図３の手段を採用すると、磁束が磁石保持棒内部に引き寄せられることなく端面延長方向に伸びる為、磁石が有する磁力を効果的に反応容器へ向けることが可能となる。磁石を挿入する穴は貫通せず、磁力が漏洩しない十分な厚みを有する。これにより保持側端面の磁束は磁石保持棒内部を通り、保持棒の外側には磁力を及ぼさない為、磁力遮断時には反応容器への磁力を完全に遮断することが可能となる。
【０００８】
本発明のＢ／Ｆ分離工程は、ハイブリダイゼーション反応終了後、次の工程（１）及び（２）を所定回数繰り返すことにより行われる（手段ａ）。
（１）当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御して上清を吸引除去する工程、
（２）当該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御して当該磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入する工程。
【０００９】
また、本発明のＢ／Ｆ分離工程は、ハイブリダイゼーション反応終了後、次の工程（１）、（２）及び（３）を行ってもよい（手段ｂ）。
（１）当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御して上清を吸引除去する工程、
（２）当該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御して当該磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入する工程、
（３）磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返して洗浄液中の当該磁性粒子を動かす工程。
【００１０】
ここで、上記工程（１）において、反応容器下部の磁力をＯＮにすることにより磁性粒子を反応容器底部にのみ不動化した状態は、図１、図２及び図３の右側に示されている。通常、ハイブリダイゼーション用反応容器、例えば２４ウェル〜９６ウェルマイクロプレートは、底面が小さくなっているので、磁性粒子を底部のみに不動化すれば、磁性粒子として磁性細菌がつくる磁性ビーズのようなプラスチックに吸着しやすい粒子を用いた場合でも吸着がほとんどない。
【００１１】
工程（２）において、反応容器下部の磁力をＯＦＦしても磁性粒子は容器底に集まった状態を保持するが、洗浄液を注入することによりある程度拡散する。その後再度磁力をＯＮにして磁性粒子を底に不動化した状態で洗浄液を吸引・廃棄してもよいが、はじめから磁力をＯＮ状態で洗浄することも可能である。それにより、更に洗浄が迅速かつ効率的に行われる。
【００１２】
手段ａにおいて、工程（１）及び工程（２）は、１回以上、例えば１〜３回繰り返せばよい。
【００１３】
手段ｂの工程（３）は、反応容器への洗浄液の注入を１回だけとしたにもかかわらず、十分な洗浄を可能とし、磁性粒子に対する非特異的吸着物質を除去する手段である。手段ｂによれば、工程（１）及び工程（２）を２回繰り返す必要がないため、洗浄液注入後の上清吸引除去工程が省略できる。従って、上清吸引操作による磁性粒子を誤って吸引してしまうという危険性が低減できる。
【００１４】
反応容器下部の磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返すことにより洗浄液中の磁性粒子が動く原理は次の如くである。すなわち、自発磁化をもつ磁性粒子は、下から与える磁場がゼロのときには、それぞれのビーズのＮ極−Ｓ極が接触するように横たわっている。下から大きなＮ極の磁場を与えると、磁性粒子間の磁力相互作用を上回り、その場でちょうど９０度回転するようにして磁性粒子はＳ極側が下を向く。磁性粒子間の磁力相互作用は、お互いに反発しあう極同士が向き合うことになる。この状態から少しずつ強制磁場を小さくしていくと、磁性粒子間の磁力相互作用が上回る時点で、磁性粒子は”穂立ち”と呼ばれる倒立現象を起す。このように、強制的に磁場を制御して強→弱→切断というサイクルを繰り返すと、磁性粒子が洗浄液中で動き回ることになり、磁性粒子表面の非特異吸着物質を解放することが可能となる。
【００１５】
工程（２）又は工程（３）終了後磁力をＯＦＦにすれば、反応容器中にはＢ／Ｆ分離の終了した被測定用固相が残存する。また、Ｂ／Ｆ分離を行った反応容器を図示しない測定部にそのまま移行することにより、底に集められた磁気粒子の発光量あるいは蛍光量を測定することが可能となる。
【００１６】
本発明に使用される磁性粒子としては、水溶液中で不溶性であり且つ磁性を示すものであるならば特に限定されるものではない。例えば、FeO、γ-FeO、Co-γ-FeO、(NiCuZn)O・FeO、(CuZn)O・FeO、(MnZn)O・FeO、(NiZn)O・FeO、SrO・6FeO、BaO・6FeO、SiO2で被覆したFeO（粒径約200Ａ）〔Enzyme Microb.Tecnol.,vol2,p.2-10(1980)参照〕、各種の高分子材料（ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン等）とフェライトとの複合微粒子及び磁性細菌が菌体内に合成する磁性細菌粒子等が挙げられる。当該磁性細菌粒子は、磁区が粒子内で一定方向にあるシングルドメイン領域にあるため、磁石を反応容器の下部に配置することで反応容器底部の狭い領域に集めることができるため、特に好ましい。
【００１７】
尚、磁性細菌は、１９７０年代、アメリカで発見され、菌体内に５０〜１００nmの程度の粒径のマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）単結晶の微粒子が１０〜２０個ほど連なったマグネトソームと呼ばれるチェイン状の粒子を保持している。磁性細菌はこのマグネトソームを保持することで地磁気を感知し、磁力線の方向を認識することができる。磁性細菌は微好気性の細菌であり、地磁気を感知することで好気的な水面から微好気的な沈殿物表層へ磁力線に沿って泳ぐことができる。
斯かる磁性細菌は、ANALYTICAL CHEMISTRY,VOL. 63,No. 3,FEBRUARY 1,1991 P268-P272に示されるように、単菌分離され、大量培養が可能となっている。
この磁性細菌中の磁性粒子は、六角柱で粒径、形状が非常に均一であり、純度も高く、粒子を含む菌体の磁化を微粒子当りに換算すると約５０emu/gである。
また、保磁力は２３０ Oe で、単磁区構造をとっていることが確かめられている。また、この磁性粒子は、粒子表面が有機薄膜で覆われていることから金属の溶出がほとんど起こらず安定に存在し、水溶液中での分散性にも優れているといった特性を有している。
【００１８】
磁性細菌からの磁性細菌粒子の抽出方法には、フレンチプレスを用いた物理的圧力破砕、アルカリ煮沸、酵素処理、超音波破砕処理等が知られており、磁性細菌粒子を大量に得る場合には、フレンチプレスによる破砕が適している。抽出後、磁石等により磁性細菌粒子を分離すればよい。
【００１９】
核酸プローブ固定化磁性粒子としては、上記磁性粒子に標的遺伝子のプローブとなるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡが固定化されているものであれば制限されない。また、ＤＮＡの配列に対して特異的に結合能を有する物質であれば、これら以外でも使用することができる。標的遺伝子のプローブとなり得るＤＮＡは、それ自体公知のものを用いることができる。プローブの磁性粒子への固定化は、通常の架橋剤を利用した共有結合による固定化が好ましい。
【００２０】
本発明のＢ／Ｆ分離手段は、自動化されたハイブリダイゼーション装置を用いたハイブリダイゼーションに用いるのが好ましい。当該ハイブリダイゼーション装置としては、図４に示すように、少なくとも（ａ）反応容器保持具及び加温・冷却装置を備えてなるディネーチャー部５、（ｂ）反応容器保持具及び加温・冷却装置を備えてなるアニーリング部６、（ｃ）反応容器保持具及び磁力制御装置を備えてなり、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御できるＢ／Ｆ分離部７、（ｄ）チップラック１５を備えてなるチップラック収納部８、（ｅ）洗浄液収容容器を備えてなる洗浄液部１０、（ｆ）廃液収容容器を備えてなる廃液部９及び（ｇ）複数本のチップノズル１４を装備し、該チップノズルにチップを装着・脱着させる機構と、装着されたチップが処理液を吸引・注入する機構と、反応容器の把持及び離脱を自由に行わせることが可能なロボットハンド機構１３とを有し、Ｘ−Ｚ軸方向へ自在に移動可能なアームユニットを備えてなるヘッド部１２、より構成される自動核酸ハイブリダイゼーション装置が挙げられる。
【００２１】
このハイブリダイゼーション装置を用いれば、下記工程（１）〜（１０）を自動で行い、次いで反応容器中の標識核酸量を測定することにより、サンプル中の核酸が検出できる。
（１）核酸プローブ固定化磁性粒子と標識されたサンプル核酸が注入・混合された反応容器をディネーチャー部５に設置し、加温・冷却装置により反応容器中の温度を核酸のディネーチャー温度に設定し、当該温度を所定時間保持してサンプル核酸を一本鎖化する。このとき、反応容器中の磁性粒子は、磁力制御により可動化されている。
（２）アームユニットを稼働してディネーチャー部５の反応容器をアニーリング部６に移送する。
（３）アニーリング部６の加温・冷却装置により反応容器中の温度を核酸のアニーリング温度に設定し、当該温度を所定時間保持してアニーリングを行なう。
（４）アームユニットをアニーリング部６に移動し、反応容器をＢ／Ｆ分離部７に移送する。
（５）磁力制御装置を稼働して磁性粒子に結合したサンプル核酸を反応容器底部に不動化させる。
（６）アームユニットをチップラック収納部８に移動し、チップノズル１４にチップ１６を装着する。
（７）アームユニットをＢ／Ｆ分離部７に移動し、反応容器中の上清をチップノズル１４にて吸引する。
（８）アームユニットを廃液部９に移動し、チップノズル内の吸引上清を廃液部９の廃棄収容容器に排出する。
（９）アームユニットを洗浄液部１０に移動し、洗浄液収容容器から洗浄液を吸引し、Ｂ／Ｆ分離部７の反応容器中に洗浄液を注入する。
（１０）（７）〜（９）の洗浄操作を所定回数繰り返し、最後に反応容器に洗浄液を注入する。
【００２２】
さらに、ハイブリダイゼーションにおけるすべての反応、すなわち、ディネイチャー、アニーリング及びＢ／Ｆ分離のすべてが、一の反応容器中において行なわれるようにしたハイブリダイゼーション装置がより好ましい。このような装置としては、反応容器保持具、加温・冷却装置及び磁力制御装置を備えた反応部を有するハイブリダイゼーション装置が挙げられる。より具体的には、少なくとも（Ａ）反応容器保持具、加温・冷却装置及び磁力制御装置を備えてなる反応部１７、（Ｂ）チップラック及び廃液収容容器を備えてなるチップラック・廃液部１８、（Ｃ）洗浄液収容容器及び加温・冷却装置を備えてなる洗浄液部１９、及び（Ｄ）複数本のチップノズルを装備し、該チップノズルにチップを装着・脱着させる機構と、装着されたチップが処理液を吸引・注入する機構とを有し、Ｘ−Ｚ軸方向へ自在に移動可能なアームユニットを備えてなるヘッド部１２、より構成される自動核酸ハイブリダイゼーション装置（図５）である。ここで、（Ａ）の反応部における磁力制御装置は、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部にのみ不動化するように磁力制御可能である。
【００２３】
このハイブリダイゼーション装置を用いて、下記工程（１）〜（８）を自動で行い、次いで反応容器中の標識核酸量を測定すれば、サンプル中の核酸が検出できる。
（１）核酸プローブ固定化磁性粒子と標識されたサンプル核酸が注入・混合された反応容器を反応部に設置し、加温・冷却装置により反応容器中の温度を核酸のディネーチャー温度に設定し、当該温度を所定時間保持してサンプル核酸を一本鎖化する。このとき、反応容器中の磁性粒子は、磁力制御により可動化されている。
（２）反応容器中の温度を核酸のアニーリング温度に変更し、当該温度を所定時間保持してアニーリングを行なう。
（３）磁力制御装置を稼働して磁性粒子に結合したサンプル核酸を容器の底部に不動化させる。
（４）アームユニットを稼働してチップラック・廃液部に移動し、チップノズルにチップを装着する。
（５）アームユニットを反応部に移動し、反応容器中の上清をチップノズルにて吸引する。
（６）アームユニットをチップラック・廃液部に移動し、チップノズル内の吸引上清を廃棄収容容器に排出する。
（７）アームユニットを洗浄液部に移動し、洗浄液収容容器から予め加温・冷却装置によりアニーリング温度に温度調節された洗浄液を吸引し、反応部の反応容器中に洗浄液を注入する。
（８）（５）〜（７）の洗浄動作を所定回数繰り返し、最後に反応容器に洗浄液を注入する。
【００２４】
以下、図面に基づいて、本発明Ｂ／Ｆ分離方法に用いるハイブリダイゼーション装置の具体例を説明する。
図５は、自動核酸ハイブリダイゼーション装置の内部構成を示す概念図である。
図５中の反応部１７はサンプル核酸を一本鎖（ディネーチャー）化し、次いで一本鎖化されたサンプル核酸と特定の核酸プローブとのハイブリダイゼーション（アニーリング）を行い、次いでＢ／Ｆ分離を行う反応部であって、反応容器を収納保持するための保持具２０と、ディネーチャー及びアニーリングの各温度を調節する加温・冷却装置及び磁力制御装置２５で構成される（図６）。
【００２５】
図６に示すように、加温・冷却装置は、反応容器保持具２０を加温するヒータ２１と、これを冷却するチラー２２と、温度を制御するセンサー２３と、温度を制御する温度制御装置２４とを備えるものである。
温度制御装置２４は、ディネーチャーでは反応容器内部でディネーチャー反応を進行させる温度（一般的には９５℃前後であるが、サンプル核酸の長さが短い場合はこれよりも低くてもよい。）にコントロールされるように固定され、アニーリングでは、アニーリング温度（通常４０〜７０℃）にコントロールされるように固定される。また、温度制御装置のタイマー機能により反応時間もコントロールされる。
【００２６】
磁力制御装置２５は、前記の如く、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化されるように磁力制御できる装置であればよい。図６では、反応容器下部に配置した永久磁石を鉛直方向にずらすことにより磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段（図１）による磁力制御装置が示されている。磁力制御装置としては、永久磁石を備えた強磁性体を回転制御する磁力制御装置、例えば図２又は図３のように、反応容器下部に配置した永久磁石を埋め込んだ磁性体棒を回転させることで磁力をＯＮ−ＯＦＦする手段による磁力制御装置を用いることが好ましい。
【００２７】
ディネーチャー及びアニーリング反応時は、図１、図２及び図３の左側のように反応容器下部の磁力をＯＦＦにしておく。アニーリング反応終了後、前記の手段ａ、又は手段ｂにより洗浄、Ｂ／Ｆ分離を行う。
【００２８】
図５における１８は、チップラック・廃液部であって、洗浄液や試薬を分注するためのディスポチップを保持するチップラックと、Ｂ／Ｆ分離／洗浄時に反応部から吸い上げた廃液を排出し、留めておくための廃液収容容器をその下部に備えるものである。このように、チップラックと廃液収容容器をヘッド部の移動平面に対して垂直に配置することで省スペース化が図れる。
チップラックには、ディスポーザブルチップ（以下、ディスポチップ）のテーパ部を支えるよう穴が空けてあり、測定を開始する前はそこにディスポチップがささっている。
【００２９】
図５における１９は、洗浄液部であって、洗浄液収容容器と加温・冷却装置を備えるものである。洗浄液は、洗浄時に反応容器内の核酸が、温度変化によって非特異吸着や解離をしないよう、加温・冷却装置によりアニーリング温度と同じ温度にコントロールされる。
洗浄液部は必要に応じて複数設けることができる。例えばハイブリダイズされた核酸を検出するために免疫反応を行う場合は２つの洗浄液部が必要となる。
【００３０】
図５の１２は、ヘッド部であり、Ｘ−Ｚ軸方向へ移動自在のアームユニットを有し、当該アームユニットは、チップノズルと、ヘッド部を移動させる機構と、該ヘッド部を移動させることにより該チップノズルにチップを装着・脱着させる機構と、装着されたチップから処理液（廃液や洗浄液）を吸引・注入する機構、より構成されている。
【００３１】
このハイブリダーゼーション装置には、必要に応じて更に試薬収容容器を備えてなる試薬部（Ｅ）を設けることができる。例えば、ハイブリダイズされた核酸を検出するための標識が必要な場合は、当該標識試薬（例えばアルカリフォスファターゼ標識アンチ−ＤＩＧ Ｆａｂ'フラグメント（ａｎｔｉ−ＤＩＧ−ＡＰ）等）や酵素発色基質（例えば、アルカリフォスファターゼ発光基質等)を収納するための試薬部を設ける必要がある。
一方、予めサンプル核酸を標識したものを用いた場合には、本試薬部を設ける必要はない。
【００３２】
ここで用いられる核酸ハイブリダイゼーション法は、サンプル中の核酸と核酸プローブ固定化磁性粒子のハイブリダイゼーションを利用するものであれば、ハイブリダイゼーション法が１ステップ法であっても２ステップ法（サンドイッチ法）であってもよい。また、用いる核酸プローブも一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡのいずれであってもよい。
【００３３】
【実施例】
上記のハイブリダイゼーション装置（図５参照）を用いた核酸の検出法の具体例を以下に示す。
１．準備工程
（１）磁性細菌粒子の作製
磁性細菌粒子の生産のため、単菌分離された磁性細菌 Magnetopsirillum sp.AMB-1 (Matsunaga et al. 1991)をＭＳＧＭ培地（Blakemore et al. 1979）(100L)を用いて室温で約７日間、嫌気条件下で培養した。培養３日後にキナ酸鉄溶液を培養液１Ｌに対し４ｍＬ添加した。培養した菌体は１００００ｇ、４℃で連続遠心機を用いて回収した。１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）を用いて懸濁した。この菌体を、１５００ｋｇ／ｃｍ2の条件下でフレンチプレス（大岳製作所、５５０１Ｍ）を用いて破砕し、ネオジウム−ボロン（Ｎｄ−Ｂ）磁石を用いて破砕菌体から磁性細菌粒子を磁気回収した。得られた磁性細菌粒子は、超音波洗浄器（Kaijo Denki Co. Ltd., CA4481）を用いて、ＰＢＳ中で３回以上洗浄された後、ＰＢＳに懸濁され４℃で保存した。
【００３４】
（２）検出用プローブの合成
シアノバクテリアの１６ＳｒＤＮＡの領域において属特異的領域を検索し、１５〜２０塩基内において各属間で２〜３以上の塩基の差異が見られる領域を見出し、その領域からMicrocystis属特異的検出用プローブＤＮＡをデザインした。デザインしたプローブＤＮＡについて、５'末端にビオチン標識された合成オリゴＤＮＡを作製した。
【００３５】
（３）ＤＮＡ固定化磁性細菌粒子の作製
磁性細菌粒子への修飾は、磁性細菌膜上に存在すると考えられるアミノ基を利用した。まず、磁性細菌ＡＭＢ−１株より抽出・精製された磁性細菌粒子（ＢＭＰｓ）１ｍｇを２．５％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ１ｍＬ中に懸濁し、室温で３０分間反応させることにより、磁性細菌粒子膜上のアミノ基に対してアルデヒド基の導入を行った。反応後、磁気回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。
洗浄後、修飾ＢＭＰｓ １ｍｇに対して、ストレプトアビジン(New England Bio Labs.)１００μｇをＰＢＳ １ｍＬ中に懸濁し、室温で２時間反応させることによりＢＭＰｓとストレプトアビジンを架橋した。架橋後、ＰＢＳで３回磁気回収、及び洗浄を行った後、ＤＮＡの非特異吸着を押さえるためにＮａＢＨ4で未反応のアルデヒド基を還元し、ストレプトアビジン固定化ＢＭＰｓ（ＳＡ−ＢＭＰｓ）とした。作製したＳＡ−ＢＭＰｓ ３００μｇに対して５′末端にビオチン標識したオリゴＤＮＡ ３００ｐｍｏｌをＰＢＳ ３００μｌ中でアビジン・ビオチン反応を行わせ、オリゴＤＮＡ固定化磁性細菌粒子（ＤＮＡ−ＢＭＰｓ）を作製した。
【００３６】
（４）サンプルＤＮＡの調製
シアノバクテリアからのゲノムＤＮＡの抽出は、MagExtractor-genome-の抽出法を改良した方法により抽出を行った。抽出された全ゲノムＤＮＡに対して、原核微生物を１６ＳｒＤＮＡ増幅用プライマーＲＳＦ−１、ＲＳＲ−２（E.coli 1523-1542ntのアンチセンス）(Kawaguchi et al.1992)を用い、ＰＣＲによって遺伝子増幅を行った。
尚、遺伝子増幅の際に、蛍光、発光若しくは電気化学的シグナルによって検出可能な蛍光色素、アルカリフォスファターゼ、フェロセン等のマーカーで標識したｄＵＴＰを用いてＰＣＲを行うことで標識されたサンプル核酸を調製することができる。例えば、ＦＩＴＣ標識された１６ＳｒＤＮＡを合成する場合には、蛍光物質であるＦＩＴＣ標識されたｄＵＴＰを用いてＰＣＲを行えばよい。
【００３７】
（５）装置への試薬等の設置
▲１▼１００μｇのプローブＤＮＡ固定化磁性粒子と、１００μｌのサンプルＤＮＡをクイクロプレート等の反応容器で混合し、十分に攪拌した後、本装置の反応部に設置する。
▲２▼チップノズルを保持したチップラックを滅菌後、チップラック・廃液部に設置する。
▲３▼洗浄液を収容する洗浄液収容容器を、洗浄部に設置する。
【００３８】
２．ディネーチャー工程
装置の始動スイッチを投入し、反応部１の加温・冷却装置の温度制御機能を稼働させ、反応容器を９５℃に温める。このまま５分間保持することにより、反応容器中のサンプル核酸の一本鎖化を行う。
【００３９】
３．アニーリング工程
温度を６０℃に冷却し、このまま１０分間保持することにより、容器中の核酸プローブ固定化磁性細菌粒子とサンプル核酸のアニーリングを行う。
【００４０】
４．Ｂ／Ｆ分離
アニーリング終了後、容器真下に設置された磁気制御装置を稼働して磁気吸引力を発生させ、磁性粒子を容器底面に集める。磁気制御装置を動作させてから約３分間そのまま待機する。この時、反応容器は６０℃に維持される。
【００４１】
５．洗浄工程
チップラック・廃液部上に移動させたアームユニットを下方へ移動させ、チップノズルとディスポチップを嵌合させることで、チップラック・廃液部に保持されたチップノズルを装着する。アームユニットを反応部へ移動させ、そのまま降下させて、適当な位置で停止後、チップノズルにて反応容器中の上清を吸引し、廃液部に移動して排出させる。
その後、アームユニットを洗浄液部へ移動させ、洗浄液収容容器より６０℃に維持された洗浄液を吸引し、再びアームユニットを反応部へ移動させ、反応容器中にこれを注入する。約３分間の待機後、再びチップノズルで反応容器中の上清を吸引し、チップラック・廃液部に排出する。この洗浄動作を３回繰り返し、最後に洗浄液を注入し動作を終了する。
【００４２】
動作終了後も反応部の磁気吸引力は維持させ、温度は０〜１５℃、好ましくは４℃で維持するように制御する。これにより、反応溶液中の磁性体が容器底部に凝集した状態を保ち、溶液の性質が変質することを防ぐことができる。尚、洗浄液部の温度制御は切断する。また、反応容器には、装置外からの光を遮断するためのカバーを装着することにより、核酸中に取り込んだ蛍光物質の劣化を防ぐことができる。
【００４３】
６．検出
反応容器を装置から取出し、容器を移し替えることなく、蛍光プレートリーダ（ＦＬＵＯstarTM）によって反応容器内に生じる光の変化を測定する。
この結果、Microcystis aeruginosa NIES-98のＰＣＲ産物試料から最も強い発光が観察され、Microcystis属を特異的に検出できることが明らかとなった。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のＢ／Ｆ分離方法によれば、磁性粒子が反応容器に吸着したままになることがなく、磁性粒子をもれなく集めることによって高い感度の測定ができ、さらにＢ／Ｆ分離後の測定にそのまま（反応容器を他の容器に移し替えることなく）移行でき、ハイブリダイゼーションの自動化された装置によるハイブリダイゼーションが迅速かつ容易に実施可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】反応容器下部に配置した永久磁石を鉛直方向にずらすことにより磁力のＯＮ−ＯＦＦをする磁力制御の例を示す図である。
【図２】磁性粒子下部に配置した永久磁石を埋め込んだ磁性体丸棒を回転させ、磁束の向きを変えることにより磁力のＯＮ−ＯＦＦをする磁力制御の例を示す図である。
【図３】磁性粒子下部に配置した、磁石の一部の端面が突出するように磁石を保持した磁性体棒を回転させ、磁力をＯＮ−ＯＦＦする磁力制御の例を示す図である。
【図４】ハイブリダイゼーション装置の例の内部構成を示す図である。
【図５】ハイブリダイゼーション装置の例の内部構成を示す図である。
【図６】図５のハイブリダイゼーション装置の反応部の内部構成を示す図である。
【符号の説明】
１：反応容器
２：溶液
３：磁性粒子
４：磁石
５：ディネーチャー部
６：アニーリング部
７：Ｂ／Ｆ分離部
８：チップラック収納部
９：廃液部
10：洗浄液部
11：試薬部
12：ヘッド部
13：ロボットハンド機構
14：ノズル
15：チップラック
16：チップ
17：反応部
18：チップラック・廃液部
19：洗浄液部
20：反応容器保持具
21：ヒーター
22：チラー
23：温度センサー
24：温度制御装置
25：磁力制御装置
Claims (3)
- プローブとして核酸プローブ固定化磁性粒子を用いた核酸ハイブリダイゼーション反応終了後のＢ／Ｆ分離方法であって、次のＢ／Ｆ分離工程（１）、（２）及び（３）を行い、磁性粒子を反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御することを特徴とするＢ／Ｆ分離方法。
（１）当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御して上清を吸引除去する工程、（２）当該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御して当該磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入する工程、（３）磁石保持棒の貫通しない穴に永久磁石を挿入して永久磁石の一部の端面が突出するように永久磁石を保持し、磁石保持棒の外側には磁力を及ぼさない磁性体棒であって、反応容器の下部に配置した該磁性体棒を回転させて磁束の向きを変えることにより、磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返して洗浄液中の当該磁性粒子を動かす工程。 - ハイブリダイゼーション反応が、反応容器保持具、加温・冷却装置及び磁力制御装置を備えてなる反応部で行なわれるものである請求項１記載のＢ／Ｆ分離方法。
- ハイブリダイゼーション反応が、少なくとも（Ａ）反応容器保持具、加温・冷却装置及び磁力制御装置を備えてなる反応部、（Ｂ）チップラック及び廃液収容容器を備えてなるチップラック・廃液部、（Ｃ）洗浄液収容容器及び加温・冷却装置を備えてなる洗浄液部、及び（Ｄ）複数本のチップノズルを装備し、該チップノズルにチップを装着・脱着させる機構と、装着されたチップが処理液を吸引・注入する機構とを有し、Ｘ−Ｚ軸方向へ自在に移動可能なアームユニットを備えてなるヘッド部、より構成される自動核酸ハイブリダイゼーション装置を用いて行なわれるものである請求項１又は２記載のＢ／Ｆ分離方法。
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