JP3809502B2 - ハンタウィルス抗原蛋白質およびモノクローナル抗体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はハンタウイルス抗体を検出するために有用な、診断用の抗原蛋白質、および抗原ペプチドを提供する。更に診断上有用であり、またハンタウイルスの増殖を抑制する機能を有するモノクローナル抗体を提供する。
【０００２】
ハンタウイルスは伝染性のウイルスであり、このウイルスに感染した場合に、ヒト体内の免疫反応が進行し、ハンタウイルスと特異的に反応する抗体ができる。本発明の抗原蛋白質、および抗原ペプチドは、ハンタウイルスに感染したヒト血液中の抗ハンタウイルス抗体と特異的に反応するため、ハンタウイルスに感染しているかどうかを診断するための、診断用抗原として利用できる。また本発明の抗原ペプチドと反応するモノクローナル抗体は、受身投与によりハンタウイルス感染症の治療に有用なものとなる。また当該モノクローナル抗体はハンタウイルスに強く結合するため、抗原測定用の診断用抗体としても利用できる。
【０００３】
【従来の技術】
ハンタウイルスの抗原調製の報告は、不活化ウイルス粒子抗原を用いる李らの方法（公開特許公報、平２−２４２６７４）と、遺伝子組換え抗原を用いる方法がある。しかしながら、不活化ウイルス粒子抗原を生産するためには、感染性のあるウイルスの大量培養を行う必要があり、大きな危険を伴う。
【０００４】
近年、遺伝子操作技術が普及し、危険なウイルス培養を行うことなく、ウイルス抗原を遺伝子組換え技術で生産することが可能になった。例えばロシらは、ハンタウイルスのＳゲノムを単離し、そこにコードされている核蛋白を遺伝子組換え技術によって生産した。そして当該核蛋白に抗原性があることを、１９９０年に報告している（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９０，Ｓｕｐｐｌ．１．ｐｐ１９−２８）。またニコルらは、国際特許ＷＯ−９５／００６４８で、同様の技術を開示している。しかしながら、これまでの報告では、抗原性のある特定の核蛋白領域は明らかにされておらず、診断用抗原蛋白質としては、まだ満足できるものではない。
【０００５】
一般的に診断上、真に有用な抗原蛋白質とは、目的とする抗ハンタウイルス抗体とのみ特異的に結合する抗原蛋白質である。この場合、できるだけ限り不要な蛋白質領域は省く必要があり、余分な蛋白質領域を削れば削るほど良質の診断用抗原蛋白質が得られる。一般に、診断用抗原蛋白質として必須となる領域以外の、不要な蛋白質領域があると、目的とする抗体以外の、他の抗体と非特異的に反応する割合が高くなり、診断の正確性を低下させてしまう恐れがあるとされている。
【０００６】
また遺伝子操作によらず、合成ペプチドを抗原として利用することも可能であるが、これまで、良好な抗原ペプチドは知られていない。更にまた、ハンタウイルスの増殖を抑制する抗原については、ほとんど研究されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
我々はハンタウイルス由来の蛋白質の研究を長年行ってきた。特に、抗ハンタウイルス抗体と結合する抗原蛋白質について、真に診断上有用な抗原蛋白質を得るため、鋭意研究を続けてきた。その結果、核蛋白のなかの、ある特定の領域のものが、抗ハンタウイルス抗体と、高率にしかも特異的に反応することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
更に我々は、長年にわたってハンタウイルスの増殖を抑制する抗原ペプチドの研究を続けており、ウイルス培養や、遺伝子組換え技術を必要としない、合成ペプチドを用いるハンタウイルスの増殖抑制機能を追求してきた。そして、核蛋白の中のある特定の領域が、ハンタウイルスの増殖を抑制する抗体と反応性があることをつきとめ、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、配列番号１〜１１のいずれかのアミノ酸配列を有するハンタウイルス核蛋白における、Ｎ末端側より第１番目から第１０３番目までのペプチド、または該ペプチドにおいて１または複数のアミノ酸が置換、挿入、付加したものであって、且つハンタウイルス抗原活性を有するペプチドを含む抗原蛋白質である。
【００１０】
更に、本発明は、配列番号１〜１３のいずれかのアミノ酸配列を有するハンタウイルス核蛋白における、Ｎ末端側より第１６６番目から第１７５番目までのアミノ酸配列を含むハンタウイルスの増殖を抑制する抗体と反応性のある抗原ペプチドである。
【００１１】
更に、本発明は、ＥＤＶＮＧＩＲＫＰＫおよびＥＤＩＮＧＩＲＲＰＫから選ばれる、ハンタウイルスの増殖を抑制する抗体と反応性のある抗原ペプチドである。
更に、本発明は、ハンタウイルス抗原蛋白質と反応性のあるモノクロナール抗体である。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明でいうハンタウイルスとは、ブンヤウイルス科（Bunyavirus）のハンタウイルス（Hantavirus）の総称であり、遺伝子は一本鎖ＲＮＡウイルス型として知られ、その中には、血清型およびＲＮＡ３’末端の塩基配列から、ハンタン型（Hantaan）、ソウル型（Seoul）、プーマラ型（Puumala）、プロスペクトヒル型（Prospect Hill）などの株があることが知られている。これらの株の中で、プロスペクトヒル型以外の株は、ヒトに対して病原性を有する。一般にハンタン型（Hantaan）、ソウル型（Seoul）、プーマラ型（Puumala）の株は腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ）を引き起こすことで知られているが、それ以外にも肝炎などを引き起こすとの報告もなされている。また最近になって、フォーコーナー型（Four Corners）と呼ばれる株が、米国を中心に分布していることが知られる様になったが、現状では米国のみの特殊な型であり、遺伝子の相同性も上記３種類の株と比べて低いこと、また症状としてもＨＦＲＳを引き起こさず、急性で死亡率の高い肺炎を引き起こすことなどから、本発明のハンタウイルスの中では、やや特殊な分類学的位置に属するものである。
【００１３】
ハンタウイルスのＲＮＡゲノムには、Ｌゲノム、Ｍゲノム、Ｓゲノムの３本があり、ＬゲノムはＲＮＡポリメラーゼを、Ｍゲノムはウイルス表面の糖蛋白抗原を、ＳゲノムはＲＮＡと結合する核蛋白をコードすることが知られている。Ｓゲノムでコードされる遺伝子から生産されるハンタウイルスの核蛋白質について、そのアミノ酸配列を配列番号１〜配列番号１３に、そしてそれらを比較したものを表１に示す。ここに示すように、分離された株毎に、アミノ酸が少しずつ変異しているが、一般にＲＮＡウイルスは遺伝子の変異が早く、それに伴いウイルスを構成するアミノ酸も変異する傾向が強いことが知られている。
【００１４】
本発明でいう核蛋白のＮ末端より第１番目から第１０３番目までアミノ酸配列を有するペプチドとは、配列番号１〜配列番号１３に示す番号で規定されるものであり、ウイルス株によっては、実際のＮ末端を１とする番号とは若干のずれが生じる場合がある。なお、基準に用いた番号は、ハンタン７６−１１８株の番号に基づくものである。また、ウイルスのＲＮＡ遺伝子が変異しやすい実情から容易に理解できるが、本発明でいう抗原蛋白質とは、配列表に例示するアミノ酸配列だけに限定されるものではない。これらの配列から、１または複数のアミノ酸が置換、挿入、付加したものであって、且つハンタウイルス抗原活性を有するペプチドを含む抗原蛋白質は総て含まれる。ここで、アミノ酸の置換、挿入又は付加は、既に周知技術である部位特異変異誘導（例えば、Nucleic Acid Reserch, Vol. 10, No. 20, P.6487 〜6500, 1982 参照) により実施することができる。アミノ酸の置換、挿入又は付加に関して、１または複数のアミノ酸とは、部位特異変異誘導により置換、挿入又は付加できる程度のアミノ酸を意味する。抗原として好適に利用できる例として配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
【００１５】
本発明でいうアミノ酸残基の番号は、全て表１により規定されるものであり、実際のＮ末端からの数字とは異なる場合がある。即ち、本発明でいう核蛋白のＮ末端より第１番目から第１０３番目までのアミノ酸配列を有するペプチド（ただし、P-HTVC1-1 及びP-HTVC1-2 株については第２番目から第１０４番目までのアミノ酸配列を有するペプチド）とは、表１に示す番号で規定されるものである。ハンタウイルスは、他のＲＮＡウイルスがそうであるように、ウイルス株によっては、アミノ酸配列中に、アミノ酸の欠落、挿入が見られる。こうした場合に、ある株の塩基配列を基準に番号付けを行い、他の株については、ギャップ（配列中に−で示し、この部分はアミノ酸が欠落していることを示す）を挿入すことにより、基準配列と相同性が高くなるように配列しなおし、統一番号で示す方法がとられる。本発明では、他の多くの文献がそうであるようにハンタウイルス７６−１１８株のアミノ酸配列を基準に番号付けを行った。このため各株については、実際のＮ末端を１とする番号とは若干のずれが生じる場合がある。配列番号１から配列番号１３のアミノ酸残基数が各株毎に異なるのはこのためである。
【００１６】
また、ウイルスのＲＮＡ遺伝子が変異しやすい実情から容易に理解できるが、本発明でいう抗原蛋白質とは、配列表に例示するアミノ酸配列だけに限定されるものではない。これらの配列から、１または複数のアミノ酸が置換、挿入及び付加したものであって、且つハンタウイルス抗原活性を有するペプチドを含む抗原蛋白質は総て含まれる。ここで配列番号１４に示すアミノ酸配列は、抗原として好適に利用できる。
【００１７】
【表１】
表１ 配列番号１〜配列番号１３のハンタウイルスの核蛋白のアミノ酸配列比較表
【００１８】
表中の略号は米国ロスアラモスのＧｅｎＢａｎｋに登録されている株の名称であり、Ｐ−ＨＴＮはハンタン型、Ｐ−ＰＵＵはプーマラ型、Ｐ−ＳＲ１１はソウル型、P-RM-97 mexicoとNP-HPSはフォーコーナー型、Ｐ−Ｔｕｌａはプーマラタイプの株である。
【００１９】
本発明でいうハンタウイルス抗原活性を有するペプチドとは、ハンタウイルス核蛋白の第１番目から第１０３番目までの領域と相同性があり、ハンタウイルス核蛋白の第１番目から第１０３番目までの領域のアミノ酸配列からなるペプチドで誘導された抗体が、実質的に、結合することのできるペプチドをさす。
【００２０】
本発明の抗原蛋白質は抗体産生を誘導しやすいものであり、更に誘導された抗体は、本発明の抗原蛋白質との反応性が強い。そのため、ハンタウイルスに感染したヒトの血清中にも当然のことながら、当該抗体が多く存在しており、実際にハンタウイルス感染者の血清と本発明の抗原蛋白質を反応させると、特異的に強く反応するため、当該抗原蛋白質は診断上、特に有用なものとなる。
【００２１】
なお本発明のハンタウイルス核蛋白のアミノ酸配列におけるＮ末端側より第１番目から第１０３番目までに相当する抗原蛋白質を生産することのできる発現プラスミドを含む大腸菌ＪＭ１０９（ｐＩＶ１５）は、平成７年５月２６日付けで、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４９４８である。
【００２２】
また、本発明でいう第１６６番から第１７５番までのアミノ酸配列を有する抗原ペプチドとは、表１に示す番号で規定したものであり、ウイルス株によっては、実際のＮ末端を１とする番号とは若干のずれが生じる場合がある。なお、基準に用いた番号は、ハンタン７６−１１８株の番号に基づくものである。
【００２３】
本発明の抗原ペプチドに対する抗体は、当該抗原ペプチドとの反応性が強い。そのため、ハンタウイルスに感染したヒトの血清中にも、当然のことながら、当該抗体の存在が予測され、実際に、ハンタウイルス感染者の血清と本発明の抗原ペプチドを反応させると、特異的に強く反応する。この様に、当該抗原ペプチドは、診断上でも有用である。
【００２４】
また本発明でいうモノクローナル抗体とは、ハンタウイルス核蛋白における、Ｎ末端側より第１６６番目から第１７５番目までのアミノ酸配列を含む抗原ペプチドと反応するモノクローナル抗体をいう。当該モノクローナル抗体には、ハンタウイルスの増殖を抑制する効果が認められ、当該モノクローナル抗体は、受身投与により、ハンタウイルス感染症増殖を抑制するための治療剤として有用である。更にまた当該モノクローナル抗体はハンタウイルスに強く結合するため、抗原測定用の診断用抗体としても利用でき、ワクチンとしての利用も期待できる。
【００２５】
【発明の効果】
本発明により抗ハンタウイルス抗体とのみ特異的に反応する、診断上有用な抗原蛋白質が得られる。本抗原蛋白質は、偽陽性反応が低く、ハンタウイルスに感染した患者の血液中の抗ハンタウイルス抗体を特異的に捕らえることができる。
【００２６】
また、本発明により、ハンタウイルスの増殖を抑制する抗体と反応する抗原ペプチドが得られる。本発明の抗原ペプチドは、ハンタウイルスの各血清型間で、広い交差反応性があることが特長であり、各種の株を広く捉えるために、幅広いハンタウイルス感染症の抗原として利用でき、また、今後ワクチンとしての利用も期待できる。
【００２７】
また、本発明の抗原ペプチドと反応するモノクローナル抗体は、ハンタウイルスの増殖を抑制する効果が認められている。当該モノクローナル抗体は受身投与により、ハンタウイルス感染症増殖を抑制するための治療剤として有用である。更にまた当該モノクローナル抗体はハンタウイルスに強く結合するため、抗原測定用の診断用抗体としても利用でる。
【００２８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が制限されるものではない。
（実施例１） 大腸菌による遺伝子クローニングと遺伝子発現
ハンタンウイルス７６−１１８株のＳゲノムのｃＤＮＡ遺伝子を制限地図で表示すると図１の様である。このうち開始コドンＡＴＧはヌクレオチド番号で３７番目に、終止コドンは１３２６番目に位置し、その間のオープンリーディングフレームから予測すると、１２８７個のヌクレオチドが４２９個のアミノ酸をコードする構造となっている。
【００２９】
ハンタウイルスの遺伝子クローニングにはＰＣＲ法を用い、開始コドンを含むＨＴＮＮＰＡＴＧプライマーと、逆のプライマーＨＴＮＮＰＥＮＤとを用いて遺伝子増幅した。ＨＴＮＮＰＡＴＧプライマーの塩基配列は、ＡＴＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＴＴＡＣＡＧであり、逆鎖（−鎖）用のＨＴＮＮＰＥＮＤプライマーの塩基配列は、ＴＴＡＧＡＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴである。逆プライマーの最初の塩基配列ＴＴＡは、＋鎖ではＴＡＡとなり終止コドンとなる。増幅に用いたハンタウイルス遺伝子はＳｃｈｍａｌｊｏｈｎらが塩基配列を報告しているハンタンウイルス７６−１１８株のＳゲノム（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５５，ｐｐ．６３３−６４３，１９８６）を使用した。ＰＣＲ法は、宝酒造社ＲＴ−ＰＣＲキットに添付されている試薬および方法で行った。
【００３０】
増幅した遺伝子はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプラスミドＴＡ−クローニングキットを用い、プラスミドベクターｐＣＲに組み込んだ。実施にあたっては、キットに添付されている試薬を用い、キットに示されている方法に従って行った。
核蛋白質内の各種の領域の遺伝子発現を行い、各種の核蛋白断片を得るために、ｐＣＲに組み込んだ遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動後、分離精製した。次に分離した遺伝子を、ＤｒａＩで切断し、結果として、ＥｃｏＲＩ（開始コドンを含む）〜ＤｒａＩ（３４８）までの断片を得た。
【００３１】
得られた断片の末端は粘着末端（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端となっており、これをＴ４ポリメラーゼで埋めて、ブラント（Ｂｌｕｎｔ）末端とした。
次いで、この遺伝子断片をプロメガ社から販売しているプラスミドベクターであるピンポイントｐＸａ−２に組み込み、遺伝子の発現プラスミドｐＩＶ１５を作成し、塩基配列が保持されてることを確認した。発現プラスミドｐＩＶ１５はＥｃｏＲＩ（開始コドン）〜ＤｒａＩ（３４８）までの断片を含む。この発現プラスミドｐＩＶ１５から生産される抗原蛋白質のアミノ酸配列を、配列番号１５に示す。この抗原蛋白質は、核蛋白の第１番目から第１０３番目までのアミノ酸配列を含む。
【００３２】
なお、得られたｐＩＶ１５の遺伝子構造は、ｐＸａ−２のマルチクローニング部位のＰｖｕＩＩ位に、配列番号１６の塩基配列の遺伝子が挿入されたものであり、挿入の方向は、ｐＸａ−２遺伝子上のｔａｑプロモーターの下流に、ハンタウイルス遺伝子が正方向に直列につながったものである。また配列番号１６中の１１番目のＡＴＧがハンタンウイルスの開始コドンに相当するが、ｐＩＶ１５では、同じフレームの上流に存在するピンポイント蛋白の開始コドンから、アミノ酸への翻訳が連続しており、結果的にピンポイント蛋白の下流に抗原蛋白が結合した、融合蛋白が得られる。
【００３３】
次に、この発現プラスミドｐＩＶ１５を大腸菌ＪＭ１０９に移入し、ＪＭ１０９を形質転換した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＩＶ１５）を作成した。
ついで、当該大腸菌を使用して、大腸菌体内でビオチン化されるペプチドを上流に持つ融合蛋白を大腸菌に生産させた。この方法は、プロメガ社のマニュアルに従って行った。大腸菌ＪＭ１０９（ｐＩＶ１５）（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９４８）を、５０ｍｌの培養液で培養後、遺伝子発現誘導剤ＩＰＴＧを加え、追加培養後、集菌し、溶菌緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０３％のＳＤＳ）で溶菌した。さらに溶菌した懸濁液を氷上に置き、超音波破砕を行った。更に不溶性画分を除去し、可溶性画分に目的の抗原蛋白質があることを、ウエスタンブロッティング法で確認した。
【００３４】
（実施例２） ＥＬＩＳＡ用抗原蛋白質感作プレートの作成
９６穴のマイクロプレートに５マイクログラム／ｍｌのアビジン溶液を加えて４℃にて一晩置き、アビジンをコートした。その後、プレートは３回洗浄を繰り返し、次いでＢＳＡ溶液を加えてブロッキング操作を行い、更に３回洗浄した。次に、実施例１で作成した発現プラスミドを用いて作成した抗原蛋白質について、蛋白質濃度が４０マイクログラム／ｍｌとなるように調製し、アビジンコートしたプレートに加え、室温にて１時間、静置した。その後洗浄を繰り返すことにより、抗ハンタウイルス抗体の評価に使用するＥＬＩＳＡ用プレートを作成した。
【００３５】
（実施例３） 抗原蛋白質の評価
ハンタウイルスに感染した５人の患者から採血した陽性血清５種類（Ａ〜Ｅ）と、正常者５人から採血した正常血清５種類（Ｆ〜Ｊ）を検定に使用した。これらの血清を、実施例２で作成したＥＬＩＳＡプレートに、各１００マイクロリットルずつ加え、３７℃にて１時間静置した後洗浄し、ついで二次抗体としてパーオキシダーゼ標識した羊由来の抗ヒトＩｇＧ抗体溶液を加え、３７℃で１時間静置した。洗浄後、発色溶液ＡＢＴＳを加え、３０分静置後、発色の度合を波長４０５ｎｍで測定した。この結果を表２に示す。
【００３６】
（比較例１）
核蛋白質内の各種の領域の遺伝子発現を行い、各種の核蛋白断片を得るために、ｐＣＲに組み込んだ遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動後、分離精製した。次に分離した遺伝子を、制限酵素ＢａｍＨＩ，ＤｒａＩ，ＢａｎＩＩ，ＰｖｕＩＩを組み合わせて切断し、結果として、ＥｃｏＲＩ（開始コドンを含む）〜ＤｒａＩ（３４８）までの断片、ＢａｍＨＩ（１３８）〜ＢａｍＨＩ（１２４２）までの断片、ＤｒａＩ（３４８）〜ＢａｎＩＩ（６４６）までの断片、ＢａｎＩＩ（６４６）〜ＰｖｕＩＩ（９１０）までの断片、ＢａｎＩＩ（６４６）〜ＥｃｏＲＩ（終止コドンを含む）までの断片、ＰｖｕＩＩ（９１０）〜ＢａｍＨＩ（１２４２）までの断片を得た。
【００３７】
次いで、これらの遺伝子断片をそれぞれ、プロメガ社から販売しているプラスミドベクターであるピンポイントｐＸａ−１，ｐＸａ−２，ｐＸａ−３に組み込み、以下に示す各種の遺伝子発現プラスミドを作成し、塩基配列が保持されてることを確認した。
各種の発現プラスミドは以下の通りである。
【００３８】
発現プラスミド１
ＥｃｏＲＩ（開始コドン）〜ＥｃｏＲＩ（終止コドン）までの断片を含む
発現プラスミド２
ＢａｍＨＩ（１３８）〜ＢａｍＨＩ（１２４２）までの断片を含む
発現プラスミド３
ＤｒａＩ（３４８）〜ＢａｎＩＩ（６４６）までの断片を含む
発現プラスミド４
ＢａｎＩＩ（６４６）〜ＰｖｕＩＩ（９１０）までの断片を含む
発現プラスミド５
ＢａｎＩＩ（６４６）〜ＥｃｏＲＩ（終止コドン）までの断片を含む
発現プラスミド６
ＰｖｕＩＩ（９１０）〜ＢａｍＨＩ（１２４２）までの断片を含む
発現プラスミドから生産される各種の比較抗原
【００３９】
比較抗原１．発現プラスミド１から生産される抗原蛋白質で、核蛋白の第１番目から第４２９番目までのアミノ酸配列を含む。
比較抗原２．発現プラスミド２から生産される抗原蛋白質で、核蛋白の第３４番目から第４０３番目までのアミノ酸配列を含む。
比較抗原３．発現プラスミド３から生産される抗原蛋白質で、核蛋白の第１０４番目から第２０４番目までのアミノ酸配列を含む。
比較抗原４．発現プラスミド４から生産される抗原蛋白質で、核蛋白の第２０５番目から第２９０番目までのアミノ酸配列を含む。
比較抗原５．発現プラスミド５から生産される抗原蛋白質で、核蛋白の第２０５番目から第４２９番目までのアミノ酸配列を含む。
比較抗原６．発現プラスミド６から生産される抗原蛋白質で、核蛋白の第２９１番目から第４０３番目までのアミノ酸配列を含む。
【００４０】
次に、実施例１と同じ方法により、これらのプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、大腸菌体内でビオチン化されるペプチドを上流に持つ、融合蛋白を大腸菌に生産させた。この方法は、プロメガ社のマニュアルに従った。
形質転換された大腸菌は、５０ｍｌの培養液で培養後、集菌し、溶菌緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０３％のＳＤＳ）で溶菌した後、懸濁液を氷上にて超音波破砕した。更に不溶性画分を除去し、可溶性画分に目的の抗原蛋白質があることを、ウエスタンブロッティング法で確認した。
【００４１】
（比較例２） ＥＬＩＳＡ用抗原蛋白質感作プレートの作成
実施例１と同じ方法により、９６穴のマイクロプレートに５マイクログラム／ｍｌのアビジン溶液を加えて４℃にて一晩置き、アビジンをコートした。その後、プレートは３回洗浄を繰り返し、次いでＢＳＡ溶液を加えてブロッキング操作を行い、更に３回洗浄した。次に、比較例１で作成した発現プラスミドを用いて作成した６種類の抗原蛋白質について、各種の抗原蛋白質の濃度がそれぞれ４０マイクログラム／ｍｌとなるように調製し、アビジンコートしたプレートに加え、室温にて１時間、静置した。その後洗浄を繰り返すことにより、抗ハンタウイルス抗体の評価に使用するＥＬＩＳＡ用プレートを作成した。
抗ハンタウイルス抗体の確認に使用する二次抗体としては、パーオキシダーゼを固定化した羊由来の抗体を使用した。
【００４２】
（比較例３） 抗原蛋白質の評価
実施例１と同じ方法により、ハンタウイルスに感染した５人の患者から採血した陽性血清５種類（Ａ〜Ｅ）と、正常者５人から採血した正常血清５種類（Ｆ〜Ｊ）を検定用に使用した。これらの血清を、実施例２で作成したＥＬＩＳＡプレートに、各１００マイクロリットルずつ加え、３７℃にて１時間静置した後洗浄し、洗浄後、パーオキシダーゼ標識した羊由来の抗ヒトＩｇＧ抗体溶液を加え、３７℃で１時間静置した。洗浄後、発色溶液ＡＢＴＳを加え、３０分静置後、発色の度合を波長４０５ｎｍで測定した。その結果を表２にまとめて示す。
【００４３】
【表２】
表２ 実施例３および比較例３の結果
【００４４】
この表２における、実施例３と比較例３の結果から、抗原蛋白質の抗原性と比較抗原１の抗原性がほぼ一致し、抗原部位がＮ末端から１０３番目までの位置に存在していることが分かる。また抗原蛋白質が正常血清とは全く反応しないのに対し、比較抗原１は正常者との偽陽性反応が見られること、陽性検体について反応性が低い場合があること等の欠点がみられた。この様に、本発明の抗原蛋白質が診断用抗原として優れていることが分かる。
【００４５】
（実施例４） 細胞融合によるモノクローナル抗体生産株の作成
モノクローナル抗体生産株は、以下の様な手順で作成した。この実験は、通常の実験手順書に従って追試できる。まず、韓国ＫＴＣＣに登録されているハンタンウイルス７６１１８株（ＡＴＣＣ ＶＲ．９８３）を、Ｖｅｒｏ／Ｅ６株細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８６）に感染させ、感染細胞中でウイルスを培養した。次に、感染細胞が１０の７乗個／ｍｌの濃度になるようにし、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳで処理して、ウイルス粗精製抗原を得た。次に、得られた粗精製抗原を用いて、マウスに免疫した。次いで当該粗抗原をフロイドの完全アジュバントと等量混合し、１００マイクロリットルをＢＡＬＢ／Ｃマウス後肢筋肉内に注射した。３回の追加免疫は不完全アジュバントを用いて同様に行った。最後に抗原液を、アジュバントを混合せずにマウスの腹腔内に注射し、その３日後に脾細胞を回収した。ついで、当該脾細胞をＡＴＣＣに登録されている骨髄腫細胞P3-X63-Ag8-U1株と細胞融合させた。融合は実験手順書に従って、ＰＥＧ１５００法を採用して行った。
【００４６】
（実施例５） モノクローナル抗体生産株の選択
実施例４では各種の細胞融合候補株が得られた。これらの中から、まずモノクローナル抗体生産株を選択した。この方法は、吉松らが既に報告している蛍光抗体法によるもので（Yoshimatsu, K., Arikawa, J. & Kariwa, H., J. Vet. Med. Sci., Vol.55, pp.1047-1050, 1993.）、抗体分泌株のスクリーニングを行う方法である。ここで、蛍光抗体法に使用した二次抗体には、カペル社のＦＩＴＣ結合羊由来抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）抗体を使用した。こうしてＥ５／Ｇ６株、ＫＡ０６株など、１７株のモノクローナル抗体生産株が得られた。
次にこれらの中から、ハンタウイルスの増殖を抑制する効果を有するモノクローナル抗体を選択した。このスクリーニング方法は、競争結合アッセイ法であり、ラフォンらの方法に従って行った（Lafon, M. & Lafage, M., J. Gen. Virol. Vol.68, pp.3113-3123, 1987.）。
【００４７】
まず１０の６乗個のＶｅｒｏ−Ｅ６細胞を２５平方センチのフラスコに入れて４８時間培養し、培養終了後、培養細胞を５ｍｌのＥＭＥＭで２回洗浄した。ついで１７種類のモノクローナル抗体と、対照となるマウス抗体ＩｇＧを、各々、ＥＭＥＭで希釈し、６００マイクロリットルの溶液とした。ついで、当該抗体溶液を培養細胞上に注いだ。引き続き、培養細胞をシリコンゴムプレートではぎ取り、５％ＦＣＳを含む４ｍｌの氷冷ＥＭＥＭで洗浄した。２回目の洗浄が終わると、モノクローナル抗体が付加された培養細胞を、２７Ｇ針の注射器で分散、懸濁させ、組織培養用のプレートに分注した。そしてモノクローナル抗体が付加された培養細胞を、一晩培養し、ついでハンタンウイルス７６１１８株またはソウルウイルスＳＲ１１株を、各々ｍ．ｏ．ｉ．が０．１となるように接種した。細胞は、０，１，４，７日後に、アセトンで固定化した。培養細胞中で増殖したウイルス抗原の検出には、蛍光抗体法を利用した。この結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
表３ ハンタウイルス増殖抑制効果の結果
実験Ａ
判定株：ハンタンウイルス７６−１１８株
【００４９】
実験Ｂ
判定株：ソウルウイルスＳＲ１１株
【００５０】
この表３から、Ｅ５／Ｇ６株から産生されるモノクローナル抗体にのみ、ハンタウイルスの増殖を抑制する効果が認められた。同時に行った、ＫＡ０６株など、他の１６株には、この様な抑制効果は見られなかった。また同時に、実験の対照として使用したマウス抗体ＩｇＧには、全く抑制効果は見られなかった。このことは、Ｅ５／Ｇ６モノクローナル抗体は受身投与により、ハンタウイルス感染症増殖を抑制するための治療剤として有用であることを示している。
また本モノクローナル抗体がハンタウイルスに強く結合することが判明したため、抗原測定用の診断用抗体として利用できることも判明した。
【００５１】
（実施例６） モノクローナル抗体の結合部位の特定
実施例５で得られたＥ５／Ｇ６株モノクローナル抗体の結合部位を特定するために、まず比較例１で作成した比較抗原１〜比較抗原６の、６種類の抗原との反応性を調べた。その結果、当該モノクローナル抗体が比較抗原１、比較抗原３とのみ反応することが判明し、まず結合部位がアミノ酸配列の第１０４番目から２０４番目までの間にあることが判明した。また更に、ＰＥＰＳＣＡＮアッセイを行い、詳しい結合部位の特定を行った。ＰＥＰＳＣＡＮアッセイは、Lundkvistらの方法に従って行った。（Lundkvist, A., Bjorsten, S., Niklasson, B. & Ahlborg, N., Clinical Diagnostic Lab. Immunol., Vol.2, pp.82-86, 1995.）。ＰＥＰＳＣＡＮアッセイは、Ｎ末端（第１番目）〜Ｃ末端（第４２９番目）までの全領域について、１０残基の連続した合成ペプチドを、５アミノ酸ずつずらして作成し、それらの抗原性を評価するＥＬＩＳＡ法の一種であり、一次抗体にＥ５／Ｇ６株モノクローナル抗体、二次抗体に羊由来パーオキシダーゼ標識抗マウス抗体を使用した。この結果を表４に示す。
【００５２】
【表４】
表４ ＰＥＰＳＣＡＮアッセイの結果
【００５３】
この表４の実験結果から、Ｅ５／Ｇ６株が産生するモノクローナル抗体は、ハンタウイルスのアミノ酸配列で、第１６６番目から第１７５番目に相当する、連続する１０残基にあることが特定された。
【００５４】
さらに合成ペプチドを用いて、競合阻害試験を行い、エピトープの確定を行った。合成ペプチドはハンタンウイルスおよびソウルウイルスの第１６６番目から第１７５番目に相当するＥＤＶＮＧＩＲＫＰＫ（抗原ペプチドＡ）と、プーマラウイルスの第１６６番目から第１７５番目に相当するＥＤＩＮＧＩＲＲＰＫ（抗原ペプチドＢ）の２種を作成した。まずこれらの合成ペプチドの５ｍｇ／ｍｌの溶液を作成し、それを順次５倍ずつ希釈した希釈系列を作成し、Ｅ５／Ｇ６株モノクローナル抗体と混合し、４℃で一晩インキュベーションした。この混合液を、ハンタウイルス抗原をコートした９６穴のプレートに加え、引続き二次抗体として羊由来標識抗マウス抗体を使用して、ＥＬＩＳＡを行った。モノクローナル抗体が予め抗原ペプチドと反応していれば、ＥＬＩＳＡでの発色は低くなり、阻害率は大きくなる。この結果を、以下の式で表される阻害率で表示する。
【００５５】
この結果を表５に示す。
【００５６】
【表５】
表５ モノクローナル抗体と抗原ペプチドのプレインキュベーションによるＥＬＩＳＡ反応の競合阻害実験結果
【００５７】
この様に、ハンタウイルスを抗原として用いるＥＬＩＳＡにおいて、抗原ペプチドの濃度に依存する阻害がみられることが判明した。このことから、当該領域が、Ｅ５／Ｇ６株モノクローナル抗体に対するエピトープであることが明らかになった。
【００５８】
（実施例７） 抗原ペプチドの評価
実施例６で特定された、ハンタウイルスのアミノ酸配列で第１６６番目から第１７５番目までの抗原ペプチドを作成し、診断用抗原としての評価を行った。
評価には９６穴のマイクロプレートを使用し、ＥＬＩＳＡ作成キットを用いて、抗原ペプチドをウェルに固定化した。用いた抗原ペプチドは、ハンタンウイルスおよびソウルウイルス核蛋白の第１６６番目から第１７５番目に相当するＥＤＶＮＧＩＲＫＰＫ（抗原ペプチドＡ）と、プーマラウイルス核蛋白の第１６６番目から第１７５番目のペプチドに相当するＥＤＩＮＧＩＲＲＰＫ（抗原ペプチドＢ）を含む抗原ペプチドの２種を用いて行った。
まず、通常の手順に従って、５種類の個別患者血清（１〜５）と５種類の個別正常者血清（６〜１０）を用いて、抗原の評価を行った。この結果を表６に示す。
【００５９】
【表６】
表６ 実施例７の抗原ペプチドの評価
【００６０】
また、抗原ペプチドＡ、抗原ペプチドＢを用いて、各種のハンタウイルス株に対する抗体との反応性を調べたところ、これらの抗原ペプチドは、ともにハンタンウイルス７６−１１８株、ソウルウイルスＳＲ１１株、プロスペクトヒルウイルス、プーマラウイルスＳｏｔｋａｍｏ株の抗体と、広く反応した。この様に、当該抗原ペプチドは各種株に対し広い交差性を示すため、広くハンタウイルス感染症を診断する診断用抗原としても有用であることが判明した。
【００６１】
【配列表】
【００６２】
【００６３】
【００６４】
【００６５】
【００６６】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【図面の簡単な説明】
【図１】ハンタウイルスのＳゲノムについて、遺伝子構造と制限地図を示す図。
【産業上の利用分野】
本発明はハンタウイルス抗体を検出するために有用な、診断用の抗原蛋白質、および抗原ペプチドを提供する。更に診断上有用であり、またハンタウイルスの増殖を抑制する機能を有するモノクローナル抗体を提供する。
【０００２】
ハンタウイルスは伝染性のウイルスであり、このウイルスに感染した場合に、ヒト体内の免疫反応が進行し、ハンタウイルスと特異的に反応する抗体ができる。本発明の抗原蛋白質、および抗原ペプチドは、ハンタウイルスに感染したヒト血液中の抗ハンタウイルス抗体と特異的に反応するため、ハンタウイルスに感染しているかどうかを診断するための、診断用抗原として利用できる。また本発明の抗原ペプチドと反応するモノクローナル抗体は、受身投与によりハンタウイルス感染症の治療に有用なものとなる。また当該モノクローナル抗体はハンタウイルスに強く結合するため、抗原測定用の診断用抗体としても利用できる。
【０００３】
【従来の技術】
ハンタウイルスの抗原調製の報告は、不活化ウイルス粒子抗原を用いる李らの方法（公開特許公報、平２−２４２６７４）と、遺伝子組換え抗原を用いる方法がある。しかしながら、不活化ウイルス粒子抗原を生産するためには、感染性のあるウイルスの大量培養を行う必要があり、大きな危険を伴う。
【０００４】
近年、遺伝子操作技術が普及し、危険なウイルス培養を行うことなく、ウイルス抗原を遺伝子組換え技術で生産することが可能になった。例えばロシらは、ハンタウイルスのＳゲノムを単離し、そこにコードされている核蛋白を遺伝子組換え技術によって生産した。そして当該核蛋白に抗原性があることを、１９９０年に報告している（Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９０，Ｓｕｐｐｌ．１．ｐｐ１９−２８）。またニコルらは、国際特許ＷＯ−９５／００６４８で、同様の技術を開示している。しかしながら、これまでの報告では、抗原性のある特定の核蛋白領域は明らかにされておらず、診断用抗原蛋白質としては、まだ満足できるものではない。
【０００５】
一般的に診断上、真に有用な抗原蛋白質とは、目的とする抗ハンタウイルス抗体とのみ特異的に結合する抗原蛋白質である。この場合、できるだけ限り不要な蛋白質領域は省く必要があり、余分な蛋白質領域を削れば削るほど良質の診断用抗原蛋白質が得られる。一般に、診断用抗原蛋白質として必須となる領域以外の、不要な蛋白質領域があると、目的とする抗体以外の、他の抗体と非特異的に反応する割合が高くなり、診断の正確性を低下させてしまう恐れがあるとされている。
【０００６】
また遺伝子操作によらず、合成ペプチドを抗原として利用することも可能であるが、これまで、良好な抗原ペプチドは知られていない。更にまた、ハンタウイルスの増殖を抑制する抗原については、ほとんど研究されていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
我々はハンタウイルス由来の蛋白質の研究を長年行ってきた。特に、抗ハンタウイルス抗体と結合する抗原蛋白質について、真に診断上有用な抗原蛋白質を得るため、鋭意研究を続けてきた。その結果、核蛋白のなかの、ある特定の領域のものが、抗ハンタウイルス抗体と、高率にしかも特異的に反応することを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】
更に我々は、長年にわたってハンタウイルスの増殖を抑制する抗原ペプチドの研究を続けており、ウイルス培養や、遺伝子組換え技術を必要としない、合成ペプチドを用いるハンタウイルスの増殖抑制機能を追求してきた。そして、核蛋白の中のある特定の領域が、ハンタウイルスの増殖を抑制する抗体と反応性があることをつきとめ、本発明を完成するに至った。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、配列番号１〜１１のいずれかのアミノ酸配列を有するハンタウイルス核蛋白における、Ｎ末端側より第１番目から第１０３番目までのペプチド、または該ペプチドにおいて１または複数のアミノ酸が置換、挿入、付加したものであって、且つハンタウイルス抗原活性を有するペプチドを含む抗原蛋白質である。
【００１０】
更に、本発明は、配列番号１〜１３のいずれかのアミノ酸配列を有するハンタウイルス核蛋白における、Ｎ末端側より第１６６番目から第１７５番目までのアミノ酸配列を含むハンタウイルスの増殖を抑制する抗体と反応性のある抗原ペプチドである。
【００１１】
更に、本発明は、ＥＤＶＮＧＩＲＫＰＫおよびＥＤＩＮＧＩＲＲＰＫから選ばれる、ハンタウイルスの増殖を抑制する抗体と反応性のある抗原ペプチドである。
更に、本発明は、ハンタウイルス抗原蛋白質と反応性のあるモノクロナール抗体である。
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明でいうハンタウイルスとは、ブンヤウイルス科（Bunyavirus）のハンタウイルス（Hantavirus）の総称であり、遺伝子は一本鎖ＲＮＡウイルス型として知られ、その中には、血清型およびＲＮＡ３’末端の塩基配列から、ハンタン型（Hantaan）、ソウル型（Seoul）、プーマラ型（Puumala）、プロスペクトヒル型（Prospect Hill）などの株があることが知られている。これらの株の中で、プロスペクトヒル型以外の株は、ヒトに対して病原性を有する。一般にハンタン型（Hantaan）、ソウル型（Seoul）、プーマラ型（Puumala）の株は腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ）を引き起こすことで知られているが、それ以外にも肝炎などを引き起こすとの報告もなされている。また最近になって、フォーコーナー型（Four Corners）と呼ばれる株が、米国を中心に分布していることが知られる様になったが、現状では米国のみの特殊な型であり、遺伝子の相同性も上記３種類の株と比べて低いこと、また症状としてもＨＦＲＳを引き起こさず、急性で死亡率の高い肺炎を引き起こすことなどから、本発明のハンタウイルスの中では、やや特殊な分類学的位置に属するものである。
【００１３】
ハンタウイルスのＲＮＡゲノムには、Ｌゲノム、Ｍゲノム、Ｓゲノムの３本があり、ＬゲノムはＲＮＡポリメラーゼを、Ｍゲノムはウイルス表面の糖蛋白抗原を、ＳゲノムはＲＮＡと結合する核蛋白をコードすることが知られている。Ｓゲノムでコードされる遺伝子から生産されるハンタウイルスの核蛋白質について、そのアミノ酸配列を配列番号１〜配列番号１３に、そしてそれらを比較したものを表１に示す。ここに示すように、分離された株毎に、アミノ酸が少しずつ変異しているが、一般にＲＮＡウイルスは遺伝子の変異が早く、それに伴いウイルスを構成するアミノ酸も変異する傾向が強いことが知られている。
【００１４】
本発明でいう核蛋白のＮ末端より第１番目から第１０３番目までアミノ酸配列を有するペプチドとは、配列番号１〜配列番号１３に示す番号で規定されるものであり、ウイルス株によっては、実際のＮ末端を１とする番号とは若干のずれが生じる場合がある。なお、基準に用いた番号は、ハンタン７６−１１８株の番号に基づくものである。また、ウイルスのＲＮＡ遺伝子が変異しやすい実情から容易に理解できるが、本発明でいう抗原蛋白質とは、配列表に例示するアミノ酸配列だけに限定されるものではない。これらの配列から、１または複数のアミノ酸が置換、挿入、付加したものであって、且つハンタウイルス抗原活性を有するペプチドを含む抗原蛋白質は総て含まれる。ここで、アミノ酸の置換、挿入又は付加は、既に周知技術である部位特異変異誘導（例えば、Nucleic Acid Reserch, Vol. 10, No. 20, P.6487 〜6500, 1982 参照) により実施することができる。アミノ酸の置換、挿入又は付加に関して、１または複数のアミノ酸とは、部位特異変異誘導により置換、挿入又は付加できる程度のアミノ酸を意味する。抗原として好適に利用できる例として配列番号１４に示すアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
【００１５】
本発明でいうアミノ酸残基の番号は、全て表１により規定されるものであり、実際のＮ末端からの数字とは異なる場合がある。即ち、本発明でいう核蛋白のＮ末端より第１番目から第１０３番目までのアミノ酸配列を有するペプチド（ただし、P-HTVC1-1 及びP-HTVC1-2 株については第２番目から第１０４番目までのアミノ酸配列を有するペプチド）とは、表１に示す番号で規定されるものである。ハンタウイルスは、他のＲＮＡウイルスがそうであるように、ウイルス株によっては、アミノ酸配列中に、アミノ酸の欠落、挿入が見られる。こうした場合に、ある株の塩基配列を基準に番号付けを行い、他の株については、ギャップ（配列中に−で示し、この部分はアミノ酸が欠落していることを示す）を挿入すことにより、基準配列と相同性が高くなるように配列しなおし、統一番号で示す方法がとられる。本発明では、他の多くの文献がそうであるようにハンタウイルス７６−１１８株のアミノ酸配列を基準に番号付けを行った。このため各株については、実際のＮ末端を１とする番号とは若干のずれが生じる場合がある。配列番号１から配列番号１３のアミノ酸残基数が各株毎に異なるのはこのためである。
【００１６】
また、ウイルスのＲＮＡ遺伝子が変異しやすい実情から容易に理解できるが、本発明でいう抗原蛋白質とは、配列表に例示するアミノ酸配列だけに限定されるものではない。これらの配列から、１または複数のアミノ酸が置換、挿入及び付加したものであって、且つハンタウイルス抗原活性を有するペプチドを含む抗原蛋白質は総て含まれる。ここで配列番号１４に示すアミノ酸配列は、抗原として好適に利用できる。
【００１７】
【表１】
表１ 配列番号１〜配列番号１３のハンタウイルスの核蛋白のアミノ酸配列比較表
表中の略号は米国ロスアラモスのＧｅｎＢａｎｋに登録されている株の名称であり、Ｐ−ＨＴＮはハンタン型、Ｐ−ＰＵＵはプーマラ型、Ｐ−ＳＲ１１はソウル型、P-RM-97 mexicoとNP-HPSはフォーコーナー型、Ｐ−Ｔｕｌａはプーマラタイプの株である。
【００１９】
本発明でいうハンタウイルス抗原活性を有するペプチドとは、ハンタウイルス核蛋白の第１番目から第１０３番目までの領域と相同性があり、ハンタウイルス核蛋白の第１番目から第１０３番目までの領域のアミノ酸配列からなるペプチドで誘導された抗体が、実質的に、結合することのできるペプチドをさす。
【００２０】
本発明の抗原蛋白質は抗体産生を誘導しやすいものであり、更に誘導された抗体は、本発明の抗原蛋白質との反応性が強い。そのため、ハンタウイルスに感染したヒトの血清中にも当然のことながら、当該抗体が多く存在しており、実際にハンタウイルス感染者の血清と本発明の抗原蛋白質を反応させると、特異的に強く反応するため、当該抗原蛋白質は診断上、特に有用なものとなる。
【００２１】
なお本発明のハンタウイルス核蛋白のアミノ酸配列におけるＮ末端側より第１番目から第１０３番目までに相当する抗原蛋白質を生産することのできる発現プラスミドを含む大腸菌ＪＭ１０９（ｐＩＶ１５）は、平成７年５月２６日付けで、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、その寄託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４９４８である。
【００２２】
また、本発明でいう第１６６番から第１７５番までのアミノ酸配列を有する抗原ペプチドとは、表１に示す番号で規定したものであり、ウイルス株によっては、実際のＮ末端を１とする番号とは若干のずれが生じる場合がある。なお、基準に用いた番号は、ハンタン７６−１１８株の番号に基づくものである。
【００２３】
本発明の抗原ペプチドに対する抗体は、当該抗原ペプチドとの反応性が強い。そのため、ハンタウイルスに感染したヒトの血清中にも、当然のことながら、当該抗体の存在が予測され、実際に、ハンタウイルス感染者の血清と本発明の抗原ペプチドを反応させると、特異的に強く反応する。この様に、当該抗原ペプチドは、診断上でも有用である。
【００２４】
また本発明でいうモノクローナル抗体とは、ハンタウイルス核蛋白における、Ｎ末端側より第１６６番目から第１７５番目までのアミノ酸配列を含む抗原ペプチドと反応するモノクローナル抗体をいう。当該モノクローナル抗体には、ハンタウイルスの増殖を抑制する効果が認められ、当該モノクローナル抗体は、受身投与により、ハンタウイルス感染症増殖を抑制するための治療剤として有用である。更にまた当該モノクローナル抗体はハンタウイルスに強く結合するため、抗原測定用の診断用抗体としても利用でき、ワクチンとしての利用も期待できる。
【００２５】
【発明の効果】
本発明により抗ハンタウイルス抗体とのみ特異的に反応する、診断上有用な抗原蛋白質が得られる。本抗原蛋白質は、偽陽性反応が低く、ハンタウイルスに感染した患者の血液中の抗ハンタウイルス抗体を特異的に捕らえることができる。
【００２６】
また、本発明により、ハンタウイルスの増殖を抑制する抗体と反応する抗原ペプチドが得られる。本発明の抗原ペプチドは、ハンタウイルスの各血清型間で、広い交差反応性があることが特長であり、各種の株を広く捉えるために、幅広いハンタウイルス感染症の抗原として利用でき、また、今後ワクチンとしての利用も期待できる。
【００２７】
また、本発明の抗原ペプチドと反応するモノクローナル抗体は、ハンタウイルスの増殖を抑制する効果が認められている。当該モノクローナル抗体は受身投与により、ハンタウイルス感染症増殖を抑制するための治療剤として有用である。更にまた当該モノクローナル抗体はハンタウイルスに強く結合するため、抗原測定用の診断用抗体としても利用でる。
【００２８】
【実施例】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例によりその技術的範囲が制限されるものではない。
（実施例１） 大腸菌による遺伝子クローニングと遺伝子発現
ハンタンウイルス７６−１１８株のＳゲノムのｃＤＮＡ遺伝子を制限地図で表示すると図１の様である。このうち開始コドンＡＴＧはヌクレオチド番号で３７番目に、終止コドンは１３２６番目に位置し、その間のオープンリーディングフレームから予測すると、１２８７個のヌクレオチドが４２９個のアミノ酸をコードする構造となっている。
【００２９】
ハンタウイルスの遺伝子クローニングにはＰＣＲ法を用い、開始コドンを含むＨＴＮＮＰＡＴＧプライマーと、逆のプライマーＨＴＮＮＰＥＮＤとを用いて遺伝子増幅した。ＨＴＮＮＰＡＴＧプライマーの塩基配列は、ＡＴＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＴＴＡＣＡＧであり、逆鎖（−鎖）用のＨＴＮＮＰＥＮＤプライマーの塩基配列は、ＴＴＡＧＡＧＴＴＴＣＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴである。逆プライマーの最初の塩基配列ＴＴＡは、＋鎖ではＴＡＡとなり終止コドンとなる。増幅に用いたハンタウイルス遺伝子はＳｃｈｍａｌｊｏｈｎらが塩基配列を報告しているハンタンウイルス７６−１１８株のＳゲノム（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５５，ｐｐ．６３３−６４３，１９８６）を使用した。ＰＣＲ法は、宝酒造社ＲＴ−ＰＣＲキットに添付されている試薬および方法で行った。
【００３０】
増幅した遺伝子はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプラスミドＴＡ−クローニングキットを用い、プラスミドベクターｐＣＲに組み込んだ。実施にあたっては、キットに添付されている試薬を用い、キットに示されている方法に従って行った。
核蛋白質内の各種の領域の遺伝子発現を行い、各種の核蛋白断片を得るために、ｐＣＲに組み込んだ遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動後、分離精製した。次に分離した遺伝子を、ＤｒａＩで切断し、結果として、ＥｃｏＲＩ（開始コドンを含む）〜ＤｒａＩ（３４８）までの断片を得た。
【００３１】
得られた断片の末端は粘着末端（Ｃｏｈｅｓｉｖｅ）末端となっており、これをＴ４ポリメラーゼで埋めて、ブラント（Ｂｌｕｎｔ）末端とした。
次いで、この遺伝子断片をプロメガ社から販売しているプラスミドベクターであるピンポイントｐＸａ−２に組み込み、遺伝子の発現プラスミドｐＩＶ１５を作成し、塩基配列が保持されてることを確認した。発現プラスミドｐＩＶ１５はＥｃｏＲＩ（開始コドン）〜ＤｒａＩ（３４８）までの断片を含む。この発現プラスミドｐＩＶ１５から生産される抗原蛋白質のアミノ酸配列を、配列番号１５に示す。この抗原蛋白質は、核蛋白の第１番目から第１０３番目までのアミノ酸配列を含む。
【００３２】
なお、得られたｐＩＶ１５の遺伝子構造は、ｐＸａ−２のマルチクローニング部位のＰｖｕＩＩ位に、配列番号１６の塩基配列の遺伝子が挿入されたものであり、挿入の方向は、ｐＸａ−２遺伝子上のｔａｑプロモーターの下流に、ハンタウイルス遺伝子が正方向に直列につながったものである。また配列番号１６中の１１番目のＡＴＧがハンタンウイルスの開始コドンに相当するが、ｐＩＶ１５では、同じフレームの上流に存在するピンポイント蛋白の開始コドンから、アミノ酸への翻訳が連続しており、結果的にピンポイント蛋白の下流に抗原蛋白が結合した、融合蛋白が得られる。
【００３３】
次に、この発現プラスミドｐＩＶ１５を大腸菌ＪＭ１０９に移入し、ＪＭ１０９を形質転換した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＩＶ１５）を作成した。
ついで、当該大腸菌を使用して、大腸菌体内でビオチン化されるペプチドを上流に持つ融合蛋白を大腸菌に生産させた。この方法は、プロメガ社のマニュアルに従って行った。大腸菌ＪＭ１０９（ｐＩＶ１５）（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９４８）を、５０ｍｌの培養液で培養後、遺伝子発現誘導剤ＩＰＴＧを加え、追加培養後、集菌し、溶菌緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０３％のＳＤＳ）で溶菌した。さらに溶菌した懸濁液を氷上に置き、超音波破砕を行った。更に不溶性画分を除去し、可溶性画分に目的の抗原蛋白質があることを、ウエスタンブロッティング法で確認した。
【００３４】
（実施例２） ＥＬＩＳＡ用抗原蛋白質感作プレートの作成
９６穴のマイクロプレートに５マイクログラム／ｍｌのアビジン溶液を加えて４℃にて一晩置き、アビジンをコートした。その後、プレートは３回洗浄を繰り返し、次いでＢＳＡ溶液を加えてブロッキング操作を行い、更に３回洗浄した。次に、実施例１で作成した発現プラスミドを用いて作成した抗原蛋白質について、蛋白質濃度が４０マイクログラム／ｍｌとなるように調製し、アビジンコートしたプレートに加え、室温にて１時間、静置した。その後洗浄を繰り返すことにより、抗ハンタウイルス抗体の評価に使用するＥＬＩＳＡ用プレートを作成した。
【００３５】
（実施例３） 抗原蛋白質の評価
ハンタウイルスに感染した５人の患者から採血した陽性血清５種類（Ａ〜Ｅ）と、正常者５人から採血した正常血清５種類（Ｆ〜Ｊ）を検定に使用した。これらの血清を、実施例２で作成したＥＬＩＳＡプレートに、各１００マイクロリットルずつ加え、３７℃にて１時間静置した後洗浄し、ついで二次抗体としてパーオキシダーゼ標識した羊由来の抗ヒトＩｇＧ抗体溶液を加え、３７℃で１時間静置した。洗浄後、発色溶液ＡＢＴＳを加え、３０分静置後、発色の度合を波長４０５ｎｍで測定した。この結果を表２に示す。
【００３６】
（比較例１）
核蛋白質内の各種の領域の遺伝子発現を行い、各種の核蛋白断片を得るために、ｐＣＲに組み込んだ遺伝子を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、アガロースゲル電気泳動後、分離精製した。次に分離した遺伝子を、制限酵素ＢａｍＨＩ，ＤｒａＩ，ＢａｎＩＩ，ＰｖｕＩＩを組み合わせて切断し、結果として、ＥｃｏＲＩ（開始コドンを含む）〜ＤｒａＩ（３４８）までの断片、ＢａｍＨＩ（１３８）〜ＢａｍＨＩ（１２４２）までの断片、ＤｒａＩ（３４８）〜ＢａｎＩＩ（６４６）までの断片、ＢａｎＩＩ（６４６）〜ＰｖｕＩＩ（９１０）までの断片、ＢａｎＩＩ（６４６）〜ＥｃｏＲＩ（終止コドンを含む）までの断片、ＰｖｕＩＩ（９１０）〜ＢａｍＨＩ（１２４２）までの断片を得た。
【００３７】
次いで、これらの遺伝子断片をそれぞれ、プロメガ社から販売しているプラスミドベクターであるピンポイントｐＸａ−１，ｐＸａ−２，ｐＸａ−３に組み込み、以下に示す各種の遺伝子発現プラスミドを作成し、塩基配列が保持されてることを確認した。
各種の発現プラスミドは以下の通りである。
【００３８】
発現プラスミド１
ＥｃｏＲＩ（開始コドン）〜ＥｃｏＲＩ（終止コドン）までの断片を含む
発現プラスミド２
ＢａｍＨＩ（１３８）〜ＢａｍＨＩ（１２４２）までの断片を含む
発現プラスミド３
ＤｒａＩ（３４８）〜ＢａｎＩＩ（６４６）までの断片を含む
発現プラスミド４
ＢａｎＩＩ（６４６）〜ＰｖｕＩＩ（９１０）までの断片を含む
発現プラスミド５
ＢａｎＩＩ（６４６）〜ＥｃｏＲＩ（終止コドン）までの断片を含む
発現プラスミド６
ＰｖｕＩＩ（９１０）〜ＢａｍＨＩ（１２４２）までの断片を含む
発現プラスミドから生産される各種の比較抗原
【００３９】
比較抗原１．発現プラスミド１から生産される抗原蛋白質で、核蛋白の第１番目から第４２９番目までのアミノ酸配列を含む。
比較抗原２．発現プラスミド２から生産される抗原蛋白質で、核蛋白の第３４番目から第４０３番目までのアミノ酸配列を含む。
比較抗原３．発現プラスミド３から生産される抗原蛋白質で、核蛋白の第１０４番目から第２０４番目までのアミノ酸配列を含む。
比較抗原４．発現プラスミド４から生産される抗原蛋白質で、核蛋白の第２０５番目から第２９０番目までのアミノ酸配列を含む。
比較抗原５．発現プラスミド５から生産される抗原蛋白質で、核蛋白の第２０５番目から第４２９番目までのアミノ酸配列を含む。
比較抗原６．発現プラスミド６から生産される抗原蛋白質で、核蛋白の第２９１番目から第４０３番目までのアミノ酸配列を含む。
【００４０】
次に、実施例１と同じ方法により、これらのプラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、大腸菌体内でビオチン化されるペプチドを上流に持つ、融合蛋白を大腸菌に生産させた。この方法は、プロメガ社のマニュアルに従った。
形質転換された大腸菌は、５０ｍｌの培養液で培養後、集菌し、溶菌緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ、ｐＨ７．２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．０３％のＳＤＳ）で溶菌した後、懸濁液を氷上にて超音波破砕した。更に不溶性画分を除去し、可溶性画分に目的の抗原蛋白質があることを、ウエスタンブロッティング法で確認した。
【００４１】
（比較例２） ＥＬＩＳＡ用抗原蛋白質感作プレートの作成
実施例１と同じ方法により、９６穴のマイクロプレートに５マイクログラム／ｍｌのアビジン溶液を加えて４℃にて一晩置き、アビジンをコートした。その後、プレートは３回洗浄を繰り返し、次いでＢＳＡ溶液を加えてブロッキング操作を行い、更に３回洗浄した。次に、比較例１で作成した発現プラスミドを用いて作成した６種類の抗原蛋白質について、各種の抗原蛋白質の濃度がそれぞれ４０マイクログラム／ｍｌとなるように調製し、アビジンコートしたプレートに加え、室温にて１時間、静置した。その後洗浄を繰り返すことにより、抗ハンタウイルス抗体の評価に使用するＥＬＩＳＡ用プレートを作成した。
抗ハンタウイルス抗体の確認に使用する二次抗体としては、パーオキシダーゼを固定化した羊由来の抗体を使用した。
【００４２】
（比較例３） 抗原蛋白質の評価
実施例１と同じ方法により、ハンタウイルスに感染した５人の患者から採血した陽性血清５種類（Ａ〜Ｅ）と、正常者５人から採血した正常血清５種類（Ｆ〜Ｊ）を検定用に使用した。これらの血清を、実施例２で作成したＥＬＩＳＡプレートに、各１００マイクロリットルずつ加え、３７℃にて１時間静置した後洗浄し、洗浄後、パーオキシダーゼ標識した羊由来の抗ヒトＩｇＧ抗体溶液を加え、３７℃で１時間静置した。洗浄後、発色溶液ＡＢＴＳを加え、３０分静置後、発色の度合を波長４０５ｎｍで測定した。その結果を表２にまとめて示す。
【００４３】
【表２】
表２ 実施例３および比較例３の結果
この表２における、実施例３と比較例３の結果から、抗原蛋白質の抗原性と比較抗原１の抗原性がほぼ一致し、抗原部位がＮ末端から１０３番目までの位置に存在していることが分かる。また抗原蛋白質が正常血清とは全く反応しないのに対し、比較抗原１は正常者との偽陽性反応が見られること、陽性検体について反応性が低い場合があること等の欠点がみられた。この様に、本発明の抗原蛋白質が診断用抗原として優れていることが分かる。
【００４５】
（実施例４） 細胞融合によるモノクローナル抗体生産株の作成
モノクローナル抗体生産株は、以下の様な手順で作成した。この実験は、通常の実験手順書に従って追試できる。まず、韓国ＫＴＣＣに登録されているハンタンウイルス７６１１８株（ＡＴＣＣ ＶＲ．９８３）を、Ｖｅｒｏ／Ｅ６株細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５８６）に感染させ、感染細胞中でウイルスを培養した。次に、感染細胞が１０の７乗個／ｍｌの濃度になるようにし、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／ＰＢＳで処理して、ウイルス粗精製抗原を得た。次に、得られた粗精製抗原を用いて、マウスに免疫した。次いで当該粗抗原をフロイドの完全アジュバントと等量混合し、１００マイクロリットルをＢＡＬＢ／Ｃマウス後肢筋肉内に注射した。３回の追加免疫は不完全アジュバントを用いて同様に行った。最後に抗原液を、アジュバントを混合せずにマウスの腹腔内に注射し、その３日後に脾細胞を回収した。ついで、当該脾細胞をＡＴＣＣに登録されている骨髄腫細胞P3-X63-Ag8-U1株と細胞融合させた。融合は実験手順書に従って、ＰＥＧ１５００法を採用して行った。
【００４６】
（実施例５） モノクローナル抗体生産株の選択
実施例４では各種の細胞融合候補株が得られた。これらの中から、まずモノクローナル抗体生産株を選択した。この方法は、吉松らが既に報告している蛍光抗体法によるもので（Yoshimatsu, K., Arikawa, J. & Kariwa, H., J. Vet. Med. Sci., Vol.55, pp.1047-1050, 1993.）、抗体分泌株のスクリーニングを行う方法である。ここで、蛍光抗体法に使用した二次抗体には、カペル社のＦＩＴＣ結合羊由来抗マウスＩｇ（Ｇ＋Ａ＋Ｍ）抗体を使用した。こうしてＥ５／Ｇ６株、ＫＡ０６株など、１７株のモノクローナル抗体生産株が得られた。
次にこれらの中から、ハンタウイルスの増殖を抑制する効果を有するモノクローナル抗体を選択した。このスクリーニング方法は、競争結合アッセイ法であり、ラフォンらの方法に従って行った（Lafon, M. & Lafage, M., J. Gen. Virol. Vol.68, pp.3113-3123, 1987.）。
【００４７】
まず１０の６乗個のＶｅｒｏ−Ｅ６細胞を２５平方センチのフラスコに入れて４８時間培養し、培養終了後、培養細胞を５ｍｌのＥＭＥＭで２回洗浄した。ついで１７種類のモノクローナル抗体と、対照となるマウス抗体ＩｇＧを、各々、ＥＭＥＭで希釈し、６００マイクロリットルの溶液とした。ついで、当該抗体溶液を培養細胞上に注いだ。引き続き、培養細胞をシリコンゴムプレートではぎ取り、５％ＦＣＳを含む４ｍｌの氷冷ＥＭＥＭで洗浄した。２回目の洗浄が終わると、モノクローナル抗体が付加された培養細胞を、２７Ｇ針の注射器で分散、懸濁させ、組織培養用のプレートに分注した。そしてモノクローナル抗体が付加された培養細胞を、一晩培養し、ついでハンタンウイルス７６１１８株またはソウルウイルスＳＲ１１株を、各々ｍ．ｏ．ｉ．が０．１となるように接種した。細胞は、０，１，４，７日後に、アセトンで固定化した。培養細胞中で増殖したウイルス抗原の検出には、蛍光抗体法を利用した。この結果を表３に示す。
【００４８】
【表３】
表３ ハンタウイルス増殖抑制効果の結果
実験Ａ
判定株：ハンタンウイルス７６−１１８株
実験Ｂ
判定株：ソウルウイルスＳＲ１１株
この表３から、Ｅ５／Ｇ６株から産生されるモノクローナル抗体にのみ、ハンタウイルスの増殖を抑制する効果が認められた。同時に行った、ＫＡ０６株など、他の１６株には、この様な抑制効果は見られなかった。また同時に、実験の対照として使用したマウス抗体ＩｇＧには、全く抑制効果は見られなかった。このことは、Ｅ５／Ｇ６モノクローナル抗体は受身投与により、ハンタウイルス感染症増殖を抑制するための治療剤として有用であることを示している。
また本モノクローナル抗体がハンタウイルスに強く結合することが判明したため、抗原測定用の診断用抗体として利用できることも判明した。
【００５１】
（実施例６） モノクローナル抗体の結合部位の特定
実施例５で得られたＥ５／Ｇ６株モノクローナル抗体の結合部位を特定するために、まず比較例１で作成した比較抗原１〜比較抗原６の、６種類の抗原との反応性を調べた。その結果、当該モノクローナル抗体が比較抗原１、比較抗原３とのみ反応することが判明し、まず結合部位がアミノ酸配列の第１０４番目から２０４番目までの間にあることが判明した。また更に、ＰＥＰＳＣＡＮアッセイを行い、詳しい結合部位の特定を行った。ＰＥＰＳＣＡＮアッセイは、Lundkvistらの方法に従って行った。（Lundkvist, A., Bjorsten, S., Niklasson, B. & Ahlborg, N., Clinical Diagnostic Lab. Immunol., Vol.2, pp.82-86, 1995.）。ＰＥＰＳＣＡＮアッセイは、Ｎ末端（第１番目）〜Ｃ末端（第４２９番目）までの全領域について、１０残基の連続した合成ペプチドを、５アミノ酸ずつずらして作成し、それらの抗原性を評価するＥＬＩＳＡ法の一種であり、一次抗体にＥ５／Ｇ６株モノクローナル抗体、二次抗体に羊由来パーオキシダーゼ標識抗マウス抗体を使用した。この結果を表４に示す。
【００５２】
【表４】
表４ ＰＥＰＳＣＡＮアッセイの結果
この表４の実験結果から、Ｅ５／Ｇ６株が産生するモノクローナル抗体は、ハンタウイルスのアミノ酸配列で、第１６６番目から第１７５番目に相当する、連続する１０残基にあることが特定された。
【００５４】
さらに合成ペプチドを用いて、競合阻害試験を行い、エピトープの確定を行った。合成ペプチドはハンタンウイルスおよびソウルウイルスの第１６６番目から第１７５番目に相当するＥＤＶＮＧＩＲＫＰＫ（抗原ペプチドＡ）と、プーマラウイルスの第１６６番目から第１７５番目に相当するＥＤＩＮＧＩＲＲＰＫ（抗原ペプチドＢ）の２種を作成した。まずこれらの合成ペプチドの５ｍｇ／ｍｌの溶液を作成し、それを順次５倍ずつ希釈した希釈系列を作成し、Ｅ５／Ｇ６株モノクローナル抗体と混合し、４℃で一晩インキュベーションした。この混合液を、ハンタウイルス抗原をコートした９６穴のプレートに加え、引続き二次抗体として羊由来標識抗マウス抗体を使用して、ＥＬＩＳＡを行った。モノクローナル抗体が予め抗原ペプチドと反応していれば、ＥＬＩＳＡでの発色は低くなり、阻害率は大きくなる。この結果を、以下の式で表される阻害率で表示する。
【００５５】
【００５６】
【表５】
表５ モノクローナル抗体と抗原ペプチドのプレインキュベーションによるＥＬＩＳＡ反応の競合阻害実験結果
この様に、ハンタウイルスを抗原として用いるＥＬＩＳＡにおいて、抗原ペプチドの濃度に依存する阻害がみられることが判明した。このことから、当該領域が、Ｅ５／Ｇ６株モノクローナル抗体に対するエピトープであることが明らかになった。
【００５８】
（実施例７） 抗原ペプチドの評価
実施例６で特定された、ハンタウイルスのアミノ酸配列で第１６６番目から第１７５番目までの抗原ペプチドを作成し、診断用抗原としての評価を行った。
評価には９６穴のマイクロプレートを使用し、ＥＬＩＳＡ作成キットを用いて、抗原ペプチドをウェルに固定化した。用いた抗原ペプチドは、ハンタンウイルスおよびソウルウイルス核蛋白の第１６６番目から第１７５番目に相当するＥＤＶＮＧＩＲＫＰＫ（抗原ペプチドＡ）と、プーマラウイルス核蛋白の第１６６番目から第１７５番目のペプチドに相当するＥＤＩＮＧＩＲＲＰＫ（抗原ペプチドＢ）を含む抗原ペプチドの２種を用いて行った。
まず、通常の手順に従って、５種類の個別患者血清（１〜５）と５種類の個別正常者血清（６〜１０）を用いて、抗原の評価を行った。この結果を表６に示す。
【００５９】
【表６】
表６ 実施例７の抗原ペプチドの評価
また、抗原ペプチドＡ、抗原ペプチドＢを用いて、各種のハンタウイルス株に対する抗体との反応性を調べたところ、これらの抗原ペプチドは、ともにハンタンウイルス７６−１１８株、ソウルウイルスＳＲ１１株、プロスペクトヒルウイルス、プーマラウイルスＳｏｔｋａｍｏ株の抗体と、広く反応した。この様に、当該抗原ペプチドは各種株に対し広い交差性を示すため、広くハンタウイルス感染症を診断する診断用抗原としても有用であることが判明した。
【００６１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ハンタウイルスのＳゲノムについて、遺伝子構造と制限地図を示す図。
Claims (2)
- 配列番号１もしくは９のアミノ酸配列からなるハンタウイルス核蛋白におけるＮ末端側より第１番目から第１０３番目までのアミノ酸配列、又は配列番号２もしくは３のアミノ酸配列からなるハンタウイルス核蛋白におけるＮ末端側より第２番目から第１０４番目までのアミノ酸配列からなるハンタウイルス抗原活性を有するペプチド。
- 配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のペプチド。
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