JP3996416B2

JP3996416B2 - B / F separation method in nucleic acid hybridization

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Publication number: JP3996416B2
Application number: JP2002085233A
Authority: JP
Inventors: 是松永; 雄司宇田川; 越男根本; 浩平丸山
Original assignee: Juki Corp
Current assignee: Juki Corp
Priority date: 2001-09-21
Filing date: 2002-03-26
Publication date: 2007-10-24
Anticipated expiration: 2022-03-26
Also published as: JP2003164279A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ハイブリダイゼーション反応終了後の効率的なＢ／Ｆ分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
核酸ハイブリダイゼーション法は、特定の遺伝子を特異的に検出する手段として広く利用されている。そのうち、プローブとして核酸プローブ固定化粒子を用い、反応容器中で液体サンプル中の標的核酸と核酸プローブ固定化粒子とをハイブリダイゼーションさせ、次いで固／液分離（Ｂ／Ｆ分離）した後、当該粒子上にハイブリダイズした標的核酸量を測定するハイブリダイゼーション法は、簡便かつ迅速なハイブリダイゼーション法であることから、特に注目されている。
【０００３】
Ｂ／Ｆ分離の簡便性等の点から、最近、核酸プローブ固定化用の粒子として磁性粒子が注目されている。当該磁性粒子を用いた場合のＢ／Ｆ分離手段としては、（１）反応容器の外側側面に磁力体を配し、磁性粒子を反応容器の内側面に吸着保持することにより、行う方法（特許第３１１５５０１号）、（２）反応容器の外側側面に回転する磁力体を配し、磁性粒子を反応容器の内側面に吸脱着させることにより、行う方法（特開平１１−１５６２３１号）、（３）溶液と隔てられたスリーブ中の磁気デバイスを用い、磁気デバイスを回転および／または昇降させることにより、スリーブの外壁に磁性粒子を吸着させて磁気回収、再懸濁する方法（特開平８−２９４２５号）等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、前記（１）〜（３）の方法でＢ／Ｆ分離を行った場合、反応容器やスリーブは通常プラスチックで作製されており、磁性粒子の種類によってはそれ自体がプラスチックに吸着しやすい特性をもっているため、磁力をオフにしても反応容器の内壁やスリーブに吸着したままになってしまい、その後測定する磁性粒子がうまく回収されず粒子数が減ることから、測定の感度（精度）が落ちてしまうことが判明した。また、測定の際には別の測定容器に移し替える手間が必要であった。
従って、本発明の目的は、もれなく磁性粒子を集めることができ、高感度で迅速なＢ／Ｆ分離手段を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、核酸ハイブリダイゼーション反応終了後のＢ／Ｆ分離について検討したところ、磁力制御することによりプローブ固定化磁性粒子を反応容器の底部のみに不動化するようにすれば、上清の吸引により容易に液体部が除去でき、さらに不動化状態で、又は磁力制御により磁性粒子を可動化後に洗浄液を注入して洗浄した後、磁性粒子をもれなく集めることができること、さらに洗浄液注入後磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返すと磁性粒子が動くので洗浄が効率的かつ容易にできることから、高い感度の測定ができ、さらにＢ／Ｆ分離後の測定にそのまま（反応容器を他の容器に移し替えることなく）移行できることを見出し本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明は、プローブとして核酸プローブ固定化磁性粒子を用いた核酸ハイブリダイゼーション反応終了後のＢ／Ｆ分離方法であって、次のＢ／Ｆ分離工程（１）、（２）及び（３）を行い、磁性粒子を反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御することを特徴とするＢ／Ｆ分離方法を提供するものである。
（１）当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御して上清を吸引除去する工程、（２）当該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御して当該磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入する工程、（３）磁石保持棒の貫通しない穴に永久磁石を挿入して永久磁石の一部の端面が突出するように永久磁石を保持し、磁石保持棒の外側には磁力を及ぼさない磁性体棒であって、反応容器の下部に配置した該磁性体棒を回転させて磁束の向きを変えることにより、磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返して洗浄液中の当該磁性粒子を動かす工程。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明のＢ／Ｆ分離方法においては、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化されるように磁力制御すればよい。具体的には反応容器の下部に磁力発生源を配置し、反応容器下部の磁力をＯＮ、ＯＦＦすることにより、磁力制御すればよい。より具体的には、（１）反応容器下部に配置した永久磁石を鉛直方向にずらすことにより磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段（図１）、（２）反応容器下面で永久磁石を水平方向に例えば半ピッチあるいは、完全に取り除くようにずらすことにより、磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段、（３）永久磁石を備えた強磁性体を回転制御する手段、例えば反応容器下部に配置した永久磁石を埋め込んだ鉄などの磁性体丸棒を回転させ、磁束の向きを変えることにより磁力をＯＮ−ＯＦＦする手段（図２）、また、反応容器下部に配置した、磁石の一部の端面が突出するように磁石を保持した磁性体棒を回転させ、磁力をＯＮ−ＯＦＦする手段（図３）、（４）永久磁石のシールド材を水平方向にずらし、磁石のＯＮ−ＯＦＦをする手段、（５）丸型電磁石により磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段、（６）馬蹄型電磁石により磁力がＯＮ−ＯＦＦをする手段、（７）コアなしの電磁石を使って磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段等が挙げられる。
これらの磁力のＯＮ−ＯＦＦ手段のうち、（１）、（２）及び（３）の手段が簡便であることから好ましい。例えば、図３の手段を採用すると、磁束が磁石保持棒内部に引き寄せられることなく端面延長方向に伸びる為、磁石が有する磁力を効果的に反応容器へ向けることが可能となる。磁石を挿入する穴は貫通せず、磁力が漏洩しない十分な厚みを有する。これにより保持側端面の磁束は磁石保持棒内部を通り、保持棒の外側には磁力を及ぼさない為、磁力遮断時には反応容器への磁力を完全に遮断することが可能となる。
【０００８】
本発明のＢ／Ｆ分離工程は、ハイブリダイゼーション反応終了後、次の工程（１）及び（２）を所定回数繰り返すことにより行われる（手段ａ）。
（１）当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御して上清を吸引除去する工程、
（２）当該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御して当該磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入する工程。
【０００９】
また、本発明のＢ／Ｆ分離工程は、ハイブリダイゼーション反応終了後、次の工程（１）、（２）及び（３）を行ってもよい（手段ｂ）。
（１）当該磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御して上清を吸引除去する工程、
（２）当該磁性粒子を不動化した状態で、又は磁力制御して当該磁性粒子を可動化後反応容器中に洗浄液を注入する工程、
（３）磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返して洗浄液中の当該磁性粒子を動かす工程。
【００１０】
ここで、上記工程（１）において、反応容器下部の磁力をＯＮにすることにより磁性粒子を反応容器底部にのみ不動化した状態は、図１、図２及び図３の右側に示されている。通常、ハイブリダイゼーション用反応容器、例えば２４ウェル〜９６ウェルマイクロプレートは、底面が小さくなっているので、磁性粒子を底部のみに不動化すれば、磁性粒子として磁性細菌がつくる磁性ビーズのようなプラスチックに吸着しやすい粒子を用いた場合でも吸着がほとんどない。
【００１１】
工程（２）において、反応容器下部の磁力をＯＦＦしても磁性粒子は容器底に集まった状態を保持するが、洗浄液を注入することによりある程度拡散する。その後再度磁力をＯＮにして磁性粒子を底に不動化した状態で洗浄液を吸引・廃棄してもよいが、はじめから磁力をＯＮ状態で洗浄することも可能である。それにより、更に洗浄が迅速かつ効率的に行われる。
【００１２】
手段ａにおいて、工程（１）及び工程（２）は、１回以上、例えば１〜３回繰り返せばよい。
【００１３】
手段ｂの工程（３）は、反応容器への洗浄液の注入を１回だけとしたにもかかわらず、十分な洗浄を可能とし、磁性粒子に対する非特異的吸着物質を除去する手段である。手段ｂによれば、工程（１）及び工程（２）を２回繰り返す必要がないため、洗浄液注入後の上清吸引除去工程が省略できる。従って、上清吸引操作による磁性粒子を誤って吸引してしまうという危険性が低減できる。
【００１４】
反応容器下部の磁力のＯＮ−ＯＦＦを繰り返すことにより洗浄液中の磁性粒子が動く原理は次の如くである。すなわち、自発磁化をもつ磁性粒子は、下から与える磁場がゼロのときには、それぞれのビーズのＮ極−Ｓ極が接触するように横たわっている。下から大きなＮ極の磁場を与えると、磁性粒子間の磁力相互作用を上回り、その場でちょうど９０度回転するようにして磁性粒子はＳ極側が下を向く。磁性粒子間の磁力相互作用は、お互いに反発しあう極同士が向き合うことになる。この状態から少しずつ強制磁場を小さくしていくと、磁性粒子間の磁力相互作用が上回る時点で、磁性粒子は”穂立ち”と呼ばれる倒立現象を起す。このように、強制的に磁場を制御して強→弱→切断というサイクルを繰り返すと、磁性粒子が洗浄液中で動き回ることになり、磁性粒子表面の非特異吸着物質を解放することが可能となる。
【００１５】
工程（２）又は工程（３）終了後磁力をＯＦＦにすれば、反応容器中にはＢ／Ｆ分離の終了した被測定用固相が残存する。また、Ｂ／Ｆ分離を行った反応容器を図示しない測定部にそのまま移行することにより、底に集められた磁気粒子の発光量あるいは蛍光量を測定することが可能となる。
【００１６】
本発明に使用される磁性粒子としては、水溶液中で不溶性であり且つ磁性を示すものであるならば特に限定されるものではない。例えば、FeO、γ-FeO、Co-γ-FeO、(NiCuZn)O・FeO、(CuZn)O・FeO、(MnZn)O・FeO、(NiZn)O・FeO、SrO・6FeO、BaO・6FeO、SiO₂で被覆したFeO（粒径約200Ａ）〔Enzyme Microb.Tecnol.,vol2,p.2-10(1980)参照〕、各種の高分子材料（ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリスチレン等）とフェライトとの複合微粒子及び磁性細菌が菌体内に合成する磁性細菌粒子等が挙げられる。当該磁性細菌粒子は、磁区が粒子内で一定方向にあるシングルドメイン領域にあるため、磁石を反応容器の下部に配置することで反応容器底部の狭い領域に集めることができるため、特に好ましい。
【００１７】
尚、磁性細菌は、１９７０年代、アメリカで発見され、菌体内に５０〜１００nmの程度の粒径のマグネタイト（Ｆｅ₃Ｏ₄）単結晶の微粒子が１０〜２０個ほど連なったマグネトソームと呼ばれるチェイン状の粒子を保持している。磁性細菌はこのマグネトソームを保持することで地磁気を感知し、磁力線の方向を認識することができる。磁性細菌は微好気性の細菌であり、地磁気を感知することで好気的な水面から微好気的な沈殿物表層へ磁力線に沿って泳ぐことができる。
斯かる磁性細菌は、ANALYTICAL CHEMISTRY,VOL. 63,No. 3,FEBRUARY 1,1991 P268-P272に示されるように、単菌分離され、大量培養が可能となっている。
この磁性細菌中の磁性粒子は、六角柱で粒径、形状が非常に均一であり、純度も高く、粒子を含む菌体の磁化を微粒子当りに換算すると約５０emu/gである。
また、保磁力は２３０ Oe で、単磁区構造をとっていることが確かめられている。また、この磁性粒子は、粒子表面が有機薄膜で覆われていることから金属の溶出がほとんど起こらず安定に存在し、水溶液中での分散性にも優れているといった特性を有している。
【００１８】
磁性細菌からの磁性細菌粒子の抽出方法には、フレンチプレスを用いた物理的圧力破砕、アルカリ煮沸、酵素処理、超音波破砕処理等が知られており、磁性細菌粒子を大量に得る場合には、フレンチプレスによる破砕が適している。抽出後、磁石等により磁性細菌粒子を分離すればよい。
【００１９】
核酸プローブ固定化磁性粒子としては、上記磁性粒子に標的遺伝子のプローブとなるＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡが固定化されているものであれば制限されない。また、ＤＮＡの配列に対して特異的に結合能を有する物質であれば、これら以外でも使用することができる。標的遺伝子のプローブとなり得るＤＮＡは、それ自体公知のものを用いることができる。プローブの磁性粒子への固定化は、通常の架橋剤を利用した共有結合による固定化が好ましい。
【００２０】
本発明のＢ／Ｆ分離手段は、自動化されたハイブリダイゼーション装置を用いたハイブリダイゼーションに用いるのが好ましい。当該ハイブリダイゼーション装置としては、図４に示すように、少なくとも（ａ）反応容器保持具及び加温・冷却装置を備えてなるディネーチャー部５、（ｂ）反応容器保持具及び加温・冷却装置を備えてなるアニーリング部６、（ｃ）反応容器保持具及び磁力制御装置を備えてなり、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化するように磁力制御できるＢ／Ｆ分離部７、（ｄ）チップラック１５を備えてなるチップラック収納部８、（ｅ）洗浄液収容容器を備えてなる洗浄液部１０、（ｆ）廃液収容容器を備えてなる廃液部９及び（ｇ）複数本のチップノズル１４を装備し、該チップノズルにチップを装着・脱着させる機構と、装着されたチップが処理液を吸引・注入する機構と、反応容器の把持及び離脱を自由に行わせることが可能なロボットハンド機構１３とを有し、Ｘ−Ｚ軸方向へ自在に移動可能なアームユニットを備えてなるヘッド部１２、より構成される自動核酸ハイブリダイゼーション装置が挙げられる。
【００２１】
このハイブリダイゼーション装置を用いれば、下記工程（１）〜（１０）を自動で行い、次いで反応容器中の標識核酸量を測定することにより、サンプル中の核酸が検出できる。
（１）核酸プローブ固定化磁性粒子と標識されたサンプル核酸が注入・混合された反応容器をディネーチャー部５に設置し、加温・冷却装置により反応容器中の温度を核酸のディネーチャー温度に設定し、当該温度を所定時間保持してサンプル核酸を一本鎖化する。このとき、反応容器中の磁性粒子は、磁力制御により可動化されている。
（２）アームユニットを稼働してディネーチャー部５の反応容器をアニーリング部６に移送する。
（３）アニーリング部６の加温・冷却装置により反応容器中の温度を核酸のアニーリング温度に設定し、当該温度を所定時間保持してアニーリングを行なう。
（４）アームユニットをアニーリング部６に移動し、反応容器をＢ／Ｆ分離部７に移送する。
（５）磁力制御装置を稼働して磁性粒子に結合したサンプル核酸を反応容器底部に不動化させる。
（６）アームユニットをチップラック収納部８に移動し、チップノズル１４にチップ１６を装着する。
（７）アームユニットをＢ／Ｆ分離部７に移動し、反応容器中の上清をチップノズル１４にて吸引する。
（８）アームユニットを廃液部９に移動し、チップノズル内の吸引上清を廃液部９の廃棄収容容器に排出する。
（９）アームユニットを洗浄液部１０に移動し、洗浄液収容容器から洗浄液を吸引し、Ｂ／Ｆ分離部７の反応容器中に洗浄液を注入する。
（１０）（７）〜（９）の洗浄操作を所定回数繰り返し、最後に反応容器に洗浄液を注入する。
【００２２】
さらに、ハイブリダイゼーションにおけるすべての反応、すなわち、ディネイチャー、アニーリング及びＢ／Ｆ分離のすべてが、一の反応容器中において行なわれるようにしたハイブリダイゼーション装置がより好ましい。このような装置としては、反応容器保持具、加温・冷却装置及び磁力制御装置を備えた反応部を有するハイブリダイゼーション装置が挙げられる。より具体的には、少なくとも（Ａ）反応容器保持具、加温・冷却装置及び磁力制御装置を備えてなる反応部１７、（Ｂ）チップラック及び廃液収容容器を備えてなるチップラック・廃液部１８、（Ｃ）洗浄液収容容器及び加温・冷却装置を備えてなる洗浄液部１９、及び（Ｄ）複数本のチップノズルを装備し、該チップノズルにチップを装着・脱着させる機構と、装着されたチップが処理液を吸引・注入する機構とを有し、Ｘ−Ｚ軸方向へ自在に移動可能なアームユニットを備えてなるヘッド部１２、より構成される自動核酸ハイブリダイゼーション装置（図５）である。ここで、（Ａ）の反応部における磁力制御装置は、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部にのみ不動化するように磁力制御可能である。
【００２３】
このハイブリダイゼーション装置を用いて、下記工程（１）〜（８）を自動で行い、次いで反応容器中の標識核酸量を測定すれば、サンプル中の核酸が検出できる。
（１）核酸プローブ固定化磁性粒子と標識されたサンプル核酸が注入・混合された反応容器を反応部に設置し、加温・冷却装置により反応容器中の温度を核酸のディネーチャー温度に設定し、当該温度を所定時間保持してサンプル核酸を一本鎖化する。このとき、反応容器中の磁性粒子は、磁力制御により可動化されている。
（２）反応容器中の温度を核酸のアニーリング温度に変更し、当該温度を所定時間保持してアニーリングを行なう。
（３）磁力制御装置を稼働して磁性粒子に結合したサンプル核酸を容器の底部に不動化させる。
（４）アームユニットを稼働してチップラック・廃液部に移動し、チップノズルにチップを装着する。
（５）アームユニットを反応部に移動し、反応容器中の上清をチップノズルにて吸引する。
（６）アームユニットをチップラック・廃液部に移動し、チップノズル内の吸引上清を廃棄収容容器に排出する。
（７）アームユニットを洗浄液部に移動し、洗浄液収容容器から予め加温・冷却装置によりアニーリング温度に温度調節された洗浄液を吸引し、反応部の反応容器中に洗浄液を注入する。
（８）（５）〜（７）の洗浄動作を所定回数繰り返し、最後に反応容器に洗浄液を注入する。
【００２４】
以下、図面に基づいて、本発明Ｂ／Ｆ分離方法に用いるハイブリダイゼーション装置の具体例を説明する。
図５は、自動核酸ハイブリダイゼーション装置の内部構成を示す概念図である。
図５中の反応部１７はサンプル核酸を一本鎖（ディネーチャー）化し、次いで一本鎖化されたサンプル核酸と特定の核酸プローブとのハイブリダイゼーション（アニーリング）を行い、次いでＢ／Ｆ分離を行う反応部であって、反応容器を収納保持するための保持具２０と、ディネーチャー及びアニーリングの各温度を調節する加温・冷却装置及び磁力制御装置２５で構成される（図６）。
【００２５】
図６に示すように、加温・冷却装置は、反応容器保持具２０を加温するヒータ２１と、これを冷却するチラー２２と、温度を制御するセンサー２３と、温度を制御する温度制御装置２４とを備えるものである。
温度制御装置２４は、ディネーチャーでは反応容器内部でディネーチャー反応を進行させる温度（一般的には９５℃前後であるが、サンプル核酸の長さが短い場合はこれよりも低くてもよい。）にコントロールされるように固定され、アニーリングでは、アニーリング温度（通常４０〜７０℃）にコントロールされるように固定される。また、温度制御装置のタイマー機能により反応時間もコントロールされる。
【００２６】
磁力制御装置２５は、前記の如く、核酸プローブ固定化磁性粒子が反応容器の底部のみに不動化されるように磁力制御できる装置であればよい。図６では、反応容器下部に配置した永久磁石を鉛直方向にずらすことにより磁力のＯＮ−ＯＦＦをする手段（図１）による磁力制御装置が示されている。磁力制御装置としては、永久磁石を備えた強磁性体を回転制御する磁力制御装置、例えば図２又は図３のように、反応容器下部に配置した永久磁石を埋め込んだ磁性体棒を回転させることで磁力をＯＮ−ＯＦＦする手段による磁力制御装置を用いることが好ましい。
【００２７】
ディネーチャー及びアニーリング反応時は、図１、図２及び図３の左側のように反応容器下部の磁力をＯＦＦにしておく。アニーリング反応終了後、前記の手段ａ、又は手段ｂにより洗浄、Ｂ／Ｆ分離を行う。
【００２８】
図５における１８は、チップラック・廃液部であって、洗浄液や試薬を分注するためのディスポチップを保持するチップラックと、Ｂ／Ｆ分離／洗浄時に反応部から吸い上げた廃液を排出し、留めておくための廃液収容容器をその下部に備えるものである。このように、チップラックと廃液収容容器をヘッド部の移動平面に対して垂直に配置することで省スペース化が図れる。
チップラックには、ディスポーザブルチップ（以下、ディスポチップ）のテーパ部を支えるよう穴が空けてあり、測定を開始する前はそこにディスポチップがささっている。
【００２９】
図５における１９は、洗浄液部であって、洗浄液収容容器と加温・冷却装置を備えるものである。洗浄液は、洗浄時に反応容器内の核酸が、温度変化によって非特異吸着や解離をしないよう、加温・冷却装置によりアニーリング温度と同じ温度にコントロールされる。
洗浄液部は必要に応じて複数設けることができる。例えばハイブリダイズされた核酸を検出するために免疫反応を行う場合は２つの洗浄液部が必要となる。
【００３０】
図５の１２は、ヘッド部であり、Ｘ−Ｚ軸方向へ移動自在のアームユニットを有し、当該アームユニットは、チップノズルと、ヘッド部を移動させる機構と、該ヘッド部を移動させることにより該チップノズルにチップを装着・脱着させる機構と、装着されたチップから処理液（廃液や洗浄液）を吸引・注入する機構、より構成されている。
【００３１】
このハイブリダーゼーション装置には、必要に応じて更に試薬収容容器を備えてなる試薬部（Ｅ）を設けることができる。例えば、ハイブリダイズされた核酸を検出するための標識が必要な場合は、当該標識試薬（例えばアルカリフォスファターゼ標識アンチ−ＤＩＧＦａｂ'フラグメント（ａｎｔｉ−ＤＩＧ−ＡＰ）等）や酵素発色基質（例えば、アルカリフォスファターゼ発光基質等)を収納するための試薬部を設ける必要がある。
一方、予めサンプル核酸を標識したものを用いた場合には、本試薬部を設ける必要はない。
【００３２】
ここで用いられる核酸ハイブリダイゼーション法は、サンプル中の核酸と核酸プローブ固定化磁性粒子のハイブリダイゼーションを利用するものであれば、ハイブリダイゼーション法が１ステップ法であっても２ステップ法（サンドイッチ法）であってもよい。また、用いる核酸プローブも一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＰＮＡのいずれであってもよい。
【００３３】
【実施例】
上記のハイブリダイゼーション装置（図５参照）を用いた核酸の検出法の具体例を以下に示す。
１．準備工程
（１）磁性細菌粒子の作製
磁性細菌粒子の生産のため、単菌分離された磁性細菌 Magnetopsirillum sp.AMB-1 (Matsunaga et al. 1991)をＭＳＧＭ培地（Blakemore et al. 1979）(100L)を用いて室温で約７日間、嫌気条件下で培養した。培養３日後にキナ酸鉄溶液を培養液１Ｌに対し４ｍＬ添加した。培養した菌体は１００００ｇ、４℃で連続遠心機を用いて回収した。１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）を用いて懸濁した。この菌体を、１５００ｋｇ／ｃｍ²の条件下でフレンチプレス（大岳製作所、５５０１Ｍ）を用いて破砕し、ネオジウム−ボロン（Ｎｄ−Ｂ）磁石を用いて破砕菌体から磁性細菌粒子を磁気回収した。得られた磁性細菌粒子は、超音波洗浄器（Kaijo Denki Co. Ltd., CA4481）を用いて、ＰＢＳ中で３回以上洗浄された後、ＰＢＳに懸濁され４℃で保存した。
【００３４】
（２）検出用プローブの合成
シアノバクテリアの１６ＳｒＤＮＡの領域において属特異的領域を検索し、１５〜２０塩基内において各属間で２〜３以上の塩基の差異が見られる領域を見出し、その領域からMicrocystis属特異的検出用プローブＤＮＡをデザインした。デザインしたプローブＤＮＡについて、５'末端にビオチン標識された合成オリゴＤＮＡを作製した。
【００３５】
（３）ＤＮＡ固定化磁性細菌粒子の作製
磁性細菌粒子への修飾は、磁性細菌膜上に存在すると考えられるアミノ基を利用した。まず、磁性細菌ＡＭＢ−１株より抽出・精製された磁性細菌粒子（ＢＭＰｓ）１ｍｇを２．５％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳ１ｍＬ中に懸濁し、室温で３０分間反応させることにより、磁性細菌粒子膜上のアミノ基に対してアルデヒド基の導入を行った。反応後、磁気回収し、ＰＢＳで３回洗浄した。
洗浄後、修飾ＢＭＰｓ１ｍｇに対して、ストレプトアビジン(New England Bio Labs.)１００μｇをＰＢＳ１ｍＬ中に懸濁し、室温で２時間反応させることによりＢＭＰｓとストレプトアビジンを架橋した。架橋後、ＰＢＳで３回磁気回収、及び洗浄を行った後、ＤＮＡの非特異吸着を押さえるためにＮａＢＨ₄で未反応のアルデヒド基を還元し、ストレプトアビジン固定化ＢＭＰｓ（ＳＡ−ＢＭＰｓ）とした。作製したＳＡ−ＢＭＰｓ３００μｇに対して５′末端にビオチン標識したオリゴＤＮＡ３００ｐｍｏｌをＰＢＳ３００μｌ中でアビジン・ビオチン反応を行わせ、オリゴＤＮＡ固定化磁性細菌粒子（ＤＮＡ−ＢＭＰｓ）を作製した。
【００３６】
（４）サンプルＤＮＡの調製
シアノバクテリアからのゲノムＤＮＡの抽出は、MagExtractor-genome-の抽出法を改良した方法により抽出を行った。抽出された全ゲノムＤＮＡに対して、原核微生物を１６ＳｒＤＮＡ増幅用プライマーＲＳＦ−１、ＲＳＲ−２（E.coli 1523-1542ntのアンチセンス）(Kawaguchi et al.1992)を用い、ＰＣＲによって遺伝子増幅を行った。
尚、遺伝子増幅の際に、蛍光、発光若しくは電気化学的シグナルによって検出可能な蛍光色素、アルカリフォスファターゼ、フェロセン等のマーカーで標識したｄＵＴＰを用いてＰＣＲを行うことで標識されたサンプル核酸を調製することができる。例えば、ＦＩＴＣ標識された１６ＳｒＤＮＡを合成する場合には、蛍光物質であるＦＩＴＣ標識されたｄＵＴＰを用いてＰＣＲを行えばよい。
【００３７】
（５）装置への試薬等の設置
▲１▼１００μｇのプローブＤＮＡ固定化磁性粒子と、１００μｌのサンプルＤＮＡをクイクロプレート等の反応容器で混合し、十分に攪拌した後、本装置の反応部に設置する。
▲２▼チップノズルを保持したチップラックを滅菌後、チップラック・廃液部に設置する。
▲３▼洗浄液を収容する洗浄液収容容器を、洗浄部に設置する。
【００３８】
２．ディネーチャー工程
装置の始動スイッチを投入し、反応部１の加温・冷却装置の温度制御機能を稼働させ、反応容器を９５℃に温める。このまま５分間保持することにより、反応容器中のサンプル核酸の一本鎖化を行う。
【００３９】
３．アニーリング工程
温度を６０℃に冷却し、このまま１０分間保持することにより、容器中の核酸プローブ固定化磁性細菌粒子とサンプル核酸のアニーリングを行う。
【００４０】
４．Ｂ／Ｆ分離
アニーリング終了後、容器真下に設置された磁気制御装置を稼働して磁気吸引力を発生させ、磁性粒子を容器底面に集める。磁気制御装置を動作させてから約３分間そのまま待機する。この時、反応容器は６０℃に維持される。
【００４１】
５．洗浄工程
チップラック・廃液部上に移動させたアームユニットを下方へ移動させ、チップノズルとディスポチップを嵌合させることで、チップラック・廃液部に保持されたチップノズルを装着する。アームユニットを反応部へ移動させ、そのまま降下させて、適当な位置で停止後、チップノズルにて反応容器中の上清を吸引し、廃液部に移動して排出させる。
その後、アームユニットを洗浄液部へ移動させ、洗浄液収容容器より６０℃に維持された洗浄液を吸引し、再びアームユニットを反応部へ移動させ、反応容器中にこれを注入する。約３分間の待機後、再びチップノズルで反応容器中の上清を吸引し、チップラック・廃液部に排出する。この洗浄動作を３回繰り返し、最後に洗浄液を注入し動作を終了する。
【００４２】
動作終了後も反応部の磁気吸引力は維持させ、温度は０〜１５℃、好ましくは４℃で維持するように制御する。これにより、反応溶液中の磁性体が容器底部に凝集した状態を保ち、溶液の性質が変質することを防ぐことができる。尚、洗浄液部の温度制御は切断する。また、反応容器には、装置外からの光を遮断するためのカバーを装着することにより、核酸中に取り込んだ蛍光物質の劣化を防ぐことができる。
【００４３】
６．検出
反応容器を装置から取出し、容器を移し替えることなく、蛍光プレートリーダ（ＦＬＵＯstar^TM）によって反応容器内に生じる光の変化を測定する。
この結果、Microcystis aeruginosa NIES-98のＰＣＲ産物試料から最も強い発光が観察され、Microcystis属を特異的に検出できることが明らかとなった。
【００４４】
【発明の効果】
本発明のＢ／Ｆ分離方法によれば、磁性粒子が反応容器に吸着したままになることがなく、磁性粒子をもれなく集めることによって高い感度の測定ができ、さらにＢ／Ｆ分離後の測定にそのまま（反応容器を他の容器に移し替えることなく）移行でき、ハイブリダイゼーションの自動化された装置によるハイブリダイゼーションが迅速かつ容易に実施可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】反応容器下部に配置した永久磁石を鉛直方向にずらすことにより磁力のＯＮ−ＯＦＦをする磁力制御の例を示す図である。
【図２】磁性粒子下部に配置した永久磁石を埋め込んだ磁性体丸棒を回転させ、磁束の向きを変えることにより磁力のＯＮ−ＯＦＦをする磁力制御の例を示す図である。
【図３】磁性粒子下部に配置した、磁石の一部の端面が突出するように磁石を保持した磁性体棒を回転させ、磁力をＯＮ−ＯＦＦする磁力制御の例を示す図である。
【図４】ハイブリダイゼーション装置の例の内部構成を示す図である。
【図５】ハイブリダイゼーション装置の例の内部構成を示す図である。
【図６】図５のハイブリダイゼーション装置の反応部の内部構成を示す図である。
【符号の説明】
１：反応容器
２：溶液
３：磁性粒子
４：磁石
５：ディネーチャー部
６：アニーリング部
７：Ｂ／Ｆ分離部
８：チップラック収納部
９：廃液部
10：洗浄液部
11：試薬部
12：ヘッド部
13：ロボットハンド機構
14：ノズル
15：チップラック
16：チップ
17：反応部
18：チップラック・廃液部
19：洗浄液部
20：反応容器保持具
21：ヒーター
22：チラー
23：温度センサー
24：温度制御装置
25：磁力制御装置[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to an efficient B / F separation method after completion of a hybridization reaction.
[0002]
[Prior art]
The nucleic acid hybridization method is widely used as a means for specifically detecting a specific gene. Among them, the nucleic acid probe-immobilized particles are used as probes, the target nucleic acid in the liquid sample and the nucleic acid probe-immobilized particles are hybridized in the reaction container, and then solid / liquid separation (B / F separation) is performed. The hybridization method for measuring the amount of the target nucleic acid hybridized above is particularly noted because it is a simple and rapid hybridization method.
[0003]
Recently, magnetic particles have attracted attention as particles for immobilizing nucleic acid probes from the viewpoint of simplicity of B / F separation and the like. As the B / F separation means using the magnetic particles, (1) a method in which a magnetic body is arranged on the outer side surface of the reaction vessel and the magnetic particles are adsorbed and held on the inner side surface of the reaction vessel (patent No. 3115501), (2) a method of carrying out by arranging a rotating magnetic body on the outer side surface of the reaction vessel and adsorbing and desorbing magnetic particles on the inner side surface of the reaction vessel (Japanese Patent Laid-Open No. 11-156231), (3 ) A method of using a magnetic device in a sleeve separated from a solution and rotating and / or raising and lowering the magnetic device to adsorb magnetic particles on the outer wall of the sleeve, thereby collecting and resuspending the magnetic particles (JP-A-8-29425). No.) is known.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
However, when B / F separation is carried out by the methods (1) to (3) above, the reaction vessel and sleeve are usually made of plastic, and depending on the type of magnetic particles, they are easily adsorbed on the plastic. Therefore, even if the magnetic force is turned off, it remains adsorbed on the inner wall and sleeve of the reaction vessel, and the magnetic particles to be measured are not recovered well, and the number of particles is reduced. It turned out that. Further, it is necessary to move to another measuring container at the time of measurement.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a highly sensitive and rapid B / F separation means that can collect magnetic particles without fail.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The present inventor examined B / F separation after the completion of the nucleic acid hybridization reaction. As a result, if the probe-immobilized magnetic particles were immobilized only at the bottom of the reaction vessel by controlling the magnetic force, the supernatant was aspirated. The liquid part can be easily removed, and the magnetic particles can be collected without fail after injecting the cleaning liquid after injecting the cleaning liquid in the immobilized state or by moving the magnetic particles by controlling the magnetic force. Since magnetic particles move when -OFF is repeated, washing can be performed efficiently and easily, allowing high-sensitivity measurement, and as it is for measurement after B / F separation (without transferring the reaction vessel to another vessel) The present invention has been completed by finding that it can be transferred.
[0006]
That is, the present invention is a B / F separation method after the completion of a nucleic acid hybridization reaction using nucleic acid probe-immobilized magnetic particles as a probe, and the following B / F separation steps (1), (2) and (3) And a magnetic force control is performed so that the magnetic particles are immobilized only at the bottom of the reaction vessel.
(1) A step of sucking and removing the supernatant by controlling the magnetic force so that the magnetic particles are immobilized only at the bottom of the reaction vessel, (2) the magnetic particles in a state where the magnetic particles are immobilized or by controlling the magnetic force A step of injecting a cleaning liquid into the reaction vessel after mobilizing the particles, (3) Insert a permanent magnet into the non-penetrating hole of the magnet holding rod to make it permanent Hold the permanent magnet so that the end face of a part of the magnet protrudes, Magnet holding rod Does not exert magnetic force on the outside A magnetic rod, which is disposed at the bottom of the reaction vessel Rotate Change the direction of the magnetic flux The process of moving the magnetic particles in the cleaning liquid by repeatedly turning on and off the magnetic force.
[0007]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the B / F separation method of the present invention, the magnetic force may be controlled so that the nucleic acid probe-immobilized magnetic particles are immobilized only at the bottom of the reaction vessel. Specifically, the magnetic force may be controlled by disposing a magnetic force generation source at the bottom of the reaction vessel and turning the magnetic force at the bottom of the reaction vessel on and off. More specifically, (1) means for turning on and off the magnetic force by shifting the permanent magnet arranged at the lower part of the reaction vessel in the vertical direction (FIG. 1), (2) the permanent magnet in the horizontal direction on the lower surface of the reaction vessel. For example, a means for turning the magnetic force on and off by shifting the pitch so that it is completely removed by half pitch or (3) means for controlling the rotation of the ferromagnetic material provided with the permanent magnet, for example, a permanent magnet arranged at the bottom of the reaction vessel Means (Fig. 2) for turning on and off the magnetic force by rotating the embedded magnetic rod such as iron and changing the direction of the magnetic flux, and the end face of a part of the magnet arranged at the bottom of the reaction vessel protrudes Means for rotating the magnetic rod holding the magnet to turn the magnetic force on and off (FIG. 3), (4) means for horizontally turning the shield material of the permanent magnet to turn the magnet on and off, (5 ) Round electromagnet Means for the ON-OFF of more force, (6) means force the horseshoe electromagnet to the ON-OFF, include means such that the ON-OFF of the magnetic force using electromagnets (7) without core.
Of these magnetic ON / OFF means, the means (1), (2) and (3) are preferred because they are simple. For example, when the means shown in FIG. 3 is employed, the magnetic flux extends in the end face extending direction without being attracted to the inside of the magnet holding rod, so that the magnetic force of the magnet can be effectively directed to the reaction vessel. The hole for inserting the magnet does not penetrate and has a sufficient thickness so that the magnetic force does not leak. As a result, the magnetic flux on the holding side end surface passes through the inside of the magnet holding rod and does not exert a magnetic force on the outside of the holding rod, so that the magnetic force to the reaction vessel can be completely cut off when the magnetic force is cut off.
[0008]
The B / F separation step of the present invention is performed by repeating the following steps (1) and (2) a predetermined number of times after completion of the hybridization reaction (means a).
(1) A step of sucking and removing the supernatant by controlling the magnetic force so that the magnetic particles are immobilized only on the bottom of the reaction vessel,
(2) A step of injecting a cleaning liquid into the reaction vessel after mobilizing the magnetic particles in a state where the magnetic particles are immobilized or by controlling the magnetic force.
[0009]
In the B / F separation step of the present invention, the following steps (1), (2) and (3) may be performed after the hybridization reaction (means b).
(1) A step of sucking and removing the supernatant by controlling the magnetic force so that the magnetic particles are immobilized only on the bottom of the reaction vessel,
(2) A step of injecting a cleaning liquid into the reaction vessel after mobilizing the magnetic particles by immobilizing the magnetic particles or controlling the magnetic force,
(3) A step of moving the magnetic particles in the cleaning liquid by repeatedly turning on and off the magnetic force.
[0010]
Here, in the step (1), the state in which the magnetic particles are immobilized only at the bottom of the reaction vessel by turning on the magnetic force at the bottom of the reaction vessel is shown on the right side of FIGS. . Usually, a reaction vessel for hybridization, such as a 24-well to 96-well microplate, has a small bottom surface, so if the magnetic particles are immobilized only at the bottom, a plastic such as magnetic beads produced by magnetic bacteria as magnetic particles. Even when particles that are easily adsorbed are used, there is almost no adsorption.
[0011]
In step (2), even if the magnetic force at the lower part of the reaction vessel is turned off, the magnetic particles remain collected at the bottom of the vessel, but diffuse to some extent by injecting the cleaning liquid. After that, the magnetic force is turned on again, and the cleaning liquid may be sucked and discarded in a state where the magnetic particles are immobilized on the bottom. However, it is also possible to perform cleaning with the magnetic force turned on from the beginning. Thereby, further cleaning is performed quickly and efficiently.
[0012]
In the means a, the step (1) and the step (2) may be repeated once or more, for example, 1 to 3 times.
[0013]
Step (3) of the means b is a means that enables sufficient washing and removes nonspecifically adsorbed substances with respect to magnetic particles even though the washing liquid is injected only once into the reaction vessel. According to the means b, it is not necessary to repeat the step (1) and the step (2) twice, so that the step of removing the supernatant after the washing liquid is injected can be omitted. Therefore, it is possible to reduce the risk of erroneously sucking magnetic particles by the supernatant suction operation.
[0014]
The principle of moving the magnetic particles in the cleaning liquid by repeating ON / OFF of the magnetic force in the lower part of the reaction vessel is as follows. That is, the magnetic particles having spontaneous magnetization lie so that the N pole-S pole of each bead contacts when the magnetic field applied from below is zero. When a large N-pole magnetic field is applied from the bottom, the magnetic particles exceed the magnetic force interaction between the magnetic particles, and the S-pole side of the magnetic particles faces downward so that the magnetic particles rotate just 90 degrees on the spot. In the magnetic force interaction between the magnetic particles, the poles repelling each other face each other. When the forcible magnetic field is gradually reduced from this state, the magnetic particles cause an inversion phenomenon called “rising” when the magnetic interaction between the magnetic particles exceeds. In this way, if the magnetic field is forcibly controlled and the cycle of strong → weak → cutting is repeated, the magnetic particles move around in the cleaning solution, and it becomes possible to release the nonspecifically adsorbed substances on the surface of the magnetic particles. .
[0015]
If the magnetic force is turned off after completion of the step (2) or step (3), the B / F separation-completed solid phase remains in the reaction vessel. Further, by transferring the reaction vessel subjected to the B / F separation to a measurement unit (not shown) as it is, it becomes possible to measure the light emission amount or the fluorescence amount of the magnetic particles collected on the bottom.
[0016]
The magnetic particles used in the present invention are not particularly limited as long as they are insoluble in an aqueous solution and exhibit magnetism. For example, FeO, γ-FeO, Co-γ-FeO, (NiCuZn) O · FeO, (CuZn) O · FeO, (MnZn) O · FeO, (NiZn) O · FeO, SrO · 6FeO, BaO · 6FeO, SiO ₂ Coated with FeO (particle size of about 200A) [see Enzyme Microb. Tecnol., Vol2, p.2-10 (1980)], various polymer materials (nylon, polyacrylamide, polystyrene, etc.) and composite fine particles And magnetic bacteria particles synthesized by the bacteria in the cells. The magnetic bacterial particles are particularly preferred because the magnetic domains are in a single domain region in a certain direction within the particles, so that magnets can be collected in a narrow region at the bottom of the reaction vessel by placing them at the bottom of the reaction vessel.
[0017]
Magnetic bacteria were discovered in the United States in the 1970s, and magnetite (Fe) having a particle size of about 50 to 100 nm was found in the cells. _Three O _Four ) Holds chain-like particles called magnetosomes, each consisting of about 10 to 20 single crystal particles. Magnetic bacteria can detect geomagnetism by holding this magnetosome and recognize the direction of magnetic field lines. Magnetic bacteria are microaerobic bacteria that can swim along the magnetic field lines from the aerobic water surface to the microaerobic sediment surface by sensing geomagnetism.
As shown in ANALYTICAL CHEMISTRY, VOL. 63, No. 3, FEBRUARY 1,1991 P268-P272, such a magnetic bacterium can be isolated and cultivated in large quantities.
The magnetic particles in this magnetic bacterium are hexagonal cylinders with a very uniform particle size and shape, high purity, and about 50 emu / g when the magnetization of the microbial cells containing the particles is converted per fine particle.
Further, the coercive force is 230 Oe, and it has been confirmed that it has a single domain structure. Further, since the particle surface is covered with an organic thin film, the magnetic particles have characteristics that they are present stably with little metal elution and excellent in dispersibility in an aqueous solution.
[0018]
Known methods for extracting magnetic bacterial particles from magnetic bacteria include physical pressure crushing using a French press, alkaline boiling, enzyme treatment, ultrasonic crushing treatment, etc. Crushing with a French press is suitable. After extraction, magnetic bacterial particles may be separated with a magnet or the like.
[0019]
Nucleic acid probe-immobilized magnetic particles are not limited as long as DNA, RNA, or PNA that serves as a probe for a target gene is immobilized on the magnetic particles. In addition, substances other than these can also be used as long as they have specific binding ability to DNA sequences. As the DNA that can serve as a probe for the target gene, a DNA known per se can be used. For immobilization of the probe to the magnetic particles, it is preferable to immobilize the probe by a covalent bond using an ordinary cross-linking agent.
[0020]
The B / F separation means of the present invention is preferably used for hybridization using an automated hybridization apparatus. As the hybridization apparatus, as shown in FIG. 4, at least (a) a denaturer unit 5 including a reaction container holder and a heating / cooling apparatus, and (b) a reaction container holder and a heating / cooling apparatus. (C) A B / F separation unit comprising a reaction vessel holder and a magnetic force control device, and capable of controlling the magnetic force so that the nucleic acid probe-immobilized magnetic particles are immobilized only on the bottom of the reaction vessel 7, (d) a chip rack storage section 8 including a chip rack 15, (e) a cleaning liquid section 10 including a cleaning liquid storage container, (f) a waste liquid section 9 including a waste liquid storage container, and (g) a plurality of Equipped with a chip nozzle 14, a mechanism for attaching / detaching a chip to / from the chip nozzle, a mechanism for the attached chip to suck / inject a processing solution, and a reaction vessel to be freely held and detached. It has a robot hand mechanism 13 capable, head portion 12 becomes provided with a freely movable arm unit to X-Z-axis direction, and a more composed automated nucleic acid hybridization device.
[0021]
If this hybridization apparatus is used, the following steps (1) to (10) are automatically performed, and then the amount of labeled nucleic acid in the reaction vessel is measured, whereby the nucleic acid in the sample can be detected.
(1) A reaction vessel in which nucleic acid probe-immobilized magnetic particles and labeled sample nucleic acid are injected and mixed is installed in the deinator unit 5, and the temperature in the reaction vessel is set to the nucleic acid deaner temperature by a heating / cooling device. The temperature is set, and the temperature is maintained for a predetermined time so that the sample nucleic acid is single-stranded. At this time, the magnetic particles in the reaction vessel are moved by magnetic force control.
(2) The arm unit is operated to transfer the reaction vessel of the detainer unit 5 to the annealing unit 6.
(3) The temperature in the reaction vessel is set to the annealing temperature of the nucleic acid by the heating / cooling device of the annealing unit 6, and annealing is performed while maintaining the temperature for a predetermined time.
(4) The arm unit is moved to the annealing unit 6 and the reaction vessel is transferred to the B / F separation unit 7.
(5) Operate the magnetic force control device to immobilize the sample nucleic acid bound to the magnetic particles at the bottom of the reaction vessel.
(6) The arm unit is moved to the chip rack storage 8 and the chip 16 is mounted on the chip nozzle 14.
(7) The arm unit is moved to the B / F separation unit 7 and the supernatant in the reaction vessel is sucked by the tip nozzle 14.
(8) The arm unit is moved to the waste liquid section 9 and the suction supernatant in the tip nozzle is discharged into the waste container of the waste liquid section 9.
(9) Move the arm unit to the cleaning liquid unit 10, suck the cleaning liquid from the cleaning liquid container, and inject the cleaning liquid into the reaction container of the B / F separation unit 7.
(10) The washing operation of (7) to (9) is repeated a predetermined number of times, and finally the washing solution is injected into the reaction vessel.
[0022]
Furthermore, a hybridization apparatus in which all reactions in hybridization, ie, denature, annealing, and B / F separation are all performed in one reaction vessel is more preferable. Examples of such an apparatus include a hybridization apparatus having a reaction section equipped with a reaction container holder, a heating / cooling apparatus, and a magnetic force control apparatus. More specifically, at least (A) a reaction unit 17 including a reaction vessel holder, a heating / cooling device, and a magnetic force control device, and (B) a chip rack / waste solution unit including a chip rack and a waste liquid storage container. 18, (C) a cleaning liquid container 19 including a cleaning liquid storage container and a heating / cooling device, and (D) a plurality of tip nozzles, and a mechanism for attaching / detaching the tips to / from the tip nozzles. An automatic nucleic acid hybridization apparatus comprising a head unit 12 having an arm unit that has a mechanism for sucking and injecting a processing solution and moving freely in the XZ axis direction (FIG. 5). It is. Here, the magnetic force control apparatus in the reaction part (A) can control the magnetic force so that the nucleic acid probe-immobilized magnetic particles are immobilized only on the bottom part of the reaction vessel.
[0023]
If this hybridization apparatus is used to automatically perform the following steps (1) to (8) and then measure the amount of labeled nucleic acid in the reaction vessel, the nucleic acid in the sample can be detected.
(1) Install a reaction vessel in which the nucleic acid probe-immobilized magnetic particles and labeled sample nucleic acid are injected and mixed in the reaction section, and set the temperature in the reaction vessel to the nucleic acid denaturer temperature using a heating / cooling device. The temperature is maintained for a predetermined time to make the sample nucleic acid single-stranded. At this time, the magnetic particles in the reaction vessel are moved by magnetic force control.
(2) The temperature in the reaction vessel is changed to the annealing temperature of the nucleic acid, and annealing is performed while maintaining the temperature for a predetermined time.
(3) Operate the magnetic force control device to immobilize the sample nucleic acid bound to the magnetic particles at the bottom of the container.
(4) Operate the arm unit to move to the chip rack / waste liquid section and attach the chip to the chip nozzle.
(5) The arm unit is moved to the reaction part, and the supernatant in the reaction container is sucked with a tip nozzle.
(6) The arm unit is moved to the tip rack / waste liquid section, and the suction supernatant in the tip nozzle is discharged to the waste container.
(7) The arm unit is moved to the cleaning liquid section, the cleaning liquid whose temperature is adjusted to the annealing temperature in advance by the heating / cooling device is sucked from the cleaning liquid storage container, and the cleaning liquid is injected into the reaction container of the reaction section.
(8) The cleaning operation of (5) to (7) is repeated a predetermined number of times, and finally the cleaning liquid is injected into the reaction vessel.
[0024]
Hereinafter, specific examples of the hybridization apparatus used in the B / F separation method of the present invention will be described with reference to the drawings.
FIG. 5 is a conceptual diagram showing the internal configuration of the automatic nucleic acid hybridization apparatus.
The reaction unit 17 in FIG. 5 converts the sample nucleic acid into a single strand (denature), then performs hybridization (annealing) between the single-stranded sample nucleic acid and a specific nucleic acid probe, and then performs B / F separation. It is a reaction part to be performed, and includes a holder 20 for storing and holding the reaction vessel, and a heating / cooling device and a magnetic force control device 25 for adjusting the temperatures of the deenergizer and the annealing (FIG. 6).
[0025]
As shown in FIG. 6, the heating / cooling device includes a heater 21 that heats the reaction vessel holder 20, a chiller 22 that cools the heater 21, a sensor 23 that controls the temperature, and a temperature control device that controls the temperature. 24.
The temperature control device 24 is a temperature at which the deenergization proceeds in the reaction vessel in the deinator (generally around 95 ° C., but may be lower if the length of the sample nucleic acid is short). In annealing, it is fixed so as to be controlled at an annealing temperature (usually 40 to 70 ° C.). The reaction time is also controlled by the timer function of the temperature controller.
[0026]
As described above, the magnetic force control device 25 may be any device that can control the magnetic force so that the nucleic acid probe-immobilized magnetic particles are immobilized only on the bottom of the reaction vessel. FIG. 6 shows a magnetic force control device by means (FIG. 1) for turning on and off the magnetic force by shifting a permanent magnet arranged in the lower part of the reaction vessel in the vertical direction. As the magnetic force control device, a magnetic force control device for controlling the rotation of a ferromagnetic material provided with a permanent magnet, for example, rotating a magnetic rod embedded with a permanent magnet arranged at the bottom of the reaction vessel as shown in FIG. 2 or FIG. It is preferable to use a magnetic force control device using means for turning the magnetic force on and off.
[0027]
At the time of the deenergization and annealing reaction, the magnetic force at the lower part of the reaction vessel is turned off as shown on the left side of FIGS. After completion of the annealing reaction, washing and B / F separation are performed by means a or b.
[0028]
Reference numeral 18 in FIG. 5 denotes a chip rack / waste liquid part which discharges waste liquid sucked up from the reaction part at the time of B / F separation / washing, a chip rack holding a disposable chip for dispensing cleaning liquid and reagents, A waste liquid storage container is provided at the lower part for retaining. In this manner, space can be saved by arranging the chip rack and the waste liquid storage container perpendicular to the moving plane of the head portion.
In the chip rack, a hole is formed to support the tapered portion of the disposable chip (hereinafter, disposable chip), and the disposable chip is inserted before the measurement is started.
[0029]
Reference numeral 19 in FIG. 5 denotes a cleaning liquid unit, which includes a cleaning liquid container and a heating / cooling device. The washing liquid is controlled to the same temperature as the annealing temperature by a heating / cooling device so that the nucleic acid in the reaction vessel does not undergo non-specific adsorption or dissociation due to temperature changes during washing.
A plurality of cleaning liquid portions can be provided as necessary. For example, when an immune reaction is performed in order to detect hybridized nucleic acid, two washing liquid parts are required.
[0030]
Reference numeral 12 in FIG. 5 denotes a head unit having an arm unit movable in the XZ axis direction. The arm unit moves the tip nozzle, a mechanism for moving the head unit, and the head unit. Thus, a mechanism for attaching / detaching a chip to / from the chip nozzle and a mechanism for sucking / injecting a processing liquid (waste liquid or cleaning liquid) from the mounted chip are constituted.
[0031]
This hybridization apparatus can be further provided with a reagent part (E) comprising a reagent container as required. For example, when a label for detecting the hybridized nucleic acid is necessary, the labeling reagent (for example, alkaline phosphatase-labeled anti-DIG Fab ′ fragment (anti-DIG-AP) or the like) or an enzyme coloring substrate (for example, alkaline phosphatase) It is necessary to provide a reagent part for storing a phosphatase luminescent substrate or the like.
On the other hand, when the sample nucleic acid labeled in advance is used, it is not necessary to provide this reagent part.
[0032]
The nucleic acid hybridization method used here is a two-step method (sandwich method) even if the hybridization method is a one-step method as long as it utilizes hybridization of nucleic acids in a sample and magnetic particles immobilized with a nucleic acid probe. It may be. In addition, the nucleic acid probe to be used may be any of single-stranded DNA, RNA, or PNA.
[0033]
【Example】
A specific example of a nucleic acid detection method using the above hybridization apparatus (see FIG. 5) is shown below.
1. Preparation process
(1) Production of magnetic bacteria particles
For the production of magnetic bacterial particles, isolated bacterial bacterium Magnetopsirillum sp. AMB-1 (Matsunaga et al. 1991) was used for about 7 days at room temperature using MSGM medium (Blakemore et al. 1979) (100 L). Cultured under anaerobic conditions. After 3 days of culture, 4 mL of the iron quinate solution was added to 1 L of the culture solution. The cultured cells were collected at 10,000 g at 4 ° C. using a continuous centrifuge. It was suspended using 10 mM phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4). This microbial cell is 1500 kg / cm ² Under the above conditions, the powder was crushed using a French press (Otake Seisakusho, 5501M), and magnetic bacteria particles were magnetically recovered from the crushed cells using a neodymium-boron (Nd-B) magnet. The obtained magnetic bacterial particles were washed three or more times in PBS using an ultrasonic cleaner (Kaijo Denki Co. Ltd., CA4481), then suspended in PBS and stored at 4 ° C.
[0034]
(2) Synthesis of detection probe
A genus-specific region is searched in the 16S rDNA region of cyanobacteria, and a region where a difference of 2 to 3 or more bases is observed between each genus within 15 to 20 bases is found. DNA was designed. For the designed probe DNA, a synthetic oligo DNA labeled with biotin at the 5 ′ end was prepared.
[0035]
(3) Preparation of DNA-immobilized magnetic bacterial particles
Modification to magnetic bacterial particles utilized amino groups that are thought to be present on magnetic bacterial membranes. First, 1 mg of magnetic bacterial particles (BMPs) extracted and purified from the magnetic bacterial strain AMB-1 were suspended in 1 mL of PBS containing 2.5% glutaraldehyde, and reacted at room temperature for 30 minutes, so that the magnetic bacterial particle film An aldehyde group was introduced into the amino group. After the reaction, it was magnetically recovered and washed 3 times with PBS.
After washing, 100 μg of streptavidin (New England Bio Labs.) Was suspended in 1 mL of PBS with respect to 1 mg of modified BMPs and reacted at room temperature for 2 hours to crosslink BMPs and streptavidin. After cross-linking, after magnetic recovery and washing with PBS three times, NaBH is used to suppress nonspecific adsorption of DNA. _Four The unreacted aldehyde group was reduced to give streptavidin-immobilized BMPs (SA-BMPs). 300 μg of the prepared SA-BMPs was subjected to avidin-biotin reaction with 300 μl of oligo DNA labeled with biotin at the 5 ′ end in 300 μl of PBS to prepare oligo DNA-immobilized magnetic bacterial particles (DNA-BMPs).
[0036]
(4) Preparation of sample DNA
Extraction of genomic DNA from cyanobacteria was performed by an improved method of MagExtractor-genome- extraction. Prokaryotic microorganisms were amplified by PCR using 16S rDNA amplification primers RSF-1 and RSR-2 (E. coli 1523-1542nt antisense) (Kawaguchi et al. 1992). went.
At the time of gene amplification, a labeled sample nucleic acid is prepared by performing PCR using a dUTP labeled with a marker such as a fluorescent dye, alkaline phosphatase, ferrocene or the like that can be detected by fluorescence, luminescence, or electrochemical signal. be able to. For example, when synthesizing FITC-labeled 16S rDNA, PCR may be performed using FITC-labeled dUTP which is a fluorescent substance.
[0037]
(5) Installation of reagents in the equipment
{Circle around (1)} 100 μg of probe DNA-immobilized magnetic particles and 100 μl of sample DNA are mixed in a reaction vessel such as a cucumber plate, and after sufficient stirring, placed in the reaction section of this apparatus.
(2) After sterilizing the tip rack holding the tip nozzle, place it in the tip rack / waste liquid section.
(3) A cleaning liquid container for storing the cleaning liquid is installed in the cleaning section.
[0038]
2. De nature process
The start switch of the apparatus is turned on, the temperature control function of the heating / cooling apparatus of the reaction section 1 is operated, and the reaction vessel is warmed to 95 ° C. By holding for 5 minutes, the sample nucleic acid in the reaction vessel is made into a single strand.
[0039]
3. Annealing process
By cooling the temperature to 60 ° C. and holding for 10 minutes as it is, annealing of the nucleic acid probe-immobilized magnetic bacterial particles and the sample nucleic acid in the container is performed.
[0040]
4). B / F separation
After the annealing is completed, a magnetic control device installed immediately below the container is operated to generate a magnetic attractive force, and the magnetic particles are collected on the bottom surface of the container. Wait about 3 minutes after operating the magnetic controller. At this time, the reaction vessel is maintained at 60 ° C.
[0041]
5). Cleaning process
The chip unit held in the chip rack / waste liquid part is mounted by moving the arm unit moved onto the chip rack / waste liquid part downward and fitting the chip nozzle and the disposable chip. The arm unit is moved to the reaction part, lowered as it is, stopped at an appropriate position, and the supernatant in the reaction vessel is sucked by the tip nozzle, moved to the waste liquid part and discharged.
Thereafter, the arm unit is moved to the cleaning liquid section, the cleaning liquid maintained at 60 ° C. is sucked from the cleaning liquid storage container, the arm unit is moved again to the reaction section, and this is injected into the reaction container. After waiting for about 3 minutes, the supernatant in the reaction vessel is again sucked with the tip nozzle and discharged to the tip rack / waste liquid part. This cleaning operation is repeated three times, and finally the cleaning liquid is injected to complete the operation.
[0042]
Even after the operation is completed, the magnetic attractive force of the reaction part is maintained, and the temperature is controlled to be maintained at 0 to 15 ° C., preferably 4 ° C. Thereby, the magnetic substance in the reaction solution can be kept in a state of being aggregated at the bottom of the container, and the properties of the solution can be prevented from being altered. The temperature control of the cleaning liquid part is cut off. In addition, by attaching a cover for blocking light from outside the apparatus to the reaction container, it is possible to prevent deterioration of the fluorescent substance incorporated in the nucleic acid.
[0043]
6). detection
Remove the reaction vessel from the apparatus and transfer the fluorescent plate reader (FLUOstar) without changing the vessel. ^TM ) To measure the change in light generated in the reaction vessel.
As a result, the strongest luminescence was observed from the PCR product sample of Microcystis aeruginosa NIES-98, and it was revealed that the genus Microcystis can be specifically detected.
[0044]
【The invention's effect】
According to the B / F separation method of the present invention, magnetic particles do not remain adsorbed in the reaction vessel, and high sensitivity can be measured by collecting all the magnetic particles. Further, for the measurement after B / F separation. The transfer can be carried out as it is (without transferring the reaction vessel to another vessel), and hybridization using an apparatus with automated hybridization can be carried out quickly and easily.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing an example of magnetic force control for turning on and off a magnetic force by shifting a permanent magnet arranged at a lower part of a reaction vessel in a vertical direction.
FIG. 2 is a diagram showing an example of magnetic force control for turning on and off a magnetic force by rotating a magnetic rod embedded with a permanent magnet disposed under a magnetic particle and changing the direction of the magnetic flux.
FIG. 3 is a diagram showing an example of magnetic force control in which a magnetic rod that holds a magnet is rotated so that a part of the end surface of the magnet protrudes, and the magnetic force is turned on and off.
FIG. 4 is a diagram showing an internal configuration of an example of a hybridization apparatus.
FIG. 5 is a diagram showing an internal configuration of an example of a hybridization apparatus.
6 is a diagram showing an internal configuration of a reaction unit of the hybridization apparatus of FIG.
[Explanation of symbols]
1: Reaction vessel
2: Solution
3: Magnetic particles
4: Magnet
5: De-Nature part
6: Annealing club
7: B / F separation part
8: Chip rack storage
9: Waste liquid part
10: Cleaning liquid part
11: Reagent part
12: Head
13: Robot hand mechanism
14: Nozzle
15: Chip rack
16: Chip
17: Reaction part
18: Chip rack and waste liquid section
19: Cleaning liquid part
20: Reaction vessel holder
21: Heater
22: Chiller
23: Temperature sensor
24: Temperature control device
25: Magnetic control device

Claims

B / F separation method after completion of nucleic acid hybridization reaction using nucleic acid probe-immobilized magnetic particles as probes, wherein the following B / F separation steps (1), (2) and (3) are performed, and the magnetic particles The B / F separation method is characterized in that the magnetic force is controlled so as to be immobilized only at the bottom of the reaction vessel.
(1) A step of sucking and removing the supernatant by controlling the magnetic force so that the magnetic particles are immobilized only at the bottom of the reaction vessel, (2) the magnetic particles in a state where the magnetic particles are immobilized or by controlling the magnetic force A step of injecting a cleaning liquid into the reaction vessel after mobilizing the particles, (3) inserting the permanent magnet into a non-penetrating hole of the magnet holding rod and holding the permanent magnet so that a part of the end face of the permanent magnet protrudes; the outside of the magnet retaining bars a magnetic rod which does not adversely force by Rukoto the magnetic substance rods arranged in the lower portion of the reaction vessel is rotated changing the direction of the magnetic flux, by repeating the oN-OFF of the magnetic force Moving the magnetic particles in the cleaning liquid.

The B / F separation method according to claim 1, wherein the hybridization reaction is carried out in a reaction section comprising a reaction vessel holder, a heating / cooling device, and a magnetic force control device.

The hybridization reaction comprises at least (A) a reaction container holding tool, a heating / cooling device and a magnetic force control device, C) A cleaning liquid part including a cleaning liquid container and a heating / cooling device, and (D) a mechanism for mounting / removing a chip to / from the chip nozzle, and a process for processing the mounted chip. And a mechanism for sucking and injecting a solution, and an automatic nucleic acid hybridization device comprising a head unit including an arm unit that can move freely in the XZ axis direction. Item 3. The B / F separation method according to Item 1 or 2.