JP3838033B2 - プレニルアルコールの製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プレニルアルコールの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内でのテルペノイド（イソプレノイド）合成は、アリル性二リン酸基質にイソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate）(IPP, C5)を順次縮合することによって直鎖プレニル二リン酸であるゲラニル二リン酸（geranyl diphosphate (GPP, C10 )）、ファルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate (FPP, C15)）、ゲラニルゲラニル二リン酸（geranylgeranyl diphosphate (GGPP, C20)）が生合成されるところから始まる（図１）。図１において、枠で囲まれた文字が酵素を表す。hmgRはヒドロキシメチルグルタリル-CoA（hydroxymethylglutaryl-CoA：HMG-CoA）還元酵素、GGPSはGGPP合成酵素、FPSはFPP合成酵素を示す。
【０００３】
プレニル二リン酸のなかでも、FPPは最も重要な生合成中間体であり、膨大な種類のテルペノイド類、例えば、エルゴステロール（プロビタミンD2）を含むステロイド類、キノン（ビタミンK, VK）の側鎖、セスキテルペン類、スクアレン（SQ）、ファルネシル化タンパク質のアンカー分子、天然ゴムなどの合成前駆体である。
【０００４】
GGPPもまた、生体内では重要な生合成中間体であり、レチノール（ビタミンA, VA）、β-カロテン（プロビタミンA）、フィロキノン（ビタミンK1, VK1）、トコフェロール類（ビタミンE, VE）、ゲラニルゲラニル化タンパク質のアンカー分子、葉緑体の側鎖、ジベレリン、アーキアのエーテル型脂質などを始めとする化合物の生合成に必須である。
【０００５】
FPP、GGPPのアルコール誘導体であるファルネソール(farnesol)(FOH, C15)、ネロリドール(nerolidol)(NOH, C15)、ゲラニルゲラニオール（geranylgeraniol） (GGOH, C20)は、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な上記ビタミン類をはじめとする化合物の合成出発物質としてもまた重要な物質である（図１）。
従って、異性体混合物でないいわゆる活性型プレニルアルコールの純品を大量に生産できる系の確立が望まれている。
【０００６】
IPPの生体内での合成は、すべてメバロン酸経路（アセチル補酵素A（acetyl-CoA）からメバロン酸を経てIPPを合成する経路）によると考えられてきたが、1980年代末より、M. Rohmerらがバクテリアを用いて新しいIPP合成経路を明らかにした。これは、非メバロン酸経路又はDXP(1-deoxyxylulose 5-phosphate)経路と呼ばれており、グリセルアルデヒド3-リン酸とピルビン酸から1-deoxyxylulose 5-phosphateを経てIPPを合成する経路である。
【０００７】
FOHやNOHは、精油等の天然物から少量調製される以外には、現在化学合成法により合成されている。化学合成法で合成されるFOH、NOHは、一般的には炭素骨格が同じであるが、二重結合が(E)-型(trans型)と(Z)-型(cis型)の混合物として得られる。(all-E)-型である(E,E)-FOH又は(E)-NOHは生物の代謝経路で合成される形であり、工業的利用価値を有する。(E,E)-FOH又は(E)-NOHを純粋な形で得るためには、カラムクロマトグラフィーや精密蒸留などを利用した精製が必要である。しかし、熱的に不安定なアリルアルコール(allylalcohol)であるFOHとその異性体であるNOHの精密蒸留は困難である。また、カラムクロマトグラフィーによる精製は、多量の溶媒充填剤を必要とし、順次溶出してくる各画分を分析しながら回収し、さらに溶媒を除去しなければならないなど、操作が煩雑でコストも高く、工業実施には適さない。そこで、(E)-、(Z)-幾何異性体の生成制御や反応産物の繰り返し構造などの特徴から、(E,E)-FOH（以下「FOH」と記す）の生合成法が望まれているが確立されていない。FOH合成基質は、例えば出芽酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の細胞内ではメバロン酸経路を経て供給されるが、そのキー酵素と考えられるHMG-CoA還元酵素を利用しても、スクアレン合成能が上がることしか知られていない(特開平5-192184号公報； Donald et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63, 3341-3344)。また、ステロール取り込み能を獲得した特別な出芽酵母のスクアレン合成酵素遺伝子欠損株を培養しても、培養液１リットルあたり1.3mgのFOHの蓄積が知られているだけであり(Chambon et al.(1990) Curr. Genet. 18, 41-46)、(E)-NOH（以下「NOH」と記す）の生合成法は知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、HMG-CoA還元酵素遺伝子、IPPΔ-イソメラーゼ遺伝子若しくはFPP合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子を含む発現用組換えDNAの導入により作製された組換え体を培養することによるプレニルアルコールの製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、発酵工業に古来から広く用いられ、メバロン酸経路あるいはDXP経路を経てプレニル二リン酸合成を行い、遺伝子組換えに関する様々な手法が駆使できる宿主、例えば単細胞真核生物（特に酵母）又は原核生物（例えばバクテリア、特に大腸菌）を実験材料にして、プレニル二リン酸合成に関わる酵素の遺伝子導入によるプレニルアルコール生産系の開発を行った。酵母でプレニル二リン酸合成に関わる酵素の遺伝子（例えばHMG-CoA還元酵素遺伝子）を宿主細胞内で人為的に発現させる系を構築するために、恒常発現型又は誘導発現型転写プロモーターを含み、各種栄養要求性マーカーを持った発現シャトルベクターの作製を行い、これに目的の遺伝子又はその変異型遺伝子を組み込み、これを各種宿主細胞へ導入した。そして、その培養物からNOH又はFOHを得、上記目的を達成することに成功し、本発明を完成するに至った。大腸菌では、既存のベクターを用いプレニル二リン酸合成に関わる酵素の遺伝子（例えばFPP合成酵素遺伝子やIPPΔ-イソメラーゼ遺伝子）を宿主細胞に導入しその培養物を脱リン酸化した後FOHを得、上記目的を達成することに成功し本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、HMG-CoA還元酵素遺伝子、FPP合成酵素遺伝子若しくはIPPΔ-イソメラーゼ遺伝子又はこれらの変異型遺伝子並びに転写プロモーター及び転写ターミネーターを含む、発現用組換えDNA又はゲノムインテグレート用DNA断片を、宿主に導入して組換え体を作製し、該組換え体を培養した後、得られる培養物からプレニルアルコールを採取することを特徴とするプレニルアルコールの製造方法である。プレニルアルコールとしては、炭素数15のもの、例えばFOH又はNOHが挙げられる。HMG-CoA還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子としては、配列番号２、４又は６に示すアミノ酸配列をコードするものやその欠失体、例えば配列番号１、３、５及び７〜16からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含むものが挙げられる。ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子としては、配列番号76、78、80、82又は84に示されるアミノ酸配列をコードするもの、例えば配列番号75、77、79、81及び83からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含むものが挙げられる。IPPΔ-イソメラーゼ遺伝子又はその変異型遺伝子としては、配列番号86に示されるアミノ酸配列をコードするもの、例えば配列番号85に示される塩基配列を含むものが挙げられる。転写プロモーターとしては、ADH1プロモーター、TDH3（GAP）プロモーター、PGK1プロモーター、TEF2プロモーター、GAL1プロモーター及びtacプロモーターかなる群から選ばれるいずれかのものが挙げられる。但し、これらのプロモーターと機能的に同等の活性を有する転写プロモーターも使用することができる。また、転写ターミネーターとしては、ADH1ターミネーター又はCYC1ターミネーターが挙げられる。但し、これらのターミネーターと機能的に同等の活性を有する転写ターミネーターも使用することができる。さらに、宿主は、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエなどの出芽酵母、具体的にはA451、YPH499、YPH500、W303-1A若しくはW303-1B又はこれらに由来する株、あるいはバクテリア、例えば大腸菌（Escherichia coli）、具体的にはJM109又はこれに由来する株であることが好ましい。
【００１１】
本発明によれば、プレニルアルコールとして例えばNOHやFOHを、宿主細胞のみの培養物では到達できない濃度（少なくとも培地中0.05mg/lの濃度）で生産することができる。
さらに、本発明は、HMG-CoA還元酵素遺伝子、FPP合成酵素遺伝子若しくはIPPΔ-イソメラーゼ遺伝子又はこれらの変異型遺伝子並びに転写プロモーター及び転写ターミネーターを含む、発現用組換えDNA又はゲノムインテグレート用DNA断片を、宿主に導入してなる組換え体であって、少なくとも0.05mg/lのFOH又はNOHを生産することができる組換え体である。宿主、プロモーター、ターミネーターの種類は前記と同様である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明者は、代謝工学的な手法を用い、生体内で活性型プレニルアルコール((all-E)-プレニルアルコール)を生産させる系の開発に臨んだ。一般に、FPPは、ファルネシル二リン酸合成酵素（FPS）の触媒により、IPP及びDMAPP（3,3-dimethylallyl diphosphate）を基質として合成されるが、通常FOHへの反応は進行せず、スクアレン合成酵素によるスクアレン合成、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素によるGGPP合成、ヘキサプレニル二リン酸合成酵素によるヘキサプレニル二リン酸合成などに進行する（図１）。本発明は、生物によって異なる二つの独立な経路（メバロン酸経路とDXP経路）を経るプレニル二リン酸合成の活性化に関与すると考えられるHMG-CoA還元酵素遺伝子、FPP合成酵素遺伝子、又はIPPΔ-イソメラーゼ遺伝子の導入により、通常予想されるスクアレンや主要最終産物であるステロール類などではなく、一般的な代謝経路マップ中にも明記されていないNOHやFOH等のプレニルアルコールを産生することができる形質転換細胞を見出し、プレニルアルコールの生物学的な大量生産系を開発したものである。また、HMG-CoA還元酵素遺伝子の一部の領域をさまざまなパターンで欠失させ（図２）、その遺伝子を転写プロモーター制御下で宿主に導入し、あるいは、FPP合成酵素のアミノ酸残基置換変異型酵素を宿主に導入し、上記物質の生物学的な大量生産系を開発したものである。
【００１３】
１．発現用組換えDNA又はゲノムインテグレート用DNA断片の作製
本発明において、宿主を形質転換するための発現用組換えDNAは、発現の目的となる遺伝子に、転写プロモーター及び転写ターミネーターDNAを連結又は挿入することにより得ることができる。発現の対象となる遺伝子としては、HMG-CoA還元酵素遺伝子（例えばHMG1)、大腸菌（Escherichia coli）FPP合成酵素遺伝子ispA、バチルス・ステアロサーモフイラス(Bacillus stearothermophilus)FPP合成酵素遺伝子、IPP-Δイソメラーゼ遺伝子idi(ORF182)等(以下、HMG-CoA還元酵素遺伝子等と略す)が挙げられる。なお、これらの遺伝子は、PCRや市販のキットを利用したクローニング手法により単離することが可能である。
【００１４】
また、HMG-CoA還元酵素遺伝子等に、予め転写プロモーター及び転写ターミネーターが連結された遺伝子発現カセットを作製しておいて、これをベクターに組み込むこともできる。連結及び挿入の順序は任意であるが、HMG-CoA還元酵素遺伝子等の上流に転写プロモーターを連結し、HMG-CoA還元酵素遺伝子等の下流に転写ターミネーターを連結する。本発明においては、適当なDNA、例えばベクターDNAに順次HMG-CoA還元酵素遺伝子等、転写プロモーター及び転写ターミネーターを組み込んでもよく、転写方向が考慮されていれば順不同で組み込んでもよい。
【００１５】
使用されるDNAは、宿主細胞に遺伝的に保持される可能性のあるものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、バクテリオファージ、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNA（YAC:yeast artificial chromosome）等が挙げられる。また、ゲノムインテグレーションによる導入のための発現用組換えDNA断片としては、複製機能は必ずしも必要ではなく、PCR法又は化学合成により作製されたものを使用することも可能である。
【００１６】
プラスミド DNAとしては、例えばpRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112又はpAUR123などのYCp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pYES2又はYEp13などのYEp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101又はpAUR135などのYIp型大腸菌-酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpACYC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW218又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）、φX174、M13mp18又はM13mp19等が挙げられる。レトロトランスポゾンとしては、Ty因子などが挙げられる。YAC用ベクターとしてはpYACC2などが挙げられる。
宿主への組換えDNAの導入には、選択マーカー遺伝子を用いる場合が多いが、アッセイ法がある場合は、必ずしもマーカー遺伝子は必要ではない。
【００１７】
転写プロモーターは、恒常発現型プロモーター又は誘導発現型プロモーターを用いることができる。恒常発現型プロモーターとは、主要代謝経路に関わる遺伝子の転写プロモーターを意味し、どの生育条件でも転写活性を有すると考えられているプロモーターである。誘導発現型プロモーターとは、特定の生育条件で転写活性があり、その他の生育条件では活性が抑えられるプロモーターを意味する。
【００１８】
転写プロモーターは、酵母等の宿主中で活性を持つものであればいずれを用いてもよい。例えば酵母での発現用として、GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、TDH3(GAP)プロモーター、ADH1プロモーター、PGK1プロモーター、TEF2プロモーター等を用いることができる。また、大腸菌での発現用として、trp、lac、trc、tacなどのプロモーターを用いることができる。
【００１９】
さらに、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカーなどを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、URA3、LEU2、TRP1、HIS3などの栄養非要求性の表現型を指標とするマーカー遺伝子や、Ampr、Tetr、Cmr、Kmr、AUR1-C等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００２０】
転写ターミネーターは、酵母等の宿主中で活性を持つものであればいずれの遺伝子に由来するターミネーターを用いてもよい。例えば酵母での発現用として、ADH1ターミネーター、CYC1ターミネーター等を用いることができる。また、大腸菌での発現用として、rrnBターミネーターが挙げられる。大腸菌をはじめとするバクテリアの遺伝子の開始コドン上流にSD配列 (5'-AGGAGG-3'で代表される) を翻訳のためのリボソーム結合部位として組み込むこともできる。
【００２１】
本発明において遺伝子導入用組換えDNAとして作製された発現ベクターは、特に記さない限り、プラスミド名の次に遺伝子名を表示することで命名及び識別することができる。例えば、TDH3(GAP)プロモーターを有するプラスミドpRS434GAPにHMG1遺伝子を連結した場合は「pRS434GAP-HMG1」のように表示する。特別の場合を除き、他のプラスミドやプロモーターを用いた場合も同じ要領で表示する。
【００２２】
さらに、本発明においては、HMG-CoA還元酵素遺伝子等は、その一部の領域（最大で2217塩基）が欠損した欠失型や、野生型遺伝子又はこれら欠失型遺伝子の塩基配列のうち1個又は数個〜十数個の塩基が欠失、置換又は付加した変異型遺伝子でもよい。アミノ酸配列においても、天然型HMG-CoA還元酵素のアミノ酸配列（配列番号２）のうち最大で739個のアミノ酸が欠失した欠失型や、アミノ酸が野性型酵素又はこれら欠失型酵素から1個又は数個（例えば1個〜10個、好ましくは１個〜３個）のアミノ酸に欠失、置換又は付加等の変異が生じてもよい。具体的には、野性型又は図2Bに例示するような欠失型遺伝子、又はそれらにコードされる酵素のアミノ酸配列において、たとえば図２Aに示される箇所の塩基又はアミノ酸の置換が、１〜10箇所の範囲で部位特異的に生じていてもよい。FPP合成酵素遺伝子においても、1個又は数個〜十数個の塩基が欠失、置換又は付加した変異型遺伝子でもよい。具体的には野生型FPP合成酵素遺伝子(配列番号77)の塩基を5個置換した各種変異型遺伝子(配列番号79、81又は83)を用いることが出来る。この変異型遺伝子は、野生型FPP合成酵素（配列番号78）の第79番目のアミノ酸残基TyrがAsp(配列番号80)、Glu(配列番号82)又は Met(配列番号84)に置換変異した変異型酵素をコードしている。
【００２３】
また、Taq DNAポリメラーゼ等の忠実性（fidelity）の低いDNAポリメラーゼを用いたPCR(polymerase chain reaction)で野性型DNAを増幅させたDNA断片に生じる塩基の置換変異を「PCRエラー」といい、例えば、野生型HMG-CoA還元酵素遺伝子（配列番号１）を鋳型に用いたときのPCRエラーによる塩基の置換変異に起因するコードされるポリペプチドの置換変異を有するHMG-CoA還元酵素遺伝子（「HMG1'」とする）も、本発明において使用することができる。野性型HMG-CoA還元酵素遺伝子（配列番号1）を鋳型にしたときの、PCRエラーによる塩基の置換の態様を図２Aに示す。HMG1'は配列番号３に示す塩基配列を有しており、これによってコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。図２Aにおいて、ヌクレオチドの変異は、置換前の塩基（1文字表記）、HMG-CoA還元酵素遺伝子の開始コドンの第1塩基を1としたときの塩基番号、置換後の塩基（1文字表記）の順で表示してある。アミノ酸の変異は、PCRエラー型HMG-CoA還元酵素のアミノ酸配列において、置換前のアミノ酸残基（１文字表記）、HMG-CoA還元酵素のアミノ酸番号、置換後のアミノ酸残基（１文字表記）の順で表示してある。さらに、上記PCRエラー型の塩基配列を部位特異的変異誘発法等により一部修正することもでき、このような修正型のHMG-CoA還元酵素遺伝子も、本発明において使用することができる。さらに、HMG-CoA還元酵素の膜貫通ドメインと予想されている領域を欠損させた欠失体をコードするHMG-CoA還元酵素遺伝子（PCRエラー型を含む）も、本発明において使用することができる。例えば、図２Bにおいて、PCRエラー型HMG-CoA還元酵素遺伝子HMG1'の欠失型遺伝子HMG1Δの例を示す。最上段は欠失のない遺伝子HMG1'である。細線（−）で表した部分は欠失した領域である。それぞれの欠失型遺伝子において、HMG1'遺伝子（配列番号３）のうちどの領域を欠失させたのかを表１に示す。HMG1'欠失型遺伝子は、欠失のパターンに従ってHMG1Δxxyで表す。xxは欠失のパターンを、yは作業番号（任意の数字）を表す。図２Bには、HMG1Δ02yの例として「Δ026」を表示した（他の欠失パターンのものも同様に表示した）。
【００２４】
【表１】
【００２５】
２．組換え体の作製
本発明の組換え体は、本発明の組換えDNAを、HMG-CoA還元酵素遺伝子等（各種変異型を含む。特に記さない限り、以下同じ。）が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、プレニルアルコールを生産することができるものであれば特に限定されるものではないが、大腸菌又は酵母が好ましい。
本発明において、プロモーター、HMG-CoA還元酵素遺伝子等及びターミネーターを含む組換えDNAは、酵母などの単細胞真核微生物を含む真菌、大腸菌などの原核生物、動物細胞、植物細胞などに導入して組換え体を得ることができる。
【００２６】
真菌としては、変形菌類（Myxomycota）、藻菌類（Phycomycetes）、子嚢菌類（Ascomycota）、担子菌類（Basidiomycota）、不完全菌類（Fungi Imperfecti）が挙げられる。真菌としては、単細胞生物のものが工業上利用上重要な酵母としてよく知られており、子嚢菌類の子嚢菌酵母、担子菌類の担子菌酵母又は不完全菌類の不完全菌酵母が挙げられる。酵母としては、子嚢菌酵母、特に出芽酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae：パン酵母として知られる)、キャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)又はピキア・パストリス(Pichia pastris)等、分裂酵母であるシゾサッカロマイセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)等が用いられる。酵母の株は、プレニルアルコールを生産することができる限り特に限定されるものではない。S. cerevisiaeの場合、例えば下記の株：A451、EUG8、EUG12、EUG27、YPH499、YPH500、W303-1A、W303-1B、AURGG101などが挙げられる。酵母への組換えDNAの導入方法は、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を採用することができる。
【００２７】
A451 (ATCC200589, MAT α can1 leu2 trp1 ura3 aro7) YPH499（ATCC76625, MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ63 his3-Δ 200 leu2-Δ 1, Stratagene , La Jolla, CA）
YPH500（ATCC76626, MAT α ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ63 his3-Δ 200 leu2-Δ 1, Stratagene）
W303-1A（MATa leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100）
W303-1B（MAT α leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100）
AURGG101（A451, aur1::AUR1-C）
EUG8 (A451, ERG9p::URA3-GAL1p)
EUG12 (YPH499, ERG9p::URA3-GAL1p)
EUG27 (YPH500, ERG9p::URA3-GAL1p)
【００２８】
原核生物としては、アーキア（archaea）とバクテリア（bacteria, 細菌）が挙げられる。アーキアとしては、メタノバクテリウム属(Metanobacterium)などのメタン生産菌、ハロバクテリウム属（Halobacterium）などの好塩菌、スルフォロバス属（Sulfolobus）等の好熱好酸性菌が挙げられる。バクテリアとしては、工業的又は学術的に利用価値の高い各種グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌、例えば大腸菌(Escherichia coli)等のエシェリシア属、枯草菌（Bacillus subutilis）やバシラス・ブレビス(Bacillus brevis)等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)やアグロバクテリウム・リゾジェネス（Agrobacterium rhizogenes）等のアグロバクテリウム属、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）等のコリネバクテリウム属、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）等のラクトバシラス属、アクチノマイセス属（Actinomyces）やストレプトマイセス（Streptmyces）等の放線菌類(Actinomycetes)が挙げられる。
【００２９】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えDNAが細胞中で自律複製可能であると同時に、転写プロモーター、リボゾームRNA結合領域としてのSD配列、本発明の遺伝子により構成されていることが好ましい。転写ターミネーターなどを適宜挿入することもできる。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、BL21、DH5α、HB101、JM101、MBV1184、TH2、XL1-Blue、Y-1088等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。転写プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、その他市販のキットを使用する方法等により行われる。
【００３０】
遺伝子が宿主細胞に導入されたか否かの確認は、PCR法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、組換え体からDNAを調製し、導入DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色するか、あるいはUV検出器でDNAを検出し、増幅産物を1本のバンド又はピークとして検出することにより、導入DNAを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。
【００３１】
３．プレニルアルコールの生産
本発明において、プレニルアルコールは、導入されたHMG-CoA還元酵素遺伝子等を含む上記組換え体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体自体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の組換え体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。プレニルアルコールとしては、炭素数１５のもの、例えばファルネソール（FOH）、ネロリドール（NOH）が挙げられる。上記プレニルアルコールは、それぞれ単独で又は混合物として上記培養物中に蓄積される。
【００３２】
微生物を宿主として得られた組換え体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、組換え体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられ、その他ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、26℃〜36℃、好ましくはS. cerevisiaeを宿主とした場合30℃で2〜7日、E. coliを宿主とした場合37℃で12〜18時間行う。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養は、必要に応じてアンピシリン、クロラムフェニコール又はオーレオバシジンA等の抗生物質を培地に添加して行ってもよい。
【００３３】
プロモーターとして誘導型転写プロモーターを用いた発現ベクターを導入した組換え体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えばGAL1プロモーターを用いた場合、炭素源としてガラクトースを使用することができる。また、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導可能な転写プロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物（例えば大腸菌）を培養するときには、IPTGを培地に添加することもできる。
【００３４】
上記培養条件で培養すると、宿主により高収率でプレニルアルコールを生産することができる。特に、宿主がAURGG101、ベクターがpYHMG044の場合には、培地１リットルあたり32mg以上、培養条件によっては150mg以上産生することが可能である。
本発明においては、上記培地に、さらにテルペノイド、油脂、界面活性剤等を添加してプレニルアルコールの生産効率を高めることができる。これらの添加剤として以下のものを例示することができる。
【００３５】
テルペノイド：スクアレン、トコフェロール、IPP、DMAPP
油脂：大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトンX-305、スパン85、アデカノールLG109(旭電化製)、アデカノールLG294(旭電化製)、アデカノールLG295S(旭電化製)、アデカノールLG297(旭電化製)、アデカノールB-3009A(旭電化製)、アデカプロニックL-61(旭電化製)
油脂濃度は0.01％以上、好ましくは1〜3％であり、界面活性剤濃度は0.005％〜1％、好ましくは0.05〜0.5％であり、テルペノイド濃度は0.01％以上、好ましくは1〜3％である。
【００３６】
培養後、プレニルアルコールが菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより目的のプレニルアルコールを採取する。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよい。あるいは、本発明のプレニルアルコールが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により前記培養物中からプレニルアルコールを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することができる。
本発明において、宿主株と、導入した組換えDNAとしてのベクターとの好ましい組み合わせ及びプレニルアルコール生産の関係を例示すると表２の通りである。
【００３７】
【表２】
【００３８】
表２より、例えば以下の生産量を示すことができる。
(1) 恒常発現型転写プロモーター下流にHMG1又はその変異型遺伝子(例えばHMG1')若しくはその欠失型遺伝子HMGxxyを結合したDNAをS.cerevisiae細胞に導入した場合、FOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-18.3mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-0.3mg/l生産した。
【００３９】
(2) 誘導発現型転写プロモーター下流にHMG1又はその変異型遺伝子(例えばHMG1')若しくはその欠失型遺伝子HMGxxyを結合したDNAをS.cerevisiae細胞に導入した場合、FOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-158mg/l、さらに好ましくは53-158mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-23mg/l、さらに好ましくは2.4-23mg/l生産した。
【００４０】
(3) 恒常発現型転写プロモーター下流にHMG1、誘導発現型転写プロモーター下流にHMG1'の欠失型遺伝子HMG04yを結合した2種のDNAをS.cerevisiae細胞に導入した場合、FOHを少なくとも22mg/l、好ましくは22-66mg/l生産し、NOHを少なくとも12mg/l、好ましくは12-28mg/l生産した。
【００４１】
(4) HMG1又はその変異型遺伝子(例えばHMG1')若しくはその欠失型遺伝子HMGxxyを含むDNAをS.cerevisiae A451又はA451由来株の細胞に導入した場合、FOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-158mg/l、さらに好ましくは53-158mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-23mg/l、さらに好ましくは2.4-23mg/l生産した。
【００４２】
(5) HMG1又はその変異型遺伝子(例えばHMG1')若しくはその欠失型遺伝子HMGxxyを含むDNAをS.cerevisiae YPH499又はYPH499由来株の細胞に導入した場合、FOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-18.3mg/l、さらに好ましくは5.9-18.3mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.13-0.30mg/l生産した。
【００４３】
(6) HMG1又はその変異型遺伝子(例えばHMG1')若しくはその欠失型遺伝子HMGxxyを含むDNAをS.cerevisiae YPH500又はYPH500由来株の細胞に導入した場合、FOHを少なくとも3.2mg/l、好ましくは3.2-13.6mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-0.22mg/l生産した。
【００４４】
(7) HMG1又はその変異型遺伝子(例えばHMG1')を含むDNAをS.cerevisiae細胞に導入した場合、FOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-18.3mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-2.7mg/l生産した。
【００４５】
(8) HMG1'の欠失型遺伝子HMGxxyを含むDNAをS.cerevisiae細胞に導入した場合、FOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-158mg/l、さらに好ましくは53-158mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-23mg/l、さらに好ましくは2.4-23mg/l生産した。
【００４６】
(9) 大腸菌のFPP合成酵素遺伝子ispAの置換変異型遺伝子を含むプラスミドを大腸菌に導入し、IPPとDMAPPを含む培養液で培養し、フォスファターゼ処理した場合、FOHを少なくとも11mg/l、好ましくは11-90mg/l、さらに好ましくは64-90mg/l生産した。
【００４７】
(10) ispAとidiを大腸菌に入れると、IPPやDMAPPの添加なしでもフォスファターゼ処理によりFOHを少なくとも0.15mg/l、好ましくは0.15-0.16mg/l生産した。
【００４８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００４９】
〔実施例1〕 発現ベクターの構築
Stratagene (La Jolla, CA)より購入したE. coli SURE2スーパーコンピテント細胞を宿主としてベクターの構築を行った。S. cerevisiaeゲノム調製用、ベクター導入テスト用にはYPH499 (Stratagene) を用いた。
【００５０】
(1) E. coli-S. cerevisiaeシャトルベクター
Stratagene社よりプラスミドpRS404及びpRS414（図３）を購入した。宝酒造よりpAUR123を購入し、Invitrogen社 (Carlsbad, CA) からpYES2（図４）を購入した。
【００５１】
(2) ゲノムDNA
宝酒造から酵母ゲノムDNA調製用キット「Genとるくん」を購入し、添付のプロトコルに従ってS. cerevisiae YPH499 からゲノムDNAを調製した。
【００５２】
(3) pRS414へADH1p-ADH1t断片の挿入
pRS414（図３）をNaeIとPvuIIで切断し、f1 oriとLacZ部分を含まない4.1 kbp断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。また、pAUR123をBamHIで切断し、Klenow酵素で平滑末端にした後、アガロースゲル電気泳動でADH1転写プロモーター（ADH1p）及びADH1転写ターミネーター（ADH1t）を含む1.0 kbpの断片 (図５、配列番号17) を精製した。pRS414の 4.1kbp断片には、大腸菌と酵母の複製開始点、大腸菌用形質転換マーカーAmprと酵母用栄養要求性マーカーTRP1が残っており、pAUR123 1.0 kbp断片はADH1p 、ADH1tおよびそれらに挟まれたクローニングサイトを含んでいる。この二つの断片を宝酒造DNAライゲーションキットにより連結したのちSURE2へ形質転換した。
得られた組換え体からプラスミドDNAを調製し、SalIとScaIによるマッピングでチェックしたところ、二通りの向きでpRS414へ挿入されたプラスミドpRS414PTadh及びpRS414TPadhが得られた（図６）。
【００５３】
(4) pRSベクターへCYC1t断片の挿入
CYC1転写ターミネーターCYC1t断片はPCRで調製した。以下のPCR用オリゴDNA：XhoI-Tcyc1FW とApaI-Tcyc1RVとの組合せをPCR用プライマーDNAに用い、鋳型としてpYES2を用いた。
XhoI-Tcyc1FW：5'- TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG -3'（配列番号18）
ApaI-Tcyc1RV：5'- CAT TAG GGC CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG -3'（配列番号19）
反応は、0.1 μg pYES2, 50 pmol プライマー DNA, MgSO4 含有1x pfu バッファー(Promega, Madison, WI), 10 nmol dNTP, 1.5 u Pfu DNA ポリメラーゼ (Promega)及び 1 μl perfect match ポリメラーゼエンハンサー (Stratagene)を含む50 μlの反応液を調製し、95℃ 2分、(95℃ 45秒、60℃ 30秒、72℃ 1分)×30サイクル、72℃ 5分、4℃ストックの反応条件で行った。増幅したDNAをXhoIとApaIで切断し、アガロースゲル電気泳動で260 bpのDNA断片を精製しCYC1t-XAとした。
pRS404、pRS406のXhoI-ApaI部位にCYC1t-XAを挿入し、それぞれ、pRS404Tcyc、pRS406Tcycとした。
【００５４】
(5) 転写プロモーターの調製
pAUR123又は酵母ゲノムDNAを鋳型にしてPCRにより転写プロモーターを含むDNA断片を調製した。使用したDNAプライマーは以下の通りである。
SacI-Padh1FW：5'-GAT CGA GCT CCT CCC TAA CAT GTA GGT GGC GG-3'（配列番号20）
SacII-Padh1RV：5'-CCC GCC GCG GAG TTG ATT GTA TGC TTG GTA TAG C-3'（配列番号21）
SacI-Ptdh3FW：5'-CAC GGA GCT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA-3'（配列番号22）
SacII-Ptdh3RV：5'-CTC TCC GCG GTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC -3'（配列番号23）
SacI-Ppgk1FW:5'-TAG GGA GCT CCA AGA ATT ACT CGT GAG TAA GG-3'（配列番号24）
SacII-Ppgk1RV:5'-ATA ACC GCG GTG TTT TAT ATT TGT TGT AAA AAG TAG-3'（配列番号25）
SacI-Ptef2FW:5'-CCG CGA GCT CTT ACC CAT AAG GTT GTT TGT GAC G-3'（配列番号26）
SacII-Ptef2RV:5'-CTT TCC GCG GGT TTA GTT AAT TAT AGT TCG TTG ACC-3'（配列番号27）
ADH1転写プロモーターADH1p増幅用にはSacI-Padh1FW及びSacII-Padh1RVをPCR用DNAプライマーに用い、鋳型にpAUR123を用いた。TDH3（GAP）転写プロモーターTDH3p（GAPp）増幅用にはSacI-Ptdh3FW及びSacII-Ptdh3RVをPCR用DNAプライマーに用い、PGK1転写プロモーターPGK1p増幅用にはSacI-Ppgk1FW及びSacII-Ppgk1RVをPCR用DNAプライマーに用い、TEF2転写プロモーターTEF2p増幅用にはSacI-Ptef2FW及びSacII-Ptef2RVをPCR用DNAプライマーに用い、鋳型にはそれぞれ酵母ゲノムDNAを用いた。反応溶液は、0.1 μg pAUR123又は0.46 μg 酵母ゲノムDNA, 100 pmol プライマー DNA, 1x ExTaq バッファー(宝酒造), 20 nmol dNTP, 0.5 u ExTaq DNAポリメラーゼ(宝酒造)及び1 μl perfect match ポリメラーゼエンハンサーを含む100 μl溶液を調製し、95℃ 2分、(95℃ 45秒、60℃ 1分、72℃ 2分)×30サイクル、72℃ 4分、4℃ストックの反応条件で行った。増幅した4種のDNAをSacIとSacIIで切断し、アガロースゲル電気泳動でそれぞれ620 bp、680 bp、710 bp、400 bpのDNA断片を精製し、ADH1p、TDH3p、PGK1p、TEF2pとした。
【００５５】
(6) 2μ DNA複製開始領域の調製
YEpベクターであるpYES2をSspIとNheIで切断後、2μ DNA複製開始点（2μori）を含む1.5 kbp断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、Klenow酵素で平滑末端化し、このDNA断片を2μOriSNとした。
【００５６】
(7)YEp型発現ベクターの作製
pRS404Tcyc、pRS406TcycをBAP（bacterial alkaline phosphatase, 宝酒造）処理したNaeI部位に2μOriSNを挿入し、E. coli SURE2に形質転換した後プラスミドDNAを調製した。これを、DraIII及びEcoRI、HpaI、又は、PstI及びPvuIIにより切断後、アガロースゲル電気泳動し、2μ oriの挿入とその向きをチェックした。作製したpRS404Tcyc、pRS406TcycにpYES2と同じ向きで2μoriが挿入されたプラスミドをそれぞれpRS434Tcyc2μOri、pRS436Tcyc2μOriとし、pRS404TcycにpYES2と反対向きで2μoriが挿入されたプラスミドをそれぞれpRS444Tcyc2μOri、pRS446Tcyc2μOriとした。
【００５７】
pRS434Tcyc2μOri、pRS436Tcyc2μOri、pRS444Tcyc2μOri及びpRS446Tcyc2μOriの4種のプラスミドのSacI-SacII部位に、転写プロモーターを含む断片ADH1p、TDH3p(GAPp)、PGK1p又はTEF2pを挿入しDNAをクローン化した。その結果、(i) pRS434Tcyc2μOriからpRS434ADH、pRS434GAP、pRS434PGK及びpRS434TEFが、 (ii) pRS436Tcyc2μOriからpRS436ADH、pRS436GAP、pRS436PGK及びpRS436TEFが、(iii) pRS444Tcyc2μOri からpRS444ADH、pRS444GAP、pRS444PGK及びpRS444TEFが、 (iv) pRS446Tcyc2μOriからpRS446ADH、pRS446GAP、pRS446PGK及びpRS446TEFが、それぞれ得られた（図７Ａ〜７Ｈ）。
本発明で作製した発現ベクターを整理すると表３の様になる。
【００５８】
【表３】
【００５９】
(8) YEp型発現ベクターの酵母への導入
作製したYEp型発現ベクターのDNA複製領域が機能するかを調べるため、各YEp型発現ベクター約40 ngをFrozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research, Orange, CA) を用いた方法でYPH499へ導入し（手順はキット同封の説明書に従った）、SD-W (DOB+CSM(-Trp), BIO101, Vista, CA) 寒天プレート上で30℃で生育してくるコロニーを調べた。結果を表４に示す。
【００６０】
【表４】
【００６１】
表４の結果より、本発明で作製した各YEp型ベクターは、ベクターとして正常に機能することがわかった。
【００６２】
〔実施例２〕遺伝子のクローニング
(1) PCRによるHMG-CoA還元酵素遺伝子（HMG1'遺伝子）のクローニング
S. cerevisiae HMG1'遺伝子クローニングは、以下のように行った。
GenBankにあるS. cerevisiae由来HMG1遺伝子(アクセッションナンバーM22002)(M. E. Basson, et al., Mol. Cell. Biol. 8, 3797-3808 (1988):配列番号１)の情報をもとに、コードしているタンパク質のN末端、C末端に該当する塩基配列部分のプライマーを作製し、これを用いて酵母のcDNAライブラリー（Clontech製No.CL7220-1, S. cerevisiae DBY746由来）を鋳型としたPCRを行った。
【００６３】
N末端側プライマー（プライマー１）：5'-ATG CCG CCG CTA TTC AAG GGA CT-3' (配列番号28)
C末端側プライマー（プライマー２）：5'-TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC GG-3' (配列番号29)
PCRは、以下の反応液中、94℃ 45秒の変性、55℃ 1分のアニーリング及び72℃ 2分の伸長を１サイクルとしてこれを30サイクル行った。
【００６４】
【００６５】
PCR後、アガロースゲル電気泳動により、目的の位置（3.2kbp）に断片が確認されたので、その3.2kbpDNA断片をTAクローニング可能なpT7Blue Tベクター(Novagen, Madison, WI)にクローニングし、これをpT7HMG1とした。クローニングしたHMG-CoA還元酵素遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、配列番号３の塩基配列及び配列番号４のアミノ酸配列を確認した。決定された塩基配列は、GenBankの配列に示した塩基配列と一部異なる変異型遺伝子となっていた（図２A）。このPCRエラーを含んだ変異型HMG-CoA還元酵素のアミノ酸配列（配列番号４）をコードする遺伝子をHMG1'とする。
【００６６】
(2) HMG1'のPCRエラーの修正
変異型HMG-CoA還元酵素をコードするHMG1'を有するpT7HMG1からHMG1'断片をサブクローニングし、HMG-CoA還元酵素コード領域のPCRエラーによるアミノ酸置換変異部分を、部位特異的変異(site-directed mutagenesis)法により修正し、pALHMG106を作製した。作製方法の詳細は以下の通りである。
プラスミドpT7HMG1をクローン化HMG1'として用いた。また、部位特異的変異導入用ベクターとしてpALTER-1を使用した(Promega)。
【００６７】
部位特異的変異は、Promega発行の"Protocols and application guide, third edition, 1996 Promega, ISBN 1-882274-57-1"に記載の方法で行った。変異導入用オリゴは、次の３種類を化学合成した。
HMG1(190-216) 5'-CCAAATAAAGACTCCAACACTCTATTT-3'（配列番号30）
HMG1(1807-1833) 5'-GAATTAGAAGCATTATTAAGTAGTGGA-3'（配列番号31）
HMG1(2713-2739) 5'-GGATTTAACGCACATGCAGCTAATTTA-3'（配列番号32）
【００６８】
まず、pT7HMG1をSmaI、ApaLI、SalIで切断し、3.2kbpのHMG1断片をアガロースゲル電気泳動で調製した。これをpALTER-1のSmaI-SalI部位に挿入し、pALHMG1を作製した。pALHMG1をアルカリ変性後、上記変異導入オリゴ、リペアオリゴとしてAmp repair oligo(Promega)、ノックアウトオリゴとしてTet knockout oligo(Promega)をアニーリングさせ、E. coli ES1301(Promega)に導入後、125μg/mlアンピシリンで部位特異的変異が導入されたプラスミドを保持する形質転換体を集積培養し、プラスミドDNAを調製した。以下の配列を有するプライマーを用いて塩基配列をチェックしたところ、HMG1(190-216)、 HMG1(1807-1833)、 HMG1(2713-2739)に相当する配列は全てこれらオリゴヌクレオチドの配列に修正されていた（配列番号５）。なお、修正された配列によりコードされるアミノ酸配列（配列番号６）は、野生型HMG1によりコードされるアミノ酸配列（配列番号２）と一致しており、サイレント変異のみ残った遺伝子である。このPCRエラー修正したHMG1は、塩基配列は一部異なるが、野生型酵素と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするので遺伝子名をHMG1とし、以下、本明細書中では野生型遺伝子HMG1と区別せずに使用する。
HMG1(558-532) 5'-GTCTGCTTGGGTTACATTTTCTGAAAA-3'（配列番号33）
HMG1(1573-1599) 5'-CATACCAGTTATACTGCAGACCAATTG-3'（配列番号34）
HMG1(2458-2484) 5'-GAATACTCATTAAAGCAAATGGTAGAA-3'（配列番号35）
このHMG1内の配列が修正されたプラスミドをpALHMG106とした（図８）。
【００６９】
(3)ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子BTS1のクローニング
S. cerevisiae BTS1遺伝子（GGPP合成酵素遺伝子ともいう）のクローニングは、以下のように行った。
GenBankにあるS. cerevisiae由来GGPP合成酵素遺伝子 (アクセッションナンバーU31632)(Y. Jiang, et al., J. Biol. Chem. 270 (37), 21793-21799 (1995))の情報をもとにN末端、C末端にマッチするプライマーを作製し、これを用いて酵母のcDNAライブラリー（CL7220-1）を鋳型としたPCRを行った。
【００７０】
N末端側プライマー：5'-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG CT-3' (配列番号36)
C末端側プライマー：5'-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC TA-3' (配列番号37)
PCRは、 (1)に記載の反応液組成と同様のPCR反応液で、94℃ 45秒の変性、55℃ 1分のアニーリング及び72℃ 2分の伸長を１サイクルとしてこれを30サイクル行った。
【００７１】
PCR後、アガロースゲル電気泳動により目的の位置（約1.0kbp）に断片が確認されたので、BTS1遺伝子をTAクローニング可能なpT7Blue Tベクターにクローニングし、BTS1遺伝子の全領域の塩基配列を決定した。その結果、GenBankの配列と完全に一致し、S. cerevisiae由来の遺伝子であることを確認した。
pT7Blue TベクターをBamHI、SalI処理してBTS1遺伝子を取り出し、これを、pYES2(Invitrogen社)のBamHI、XhoIサイトに導入した。得られた組換えベクターをpYESGGPSとした。
【００７２】
(4) Escherichia coli由来のFPP合成酵素遺伝子ispAのクローニング
E. coliゲノムDNAは、E. coli JM109 (Takara) から次の方法で調製した。JM109を 1.5 ml 2xYT培地で培養後、遠心により集菌し、567 μlのTE (pH 8.0)、 3μlの20 mg/ml proteinase-K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) 及び30μlの10% SDSを加え、37℃で1時間保温後、100 μlの5M NaClを加え混合した。これに、80 μlのCTAB/NaCl溶液 (10% CTAB, 0.7 M NaCl) を加え、65℃で10分加熱した。これを700 μlのクロロホルム /イソアミルアルコール (24:1) で抽出し、水層画分をさらに600 μlのフェノール/クロロホルム /イソアミルアルコール (25:24:1) で抽出した。抽出後の水層画分に0.6 容量のイソプロパノールを加えて遠心した。沈殿画分を70% エタノールで洗い、乾燥後100 μlのTE (pH 8.0)に溶解し大腸菌ゲノムDNA溶液とした。DNAをOD260で測定、定量後、DNA濃度が1 μg/μlになるようにTEで調製した。
【００７３】
E. coliゲノムDNAを鋳型にし、以下の合成オリゴDNAをプライマーに用いてPCRによりE. coli由来のFPP合成酵素遺伝子ispAのクローニングを行った。
ISPA1:5'-TGA GGC ATG CAA TTT CCG CAG CAA CTC G-3'( 配列番号 68)
ISPA2:5'-TC AGA ATT CAT CAG GGG CCT ATT AAT AC-3'( 配列番号 69)
1x ExTaq バッファー、0.5 mM dNTP、100 pmol ISPA1、100 pmol ISPA2、0.2 μg E. coli ゲノムDNA、5 u ExTaqを含んだ100 μlの反応溶液で、94℃ 1 分、55℃ 1 分、72℃ 1.5分を30サイクル繰り返すことでPCRを行った。PCR産物はEcoRIとSphIで切断後、アガロースゲル電気泳動で 1.0 kbpのDNA断片を精製し、pALTER-Ex2 (Promega) のEcoRI-SphI部位に挿入し、E. coli JM109へ導入し遺伝子クローニングを行った。EcoRI、SphI、NdeI、SmaI、BamHIを用いた制限酵素マッピングにより正しくispA遺伝子（配列番号77）が導入されたプラスミドpALispA4、pALispA16 、pALispA18が得られた。
【００７４】
(5) 変異型FPP合成酵素遺伝子の作製
pALispA16を用いて、Promega発行の "Protocols and applications guide, third edition, 1996 Promega, ISBN 1-882274-57-1"に 記載のプロトコルに従って、E. coli ispAにコードされるポリペプチドの79番目のアミノ酸残基Tyrをコードしているコドンを置換変異により改変した。以下の変異導入用オリゴヌクレオチド（変異オリゴともいう）は、化学合成法により調製した。
【００７５】
ISPA-D: 5'-ATC ATG AAT TAA TGA GTC AGC GTG GAT GCA TTC AAC GGC GGC AGC-3'（配列番号70）
ISPA-E: 5'-ATC ATG AAT TAA TGA TTC AGC GTG GAT GCA TTC AAC GGC GGC AGC-3'（配列番号71）
ISPA-M: 5'-ATC ATG AAT TAA TGA CAT AGC GTG GAT GCA TTC AAC GGC GGC AGC -3'（配列番号72）
【００７６】
上記変異オリゴISPA-Mは、第16番目〜第18番目の塩基（3塩基を下線で示した部分）が野性型では79番目のTyrをコードしているコドンであるため、Metをコードするように設計したものである。同様にして、変異オリゴISPA-D、変異オリゴISPA-Eは、それぞれAsp、Gluをコードするように設計したものである。上記変異オリゴにおいて、第26番目〜第31番目の塩基（６塩基を下線で示した部分）は、置換変異導入より新たにEcoT22I (NsiI) 部位ができるように設計し、変異遺伝子が制限酵素マッピングにより容易に区別できるように計画した配列である。変異オリゴは、あらかじめ、T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (Promega)により5'末端をリン酸化し、Nick Culumn (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) を用いてゲル濾過精製してある。変異導入の際にはリペアオリゴとしてCm repair oligo (Promega)を、ノックアウトオリゴとしてTet knockout oligo (Promega)を用いた。アルカリ変性させたpALispA16にCm repair oligo、Tet knockout oligo、変異オリゴをアニールさせE. coli ES1301 mutS (Promega)へ形質転換した。20 μg/ml のCm (クロラムフェニコール) 共存下で生育してきた大腸菌からプラスミドDNAを調製し、E. coli JM109へ形質転換し、20 μg/ml Cm寒天プレート上で生育してきたコロニーからプラスミドDNAを調製した。pALispA4を鋳型にし、ISPA-D、ISPA-E、ISPA-Mを変異オリゴに用いて作製した置換変異型ispA(これをispAmという)を含むプラスミドを、それぞれp4D、p4E、p4Mとした。同様に、pALispA16を鋳型にして作製したプラスミドをそれぞれp16D、p16E、p16Mとし、pALispA18を鋳型にして作製したプラスミドをそれぞれp18D、p18E、p18Mとした。
【００７７】
(6)IPPΔ-イソメラーゼ遺伝子idiのクローニング
大腸菌IPPΔ-イソメラーゼ遺伝子は、以前の命名ではORF182（NCBI BLASTサーチによる；GenBankアクセッション番号AE000372）としていたが、Hahn et al. (1999) J. Bacteriol., 181, 4499-4504によりidiと名付けられている。idi（配列番号85；配列番号86に示すアミノ酸配列をコードする）をクローニングしたプラスミドとしては、Hemmi et al. (1998) J. Biochem., 123, 1088-1096 記載のp3-47-11とp3-47-13を用いた。
【００７８】
(7) Bacillus stearothermophilus FPP合成酵素遺伝子のクローニング
特開平5-219961記載のpFE15をNotIとSmaIで切断後、2.9kbpの転写単位を含んだBacillus stearothermophilus FPP合成酵素遺伝子(以下fpsとする)（配列番号75；配列番号76に示すアミノ酸配列をコードする）断片を精製し、pACYC177 (日本ジーン)のScaI部位に挿入し、これをpFE15NS2.9-1とした。
【００７９】
〔実施例3〕 遺伝子の発現ベクターへの挿入
(1) pRS発現ベクターへのサブクローニング
今回作製した恒常発現型転写プロモーターをもつE. coli- S. cerevisiae YEp型シャトルベクターである各pRSベクター（図６、図７）を用いて、HMG1遺伝子を発現ベクターに導入した。
【００８０】
PCRエラーを修正したHMG-CoA還元酵素遺伝子を含むpALHMG106 （図８）をSmaIとSalIで切断後、アガロースゲル電気泳動で3.2 kbpのHMG1遺伝子断片を精製した。これをpRS434GAP、pRS444GAP、pRS434TEF、pRS444TEF、pRS434PGK及びpRS444PGKのSmaI-SalI部位へ挿入した。サブクローン化したプラスミドは、XhoI、SpeI、NaeI及びSphIの各制限酵素マッピングと、挿入された3.2 kbp HMG1遺伝子断片のボーダー領域の塩基配列確認により物理地図をチェックし、計画通りに作製できたプラスミドを選抜した。選抜したプラスミドは、それぞれ、pRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1、pRS434TEF-HMG1、pRS444TEF-HMG1、pRS434PGK-HMG1、pRS444PGK-HMG1とした。
【００８１】
(2) pRS414PTadh-HMG1又はpRS414TPadh-HMG1の作製
恒常発現型転写プロモーターADH1pを含むベクターpRS414PTadh、pRS414TPadh（図６）を制限酵素SmaIとSalIで処理し、(1)と同様の操作を行い、HMG1遺伝子が挿入されたプラスミドpRS414PTadh-HMG1及びpRS414TPadh-HMG1を作製した。
【００８２】
(3) HMG1'発現用プラスミドpYES-HMG1の作製
実施例２(1) で作製したpT7HMG1をBamHI、SalI、ScaI処理してPCRエラーによる変異型HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子HMG1'を取り出し、これをpYES2(Invitrogen, Carlsbad, CA)のBamHI-XhoI部位に導入した。得られた組換えベクターをpYES-HMG1とした。ベクター内の塩基配列決定を行ったところ、配列番号３に示す塩基配列であることを確認した。なお、pYES2は、複製起点として酵母２μmDNAのori、及びガラクトースで誘導可能なGAL1転写プロモーターをもつ酵母発現用シャトルベクターである（図4）。
【００８３】
(4) 欠失型HMG1'発現用プラスミドpYHMGxxyの作製
HMG-CoA還元酵素触媒部位と考えられている部分より上流の領域をコードする塩基配列を欠損させた欠失型HMG-CoA還元酵素遺伝子発現ベクターを作製するため、(3)で作製したpYES-HMG1を鋳型として、PCR法でベクター部分とともにHMG1'コード領域の一部分を欠失させた断片を調製した。得られた断片をKlenow酵素で平滑末端にした後、セルフライゲーションにより再び環化し、E. coli JM109へ形質転換させ、プラスミドDNAを調製した。プライマーとして使用した合成DNA配列とその組合せを表１に示した。
【００８４】
得られたプラスミドDNA内のHMG1上流、下流のアミノ酸の読み枠がずれていないことと、その結合部位近辺にPCRエラーによるアミノ酸置換が起きていないことを373A DNA sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA) で確認した。その結果、結合部位近辺にPCRエラーによるアミノ酸置換がなく、読み枠がずれずに遺伝子を欠失する事のできた以下のプラスミドを得た。欠失型HMG1遺伝子は、欠失のパターンに従ってΔ02y（yは任意の作業番号を表す）のように記載し、Δ02yを含むpYES2ベクターを例えばpYHMG026と記すこととする（他の欠失体も同様）。
【００８５】
HMG1Δ02y：配列番号7
HMG1Δ04y：配列番号8
HMG1Δ05y：配列番号9
HMG1Δ06y：配列番号10
HMG1Δ07y：配列番号11
HMG1Δ08y：配列番号12
HMG1Δ10y：配列番号13
HMG1Δ11y：配列番号14
HMG1Δ12y：配列番号15
HMG1Δ13y：配列番号16
ベクター：pYHMG026, pYHMG027, pYHMG044, pYHMG045, pYHMG062, pYHMG063, pYHMG065, pYHMG076, pYHMG081, pYHMG083, pYHMG085, pYHMG094, pYHMG100, pYHMG106, pYHMG107, pYHMG108, pYHMG109, pYHMG112, pYHMG122, pYHMG123, pYHMG125, pYHMG133
【００８６】
〔実施例4〕 AURGG101の作製
実施例2(3)に記載のpYESGGPSを鋳型にして、プライマーPYES2(1-27)とPYES2(861-835)を用いてPCR法により、GAL1転写プロモーター＝BTS1＝CYC1転写ターミネーターの一次構造(GAL1p-BTS1-CYC1t)を持つ1.9kbpのSalI断片を調製した。
【００８７】
PYES2(1-27):5'-GGC CGC AAA TTA AAG CCT TCG AGC GTC-3'（配列番号73）
PYES2(861-835): 5'-ACG GAT TAG AAG CCG CCG AGC GGG TGA-3'（配列番号74）
この断片をpAUR101(Takara)のSalI部位へ挿入し、pAURGG115を得た。pAURGG115内のBTS1遺伝子にPCRエラーがないことはDNAシークエンシングにより確認した。
【００８８】
pAURGG115をEcoO65Iで線状化し、酢酸リチウム法でA451株へ導入し、1μg/mlオーレオバシジンを含むYPD寒天プレート (1%酵母エキス, 2% ペプトン, 2% デキストロース, 2% 寒天) 上で30℃で生育してくるコロニーを形質転換体とした。
得られた形質転換体は、もう一度オーレオバシジン選択プレート上でシングルコロニー選抜した。
その結果、A451を宿主とした組換え体としてAURGG101及びAURGG102の2クローンが得られ、本発明ではAURGG101をA451由来宿主株の１つとして用いた。
【００８９】
なお、サザンブロットハイブリダイゼーション（図９）とPCRマッピング（図10）で明らかになったように、AURGG102はBTS1がゲノムにインテグレートしているが、AURGG101はインテグレートしておらず、AUR1がマーカー遺伝子のAUR1-Cに単に置き換わったものであることが分かっている。AUR1はプレニルアルコール又はプレニル二リン酸合成と直接関与していないので、AURGG101はA451由来宿主株の例として使用できる。
サザンブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、PCRマッピングは、後述の実施例6に方法を記載してある。
【００９０】
〔実施例5〕 各EUG株の作製
酵母ゲノムデータベースから、スクアレン合成酵素遺伝子ERG9付近の遺伝子地図を引き出し、ERG9転写プロモーター (ERG9p) 置換用DNA断片増幅のためのPCRプライマーDNAを設計した。形質転換体選択マーカー遺伝子URA3と転写プロモーターGAL1pを含む1.8 kbp DNA断片は、pYES2をNaeIとNheI切断後Klenow酵素で平滑末端化し、セルフライゲーションにより2μ ori部分を削除したpYES2Δを鋳型にしてPCR増幅により調製した。
【００９１】
PCRで使用したプライマーは以下の通りである。
E-MCSf：5'- GCC GTT GAC AGA GGG TCC GAG CTC GGT ACC AAG-3'（配列番号49）
E-URA3r：5'- CAT ACT GAC CCA TTG TCA ATG GGT AAT AAC TGA T-3'（配列番号50）
上記プライマーには、S.cerevisiae ゲノム中のオープンリーディングフレームYHR189Ｗの下流部分を含む0.7 kbpDNA断片とERG9の上流部分を含む 0.9 kbp DNA断片とでT/AライゲーションできるようにEam1105I認識部位（下線部分）を加えてある。YHR189Ｗ断片は、PCRプライマーYHR189WfとYHR189Wrを用いてYPH499ゲノムDNAを鋳型にPCRにより調製し、ERG9断片は、PCRプライマーERG9fとERG9rを用いてYPH499ゲノムDNAを鋳型にPCRにより調製した。YPH499ゲノムDNAは、「Genとるくん」を用いて調製した。
【００９２】
YHR189Wf：5'-TGT CCG GTA AAT GGA GAC-3'(配列番号51)
YHR189Wr：5'-TGT TCT CGC TGC TCG TTT-3'(配列番号52)
ERG9f：5'-ATG GGA AAG CTA TTA CAA T-3'(配列番号53)
ERG9r：5'-CAA GGT TGC AAT GGC CAT-3'(配列番号54)
1.8 kbp DNA断片をEam1105Iで消化後、0.7 kbpDNA断片とライゲーションし、これを鋳型にしてプライマーYHR189WfとE-MCSfを用いて2nd PCRを行った。増幅した2.5 kbp DNA断片をEam1105Iで消化後、0.9 kbp DNA断片とライゲーションし、これを鋳型にしてプライマーYHR189W-3fとERG9-2rを用いて3rd PCRを行った。増幅した3.4 kbp DNA断片を形質転換用DNA断片とした。
【００９３】
YHR189W-3f：5'-CAA TGT AGG GCT ATA TAT G-3'(配列番号55)
ERG9-2r：5'-AAC TTG GGG AAT GGC ACA-3'(配列番号56)
Zymo Research (Orange, CA) より購入したFrozen EZ yeast transformation II kitを用いて酵母にベクターの導入を行った。組換え体は、SGR培地（SD培地のグルコース成分をガラクトースとラフィノースで置き換えたもの）をベースにし、CSM(-URA) (BIO 101 (Vista, CA) より購入) と終濃度40 mg/lになるようにアデニン硫酸塩を加えた寒天培地（SGR-U培地）上で30℃で培養し、生育してきた菌体をもう一度同じ培地に広げ、培養しシングルコロニーアイソレーションを行った。
【００９４】
取得した組換え体は、EUG (ERG9p::URA3-GAL1p) 株と名付け、A451由来のクローンをEUG1〜10、YPH499由来のクローンをEUG11〜20、YPH500由来のクローンをEUG21〜30とした。
SD培地でグルコースリプレッションによりERG9発現が阻害され生育抑制のかかったクローンを選抜し、A451からEUG8が、YPH499からEUG12が、YPH500からEUG27が得られた。
なお、EUG8、EUG12、EUG27から「Geneとるくん」を用いてゲノムDNAを調製し、これを鋳型にしてPCRを行った結果、URA3とGAL1pを含む1.8 kbp のPCR断片がゲノム中のERG9コード領域上流にインテグレートされていることを確認した。
【００９５】
〔実施例6〕 遺伝子解析、酵素活性解析
本実施例では、作製した各種組換え酵母（各組換え体の作製については、後述するプレニルアルコールの生産についての実施例7、8を参照）の遺伝子発現を、プレニル二リン酸合成酵素の酵素活性、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼーション、PCRマッピングの各種手法を用いて解析した。作製した組換え体のうち、下記宿主株、組換え体を用いた。宿主への各ベクターの導入は、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., pp.13.7.1-13.7.2 に記載の酢酸リチウム法、又は、Frozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research, Orange, CA) を用いた方法で導入した（手順はキット同封の説明書に従った）。なお、1-2株はpYES-HMG1をA451株に導入したものであり、3-2株はpYHMG044をA451に導入したものであり、13-2株はpYES-HMG1をAURGG101に導入したものであり、15-2はpYHMG044をAURGG101に導入したものである。
【００９６】
No.1 宿主株：A451
No.2 GAL1p-BTS1 (YIp)：AURGG101 (A451,aur1::AUR1-C)
No.3 GAL1p-BTS1 (YIp)：AURGG102 (A451,aur1::BTS1-AUR1-C)
No.4 GAL1p-HMG1 (YEp)：1-2 (pYES-HMG1/A451)
No.5 GAL1p-HMG1Δ(YEp)：3-2 (pYHMG044/A451)
No.6 GAL1p-HMG1(YEp)：13-2 (pYES-HMG1/AURGG101)
No.7 GAL1p-HMG1Δ(YEp)：15-2 (pYHMG044/AURGG101)
【００９７】
No.1-No.7の株を26℃で培養した1 mlの前培養液を生理食塩水で洗い、100 mlの培養液へ加え、300 mlの三角フラスコ内で26℃、1分あたり120回の往復振盪で培養した。培地はSDおよびSG（SD培地のグルコースをガラクトースに置き換えたもの）を用いた。URA3マーカーを保持している組換え体はSD-U（SDにCSM(-URA)を加えたもの）又はSG-U（SGにCSM(-URA)を加えたもの）培地にし、AURGG株はオーレオバシジンを1 μg/lになるように加えた。
菌体増殖はOD600で測定し、OD600が3-4程度になった時点（23-52時間）で培養を止め、氷中で冷却し、以下に記載のDNA調製、RNA調製、粗酵素液調製を行った。
【００９８】
(1) サザンブロッティング
酵母DNA精製キット「Genとるくん」を用いて酵母DNAの調製を行った。手順は、キット添付のプロトコルに従った。
酵母より調製したDNAは、NdeIおよびStuIで切断後1レーンあたり3 μgを0.8%アガロースゲル電気泳動した。分子量マーカーは、Promega社 (Madison, WI) の 1 kb ラダーとλ/HindIIIをそれぞれ0.5 μg使用した。泳動後、定法に従ってアルカリ変性、中和し、Hybond Nナイロンメンブレン (Amersham, Buckinghamshire, England) に20 x SSCによるキャピラリーブロットで転写した。転写後、メンブレンはStratagene社のUV cross-linkerでoptimal cross-linkの条件で紫外線照射し、DNAをメンブレン上に固定した。
【００９９】
(2) ノーザンブロッティング
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., pp.13.12.2-13.12.3 記載の方法を一部改変してRNAを調製した。上記改変は、調製したRNAサンプルをさらにDNase Iで処理した点である。
【０１００】
フォルムアルデヒド変性アガロースゲル電気泳動によりRNAを分離後、定法に従って、Hybond Nナイロンメンブレンに20 x SSCによるキャピラリーブロットで転写した。１レーンあたりtotal RNA は5 μg泳動した。分子量マーカーはDIG-RNA Marker I 20 ngを使用した。転写後、メンブレンはStratagene社のUV cross-linkerでoptimal cross-linkの条件で紫外線照射し、RNAをメンブレン上に固定した。
【０１０１】
(3) PCRマッピング
実施例４で作製したYIp型ベクターであるpAURGG115由来の断片が、ゲノムにどのようにインテグレートされているかを調べるために、調製した酵母DNA 0.3-0.6 μgを鋳型にし、合成オリゴヌクレオチドAUR-FWcとAUR-RVc、およびAUR-SAL1とAUR-SAL2 との各組合せをプライマーに用いてPCRを行った。PCRは94℃30 秒, 55℃1 分, 72℃3 分を30サイクル繰り返す条件で行った。
AUR-FWc: 5'-TCT CGA AAA AGG GTT TGC CAT-3' (配列番号57)
AUR-RVc: 5'-TCA CTA GGT GTA AAG AGG GCT-3' (配列番号58)
AUR-SAL1: 5'-TGT TGA AGC TTG CAT GCC TGC-3' (配列番号59)
AUR-SAL2: 5'-TTG TAA AAC GAC GGC CAG TGA-3' (配列番号60)
【０１０２】
(4) DIGラベルプローブDNAの作製
ハイブリダイゼーションプローブはProbe I、II、III及びVの4種を作製した（表５）。
【０１０３】
【表５】
【０１０４】
プローブI:
合成オリゴヌクレオチドSCFPS1 とSCFPS2をプライマーにしてClontech社 (Palo Alto, CA) S. cerevisiae cDNA ライブラリよりPCR断片をpT7blue Tベクター (Novagen, Madison, WI)へクローニングし、pT7ERG20を作製した。
【０１０５】
SCFPS1: 5'-ATG GCT TCA GAA AAA GAA ATT AG-3' (配列番号61)
SCFPS2: 5'-CTA TTT GCT TCT CTT GTA AAC TT-3' (配列番号62)
pT7ERG20を鋳型にしてSCFPS1とSCFPS2をプライマーに用い、PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) によりDIGラベルプローブDNAを作製した。実験条件はRoche Diagnostics社添付のプロトコルに従った。
PCRは94℃30秒, 58℃1分, 72℃3分のサイクルを30サイクル繰り返す条件で行った。なお、DIGラベルプローブDNAは、反応後アガロースゲル電気泳動により合成状態をチェックした。
【０１０６】
プローブ II:
合成オリゴヌクレオチドBTS1(1-21) 及びBTS1(1008-988)をプライマーにし、pYESGGPS (実施例2(3)参照) を鋳型にしてプローブIと同様にしてDIGラベルプローブDNAを作製した。
BTS1(1-21): 5'-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG-3' (配列番号63)
BTS1(1008-988): 5'-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC-3' (配列番号64)
【０１０７】
プローブIII:
合成オリゴヌクレオチドHMG1(1267-1293)とHMG1(2766-2740)をプライマーにし、pYES-HMG1 (実施例3(3)参照) を鋳型にしてプローブIと同様にしてDIGラベルプローブDNAを作製した。
HMG1(1267-1293): 5'-AAC TTT GGT GCA AAT TGG GTC AAT GAT-3' (配列番号42)
HMG1(2766-2740): 5'-TCC TAA TGC CAA GAA AAC AGC TGT CAC-3' (配列番号65)
【０１０８】
プローブ V:
合成オリゴヌクレオチドAUR-FWとAUR-RVをプライマーにし、pAUR123 (宝酒造)
を鋳型にしてProbe Iと同様にしてDIGラベルプローブDNAを作製した。
AUR-FW: 5'-ATG GCA AAC CCT TTT TCG AGA-3' (配列番号66)
AUR-RV: 5'-AGC CCT CTT TAC ACC TAG TGA-3' (配列番号67)
【０１０９】
(5) ハイブリダイゼーションとプローブの検出
サザンブロットハイブリダイゼーションは、20 ng/mlのプローブ濃度でDIG Easy Hyb (Roche) を用いて42℃24時間行った。ノーザンブロットハイブリダイゼーションは、100 ng/mlのプローブ濃度でDIG Easy Hybを用いて50℃24時間行った。それぞれ、あらかじめハイブリダイゼーションと同じ温度でDIG Easy Hyb溶液で24時間プレハイブリダイゼーションを行ってある。ハイブリダイゼーション後、2x SSC, 0.1% SDS, 65℃, 10 分で3回、0.2x SSC, 0.1% SDS, 65℃, 15-20 分で2回、それぞれ洗浄した。洗浄後メンブレンはDIG Luminescent Detection Kit (Roche) でDIGラベルプローブを化学発光させ、X線フィルムに感光させ可視化した。
【０１１０】
(6) 酵素活性測定
各培養液から遠心により菌体を集め、RNA調製と同様にして4℃でガラスビーズで菌体を破砕後、滅菌水に懸濁した。微量冷却遠心機を用いて12,000 r.p.m.で10分遠心し、その上清を粗酵素画分とした。粗酵素画分中のタンパク質濃度は、Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA)でBSAを標準タンパク質として測定した。粗酵素液10 μgを用い下記の200 μl反応カクテル中で、37℃で40分間反応させた。
【０１１１】
【０１１２】
反応後、水飽和ブタノールで伸長したプレニル二リン酸を抽出し、一部は液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。残りのサンプルは、Koyamaらの方法 (Koyama T., Fujii, H. and Ogura, K. 1985. Meth. Enzymol. 110: 153-155) に従ってジャガイモ酸性フォスファターゼで脱リン酸化後、薄層クロマトグラフィー（プレートLKC18 (Whatman, Clifton, NJ)、展開液H2O/acetone=1:19）で展開し、Bio Image Analyzer BAS2000 (Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)でオートラジオグラムを可視化し、相対放射活性を測定した。
【０１１３】
(7) 結果と考察
(7-1) サザンブロットハイブリダイゼーションとPCRマッピング
サザンブロットハイブリダイゼーションの結果を図９に示す。また、AUR1近辺のPCRによるマッピングの結果を図10に示す。図９及び図10において、各レーン１〜７は、(6)において使用した株の番号（No.1〜No.7）にそれぞれ対応する。NはNdeI消化、SはStuI消化DNAのレーンを示す。各レーンのDNAは以下の株より調製した。
【０１１４】
レーン１, A451; レーン2, AURGG101; レーン3, AURGG102; レーン4, pYES-HMG1/A451; レーン5, pYHMG044/A451; レーン6, pYES-HMG1/ AURGG101; レーン7, pYHMG044/AURGG101
ERG20（FPP合成酵素遺伝子）は全ての株で同一であり、ERG20遺伝子の周辺のゲノムに変化がないことがわかった（図９）。
【０１１５】
BTS1（GGPP合成酵素遺伝子）とAUR1をプローブに用いたところ、AURGG102株では、AUR1部分にBTS1がインテグレーションされていたが、AURGG101では宿主のA451と変わらなかった。AURGG101はAUR1遺伝子部分のみがpAUR101由来のAUR1-C遺伝子に置換変異しただけで、GAL1p-BTS1断片はゲノムに組み込まれていないことがわかった。PCRによって、ゲノムインテグレーションの結果生じるAUR1遺伝子座の重複を検出したところ、やはりAURGG101由来の株ではバンドが検出されず、AURGG102株のみでバンドが検出された （図10）。
【０１１６】
図９において、HMG1をプローブにしたときには、NdeI切断の時プラスミド由来のバンドがみられた（No.4-7）。また、StuI切断では1-2株（No.4）の様に8.2 kbpのプラスミド由来のバンド（8.3 kbpのゲノム由来のバンドと重なっている）が生じるはずなのに、13-2株（No.6）、15-2株（No.7）ではゲノム中のHMG1付近と導入したプラスミド間で組換えが起こりバンドシフトがみられた。
サザンブロットハイブリダイゼーションとPCRマッピングの結果から、今回使用した株の遺伝子型は表６のようにまとめることができる。表中、AURはオーレオバシジンを加えた培地で、培地1が前培養培地、培地2が本培養用の培地を示す。
【０１１７】
【表６】
【０１１８】
(7-2) ノーザンブロットハイブリダイゼーション
ノーザンブロットハイブリダイゼーションの結果を図11に示す。プローブは、表５のI、II、IIIを使用した。
【０１１９】
図11において、各レーン１〜７は図９と同様である。また、−はSD培地での転写産物を、＋はSG培地での転写産物を示す。
ERG20の転写産物は、SG培地でGAL1p転写誘導をかけたときに13-2株（No.6）、15-2株（No.7）で低下する傾向がみられた。
SG培地によりGAL1転写プロモーター制御下の遺伝子の転写誘導を行ったところ、BTS1転写産物は、GAL1p-BTS1断片がゲノムにインテグレートされている株、すなわちAURGG102（No.3 ）でのみ誘導が増加していた。
しかしながら、HMG1転写産物と比較すると、その転写誘導の度合いは低いことが分かる。HMG1転写産物は、SG培地による転写誘導で、プラスミドによりGAL1p-HMG1断片が導入された株（No.4-7）で顕著に増加した。
【０１２０】
(7-3) プレニル二リン酸合成酵素活性
アリル性二リン酸基質としてゲラニル二リン酸（GPP）と14CラベルしたIPPとを用いて、粗酵素液中のプレニル二リン酸合成酵素活性を調べた。
【０１２１】
GPPと[14C]IPPを基質として合成された各プレニル二リン酸を脱リン酸化し、TLC展開の後各スポットの放射活性を調べたところ、 FPP合成酵素活性が高く、次に、GGPP合成酵素活性に比べてはるかに高いHexPP（ヘキサプレニル二リン酸）合成酵素活性が検出された。そこで、オートラジオグラムから反応産物の相対量を計算し、総タンパク質あたりの比活性を計算した。その結果を図12に示す。図12は、左上パネルがFPP合成酵素(FPS)活性、左下パネルがGGPP合成酵素(GGPS)活性、右上パネルがHexPP合成酵素(HexPS)活性、右下パネルがPTase（総プレニル二リン酸合成酵素）活性を示す。また、灰色の棒はSD培地での結果を、白色の棒はSG培地での結果を示す。総プレニル二リン酸合成酵素活性のうちの多くがFPP合成酵素活性であり、SG培地による活性上昇がみられた。特に、FOHを大量生産する（実施例9参照）13-2株（No.6）と15-2株（No.7）で顕著に増加していた。全体的には、GPPをアリル性基質にしたときのGGPP合成酵素活性はFPP合成酵素活性の20000分の一、HexPP合成酵素活性の300分の一程度である。HexPP合成酵素活性はSG培地で低下した。
【０１２２】
〔実施例7〕 組換え体の培養とプレニルアルコール生産
(1) 恒常発現型プロモーターを連結したHMG1遺伝子をA451に導入した場合
（「恒常発現プロモーター；HMG1；A451」のように表記する。以下同様。）のプレニルアルコール生産
FOH高生産組換え体を工業利用するには、恒常発現型プロモーターを利用すると安価な通常培地を利用できるので有利である。そこで、予備実験においてFOHを産生する可能性のあることが認められた酵母（S. cerevisiae）A451株（ATCC200589）を宿主に用い、恒常発現型プロモーター制御下でHMG1遺伝子を発現させた。
【０１２３】
恒常発現型プロモーターGAPp (=TDH3p)を含むベクターpRS434GAP又はpRS444GAPにHMG1遺伝子（PCRエラー修正後の遺伝子）を挿入し、それぞれpRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1を作製し、A451 に導入した。得られた組換え体をpRS434GAP-HMG1/A451、pRS444GAP-HMG1/A451とした。
【０１２４】
HMG-CoA還元酵素遺伝子を導入した酵母について、任意に10個のコロニーを選択した。選んだコロニーから、マーカー遺伝子TRP1に応じたSD選択培地であるSD-W培地（SDにCSM(-TRP)を加えたもの。以下同様。）に菌株を接種し、前培養を行った。その後、前培養液250μl（恒常発現型プロモーターを使用した酵母を用いて前培養を行った場合の添加量。以下同様。）を2.5 mlのYM培地に加え、26℃で4日間、130 r.p.m.の往復振盪培養で培養した。
【０１２５】
培養後、培養液にメタノールを2.5ml加えて混合後、ペンタンを約5ml加えて激しく撹拌し、静置した。ペンタン層を新しいガラス試験管にとり、ドラフト中でペンタンを気化させ溶質成分を濃縮後、ガスクロマトグラフィー/質量分析（GC/MS）でプレニルアルコールを同定し、内部標準としてウンデカノールを用いて定量した。また、その際、菌体増殖の度合いを調べるため、培養液50μlを水で30倍に希釈し、600nmの吸光度を測定した。
GC/MSは、HP6890/5973 GC/MSシステム(Hewlett-Packard, Wilmington, DE) を用いた。使用カラムはHP-5MS (0.25 mm x 30 m、フィルム厚0.25 μm)であり、分析条件は以下の通りである。本明細書中でのGC/MS分析条件は、全て同様である。
【０１２６】
インレット温度 250℃
検出器温度 260℃
[MS ゾーン温度]
MS Quad 150℃
MS Source 230℃
マススキャン範囲 35-200
[インジェクションパラメーター]
自動インジェクションモード
サンプル容量 2 μl
3回のメタノール洗浄及び2回のヘキサン洗浄
スプリット比 1/20
キャリヤーガス ヘリウム 1.0 ml/分
溶媒遅延 2 分
[オーブン加熱条件]
115℃ 90 秒
70℃ /分で250℃まで加熱し、2分間維持
70℃ /分で300℃まで加熱し、7分間維持
時間0後
内部標準 エタノール中0.01 μl 1-ウンデカノール
信頼標準 (E)-ネロリドール (エーザイ)
(all-E)-ファルネソール (Sigma)
(all-E)-ゲラニルゲラニオール (エーザイ)
スクアレン (東京化成工業)
【０１２７】
プレニルアルコールの生産量を測定した結果を図13〜15に示す。図13のpRS434 No.3からさらに10コロニーとったときの結果が図14であり、図13に示すデータをまとめた図が図15である。図13のNo:10(pRS434)のコロニーにおいて4.9mg/lのFOH生産が認められた。また、図15において、434、444は、それぞれpRS434GAP、pRS444GAPベクターを用いたときの結果を表す。一番右のグラフが遺伝子導入前の宿主(A451)を培養したときの結果を示す。
【０１２８】
この結果より、A451を宿主に用いると、pRS434GAP-HMG/A451ではNOH、FOHとも生産性が向上し、HMG1遺伝子の転写を活性化させるだけでFOHは平均3.8mg/l、コロニーによっては、最高で11.2mg/l生産された（図13）。pRS444GAP-HMG1/A451ではNOHは最高0.16mg/lであり、FOH生産に主に有効であることが分かった。
【０１２９】
これは、YPH499などの通常用いられている組換えDNA宿主株と比較して、A451はスクアレン合成酵素活性とメバロン酸経路活性のバランスとが異なっており、HMG1遺伝子の多コピー化又は転写活性化により中間代謝産物のファルネシル二リン酸(FPP) が蓄積され、結果としてその脱リン酸化物のFOHが生産されると考えられる。つまり、A451と同様なスクアレン合成酵素活性とメバロン酸経路活性のバランスを有している株であれば、どの株でも同様にHMG1導入でFOH生産が期待できることになる。FOH生産に関しては、pRS444GAPをベクターとして用いたときよりpRS434GAPを用いたときの方が生産性がよい傾向がみられた。
【０１３０】
(2) 恒常発現型プロモーター；HMG1; YPH499
恒常発現型プロモーターADH1p、 GAPp (=TDH3p)、PGK1p又はTEF2pを含むベクターpRS414PTadh、pRS414TPadh、pRS434GAP、pRS444GAP、pRS434PGK、pRS444PGK、pRS434TEF又はpRS444TEFに、それぞれHMG1遺伝子（PCRエラー修正後の遺伝子）を挿入した以下のプラスミドをYPH499へ導入した。
【０１３１】
pRS414PTadh-HMG1
pRS414TPadh-HMG1
pRS434GAP-HMG1
pRS444GAP-HMG1
pRS434PGK-HMG1
pRS444PGK-HMG1
pRS434TEF-HMG1
pRS444TEF-HMG1
得られる組換え体を、40μg/mlとなるようにアデニン硫酸塩を加えたYM培地（YPH499を宿主としたときの培地。以下同様。）で培養した。培養条件は、(1)と同様である。培養後、培養液のペンタン抽出画分をGC/MS解析した。培養後、プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した。
【０１３２】
結果を図16に示す。図16において、414PT、414TP、434、444は、それぞれpRS414PTadh、pRS414TPadh、pRS434xxx、pRS444 xxxベクター（xxxはプロモーターに用いた遺伝子名のアルファベット部分を示す）を用いたときの結果を表す。一番右のグラフが遺伝子導入前の宿主(YPH499)を培養したときの結果を示す。図16より、全ての組換え体でFOHの生産量が向上し、pRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1、pRS434TEF-HMG1、pRS444TEF-HMG1、pRS434PGK-HMG1、pRS444PGK-HMG1を導入したYPH499ではNOHの生産性が上昇する株が得られた。
【０１３３】
(3) 恒常発現型プロモーター；HMG1; EUG
A451、YPH499、YPH500由来でGlc生育抑制がみられ、ゲノムへのインテグレーションも完全に行われたEUG株（EUG8、EUG12、EU27）を選択した。恒常発現型プロモーターGAPp (=TDH3p)を含むベクターpRS434GAP又はpRS444GAPにHMG1遺伝子（PCRエラー修正後のもの）を挿入したプラスミドpRS434GAP-HMG1及びpRS444GAP-HMG1を、EUG8(0.021mg/l NOH, 0.20mg/l FOH生産)、EUG12(0.13mg/l NOH, 5.9mg/l FOH生産)、EU27(0.038mg/l NOH, 3.2mg/l FOH生産)へ導入し、プレニルアルコール生産量を測定した。
結果を図17（EUG8）、図18（EUG12）、図19（EUG27）に示す。
【０１３４】
EUG株は、グルコース（Glc）を炭素源としたYM培地で培養するとFOHを生産するが、HMG1導入で生産性が向上した。A451株由来のEUG8とYPH499や、YPH500由来のEUG12、EUG27では生産プロファイルが異なり、YPH系の株の方がより生産に適していると考えられる。
この結果から、HMG1導入によりA451由来株、YPH499由来株、YPH500由来株のプレニルアルコール生産性を向上できることが分かった。
【０１３５】
(4) 誘導型プロモーター；HMG1; A451 & AURGG101
誘導型プロモーターGAL1pを含むベクターpYES2にHMG1遺伝子（PCRエラー変異型HMG1であるHMG1'）を挿入したプラスミドpYES2-HMGを、A451と実施例４で作製したAURGG101 (A451, aur1::AUR1-C)へ導入した。
【０１３６】
それぞれの組換え体を前培養し、25 μl（誘導型プロモーターを使用した酵母を用いて前培養を行ったときの量。以下同じ。）の前培養液を2.5 mlのSG培地に加え、26℃で4日間 130 r.p.m.の往復振盪培養で培養した。ただし、SG培地に加える前には菌体を生理食塩水で洗浄し、グルコース成分の持ち込みがないようにした。SG培地で培養後、プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した。
【０１３７】
その結果、pYES-HMG1/AURGG101でNOHを平均1.43mg/l、FOHを平均4.31mg/l生産し、変異型HMG1であるHMG1'を含むpYES-HMG1を導入した組換え体でもプレニルアルコール高生産性を示すクローンが得られた（図20）。図20AはA451の結果、図20BはAURGG101の結果である。pYESは遺伝子導入に用いたベクター名である。
A451由来株であるAURGG101を宿主に用い、GAL1pを使用した場合は、FOHを特に高生産するクローンが得られた。
【０１３８】
(5) 誘導型プロモーター；HMG1; W303-1A又はW303-1B
誘導型プロモーターGAL1pを含むベクターpYES2にHMG1遺伝子を挿入したプラスミドpYES2-HMGを、W303-1AとW303-1Bへ導入した。SG培地で培養後、プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した（図21）。
HMG1遺伝子を導入すると（それぞれ左側の棒グラフ）、全ての産物の生産量が増加していた。W303株の特徴としては、NOHの生産に有効であった。
【０１３９】
〔実施例8〕欠失型HMG-CoA還元酵素遺伝子の高発現によるプレニルアルコール生産
実施例7ではHMG-CoA還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子の完全長のものを用いてプレニルアルコール生産型組換え酵母を開発したが、本実施例では欠失型HMG-CoA還元酵素遺伝子を用いてプレニルアルコール生産型組換え酵母を作製し、その生産を行った。
【０１４０】
(1) 誘導型プロモーター；HMG1Δ; A451
誘導型プロモーターGAL1pを含むベクターpYES2に欠失型HMG1'遺伝子を挿入した以下のプラスミド(実施例3(4)記載)をそれぞれA451へ導入した。
【０１４１】
pYHMG026
pYHMG044
pYHMG056
pYHMG062
pYHMG076
pYHMG081
pYHMG100
pYHMG112
pYHMG122
SG培地で培養後、プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した（図22）。
欠失型HMG1遺伝子を誘導型プロモーターで発現させると、FOH高生産株が得られた。FOH生産にはHMG1Δ044とHMG1Δ122が効果があった（HMG122/A451で平均0.20mg/l）。
【０１４２】
(2) 誘導型プロモーター；HMG1Δ; AURGG101
誘導型プロモーターGAL1pを含むベクターpYES2に、欠失型HMG1'遺伝子を挿入した以下のプラスミド(実施例3(4)記載)をそれぞれAURGG101へ導入した。
【０１４３】
pYHMG026
pYHMG044
pYHMG056
pYHMG062
pYHMG076
pYHMG081
pYHMG100
pYHMG112
pYHMG122
pYHMG133
SG培地で培養後、プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した（図23、図24）。図23において、一番右側のカラムは遺伝子導入前の宿主AURGG101の生産量を示す。図24は、図23のスケールを拡大したものである。
【０１４４】
特に、HMG1Δ044を誘導型プロモーターで発現させた場合には、プレニルアルコールを高生産する株(15-2株)が得られた。NOH、FOHは平均でそれぞれ12 mg/l、31.7 mg/lであり（図23）、最大生産量はそれぞれ、23 mg/l、53 mg/lであった。HMG1Δ044以外では0.05-0.06mg/l程度のNOH、FOH生産株が得られ（図24）、HMG1Δ62導入株では最大で0.11mg/l NOH、0.13mg/l FOHを生産した。
【０１４５】
(3) 恒常発現型プロモーター；HMG1、誘導型プロモーター；HMG1Δ；AURGG101実施例7(2)で作製したpRS434GAP-HMG1又はpRS444GAP-HMG1を、本実施例(2)で作製した15-2株へ導入した。SG培地で培養後、プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した（図25）。
その結果、15-2株のFOH生産53mg/lを向上させ、最大で66mg/l FOHを生産する株が得られた。
【０１４６】
〔実施例9〕 大腸菌によるプレニルアルコールの生産
（1）実施例2(4)、(5)、(7)で得られたプラスミドを大腸菌JM109に導入し、50 ml/300 ml flaskの2x YT、1 mM IPTG培地に前培養液を0.5 ml加え、必要に応じた抗生物質（アンピシリン、クロラムフェニコール）と5 mM (約0.12% (W/V))のIPPとDMAPPを加え、37℃で16時間振盪培養した。
37℃で16時間振盪培養した後、培養液上清と沈澱超音波破砕物にジャガイモ酸性フォスファターゼを加え、ペンタンを有機溶媒としてプレニルアルコールを抽出し、実施例7(1)にあるようにGC/MSにより生産量を同定、定量した。
その結果、培地に添加成分としてIPPとDMAPPを加えたときのFOHの生産量は、野性型ispAを導入した場合(図26中のpALispAで示す)で86.4 mg/lであり、野性型fpsを導入した場合(図26中のpFE15NS2.9-1で示す)で12.0 mg/lであった。また、変異型ispAを導入した場合でも、 p18M、p18Eを保持するJM109を培養した場合はそれぞれ11.1 mg/l、16.3 mg/lであり、p4Dを保持するJM109を培養した場合は72.7 mg/l、p16Dを保持するJM109を培養した場合は93.3 mg/lに達した(図26)。
【０１４７】
（2）IPPとDMAPPを添加しなくてもプレニルアルコール生産が行えるかどうかを確かめるため、実施例2(4)、(6)で得られたプラスミドpALispA4とp3-47-11、又はpALispA4とp3-47-13を大腸菌JM109に導入、50 ml/300 ml flaskの2x YT、1 mM IPTG培地に前培養液を0.5 ml加え、必要に応じて抗生物質を加え（アンピシリン、クロラムフェニコール）、37℃で16時間振盪培養した。
その結果、pALispA4とp3-47-11を保持するJM109で0.15 mg/l、pALispA4とp3-47-13を保持するJM109で0.16 mg/lのFOH生産能力があった(図27)。
したがって、idiを含むプラスミドp3-47-11又はp3-47-13と、ispAを含むプラスミドpALispA4の二種のプラスミドを保持するJM109、すなわちidiとispAを導入した大腸菌であれば、IPPやDMAPPといった添加物なしでも0.15-0.16 mg/lのFOHを生産する能力があることがわかった。
【０１４８】
〔実施例10〕 FOHの大量生産
１ 培養条件
CSM-URA（BIO 101 Inc.製）及びDOB（BIO 101 Inc.製）培地（200ml/500ml-バッフル付き三角フラスコ）にスラントより実施例8(2)に記載の15-2株組換え酵母（pYHMG044を保持するAURGG101株）を一白金耳植菌し、30℃、130rpmで２日間培養した。次に、培養液に含まれているグルコースを完全に除くため、遠心（1500g、５分、４℃）及び滅菌した生理食塩水による洗浄を３回繰り返した。その後、ファーメンターに50ml植菌（１％）し、以下の条件で培養した。
【０１４９】
＜ファーメンター培地＞
５％ ガラクトース
アミノ酸含有YNB（Difco製）
1％ 大豆油（ナカライ）
0.1％アデカノールLG109（旭電化）
＜運転条件＞
培養装置：MSJ-U 10L培養装置（丸菱バイオエンジ）
培地量：5L
培養温度：26℃
通気量：１vvm
アジテーション：300rpm
ｐH：特に断らない限り４Ｎ水酸化ナトリウム溶液及び２Ｎ塩酸溶液を用い、以下のパラメーターでpHを比例制御
Proportional Band 1.00
Non Sensitive Band 0.15
Control Period 16 Sec
Full Stroke 1 Sec
Minimun Stroke 0 Sec
【０１５０】
２．菌体数測定
培養液100μlを生理食塩水で1〜20倍に希釈し、血球計（林理化学）で細胞数を計数した。0.06mm四方（最少のグリッド９つ分）の菌数を４平均し、以下の式から培養液1L当たりの菌数を算出した。
菌数（1×109/L-broth）＝0.444×（0.06mm四方の菌体数）×希釈倍率
３．FOHの定量
FOH量は、実施例８と同様に同定・定量した。
４．結果
結果を図28に示す。図28より、変異型HMG-CoA還元酵素遺伝子HMG1'の欠失型遺伝子HMG1Δ044を、A451由来株であるAURGG101に導入した組換え酵母で、培養液1Lあたり平均146mg、最高で158mgのFOHを生産できることが示された。
【０１５１】
【発明の効果】
本発明により、プレニルアルコールの製造方法が提供される。本発明によれば、生物学的に活性なプレニルアルコールを大量に入手できるため、これをもとに様々な生理活性のあるイソプレノイド・テルペノイドを合成することができる。また、本発明において提供された活性型プレニルアルコールは、新たな生理活性を持つ物質を見出すための原料としても利用することができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】メバロン酸経路関連酵素の代謝経路を示す図である。
【図２】欠失型HMG1遺伝子の構築図及び置換変異のパターンを示す図である。
【図３】プラスミドpRS414を示す図である。
【図４】プラスミドpYES2を示す図である。
【図５】ADH1プロモーター、ターミネーターの配列を示す図である。
【図６】プラスミドpRS414PTadh及びpRS414TPadhを示す図である。
【図７Ａ】プラスミドpRS434ADH及びpRS434GAPを示す図である。
【図７Ｂ】プラスミドpRS434PGK及びpRS434TEFを示す図である。
【図７Ｃ】プラスミドpRS436ADH及びpRS436GAPを示す図である。
【図７Ｄ】プラスミドpRS436PGK及びpRS436TEFを示す図である。
【図７Ｅ】プラスミドpRS444ADH及びpRS444GAPを示す図である。
【図７Ｆ】プラスミドpRS444PGK及びpRS444TEFを示す図である。
【図７Ｇ】プラスミドpRS446ADH及びpRS446GAPを示す図である。
【図７Ｈ】プラスミドpRS446PGK及びpRS446TEFを示す図である。
【図８】プラスミドpALHMG106の物理地図を示す図である。
【図９】サザンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１０】 PCRマッピングの結果を示す写真である。
【図１１】ノーザンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１２】粗酵素液中の各プレニル二リン酸合成酵素の比活性を示す図である。
【図１３】 A451にpRS434GAP-HMG1又はpRS444GAP-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図１４】 A451にpRS434GAP-HMG1又はpRS444GAP-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図１５】 A451にpRS434GAP-HMG1又はpRS444GAP-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図１６】 YPH499にpRS414PTadh-HMG1、pRS414TPadh-HMG1、pRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1、pRS434PGK-HMG1、pRS444PGK-HMG1、pRS434TEF-HMG1又はpRS444TEF-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図１７】 EUG8にpRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図１８】 EUG12にpRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図１９】 EUG27にpRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２０】 A451株又はAURGG101株にpYES-HMG1、pYHMG044を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２１】 W303-1A、W303-1BにpYES-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２２】 A451にpYHMG026、pYHMG044、pYHMG056、pYHMG062、pYHMG076、pYHMG081、pYHMG100、pYHMG112、pYHMG122を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２３】 AURGG101にpYHMG026、pYHMG044、pYHMG056、pYHMG062、pYHMG076、pYHMG081、pYHMG100、pYHMG112、pYHMG122を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２４】 AURGG101にpYHMG026、pYHMG044、pYHMG056、pYHMG062、pYHMG076、pYHMG081、pYHMG100、pYHMG112、pYHMG122を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である(図23の拡大図)。
【図２５】 AURGG101にpRS434GAP-HMG1 又はpRS444GAP-HMG1とpYHMG044とを導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２６】変異型ispA遺伝子を導入したE. coliを、IPPとDMAPPを含む培養液で培養したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２７】変異型ispA遺伝子を導入したE. coliを、IPPとDMAPPを含まない培養液で培養したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２８】組換え体15-2株(pYHMG044/AURGG101)をジャーファーメンター培養したときのプレニルアルコールの生産量と細胞数を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、プレニルアルコールの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
生体内でのテルペノイド（イソプレノイド）合成は、アリル性二リン酸基質にイソペンテニル二リン酸（isopentenyl diphosphate）(IPP, C5)を順次縮合することによって直鎖プレニル二リン酸であるゲラニル二リン酸（geranyl diphosphate (GPP, C10 )）、ファルネシル二リン酸（farnesyl diphosphate (FPP, C15)）、ゲラニルゲラニル二リン酸（geranylgeranyl diphosphate (GGPP, C20)）が生合成されるところから始まる（図１）。図１において、枠で囲まれた文字が酵素を表す。hmgRはヒドロキシメチルグルタリル-CoA（hydroxymethylglutaryl-CoA：HMG-CoA）還元酵素、GGPSはGGPP合成酵素、FPSはFPP合成酵素を示す。
【０００３】
プレニル二リン酸のなかでも、FPPは最も重要な生合成中間体であり、膨大な種類のテルペノイド類、例えば、エルゴステロール（プロビタミンD2）を含むステロイド類、キノン（ビタミンK, VK）の側鎖、セスキテルペン類、スクアレン（SQ）、ファルネシル化タンパク質のアンカー分子、天然ゴムなどの合成前駆体である。
【０００４】
GGPPもまた、生体内では重要な生合成中間体であり、レチノール（ビタミンA, VA）、β-カロテン（プロビタミンA）、フィロキノン（ビタミンK1, VK1）、トコフェロール類（ビタミンE, VE）、ゲラニルゲラニル化タンパク質のアンカー分子、葉緑体の側鎖、ジベレリン、アーキアのエーテル型脂質などを始めとする化合物の生合成に必須である。
【０００５】
FPP、GGPPのアルコール誘導体であるファルネソール(farnesol)(FOH, C15)、ネロリドール(nerolidol)(NOH, C15)、ゲラニルゲラニオール（geranylgeraniol） (GGOH, C20)は、香料として用いられる精油中の芳香物質として知られるが、薬理作用物質として有用な上記ビタミン類をはじめとする化合物の合成出発物質としてもまた重要な物質である（図１）。
従って、異性体混合物でないいわゆる活性型プレニルアルコールの純品を大量に生産できる系の確立が望まれている。
【０００６】
IPPの生体内での合成は、すべてメバロン酸経路（アセチル補酵素A（acetyl-CoA）からメバロン酸を経てIPPを合成する経路）によると考えられてきたが、1980年代末より、M. Rohmerらがバクテリアを用いて新しいIPP合成経路を明らかにした。これは、非メバロン酸経路又はDXP(1-deoxyxylulose 5-phosphate)経路と呼ばれており、グリセルアルデヒド3-リン酸とピルビン酸から1-deoxyxylulose 5-phosphateを経てIPPを合成する経路である。
【０００７】
FOHやNOHは、精油等の天然物から少量調製される以外には、現在化学合成法により合成されている。化学合成法で合成されるFOH、NOHは、一般的には炭素骨格が同じであるが、二重結合が(E)-型(trans型)と(Z)-型(cis型)の混合物として得られる。(all-E)-型である(E,E)-FOH又は(E)-NOHは生物の代謝経路で合成される形であり、工業的利用価値を有する。(E,E)-FOH又は(E)-NOHを純粋な形で得るためには、カラムクロマトグラフィーや精密蒸留などを利用した精製が必要である。しかし、熱的に不安定なアリルアルコール(allylalcohol)であるFOHとその異性体であるNOHの精密蒸留は困難である。また、カラムクロマトグラフィーによる精製は、多量の溶媒充填剤を必要とし、順次溶出してくる各画分を分析しながら回収し、さらに溶媒を除去しなければならないなど、操作が煩雑でコストも高く、工業実施には適さない。そこで、(E)-、(Z)-幾何異性体の生成制御や反応産物の繰り返し構造などの特徴から、(E,E)-FOH（以下「FOH」と記す）の生合成法が望まれているが確立されていない。FOH合成基質は、例えば出芽酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の細胞内ではメバロン酸経路を経て供給されるが、そのキー酵素と考えられるHMG-CoA還元酵素を利用しても、スクアレン合成能が上がることしか知られていない(特開平5-192184号公報； Donald et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63, 3341-3344)。また、ステロール取り込み能を獲得した特別な出芽酵母のスクアレン合成酵素遺伝子欠損株を培養しても、培養液１リットルあたり1.3mgのFOHの蓄積が知られているだけであり(Chambon et al.(1990) Curr. Genet. 18, 41-46)、(E)-NOH（以下「NOH」と記す）の生合成法は知られていない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、HMG-CoA還元酵素遺伝子、IPPΔ-イソメラーゼ遺伝子若しくはFPP合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子を含む発現用組換えDNAの導入により作製された組換え体を培養することによるプレニルアルコールの製造方法を提供することを目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、発酵工業に古来から広く用いられ、メバロン酸経路あるいはDXP経路を経てプレニル二リン酸合成を行い、遺伝子組換えに関する様々な手法が駆使できる宿主、例えば単細胞真核生物（特に酵母）又は原核生物（例えばバクテリア、特に大腸菌）を実験材料にして、プレニル二リン酸合成に関わる酵素の遺伝子導入によるプレニルアルコール生産系の開発を行った。酵母でプレニル二リン酸合成に関わる酵素の遺伝子（例えばHMG-CoA還元酵素遺伝子）を宿主細胞内で人為的に発現させる系を構築するために、恒常発現型又は誘導発現型転写プロモーターを含み、各種栄養要求性マーカーを持った発現シャトルベクターの作製を行い、これに目的の遺伝子又はその変異型遺伝子を組み込み、これを各種宿主細胞へ導入した。そして、その培養物からNOH又はFOHを得、上記目的を達成することに成功し、本発明を完成するに至った。大腸菌では、既存のベクターを用いプレニル二リン酸合成に関わる酵素の遺伝子（例えばFPP合成酵素遺伝子やIPPΔ-イソメラーゼ遺伝子）を宿主細胞に導入しその培養物を脱リン酸化した後FOHを得、上記目的を達成することに成功し本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は、HMG-CoA還元酵素遺伝子、FPP合成酵素遺伝子若しくはIPPΔ-イソメラーゼ遺伝子又はこれらの変異型遺伝子並びに転写プロモーター及び転写ターミネーターを含む、発現用組換えDNA又はゲノムインテグレート用DNA断片を、宿主に導入して組換え体を作製し、該組換え体を培養した後、得られる培養物からプレニルアルコールを採取することを特徴とするプレニルアルコールの製造方法である。プレニルアルコールとしては、炭素数15のもの、例えばFOH又はNOHが挙げられる。HMG-CoA還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子としては、配列番号２、４又は６に示すアミノ酸配列をコードするものやその欠失体、例えば配列番号１、３、５及び７〜16からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含むものが挙げられる。ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子としては、配列番号76、78、80、82又は84に示されるアミノ酸配列をコードするもの、例えば配列番号75、77、79、81及び83からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含むものが挙げられる。IPPΔ-イソメラーゼ遺伝子又はその変異型遺伝子としては、配列番号86に示されるアミノ酸配列をコードするもの、例えば配列番号85に示される塩基配列を含むものが挙げられる。転写プロモーターとしては、ADH1プロモーター、TDH3（GAP）プロモーター、PGK1プロモーター、TEF2プロモーター、GAL1プロモーター及びtacプロモーターかなる群から選ばれるいずれかのものが挙げられる。但し、これらのプロモーターと機能的に同等の活性を有する転写プロモーターも使用することができる。また、転写ターミネーターとしては、ADH1ターミネーター又はCYC1ターミネーターが挙げられる。但し、これらのターミネーターと機能的に同等の活性を有する転写ターミネーターも使用することができる。さらに、宿主は、酵母、例えばサッカロマイセス・セレビシエなどの出芽酵母、具体的にはA451、YPH499、YPH500、W303-1A若しくはW303-1B又はこれらに由来する株、あるいはバクテリア、例えば大腸菌（Escherichia coli）、具体的にはJM109又はこれに由来する株であることが好ましい。
【００１１】
本発明によれば、プレニルアルコールとして例えばNOHやFOHを、宿主細胞のみの培養物では到達できない濃度（少なくとも培地中0.05mg/lの濃度）で生産することができる。
さらに、本発明は、HMG-CoA還元酵素遺伝子、FPP合成酵素遺伝子若しくはIPPΔ-イソメラーゼ遺伝子又はこれらの変異型遺伝子並びに転写プロモーター及び転写ターミネーターを含む、発現用組換えDNA又はゲノムインテグレート用DNA断片を、宿主に導入してなる組換え体であって、少なくとも0.05mg/lのFOH又はNOHを生産することができる組換え体である。宿主、プロモーター、ターミネーターの種類は前記と同様である。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明者は、代謝工学的な手法を用い、生体内で活性型プレニルアルコール((all-E)-プレニルアルコール)を生産させる系の開発に臨んだ。一般に、FPPは、ファルネシル二リン酸合成酵素（FPS）の触媒により、IPP及びDMAPP（3,3-dimethylallyl diphosphate）を基質として合成されるが、通常FOHへの反応は進行せず、スクアレン合成酵素によるスクアレン合成、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素によるGGPP合成、ヘキサプレニル二リン酸合成酵素によるヘキサプレニル二リン酸合成などに進行する（図１）。本発明は、生物によって異なる二つの独立な経路（メバロン酸経路とDXP経路）を経るプレニル二リン酸合成の活性化に関与すると考えられるHMG-CoA還元酵素遺伝子、FPP合成酵素遺伝子、又はIPPΔ-イソメラーゼ遺伝子の導入により、通常予想されるスクアレンや主要最終産物であるステロール類などではなく、一般的な代謝経路マップ中にも明記されていないNOHやFOH等のプレニルアルコールを産生することができる形質転換細胞を見出し、プレニルアルコールの生物学的な大量生産系を開発したものである。また、HMG-CoA還元酵素遺伝子の一部の領域をさまざまなパターンで欠失させ（図２）、その遺伝子を転写プロモーター制御下で宿主に導入し、あるいは、FPP合成酵素のアミノ酸残基置換変異型酵素を宿主に導入し、上記物質の生物学的な大量生産系を開発したものである。
【００１３】
１．発現用組換えDNA又はゲノムインテグレート用DNA断片の作製
本発明において、宿主を形質転換するための発現用組換えDNAは、発現の目的となる遺伝子に、転写プロモーター及び転写ターミネーターDNAを連結又は挿入することにより得ることができる。発現の対象となる遺伝子としては、HMG-CoA還元酵素遺伝子（例えばHMG1)、大腸菌（Escherichia coli）FPP合成酵素遺伝子ispA、バチルス・ステアロサーモフイラス(Bacillus stearothermophilus)FPP合成酵素遺伝子、IPP-Δイソメラーゼ遺伝子idi(ORF182)等(以下、HMG-CoA還元酵素遺伝子等と略す)が挙げられる。なお、これらの遺伝子は、PCRや市販のキットを利用したクローニング手法により単離することが可能である。
【００１４】
また、HMG-CoA還元酵素遺伝子等に、予め転写プロモーター及び転写ターミネーターが連結された遺伝子発現カセットを作製しておいて、これをベクターに組み込むこともできる。連結及び挿入の順序は任意であるが、HMG-CoA還元酵素遺伝子等の上流に転写プロモーターを連結し、HMG-CoA還元酵素遺伝子等の下流に転写ターミネーターを連結する。本発明においては、適当なDNA、例えばベクターDNAに順次HMG-CoA還元酵素遺伝子等、転写プロモーター及び転写ターミネーターを組み込んでもよく、転写方向が考慮されていれば順不同で組み込んでもよい。
【００１５】
使用されるDNAは、宿主細胞に遺伝的に保持される可能性のあるものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、バクテリオファージ、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNA（YAC:yeast artificial chromosome）等が挙げられる。また、ゲノムインテグレーションによる導入のための発現用組換えDNA断片としては、複製機能は必ずしも必要ではなく、PCR法又は化学合成により作製されたものを使用することも可能である。
【００１６】
プラスミド DNAとしては、例えばpRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112又はpAUR123などのYCp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pYES2又はYEp13などのYEp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101又はpAUR135などのYIp型大腸菌-酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpACYC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW218又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げられ、ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP）、φX174、M13mp18又はM13mp19等が挙げられる。レトロトランスポゾンとしては、Ty因子などが挙げられる。YAC用ベクターとしてはpYACC2などが挙げられる。
宿主への組換えDNAの導入には、選択マーカー遺伝子を用いる場合が多いが、アッセイ法がある場合は、必ずしもマーカー遺伝子は必要ではない。
【００１７】
転写プロモーターは、恒常発現型プロモーター又は誘導発現型プロモーターを用いることができる。恒常発現型プロモーターとは、主要代謝経路に関わる遺伝子の転写プロモーターを意味し、どの生育条件でも転写活性を有すると考えられているプロモーターである。誘導発現型プロモーターとは、特定の生育条件で転写活性があり、その他の生育条件では活性が抑えられるプロモーターを意味する。
【００１８】
転写プロモーターは、酵母等の宿主中で活性を持つものであればいずれを用いてもよい。例えば酵母での発現用として、GAL1プロモーター、GAL10プロモーター、TDH3(GAP)プロモーター、ADH1プロモーター、PGK1プロモーター、TEF2プロモーター等を用いることができる。また、大腸菌での発現用として、trp、lac、trc、tacなどのプロモーターを用いることができる。
【００１９】
さらに、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカーなどを連結することができる。なお、選択マーカーとしては、URA3、LEU2、TRP1、HIS3などの栄養非要求性の表現型を指標とするマーカー遺伝子や、Ampr、Tetr、Cmr、Kmr、AUR1-C等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【００２０】
転写ターミネーターは、酵母等の宿主中で活性を持つものであればいずれの遺伝子に由来するターミネーターを用いてもよい。例えば酵母での発現用として、ADH1ターミネーター、CYC1ターミネーター等を用いることができる。また、大腸菌での発現用として、rrnBターミネーターが挙げられる。大腸菌をはじめとするバクテリアの遺伝子の開始コドン上流にSD配列 (5'-AGGAGG-3'で代表される) を翻訳のためのリボソーム結合部位として組み込むこともできる。
【００２１】
本発明において遺伝子導入用組換えDNAとして作製された発現ベクターは、特に記さない限り、プラスミド名の次に遺伝子名を表示することで命名及び識別することができる。例えば、TDH3(GAP)プロモーターを有するプラスミドpRS434GAPにHMG1遺伝子を連結した場合は「pRS434GAP-HMG1」のように表示する。特別の場合を除き、他のプラスミドやプロモーターを用いた場合も同じ要領で表示する。
【００２２】
さらに、本発明においては、HMG-CoA還元酵素遺伝子等は、その一部の領域（最大で2217塩基）が欠損した欠失型や、野生型遺伝子又はこれら欠失型遺伝子の塩基配列のうち1個又は数個〜十数個の塩基が欠失、置換又は付加した変異型遺伝子でもよい。アミノ酸配列においても、天然型HMG-CoA還元酵素のアミノ酸配列（配列番号２）のうち最大で739個のアミノ酸が欠失した欠失型や、アミノ酸が野性型酵素又はこれら欠失型酵素から1個又は数個（例えば1個〜10個、好ましくは１個〜３個）のアミノ酸に欠失、置換又は付加等の変異が生じてもよい。具体的には、野性型又は図2Bに例示するような欠失型遺伝子、又はそれらにコードされる酵素のアミノ酸配列において、たとえば図２Aに示される箇所の塩基又はアミノ酸の置換が、１〜10箇所の範囲で部位特異的に生じていてもよい。FPP合成酵素遺伝子においても、1個又は数個〜十数個の塩基が欠失、置換又は付加した変異型遺伝子でもよい。具体的には野生型FPP合成酵素遺伝子(配列番号77)の塩基を5個置換した各種変異型遺伝子(配列番号79、81又は83)を用いることが出来る。この変異型遺伝子は、野生型FPP合成酵素（配列番号78）の第79番目のアミノ酸残基TyrがAsp(配列番号80)、Glu(配列番号82)又は Met(配列番号84)に置換変異した変異型酵素をコードしている。
【００２３】
また、Taq DNAポリメラーゼ等の忠実性（fidelity）の低いDNAポリメラーゼを用いたPCR(polymerase chain reaction)で野性型DNAを増幅させたDNA断片に生じる塩基の置換変異を「PCRエラー」といい、例えば、野生型HMG-CoA還元酵素遺伝子（配列番号１）を鋳型に用いたときのPCRエラーによる塩基の置換変異に起因するコードされるポリペプチドの置換変異を有するHMG-CoA還元酵素遺伝子（「HMG1'」とする）も、本発明において使用することができる。野性型HMG-CoA還元酵素遺伝子（配列番号1）を鋳型にしたときの、PCRエラーによる塩基の置換の態様を図２Aに示す。HMG1'は配列番号３に示す塩基配列を有しており、これによってコードされるアミノ酸配列を配列番号４に示す。図２Aにおいて、ヌクレオチドの変異は、置換前の塩基（1文字表記）、HMG-CoA還元酵素遺伝子の開始コドンの第1塩基を1としたときの塩基番号、置換後の塩基（1文字表記）の順で表示してある。アミノ酸の変異は、PCRエラー型HMG-CoA還元酵素のアミノ酸配列において、置換前のアミノ酸残基（１文字表記）、HMG-CoA還元酵素のアミノ酸番号、置換後のアミノ酸残基（１文字表記）の順で表示してある。さらに、上記PCRエラー型の塩基配列を部位特異的変異誘発法等により一部修正することもでき、このような修正型のHMG-CoA還元酵素遺伝子も、本発明において使用することができる。さらに、HMG-CoA還元酵素の膜貫通ドメインと予想されている領域を欠損させた欠失体をコードするHMG-CoA還元酵素遺伝子（PCRエラー型を含む）も、本発明において使用することができる。例えば、図２Bにおいて、PCRエラー型HMG-CoA還元酵素遺伝子HMG1'の欠失型遺伝子HMG1Δの例を示す。最上段は欠失のない遺伝子HMG1'である。細線（−）で表した部分は欠失した領域である。それぞれの欠失型遺伝子において、HMG1'遺伝子（配列番号３）のうちどの領域を欠失させたのかを表１に示す。HMG1'欠失型遺伝子は、欠失のパターンに従ってHMG1Δxxyで表す。xxは欠失のパターンを、yは作業番号（任意の数字）を表す。図２Bには、HMG1Δ02yの例として「Δ026」を表示した（他の欠失パターンのものも同様に表示した）。
【００２４】
【表１】
２．組換え体の作製
本発明の組換え体は、本発明の組換えDNAを、HMG-CoA還元酵素遺伝子等（各種変異型を含む。特に記さない限り、以下同じ。）が発現し得るように宿主中に導入することにより得ることができる。ここで、宿主としては、プレニルアルコールを生産することができるものであれば特に限定されるものではないが、大腸菌又は酵母が好ましい。
本発明において、プロモーター、HMG-CoA還元酵素遺伝子等及びターミネーターを含む組換えDNAは、酵母などの単細胞真核微生物を含む真菌、大腸菌などの原核生物、動物細胞、植物細胞などに導入して組換え体を得ることができる。
【００２６】
真菌としては、変形菌類（Myxomycota）、藻菌類（Phycomycetes）、子嚢菌類（Ascomycota）、担子菌類（Basidiomycota）、不完全菌類（Fungi Imperfecti）が挙げられる。真菌としては、単細胞生物のものが工業上利用上重要な酵母としてよく知られており、子嚢菌類の子嚢菌酵母、担子菌類の担子菌酵母又は不完全菌類の不完全菌酵母が挙げられる。酵母としては、子嚢菌酵母、特に出芽酵母であるサッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae：パン酵母として知られる)、キャンディダ・ユーティリス(Candida utilis)又はピキア・パストリス(Pichia pastris)等、分裂酵母であるシゾサッカロマイセス・ポンベ(Shizosaccharomyces pombe)等が用いられる。酵母の株は、プレニルアルコールを生産することができる限り特に限定されるものではない。S. cerevisiaeの場合、例えば下記の株：A451、EUG8、EUG12、EUG27、YPH499、YPH500、W303-1A、W303-1B、AURGG101などが挙げられる。酵母への組換えDNAの導入方法は、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を採用することができる。
【００２７】
A451 (ATCC200589, MAT α can1 leu2 trp1 ura3 aro7) YPH499（ATCC76625, MATa ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ63 his3-Δ 200 leu2-Δ 1, Stratagene , La Jolla, CA）
YPH500（ATCC76626, MAT α ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-Δ63 his3-Δ 200 leu2-Δ 1, Stratagene）
W303-1A（MATa leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100）
W303-1B（MAT α leu2-3 leu2-112 his3-11 ade2-1 ura3-1 trp1-1 can1-100）
AURGG101（A451, aur1::AUR1-C）
EUG8 (A451, ERG9p::URA3-GAL1p)
EUG12 (YPH499, ERG9p::URA3-GAL1p)
EUG27 (YPH500, ERG9p::URA3-GAL1p)
【００２８】
原核生物としては、アーキア（archaea）とバクテリア（bacteria, 細菌）が挙げられる。アーキアとしては、メタノバクテリウム属(Metanobacterium)などのメタン生産菌、ハロバクテリウム属（Halobacterium）などの好塩菌、スルフォロバス属（Sulfolobus）等の好熱好酸性菌が挙げられる。バクテリアとしては、工業的又は学術的に利用価値の高い各種グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌、例えば大腸菌(Escherichia coli)等のエシェリシア属、枯草菌（Bacillus subutilis）やバシラス・ブレビス(Bacillus brevis)等のバシラス属、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）等のシュードモナス属、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)やアグロバクテリウム・リゾジェネス（Agrobacterium rhizogenes）等のアグロバクテリウム属、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）等のコリネバクテリウム属、ラクトバシラス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）等のラクトバシラス属、アクチノマイセス属（Actinomyces）やストレプトマイセス（Streptmyces）等の放線菌類(Actinomycetes)が挙げられる。
【００２９】
大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発明の組換えDNAが細胞中で自律複製可能であると同時に、転写プロモーター、リボゾームRNA結合領域としてのSD配列、本発明の遺伝子により構成されていることが好ましい。転写ターミネーターなどを適宜挿入することもできる。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。大腸菌としては、BL21、DH5α、HB101、JM101、MBV1184、TH2、XL1-Blue、Y-1088等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。転写プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrpプロモーター、lacプロモーター、PLプロモーター、PRプロモーターなどの、大腸菌やファージに由来するプロモーターが用いられる。tacプロモーターなどのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用いてもよい。細菌への組換えベクターの導入方法は、細菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、その他市販のキットを使用する方法等により行われる。
【００３０】
遺伝子が宿主細胞に導入されたか否かの確認は、PCR法、サザンブロットハイブリダイゼーション法等により行うことができる。例えば、組換え体からDNAを調製し、導入DNA特異的プライマーを設計してPCRを行う。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、SYBR Green液等により染色するか、あるいはUV検出器でDNAを検出し、増幅産物を1本のバンド又はピークとして検出することにより、導入DNAを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてPCRを行い、増幅産物を検出することもできる。
【００３１】
３．プレニルアルコールの生産
本発明において、プレニルアルコールは、導入されたHMG-CoA還元酵素遺伝子等を含む上記組換え体を培養し、その培養物から採取することにより得ることができる。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞若しくは培養菌体自体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の組換え体を培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。プレニルアルコールとしては、炭素数１５のもの、例えばファルネソール（FOH）、ネロリドール（NOH）が挙げられる。上記プレニルアルコールは、それぞれ単独で又は混合物として上記培養物中に蓄積される。
【００３２】
微生物を宿主として得られた組換え体を培養する培地は、微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、組換え体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩又はその他の含窒素化合物が挙げられ、その他ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、各種アミノ酸等が挙げられる。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等が挙げられる。培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養などの好気的条件下、26℃〜36℃、好ましくはS. cerevisiaeを宿主とした場合30℃で2〜7日、E. coliを宿主とした場合37℃で12〜18時間行う。pHの調整は、無機又は有機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養は、必要に応じてアンピシリン、クロラムフェニコール又はオーレオバシジンA等の抗生物質を培地に添加して行ってもよい。
【００３３】
プロモーターとして誘導型転写プロモーターを用いた発現ベクターを導入した組換え体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えばGAL1プロモーターを用いた場合、炭素源としてガラクトースを使用することができる。また、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）で誘導可能な転写プロモーターを有する発現ベクターで形質転換した微生物（例えば大腸菌）を培養するときには、IPTGを培地に添加することもできる。
【００３４】
上記培養条件で培養すると、宿主により高収率でプレニルアルコールを生産することができる。特に、宿主がAURGG101、ベクターがpYHMG044の場合には、培地１リットルあたり32mg以上、培養条件によっては150mg以上産生することが可能である。
本発明においては、上記培地に、さらにテルペノイド、油脂、界面活性剤等を添加してプレニルアルコールの生産効率を高めることができる。これらの添加剤として以下のものを例示することができる。
【００３５】
テルペノイド：スクアレン、トコフェロール、IPP、DMAPP
油脂：大豆油、魚油、アーモンド油、オリーブ油
界面活性剤：タージトール、トリトンX-305、スパン85、アデカノールLG109(旭電化製)、アデカノールLG294(旭電化製)、アデカノールLG295S(旭電化製)、アデカノールLG297(旭電化製)、アデカノールB-3009A(旭電化製)、アデカプロニックL-61(旭電化製)
油脂濃度は0.01％以上、好ましくは1〜3％であり、界面活性剤濃度は0.005％〜1％、好ましくは0.05〜0.5％であり、テルペノイド濃度は0.01％以上、好ましくは1〜3％である。
【００３６】
培養後、プレニルアルコールが菌体内又は細胞内に生産される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより目的のプレニルアルコールを採取する。また、細胞を破砕せずに有機溶媒等で直接抽出してもよい。あるいは、本発明のプレニルアルコールが菌体外又は細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、有機溶媒による抽出等により前記培養物中からプレニルアルコールを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製することができる。
本発明において、宿主株と、導入した組換えDNAとしてのベクターとの好ましい組み合わせ及びプレニルアルコール生産の関係を例示すると表２の通りである。
【００３７】
【表２】
表２より、例えば以下の生産量を示すことができる。
(1) 恒常発現型転写プロモーター下流にHMG1又はその変異型遺伝子(例えばHMG1')若しくはその欠失型遺伝子HMGxxyを結合したDNAをS.cerevisiae細胞に導入した場合、FOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-18.3mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-0.3mg/l生産した。
【００３９】
(2) 誘導発現型転写プロモーター下流にHMG1又はその変異型遺伝子(例えばHMG1')若しくはその欠失型遺伝子HMGxxyを結合したDNAをS.cerevisiae細胞に導入した場合、FOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-158mg/l、さらに好ましくは53-158mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-23mg/l、さらに好ましくは2.4-23mg/l生産した。
【００４０】
(3) 恒常発現型転写プロモーター下流にHMG1、誘導発現型転写プロモーター下流にHMG1'の欠失型遺伝子HMG04yを結合した2種のDNAをS.cerevisiae細胞に導入した場合、FOHを少なくとも22mg/l、好ましくは22-66mg/l生産し、NOHを少なくとも12mg/l、好ましくは12-28mg/l生産した。
【００４１】
(4) HMG1又はその変異型遺伝子(例えばHMG1')若しくはその欠失型遺伝子HMGxxyを含むDNAをS.cerevisiae A451又はA451由来株の細胞に導入した場合、FOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-158mg/l、さらに好ましくは53-158mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-23mg/l、さらに好ましくは2.4-23mg/l生産した。
【００４２】
(5) HMG1又はその変異型遺伝子(例えばHMG1')若しくはその欠失型遺伝子HMGxxyを含むDNAをS.cerevisiae YPH499又はYPH499由来株の細胞に導入した場合、FOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-18.3mg/l、さらに好ましくは5.9-18.3mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.13-0.30mg/l生産した。
【００４３】
(6) HMG1又はその変異型遺伝子(例えばHMG1')若しくはその欠失型遺伝子HMGxxyを含むDNAをS.cerevisiae YPH500又はYPH500由来株の細胞に導入した場合、FOHを少なくとも3.2mg/l、好ましくは3.2-13.6mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-0.22mg/l生産した。
【００４４】
(7) HMG1又はその変異型遺伝子(例えばHMG1')を含むDNAをS.cerevisiae細胞に導入した場合、FOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-18.3mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-2.7mg/l生産した。
【００４５】
(8) HMG1'の欠失型遺伝子HMGxxyを含むDNAをS.cerevisiae細胞に導入した場合、FOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-158mg/l、さらに好ましくは53-158mg/l生産し、NOHを少なくとも0.05mg/l、好ましくは0.05-23mg/l、さらに好ましくは2.4-23mg/l生産した。
【００４６】
(9) 大腸菌のFPP合成酵素遺伝子ispAの置換変異型遺伝子を含むプラスミドを大腸菌に導入し、IPPとDMAPPを含む培養液で培養し、フォスファターゼ処理した場合、FOHを少なくとも11mg/l、好ましくは11-90mg/l、さらに好ましくは64-90mg/l生産した。
【００４７】
(10) ispAとidiを大腸菌に入れると、IPPやDMAPPの添加なしでもフォスファターゼ処理によりFOHを少なくとも0.15mg/l、好ましくは0.15-0.16mg/l生産した。
【００４８】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００４９】
〔実施例1〕 発現ベクターの構築
Stratagene (La Jolla, CA)より購入したE. coli SURE2スーパーコンピテント細胞を宿主としてベクターの構築を行った。S. cerevisiaeゲノム調製用、ベクター導入テスト用にはYPH499 (Stratagene) を用いた。
【００５０】
(1) E. coli-S. cerevisiaeシャトルベクター
Stratagene社よりプラスミドpRS404及びpRS414（図３）を購入した。宝酒造よりpAUR123を購入し、Invitrogen社 (Carlsbad, CA) からpYES2（図４）を購入した。
【００５１】
(2) ゲノムDNA
宝酒造から酵母ゲノムDNA調製用キット「Genとるくん」を購入し、添付のプロトコルに従ってS. cerevisiae YPH499 からゲノムDNAを調製した。
【００５２】
(3) pRS414へADH1p-ADH1t断片の挿入
pRS414（図３）をNaeIとPvuIIで切断し、f1 oriとLacZ部分を含まない4.1 kbp断片をアガロースゲル電気泳動で精製した。また、pAUR123をBamHIで切断し、Klenow酵素で平滑末端にした後、アガロースゲル電気泳動でADH1転写プロモーター（ADH1p）及びADH1転写ターミネーター（ADH1t）を含む1.0 kbpの断片 (図５、配列番号17) を精製した。pRS414の 4.1kbp断片には、大腸菌と酵母の複製開始点、大腸菌用形質転換マーカーAmprと酵母用栄養要求性マーカーTRP1が残っており、pAUR123 1.0 kbp断片はADH1p 、ADH1tおよびそれらに挟まれたクローニングサイトを含んでいる。この二つの断片を宝酒造DNAライゲーションキットにより連結したのちSURE2へ形質転換した。
得られた組換え体からプラスミドDNAを調製し、SalIとScaIによるマッピングでチェックしたところ、二通りの向きでpRS414へ挿入されたプラスミドpRS414PTadh及びpRS414TPadhが得られた（図６）。
【００５３】
(4) pRSベクターへCYC1t断片の挿入
CYC1転写ターミネーターCYC1t断片はPCRで調製した。以下のPCR用オリゴDNA：XhoI-Tcyc1FW とApaI-Tcyc1RVとの組合せをPCR用プライマーDNAに用い、鋳型としてpYES2を用いた。
XhoI-Tcyc1FW：5'- TGC ATC TCG AGG GCC GCA TCA TGT AAT TAG -3'（配列番号18）
ApaI-Tcyc1RV：5'- CAT TAG GGC CCG GCC GCA AAT TAA AGC CTT CG -3'（配列番号19）
反応は、0.1 μg pYES2, 50 pmol プライマー DNA, MgSO4 含有1x pfu バッファー(Promega, Madison, WI), 10 nmol dNTP, 1.5 u Pfu DNA ポリメラーゼ (Promega)及び 1 μl perfect match ポリメラーゼエンハンサー (Stratagene)を含む50 μlの反応液を調製し、95℃ 2分、(95℃ 45秒、60℃ 30秒、72℃ 1分)×30サイクル、72℃ 5分、4℃ストックの反応条件で行った。増幅したDNAをXhoIとApaIで切断し、アガロースゲル電気泳動で260 bpのDNA断片を精製しCYC1t-XAとした。
pRS404、pRS406のXhoI-ApaI部位にCYC1t-XAを挿入し、それぞれ、pRS404Tcyc、pRS406Tcycとした。
【００５４】
(5) 転写プロモーターの調製
pAUR123又は酵母ゲノムDNAを鋳型にしてPCRにより転写プロモーターを含むDNA断片を調製した。使用したDNAプライマーは以下の通りである。
SacI-Padh1FW：5'-GAT CGA GCT CCT CCC TAA CAT GTA GGT GGC GG-3'（配列番号20）
SacII-Padh1RV：5'-CCC GCC GCG GAG TTG ATT GTA TGC TTG GTA TAG C-3'（配列番号21）
SacI-Ptdh3FW：5'-CAC GGA GCT CCA GTT CGA GTT TAT CAT TAT CAA-3'（配列番号22）
SacII-Ptdh3RV：5'-CTC TCC GCG GTT TGT TTG TTT ATG TGT GTT TAT TC -3'（配列番号23）
SacI-Ppgk1FW:5'-TAG GGA GCT CCA AGA ATT ACT CGT GAG TAA GG-3'（配列番号24）
SacII-Ppgk1RV:5'-ATA ACC GCG GTG TTT TAT ATT TGT TGT AAA AAG TAG-3'（配列番号25）
SacI-Ptef2FW:5'-CCG CGA GCT CTT ACC CAT AAG GTT GTT TGT GAC G-3'（配列番号26）
SacII-Ptef2RV:5'-CTT TCC GCG GGT TTA GTT AAT TAT AGT TCG TTG ACC-3'（配列番号27）
ADH1転写プロモーターADH1p増幅用にはSacI-Padh1FW及びSacII-Padh1RVをPCR用DNAプライマーに用い、鋳型にpAUR123を用いた。TDH3（GAP）転写プロモーターTDH3p（GAPp）増幅用にはSacI-Ptdh3FW及びSacII-Ptdh3RVをPCR用DNAプライマーに用い、PGK1転写プロモーターPGK1p増幅用にはSacI-Ppgk1FW及びSacII-Ppgk1RVをPCR用DNAプライマーに用い、TEF2転写プロモーターTEF2p増幅用にはSacI-Ptef2FW及びSacII-Ptef2RVをPCR用DNAプライマーに用い、鋳型にはそれぞれ酵母ゲノムDNAを用いた。反応溶液は、0.1 μg pAUR123又は0.46 μg 酵母ゲノムDNA, 100 pmol プライマー DNA, 1x ExTaq バッファー(宝酒造), 20 nmol dNTP, 0.5 u ExTaq DNAポリメラーゼ(宝酒造)及び1 μl perfect match ポリメラーゼエンハンサーを含む100 μl溶液を調製し、95℃ 2分、(95℃ 45秒、60℃ 1分、72℃ 2分)×30サイクル、72℃ 4分、4℃ストックの反応条件で行った。増幅した4種のDNAをSacIとSacIIで切断し、アガロースゲル電気泳動でそれぞれ620 bp、680 bp、710 bp、400 bpのDNA断片を精製し、ADH1p、TDH3p、PGK1p、TEF2pとした。
【００５５】
(6) 2μ DNA複製開始領域の調製
YEpベクターであるpYES2をSspIとNheIで切断後、2μ DNA複製開始点（2μori）を含む1.5 kbp断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、Klenow酵素で平滑末端化し、このDNA断片を2μOriSNとした。
【００５６】
(7)YEp型発現ベクターの作製
pRS404Tcyc、pRS406TcycをBAP（bacterial alkaline phosphatase, 宝酒造）処理したNaeI部位に2μOriSNを挿入し、E. coli SURE2に形質転換した後プラスミドDNAを調製した。これを、DraIII及びEcoRI、HpaI、又は、PstI及びPvuIIにより切断後、アガロースゲル電気泳動し、2μ oriの挿入とその向きをチェックした。作製したpRS404Tcyc、pRS406TcycにpYES2と同じ向きで2μoriが挿入されたプラスミドをそれぞれpRS434Tcyc2μOri、pRS436Tcyc2μOriとし、pRS404TcycにpYES2と反対向きで2μoriが挿入されたプラスミドをそれぞれpRS444Tcyc2μOri、pRS446Tcyc2μOriとした。
【００５７】
pRS434Tcyc2μOri、pRS436Tcyc2μOri、pRS444Tcyc2μOri及びpRS446Tcyc2μOriの4種のプラスミドのSacI-SacII部位に、転写プロモーターを含む断片ADH1p、TDH3p(GAPp)、PGK1p又はTEF2pを挿入しDNAをクローン化した。その結果、(i) pRS434Tcyc2μOriからpRS434ADH、pRS434GAP、pRS434PGK及びpRS434TEFが、 (ii) pRS436Tcyc2μOriからpRS436ADH、pRS436GAP、pRS436PGK及びpRS436TEFが、(iii) pRS444Tcyc2μOri からpRS444ADH、pRS444GAP、pRS444PGK及びpRS444TEFが、 (iv) pRS446Tcyc2μOriからpRS446ADH、pRS446GAP、pRS446PGK及びpRS446TEFが、それぞれ得られた（図７Ａ〜７Ｈ）。
本発明で作製した発現ベクターを整理すると表３の様になる。
【００５８】
【表３】
(8) YEp型発現ベクターの酵母への導入
作製したYEp型発現ベクターのDNA複製領域が機能するかを調べるため、各YEp型発現ベクター約40 ngをFrozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research, Orange, CA) を用いた方法でYPH499へ導入し（手順はキット同封の説明書に従った）、SD-W (DOB+CSM(-Trp), BIO101, Vista, CA) 寒天プレート上で30℃で生育してくるコロニーを調べた。結果を表４に示す。
【００６０】
【表４】
表４の結果より、本発明で作製した各YEp型ベクターは、ベクターとして正常に機能することがわかった。
【００６２】
〔実施例２〕遺伝子のクローニング
(1) PCRによるHMG-CoA還元酵素遺伝子（HMG1'遺伝子）のクローニング
S. cerevisiae HMG1'遺伝子クローニングは、以下のように行った。
GenBankにあるS. cerevisiae由来HMG1遺伝子(アクセッションナンバーM22002)(M. E. Basson, et al., Mol. Cell. Biol. 8, 3797-3808 (1988):配列番号１)の情報をもとに、コードしているタンパク質のN末端、C末端に該当する塩基配列部分のプライマーを作製し、これを用いて酵母のcDNAライブラリー（Clontech製No.CL7220-1, S. cerevisiae DBY746由来）を鋳型としたPCRを行った。
【００６３】
N末端側プライマー（プライマー１）：5'-ATG CCG CCG CTA TTC AAG GGA CT-3' (配列番号28)
C末端側プライマー（プライマー２）：5'-TTA GGA TTT AAT GCA GGT GAC GG-3' (配列番号29)
PCRは、以下の反応液中、94℃ 45秒の変性、55℃ 1分のアニーリング及び72℃ 2分の伸長を１サイクルとしてこれを30サイクル行った。
【００６４】
PCR後、アガロースゲル電気泳動により、目的の位置（3.2kbp）に断片が確認されたので、その3.2kbpDNA断片をTAクローニング可能なpT7Blue Tベクター(Novagen, Madison, WI)にクローニングし、これをpT7HMG1とした。クローニングしたHMG-CoA還元酵素遺伝子の塩基配列を決定した。その結果、配列番号３の塩基配列及び配列番号４のアミノ酸配列を確認した。決定された塩基配列は、GenBankの配列に示した塩基配列と一部異なる変異型遺伝子となっていた（図２A）。このPCRエラーを含んだ変異型HMG-CoA還元酵素のアミノ酸配列（配列番号４）をコードする遺伝子をHMG1'とする。
【００６６】
(2) HMG1'のPCRエラーの修正
変異型HMG-CoA還元酵素をコードするHMG1'を有するpT7HMG1からHMG1'断片をサブクローニングし、HMG-CoA還元酵素コード領域のPCRエラーによるアミノ酸置換変異部分を、部位特異的変異(site-directed mutagenesis)法により修正し、pALHMG106を作製した。作製方法の詳細は以下の通りである。
プラスミドpT7HMG1をクローン化HMG1'として用いた。また、部位特異的変異導入用ベクターとしてpALTER-1を使用した(Promega)。
【００６７】
部位特異的変異は、Promega発行の"Protocols and application guide, third edition, 1996 Promega, ISBN 1-882274-57-1"に記載の方法で行った。変異導入用オリゴは、次の３種類を化学合成した。
HMG1(190-216) 5'-CCAAATAAAGACTCCAACACTCTATTT-3'（配列番号30）
HMG1(1807-1833) 5'-GAATTAGAAGCATTATTAAGTAGTGGA-3'（配列番号31）
HMG1(2713-2739) 5'-GGATTTAACGCACATGCAGCTAATTTA-3'（配列番号32）
【００６８】
まず、pT7HMG1をSmaI、ApaLI、SalIで切断し、3.2kbpのHMG1断片をアガロースゲル電気泳動で調製した。これをpALTER-1のSmaI-SalI部位に挿入し、pALHMG1を作製した。pALHMG1をアルカリ変性後、上記変異導入オリゴ、リペアオリゴとしてAmp repair oligo(Promega)、ノックアウトオリゴとしてTet knockout oligo(Promega)をアニーリングさせ、E. coli ES1301(Promega)に導入後、125μg/mlアンピシリンで部位特異的変異が導入されたプラスミドを保持する形質転換体を集積培養し、プラスミドDNAを調製した。以下の配列を有するプライマーを用いて塩基配列をチェックしたところ、HMG1(190-216)、 HMG1(1807-1833)、 HMG1(2713-2739)に相当する配列は全てこれらオリゴヌクレオチドの配列に修正されていた（配列番号５）。なお、修正された配列によりコードされるアミノ酸配列（配列番号６）は、野生型HMG1によりコードされるアミノ酸配列（配列番号２）と一致しており、サイレント変異のみ残った遺伝子である。このPCRエラー修正したHMG1は、塩基配列は一部異なるが、野生型酵素と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするので遺伝子名をHMG1とし、以下、本明細書中では野生型遺伝子HMG1と区別せずに使用する。
HMG1(558-532) 5'-GTCTGCTTGGGTTACATTTTCTGAAAA-3'（配列番号33）
HMG1(1573-1599) 5'-CATACCAGTTATACTGCAGACCAATTG-3'（配列番号34）
HMG1(2458-2484) 5'-GAATACTCATTAAAGCAAATGGTAGAA-3'（配列番号35）
このHMG1内の配列が修正されたプラスミドをpALHMG106とした（図８）。
【００６９】
(3)ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子BTS1のクローニング
S. cerevisiae BTS1遺伝子（GGPP合成酵素遺伝子ともいう）のクローニングは、以下のように行った。
GenBankにあるS. cerevisiae由来GGPP合成酵素遺伝子 (アクセッションナンバーU31632)(Y. Jiang, et al., J. Biol. Chem. 270 (37), 21793-21799 (1995))の情報をもとにN末端、C末端にマッチするプライマーを作製し、これを用いて酵母のcDNAライブラリー（CL7220-1）を鋳型としたPCRを行った。
【００７０】
N末端側プライマー：5'-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG CT-3' (配列番号36)
C末端側プライマー：5'-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC TA-3' (配列番号37)
PCRは、 (1)に記載の反応液組成と同様のPCR反応液で、94℃ 45秒の変性、55℃ 1分のアニーリング及び72℃ 2分の伸長を１サイクルとしてこれを30サイクル行った。
【００７１】
PCR後、アガロースゲル電気泳動により目的の位置（約1.0kbp）に断片が確認されたので、BTS1遺伝子をTAクローニング可能なpT7Blue Tベクターにクローニングし、BTS1遺伝子の全領域の塩基配列を決定した。その結果、GenBankの配列と完全に一致し、S. cerevisiae由来の遺伝子であることを確認した。
pT7Blue TベクターをBamHI、SalI処理してBTS1遺伝子を取り出し、これを、pYES2(Invitrogen社)のBamHI、XhoIサイトに導入した。得られた組換えベクターをpYESGGPSとした。
【００７２】
(4) Escherichia coli由来のFPP合成酵素遺伝子ispAのクローニング
E. coliゲノムDNAは、E. coli JM109 (Takara) から次の方法で調製した。JM109を 1.5 ml 2xYT培地で培養後、遠心により集菌し、567 μlのTE (pH 8.0)、 3μlの20 mg/ml proteinase-K (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) 及び30μlの10% SDSを加え、37℃で1時間保温後、100 μlの5M NaClを加え混合した。これに、80 μlのCTAB/NaCl溶液 (10% CTAB, 0.7 M NaCl) を加え、65℃で10分加熱した。これを700 μlのクロロホルム /イソアミルアルコール (24:1) で抽出し、水層画分をさらに600 μlのフェノール/クロロホルム /イソアミルアルコール (25:24:1) で抽出した。抽出後の水層画分に0.6 容量のイソプロパノールを加えて遠心した。沈殿画分を70% エタノールで洗い、乾燥後100 μlのTE (pH 8.0)に溶解し大腸菌ゲノムDNA溶液とした。DNAをOD260で測定、定量後、DNA濃度が1 μg/μlになるようにTEで調製した。
【００７３】
E. coliゲノムDNAを鋳型にし、以下の合成オリゴDNAをプライマーに用いてPCRによりE. coli由来のFPP合成酵素遺伝子ispAのクローニングを行った。
ISPA1:5'-TGA GGC ATG CAA TTT CCG CAG CAA CTC G-3'( 配列番号 68)
ISPA2:5'-TC AGA ATT CAT CAG GGG CCT ATT AAT AC-3'( 配列番号 69)
1x ExTaq バッファー、0.5 mM dNTP、100 pmol ISPA1、100 pmol ISPA2、0.2 μg E. coli ゲノムDNA、5 u ExTaqを含んだ100 μlの反応溶液で、94℃ 1 分、55℃ 1 分、72℃ 1.5分を30サイクル繰り返すことでPCRを行った。PCR産物はEcoRIとSphIで切断後、アガロースゲル電気泳動で 1.0 kbpのDNA断片を精製し、pALTER-Ex2 (Promega) のEcoRI-SphI部位に挿入し、E. coli JM109へ導入し遺伝子クローニングを行った。EcoRI、SphI、NdeI、SmaI、BamHIを用いた制限酵素マッピングにより正しくispA遺伝子（配列番号77）が導入されたプラスミドpALispA4、pALispA16 、pALispA18が得られた。
【００７４】
(5) 変異型FPP合成酵素遺伝子の作製
pALispA16を用いて、Promega発行の "Protocols and applications guide, third edition, 1996 Promega, ISBN 1-882274-57-1"に 記載のプロトコルに従って、E. coli ispAにコードされるポリペプチドの79番目のアミノ酸残基Tyrをコードしているコドンを置換変異により改変した。以下の変異導入用オリゴヌクレオチド（変異オリゴともいう）は、化学合成法により調製した。
【００７５】
ISPA-D: 5'-ATC ATG AAT TAA TGA GTC AGC GTG GAT GCA TTC AAC GGC GGC AGC-3'（配列番号70）
ISPA-E: 5'-ATC ATG AAT TAA TGA TTC AGC GTG GAT GCA TTC AAC GGC GGC AGC-3'（配列番号71）
ISPA-M: 5'-ATC ATG AAT TAA TGA CAT AGC GTG GAT GCA TTC AAC GGC GGC AGC -3'（配列番号72）
【００７６】
上記変異オリゴISPA-Mは、第16番目〜第18番目の塩基（3塩基を下線で示した部分）が野性型では79番目のTyrをコードしているコドンであるため、Metをコードするように設計したものである。同様にして、変異オリゴISPA-D、変異オリゴISPA-Eは、それぞれAsp、Gluをコードするように設計したものである。上記変異オリゴにおいて、第26番目〜第31番目の塩基（６塩基を下線で示した部分）は、置換変異導入より新たにEcoT22I (NsiI) 部位ができるように設計し、変異遺伝子が制限酵素マッピングにより容易に区別できるように計画した配列である。変異オリゴは、あらかじめ、T4 ポリヌクレオチドキナーゼ (Promega)により5'末端をリン酸化し、Nick Culumn (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) を用いてゲル濾過精製してある。変異導入の際にはリペアオリゴとしてCm repair oligo (Promega)を、ノックアウトオリゴとしてTet knockout oligo (Promega)を用いた。アルカリ変性させたpALispA16にCm repair oligo、Tet knockout oligo、変異オリゴをアニールさせE. coli ES1301 mutS (Promega)へ形質転換した。20 μg/ml のCm (クロラムフェニコール) 共存下で生育してきた大腸菌からプラスミドDNAを調製し、E. coli JM109へ形質転換し、20 μg/ml Cm寒天プレート上で生育してきたコロニーからプラスミドDNAを調製した。pALispA4を鋳型にし、ISPA-D、ISPA-E、ISPA-Mを変異オリゴに用いて作製した置換変異型ispA(これをispAmという)を含むプラスミドを、それぞれp4D、p4E、p4Mとした。同様に、pALispA16を鋳型にして作製したプラスミドをそれぞれp16D、p16E、p16Mとし、pALispA18を鋳型にして作製したプラスミドをそれぞれp18D、p18E、p18Mとした。
【００７７】
(6)IPPΔ-イソメラーゼ遺伝子idiのクローニング
大腸菌IPPΔ-イソメラーゼ遺伝子は、以前の命名ではORF182（NCBI BLASTサーチによる；GenBankアクセッション番号AE000372）としていたが、Hahn et al. (1999) J. Bacteriol., 181, 4499-4504によりidiと名付けられている。idi（配列番号85；配列番号86に示すアミノ酸配列をコードする）をクローニングしたプラスミドとしては、Hemmi et al. (1998) J. Biochem., 123, 1088-1096 記載のp3-47-11とp3-47-13を用いた。
【００７８】
(7) Bacillus stearothermophilus FPP合成酵素遺伝子のクローニング
特開平5-219961記載のpFE15をNotIとSmaIで切断後、2.9kbpの転写単位を含んだBacillus stearothermophilus FPP合成酵素遺伝子(以下fpsとする)（配列番号75；配列番号76に示すアミノ酸配列をコードする）断片を精製し、pACYC177 (日本ジーン)のScaI部位に挿入し、これをpFE15NS2.9-1とした。
【００７９】
〔実施例3〕 遺伝子の発現ベクターへの挿入
(1) pRS発現ベクターへのサブクローニング
今回作製した恒常発現型転写プロモーターをもつE. coli- S. cerevisiae YEp型シャトルベクターである各pRSベクター（図６、図７）を用いて、HMG1遺伝子を発現ベクターに導入した。
【００８０】
PCRエラーを修正したHMG-CoA還元酵素遺伝子を含むpALHMG106 （図８）をSmaIとSalIで切断後、アガロースゲル電気泳動で3.2 kbpのHMG1遺伝子断片を精製した。これをpRS434GAP、pRS444GAP、pRS434TEF、pRS444TEF、pRS434PGK及びpRS444PGKのSmaI-SalI部位へ挿入した。サブクローン化したプラスミドは、XhoI、SpeI、NaeI及びSphIの各制限酵素マッピングと、挿入された3.2 kbp HMG1遺伝子断片のボーダー領域の塩基配列確認により物理地図をチェックし、計画通りに作製できたプラスミドを選抜した。選抜したプラスミドは、それぞれ、pRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1、pRS434TEF-HMG1、pRS444TEF-HMG1、pRS434PGK-HMG1、pRS444PGK-HMG1とした。
【００８１】
(2) pRS414PTadh-HMG1又はpRS414TPadh-HMG1の作製
恒常発現型転写プロモーターADH1pを含むベクターpRS414PTadh、pRS414TPadh（図６）を制限酵素SmaIとSalIで処理し、(1)と同様の操作を行い、HMG1遺伝子が挿入されたプラスミドpRS414PTadh-HMG1及びpRS414TPadh-HMG1を作製した。
【００８２】
(3) HMG1'発現用プラスミドpYES-HMG1の作製
実施例２(1) で作製したpT7HMG1をBamHI、SalI、ScaI処理してPCRエラーによる変異型HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子HMG1'を取り出し、これをpYES2(Invitrogen, Carlsbad, CA)のBamHI-XhoI部位に導入した。得られた組換えベクターをpYES-HMG1とした。ベクター内の塩基配列決定を行ったところ、配列番号３に示す塩基配列であることを確認した。なお、pYES2は、複製起点として酵母２μmDNAのori、及びガラクトースで誘導可能なGAL1転写プロモーターをもつ酵母発現用シャトルベクターである（図4）。
【００８３】
(4) 欠失型HMG1'発現用プラスミドpYHMGxxyの作製
HMG-CoA還元酵素触媒部位と考えられている部分より上流の領域をコードする塩基配列を欠損させた欠失型HMG-CoA還元酵素遺伝子発現ベクターを作製するため、(3)で作製したpYES-HMG1を鋳型として、PCR法でベクター部分とともにHMG1'コード領域の一部分を欠失させた断片を調製した。得られた断片をKlenow酵素で平滑末端にした後、セルフライゲーションにより再び環化し、E. coli JM109へ形質転換させ、プラスミドDNAを調製した。プライマーとして使用した合成DNA配列とその組合せを表１に示した。
【００８４】
得られたプラスミドDNA内のHMG1上流、下流のアミノ酸の読み枠がずれていないことと、その結合部位近辺にPCRエラーによるアミノ酸置換が起きていないことを373A DNA sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA) で確認した。その結果、結合部位近辺にPCRエラーによるアミノ酸置換がなく、読み枠がずれずに遺伝子を欠失する事のできた以下のプラスミドを得た。欠失型HMG1遺伝子は、欠失のパターンに従ってΔ02y（yは任意の作業番号を表す）のように記載し、Δ02yを含むpYES2ベクターを例えばpYHMG026と記すこととする（他の欠失体も同様）。
【００８５】
HMG1Δ02y：配列番号7
HMG1Δ04y：配列番号8
HMG1Δ05y：配列番号9
HMG1Δ06y：配列番号10
HMG1Δ07y：配列番号11
HMG1Δ08y：配列番号12
HMG1Δ10y：配列番号13
HMG1Δ11y：配列番号14
HMG1Δ12y：配列番号15
HMG1Δ13y：配列番号16
ベクター：pYHMG026, pYHMG027, pYHMG044, pYHMG045, pYHMG062, pYHMG063, pYHMG065, pYHMG076, pYHMG081, pYHMG083, pYHMG085, pYHMG094, pYHMG100, pYHMG106, pYHMG107, pYHMG108, pYHMG109, pYHMG112, pYHMG122, pYHMG123, pYHMG125, pYHMG133
【００８６】
〔実施例4〕 AURGG101の作製
実施例2(3)に記載のpYESGGPSを鋳型にして、プライマーPYES2(1-27)とPYES2(861-835)を用いてPCR法により、GAL1転写プロモーター＝BTS1＝CYC1転写ターミネーターの一次構造(GAL1p-BTS1-CYC1t)を持つ1.9kbpのSalI断片を調製した。
【００８７】
PYES2(1-27):5'-GGC CGC AAA TTA AAG CCT TCG AGC GTC-3'（配列番号73）
PYES2(861-835): 5'-ACG GAT TAG AAG CCG CCG AGC GGG TGA-3'（配列番号74）
この断片をpAUR101(Takara)のSalI部位へ挿入し、pAURGG115を得た。pAURGG115内のBTS1遺伝子にPCRエラーがないことはDNAシークエンシングにより確認した。
【００８８】
pAURGG115をEcoO65Iで線状化し、酢酸リチウム法でA451株へ導入し、1μg/mlオーレオバシジンを含むYPD寒天プレート (1%酵母エキス, 2% ペプトン, 2% デキストロース, 2% 寒天) 上で30℃で生育してくるコロニーを形質転換体とした。
得られた形質転換体は、もう一度オーレオバシジン選択プレート上でシングルコロニー選抜した。
その結果、A451を宿主とした組換え体としてAURGG101及びAURGG102の2クローンが得られ、本発明ではAURGG101をA451由来宿主株の１つとして用いた。
【００８９】
なお、サザンブロットハイブリダイゼーション（図９）とPCRマッピング（図10）で明らかになったように、AURGG102はBTS1がゲノムにインテグレートしているが、AURGG101はインテグレートしておらず、AUR1がマーカー遺伝子のAUR1-Cに単に置き換わったものであることが分かっている。AUR1はプレニルアルコール又はプレニル二リン酸合成と直接関与していないので、AURGG101はA451由来宿主株の例として使用できる。
サザンブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、PCRマッピングは、後述の実施例6に方法を記載してある。
【００９０】
〔実施例5〕 各EUG株の作製
酵母ゲノムデータベースから、スクアレン合成酵素遺伝子ERG9付近の遺伝子地図を引き出し、ERG9転写プロモーター (ERG9p) 置換用DNA断片増幅のためのPCRプライマーDNAを設計した。形質転換体選択マーカー遺伝子URA3と転写プロモーターGAL1pを含む1.8 kbp DNA断片は、pYES2をNaeIとNheI切断後Klenow酵素で平滑末端化し、セルフライゲーションにより2μ ori部分を削除したpYES2Δを鋳型にしてPCR増幅により調製した。
【００９１】
PCRで使用したプライマーは以下の通りである。
E-MCSf：5'- GCC GTT GAC AGA GGG TCC GAG CTC GGT ACC AAG-3'（配列番号49）
E-URA3r：5'- CAT ACT GAC CCA TTG TCA ATG GGT AAT AAC TGA T-3'（配列番号50）
上記プライマーには、S.cerevisiae ゲノム中のオープンリーディングフレームYHR189Ｗの下流部分を含む0.7 kbpDNA断片とERG9の上流部分を含む 0.9 kbp DNA断片とでT/AライゲーションできるようにEam1105I認識部位（下線部分）を加えてある。YHR189Ｗ断片は、PCRプライマーYHR189WfとYHR189Wrを用いてYPH499ゲノムDNAを鋳型にPCRにより調製し、ERG9断片は、PCRプライマーERG9fとERG9rを用いてYPH499ゲノムDNAを鋳型にPCRにより調製した。YPH499ゲノムDNAは、「Genとるくん」を用いて調製した。
【００９２】
YHR189Wf：5'-TGT CCG GTA AAT GGA GAC-3'(配列番号51)
YHR189Wr：5'-TGT TCT CGC TGC TCG TTT-3'(配列番号52)
ERG9f：5'-ATG GGA AAG CTA TTA CAA T-3'(配列番号53)
ERG9r：5'-CAA GGT TGC AAT GGC CAT-3'(配列番号54)
1.8 kbp DNA断片をEam1105Iで消化後、0.7 kbpDNA断片とライゲーションし、これを鋳型にしてプライマーYHR189WfとE-MCSfを用いて2nd PCRを行った。増幅した2.5 kbp DNA断片をEam1105Iで消化後、0.9 kbp DNA断片とライゲーションし、これを鋳型にしてプライマーYHR189W-3fとERG9-2rを用いて3rd PCRを行った。増幅した3.4 kbp DNA断片を形質転換用DNA断片とした。
【００９３】
YHR189W-3f：5'-CAA TGT AGG GCT ATA TAT G-3'(配列番号55)
ERG9-2r：5'-AAC TTG GGG AAT GGC ACA-3'(配列番号56)
Zymo Research (Orange, CA) より購入したFrozen EZ yeast transformation II kitを用いて酵母にベクターの導入を行った。組換え体は、SGR培地（SD培地のグルコース成分をガラクトースとラフィノースで置き換えたもの）をベースにし、CSM(-URA) (BIO 101 (Vista, CA) より購入) と終濃度40 mg/lになるようにアデニン硫酸塩を加えた寒天培地（SGR-U培地）上で30℃で培養し、生育してきた菌体をもう一度同じ培地に広げ、培養しシングルコロニーアイソレーションを行った。
【００９４】
取得した組換え体は、EUG (ERG9p::URA3-GAL1p) 株と名付け、A451由来のクローンをEUG1〜10、YPH499由来のクローンをEUG11〜20、YPH500由来のクローンをEUG21〜30とした。
SD培地でグルコースリプレッションによりERG9発現が阻害され生育抑制のかかったクローンを選抜し、A451からEUG8が、YPH499からEUG12が、YPH500からEUG27が得られた。
なお、EUG8、EUG12、EUG27から「Geneとるくん」を用いてゲノムDNAを調製し、これを鋳型にしてPCRを行った結果、URA3とGAL1pを含む1.8 kbp のPCR断片がゲノム中のERG9コード領域上流にインテグレートされていることを確認した。
【００９５】
〔実施例6〕 遺伝子解析、酵素活性解析
本実施例では、作製した各種組換え酵母（各組換え体の作製については、後述するプレニルアルコールの生産についての実施例7、8を参照）の遺伝子発現を、プレニル二リン酸合成酵素の酵素活性、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、サザンブロットハイブリダイゼーション、PCRマッピングの各種手法を用いて解析した。作製した組換え体のうち、下記宿主株、組換え体を用いた。宿主への各ベクターの導入は、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., pp.13.7.1-13.7.2 に記載の酢酸リチウム法、又は、Frozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research, Orange, CA) を用いた方法で導入した（手順はキット同封の説明書に従った）。なお、1-2株はpYES-HMG1をA451株に導入したものであり、3-2株はpYHMG044をA451に導入したものであり、13-2株はpYES-HMG1をAURGG101に導入したものであり、15-2はpYHMG044をAURGG101に導入したものである。
【００９６】
No.1 宿主株：A451
No.2 GAL1p-BTS1 (YIp)：AURGG101 (A451,aur1::AUR1-C)
No.3 GAL1p-BTS1 (YIp)：AURGG102 (A451,aur1::BTS1-AUR1-C)
No.4 GAL1p-HMG1 (YEp)：1-2 (pYES-HMG1/A451)
No.5 GAL1p-HMG1Δ(YEp)：3-2 (pYHMG044/A451)
No.6 GAL1p-HMG1(YEp)：13-2 (pYES-HMG1/AURGG101)
No.7 GAL1p-HMG1Δ(YEp)：15-2 (pYHMG044/AURGG101)
【００９７】
No.1-No.7の株を26℃で培養した1 mlの前培養液を生理食塩水で洗い、100 mlの培養液へ加え、300 mlの三角フラスコ内で26℃、1分あたり120回の往復振盪で培養した。培地はSDおよびSG（SD培地のグルコースをガラクトースに置き換えたもの）を用いた。URA3マーカーを保持している組換え体はSD-U（SDにCSM(-URA)を加えたもの）又はSG-U（SGにCSM(-URA)を加えたもの）培地にし、AURGG株はオーレオバシジンを1 μg/lになるように加えた。
菌体増殖はOD600で測定し、OD600が3-4程度になった時点（23-52時間）で培養を止め、氷中で冷却し、以下に記載のDNA調製、RNA調製、粗酵素液調製を行った。
【００９８】
(1) サザンブロッティング
酵母DNA精製キット「Genとるくん」を用いて酵母DNAの調製を行った。手順は、キット添付のプロトコルに従った。
酵母より調製したDNAは、NdeIおよびStuIで切断後1レーンあたり3 μgを0.8%アガロースゲル電気泳動した。分子量マーカーは、Promega社 (Madison, WI) の 1 kb ラダーとλ/HindIIIをそれぞれ0.5 μg使用した。泳動後、定法に従ってアルカリ変性、中和し、Hybond Nナイロンメンブレン (Amersham, Buckinghamshire, England) に20 x SSCによるキャピラリーブロットで転写した。転写後、メンブレンはStratagene社のUV cross-linkerでoptimal cross-linkの条件で紫外線照射し、DNAをメンブレン上に固定した。
【００９９】
(2) ノーザンブロッティング
Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., pp.13.12.2-13.12.3 記載の方法を一部改変してRNAを調製した。上記改変は、調製したRNAサンプルをさらにDNase Iで処理した点である。
【０１００】
フォルムアルデヒド変性アガロースゲル電気泳動によりRNAを分離後、定法に従って、Hybond Nナイロンメンブレンに20 x SSCによるキャピラリーブロットで転写した。１レーンあたりtotal RNA は5 μg泳動した。分子量マーカーはDIG-RNA Marker I 20 ngを使用した。転写後、メンブレンはStratagene社のUV cross-linkerでoptimal cross-linkの条件で紫外線照射し、RNAをメンブレン上に固定した。
【０１０１】
(3) PCRマッピング
実施例４で作製したYIp型ベクターであるpAURGG115由来の断片が、ゲノムにどのようにインテグレートされているかを調べるために、調製した酵母DNA 0.3-0.6 μgを鋳型にし、合成オリゴヌクレオチドAUR-FWcとAUR-RVc、およびAUR-SAL1とAUR-SAL2 との各組合せをプライマーに用いてPCRを行った。PCRは94℃30 秒, 55℃1 分, 72℃3 分を30サイクル繰り返す条件で行った。
AUR-FWc: 5'-TCT CGA AAA AGG GTT TGC CAT-3' (配列番号57)
AUR-RVc: 5'-TCA CTA GGT GTA AAG AGG GCT-3' (配列番号58)
AUR-SAL1: 5'-TGT TGA AGC TTG CAT GCC TGC-3' (配列番号59)
AUR-SAL2: 5'-TTG TAA AAC GAC GGC CAG TGA-3' (配列番号60)
【０１０２】
(4) DIGラベルプローブDNAの作製
ハイブリダイゼーションプローブはProbe I、II、III及びVの4種を作製した（表５）。
【０１０３】
【表５】
プローブI:
合成オリゴヌクレオチドSCFPS1 とSCFPS2をプライマーにしてClontech社 (Palo Alto, CA) S. cerevisiae cDNA ライブラリよりPCR断片をpT7blue Tベクター (Novagen, Madison, WI)へクローニングし、pT7ERG20を作製した。
【０１０５】
SCFPS1: 5'-ATG GCT TCA GAA AAA GAA ATT AG-3' (配列番号61)
SCFPS2: 5'-CTA TTT GCT TCT CTT GTA AAC TT-3' (配列番号62)
pT7ERG20を鋳型にしてSCFPS1とSCFPS2をプライマーに用い、PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) によりDIGラベルプローブDNAを作製した。実験条件はRoche Diagnostics社添付のプロトコルに従った。
PCRは94℃30秒, 58℃1分, 72℃3分のサイクルを30サイクル繰り返す条件で行った。なお、DIGラベルプローブDNAは、反応後アガロースゲル電気泳動により合成状態をチェックした。
【０１０６】
プローブ II:
合成オリゴヌクレオチドBTS1(1-21) 及びBTS1(1008-988)をプライマーにし、pYESGGPS (実施例2(3)参照) を鋳型にしてプローブIと同様にしてDIGラベルプローブDNAを作製した。
BTS1(1-21): 5'-ATG GAG GCC AAG ATA GAT GAG-3' (配列番号63)
BTS1(1008-988): 5'-TCA CAA TTC GGA TAA GTG GTC-3' (配列番号64)
【０１０７】
プローブIII:
合成オリゴヌクレオチドHMG1(1267-1293)とHMG1(2766-2740)をプライマーにし、pYES-HMG1 (実施例3(3)参照) を鋳型にしてプローブIと同様にしてDIGラベルプローブDNAを作製した。
HMG1(1267-1293): 5'-AAC TTT GGT GCA AAT TGG GTC AAT GAT-3' (配列番号42)
HMG1(2766-2740): 5'-TCC TAA TGC CAA GAA AAC AGC TGT CAC-3' (配列番号65)
【０１０８】
プローブ V:
合成オリゴヌクレオチドAUR-FWとAUR-RVをプライマーにし、pAUR123 (宝酒造)
を鋳型にしてProbe Iと同様にしてDIGラベルプローブDNAを作製した。
AUR-FW: 5'-ATG GCA AAC CCT TTT TCG AGA-3' (配列番号66)
AUR-RV: 5'-AGC CCT CTT TAC ACC TAG TGA-3' (配列番号67)
【０１０９】
(5) ハイブリダイゼーションとプローブの検出
サザンブロットハイブリダイゼーションは、20 ng/mlのプローブ濃度でDIG Easy Hyb (Roche) を用いて42℃24時間行った。ノーザンブロットハイブリダイゼーションは、100 ng/mlのプローブ濃度でDIG Easy Hybを用いて50℃24時間行った。それぞれ、あらかじめハイブリダイゼーションと同じ温度でDIG Easy Hyb溶液で24時間プレハイブリダイゼーションを行ってある。ハイブリダイゼーション後、2x SSC, 0.1% SDS, 65℃, 10 分で3回、0.2x SSC, 0.1% SDS, 65℃, 15-20 分で2回、それぞれ洗浄した。洗浄後メンブレンはDIG Luminescent Detection Kit (Roche) でDIGラベルプローブを化学発光させ、X線フィルムに感光させ可視化した。
【０１１０】
(6) 酵素活性測定
各培養液から遠心により菌体を集め、RNA調製と同様にして4℃でガラスビーズで菌体を破砕後、滅菌水に懸濁した。微量冷却遠心機を用いて12,000 r.p.m.で10分遠心し、その上清を粗酵素画分とした。粗酵素画分中のタンパク質濃度は、Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA)でBSAを標準タンパク質として測定した。粗酵素液10 μgを用い下記の200 μl反応カクテル中で、37℃で40分間反応させた。
【０１１１】
反応後、水飽和ブタノールで伸長したプレニル二リン酸を抽出し、一部は液体シンチレーションカウンターで放射活性を測定した。残りのサンプルは、Koyamaらの方法 (Koyama T., Fujii, H. and Ogura, K. 1985. Meth. Enzymol. 110: 153-155) に従ってジャガイモ酸性フォスファターゼで脱リン酸化後、薄層クロマトグラフィー（プレートLKC18 (Whatman, Clifton, NJ)、展開液H2O/acetone=1:19）で展開し、Bio Image Analyzer BAS2000 (Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)でオートラジオグラムを可視化し、相対放射活性を測定した。
【０１１３】
(7) 結果と考察
(7-1) サザンブロットハイブリダイゼーションとPCRマッピング
サザンブロットハイブリダイゼーションの結果を図９に示す。また、AUR1近辺のPCRによるマッピングの結果を図10に示す。図９及び図10において、各レーン１〜７は、(6)において使用した株の番号（No.1〜No.7）にそれぞれ対応する。NはNdeI消化、SはStuI消化DNAのレーンを示す。各レーンのDNAは以下の株より調製した。
【０１１４】
レーン１, A451; レーン2, AURGG101; レーン3, AURGG102; レーン4, pYES-HMG1/A451; レーン5, pYHMG044/A451; レーン6, pYES-HMG1/ AURGG101; レーン7, pYHMG044/AURGG101
ERG20（FPP合成酵素遺伝子）は全ての株で同一であり、ERG20遺伝子の周辺のゲノムに変化がないことがわかった（図９）。
【０１１５】
BTS1（GGPP合成酵素遺伝子）とAUR1をプローブに用いたところ、AURGG102株では、AUR1部分にBTS1がインテグレーションされていたが、AURGG101では宿主のA451と変わらなかった。AURGG101はAUR1遺伝子部分のみがpAUR101由来のAUR1-C遺伝子に置換変異しただけで、GAL1p-BTS1断片はゲノムに組み込まれていないことがわかった。PCRによって、ゲノムインテグレーションの結果生じるAUR1遺伝子座の重複を検出したところ、やはりAURGG101由来の株ではバンドが検出されず、AURGG102株のみでバンドが検出された （図10）。
【０１１６】
図９において、HMG1をプローブにしたときには、NdeI切断の時プラスミド由来のバンドがみられた（No.4-7）。また、StuI切断では1-2株（No.4）の様に8.2 kbpのプラスミド由来のバンド（8.3 kbpのゲノム由来のバンドと重なっている）が生じるはずなのに、13-2株（No.6）、15-2株（No.7）ではゲノム中のHMG1付近と導入したプラスミド間で組換えが起こりバンドシフトがみられた。
サザンブロットハイブリダイゼーションとPCRマッピングの結果から、今回使用した株の遺伝子型は表６のようにまとめることができる。表中、AURはオーレオバシジンを加えた培地で、培地1が前培養培地、培地2が本培養用の培地を示す。
【０１１７】
【表６】
(7-2) ノーザンブロットハイブリダイゼーション
ノーザンブロットハイブリダイゼーションの結果を図11に示す。プローブは、表５のI、II、IIIを使用した。
【０１１９】
図11において、各レーン１〜７は図９と同様である。また、−はSD培地での転写産物を、＋はSG培地での転写産物を示す。
ERG20の転写産物は、SG培地でGAL1p転写誘導をかけたときに13-2株（No.6）、15-2株（No.7）で低下する傾向がみられた。
SG培地によりGAL1転写プロモーター制御下の遺伝子の転写誘導を行ったところ、BTS1転写産物は、GAL1p-BTS1断片がゲノムにインテグレートされている株、すなわちAURGG102（No.3 ）でのみ誘導が増加していた。
しかしながら、HMG1転写産物と比較すると、その転写誘導の度合いは低いことが分かる。HMG1転写産物は、SG培地による転写誘導で、プラスミドによりGAL1p-HMG1断片が導入された株（No.4-7）で顕著に増加した。
【０１２０】
(7-3) プレニル二リン酸合成酵素活性
アリル性二リン酸基質としてゲラニル二リン酸（GPP）と14CラベルしたIPPとを用いて、粗酵素液中のプレニル二リン酸合成酵素活性を調べた。
【０１２１】
GPPと[14C]IPPを基質として合成された各プレニル二リン酸を脱リン酸化し、TLC展開の後各スポットの放射活性を調べたところ、 FPP合成酵素活性が高く、次に、GGPP合成酵素活性に比べてはるかに高いHexPP（ヘキサプレニル二リン酸）合成酵素活性が検出された。そこで、オートラジオグラムから反応産物の相対量を計算し、総タンパク質あたりの比活性を計算した。その結果を図12に示す。図12は、左上パネルがFPP合成酵素(FPS)活性、左下パネルがGGPP合成酵素(GGPS)活性、右上パネルがHexPP合成酵素(HexPS)活性、右下パネルがPTase（総プレニル二リン酸合成酵素）活性を示す。また、灰色の棒はSD培地での結果を、白色の棒はSG培地での結果を示す。総プレニル二リン酸合成酵素活性のうちの多くがFPP合成酵素活性であり、SG培地による活性上昇がみられた。特に、FOHを大量生産する（実施例9参照）13-2株（No.6）と15-2株（No.7）で顕著に増加していた。全体的には、GPPをアリル性基質にしたときのGGPP合成酵素活性はFPP合成酵素活性の20000分の一、HexPP合成酵素活性の300分の一程度である。HexPP合成酵素活性はSG培地で低下した。
【０１２２】
〔実施例7〕 組換え体の培養とプレニルアルコール生産
(1) 恒常発現型プロモーターを連結したHMG1遺伝子をA451に導入した場合
（「恒常発現プロモーター；HMG1；A451」のように表記する。以下同様。）のプレニルアルコール生産
FOH高生産組換え体を工業利用するには、恒常発現型プロモーターを利用すると安価な通常培地を利用できるので有利である。そこで、予備実験においてFOHを産生する可能性のあることが認められた酵母（S. cerevisiae）A451株（ATCC200589）を宿主に用い、恒常発現型プロモーター制御下でHMG1遺伝子を発現させた。
【０１２３】
恒常発現型プロモーターGAPp (=TDH3p)を含むベクターpRS434GAP又はpRS444GAPにHMG1遺伝子（PCRエラー修正後の遺伝子）を挿入し、それぞれpRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1を作製し、A451 に導入した。得られた組換え体をpRS434GAP-HMG1/A451、pRS444GAP-HMG1/A451とした。
【０１２４】
HMG-CoA還元酵素遺伝子を導入した酵母について、任意に10個のコロニーを選択した。選んだコロニーから、マーカー遺伝子TRP1に応じたSD選択培地であるSD-W培地（SDにCSM(-TRP)を加えたもの。以下同様。）に菌株を接種し、前培養を行った。その後、前培養液250μl（恒常発現型プロモーターを使用した酵母を用いて前培養を行った場合の添加量。以下同様。）を2.5 mlのYM培地に加え、26℃で4日間、130 r.p.m.の往復振盪培養で培養した。
【０１２５】
培養後、培養液にメタノールを2.5ml加えて混合後、ペンタンを約5ml加えて激しく撹拌し、静置した。ペンタン層を新しいガラス試験管にとり、ドラフト中でペンタンを気化させ溶質成分を濃縮後、ガスクロマトグラフィー/質量分析（GC/MS）でプレニルアルコールを同定し、内部標準としてウンデカノールを用いて定量した。また、その際、菌体増殖の度合いを調べるため、培養液50μlを水で30倍に希釈し、600nmの吸光度を測定した。
GC/MSは、HP6890/5973 GC/MSシステム(Hewlett-Packard, Wilmington, DE) を用いた。使用カラムはHP-5MS (0.25 mm x 30 m、フィルム厚0.25 μm)であり、分析条件は以下の通りである。本明細書中でのGC/MS分析条件は、全て同様である。
【０１２６】
インレット温度 250℃
検出器温度 260℃
[MS ゾーン温度]
MS Quad 150℃
MS Source 230℃
マススキャン範囲 35-200
[インジェクションパラメーター]
自動インジェクションモード
サンプル容量 2 μl
3回のメタノール洗浄及び2回のヘキサン洗浄
スプリット比 1/20
キャリヤーガス ヘリウム 1.0 ml/分
溶媒遅延 2 分
[オーブン加熱条件]
115℃ 90 秒
70℃ /分で250℃まで加熱し、2分間維持
70℃ /分で300℃まで加熱し、7分間維持
時間0後
内部標準 エタノール中0.01 μl 1-ウンデカノール
信頼標準 (E)-ネロリドール (エーザイ)
(all-E)-ファルネソール (Sigma)
(all-E)-ゲラニルゲラニオール (エーザイ)
スクアレン (東京化成工業)
【０１２７】
プレニルアルコールの生産量を測定した結果を図13〜15に示す。図13のpRS434 No.3からさらに10コロニーとったときの結果が図14であり、図13に示すデータをまとめた図が図15である。図13のNo:10(pRS434)のコロニーにおいて4.9mg/lのFOH生産が認められた。また、図15において、434、444は、それぞれpRS434GAP、pRS444GAPベクターを用いたときの結果を表す。一番右のグラフが遺伝子導入前の宿主(A451)を培養したときの結果を示す。
【０１２８】
この結果より、A451を宿主に用いると、pRS434GAP-HMG/A451ではNOH、FOHとも生産性が向上し、HMG1遺伝子の転写を活性化させるだけでFOHは平均3.8mg/l、コロニーによっては、最高で11.2mg/l生産された（図13）。pRS444GAP-HMG1/A451ではNOHは最高0.16mg/lであり、FOH生産に主に有効であることが分かった。
【０１２９】
これは、YPH499などの通常用いられている組換えDNA宿主株と比較して、A451はスクアレン合成酵素活性とメバロン酸経路活性のバランスとが異なっており、HMG1遺伝子の多コピー化又は転写活性化により中間代謝産物のファルネシル二リン酸(FPP) が蓄積され、結果としてその脱リン酸化物のFOHが生産されると考えられる。つまり、A451と同様なスクアレン合成酵素活性とメバロン酸経路活性のバランスを有している株であれば、どの株でも同様にHMG1導入でFOH生産が期待できることになる。FOH生産に関しては、pRS444GAPをベクターとして用いたときよりpRS434GAPを用いたときの方が生産性がよい傾向がみられた。
【０１３０】
(2) 恒常発現型プロモーター；HMG1; YPH499
恒常発現型プロモーターADH1p、 GAPp (=TDH3p)、PGK1p又はTEF2pを含むベクターpRS414PTadh、pRS414TPadh、pRS434GAP、pRS444GAP、pRS434PGK、pRS444PGK、pRS434TEF又はpRS444TEFに、それぞれHMG1遺伝子（PCRエラー修正後の遺伝子）を挿入した以下のプラスミドをYPH499へ導入した。
【０１３１】
pRS414PTadh-HMG1
pRS414TPadh-HMG1
pRS434GAP-HMG1
pRS444GAP-HMG1
pRS434PGK-HMG1
pRS444PGK-HMG1
pRS434TEF-HMG1
pRS444TEF-HMG1
得られる組換え体を、40μg/mlとなるようにアデニン硫酸塩を加えたYM培地（YPH499を宿主としたときの培地。以下同様。）で培養した。培養条件は、(1)と同様である。培養後、培養液のペンタン抽出画分をGC/MS解析した。培養後、プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した。
【０１３２】
結果を図16に示す。図16において、414PT、414TP、434、444は、それぞれpRS414PTadh、pRS414TPadh、pRS434xxx、pRS444 xxxベクター（xxxはプロモーターに用いた遺伝子名のアルファベット部分を示す）を用いたときの結果を表す。一番右のグラフが遺伝子導入前の宿主(YPH499)を培養したときの結果を示す。図16より、全ての組換え体でFOHの生産量が向上し、pRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1、pRS434TEF-HMG1、pRS444TEF-HMG1、pRS434PGK-HMG1、pRS444PGK-HMG1を導入したYPH499ではNOHの生産性が上昇する株が得られた。
【０１３３】
(3) 恒常発現型プロモーター；HMG1; EUG
A451、YPH499、YPH500由来でGlc生育抑制がみられ、ゲノムへのインテグレーションも完全に行われたEUG株（EUG8、EUG12、EU27）を選択した。恒常発現型プロモーターGAPp (=TDH3p)を含むベクターpRS434GAP又はpRS444GAPにHMG1遺伝子（PCRエラー修正後のもの）を挿入したプラスミドpRS434GAP-HMG1及びpRS444GAP-HMG1を、EUG8(0.021mg/l NOH, 0.20mg/l FOH生産)、EUG12(0.13mg/l NOH, 5.9mg/l FOH生産)、EU27(0.038mg/l NOH, 3.2mg/l FOH生産)へ導入し、プレニルアルコール生産量を測定した。
結果を図17（EUG8）、図18（EUG12）、図19（EUG27）に示す。
【０１３４】
EUG株は、グルコース（Glc）を炭素源としたYM培地で培養するとFOHを生産するが、HMG1導入で生産性が向上した。A451株由来のEUG8とYPH499や、YPH500由来のEUG12、EUG27では生産プロファイルが異なり、YPH系の株の方がより生産に適していると考えられる。
この結果から、HMG1導入によりA451由来株、YPH499由来株、YPH500由来株のプレニルアルコール生産性を向上できることが分かった。
【０１３５】
(4) 誘導型プロモーター；HMG1; A451 & AURGG101
誘導型プロモーターGAL1pを含むベクターpYES2にHMG1遺伝子（PCRエラー変異型HMG1であるHMG1'）を挿入したプラスミドpYES2-HMGを、A451と実施例４で作製したAURGG101 (A451, aur1::AUR1-C)へ導入した。
【０１３６】
それぞれの組換え体を前培養し、25 μl（誘導型プロモーターを使用した酵母を用いて前培養を行ったときの量。以下同じ。）の前培養液を2.5 mlのSG培地に加え、26℃で4日間 130 r.p.m.の往復振盪培養で培養した。ただし、SG培地に加える前には菌体を生理食塩水で洗浄し、グルコース成分の持ち込みがないようにした。SG培地で培養後、プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した。
【０１３７】
その結果、pYES-HMG1/AURGG101でNOHを平均1.43mg/l、FOHを平均4.31mg/l生産し、変異型HMG1であるHMG1'を含むpYES-HMG1を導入した組換え体でもプレニルアルコール高生産性を示すクローンが得られた（図20）。図20AはA451の結果、図20BはAURGG101の結果である。pYESは遺伝子導入に用いたベクター名である。
A451由来株であるAURGG101を宿主に用い、GAL1pを使用した場合は、FOHを特に高生産するクローンが得られた。
【０１３８】
(5) 誘導型プロモーター；HMG1; W303-1A又はW303-1B
誘導型プロモーターGAL1pを含むベクターpYES2にHMG1遺伝子を挿入したプラスミドpYES2-HMGを、W303-1AとW303-1Bへ導入した。SG培地で培養後、プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した（図21）。
HMG1遺伝子を導入すると（それぞれ左側の棒グラフ）、全ての産物の生産量が増加していた。W303株の特徴としては、NOHの生産に有効であった。
【０１３９】
〔実施例8〕欠失型HMG-CoA還元酵素遺伝子の高発現によるプレニルアルコール生産
実施例7ではHMG-CoA還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子の完全長のものを用いてプレニルアルコール生産型組換え酵母を開発したが、本実施例では欠失型HMG-CoA還元酵素遺伝子を用いてプレニルアルコール生産型組換え酵母を作製し、その生産を行った。
【０１４０】
(1) 誘導型プロモーター；HMG1Δ; A451
誘導型プロモーターGAL1pを含むベクターpYES2に欠失型HMG1'遺伝子を挿入した以下のプラスミド(実施例3(4)記載)をそれぞれA451へ導入した。
【０１４１】
pYHMG026
pYHMG044
pYHMG056
pYHMG062
pYHMG076
pYHMG081
pYHMG100
pYHMG112
pYHMG122
SG培地で培養後、プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した（図22）。
欠失型HMG1遺伝子を誘導型プロモーターで発現させると、FOH高生産株が得られた。FOH生産にはHMG1Δ044とHMG1Δ122が効果があった（HMG122/A451で平均0.20mg/l）。
【０１４２】
(2) 誘導型プロモーター；HMG1Δ; AURGG101
誘導型プロモーターGAL1pを含むベクターpYES2に、欠失型HMG1'遺伝子を挿入した以下のプラスミド(実施例3(4)記載)をそれぞれAURGG101へ導入した。
【０１４３】
pYHMG026
pYHMG044
pYHMG056
pYHMG062
pYHMG076
pYHMG081
pYHMG100
pYHMG112
pYHMG122
pYHMG133
SG培地で培養後、プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した（図23、図24）。図23において、一番右側のカラムは遺伝子導入前の宿主AURGG101の生産量を示す。図24は、図23のスケールを拡大したものである。
【０１４４】
特に、HMG1Δ044を誘導型プロモーターで発現させた場合には、プレニルアルコールを高生産する株(15-2株)が得られた。NOH、FOHは平均でそれぞれ12 mg/l、31.7 mg/lであり（図23）、最大生産量はそれぞれ、23 mg/l、53 mg/lであった。HMG1Δ044以外では0.05-0.06mg/l程度のNOH、FOH生産株が得られ（図24）、HMG1Δ62導入株では最大で0.11mg/l NOH、0.13mg/l FOHを生産した。
【０１４５】
(3) 恒常発現型プロモーター；HMG1、誘導型プロモーター；HMG1Δ；AURGG101実施例7(2)で作製したpRS434GAP-HMG1又はpRS444GAP-HMG1を、本実施例(2)で作製した15-2株へ導入した。SG培地で培養後、プレニルアルコール (NOH, FOH) の生産量を測定した（図25）。
その結果、15-2株のFOH生産53mg/lを向上させ、最大で66mg/l FOHを生産する株が得られた。
【０１４６】
〔実施例9〕 大腸菌によるプレニルアルコールの生産
（1）実施例2(4)、(5)、(7)で得られたプラスミドを大腸菌JM109に導入し、50 ml/300 ml flaskの2x YT、1 mM IPTG培地に前培養液を0.5 ml加え、必要に応じた抗生物質（アンピシリン、クロラムフェニコール）と5 mM (約0.12% (W/V))のIPPとDMAPPを加え、37℃で16時間振盪培養した。
37℃で16時間振盪培養した後、培養液上清と沈澱超音波破砕物にジャガイモ酸性フォスファターゼを加え、ペンタンを有機溶媒としてプレニルアルコールを抽出し、実施例7(1)にあるようにGC/MSにより生産量を同定、定量した。
その結果、培地に添加成分としてIPPとDMAPPを加えたときのFOHの生産量は、野性型ispAを導入した場合(図26中のpALispAで示す)で86.4 mg/lであり、野性型fpsを導入した場合(図26中のpFE15NS2.9-1で示す)で12.0 mg/lであった。また、変異型ispAを導入した場合でも、 p18M、p18Eを保持するJM109を培養した場合はそれぞれ11.1 mg/l、16.3 mg/lであり、p4Dを保持するJM109を培養した場合は72.7 mg/l、p16Dを保持するJM109を培養した場合は93.3 mg/lに達した(図26)。
【０１４７】
（2）IPPとDMAPPを添加しなくてもプレニルアルコール生産が行えるかどうかを確かめるため、実施例2(4)、(6)で得られたプラスミドpALispA4とp3-47-11、又はpALispA4とp3-47-13を大腸菌JM109に導入、50 ml/300 ml flaskの2x YT、1 mM IPTG培地に前培養液を0.5 ml加え、必要に応じて抗生物質を加え（アンピシリン、クロラムフェニコール）、37℃で16時間振盪培養した。
その結果、pALispA4とp3-47-11を保持するJM109で0.15 mg/l、pALispA4とp3-47-13を保持するJM109で0.16 mg/lのFOH生産能力があった(図27)。
したがって、idiを含むプラスミドp3-47-11又はp3-47-13と、ispAを含むプラスミドpALispA4の二種のプラスミドを保持するJM109、すなわちidiとispAを導入した大腸菌であれば、IPPやDMAPPといった添加物なしでも0.15-0.16 mg/lのFOHを生産する能力があることがわかった。
【０１４８】
〔実施例10〕 FOHの大量生産
１ 培養条件
CSM-URA（BIO 101 Inc.製）及びDOB（BIO 101 Inc.製）培地（200ml/500ml-バッフル付き三角フラスコ）にスラントより実施例8(2)に記載の15-2株組換え酵母（pYHMG044を保持するAURGG101株）を一白金耳植菌し、30℃、130rpmで２日間培養した。次に、培養液に含まれているグルコースを完全に除くため、遠心（1500g、５分、４℃）及び滅菌した生理食塩水による洗浄を３回繰り返した。その後、ファーメンターに50ml植菌（１％）し、以下の条件で培養した。
【０１４９】
＜ファーメンター培地＞
５％ ガラクトース
アミノ酸含有YNB（Difco製）
1％ 大豆油（ナカライ）
0.1％アデカノールLG109（旭電化）
＜運転条件＞
培養装置：MSJ-U 10L培養装置（丸菱バイオエンジ）
培地量：5L
培養温度：26℃
通気量：１vvm
アジテーション：300rpm
ｐH：特に断らない限り４Ｎ水酸化ナトリウム溶液及び２Ｎ塩酸溶液を用い、以下のパラメーターでpHを比例制御
Proportional Band 1.00
Non Sensitive Band 0.15
Control Period 16 Sec
Full Stroke 1 Sec
Minimun Stroke 0 Sec
【０１５０】
２．菌体数測定
培養液100μlを生理食塩水で1〜20倍に希釈し、血球計（林理化学）で細胞数を計数した。0.06mm四方（最少のグリッド９つ分）の菌数を４平均し、以下の式から培養液1L当たりの菌数を算出した。
菌数（1×109/L-broth）＝0.444×（0.06mm四方の菌体数）×希釈倍率
３．FOHの定量
FOH量は、実施例８と同様に同定・定量した。
４．結果
結果を図28に示す。図28より、変異型HMG-CoA還元酵素遺伝子HMG1'の欠失型遺伝子HMG1Δ044を、A451由来株であるAURGG101に導入した組換え酵母で、培養液1Lあたり平均146mg、最高で158mgのFOHを生産できることが示された。
【０１５１】
【発明の効果】
本発明により、プレニルアルコールの製造方法が提供される。本発明によれば、生物学的に活性なプレニルアルコールを大量に入手できるため、これをもとに様々な生理活性のあるイソプレノイド・テルペノイドを合成することができる。また、本発明において提供された活性型プレニルアルコールは、新たな生理活性を持つ物質を見出すための原料としても利用することができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】メバロン酸経路関連酵素の代謝経路を示す図である。
【図２】欠失型HMG1遺伝子の構築図及び置換変異のパターンを示す図である。
【図３】プラスミドpRS414を示す図である。
【図４】プラスミドpYES2を示す図である。
【図５】ADH1プロモーター、ターミネーターの配列を示す図である。
【図６】プラスミドpRS414PTadh及びpRS414TPadhを示す図である。
【図７Ａ】プラスミドpRS434ADH及びpRS434GAPを示す図である。
【図７Ｂ】プラスミドpRS434PGK及びpRS434TEFを示す図である。
【図７Ｃ】プラスミドpRS436ADH及びpRS436GAPを示す図である。
【図７Ｄ】プラスミドpRS436PGK及びpRS436TEFを示す図である。
【図７Ｅ】プラスミドpRS444ADH及びpRS444GAPを示す図である。
【図７Ｆ】プラスミドpRS444PGK及びpRS444TEFを示す図である。
【図７Ｇ】プラスミドpRS446ADH及びpRS446GAPを示す図である。
【図７Ｈ】プラスミドpRS446PGK及びpRS446TEFを示す図である。
【図８】プラスミドpALHMG106の物理地図を示す図である。
【図９】サザンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１０】 PCRマッピングの結果を示す写真である。
【図１１】ノーザンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１２】粗酵素液中の各プレニル二リン酸合成酵素の比活性を示す図である。
【図１３】 A451にpRS434GAP-HMG1又はpRS444GAP-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図１４】 A451にpRS434GAP-HMG1又はpRS444GAP-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図１５】 A451にpRS434GAP-HMG1又はpRS444GAP-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図１６】 YPH499にpRS414PTadh-HMG1、pRS414TPadh-HMG1、pRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1、pRS434PGK-HMG1、pRS444PGK-HMG1、pRS434TEF-HMG1又はpRS444TEF-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図１７】 EUG8にpRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図１８】 EUG12にpRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図１９】 EUG27にpRS434GAP-HMG1、pRS444GAP-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２０】 A451株又はAURGG101株にpYES-HMG1、pYHMG044を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２１】 W303-1A、W303-1BにpYES-HMG1を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２２】 A451にpYHMG026、pYHMG044、pYHMG056、pYHMG062、pYHMG076、pYHMG081、pYHMG100、pYHMG112、pYHMG122を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２３】 AURGG101にpYHMG026、pYHMG044、pYHMG056、pYHMG062、pYHMG076、pYHMG081、pYHMG100、pYHMG112、pYHMG122を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２４】 AURGG101にpYHMG026、pYHMG044、pYHMG056、pYHMG062、pYHMG076、pYHMG081、pYHMG100、pYHMG112、pYHMG122を導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である(図23の拡大図)。
【図２５】 AURGG101にpRS434GAP-HMG1 又はpRS444GAP-HMG1とpYHMG044とを導入したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２６】変異型ispA遺伝子を導入したE. coliを、IPPとDMAPPを含む培養液で培養したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２７】変異型ispA遺伝子を導入したE. coliを、IPPとDMAPPを含まない培養液で培養したときのプレニルアルコールの生産量を示す図である。
【図２８】組換え体15-2株(pYHMG044/AURGG101)をジャーファーメンター培養したときのプレニルアルコールの生産量と細胞数を示す図である。
Claims (21)
- ヒドロキシメチルグルタリル-CoA還元酵素遺伝子、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子若しくはファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子又はこれらの変異型遺伝子並びに転写プロモーター及び転写ターミネーターを含む、発現用組換えDNA又はゲノムインテグレート用DNA断片を、スクアレン合成酵素遺伝子のプロモーターを発現誘導型プロモーターに置換してなる宿主に導入した組換え体を、当該プロモーターを抑制する条件下で培養した後、得られる培養物からプレニルアルコールを採取することを特徴とするプレニルアルコールの製造方法。
- プレニルアルコールが炭素数15のものである請求項１記載の製造方法。
- 炭素数15のプレニルアルコールがファルネソール又はネロリドールである請求項２記載の製造方法。
- ファルネソール又はネロリドールの培養物中の濃度が少なくとも0.05mg/lである請求項３記載の製造方法。
- ヒドロキシメチルグルタリル-CoA還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子が、配列番号１、３、５及び７〜16からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含むものである請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
- ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子が、配列番号75、77、79、81及び83からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含むものである請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
- イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子又はその変異型遺伝子が、配列番号85に示される塩基配列を含むものである請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
- 転写プロモーターが、ADH1プロモーター、TDH3（GAP）プロモーター、PGK1プロモーター、TEF2プロモーター、GAL1プロモーター及びtacプロモーターからなる群から選ばれるいずれかのものである請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
- 転写ターミネーターが、ADH1ターミネーター又はCYC1ターミネーターである請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
- 宿主が酵母である請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
- 酵母がサッカロマイセス・セレビシエである請求項10記載の製造方法。
- サッカロマイセス・セレビシエが、A451 に由来する株である請求項11記載の製造方法。
- ヒドロキシメチルグルタリル-CoA還元酵素遺伝子、イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子若しくはファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子又はこれらの変異型遺伝子並びに転写プロモーター及び転写ターミネーターを含む、発現用組換えDNA又はゲノムインテグレート用DNA断片を、スクアレン合成酵素遺伝子のプロモーターを発現誘導型プロモーターに置換してなる宿主に導入してなる組換え体であって、当該プロモーターを抑制する条件下で培養することで少なくとも0.05mg/lのファルネソール又はネロリドールを生産することができる組換え体。
- ヒドロキシメチルグルタリル-CoA還元酵素遺伝子又はその変異型遺伝子が、配列番号１、３、５及び７〜16からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含むものである請求項13記載の組換え体。
- ファルネシル二リン酸合成酵素遺伝子又はその変異型遺伝子が、配列番号75、77、79、81及び83からなる群から選ばれるいずれかの塩基配列を含むものである請求項13記載の組換え体。
- イソペンテニル二リン酸Δ-イソメラーゼ遺伝子又はその変異型遺伝子が、配列番号85に示される塩基配列を含むものである請求項13記載の組換え体。
- 転写プロモーターが、ADH1プロモーター、TDH3（GAP）プロモーター、PGK1プロモーター、TEF2プロモーター、GAL1プロモーター及びtacプロモーターからなる群から選ばれるいずれかのものである請求項13〜16のいずれかに記載の組換え体。
- 転写ターミネーターが、ADH1ターミネーター又はCYC1ターミネーターである請求項13〜16のいずれかに記載の組換え体。
- 宿主が酵母である請求項13〜18のいずれかに記載の組換え体。
- 酵母がサッカロマイセス・セレビシエである請求項19記載の組換え体。
- サッカロマイセス・セレビシエが、A451 に由来する株である請求項20記載の組換え体。
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