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KR100828707B1 - 트리오스포스페이트 아이소머라제(ｔｐｉ) 변이체 및 이를코딩하는 유전자 - Google Patents

트리오스포스페이트 아이소머라제(ｔｐｉ) 변이체 및 이를코딩하는 유전자 Download PDF

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KR100828707B1
KR100828707B1 KR1020070003076A KR20070003076A KR100828707B1 KR 100828707 B1 KR100828707 B1 KR 100828707B1 KR 1020070003076 A KR1020070003076 A KR 1020070003076A KR 20070003076 A KR20070003076 A KR 20070003076A KR 100828707 B1 KR100828707 B1 KR 100828707B1
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엄혜원
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Abstract

본 발명은 글리세르알데히드 삼인산을 다이하이드록시아세톤 인산으로 전환하는 효율을 증가시키는 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체, 및 이를 코딩하는 유전자 또는 이를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 본 발명에 따른 효소 또는 그의 변이체를 이용하면 글리세롤을 더욱 효율적으로 생산할 수 있다.
트리오스포스페이트 아이소머라제, 글리세롤

Description

트리오스포스페이트 아이소머라제(ＴＰＩ) 변이체 및 이를 코딩하는 유전자{Mutants of triosephophate isomerase(TPI) and genes encoding the same}
도 1은 포도당으로부터 글리세롤이 합성되는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래한 TPI를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 pSE280-tpi를 도시한다.
도 3은 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래한 TPI를 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 효모용 벡터 YEP-pGal-TPI를 도시한다.
도 4는 사카로마이세스 세레비지애 TPI 변이체를 코딩하는 유전자의 라이브러리를 제작하기 위하여 효모에서 생체내 재조합을 이용한 벡터를 제조하는 방법을 도시한다.
본 발명은 글리세르알데히드 삼인산을 다이하이드록시아세톤 인산으로 전환하는 효율이 높은 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체 및 이를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.
트리오스포스페이트 아이소머라제는 해당과정(glycolysis)에 관여하는 효소로서 글리세르알데히드 삼인산과 다이하이드록시아세톤 인산을 양쪽 방향으로 전환시켜주는 가역반응을 담당한다.
Figure 112007002714522-pat00001
트리오스포스페이트 아이소머라제는 다이하이드록시아세톤 인산의 첫 번째 탄소에서 프로톤을 제거하여 중간 단계를 거쳐 두 번째 탄소로 프로톤을 옮겨 글리세르알테히드 삼인산을 생성한다. 균주 내에서 글리세르알데히드 삼인산의 경우 해당과정을 통해 피루베이트(pyruvate)로 전환되고 이후 TCA회로를 거쳐 에너지원을 생성하게 되지만 다이하이드록시아세톤인산의 경우 해당과정을 거치지 못한다. 따라서 균주내에서 프럭토스이이산(Fructose-1,6-P)으로부터 동일한 양의 다이하이드록시아세톤인산과 글리세르알데히드삼인산이 생성된다 하더라도 이후 다이하이드록시아세톤인산의 양이 상대적으로 많아지게 되고 이는 트리오스포스페이트 아이소머라제 효소에 의해서 글리세르알데히드삼인산으로 전환된다. 이와 같이 다이하이드록시아세톤 인산은 글리세르알데히드삼인산으로 전환되어 해당과정을 통해 에너지원으로 사용되거나 또는 글리세롤 발효를 통해 글리세롤로 전환될 수 있다.
글리세롤은 지방산과의 에스테르로서 유지나 지질 등의 형태로 동식물계에 널리 분포한다. 주로 비누 제조시의 부산물인 폐액에서 제조되었으나, 최근에는 석유의 분해증류에 의해 생기는 프로필렌에서 염화알릴을 거쳐 합성하는 방법이나, 효모의 글리세롤발효의 생성물로서 생산한다. 관장제, 습윤제, 점활제 등의 약제로 사용되거나 니트로글리세린의 제조원료로 널리 사용된다.
트리오스포스페이트 아이소머라제 효소의 구조에 대한 연구는 상당부분 진행되었다. 문헌[Biochemistry (1988), 27, 5948-5960]에서는 S. cerevisiae의 트리오스포스페이트 아이소머라제를 이용하여 95번 위치의 His이 효소활성에 중요한 역할을 담당하고 있다는 것을 밝혔다. 문헌[Eur.J.Biochem. (2001), 268, 5189-5196] 에서는 Leishmania mexicana의 트리오스포스페이트 아이소머라제와 글리세르알데히드 삼인산의 유사체를 이용하여 효소와 기질의 결합 위치와 반응 기작을 구조적으로 밝혔다. 문헌[J.Mol.Biol.(2004). 337, 227-239]에서는 컴퓨터의 모델을 이용하여 효소와 기질(다이하이드록시아세톤산)의 결합 작용을 규명하였다.
이에 본 발명자들은 글리세르알데히드 삼인산을 다이하이드록시아세톤 인산으로 전환하는 효율이 높은 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체 및 이를 코딩하는 변이체를 이용하여 글리세롤을 더 많이 생산할 수 있게 하는 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 글리세르알데히드 삼인산을 다이하이드록시아세톤 인산으로 전환하는 효율이 높은 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체를 코딩하는 유전자 및 이를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 글리세르알데히드 삼인산으로부터 다이하이드록시 아세톤 인산으로의 전환 효율을 향상시킴으로써, 높은 효율로 글리세롤을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부터 유래하는 트리오스포스페이트 아이소머라제와 95% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는, 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체를 코딩하는 유전자 및 이를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체, 또는 이를 코딩하는 유전자 또는 상기 유전자를 포함하는 벡터를 이용하여 글리세롤을 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 글리세르알데히드 삼인산을 다이하이드록시아세톤 인산으로 전환하는 효율이 증가된 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체를 제공한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체에 의한 반응에서 다이하이드록시아세톤 인산으로의 전환 효율이 증가되어 그 양이 증가하게 되면 글리세롤의 생성량도 증가하게 된다.
이러한 변이체는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로부 터 유래하는 서열번호 24의 트리오스포스페이트 아이소머라제와 95% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 변이체는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래하는 서열번호 24의 트리오스포스페이트 아이소머라제의 N-말단으로부터 140 내지 160번째 위치에 존재하는 아미노산 중 어느 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환된다. 바람직하게는, 상기 변이체는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래하는 서열번호 24의 트리오스포스페이트 아이소머라제의 N-말단으로부터 153번째 위치에 존재하는 글루탐산이 알라닌, 발린, 이소루이신 또는 루이신으로 치환된다. 더 바람직하게는, 상기 변이체는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래하는 서열번호 24의 트리오스포스페이트 아이소머라제의 N-말단으로부터 153번째 위치에 존재하는 글루탐산이 알라닌으로 치환되며, 그 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 변이체는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래하는 서열번호 24의 트리오스포스페이트 아이소머라제의 N-말단으로부터 210 내지 230번째 위치에 존재하는 아미노산 중 어느 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환된다. 바람직하게는, 상기 변이체는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래하는 서열번호 24의 트리오스포스페이트 아이소머라제의 N-말단으로부터 220번째 위치에 존재하는 페닐알라닌이 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라긴 또는 글루타민으로 치환된다. 더 바람직하게는, 상기 변이체는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래하는 서열번호 24의 트리오스포스페이트 아이소머라제의 N-말단으로부터 220번 째 위치에 존재하는 페닐알라닌이 세린으로 치환되며, 그 변이체는 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는다.
상기 트리오스포스페이트 아이소머라제(TPI) 변이체를 제조하기 위하여, 먼저 균주 자체의 TPI 유전자를 결실시키고, 나아가 글리세롤 분해 효소 유전자(예를 들어, 글리세롤 카이네즈 유전자(glpK) 및 글리세롤 디하이드로게나제 유전자(gldA))를 결실시킨 숙주 세포를 준비한다. 숙주 세포로는 대장균(E. coli)을 사용하는 것이 바람직하다.
상기와 같이 TPI 유전자 및 글리세롤 분해효소 유전자를 결실시킨 숙주세포는, 글리세롤 합성에 관여하는 유전자(예를 들어, 삼인산 디하이드로게나제 유전자(gpd2) 및 글리세롤삼포스파타제(RHR2) 유전자)가 클로닝된 벡터를 도입함으로써, 글리세롤을 합성할 수 있는 숙주 세포 균주가 제작된다.
한편, 야생형 TPI 유전자로부터 TPI 변이체 유전자를 유도하기 위해 당업계에 통상적으로 이용되는 돌연변이 유도법을 이용할 수 있다. 바람직하게는, PCR을 이용하여 변이체를 유도한다.
그 후, 상기에서 변이가 유도된 TPI 유전자 변이체 단편을 생체내 재조합 방법(in vivo recombination) 등에 의해 효모용 벡터에 도입한다. 이러한 생체 내 재조합 방법은 효모 벡터 절편의 말단 부분과 상동성을 갖는 인서트를 포함하는 DNA 절편을 효모 벡터와 함께 효모 세포를 형질전환시킨 후, 두 종류의 DNA 절편이 세포 내에서 재조합되어 다시 원형 벡터를 형성하게 함으로써 형질전환주가 생성되도록 하는 방법이다. 이 방법에 의해 라이브러리를 제작하면 인서트 DNA가 포함되지 않은 벡터의 생성을 막을 수 있으며, 효모 세포를 이용하여 대장균에 유해한 DNA를 손쉽게 클로닝할 수 있는 장점이 있다.
상기에서 제작된 글리세롤을 합성할 수 있는 숙주 세포 균주에 상기 TPI 변이체 유전자를 포함하는 효모 벡터를 도입하여 배양하여 글리세롤 생산량이 높은 균주를 선택한다. 선택된 균주로부터 벡터를 분리하여 유전자 분석을 수행하면 글리세롤을 효율적으로 생산할 수 있는 효소 변이체를 분리할 수 있다.
또한, 본 발명은 다이하이드록시아세톤 인산으로의 전환 효율이 증가되어 글리세롤 생산에 기여하는 상기 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다.
상기 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체를 코딩하는 유전자는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래하는 트리오스포스페이트 아이소머라제 유전자의 염기서열인 서열번호 2의 염기서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일구체예에서, 상기 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체를 코딩하는 유전자는 서열번호 20의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 서열번호 20의 염기서열은 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래하는 야생형 TPI 유전자(서열번호 2)의 5' 말단으로부터 458번째 위치하는 염기가 A에서 C로 치환된 것이고; 이러한 유전자에 의해 코딩되는 효소 변이체는 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는다. 서열번호 22의 아미노산 서열은 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래하는 야생형 TPI(서열번호 24)의 N-말단으로부터 153번째 위치에 존재하는 글루탐산이 알라닌으로 치환된 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서는, 상기 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체를 코딩하는 유전자는 서열번호 21의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 한다. 서열번호 21의 염기서열은 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래하는 야생형 TPI 유전자(서열번호 2)의 5' 말단으로부터 659번째 위치하는 염기가 T에서 C로 치환된 것이고; 이러한 유전자에 의해 코딩되는 효소 변이체는 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는다. 서열번호 23의 아미노산 서열은 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래하는 야생형 TPI((서열번호 24)의 N-말단으로부터 220번째 위치에 존재하는 페닐알라닌이 세린으로 치환된 것이다.
본 발명은 또한 상기 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 벡터는 서열번호 20 또는 21의 서열을 갖는 유전자를 포함한다.
본 발명에 있어서, "벡터"란 세포의 중심 대사의 일부분이 아닌 유전자를 포함하기도 하는 외래 염색체 요소로서, 보통 원형의 이중가닥 DNA이다. 상기 요소는 자가복제서열, 게놈삽입서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형 또는 원형, 단일 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 일반적으로, 상기 벡터는 적당한 유전자의 전사 및 번역을 지시하는 서열, 선택마커, 및 자가복제 또는 염색체 삽입을 허용하는 서열이 포함된다. 적절한 벡터는 전사 개시 조절을 포함하는 유전자의 5' 영역 및 전사 종결을 제어하는 DNA 단편의 3'영역을 포함한다.
또한, 이러한 벡터는 상기 유전자를 작동가능하게 하는 적당한 조절 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
상기 "적당한 조절 서열"이란 상기 폴리뉴클레오티드가 전사 및 번역될 수 있도록 조절기능을 하는 서열을 말한다. 상기 조절 서열에는 예를 들면, 리보좀 결합 서열(RBS), 프로모터 및 터미네이터가 포함된다. 상기 프로모터는 본 발명의 유전자의 전사의 개시를 지시할 수 있는 서열이면, 어느 것이나 될 수 있으나, 예를 들면, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI (S. cerevisiae에서의 발현에 유용함), lac, trp, λPL, λPR, T7, tac 및 trc (E. coli에서의 발현에 유용함)가 사용될 수 있다. 또한, 상기 터미네이터 영역은 바람직한 숙주세로의 다양한 유전자로부터 유래하는 것일 수 있으며, 또한 선택적으로 필요하지 않을 수도 있다.
본 발명은 또한 상기 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체, 또는 이를 코딩하는 유전자(또는 이러한 유전자를 포함하는 벡터)를 이용하여 글리세롤을 생산하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 글리세롤을 생산하는 방법은 트리오스포르페이트 아이소머라제 변이체를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 수득한 글리세르알데히드삼인산을 다이하이드록시아세톤인산로 전환하는 효율이 향상된 형질변환체를 배양하는 단계 및 상기 배양으로부터 글리세롤을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 야생형 TPI 유전자의 클로닝
본 실시예에서는, 미국 국립생물정보센터(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 블라스트 서치(Blast search)를 이용하여 얻은, 대장균(E.coli), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 야로비아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에서 유래하는 TPI 효소의 유전자 서열을 알아내어, 이 서열을 PCR을 통해 증폭시킨 후 벡터에 클로닝하였다.
하기 PCR 반응은 한국 Bioneer 사의 HL PCR premix kit를 이용하여 94℃에서 3분; 94℃에서 45초, 55℃에서 45초 및 72℃에서 1분 동안의 사이클을 25회 반복하고; 72℃에서 10분의 조건으로 수행하였다.
(1) 대장균의 TPI 유전자(tpi)(서열번호 1)를 클로닝하기 위해 서열번호 6 및 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하였다. 대장균의 게놈 DNA를 추출하여 이를 주형으로, 서열번호 6 및 7의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR를 수행하여 TPI 유전자를 증폭하였다.
(2) 사카로마이세스 세레비지에의 TPI 유전자(서열번호 2)를 클로닝하기 위해 서열번호 8 및 9의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하였다. 사카로마이세스 세레비지에의 게놈 DNA를 추출하여 이를 주형으로, 서열번호 8 및 9의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR를 수행하여 TPI 유전자를 증폭하였다.
(3) 캔디다 알비칸스의 TPI 유전자(서열번호 3)를 클로닝하기 위해 서열번호 10 및 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하였다. 캔디다 알비칸스의 게놈 DNA를 추출하여 이를 주형으로, 서열번호 10 및 11의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR를 수행하여 TPI 유전자를 증폭하였다.
(4) 야로비아 리폴리티카의 TPI 유전자(서열번호 4)를 클로닝하기 위해 서열번호 12 및 13의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하였다. 야로비아 리폴리티카의 게놈 DNA를 추출하여 이를 주형으로, 서열번호 12 및 13의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR를 수행하여 TPI 유전자를 증폭하였다.
(5) 코리레박테리움 글루타미쿰의 TPI 유전자(서열번호5)를 클로닝하기 위해 서열번호 14 및 15의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제작하였다. 코리레박테리움 글루타미쿰의 게놈 DNA를 추출하여 이를 주형으로, 서열번호 14 및 15의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 사용한 PCR를 수행하여 TPI 유전자를 증폭하였다.
상기에서 각각 증폭된 TPI 유전자는 TOPO TA cloning 키트(Invitrogen, 미국)를 이용하여 pCR2.1 벡터에 클로닝하여 pCR2.1-TOPO-tpi를 제조하였다.
실시예 2: 발현벡터에 야생형 TPI 유전자의 클로닝
본 실시예에서는 TPI 유전자가 클로닝된 벡터로부터 TPI 유전자를 분리해 낸 후, 이를 다시 발현벡터로 클로닝하였다.
이를 위해, 먼저 PCR에 의해 증폭된 TPI 유전자(tpi)가 클로닝된 pCR2.1- TOPO-tpi를 제한효소 BamHI 및 AvrII으로 처리하여 tpi를 잘라내고, 이를 분리/정제하였다.
대장균, 사카로마이세스 세레비지애, 캔디다 알비칸스, 야로비아 리폴리티카 및 코리네박테리움 글루타미쿰의 tpi 모두 5' 및 3' 말단은 각각 BamHI 제한효소 인식부위 및 AvrII 제한효소 인식부위를 가지고 있다.
한편, pSE280(Invitrogen, 미국)을 BamHI 및 AvrII으로 처리한 다음, 30㎕의 부피로 CIP(calf intestinal phosphatase) 처리를 하였다.
TPI 유전자(tpi) 100ng 및 pSE280 10ng에 T4 DNA 리가아제 1㎕, 리가아제 완충용액 1㎕ (T4 리가아제용 완충용액, 미국 Promega 사)를 넣고 총부피 10㎕가 되도록 조정한 다음, 16℃에서 6시간 동안 반응시켰다.
반응이 끝난 후 대장균 DH5α(한국 Intron사, 카탈로그 #:15041)에 형질전환시켜 도 2에 도시된 바와 같은 TPI 유전자를 포함하는 pSE280-tpi를 분리/정제하였다.
실시예 3: 야생형 TPI의 효소활성 측정
본 실시예에서는, 글리세롤 분해 효소인 글리세롤 카이네즈 유전자(glpK) 및 글리세롤 디하이드로게나제 유전자(gldA)를 제거하고, 균주 자체의 TPI 유전자(tpi)를 제거한 대장균 BW25113 균주(Yale University Coli Genetic Stock Center)(Δtpi, ΔglpK, ΔgldA)를 제조하였고; 또한 캔디다 알비칸스로부터 유래하는, 글리세롤 합성에 관여하는 유전자들을 클로닝한 벡터를 제조한 후, 이 벡터 및/또는 TPI 발현벡터로 형질전환시킨 대장균 BW25113 균주(Δtpi, ΔglpK, Δ gldA)의 글리세롤 생성량을 측정하였다.
먼저, 글리세롤을 생산하는 균주를 제조하기 위하여 대장균 BW25113 균주로부터 글리세롤 분해 효소인 글리세롤 카이네즈 유전자(glpK) 및 글리세롤 디하이드로게나제 유전자(gldA)를 제거하였다. 또한 외부 TPI의 효소 활성을 측정하기 위하여, 대장균 BW25113 균주가 가지고 있는 자체 TPI 유전자(tpi)를 제거하였다.
한편, 벡터 pCL-gpd2-RHR2를 제조하였는 바, 이 벡터는 대장균 내에 존재하지 않는 글리세롤 합성에 관여하는 두 유전자인 글리세롤 삼인산 디하이드로게나제 유전자(gpd2) 및 글리세롤삼포스파타제(RHR2) 유전자를 캔디다 알비칸스로부터 클로닝하여 작동 가능하게 연결한 것이다.
위와 같이 제작된 대장균 BW25113 균주(Δtpi, ΔglpK, ΔgldA)에 pCL-gpd2-RHR2를 형질전환한 후 다시 실시예 2에서 제조된 pSE280-tpi 벡터를 형질전환시켜 앰피실린 및 스펙트로마이신을 각각 3 ㎕을 포함하는 3 mL LB 배지에 접종하고, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다.
그런 다음, 글리세롤 생산배지에 IPTG, 티아민, 앰피실린 및 스펙트로마이신과 함께 접종한 뒤 37 ℃에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 글리세롤 생산 배지는 증류수 1L에 KH2PO4 8g, Na2HP4 2g, (NH4)2SO4 0.75g, (NH4)2HPO4 8g, 시트르산 6.6g, MgSO4 2.05g, CaCl2 40mg, FeSO4 40mg 및 미량 원소를 넣고, pH를 6.7로 맞추어 멸균한 후 멸균 포도당 10 또는 20 g/L 를 첨가한 것이다. 상기 미량원소는 증류수 1L에 MnSO4ㆍ H2O 2g, CoCl2ㆍ6H2O 0.8g, ZnSO4ㆍ7H2O 0.4g, Na2MoO4ㆍ2H2O 0.4g, CuCl2ㆍ2H2O 0.2g, H3BO3 0.1g, HCl(37%) 10ml를 넣어 멸균한 것이다. 글리세롤 생산배지에서 48시간 동안 배양한 후 글리세롤 생산량을 측정하였다.
글리세롤 생성량은 DHAP와 G3P의 비율로부터 판단할 수 있다. pSE280-tpi 벡터를 형질전환시키지 않고 pCL-gpd2-RHR2 벡터만 지니고 있는 균주의 글리세롤 생성량을 기준으로 정하여 그 수치를 1.00로 보고 pSE280-tpi 벡터를 형질전환시킨 균주의 글리세롤 생성량을 측정한 결과는 하기 표 1과 같다.
대장균(Δtpi, ΔglpK, ΔgldA) 글리세롤 생성량(DHAP/G3P)
pCL-gpd2-RHR2 1.00
pCL-gpd2-RHR2 + pSE280-tpi(E.coli로부터 유래) 0.06
pCL-gpd2-RHR2 + pSE280-tpi(S.cerevisiae로부터 유래) 1.11
pCL-gpd2-RHR2 + pSE280-tpi(C.albicans로부터 유래) 0.55
pCL-gpd2-RHR2 + pSE280-tpi(Y.lipolytica로부터 유래) 0.67
pCL-gpd2-RHR2 + pSE280-tpi(C.glutamicum로부터 유래) 0.34
상기 표 1을 살펴보면, 글리세롤 생성량을 통해 분석해본 결과 E. coli로부터 유래된 tpi 유전자가 도입된 경우 DHAP의 94% 가량이 G3P으로 전환되었고, S.cerevisiae로부터 유래된 tpi 유전자가 도입된 경우 G3P이 10% 가량 DHAP로 전환되는 것을 확인하였다.
따라서, 다른 세포로부터 유래된 경우보다 S.cerevisiae로부터 유래된 tpi 유전자가 도입된 경우 DHAP 전환율이 가장 높으며, 그 결과 글리세롤 생성도 가장 높을 것으로 예측된다.
실시예 4: 야생형 TPI 유전자의 효모 벡터로의 도입
본 실시예에서는, S. cerevisiae 유래의 야생형 TPI 유전자(서열번호 2)를 효모용 벡터에 도입하였다.
먼저, S. cerevisiae 유래의 TPI 유전자는 서열번호 16 및 17을 프라이머로 이용하고 실시예 2에서 제조된 pSE280-tpi(S.cerevisiae로부터 유래) 벡터를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 미국 Clontech사의 pfu polymerase를 이용하여 94℃에서 3분; 94℃에서 45초, 55℃에서 45초 및 72℃에서 1분 동안 25 주기 반복하고; 72℃에서 10분의 조건으로 수행하였다.
상기 PCR 반응에 의해 증폭된 DNA 절편을 제한효소 EcoRI 및 SalI으로 절단한 후, 아가로스 겔에 전기영동한 후 이로부터 절단된 단편을 회수하였다. 그 후, 상기 단편을 동일한 제한 효소, 즉 EcoRI 및 SalI으로 절단한 YEG a- Hir 525 벡터( Appl . Microbiol . Biotechnol. 1994, vol 42, p587-594)에 도입하고, 이를 YEP-pGal-TPI라고 명명하였다(도 3). 사용된 YEG a- Hir 525 벡터는 효모의 gal1-10 프로모터와 gal7 터미네이터를 YEP352 벡터에 도입한 벡터이다.
상기 YEP-pGal-TPI 벡터는 제한 효소 절단 및 시퀀싱을 이용하여 확인하였다. YEP-pGal-TPI를 대장균 BW25113 (Δtpi, Δ glpK , Δ gldA) 균주를 이용하여 TPI 유전자 결손에 의한 생육 저해를 극복함을 재확인하였다. 나아가, BW25113 (Δtpi, ΔglpK , ΔgldA) 균주를 pCL-gpd2-PHR2로 형질전환한 후, YEP-pGal-TPI를 함께 형질전환하여 글리세롤을 생산함을 확인하였다.
실시예 5: TPI 변이체 유전자의 라이브러리 확립
본 실시예에서는, TPI 변이체 유전자 라이브러리의 제작을 위해 서열번호 18 및 19를 이용하여 변이 유도 PCR을 수행하였다.
변이 유도 PCR은 미국 BD사에서 제조한 변이 유도 키트(제품 번호: 630703)를 이용하여 1kb의 유전자에 3 개부터 5개까지의 뉴클레오티드 변이를 유도할 수 있는 조건으로 하였으며, 제조사의 설명서에 따라 변이 유도 PCR을 수행하였다.
변이 유도 PCR에 의해 얻어진 변이 DNA 절편은 아가로스 겔을 이용하여 회수하였으며, 이를 다시 premix PCR kit(바이오니아, 한국), 서열번호 18 및 19의 프라이머를 이용하여 94℃에서 5분 처리 후, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 2분의 사이클을 25회 수행한 후, 72℃에서 7분의 조건으로 증폭하였다.
증폭된 DNA 절편은 YEP-pGal-TPI 벡터와 연결하기 위하여 생체 내에서 재조합(in vivo recombination) 방법을 이용하였다. YEP-pGal-TPI 벡터를 EcoRI 및 SalI으로 절단하여 인서트 DNA가 제거된 벡터를 회수하고 회수된 벡터를 변이 유도를 통해 수득한 TPI 유전자 절편과 함께 S. cerevisiae L3262에 형질전환시킨 후, 변이 TPI 유전자 절편이 포함되어 있는 벡터를 분리하였다. TPI 유전자 절편은 벡터 DNA와 양 말단에서 각각 171 bp, 300 bp의 상동성을 가졌다.
상기에서 분리된 TPI 변이체 유전자가 포함되어 있는 벡터를, pCL-gpd2-PHR2로 형질전화된 대장균 BW25113 (Δtpi, ΔglpK , ΔgldA) 균주에 도입시켜 변이 효율과 벡터가 잘 형성되었는지 여부를 확인하였다.
실시예 6: 글리세롤 생성능이 향상된 균주의 선별 방법
글리세롤 생성능이 향상된 TPI 유전자를 가지고 있는 균주를 선별하기 위하여 다양한 염에 대한 내성을 실험하였다. 글리세롤은 과량 존재시 세포에 삼투압 내성을 부여하여 염에 대한 내성을 증가시킬 수 있다. 따라서 글리세롤이 과량 생산되는 균주의 경우 더 높은 염이 존재하는 경우에도 글리세롤을 생산하지 못하는 균주보다 더 잘 생육할 수 있다. 따라서 높은 염 농도에서 생육하는 균주를 선별하면 더 많은 글리세롤을 생산하는 균주를 선별할 수 있을 것으로 추정된다. 일단 서로 다른 농도의 글리세롤을 생산하는 두 종류의 균주를 이용하여 여러 염 농도에서의 생육을 측정하였다.
이를 위해 TPI 유전자가 제거된 균주 BW25113(Δtpi, ΔglpK , ΔgldA)와 TPI 유전자가 존재하는 균주 BW25113(ΔglpK , ΔgldA) 각각에 pCL-gpd2-PHR2를 형질전환하여 글리세롤을 서로 다른 농도로 생산하도록 한 후 다양한 염을 포함한 LB 배지에서 생육을 비교하였다.
그 결과, 0.8M KCl을 포함한 LB (+ 1% 포도당) 배지에서 글리세롤을 많이 생산하는 균주가 BW25113(Δtpi , ΔglpK , ΔgldA (pCL-gpd2-RHR2)로 형질전환됨) 균주보다 더 빠른 생육을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이 방법을 이용한 글리세롤 생산 증가 균주를 선별하고자 하였다. 실시예 5에서 분리된 TPI 변이체 유전자를 포함하는 벡터를, pCL-gpd2-PHR2가 도입된 BW25113(Δtpi, ΔglpK , ΔgldA) 균주에 형질전환하여 약 10,000 주의 형질전환 균주를 획득하였다.
획득한 형질전환 균주를 한 플레이트당 약 1,000 주가 포함되도록 도말하였으며, 도말한 균주가 직경 2 mm 정도 생육하면, 각각 0.8 M KCl 및 1% 포도당을 포함하는 LB 배지(미국 Merck사)에 레플리카(replica)하여 빠르게 자라는 균주를 선별하였다. 따라서 각각 0.8 M KCl 및 1% 포도당을 포함하는 LB 배지에서 빠르게 생육하는 균주는 더 많은 글리세롤을 생산할 것으로 판단되었다.
실시예 7: TPI 변이체 유전자로 형질전환시킨 균주의 글리세롤 생성량 확인
선별된 균주는 다시 0.8 M KCl 및 1% 포도당을 포함하는 LB 배지 접종하여 비슷한 정도의 생육을 보이는 지 확인한 후 액체 배양을 통하여 글리세롤 생산량을 측정하였다. 액체 배양은 상기 실시예 3에 나온 바와 같다. 10,000 주의 형질전환 주로부터 빠른 생육을 나타낸 30 균주를 액체 배양으로 확인하였으며 이로부터 글리세롤 생산이 증가된 2 종의 균주를 선별하였다. 각 균주는 TPI 변이주 2 및 4번으로 명명되었으며 글리세롤 생산량은 다음 표와 같았다.
DHAP/G3P(글리세롤 생성량으로부터 환산)
YEP 벡터 콘트롤 (YEG a-Hir525) 1.0
YEP-pGAL-TPI 1.02
TPI 변이주 2번 3.30
TPI 변이주 4번 4.35
3회 반복 실험에서 TPI 변이주 2 및 4번은 높은 글리세롤 생성량을 보였으며 생성량 증가가 벡터에 의한 것인지 확인하기 위하여 균주로부터 벡터를 분리한 후 다시 대장균 BW25113(Δtpi, ΔglpK , ΔgldA) 균주에 형질전환하여 동일한 효과를 보임을 확인하였다.
실시예 8: TPI 변이주의 서열 확인
TPI 변이주 2번 및 4번의 벡터에서 TPI 유전자 부분에 대한 염기서열 분석을 실시하였다. 염기서열 분석은 당업계에 통상적으로 사용되는 방법으로 수행하였다.
염기서열 분석 결과, TPI 변이주 2번의 경우 TPI 유전자는 서열번호 20의 염기서열을 가지며, 이 염기서열은 S. cerevisiae로부터 유래하는 야생형 TPI 유전자(서열번호 2)의 5' 말단으로부터 458번째 위치하는 염기가 A에서 C로 치환된 것이고; 이러한 유전자에 의해 코딩되는 효소는 서열번호 22의 아미노산 서열과 같은데 이러한 아미노산 서열은 S. cerevisiae로부터 유래하는 야생형 TPI(서열번호 24)의 N-말단으로부터 153번째 위치에 존재하는 글루탐산이 알라닌으로 치환된 것이다.
또한, TPI 변이주 4번의 경우 TPI 유전자는 서열번호 21의 염기서열을 나타내고, 이러한 염기서열은 S. cerevisiae로부터 유래하는 야생형 TPI 유전자(서열번호 2)의 5' 말단으로부터 659번째 위치하는 염기가 T에서 C로 치환된 것이고; 이러한 유전자에 의해 코딩되는 효소는 서열번호 23의 아미노산 서열과 같은데, 이러한 아미노산 서열은 S. cerevisiae로부터 유래하는 야생형 TPI(서열번호 24)의 N-말단으로부터 220번째 위치에 존재하는 페닐알라닌이 세린으로 치환된 것이다.
상기 TPI 변이주 2번 및 4번은 TPI 유전자의 평형이 DHAP 생산 쪽으로 좀더 이동하여 더 많은 글리세롤 생성을 유도한 것으로 추정된다.
본 발명에 따른 TPI 변이체 또는 이를 코딩하는 유전자(또는 이를 포함하는 벡터)를 이용하면 높은 효율로 글리세롤을 생산할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (12)

  1. 글리세르알데히드 삼인산을 다이하이드록시아세톤 인산으로 전환하는 활성이증가된, 서열번호 24의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 153번째 위치에 존재하는 글루탐산이 알라닌, 발린, 이소루이신 또는 루이신으로 치환된 것을 특징으로 하는 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 24의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 153번째 위치에 존재하는 글루탐산이 알라닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체를 코딩하는 유전자.
  4. 제3항에 있어서, 서열번호 20의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
  5. 글리세르알데히드 삼인산을 다이하이드록시아세톤 인산으로 전환하는 활성이증가된, 서열번호 24의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 220번째 위치에 존재하는 페닐알라닌이 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파라긴 또는 글루타민으로 치환된 것을 특징으로 하는 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 서열번호 24의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 220번째 위치에 존재하는 페닐알라닌이 세린으로 치환된 것을 특징으로 하는 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체.
  7. 제5항 또는 제6항에 따른 트리오스포스페이트 아이소머라제 변이체를 코딩하는 유전자.
  8. 제7항에 있어서, 서열번호 21의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 유전자.
  9. 제3항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  10. 제9항에 따른 벡터를 포함하는 형질전환체를 배양하는 단계 및 상기 배양으로부터 글리세롤을 분리하는 단계를 포함하는, 글리세롤을 생산하는 방법.
  11. 제7항에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  12. 제11항에 따른 벡터를 포함하는 형질전환체를 배양하는 단계 및 상기 배양으로부터 글리세롤을 분리하는 단계를 포함하는, 글리세롤을 생산하는 방법.
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