JPH02211881A - ＨＩＶに対する中和抗体を誘発するかまたはかかる抗体によって認識され得る免疫原配列を含むＨＢｓＡｇ抗原の形態学的特徴を有する組換えハイブリッドＨＢｓＡｇ粒子、かかる粒子をコードするヌクレオチド配列及び核粒子を含むワクチン - Google Patents
ＨＩＶに対する中和抗体を誘発するかまたはかかる抗体によって認識され得る免疫原配列を含むＨＢｓＡｇ抗原の形態学的特徴を有する組換えハイブリッドＨＢｓＡｇ粒子、かかる粒子をコードするヌクレオチド配列及び核粒子を含むワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ＨＩＶ族（ｆａｍｉｌｌｅ）のレトロウィル
スに対する中和抗体を誘発するかまたはかかる抗体によ
って認識され得る免疫原アミノ酸配列を含むＨＢｓＡｇ
抗原の形態学的特徴を有するハイブリッド組換え粒子に
係る。
スに対する中和抗体を誘発するかまたはかかる抗体によ
って認識され得る免疫原アミノ酸配列を含むＨＢｓＡｇ
抗原の形態学的特徴を有するハイブリッド組換え粒子に
係る。
本発明の目的はまた、任意に真核細胞宿主のポリメラー
ゼによって認識されるプロモーターのコントロール下に
、組換えハイブリッド核酸によりて形成されたインサー
トを含む組換え核酸または組換えベクターを提供するこ
とである。該組換え核酸は、前記真核細胞宿主に前記組
換えハイブリッド粒子を産生させるために必要な遺伝情
報を保有している。前記組換えベクターによって形質転
換された真核細胞宿主も本発明の目的の１つである。
ゼによって認識されるプロモーターのコントロール下に
、組換えハイブリッド核酸によりて形成されたインサー
トを含む組換え核酸または組換えベクターを提供するこ
とである。該組換え核酸は、前記真核細胞宿主に前記組
換えハイブリッド粒子を産生させるために必要な遺伝情
報を保有している。前記組換えベクターによって形質転
換された真核細胞宿主も本発明の目的の１つである。
本発明は、前記組換え粒子を介して、エイズまたはエイ
ズの前駆症状、特にリンパ節障害症候群（ＬＡＳ）に対
する新規な予防手段を提供する。
ズの前駆症状、特にリンパ節障害症候群（ＬＡＳ）に対
する新規な予防手段を提供する。
より詳細には本発明は、ＨＩＶレトロウィルスに対する
中和抗体の形成を誘発する能力をもつこの種の組換え粒
子、及び、ＨＩｖレトロウィルス感染を予防するワクチ
ン組成物の製造における該組換え粒子の使用に係る。
中和抗体の形成を誘発する能力をもつこの種の組換え粒
子、及び、ＨＩｖレトロウィルス感染を予防するワクチ
ン組成物の製造における該組換え粒子の使用に係る。
本発明の目的はまた、エイズを防御する免疫原特性を有
する適当なペプチド及びポリペプチド、特に前記組換え
粒子を製造するためのＨＩＶまたはＳＩＶレトロウィル
スのエンベロープのポリペプチドを提供することである
。
する適当なペプチド及びポリペプチド、特に前記組換え
粒子を製造するためのＨＩＶまたはＳＩＶレトロウィル
スのエンベロープのポリペプチドを提供することである
。
本発明は更に、前記ペプチド及びポリペプチドをコード
する核酸及び該核酸を含むベクターに係る。
する核酸及び該核酸を含むベクターに係る。
ＨＩｖ感染のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断を行なうために前記
手段を使用することも本発明の目的の１つである。
手段を使用することも本発明の目的の１つである。
後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に先立って、リンパ
節障害症候群（ＬＡＳ）の原因となる病原物質が・しば
しば検出されることが判ってきた。
節障害症候群（ＬＡＳ）の原因となる病原物質が・しば
しば検出されることが判ってきた。
ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃ
ｙ Ｖｉｒｕｓの略称）なる用語は、ある種の条件下に
、ときにはヒトの後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に
つながるＬＡＳを発症せしめる複数のヒトレトロウィル
スを意味する。
ｙ Ｖｉｒｕｓの略称）なる用語は、ある種の条件下に
、ときにはヒトの後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に
つながるＬＡＳを発症せしめる複数のヒトレトロウィル
スを意味する。
例えば、最初に単離されたウィルスはＬＡＶ−１または
ＨＩＶ−１と命名されて、英国特許出願第８３７２４，
８００号及び１９８４年９月１４日の欧州特許出願第８
４７４０１８３４号に記載された。このウィルスはまた
、Ｆ。
ＨＩＶ−１と命名されて、英国特許出願第８３７２４，
８００号及び１９８４年９月１４日の欧州特許出願第８
４７４０１８３４号に記載された。このウィルスはまた
、Ｆ。
Ｂａｒｒｅ ５ｉｎｏｕｓｓｉ等によって５ｃｉｅｎｃ
ｅ、 ２２０、Ｎｏ、４５〜９９．２０．８６８〜８７
１ページに記載された。
ｅ、 ２２０、Ｎｏ、４５〜９９．２０．８６８〜８７
１ページに記載された。
ＬＡＶ ＥＬｌ及びＬＡＹ ＭＡＬト命名されり、：（
７）ＨＩＶ−１ウイルスの変種も単離及び特性決定され
、欧州特許出願第８４７４０１．８３４号に記載されて
いる。
７）ＨＩＶ−１ウイルスの変種も単離及び特性決定され
、欧州特許出願第８４７４０１．８３４号に記載されて
いる。
別のクラスに所属し前記レトロウィルスとの免疫頭領性
が小さいレトロウィルスの単離及び特性決定は、欧州特
許出願第８７／４００，１５１．４（公開第２３９゜４
２５号）に記載されている。ＨＩＶ〜２として分類され
たこれらのレトロウィルスは、リンパ節障害症候群また
はエイズの症状を示す複数のアフリカ人患者から単離さ
れた。
が小さいレトロウィルスの単離及び特性決定は、欧州特
許出願第８７／４００，１５１．４（公開第２３９゜４
２５号）に記載されている。ＨＩＶ〜２として分類され
たこれらのレトロウィルスは、リンパ節障害症候群また
はエイズの症状を示す複数のアフリカ人患者から単離さ
れた。
上記のごときＨＩＶレトロウィルスの研究、それらのヌ
クレオチド配列の単離及び分析、それらの抗原タンパク
質の特性決定を行なった結果、得られな種々の株の構造
的及び機能的な類似性または逆に特異性を比較研究する
ことが可能になった。
クレオチド配列の単離及び分析、それらの抗原タンパク
質の特性決定を行なった結果、得られな種々の株の構造
的及び機能的な類似性または逆に特異性を比較研究する
ことが可能になった。
これらのレトロウィルスＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２はま
た、サル起源のレトロウィルス（ＳＩＶまたは５ＴＬＶ
−Ｉｆｆと略称）との比較によって研究され、この研究
の結果から、レトロウィルスＦＩＩＶ−２及びその変種
とレトロウィルスＳＩＶとの間のタンパク質及び糖タン
パク質の免疫学的類似性が証明された。レトロウィルス
ＳＩＶのエンベロープ糖タンパク質はレトロウィルスＨ
ＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質に対する抗体と免
疫学的に反応しまたその逆の反応も生じる。これに反し
て、レトロウィルスＳＩＶまたはレトロウィルスｕｒｖ
−ｚのエンベロープ糖タンパク質はレトロウィルスＲＴ
Ｖ−１のエンベロープ糖タンパク質と免疫学的交差反応
を生じない。
た、サル起源のレトロウィルス（ＳＩＶまたは５ＴＬＶ
−Ｉｆｆと略称）との比較によって研究され、この研究
の結果から、レトロウィルスＦＩＩＶ−２及びその変種
とレトロウィルスＳＩＶとの間のタンパク質及び糖タン
パク質の免疫学的類似性が証明された。レトロウィルス
ＳＩＶのエンベロープ糖タンパク質はレトロウィルスＨ
ＩＶ−２のエンベロープ糖タンパク質に対する抗体と免
疫学的に反応しまたその逆の反応も生じる。これに反し
て、レトロウィルスＳＩＶまたはレトロウィルスｕｒｖ
−ｚのエンベロープ糖タンパク質はレトロウィルスＲＴ
Ｖ−１のエンベロープ糖タンパク質と免疫学的交差反応
を生じない。
発明者等は、これらのレトロウィルスの表面抗原の構造
に関する研究から、これらの抗原、特にこれらのレトロ
ウィルスのエンベロープ糖タンパク質またはトランスメ
ンブラン糖タンパク質に所属する種々のペプチド及びポ
リペプチドの免疫原特性に注目した。
に関する研究から、これらの抗原、特にこれらのレトロ
ウィルスのエンベロープ糖タンパク質またはトランスメ
ンブラン糖タンパク質に所属する種々のペプチド及びポ
リペプチドの免疫原特性に注目した。
これらの糖タンパク質のペプチド構造に含まれる配列を
有する種々の特性的ペプチド及びポリペプチドは、該レ
トロウィルスに直接由来するかまたは化学的方法で合成
されたかにがかわりなく、免疫原性が比較的弱い。
有する種々の特性的ペプチド及びポリペプチドは、該レ
トロウィルスに直接由来するかまたは化学的方法で合成
されたかにがかわりなく、免疫原性が比較的弱い。
本発明において発明者等は１．ＦＩＩＶのエンベロープ
糖タンパク質またはメンプラン糖タンパク質に由来する
前記のごときペプチドもしくはポリペプチドまたは夫々
の配列の認識がら作成された前記のごときペプチドまた
はポリペプチドまたは機能的に類似の配列の免疫原性を
強化し得る手段、特にＩ（ＴＶタイプの１つまたは複数
のレトロウィルスより詳細には、発明者等の研究の目的
は、一方の成分が前記ペプチドまたはポリペプチドから
成り、他方の成分がＢ型肝炎ウィルスの表面抗原（しば
しばＨＢ ｓ Ａ ｇまたはより簡単にＨＢｓと略称）
の本質的な免疫原特性及び免疫学的特性を有する粒子か
ら成る混合生物学的構造を作成することであった。
糖タンパク質またはメンプラン糖タンパク質に由来する
前記のごときペプチドもしくはポリペプチドまたは夫々
の配列の認識がら作成された前記のごときペプチドまた
はポリペプチドまたは機能的に類似の配列の免疫原性を
強化し得る手段、特にＩ（ＴＶタイプの１つまたは複数
のレトロウィルスより詳細には、発明者等の研究の目的
は、一方の成分が前記ペプチドまたはポリペプチドから
成り、他方の成分がＢ型肝炎ウィルスの表面抗原（しば
しばＨＢ ｓ Ａ ｇまたはより簡単にＨＢｓと略称）
の本質的な免疫原特性及び免疫学的特性を有する粒子か
ら成る混合生物学的構造を作成することであった。
天然ＨＢｓＡｇ抗原の本質的な形態学的特徴及び免疫原
特性を有しており真核細胞中のＢ型肝炎ウィルスのＳ遺
伝子の発現によって産生される粒子は、１９８１年４月
２２日出願の欧州特許第００３８７６５号に記載されて
いる。簡単に説明すると、これらのＨＢｓ粒子は、直径
的１７〜２５ｒ＋ｍ、特に２２ｎｍのサイズを有する。
特性を有しており真核細胞中のＢ型肝炎ウィルスのＳ遺
伝子の発現によって産生される粒子は、１９８１年４月
２２日出願の欧州特許第００３８７６５号に記載されて
いる。簡単に説明すると、これらのＨＢｓ粒子は、直径
的１７〜２５ｒ＋ｍ、特に２２ｎｍのサイズを有する。
これらの粒子はまた、Ｍ、 Ｆ、 ＤｔｌＢＯＩＳ等（
１９８０）、子は、酵ｉ（Ｐ、 Ｖ＾ＬＥＮＺＵＥＬΔ
等、（１９８２）、Ｎａｔｕｒｅ、２９８．３４７〜３
５０）中でも得られた。または組換えウィルスを介して
も得られた（Ｇ、Ｌ、ＳＭｒＴｌ（等、（１９８３）、
Ｎａｔｕｒｅ、 ３０２．４９０〜４９５）。
１９８０）、子は、酵ｉ（Ｐ、 Ｖ＾ＬＥＮＺＵＥＬΔ
等、（１９８２）、Ｎａｔｕｒｅ、２９８．３４７〜３
５０）中でも得られた。または組換えウィルスを介して
も得られた（Ｇ、Ｌ、ＳＭｒＴｌ（等、（１９８３）、
Ｎａｔｕｒｅ、 ３０２．４９０〜４９５）。
これらの粒子の製造方法では、真核細胞中で有効なプロ
モーターの支配下にＳ遺伝子を含む適当なベクターによ
って真核細胞を形質転換し、形質転換された細胞を培養
し、産生された粒子を予め溶菌した細胞から回収するか
、または粒子が使用細胞系（特にサル、ハムスター、マ
ウス等の細胞を使用する場合）によって培地に分泌され
るときポリペプチドは分子量（Ｈ）約２５４００ダルト
ンである。主要タンパク質がグリコジル形のときは該分
子量は約２７０００ダルトンである。
モーターの支配下にＳ遺伝子を含む適当なベクターによ
って真核細胞を形質転換し、形質転換された細胞を培養
し、産生された粒子を予め溶菌した細胞から回収するか
、または粒子が使用細胞系（特にサル、ハムスター、マ
ウス等の細胞を使用する場合）によって培地に分泌され
るときポリペプチドは分子量（Ｈ）約２５４００ダルト
ンである。主要タンパク質がグリコジル形のときは該分
子量は約２７０００ダルトンである。
本発明において発明者等はまた、主要ポリペプチドと同
じＣ末端をもつＳ領域によってコードされる前記主要ポ
リペプチドのポリペプチド配列を含み、更にＮ末端位に
Ｂ型肝炎ゲノムのプレＳ２領域によってコードされる５
５個のアミノ酸の付加配列（ＳＴＩＢＢＥ Ｘ、及びＧ
ＥＲ［、ＩＣＩｒ Ｗ、 Ｈ，、（１９８３）、Ｊ。
じＣ末端をもつＳ領域によってコードされる前記主要ポ
リペプチドのポリペプチド配列を含み、更にＮ末端位に
Ｂ型肝炎ゲノムのプレＳ２領域によってコードされる５
５個のアミノ酸の付加配列（ＳＴＩＢＢＥ Ｘ、及びＧ
ＥＲ［、ＩＣＩｒ Ｗ、 Ｈ，、（１９８３）、Ｊ。
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、４６．６２６〜６２８）を含むより
高い分子量（約３４０００ダルトン）のタンパク質の製
造に注目した。
高い分子量（約３４０００ダルトン）のタンパク質の製
造に注目した。
発明者等はまた、Ｓ領域、プレＳ１領域及びプレＳ２領
域（これらの２つのドメインを合わせてプレＳと指体す
る）の転写によって得られる粒子を研究した。
域（これらの２つのドメインを合わせてプレＳと指体す
る）の転写によって得られる粒子を研究した。
前記組換えタンパク質はサイズ約２２ｎｍの粒子として
集合する。
集合する。
本発明は、所望の結果を得るなめに以下のごとき複数の
協力因子を１つの統合体（ｅｎｔｉｔどｃｏｗｎｕｎｅ
）として結合することによって得られる。
協力因子を１つの統合体（ｅｎｔｉｔどｃｏｗｎｕｎｅ
）として結合することによって得られる。
１／複数のＴ及びＢエピトープ部位を含むＨＢｓＡｙ粒
子から成る支持体。エピトープ部位が修飾されないとき
（及び表面タンパク質がＢ型肝炎ウィルスのゲノムのプ
レＳ領域によってコードされるアミノ酸配列を含むとき
に）防御免疫原性が獲得される。
子から成る支持体。エピトープ部位が修飾されないとき
（及び表面タンパク質がＢ型肝炎ウィルスのゲノムのプ
レＳ領域によってコードされるアミノ酸配列を含むとき
に）防御免疫原性が獲得される。
Ｚ／ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質に由来の免疫原
Ｔエピトープ。
Ｔエピトープ。
３／同じ（）ＩＩＶのエンベロープ糖タンパク質に所属
する本発明の形態のＢエピトープ。
する本発明の形態のＢエピトープ。
４／好ましくはＴ４リンパ球のＣＤ４レセプターとの結
合部位、この部位は、上記因子と共にＨＩＶに対する中
和抗体のｉｎ ｖｉｖｏ銹発に関与し、ウィルス固定部
位に案内されたときの形成抗体の遮断作用を伴う細胞応
答の誘発に関与する。
合部位、この部位は、上記因子と共にＨＩＶに対する中
和抗体のｉｎ ｖｉｖｏ銹発に関与し、ウィルス固定部
位に案内されたときの形成抗体の遮断作用を伴う細胞応
答の誘発に関与する。
発明者等の目的は、ｔｒＢｓＡｙ粒子の本質的な形態学
的特徴を有し、Ｂ型肝炎ウィルスのゲノムのＳ領域によ
ってコードされるアミノ酸配列（Ｓ）の本質的部分及び
任意に該アミノ酸配列（Ｓ）の上流のる中和抗体を誘発
するかまさがる抗体によ・て認識され得る免疫原アミノ
酸配列を含み、この配列自体が、Ｂリンパ球によって認
識され得る少なくとも１つのエピトープとＴリンパ球に
よって認識され得る少なくとも１つのエピトープとを含
み、前記免疫原アミノ酸配列がプレＳアミノ酸配列に挿
入されるかまたはプレＳタンパク質の全部または一部に
置換していることを特徴とする組換えハイブリッド粒子
の製造によって達成された。
的特徴を有し、Ｂ型肝炎ウィルスのゲノムのＳ領域によ
ってコードされるアミノ酸配列（Ｓ）の本質的部分及び
任意に該アミノ酸配列（Ｓ）の上流のる中和抗体を誘発
するかまさがる抗体によ・て認識され得る免疫原アミノ
酸配列を含み、この配列自体が、Ｂリンパ球によって認
識され得る少なくとも１つのエピトープとＴリンパ球に
よって認識され得る少なくとも１つのエピトープとを含
み、前記免疫原アミノ酸配列がプレＳアミノ酸配列に挿
入されるかまたはプレＳタンパク質の全部または一部に
置換していることを特徴とする組換えハイブリッド粒子
の製造によって達成された。
特に好ましくは、前記組換えハイブリッド粒子が更に、
ヒトＴ４リンパ球のＣＤ４レセプターとの結合部位を含
む。
ヒトＴ４リンパ球のＣＤ４レセプターとの結合部位を含
む。
本発明はまた、前記のごとき粒子を産生できるようにコ
ンピテント細胞を後で形質転換せしめる組換えベクター
に係る。
ンピテント細胞を後で形質転換せしめる組換えベクター
に係る。
本発明の組換えベクターは、Ｂ型肝炎ウィルスの主要表
面抗原のＳ領域及び任意にプレＳ領域の全部もしくは一
部に対応する核酸フラグメントを含み、コンピテント真
核細胞宿主に導入されると、形質転換された細胞宿主の
培養の際に、ＨＢｓＡｙ抗原の本質的な形態学的特徴を
有し、ＨＢｓＡｙ抗原のＳタンパク質の特性アミノ酸配
列を含む粒子の産生を誘発し得、好ましくは培地中に粒
子を分泌し得る０組換えベクターの特徴は、 一部に、Ｉ（ＩＶ族のレトロウィルスに対する中和抗体
を誘発するかまたはかかる抗体によって認識さ球によっ
て認識され得る少なくとも１つのエピトープとＴリンパ
球によって認識され得る少なくとも１つのエピトープと
を含む ≠孝会参こと、及び、 一前記外来ヌクレオチド配列が前記プレＳ領域に挿入さ
れるかまたは前記プレＳ領域の全部または一部に置換し
ていることである。
面抗原のＳ領域及び任意にプレＳ領域の全部もしくは一
部に対応する核酸フラグメントを含み、コンピテント真
核細胞宿主に導入されると、形質転換された細胞宿主の
培養の際に、ＨＢｓＡｙ抗原の本質的な形態学的特徴を
有し、ＨＢｓＡｙ抗原のＳタンパク質の特性アミノ酸配
列を含む粒子の産生を誘発し得、好ましくは培地中に粒
子を分泌し得る０組換えベクターの特徴は、 一部に、Ｉ（ＩＶ族のレトロウィルスに対する中和抗体
を誘発するかまたはかかる抗体によって認識さ球によっ
て認識され得る少なくとも１つのエピトープとＴリンパ
球によって認識され得る少なくとも１つのエピトープと
を含む ≠孝会参こと、及び、 一前記外来ヌクレオチド配列が前記プレＳ領域に挿入さ
れるかまたは前記プレＳ領域の全部または一部に置換し
ていることである。
好ましくは、外来ヌクレオチド配列が、ＣＤ４レセプタ
ーとの結合部位を更に含む前記に定義したような免疫原
アミノ酸配列をコードする。
ーとの結合部位を更に含む前記に定義したような免疫原
アミノ酸配列をコードする。
組換えベクターの好ましい実施態様において、Ｓ領域及
び任意にプレＳ領域の全部または一部に対応する核酸フ
ラグメントは、真核細胞宿主のポリメラーゼによって認
識されるプロモーターのコントロール下に配置されてい
る。
び任意にプレＳ領域の全部または一部に対応する核酸フ
ラグメントは、真核細胞宿主のポリメラーゼによって認
識されるプロモーターのコントロール下に配置されてい
る。
プレＳ領域にＨＩＶの特性配列を組み込むと（または該
プレＳ領域の全部または一部を前記特性配列で置換する
と）、ＨＢｓＡｙ粒子の本質的特徴を保存する粒子の表
面にＨＩＶ由来の配列が発現しまた露出する。このよう
に発現及び露出されるこれらの配列は、該配列がＨＩ■
レトロウィルスに対する中和抗体のｉｎ ｖｉｖｏ形成
を誘発し得る程度の天然免疫原性を保存しかつ増幅する
ようなコンホーメーションを有する。
プレＳ領域の全部または一部を前記特性配列で置換する
と）、ＨＢｓＡｙ粒子の本質的特徴を保存する粒子の表
面にＨＩＶ由来の配列が発現しまた露出する。このよう
に発現及び露出されるこれらの配列は、該配列がＨＩ■
レトロウィルスに対する中和抗体のｉｎ ｖｉｖｏ形成
を誘発し得る程度の天然免疫原性を保存しかつ増幅する
ようなコンホーメーションを有する。
好ましくは、ＨＩＶレトロウィルスの種々の単離物の内
部に高い保存度を有するように選択された１（ＴＶ由来
の外来ヌクレオチド配列を含む組換えベクターを使用す
る。
部に高い保存度を有するように選択された１（ＴＶ由来
の外来ヌクレオチド配列を含む組換えベクターを使用す
る。
Ｓ領域及び任意にプレＳ領域の全部または一部を含む核
酸連頷に挿入されるヌクレオチド配列の長さは、ｆｌＢ
ｓ保有粒子の本質的な構造的特性及びコンホーメーショ
ン（形態学的）特性の維持に適合し得る長さでなければ
ならない、この長さは、プ明のいくつかの具体例では挿
入配列の長さは欠失配列の長さを上回る。
酸連頷に挿入されるヌクレオチド配列の長さは、ｆｌＢ
ｓ保有粒子の本質的な構造的特性及びコンホーメーショ
ン（形態学的）特性の維持に適合し得る長さでなければ
ならない、この長さは、プ明のいくつかの具体例では挿
入配列の長さは欠失配列の長さを上回る。
本発明の組換えベクターの好ましい具体例において、外
来ヌクレオチド配列は、ＳＶ４０由来のプロモーターの
コントロール下にプレＳ領域（またはＳ遺伝子の上流）
に適正読取フェーズで挿入されている。
来ヌクレオチド配列は、ＳＶ４０由来のプロモーターの
コントロール下にプレＳ領域（またはＳ遺伝子の上流）
に適正読取フェーズで挿入されている。
本発明の特定具常例によれば、組換え核酸配列置換して
いることである。
いることである。
言い替えると、前記外来ヌクレオチド配列の挿入後に残
存するプレＳ２領域は実質的に完全に欠失し、従って外
来ヌクレオチド配列はＳ領域とプレ８１ｍ域との間に直
接挿入される。外来ヌクレオチド配列なる用語は、前記
に定義した配列及び以下特に所望特性の外来ヌクレオチ
ド配列を発現させる適当な組換えベクターは、ｐＳＶＳ
と命名されたＨＢｓｌｈの既知の発現ベクター（参考文
献１１参照）とクローニングベクターＭ１３ｔｇ１３０
に保有されたＨＩＶ−２由来の外来配列との組換えによ
って得られたベクターである。
存するプレＳ２領域は実質的に完全に欠失し、従って外
来ヌクレオチド配列はＳ領域とプレ８１ｍ域との間に直
接挿入される。外来ヌクレオチド配列なる用語は、前記
に定義した配列及び以下特に所望特性の外来ヌクレオチ
ド配列を発現させる適当な組換えベクターは、ｐＳＶＳ
と命名されたＨＢｓｌｈの既知の発現ベクター（参考文
献１１参照）とクローニングベクターＭ１３ｔｇ１３０
に保有されたＨＩＶ−２由来の外来配列との組換えによ
って得られたベクターである。
かかるベクターとしては、ＨＢｓＡｙのプレ８２領域に
外来配列を挿入して得られたベクター（プレＳ１配列を
含むベクターｐＨ２５）、またはプレＳ領域の一部を外
来配列によって置換して得られたベクター（プレ８１領
域が欠失したｐＳＶ２Ｓ）がある、これらの２種類のベ
クターは本発明に使用し得るベクターの非限定例であり
、クローニングによって産生列を含む。
外来配列を挿入して得られたベクター（プレＳ１配列を
含むベクターｐＨ２５）、またはプレＳ領域の一部を外
来配列によって置換して得られたベクター（プレ８１領
域が欠失したｐＳＶ２Ｓ）がある、これらの２種類のベ
クターは本発明に使用し得るベクターの非限定例であり
、クローニングによって産生列を含む。
前記１（ＴＶ−１配列を対応する１（ＩＶ−２もしくは
ＳＩＶのヌクレオチド配列で置換するかまたはＨＩＶレ
トロウィルスに対する中和抗体をｉｎ ｖｉｖｏ産生じ
得る免疫学的に等価の修飾配列で置換することによって
別の構造を得ることも可能である。
ＳＩＶのヌクレオチド配列で置換するかまたはＨＩＶレ
トロウィルスに対する中和抗体をｉｎ ｖｉｖｏ産生じ
得る免疫学的に等価の修飾配列で置換することによって
別の構造を得ることも可能である。
前記ヌクレオチド連鎖に挿入される好ましい配列の例は
、以下のアミノ酸配列の１つをコードするヌクレオチド
配列である。
、以下のアミノ酸配列の１つをコードするヌクレオチド
配列である。
Ｘｉ ＣＨＩＲＱＩＩＮＴＷＩ（ＫＶＧＫＮＶＹＬＰＰ
ＲＥＧＤＬＴＣＺＩＸ２ ＣＨＩＫＱＴＩＮＴＷＨＫＶ
ＧＲＮＶＹＬＰＰＲＥＧＥＬＳＣＺ２Ｘ３ ＣＲＩＫＱ
ＦＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＰＩＳＧＱＩＲＣＺ３
式中］ＸＩ、２１．Ｘ２．Ｚ２及びＸ３．Ｚ３ノ対は、
Ｃ００ＦＩモしくはＮＨ３基を示すか、または、通常は
前記アミノ酸配列を含むレトロウィルスＳＩＶ、 ＨＩ
Ｖ−２、ＨＩＶ−１の糖タンパクπ中で前記アミノ酸配
列の対応する中央部に正常に夫々結合したアミノ酸配列
を示す。
ＲＥＧＤＬＴＣＺＩＸ２ ＣＨＩＫＱＴＩＮＴＷＨＫＶ
ＧＲＮＶＹＬＰＰＲＥＧＥＬＳＣＺ２Ｘ３ ＣＲＩＫＱ
ＦＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡＭＹＡＰＰＩＳＧＱＩＲＣＺ３
式中］ＸＩ、２１．Ｘ２．Ｚ２及びＸ３．Ｚ３ノ対は、
Ｃ００ＦＩモしくはＮＨ３基を示すか、または、通常は
前記アミノ酸配列を含むレトロウィルスＳＩＶ、 ＨＩ
Ｖ−２、ＨＩＶ−１の糖タンパクπ中で前記アミノ酸配
列の対応する中央部に正常に夫々結合したアミノ酸配列
を示す。
これらの配列は特に合計１００個までのアミノ酸を含む
。
。
同じく好ましい別のヌクレオチド配列は、以下のアミツ
ノ酸配列をコードする。
ノ酸配列をコードする。
ＲＧＥＦＬＹＣＫＭＮＷＦＬＮＷＶ ＥＤＲＳＬＴＴＱ
Ｋ ＰＫ ＥＲＨＫＲＮＹＶ ＰＣＨＩＲＱ Ｉ ＩＮ
ＴＩＩＩＫＶＧＫＮＶＹＬＰＰＲＥＧＤＬＴＣＮＳＴＶ
ＴＳＬ ＩＡ旧ＩＪ１４ＴＤＧＲＧＥＦＬＹＣＮＭＴＷ
ＦＬＮＷ ＩＥＮＫＴＩＩＲＮＹＡＰＣＨＩＫＱ Ｉ
ＩＮＴＷＩＩＫＶＧＲＮＶＹＬＰＰＲＥＧＥＬＳＣＮＳ
ＴＶＴＳＴＩＡＮＩＤＩＩＩＱＮＮＧＧＥＦＦＹＣＮＳ
ＴＱＬＦＮＳＴＷＦＮＳＴＷＳＴＥＧＳＮＮＴＥＧＳＤ
ＴＩＴＬＰＣＲＩＫＱＦＩＩＪＨ１４ＱＥＶＧＫＡＭＹ
八ＰＰ： ５ＧＱＩＲＣＳＳＮＩＴＧＬＬＬＴＲＤＧＧ
ＮＮ前記粒子の特定具体例において、外来アミノ酸配列
はＢ型肝炎ウィルスのゲノムのプレＳ２領域によ・って
コ・−ドされたペプチド配列に挿入されるかまたは該ペ
プチド配列の全部または一部に置換して魁・る。
Ｋ ＰＫ ＥＲＨＫＲＮＹＶ ＰＣＨＩＲＱ Ｉ ＩＮ
ＴＩＩＩＫＶＧＫＮＶＹＬＰＰＲＥＧＤＬＴＣＮＳＴＶ
ＴＳＬ ＩＡ旧ＩＪ１４ＴＤＧＲＧＥＦＬＹＣＮＭＴＷ
ＦＬＮＷ ＩＥＮＫＴＩＩＲＮＹＡＰＣＨＩＫＱ Ｉ
ＩＮＴＷＩＩＫＶＧＲＮＶＹＬＰＰＲＥＧＥＬＳＣＮＳ
ＴＶＴＳＴＩＡＮＩＤＩＩＩＱＮＮＧＧＥＦＦＹＣＮＳ
ＴＱＬＦＮＳＴＷＦＮＳＴＷＳＴＥＧＳＮＮＴＥＧＳＤ
ＴＩＴＬＰＣＲＩＫＱＦＩＩＪＨ１４ＱＥＶＧＫＡＭＹ
八ＰＰ： ５ＧＱＩＲＣＳＳＮＩＴＧＬＬＬＴＲＤＧＧ
ＮＮ前記粒子の特定具体例において、外来アミノ酸配列
はＢ型肝炎ウィルスのゲノムのプレＳ２領域によ・って
コ・−ドされたペプチド配列に挿入されるかまたは該ペ
プチド配列の全部または一部に置換して魁・る。
組換えハイブリッド粒子が、好ましい例として前記に示
した配列、即ち Ｘｌ 馴：ＲＱ？１ＮＴｎＨＫＶ（：ＫＮＶＹＬＰＰＲ
ＥＧＤＬＴＣＺＩＸ２ Ｃ１＋１ＫＣｌｉＴＮ”、’ｋ
ｔｌに’ｒＧＲＮＶＹＬＰＰＲＥＧＥＬＳＣ２２ＸＪ
ＣドＴＶＣ）！４Ｎ！：ＷＱＥ’ｒＣＫＡＭＹＡＰＰ
ｌ５ＧＱＩＲＣ２３か−、ス歳碍１゛乙ｉ：ｔ）来１゛
ミノ酸配列を含むのが好ましい。
した配列、即ち Ｘｌ 馴：ＲＱ？１ＮＴｎＨＫＶ（：ＫＮＶＹＬＰＰＲ
ＥＧＤＬＴＣＺＩＸ２ Ｃ１＋１ＫＣｌｉＴＮ”、’ｋ
ｔｌに’ｒＧＲＮＶＹＬＰＰＲＥＧＥＬＳＣ２２ＸＪ
ＣドＴＶＣ）！４Ｎ！：ＷＱＥ’ｒＣＫＡＭＹＡＰＰ
ｌ５ＧＱＩＲＣ２３か−、ス歳碍１゛乙ｉ：ｔ）来１゛
ミノ酸配列を含むのが好ましい。
これらの特定配列は、有利な機能的特性を有する。特に
、ＦＩＩＶ由来の共通配列中にＴリンパ球及びＣＤ４レ
セプターへの結合部位とエピトープＴとを互いに極めて
近接して含む。
、ＦＩＩＶ由来の共通配列中にＴリンパ球及びＣＤ４レ
セプターへの結合部位とエピトープＴとを互いに極めて
近接して含む。
本発明の用途を拡大し、ＣＤ４レセプターとの結合部位
をコードする配列が欠失したＨＩＶエンベロープ糖タン
パク質に特有の外来組換えベクターを製造することも可
能である。前記プレＳ領域に挿入されたかかる外来配列
は、Ｂリンパ球及びＴリンパ球によって認識され抗体の
誘発または細胞応答の誘発に夫々関与し得るエピトープ
を表面に有し得る組換えハイブリッド粒子の形成を極め
て有利に誘発し得る。
をコードする配列が欠失したＨＩＶエンベロープ糖タン
パク質に特有の外来組換えベクターを製造することも可
能である。前記プレＳ領域に挿入されたかかる外来配列
は、Ｂリンパ球及びＴリンパ球によって認識され抗体の
誘発または細胞応答の誘発に夫々関与し得るエピトープ
を表面に有し得る組換えハイブリッド粒子の形成を極め
て有利に誘発し得る。
本発明の好ましい外来アミノ酸配列は、ＳＩＶ、！（Ｙ
Ｖ−２及び）ＩＴＶ−１ウイルスの夫々の特性ペプチド
配列を含み、以下の配列を有する。
Ｖ−２及び）ＩＴＶ−１ウイルスの夫々の特性ペプチド
配列を含み、以下の配列を有する。
Ｒに ＥＦＬＹＣＫＭＮ１４ＦＬＮＷＶＥＤＲＳＬＴＴ
ＱＫ ＰＫＥＲＩＩＫＲＮＹＶＰＣＨＴＲＱ ｒ ＩＮ
ＴＨＫＶＧＫＮＶＹＬＰＰＲＥＧＤＬＴＣＮＳＴＶＴＳ
Ｌ４Ａ旧ＮＷＴＤＧＲＣＥＦＬＹＣＮＨＴＷＦＬＮ１４
ｒＥＮＫＴＨＲＮＹＡ ＰＣ）Ｉ ＴＫＱ Ｉ Ｔ
ＮＴＷ！（ＫＶＧＲＮＶ ＹＬＰＰＲＥＧＥＬＳＣＮＳ
ＴＶＴＳ Ｉ Ｉ＾旧ｆＶＱＮＮＧＧ ＥＦＦ ＹＣＮ
ＳＴＱＬＦＮＳＴＷＦＮＳＴ１４ＳＴＥＧＳＮＮＴＥＧ
ＳＤＴ Ｔ ＴＬＰＣＲＩＫＱＦＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡ
ＭＹＡＰＰＩＳＧＱＩＲＣＳＳＮＩＴＧＬＬＬＴＲＤＧ
ＧＮＮ前記に定義したような組換え粒子の所望の特性を
維持するその他の外来ペプチド配列も本発明の範囲に包
含される。
ＱＫ ＰＫＥＲＩＩＫＲＮＹＶＰＣＨＴＲＱ ｒ ＩＮ
ＴＨＫＶＧＫＮＶＹＬＰＰＲＥＧＤＬＴＣＮＳＴＶＴＳ
Ｌ４Ａ旧ＮＷＴＤＧＲＣＥＦＬＹＣＮＨＴＷＦＬＮ１４
ｒＥＮＫＴＨＲＮＹＡ ＰＣ）Ｉ ＴＫＱ Ｉ Ｔ
ＮＴＷ！（ＫＶＧＲＮＶ ＹＬＰＰＲＥＧＥＬＳＣＮＳ
ＴＶＴＳ Ｉ Ｉ＾旧ｆＶＱＮＮＧＧ ＥＦＦ ＹＣＮ
ＳＴＱＬＦＮＳＴＷＦＮＳＴ１４ＳＴＥＧＳＮＮＴＥＧ
ＳＤＴ Ｔ ＴＬＰＣＲＩＫＱＦＩＮＭＷＱＥＶＧＫＡ
ＭＹＡＰＰＩＳＧＱＩＲＣＳＳＮＩＴＧＬＬＬＴＲＤＧ
ＧＮＮ前記に定義したような組換え粒子の所望の特性を
維持するその他の外来ペプチド配列も本発明の範囲に包
含される。
本発明の範囲に含まれる）ＩＩＶまたはＳＩＶの特性的
免疫原ペプチド及びポリペプチドは、１９８６年１２月
１６日に許諾されたＧＥＮＥＴＩＣＳＹＳＴＥＭＳ社の
米国特許第４６２９７８３号に記載されている＃、１ｒ
＝ｉ、マ矛入プ゛ぜ多Ｑ以下に簡単に説明する原理に基
づく別の方法を使用することも可能である。
免疫原ペプチド及びポリペプチドは、１９８６年１２月
１６日に許諾されたＧＥＮＥＴＩＣＳＹＳＴＥＭＳ社の
米国特許第４６２９７８３号に記載されている＃、１ｒ
＝ｉ、マ矛入プ゛ぜ多Ｑ以下に簡単に説明する原理に基
づく別の方法を使用することも可能である。
応体とを簡゛単なア過及び洗浄によって分離する。
最初に、反応基を保有する固体支持体を、（例えばｔ−
ブチルオキシカルボニルによって保護することによって
）α−ＮＨ２を遮断して導入したアミノ酸のカルボキシ
ルと反応させ、共有結合を形成する。アミノ官能基を（
例えばトリフルオロ酢酸のごとき酸で洗浄して）脱保護
し、保護された第２アミノ酸を導入し結合させて第１ペ
プチド結合を形成させる。配列の第２アミノ−アシルを
供給する第２アミノ酸はＣ末端アミノ−アシル残基から
鎖のＣ末端第１アミノ酸の脱保護アミン官能基に結合す
る。好ましくは、この第２アミノ酸のカルボキシル官能
基は、例えばジシクロへキシルカルに向かって合成が進
行する。所望の配列が組立てられると、最初に形成され
たペプチド−樹脂結合の特異的切断反応によってペプチ
ドを固相から分離する。
ブチルオキシカルボニルによって保護することによって
）α−ＮＨ２を遮断して導入したアミノ酸のカルボキシ
ルと反応させ、共有結合を形成する。アミノ官能基を（
例えばトリフルオロ酢酸のごとき酸で洗浄して）脱保護
し、保護された第２アミノ酸を導入し結合させて第１ペ
プチド結合を形成させる。配列の第２アミノ−アシルを
供給する第２アミノ酸はＣ末端アミノ−アシル残基から
鎖のＣ末端第１アミノ酸の脱保護アミン官能基に結合す
る。好ましくは、この第２アミノ酸のカルボキシル官能
基は、例えばジシクロへキシルカルに向かって合成が進
行する。所望の配列が組立てられると、最初に形成され
たペプチド−樹脂結合の特異的切断反応によってペプチ
ドを固相から分離する。
本発明の別の実施態様においては、Ｆ！０ＩＪＢＥＮＷ
ＥＹＬの論文’Ｍｅｔｈｏｄｅ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉ
ｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ（有機化学の方法）」、Ｅ、
Ｗｕｎｓｃｈ ｅｄ、、ｖｏｌ、１５州及び■、Ｔｔ
ｌｒＥＭＥ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ １９７４、に記載の
均質溶液中の合成方法を使用する。
ＥＹＬの論文’Ｍｅｔｈｏｄｅ ｄｅｒ Ｏｒｇａｎｉ
ｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ（有機化学の方法）」、Ｅ、
Ｗｕｎｓｃｈ ｅｄ、、ｖｏｌ、１５州及び■、Ｔｔ
ｌｒＥＭＥ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ １９７４、に記載の
均質溶液中の合成方法を使用する。
この合成方法では、連続するアミノアシルを所望順序で
２つずつ順次縮合するか、またはアミノアシルと、適当
な順序の複数のアミノアシルを含むように予め形成され
たフラグメントとを縮合させるか、またはアミノアシル
と上記フラグメントを複数個含むフラグメントとを縮合
させる。この際、これらのアミノアシルまたはフラグメ
ントに含まれた全部の反応性官能基を予め保護する必要
がある。但し、公知のペプチド合成方法を用い、特にカ
ルボキシル官能基のは活後にペプチド結合を形成・する
とき通常は関与する一方のアミノ官能基と他方のカルボ
キシル官能基またはその逆の官能基は保護しない、変形
方法によれば、例えば１エチル−３−（３−ジメチル−
アミノ−プロピル）−カルボジイミドのごときカルボジ
イミド型の従来の結合反応体を使用して結合反応を生起
する。使用されるアミノアシルが付加的官能基を有する
とき（特にグルタミン酸の場合）、これらの官能基は例
えば、し−ブチルエステル基によって保護されるであろ
う。
２つずつ順次縮合するか、またはアミノアシルと、適当
な順序の複数のアミノアシルを含むように予め形成され
たフラグメントとを縮合させるか、またはアミノアシル
と上記フラグメントを複数個含むフラグメントとを縮合
させる。この際、これらのアミノアシルまたはフラグメ
ントに含まれた全部の反応性官能基を予め保護する必要
がある。但し、公知のペプチド合成方法を用い、特にカ
ルボキシル官能基のは活後にペプチド結合を形成・する
とき通常は関与する一方のアミノ官能基と他方のカルボ
キシル官能基またはその逆の官能基は保護しない、変形
方法によれば、例えば１エチル−３−（３−ジメチル−
アミノ−プロピル）−カルボジイミドのごときカルボジ
イミド型の従来の結合反応体を使用して結合反応を生起
する。使用されるアミノアシルが付加的官能基を有する
とき（特にグルタミン酸の場合）、これらの官能基は例
えば、し−ブチルエステル基によって保護されるであろ
う。
本発明はまた、前記のごとき組換えベクターによって形
π転換され組換えベクターに含まれるインサートの発現
を確保するコンピテントな細胞宿主に係る。
π転換され組換えベクターに含まれるインサートの発現
を確保するコンピテントな細胞宿主に係る。
例えば、組換えハイブリッド粒子ｔ（ＴＶ−ＨＢｓの発
現は、種々の細胞型においてプラスミドベクターまたは
ウィルスベクター、例えば（ワクチンのウィルス型の）
ポックスウィルス、アデノウィルス、バキュロウィルス
によって確保される。ウィルスであるかプラスミドであ
るかに従って、感染またはトランスフェクションの方法
は当業者に十分に公知である。これに関しては、フラン
ス特許第２４５．１３６号または欧州特許第２６５，７
８５号を参照するとよい。
現は、種々の細胞型においてプラスミドベクターまたは
ウィルスベクター、例えば（ワクチンのウィルス型の）
ポックスウィルス、アデノウィルス、バキュロウィルス
によって確保される。ウィルスであるかプラスミドであ
るかに従って、感染またはトランスフェクションの方法
は当業者に十分に公知である。これに関しては、フラン
ス特許第２４５．１３６号または欧州特許第２６５，７
８５号を参照するとよい。
本発明の実施に適した細胞宿主の例は、哺乳類の真核細
胞例えばＣＩＯ細胞または酵母例えば襲±−７ｃ ｅ
ｒ ｅ ｖ ｉ ｓ ｉ ａ ｅである。
胞例えばＣＩＯ細胞または酵母例えば襲±−７ｃ ｅ
ｒ ｅ ｖ ｉ ｓ ｉ ａ ｅである。
ベクターのインサートを発現させるべく使用される形質
転換方法（及び発現産物の証明方法）は、従来から公知
であり、実施例において後述する。
転換方法（及び発現産物の証明方法）は、従来から公知
であり、実施例において後述する。
本発明は更に、ＨＩＶレトロウィルス感染を予防するワ
クチン組成物に係る。該組成物の特徴は、前記のごとき
組換えハイブリッド粒子を活性成分として含み、同時に
薬剖として許容されるビヒクルを含むことである。
クチン組成物に係る。該組成物の特徴は、前記のごとき
組換えハイブリッド粒子を活性成分として含み、同時に
薬剖として許容されるビヒクルを含むことである。
患者に対する組成物の投与は、薬用量（ｄｏｓｅ）あた
り約５〜約２０μｇの精製組換えハイブリッド粒子を含
有する量で行なわれる。これらの量が例えば毎月１回の
間隔で３回投与される。
り約５〜約２０μｇの精製組換えハイブリッド粒子を含
有する量で行なわれる。これらの量が例えば毎月１回の
間隔で３回投与される。
本発明はまた以下の段階を特徴とする組換えベクターの
製造方法に係る。
製造方法に係る。
一任意に適当な真核細胞宿主のポリメラーゼによって認
識されるプロモーターのコントロール下に、ＨＩＶ族の
レトロウィルスに対する中和抗体を誘発認諾され得る少
なくとも１つのエピトープとＴす肝炎ウィルスのゲノム
のＳ領域及び任意にプレＳ領域の全部または一部に対応
するヌクレオチド連−鎖とのｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子組
換えを行ない、−形成された前記成分を含む組換えベク
ターを回収する。
識されるプロモーターのコントロール下に、ＨＩＶ族の
レトロウィルスに対する中和抗体を誘発認諾され得る少
なくとも１つのエピトープとＴす肝炎ウィルスのゲノム
のＳ領域及び任意にプレＳ領域の全部または一部に対応
するヌクレオチド連−鎖とのｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子組
換えを行ない、−形成された前記成分を含む組換えベク
ターを回収する。
挿入外来配列が更にＣＤ４レセプターとの結合部位を含
むアミノ酸配列をコードする前記に定義の組換えベクタ
ーの形成にも同様の方法を使用し得る。
むアミノ酸配列をコードする前記に定義の組換えベクタ
ーの形成にも同様の方法を使用し得る。
組換えベクターの回収は公知の方法で行なう。
特に、ＨＩＶレトロウィルスのゲノムの対応配列の特性
ヌクレオチドプローブとＢ型肝炎ウィルスのゲノムのＳ
ｆＲ域の特性プローブとの選択的ハイブリダイゼーショ
ンを用いる。
ヌクレオチドプローブとＢ型肝炎ウィルスのゲノムのＳ
ｆＲ域の特性プローブとの選択的ハイブリダイゼーショ
ンを用いる。
本発明はまた、被験者の生物媒体中のＨＩＶ感染のガへ
お豆診断用組成物に係る。かかる組成物は、ＨＩＶ−１
、ＨＩＶ−２またはＳ■■ノ１ツまたは複数のポリペプ
チドまたはペプチドを表面で発現する組換えハイブリッ
ド粒子またはこれらの組換えハイブリッド粒子の混合物
を含む。
お豆診断用組成物に係る。かかる組成物は、ＨＩＶ−１
、ＨＩＶ−２またはＳ■■ノ１ツまたは複数のポリペプ
チドまたはペプチドを表面で発現する組換えハイブリッ
ド粒子またはこれらの組換えハイブリッド粒子の混合物
を含む。
本発明はまた、ＨＩＶ感染に起因する抗体の存在のｉｎ
ｖｉｔｒｏ診断試験を行なうための組換えハイブリッ
ド粒子の使用に係る。この試験の特徴は、被験者の生物
媒体と組換えハイブリッド粒子とを接触させ、 一任意に形成された反応産物即ち抗原−抗体複合体を検
出することである。
ｖｉｔｒｏ診断試験を行なうための組換えハイブリッ
ド粒子の使用に係る。この試験の特徴は、被験者の生物
媒体と組換えハイブリッド粒子とを接触させ、 一任意に形成された反応産物即ち抗原−抗体複合体を検
出することである。
抗原−抗体複合体の検出手段は当業者に公知であり特に
放射性標識がある。組換えハイブリッド粒子の組成次第
で、■ＩＶ−１またはＨＩＶ−２の遷択的診断試験を行
なうこともでき、またはＨｒｖ−を及び１（ＩＶ−２の
配列即ち２つのウィルスの特性配列を表面で同時に発現
する粒子を含む組成物を使用して非選択的診断試験を行
なうこともできる。
放射性標識がある。組換えハイブリッド粒子の組成次第
で、■ＩＶ−１またはＨＩＶ−２の遷択的診断試験を行
なうこともでき、またはＨｒｖ−を及び１（ＩＶ−２の
配列即ち２つのウィルスの特性配列を表面で同時に発現
する粒子を含む組成物を使用して非選択的診断試験を行
なうこともできる。
本発明はまた、ＨＩＶ感染のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法
に係る。この方法は、以下の段階を含む。
に係る。この方法は、以下の段階を含む。
−）ＩＩＶに対する中和抗体を含有すると予想される一
抗原一抗体複合体が形成され字キこの複合体を検出する
。
抗原一抗体複合体が形成され字キこの複合体を検出する
。
生物媒体なる用語は、被験者の血清のごとき抗体を含有
し得るすべての標本を意味する。
し得るすべての標本を意味する。
本発明は更に、前記組換えハイブリッド粒子の産生方法
を提供する。該方法は以下の段階を含むことを特徴とす
る。
を提供する。該方法は以下の段階を含むことを特徴とす
る。
−所定の細胞宿主を前記のごとき組換えベクターで形買
転換させる。ベクター中にプロモーターが存在するとき
は該プロモーターは形質転換された細胞宿主のポリメラ
ーゼによって認識される。
転換させる。ベクター中にプロモーターが存在するとき
は該プロモーターは形質転換された細胞宿主のポリメラ
ーゼによって認識される。
適当な培地で細胞宿主を培養し、形成された粒子特に培
地中に分泌された粒子を回収する。この粒子の特徴は、
形態学的特徴及び抗ＨＩＶ抗体との免疫反応性を有する
だけでなく、対応する抗ＨＩＶ抗体によって認識され得
るかまたはかかる抗体を誘発し得る能力を有することで
ある。
地中に分泌された粒子を回収する。この粒子の特徴は、
形態学的特徴及び抗ＨＩＶ抗体との免疫反応性を有する
だけでなく、対応する抗ＨＩＶ抗体によって認識され得
るかまたはかかる抗体を誘発し得る能力を有することで
ある。
本発明はまた、抗体特にワクチン接種後の中和抗体をｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ検出するための免疫試験抗原として単独
または混合物の形態で使用される前記のごとき免疫原ア
ミノ酸フラグメントの使用に係る。
ｎ ｖｉｔｒｏ検出するための免疫試験抗原として単独
または混合物の形態で使用される前記のごとき免疫原ア
ミノ酸フラグメントの使用に係る。
ワクチン接種後の中和抗体のアッセイ方法に係る。
この方法は以下の段階を含む。
一後で定量できるように標識した前記免疫原アミノ酸フ
ラグメントと被検生物媒体とを、該フラグメントと媒体
との間の反応が生じる適当な条件下に接触させる、 媒体と反応し、た前記フラグメントを定量する。
ラグメントと被検生物媒体とを、該フラグメントと媒体
との間の反応が生じる適当な条件下に接触させる、 媒体と反応し、た前記フラグメントを定量する。
本発明はまた、生物媒体中の抗１（ＴＶ抗体、特にワク
チン接種後の中和抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用キット
に係る。該キットは、 検出手段は例えば、抗原と生物媒体の抗体との間に形成
される結合体を認識し得る抗−抗体から成る。
チン接種後の中和抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ診断用キット
に係る。該キットは、 検出手段は例えば、抗原と生物媒体の抗体との間に形成
される結合体を認識し得る抗−抗体から成る。
本発明の別の特徴及び利点は、添付図面に基づいて以下
に説明する実施例より明らかにされるであろう。
に説明する実施例より明らかにされるであろう。
材料及び方法
ぺり」−１り」１」
旧’：ｍｔ３ｏはバクテリオファージ阿１３に由来のク
ロニングベクターである。 ＫＩＥＮＹ等（１４）に記
載されたごとく、該ベクターは、βガラクトシダーゼを
コードする遺伝子の５′配列に、ポリアダプター（ｐｏ
ｌｙａｄａｐｔａｔｅｕｒ＞（ポリリンカー）を構成す
る１１の非反復制限部位を含む（第１図参照）。該［ポ
リリンカーＪに外来ＤＮ＾配列フラグメントが挿入され
ると、このフラグメントはＸ−ｇａｌで着色されないこ
とによって検出され得る。ｉｎ ５ｉｔｕハイブリダイ
ゼーシヨンによって青色プラークをスクリーニングする
とインフェーズ（ｅｎｐｈａｓｅ）で挿入されたＤＮ＾
フラグメントを検出し得る。
ロニングベクターである。 ＫＩＥＮＹ等（１４）に記
載されたごとく、該ベクターは、βガラクトシダーゼを
コードする遺伝子の５′配列に、ポリアダプター（ｐｏ
ｌｙａｄａｐｔａｔｅｕｒ＞（ポリリンカー）を構成す
る１１の非反復制限部位を含む（第１図参照）。該［ポ
リリンカーＪに外来ＤＮ＾配列フラグメントが挿入され
ると、このフラグメントはＸ−ｇａｌで着色されないこ
とによって検出され得る。ｉｎ ５ｉｔｕハイブリダイ
ゼーシヨンによって青色プラークをスクリーニングする
とインフェーズ（ｅｎｐｈａｓｅ）で挿入されたＤＮ＾
フラグメントを検出し得る。
ＨＢｓＡｇ（７）発現ベクター ｐＳＶＳ（１１）を修
飾し、ＨＢＶ トも表記されるＢ型肝炎ウィルスのゲノ
ムのプレ８２頭域のＥｃｏＲ１部位とＸｈｏ １部位と
の間に１０個の制限部位を含むＭ１３ｔｇ１３０のＤＮ
ＡのＥｃｏＲＩ −５ａｔ Ｉフラグメントを前記ベク
ターに挿入した。５ａｔ）制限部位とＸｈｏ ｌ制限部
位との融合によってプレＳ２領ベクターをｐｓＶ２ｓと
命名する。この組立において、クローニングされたＤＮ
ＡとプレＳ２領域に隣接のＳ遺伝子との融合はＳＶ４０
の初期プロモーターの直接コントロール下にある。
飾し、ＨＢＶ トも表記されるＢ型肝炎ウィルスのゲノ
ムのプレ８２頭域のＥｃｏＲ１部位とＸｈｏ １部位と
の間に１０個の制限部位を含むＭ１３ｔｇ１３０のＤＮ
ＡのＥｃｏＲＩ −５ａｔ Ｉフラグメントを前記ベク
ターに挿入した。５ａｔ）制限部位とＸｈｏ ｌ制限部
位との融合によってプレＳ２領ベクターをｐｓＶ２ｓと
命名する。この組立において、クローニングされたＤＮ
ＡとプレＳ２領域に隣接のＳ遺伝子との融合はＳＶ４０
の初期プロモーターの直接コントロール下にある。
同様の手段を使用し、Ｘｈｏ １部位及びＳｍａ ）部
位の夫々の処でｐＳＶＳ及びｐＭ２Ｓとの組換えを行な
ってｐｓｖｓ ＸＬと命名されたベクターを得た。
位の夫々の処でｐＳＶＳ及びｐＭ２Ｓとの組換えを行な
ってｐｓｖｓ ＸＬと命名されたベクターを得た。
のトランスフェクション
クローンＤＸＢＩＩ（１５）のチャイニーズハムスター
の卵巣細胞ｄｈｆｒ−（ＣＨＯ）を、１０％のウシ胎児
血清を補充したＨａｍ Ｆ１２培地中に単層形態で維持
した。
の卵巣細胞ｄｈｆｒ−（ＣＨＯ）を、１０％のウシ胎児
血清を補充したＨａｍ Ｆ１２培地中に単層形態で維持
した。
参考文献（１６）に記載のリン酸カルシウム法を使用し
て細胞をトランスフェクトし６時間後にグリセロールシ
ョック（Ｐａｒｋｅｒ等、１９７９）を与えた。参考文
献（１７）に記載の原理に従ってベクターｐｓＶ２ ｄ
ｈ４ｒとのコトランスフエクションを行なうと、ＨＢＳ
Ａｇとの融合タンパク質（組換えタンパク質とも指体で
きる）を発現する安定なりローンを選択し得る。
て細胞をトランスフェクトし６時間後にグリセロールシ
ョック（Ｐａｒｋｅｒ等、１９７９）を与えた。参考文
献（１７）に記載の原理に従ってベクターｐｓＶ２ ｄ
ｈ４ｒとのコトランスフエクションを行なうと、ＨＢＳ
Ａｇとの融合タンパク質（組換えタンパク質とも指体で
きる）を発現する安定なりローンを選択し得る。
漸増濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下に細胞
培養を行なって形質転換配列を増殖させた（１８）。
培養を行なって形質転換配列を増殖させた（１８）。
に５％のウシ胎児血清だけを含む培地を補充した。
細胞培養物の上清を回収し、清澄化し、Ｖｌ酸アンモニ
ウムで沈降させてＨＢｓＡｇ粒子を濃縮し、Ｃ５Ｃｔ’
等密度勾配と０〜２０％のショ糖速度勾配との連続を２
回繰り返して精製した。
ウムで沈降させてＨＢｓＡｇ粒子を濃縮し、Ｃ５Ｃｔ’
等密度勾配と０〜２０％のショ糖速度勾配との連続を２
回繰り返して精製した。
イムノプロット
約１μりの精製組換え粒子をＬａｅｍｍｅ Ｉ ｉバッ
ファ中で沸騰させ、１２．５％のドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＮａＤｏｄＳＯ、）ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動させてＩ！し、ニトロセルロースフィルター（ＳＣ
ＩＩＬＥＩＣｌｆＥＲ＆ ５ＣＨ１ｌＬＬ）に電気転移
（ｅ！ｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ−）した。
ファ中で沸騰させ、１２．５％のドデシル硫酸ナトリウ
ム（ＮａＤｏｄＳＯ、）ポリアクリルアミドゲルで電気
泳動させてＩ！し、ニトロセルロースフィルター（ＳＣ
ＩＩＬＥＩＣｌｆＥＲ＆ ５ＣＨ１ｌＬＬ）に電気転移
（ｅ！ｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ−）した。
フィルターに固定されたタンパク質を以下の種々の抗血
清と反応させた。ａ−ｐ４９ａ（１９） ；ＨＢｓＡｙ
の特異的ウサギ抗ペプチド抗血清、１８／７（２０）
；ＨＢＶのプレＳ１領域の特異的抗体、子ウシ血清アル
ブミン（ＢＳ＾）または笠貝（ｌｉｍｐｅｔ ｋｅｙｈ
ｏｌｅ）ヘモシアニン（ＫＬｌｌ）と結合した合成ペプ
チドを使用してウサギから得られたＨｍのＧＰ１６０の
領域（第２図）に対する抗血清。
清と反応させた。ａ−ｐ４９ａ（１９） ；ＨＢｓＡｙ
の特異的ウサギ抗ペプチド抗血清、１８／７（２０）
；ＨＢＶのプレＳ１領域の特異的抗体、子ウシ血清アル
ブミン（ＢＳ＾）または笠貝（ｌｉｍｐｅｔ ｋｅｙｈ
ｏｌｅ）ヘモシアニン（ＫＬｌｌ）と結合した合成ペプ
チドを使用してウサギから得られたＨｍのＧＰ１６０の
領域（第２図）に対する抗血清。
最終免疫反応性タンパク質を抗ウサギ抗体またはペルオ
キシダーゼ（＾ＥＭＲＳＩＩＡＭ）と結きしたマウスの
免疫グロブリンによって検出し、ジアミノベンジジンで
発色させた。
キシダーゼ（＾ＥＭＲＳＩＩＡＭ）と結きしたマウスの
免疫グロブリンによって検出し、ジアミノベンジジンで
発色させた。
九聚進−失μＪＵ（ユ滋Ｊ〜汲丈−
フロインド完全アジュバント中の約４μｇの精製ＨＢｓ
Ａｇの組換え粒子を毎月１回の間隔割合で２回またけ３
回皮内注射してウサギを免疫化した。最終注射の３０日
後に血清を採取した。
Ａｇの組換え粒子を毎月１回の間隔割合で２回またけ３
回皮内注射してウサギを免疫化した。最終注射の３０日
後に血清を採取した。
この抗血清の抗体産生レベルを知るために、ＥＬＩＳ八
（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｂ
ｓＫｅｎｔ Ａｓ５ａｙ）法で試験した。固相中に血
漿由来のＨＢｓＡｇ粒子（）ＩｅｖａｃＢ、 Ｐａ５ｔ
ｅｕｒ、Ｐａ５ｔｅｕｒ Ｖａｃｃｉｎｓ Ｆｒａｎｅ
ｅの製品）または）ＩＩＶの特性的合成ペプチド（第２
図参照）を使用した。合成ペプチドは、Ｄｒ ＲＯＣＨ
ＡＴ（Ｕ＾、５５３、ＣＮＲ５Ｍ＾ＲＳＥＩＬＬＥ＞か
ら提供されたものである。全部の抗原をマイクロタイタ
ープレー）−（ＦＡＬＣＯＮ“Ｐｒｏｂｉｎｄ”）上で
１ ｕｐ／ｘ １の濃度で使用し、ＣＩＩＡＲＢＩＴ等
に記載の方法（２１）でＥＬＩＳ＾試験を行なった。
（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｂ
ｓＫｅｎｔ Ａｓ５ａｙ）法で試験した。固相中に血
漿由来のＨＢｓＡｇ粒子（）ＩｅｖａｃＢ、 Ｐａ５ｔ
ｅｕｒ、Ｐａ５ｔｅｕｒ Ｖａｃｃｉｎｓ Ｆｒａｎｅ
ｅの製品）または）ＩＩＶの特性的合成ペプチド（第２
図参照）を使用した。合成ペプチドは、Ｄｒ ＲＯＣＨ
ＡＴ（Ｕ＾、５５３、ＣＮＲ５Ｍ＾ＲＳＥＩＬＬＥ＞か
ら提供されたものである。全部の抗原をマイクロタイタ
ープレー）−（ＦＡＬＣＯＮ“Ｐｒｏｂｉｎｄ”）上で
１ ｕｐ／ｘ １の濃度で使用し、ＣＩＩＡＲＢＩＴ等
に記載の方法（２１）でＥＬＩＳ＾試験を行なった。
虫」口免体Ｅｌす」」え飛−
血清中に含まれた抗体の中和活性を証明するために、ヒ
ト末梢血液（ＰＢＬ）の刺激リンパ球を使用した。これ
らの細胞を使用した理由は、これらの細胞がＨＩＶ感染
に感受性を有するからである。ＭＯＮＴＡＧＮＴＥＲ等
（２２） ４：よッテ記載され７’：ＬＡＶ ＢＲ１ｌ
単離物の種々の標本をウィルス接種物として使用しな。
ト末梢血液（ＰＢＬ）の刺激リンパ球を使用した。これ
らの細胞を使用した理由は、これらの細胞がＨＩＶ感染
に感受性を有するからである。ＭＯＮＴＡＧＮＴＥＲ等
（２２） ４：よッテ記載され７’：ＬＡＶ ＢＲ１ｌ
単離物の種々の標本をウィルス接種物として使用しな。
各希釈度の血清を等容のウィルス接種物と共に３７℃で
１時間プレインキュベートしな。次いで、２０Ｕ 。
１時間プレインキュベートしな。次いで、２０Ｕ 。
／ｌｒのインターロイキンと２．２μｇ／ｘ１のポリプ
レンと２！５１Ｊ、／ｘｉの抗インターフェロン血清と
を含む１０％のウシ胎児血清を補充したＲＰ旧１６−４
０培地中の４Ｘ１０’ヒトＰＡＩＬに前記混合物を添加
した。
レンと２！５１Ｊ、／ｘｉの抗インターフェロン血清と
を含む１０％のウシ胎児血清を補充したＲＰ旧１６−４
０培地中の４Ｘ１０’ヒトＰＡＩＬに前記混合物を添加
した。
３７℃で１時間インキュベーション後に細胞を洗い、完
全ＲＰ旧培地で培養した。上清を毎週２回採取し、最初
の２回は同じ希釈度の試験血清を新しい培地に添加した
。上清を一７０℃で凍結し、逆転写酵素活性（ＲＴ活性
）を試験した（２３）。
全ＲＰ旧培地で培養した。上清を毎週２回採取し、最初
の２回は同じ希釈度の試験血清を新しい培地に添加した
。上清を一７０℃で凍結し、逆転写酵素活性（ＲＴ活性
）を試験した（２３）。
結果
クローニングを２段溝で行なった。
第１段潜では、バクテリオファージＭ１３ｔｇ１３０中
で発現ゲノムバンクを構築し、選択されたＤＮ＾フラグ
メントをＨＢｓＡｇの発現ベクターに移入した。
で発現ゲノムバンクを構築し、選択されたＤＮ＾フラグ
メントをＨＢｓＡｇの発現ベクターに移入した。
バクテリオファージＭ１３ｔｇ１３０は大腸菌の１ａｃ
Ｚ遺伝子の第５のコドンの処に１１個の非反復制限部位
を含むポリリンカー（ポリアダプター）を保有するクロ
ーニング及び配列決定ベクターである。ランダムに切断
され５０〜１０００ｂｐを含むＨＩＶゲノムのＤＮＡフ
ラグメントをバクテリオファージＭ１．３ｔｇ１３０の
Ｓｍａ （及びＥｃｏＲ％部位にクローニングしたく第
１図）。ガ５ｉｔｕハイブリダイゼーション及び配列決
定の結果、ＨＩＶＩのエンベロープをコードする領域に
クローニングされたフラグメントを正確に検出した。
Ｚ遺伝子の第５のコドンの処に１１個の非反復制限部位
を含むポリリンカー（ポリアダプター）を保有するクロ
ーニング及び配列決定ベクターである。ランダムに切断
され５０〜１０００ｂｐを含むＨＩＶゲノムのＤＮＡフ
ラグメントをバクテリオファージＭ１．３ｔｇ１３０の
Ｓｍａ （及びＥｃｏＲ％部位にクローニングしたく第
１図）。ガ５ｉｔｕハイブリダイゼーション及び配列決
定の結果、ＨＩＶＩのエンベロープをコードする領域に
クローニングされたフラグメントを正確に検出した。
選択されたＨＩＶフラグメントをＨＢｓＡｙの発現ベク
ターｐＳＶ２Ｓニ移入したく第２図）、 ｐｓｖ２ｓｇ
ｉｒ材料及び方法」の項で前述した発現ベクターｐＳＶ
Ｓの修飾によって得られる。 ｐｓｉｓは、複製起点と
後期及び初期プロモーターとアクチベーターとｍＲＮ八
開へ部位とを含むＳＶ４０配列を含む、初期プロモータ
ーの直ぐそばにプレＳ２ゲノム領域を含むＩ（ＢＶ配列
と、Ｓ遺伝子と、Ｉｔ Ｂ ｓ Ａ ｇのメッセンジャ
ーＲＮＡをポリアデニル化し得る配列とが検出される。
ターｐＳＶ２Ｓニ移入したく第２図）、 ｐｓｖ２ｓｇ
ｉｒ材料及び方法」の項で前述した発現ベクターｐＳＶ
Ｓの修飾によって得られる。 ｐｓｉｓは、複製起点と
後期及び初期プロモーターとアクチベーターとｍＲＮ八
開へ部位とを含むＳＶ４０配列を含む、初期プロモータ
ーの直ぐそばにプレＳ２ゲノム領域を含むＩ（ＢＶ配列
と、Ｓ遺伝子と、Ｉｔ Ｂ ｓ Ａ ｇのメッセンジャ
ーＲＮＡをポリアデニル化し得る配列とが検出される。
ベクターｐｓＶＺｓ中で、プレ３２領域の一部が欠失し
ポリアダプターＭ１３ｔｇ１３０によって置換されてい
る。この構造において、ポリアダプターは、ＤＮＡフラ
グメントをプレＳ２領域及び３３ｍ伝子ヒビンフェーズ
で挿入し得る。従って、バクテリオファージＨ１３ｔｇ
１３０のＬａｃＺ遺伝子の正確な読取枠にクローニング
されたすべての７ラグメントは発現ベクターｐｓＶ２ｓ
にＳ３！！伝子とインフェーズで容易に移入され得る。
ポリアダプターＭ１３ｔｇ１３０によって置換されてい
る。この構造において、ポリアダプターは、ＤＮＡフラ
グメントをプレＳ２領域及び３３ｍ伝子ヒビンフェーズ
で挿入し得る。従って、バクテリオファージＨ１３ｔｇ
１３０のＬａｃＺ遺伝子の正確な読取枠にクローニング
されたすべての７ラグメントは発現ベクターｐｓＶ２ｓ
にＳ３！！伝子とインフェーズで容易に移入され得る。
ｐｓｉｓの別の誘導体は、ベクターｐＳＶＳ ＸＬであ
る。
る。
し得る。この構造において、プレＳ１及びプレＳ２領域
は外来抗原と隣接するように発現される。
は外来抗原と隣接するように発現される。
バンクで得られた１（Ｉｖエンベロープに対応するフラ
グメントのうちの３つのフラグメントを詳細に検討した
。
グメントのうちの３つのフラグメントを詳細に検討した
。
クローンＮｏ、２は、５２ｂｐ（ヌクレオチド６４４０
〜６４９１ ）から形成されＧＰ１２０をコードする配
列の中央部に存在するＨＩＶインサート（第２図）を含
む、このインサートは、ｌ！ＩＶＩの種々の単離物にお
いて保存された領域をカバーする（３）。
〜６４９１ ）から形成されＧＰ１２０をコードする配
列の中央部に存在するＨＩＶインサート（第２図）を含
む、このインサートは、ｌ！ＩＶＩの種々の単離物にお
いて保存された領域をカバーする（３）。
クローンＮｏ、８は、タンパク質ＧＰ１２０のサブカル
ボキシ末端部分に対応する２５２ｂｐ（ヌクレオチド６
９１５〜７１６６）ノＨＩＶインサー ト（第２図）を
含む、この領域は種々の単離物において比較的よく保存
され、免疫グロブリンのＬｌの定常領域と相同性を有す
る（参考文献２４）、更に、ＤＮＡフラグメントの一部
はウィルスのレセプターたるＣＤ４分子にタンパク質Ｃ
Ｐ（財）牛を結合させるときに関与するドメインをコー
ドする（参考文献２５）。
ボキシ末端部分に対応する２５２ｂｐ（ヌクレオチド６
９１５〜７１６６）ノＨＩＶインサー ト（第２図）を
含む、この領域は種々の単離物において比較的よく保存
され、免疫グロブリンのＬｌの定常領域と相同性を有す
る（参考文献２４）、更に、ＤＮＡフラグメントの一部
はウィルスのレセプターたるＣＤ４分子にタンパク質Ｃ
Ｐ（財）牛を結合させるときに関与するドメインをコー
ドする（参考文献２５）。
クローンＮｏ、６は、トランスメンブランタンパク質Ｇ
Ｐ４１のアミン末端部をコードする領域に存在する５５
ｂｐ（ヌクレオチド７３０６〜７３６０）を有するＨＩ
Ｖインサートを含む、この領域はＨＩＶ単Ｍ物中で保存
され、別のウィルスの融合タンパク質と相同性を共有す
る（参考文献２６）。
Ｐ４１のアミン末端部をコードする領域に存在する５５
ｂｐ（ヌクレオチド７３０６〜７３６０）を有するＨＩ
Ｖインサートを含む、この領域はＨＩＶ単Ｍ物中で保存
され、別のウィルスの融合タンパク質と相同性を共有す
る（参考文献２６）。
ＨＩＶ−１のエンベロープ遺伝子のフラグメントを含む
ＨＢｓＡｇの発現ベクターをＣＦＩＯ細胞にトランスフ
ェクトした。外来（ｈｅｔｅｒｏ １ｏＨｅ）遺伝子の
発現を検出するなめに、）ＩＢＶのエンベロープ主要タ
ンパク質に特異的なＲＩＡ試験によって検出されたＨＢ
ｓＡ！？を発現する安定なりローンをスクリーニングし
た。
ＨＢｓＡｇの発現ベクターをＣＦＩＯ細胞にトランスフ
ェクトした。外来（ｈｅｔｅｒｏ １ｏＨｅ）遺伝子の
発現を検出するなめに、）ＩＢＶのエンベロープ主要タ
ンパク質に特異的なＲＩＡ試験によって検出されたＨＢ
ｓＡ！？を発現する安定なりローンをスクリーニングし
た。
次いで、所謂ｒノーインプロット」法で分析して特性決
定しハイブリッドメツセンジャーＲＮ＾を観察した０分
泌された粒子を次に、ＨＢｓＡｙ粒子に使用した方法（
１１）で細胞培養物の上清がら精製した。
定しハイブリッドメツセンジャーＲＮ＾を観察した０分
泌された粒子を次に、ＨＢｓＡｙ粒子に使用した方法（
１１）で細胞培養物の上清がら精製した。
ｍ換えｆｆｌＶ−ＨＢｓＡｇ粒子はＣｓＣ１勾配で天然
粒子トホぼ同じ密度を有していた０組換え粒子のタンパ
ク質をＮａＤｏｄＳｏ ４ポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって分離し、ニトロセルロースフィルターに移
し、ＨＢｓＡｇ粒子またはＨＩＶエンベロープの決定基
（第３図）に対応する合成ペプチドに対するウサギ抗血
清で試験した。
粒子トホぼ同じ密度を有していた０組換え粒子のタンパ
ク質をＮａＤｏｄＳｏ ４ポリアクリルアミドゲル電気
泳動によって分離し、ニトロセルロースフィルターに移
し、ＨＢｓＡｇ粒子またはＨＩＶエンベロープの決定基
（第３図）に対応する合成ペプチドに対するウサギ抗血
清で試験した。
以下の結果が観察された。
１ｍ丑ＩＪ
抗ｐ４９ａ血清は、ＨＢｓＡｇの主要タンパク質とグリ
コジル形の対応タンパク質ＧＰ２６に加えて、中間的タ
ンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｅ ｍｏｙｅｎｎｅ）に対応
する２７０００〜３２０００ダルトンの範囲に４つのバ
ンドを与えた（第３八図、ライン１）、相同ＨＩＶＩの
ペプチド（ｐｅｐ５）に対する血清もこの４つのバンド
をはっきりと与えた（第３八図、ライン１）、これは、
組換えＨＢｓＡｙ粒的に等しい、Ｗ＆合した中間的タン
パク質は、ＦＩＢＶ領域（１つのグリコシレージョン部
位）及び旧■領域（２つのグリコシレージョン可能部位
）のグリコシレージョンに基いて４つの形態で存在する
。
コジル形の対応タンパク質ＧＰ２６に加えて、中間的タ
ンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｅ ｍｏｙｅｎｎｅ）に対応
する２７０００〜３２０００ダルトンの範囲に４つのバ
ンドを与えた（第３八図、ライン１）、相同ＨＩＶＩの
ペプチド（ｐｅｐ５）に対する血清もこの４つのバンド
をはっきりと与えた（第３八図、ライン１）、これは、
組換えＨＢｓＡｙ粒的に等しい、Ｗ＆合した中間的タン
パク質は、ＦＩＢＶ領域（１つのグリコシレージョン部
位）及び旧■領域（２つのグリコシレージョン可能部位
）のグリコシレージョンに基いて４つの形態で存在する
。
粧（」し１予Ｎｏ、８
抗ｐ４９ａ血清は、ＨＢＳＡ！１の主要タンパク質を２
つの形態（Ｐ２２及びＧＰ２６）で出現させ、または分
子量３７０００〜４６０００の範囲に対応するバンドを
与えた（第３Ｂ図、ライン１）。相同な２つのペプチド
６及び７に対する血清はルタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ
ｅ Ｉｏｕｒｄｅ）と同じ分布を示しく第３Ｂ図、ライ
ン２及び３）、粒子中のＨＩＶ決定基の存在を証明した
。中間的タンパク質の融合量は、主要タンパク質の融合
量よりも少ない。３７ｋｄのタンパク質は非グリコジル
化融合タンパク質に対応し、それよりも大きい分子量の
タンパク質はグリコジル形に対応する（旧■部分の５つ
のグリコシレージョン可能部位）。抗ペプチド血清もま
た、同時精製された血清アルブミンに対応する６７ｋｄ
のタンパク質を出現させた。
つの形態（Ｐ２２及びＧＰ２６）で出現させ、または分
子量３７０００〜４６０００の範囲に対応するバンドを
与えた（第３Ｂ図、ライン１）。相同な２つのペプチド
６及び７に対する血清はルタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ
ｅ Ｉｏｕｒｄｅ）と同じ分布を示しく第３Ｂ図、ライ
ン２及び３）、粒子中のＨＩＶ決定基の存在を証明した
。中間的タンパク質の融合量は、主要タンパク質の融合
量よりも少ない。３７ｋｄのタンパク質は非グリコジル
化融合タンパク質に対応し、それよりも大きい分子量の
タンパク質はグリコジル形に対応する（旧■部分の５つ
のグリコシレージョン可能部位）。抗ペプチド血清もま
た、同時精製された血清アルブミンに対応する６７ｋｄ
のタンパク質を出現させた。
肚遺叉１ｊすＬｌ
抗ｐ４９ａ血清は、ＨＢｓＡｙ主要タンパク質を出現さ
せたが、そのグリコジル化対応物は中間的タンパク質を
出現させなかった（第３Ｃ図、ライン１）、三重（ｔｒ
ｉρ１ｅｔ）の高分子量バンドが観察された。このバン
ドはまた、プレＳ１抗原に対するモノクローナル抗体に
よっても与えられた（第３Ｃ図、ラインユ ｔ）。これらのタンパク質のサイズは、グリコジル形及
び非グリコジル形の外来ペプチドを含む大きいＨＢｓＡ
ｙタンパク質のサイズと適合する。
せたが、そのグリコジル化対応物は中間的タンパク質を
出現させなかった（第３Ｃ図、ライン１）、三重（ｔｒ
ｉρ１ｅｔ）の高分子量バンドが観察された。このバン
ドはまた、プレＳ１抗原に対するモノクローナル抗体に
よっても与えられた（第３Ｃ図、ラインユ ｔ）。これらのタンパク質のサイズは、グリコジル形及
び非グリコジル形の外来ペプチドを含む大きいＨＢｓＡ
ｙタンパク質のサイズと適合する。
えＨＢｓ＾ に る 応
完全フロインドアジュバント中の前記組換えＨＢｓＡＦ
Ｉ粒子の各々を毎月１回の間隔で２回または３回投与し
てウサギを免疫化したく「材料及び方法」の項参照）、
血漿由来の粒子と［１ＩＶ１の種々の対応ペプチドとを
使用したＥＬＩＳ＾試験で免疫応答の特異性を決定した
。また、抗血清をプレＳ２ペプチドに対して試験した（
ＨＢＶエンベロープタンパク質のアミノ酸１２０〜１４
５（両端値を含む）までのアミノ酸配列）。
完全フロインドアジュバント中の前記組換えＨＢｓＡＦ
Ｉ粒子の各々を毎月１回の間隔で２回または３回投与し
てウサギを免疫化したく「材料及び方法」の項参照）、
血漿由来の粒子と［１ＩＶ１の種々の対応ペプチドとを
使用したＥＬＩＳ＾試験で免疫応答の特異性を決定した
。また、抗血清をプレＳ２ペプチドに対して試験した（
ＨＢＶエンベロープタンパク質のアミノ酸１２０〜１４
５（両端値を含む）までのアミノ酸配列）。
全部のウサギにおいて、天然のＨＢｓＡｙ粒子に対する
抗体が種々のレベルで増殖した。最も弱い応答は、組換
え体Ｎｏ、８で得られた。これは、ＨＢｓＡｇ抗原決定
基と競合し該決定基を遮蔽する外来抗原のサイズが比較
的大きい（アミノ酸８４個）ことに起因する。この組換
え体Ｎ０１８は逆に、外来ペプチドに対して最良の応答
を示した。これは、この場合にはＨＢｓＡｙの抗原決定
基に対して旧■の抗原決定基が優勢に存在することを示
唆する。
抗体が種々のレベルで増殖した。最も弱い応答は、組換
え体Ｎｏ、８で得られた。これは、ＨＢｓＡｇ抗原決定
基と競合し該決定基を遮蔽する外来抗原のサイズが比較
的大きい（アミノ酸８４個）ことに起因する。この組換
え体Ｎ０１８は逆に、外来ペプチドに対して最良の応答
を示した。これは、この場合にはＨＢｓＡｙの抗原決定
基に対して旧■の抗原決定基が優勢に存在することを示
唆する。
組換え体Ｎｏ、２及びＮ０１６中では、ＨＩＶに属する
外来抗原はより小さく同等のサイズを有する（アミノ酸
の数は１８個及び２０個）。２つの場合に観察されたペ
プチドに対する応答は、天然ＨＢｓＡｇ粒子に対する応
答よりも弱い０組換え体Ｎ００２では天然主要タンパク
質に対する融合タンパク質の割合が高い（第３図参照）
、これらの結果は、この組換え体に挿入された配列の免
疫原性が弱いことを示唆する。プレＳ２ペプチドに対す
る応答は、組換え体Ｎｏ。
外来抗原はより小さく同等のサイズを有する（アミノ酸
の数は１８個及び２０個）。２つの場合に観察されたペ
プチドに対する応答は、天然ＨＢｓＡｇ粒子に対する応
答よりも弱い０組換え体Ｎ００２では天然主要タンパク
質に対する融合タンパク質の割合が高い（第３図参照）
、これらの結果は、この組換え体に挿入された配列の免
疫原性が弱いことを示唆する。プレＳ２ペプチドに対す
る応答は、組換え体Ｎｏ。
６がベクターｐＳＶＳ ＸＬ中で発現するときにのみ得
られる（第１図参照）、ベクターｐｓＶＺｓ中で発現さ
せることによって得られた粒子で免疫化した別の２つの
ウサギの抗血清は陰性であり対照として使用できる。
られる（第１図参照）、ベクターｐｓＶＺｓ中で発現さ
せることによって得られた粒子で免疫化した別の２つの
ウサギの抗血清は陰性であり対照として使用できる。
組換えＨＩＶ−ＨＢｓＡｙ粒子でウサギを免疫化し、単
離物ＬＡＶＩ ＢＲ［Ｊを中和する血清の能力を試験し
た（２４）、逆転写酵素（ＲＴ）活性を使用して末梢血
液リンパ球中のウィルス感染を３〜５日間試験した。
離物ＬＡＶＩ ＢＲ［Ｊを中和する血清の能力を試験し
た（２４）、逆転写酵素（ＲＴ）活性を使用して末梢血
液リンパ球中のウィルス感染を３〜５日間試験した。
試験は、免疫血清の存在下のＲＴ活性の減少に基づいて
行ない、得られた結果を同じウサギのプレ免疫血清の存
在下に得られた結果と比較した。
行ない、得られた結果を同じウサギのプレ免疫血清の存
在下に得られた結果と比較した。
この試験において、飽和量の感染ピリオンが存在すると
きは抗体がウィルスを有効に中和できない。
きは抗体がウィルスを有効に中和できない。
従って、ウィルスの種々の標本を中和するために種々の
希釈（１：５０）抗血清で試験したく第４八図、第４Ｂ
図及び第４Ｃ図参照）。組換え粒子Ｎｏ、８で免疫した
ウサギの血清は感染性の小さいウィルスのウィルス感染
力を完全に中和したく第４図）、またウィルス標本の感
染力を増加させるとＲＴ活性は９５％から６３％及び３
５％に減少した（第４Ｄ図）、これは抗血清の中和能力
がウィルスの量の間数であることを示す。
希釈（１：５０）抗血清で試験したく第４八図、第４Ｂ
図及び第４Ｃ図参照）。組換え粒子Ｎｏ、８で免疫した
ウサギの血清は感染性の小さいウィルスのウィルス感染
力を完全に中和したく第４図）、またウィルス標本の感
染力を増加させるとＲＴ活性は９５％から６３％及び３
５％に減少した（第４Ｄ図）、これは抗血清の中和能力
がウィルスの量の間数であることを示す。
組換え粒子Ｎｏ、Ｂに対応する抗血清はウィルス濃度が
低いときに弱い中和を示したが、組換え粒子Ｎｏ、２で
免疫したウサギの抗血清はウィルス濃度が低いときにも
ＲＴ活性の減少を示さなかった。
低いときに弱い中和を示したが、組換え粒子Ｎｏ、２で
免疫したウサギの抗血清はウィルス濃度が低いときにも
ＲＴ活性の減少を示さなかった。
更に、組換え粒子Ｎｏ、８に対して異なる希釈度の抗血
清と一定濃度のウィルスとを使用しＨＩＶＩの種々の単
離物の中和を試験した。
清と一定濃度のウィルスとを使用しＨＩＶＩの種々の単
離物の中和を試験した。
第５図は、希釈度１１５０の単Ｍ物Ｌ＾Ｖ ＢＲＵの感
染能力がプレ免疫血清に比較して５０％減少したことを
示す。
染能力がプレ免疫血清に比較して５０％減少したことを
示す。
この抗血清はまた）ＩＩＶｌのザイール（ｚａｉｒｏｉ
ｓ）単離物に対する中和活性を示した。希釈度１／２５
でＬＡＶ ＥＬＩに対する５０％の中和効果が観察され
た（第５図）。
ｓ）単離物に対する中和活性を示した。希釈度１／２５
でＬＡＶ ＥＬＩに対する５０％の中和効果が観察され
た（第５図）。
ｌ【
ＨＩＶに対する防御免疫応答を誘発する能力を有するこ
とによって先験的に重要なｆｌｌＶｌのエンベロープ内
部糖タンパク質ＧＰ１２０は、保存領域とその他の可変
領域とを含み、可変領域はＨＩＶの種々の単離物毎に異
なっている。一定ドメインの内部に保存された配列は、
潜在的に重要な機能を有する配列の領域に対応すると考
えられる。上記の結果から明らかなように、ＨＩＶＩの
エンベロープの種々の保存領域を選択しＢ型肝炎の表面
抗原の中間的タンパク質との融合タンパク質の形態で発
現させた。
とによって先験的に重要なｆｌｌＶｌのエンベロープ内
部糖タンパク質ＧＰ１２０は、保存領域とその他の可変
領域とを含み、可変領域はＨＩＶの種々の単離物毎に異
なっている。一定ドメインの内部に保存された配列は、
潜在的に重要な機能を有する配列の領域に対応すると考
えられる。上記の結果から明らかなように、ＨＩＶＩの
エンベロープの種々の保存領域を選択しＢ型肝炎の表面
抗原の中間的タンパク質との融合タンパク質の形態で発
現させた。
発明者等はＨＢｓＡｇ粒子が２つの観点ですぐれた免疫
原特性を有することを知見した。
原特性を有することを知見した。
（ｉ）抗原決定基の多数のコピーを表面に保有する高分
子量ポリマーである。
子量ポリマーである。
（ｉｉ）また免疫系による外来Ｂエピトープの認識に役
立つＴエピトープを保有する（２７）。
立つＴエピトープを保有する（２７）。
上記で研究した１（ＩＶの異なる３つの保存領域のうち
の、１つの領域（クローンＮｏ、８）はＣＯ２結合部位
に結合しく２５）、別の１つの領域（クローンＮｏ、６
）は融合プロセスに関与しく２６）、第３の領域（クロ
ーンＮｏ、２）は既知のいかなる生物活性にも結びつか
ない。
の、１つの領域（クローンＮｏ、８）はＣＯ２結合部位
に結合しく２５）、別の１つの領域（クローンＮｏ、６
）は融合プロセスに関与しく２６）、第３の領域（クロ
ーンＮｏ、２）は既知のいかなる生物活性にも結びつか
ない。
これらの抗原決定基と１し３２領域の遺伝子産物との融
合によって得られた組換えＨＩＶ−ＨＢｓＡＩ？粒子を
、合成相同ペプチドに対する抗体を使用して試験した０
粒子中のＨＩＶ抗原決定基の存在と融合タンパク質のグ
リコシレージョンの可能性とをウェスタンプロット分析
によって証明した。種々の組換え粒子中で観察された融
合タンパク質と天然主要タンパク質との割合は一定の値
ではながった。
合によって得られた組換えＨＩＶ−ＨＢｓＡＩ？粒子を
、合成相同ペプチドに対する抗体を使用して試験した０
粒子中のＨＩＶ抗原決定基の存在と融合タンパク質のグ
リコシレージョンの可能性とをウェスタンプロット分析
によって証明した。種々の組換え粒子中で観察された融
合タンパク質と天然主要タンパク質との割合は一定の値
ではながった。
組換え体Ｎｏ、８においては融合タンパク質があきらか
に少なく、これは挿入された外来配列のサイズが比較的
大きいことに関係する。 Ｉ（ＢＶのプレＳ２の翻訳産
物の初期サイズはアミノ酸５５個に相当するが、融合タ
ンパク質の構築によってアミノ酸１１１個のサイズまで
増大する。融合すべきタンパク質のサイズ次第では、該
タンパク質がＨＢｓＡｇ粒子に挿入し難い。
に少なく、これは挿入された外来配列のサイズが比較的
大きいことに関係する。 Ｉ（ＢＶのプレＳ２の翻訳産
物の初期サイズはアミノ酸５５個に相当するが、融合タ
ンパク質の構築によってアミノ酸１１１個のサイズまで
増大する。融合すべきタンパク質のサイズ次第では、該
タンパク質がＨＢｓＡｇ粒子に挿入し難い。
組換え体Ｎｏ、６及びＮｏ、２において、融合タンパク
質と主要タンパク質との割合は、出発ＨＢｓＡｙ粒子の
発現ベクターｐＳＶＳのトランスフェクションによって
得られた粒子中の中間的タンパク質と主要タンパク質と
の間で観察された割合と同等である。
質と主要タンパク質との割合は、出発ＨＢｓＡｙ粒子の
発現ベクターｐＳＶＳのトランスフェクションによって
得られた粒子中の中間的タンパク質と主要タンパク質と
の間で観察された割合と同等である。
組換えＨＩＶ−ＨＢｓＡｙ粒子の免疫原性については前
述した。２つの抗原領域に対する体液性応答が生じ、外
来エピトープが粒子の表面に有効に存在することが証明
された。
述した。２つの抗原領域に対する体液性応答が生じ、外
来エピトープが粒子の表面に有効に存在することが証明
された。
抗体の生物学的活性をｉｎ ｖｉｔｒｏ中和試験で測定
した。ＨＩＶのエンベロープタンパク質中で中和性及び
非中和性のエピトープが検出された。組換え体Ｎｏ、８
に対する抗体は、融合タンパク質製造の出発物質として
使用されたＨＩＶ単離物（ＬＡＶ ＢＲＵ）に対する潜
在的中和効果を有していた。ＨＩＶＩの別の単離物（Ｌ
ＡＶ ＥＬＩ）と反応したときには抗体が先の場合より
も弱い効果を示した。組換え体Ｎｏ、８で使用したＨＩ
Ｖのインサートは種々のＨＩＶＩ単離物中に比較的よく
保存された２つの領域をカバーする。これらの２つの領
域は、単離物の特性的超可変額域（ｒｅｇｉｏｎ ｈｙ
ｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）によって隔てられている。
した。ＨＩＶのエンベロープタンパク質中で中和性及び
非中和性のエピトープが検出された。組換え体Ｎｏ、８
に対する抗体は、融合タンパク質製造の出発物質として
使用されたＨＩＶ単離物（ＬＡＶ ＢＲＵ）に対する潜
在的中和効果を有していた。ＨＩＶＩの別の単離物（Ｌ
ＡＶ ＥＬＩ）と反応したときには抗体が先の場合より
も弱い効果を示した。組換え体Ｎｏ、８で使用したＨＩ
Ｖのインサートは種々のＨＩＶＩ単離物中に比較的よく
保存された２つの領域をカバーする。これらの２つの領
域は、単離物の特性的超可変額域（ｒｅｇｉｏｎ ｈｙ
ｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ）によって隔てられている。
ＣＥＡＳＥ等はこの領域にＴ細胞エピトープを同定した
（３０）。
（３０）。
更に、ＧＰ１２０に対するモノクローナル抗体を使用し
た実験及びｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発実験によって
、ＣＤ４レセプターとの相互作用に重要な配列を同定し
た（２５）。また、先に使用した配列と一部重複する配
列を保有し中和抗体の形成と細胞性免疫応答とを生起し
得る大腸菌中で融合タンパク質が産生じたことも知られ
ている（３１）、 ＨＢｓＡｆＩ系において、融合タン
パク質は正常にグリコジル化されることができ、エピト
ープに対する強い親和性を有しＨＩＶのエンベロープタ
ンパク質とＣＤ４レセプターとの相互作用を遮断し得る
抗体の産生に重要な成分となり得る。更に、ＨＩＶの抗
原決定基は天然ウィルスタンパク質ＧＰの場合よりも十
分に粒子の表面に露出すると考えられる。ザイール単離
物ＬＡＶ ＥＬＩで観察された中和効率が低い理由は、
ウィルスとＣＤ４レセプターとの相互作用の決定領域で
約３０％のアミノ酸配列の変異があるためと推定される
（２５）。
た実験及びｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発実験によって
、ＣＤ４レセプターとの相互作用に重要な配列を同定し
た（２５）。また、先に使用した配列と一部重複する配
列を保有し中和抗体の形成と細胞性免疫応答とを生起し
得る大腸菌中で融合タンパク質が産生じたことも知られ
ている（３１）、 ＨＢｓＡｆＩ系において、融合タン
パク質は正常にグリコジル化されることができ、エピト
ープに対する強い親和性を有しＨＩＶのエンベロープタ
ンパク質とＣＤ４レセプターとの相互作用を遮断し得る
抗体の産生に重要な成分となり得る。更に、ＨＩＶの抗
原決定基は天然ウィルスタンパク質ＧＰの場合よりも十
分に粒子の表面に露出すると考えられる。ザイール単離
物ＬＡＶ ＥＬＩで観察された中和効率が低い理由は、
ウィルスとＣＤ４レセプターとの相互作用の決定領域で
約３０％のアミノ酸配列の変異があるためと推定される
（２５）。
組換え体Ｎｏ、２及びＮｏ、６に対する抗体を更に、中
和実験で試験した。これらの実験中に組換え体Ｎｏ。
和実験で試験した。これらの実験中に組換え体Ｎｏ。
２を保有するＨＩＶ配列は中和抗体を誘発しなかった。
この結果は、使用される動物の弱い免疫応答または組換
え体Ｎｏ、２に含まれた領域の弱い免疫原性によって説
明できる。ＧＰ４１のアミノ末端部は融合プロセスに関
与し従ってウィルス中和に関与する。
え体Ｎｏ、２に含まれた領域の弱い免疫原性によって説
明できる。ＧＰ４１のアミノ末端部は融合プロセスに関
与し従ってウィルス中和に関与する。
また、組換え体Ｎｏ、６で免疫化して得られた抗体のＨ
ＩＶＩ感染力に対する潜在的効果を試験した。中和効果
は弱く、シンシチウムの形成阻害は完全ではなかった。
ＩＶＩ感染力に対する潜在的効果を試験した。中和効果
は弱く、シンシチウムの形成阻害は完全ではなかった。
その理由はＨＩＶのインサートのサイズが小さいことに
ある。
ある。
前記のごと〈発明者等は、ＨＩＶのエンベロープの外来
抗原決定基を潜在的に存在させ得る系を製造した。この
系は更に、天然形態で弱い免疫原特性を有していたかま
たは該天然タンパク質の表面に存在していなかったエン
ベロープタンパク質の領域に対する中和抗体を産生じ得
る。
抗原決定基を潜在的に存在させ得る系を製造した。この
系は更に、天然形態で弱い免疫原特性を有していたかま
たは該天然タンパク質の表面に存在していなかったエン
ベロープタンパク質の領域に対する中和抗体を産生じ得
る。
更に、ＨＢＶとＨＩＶとの抗原決定基が同一免疫原粒子
の表面に並列して存在するので多価ワクチンを製造し得
る。
の表面に並列して存在するので多価ワクチンを製造し得
る。
ＨＩＶ ＨＢｓ＾ 子によるアカゲザルの 疫前記のご
と＜ 、ＨＢｓＡｆＩの中間的タンパク質のプレＳ２内
部にＨＩｖｌの外側エンベロープ糖タンパク質の８４個
のアミノ酸（＾＾３８４→４７２）を融合することによ
って得られた粒子を使用し、アカゲザルにおける中和抗
体の産生を試験した。これらのハイブリッド粒子が霊長
類のＨＩＶに対する体液性免疫応答及びＴ細胞媒介免疫
応答の双方を誘発することを証明するために、アカゲザ
ルをハイブリ・ンドＨＢｓＡｙ粒子または天然ＨＢｓＡ
ｙ粒子で免疫化した。
と＜ 、ＨＢｓＡｆＩの中間的タンパク質のプレＳ２内
部にＨＩｖｌの外側エンベロープ糖タンパク質の８４個
のアミノ酸（＾＾３８４→４７２）を融合することによ
って得られた粒子を使用し、アカゲザルにおける中和抗
体の産生を試験した。これらのハイブリッド粒子が霊長
類のＨＩＶに対する体液性免疫応答及びＴ細胞媒介免疫
応答の双方を誘発することを証明するために、アカゲザ
ルをハイブリ・ンドＨＢｓＡｙ粒子または天然ＨＢｓＡ
ｙ粒子で免疫化した。
精製したＨＩＶ／ＨＢｓｈ粒子で免疫するために、２匹
のアカゲザルに１箇月に１回の間隔で３回の皮下注射を
与え３箇月後に２回のブースター注射を与えた。対照と
して、天然のＨＢｓＡｇを同じプロトコルで４回投与し
て１匹のアカゲザルを免疫した。
のアカゲザルに１箇月に１回の間隔で３回の皮下注射を
与え３箇月後に２回のブースター注射を与えた。対照と
して、天然のＨＢｓＡｇを同じプロトコルで４回投与し
て１匹のアカゲザルを免疫した。
各免疫化の前後に各動物から血液標本を採取した。
固相上の天然ＨＢｓＡｇ粒子またはＨＩＶ相同合成ペプ
チド（ｐｅｐ６：＾＾３７３〜３９８、ｐｅｐ７：＾＾
４２１〜４４１、第３図参照）を使用して体液性免疫応
答をＥＬＩＳ＾で追跡したく第７図）。
チド（ｐｅｐ６：＾＾３７３〜３９８、ｐｅｐ７：＾＾
４２１〜４４１、第３図参照）を使用して体液性免疫応
答をＥＬＩＳ＾で追跡したく第７図）。
抗ＨＢｓ抗体価は３回目のワクチン投与の３週後にピー
クを示し、以後次第に減少した。抗体価の第２ピークは
Ｍａｃ Ｓ以外ではブースター免疫後にｌｌＩ察された
。Ｍａｃ Ｓでは４回目の注射後も抗体価が一定であり
５回目の注射後に少し増加した。抗ＨＩＶ抗体は両方の
ペプチドを使用したＥＬＩＳ＾によって検出された。２
回目の注射（Ｍａｃ Ｈ）または３回目の注射（Ｍａｃ
Ｓ）の３週後に抗体価が最高のレベルに達し、以後少
し減少した。しかしながら、抗１１１Ｖ応答は２回目の
注射後にプラトーに達したと考えられる。抗ＨＢｓ抗体
価に関しては、４回目の投与によるブースター効果がＭ
ａｃ Ｈの血清ではっきりと検出された。
クを示し、以後次第に減少した。抗体価の第２ピークは
Ｍａｃ Ｓ以外ではブースター免疫後にｌｌＩ察された
。Ｍａｃ Ｓでは４回目の注射後も抗体価が一定であり
５回目の注射後に少し増加した。抗ＨＩＶ抗体は両方の
ペプチドを使用したＥＬＩＳ＾によって検出された。２
回目の注射（Ｍａｃ Ｈ）または３回目の注射（Ｍａｃ
Ｓ）の３週後に抗体価が最高のレベルに達し、以後少
し減少した。しかしながら、抗１１１Ｖ応答は２回目の
注射後にプラトーに達したと考えられる。抗ＨＢｓ抗体
価に関しては、４回目の投与によるブースター効果がＭ
ａｃ Ｈの血清ではっきりと検出された。
免疫対照として天然ＨＢｓＡｙを投与したＭａｃ 八は
３回目の注射後に高い抗ＨＢｓ抗体価を示したが、この
対照動物の血清とＨＩＶペプチドとを反応させても抗Ｈ
ＩＶ抗体応答は全く検出されなかった。
３回目の注射後に高い抗ＨＢｓ抗体価を示したが、この
対照動物の血清とＨＩＶペプチドとを反応させても抗Ｈ
ＩＶ抗体応答は全く検出されなかった。
これらの試験から、ハイブリッド粒子の２回の投与によ
る免疫化が免疫学的記憶を確立するために十分であり、
また高い抗体価の免疫応答を維持するためにブースター
投与が必要であると推定できる。
る免疫化が免疫学的記憶を確立するために十分であり、
また高い抗体価の免疫応答を維持するためにブースター
投与が必要であると推定できる。
ハイブリッド粒子の両方の部分に対するＴ細胞媒介免疫
応答がこれらのワクチン接種アカゲザルで検出できるか
否かを決定するために、末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を
用い、精製天然ＨＢｓＡＦＩまたはＨＩＶ／ＨＢｓＡｙ
粒子及び精製熱失活ＨＩＶによる刺激に応答したその増
殖能力及び３Ｈチミジンの取り込み能力を試験した。
ＰＢＬ増殖の内部対照としてはマイトジェンコンカナバ
リンＡを使用した。免疫化の前及び２回目及び３回目の
注射の２１日後並びにＨＢｓＡＦＩ粒子によるブースタ
ーの前後に各アカゲザルのＰＢＬを単離した。これらを
単独に培地で培養するかまたはＨＢｓＡｙもしくはＣｏ
ｎ＾で４日間またはＨＩＶＩで５日間刺激した。３回目
のワクチン投与の２１日後に得られた典型的な用量−反
応曲線を第８図に示す。
応答がこれらのワクチン接種アカゲザルで検出できるか
否かを決定するために、末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）を
用い、精製天然ＨＢｓＡＦＩまたはＨＩＶ／ＨＢｓＡｙ
粒子及び精製熱失活ＨＩＶによる刺激に応答したその増
殖能力及び３Ｈチミジンの取り込み能力を試験した。
ＰＢＬ増殖の内部対照としてはマイトジェンコンカナバ
リンＡを使用した。免疫化の前及び２回目及び３回目の
注射の２１日後並びにＨＢｓＡＦＩ粒子によるブースタ
ーの前後に各アカゲザルのＰＢＬを単離した。これらを
単独に培地で培養するかまたはＨＢｓＡｙもしくはＣｏ
ｎ＾で４日間またはＨＩＶＩで５日間刺激した。３回目
のワクチン投与の２１日後に得られた典型的な用量−反
応曲線を第８図に示す。
非刺激ＰＢＬに比較してＭａｃ ＨのＰＢＬは、最適濃
度の■［Ｖ／ＨＢｓＡｙ粒子による刺激に応答して８倍
の３Ｈチミジンを取り込んでおり、天然ＨＢｓＡｌＦに
よる刺激に応答して６倍の３Ｈチミジンを取り込んでい
た。Ｒ適温度のＨＩＶで刺激したとき、Ｍａｃ ＨのＰ
ＢＬは培地単独で刺激したＰＢＬの５倍の１Ｈチミジン
の取り込みを示した。対照として、Ｍａｃ＾のＰＢＬ増
殖応答を試験した。天然Ｉｆ Ｂ ｓ Ａ ｇの３回目
の注射の２１日後に、Ｍａｃ＾のＰＢＬは天然またはハ
イブリッドＨＢｓＡｇによる刺激に応答したが、いかな
る濃度の場合にも旧■による刺激に応答して増殖しなか
った。
度の■［Ｖ／ＨＢｓＡｙ粒子による刺激に応答して８倍
の３Ｈチミジンを取り込んでおり、天然ＨＢｓＡｌＦに
よる刺激に応答して６倍の３Ｈチミジンを取り込んでい
た。Ｒ適温度のＨＩＶで刺激したとき、Ｍａｃ ＨのＰ
ＢＬは培地単独で刺激したＰＢＬの５倍の１Ｈチミジン
の取り込みを示した。対照として、Ｍａｃ＾のＰＢＬ増
殖応答を試験した。天然Ｉｆ Ｂ ｓ Ａ ｇの３回目
の注射の２１日後に、Ｍａｃ＾のＰＢＬは天然またはハ
イブリッドＨＢｓＡｇによる刺激に応答したが、いかな
る濃度の場合にも旧■による刺激に応答して増殖しなか
った。
イムノシーム（ｉｍｍｕｎｏｚｏｍｅ）として組立てら
れた精製ｇｐ１６０または天然ｇｐ１６０に対するＰＢ
Ｌ増殖応答も試験した。最終注射の３箇月後に単離した
ＭａｃＨノＰＢＬを、投与量依存的に精製１１１ＶＩま
り！ｉＩ？ｐ１６０イムノシームで同様に刺激したく表
２）。逆に、ワクシニア系で産生された組換え、ｐ１６
０はいかなる増殖応答も誘発しない。対照として最終注
射の５７日後に採取したＭａｃ＾のＰＢＬはこれらの抗
原のいずれによって刺激しても増殖しない、これらの結
果は、本発明の特定抗原中のｇｐ１２０フラグメントの
プロセッシングが単量体形としてよりもピリオンまたは
イムノシームとして組立てられた環タンパク質のプロセ
ッシングに密接に関係していることを示唆する。
れた精製ｇｐ１６０または天然ｇｐ１６０に対するＰＢ
Ｌ増殖応答も試験した。最終注射の３箇月後に単離した
ＭａｃＨノＰＢＬを、投与量依存的に精製１１１ＶＩま
り！ｉＩ？ｐ１６０イムノシームで同様に刺激したく表
２）。逆に、ワクシニア系で産生された組換え、ｐ１６
０はいかなる増殖応答も誘発しない。対照として最終注
射の５７日後に採取したＭａｃ＾のＰＢＬはこれらの抗
原のいずれによって刺激しても増殖しない、これらの結
果は、本発明の特定抗原中のｇｐ１２０フラグメントの
プロセッシングが単量体形としてよりもピリオンまたは
イムノシームとして組立てられた環タンパク質のプロセ
ッシングに密接に関係していることを示唆する。
免疫化操作中に各動物についてＨＢｓＡｙまたはＨＩＶ
に応答したＰＢＬの特異的増殖もモニターした。
に応答したＰＢＬの特異的増殖もモニターした。
第９図はＨＩＶ／ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｙまたはＨＩＶ
による刺激に応答したリンパ球増殖の結果をまとめたも
のである。各抗原をいくつかの濃度で試験し４日目及び
５日目に応答を測定した。アカゲザルでは、最適濃度２
５０ｎｙ／ｚｌのＨＢｓＡｙ使用の４日後及び最適濃度
５００Ｂ／１１のＨＩＶ使用の５または６日後に増殖応
答のピークが得られる。ハイブリッド粒子で免疫化した
双方のアカゲザルにおいてＨＩＶ／ＨＢｓＡＦＩ及びＨ
ＢｓＡｙに対する最大増殖応答は２回目の注射後に観察
され、天然ＨＢｓＡりによる刺激後に得られる応答より
も常に大きい。
による刺激に応答したリンパ球増殖の結果をまとめたも
のである。各抗原をいくつかの濃度で試験し４日目及び
５日目に応答を測定した。アカゲザルでは、最適濃度２
５０ｎｙ／ｚｌのＨＢｓＡｙ使用の４日後及び最適濃度
５００Ｂ／１１のＨＩＶ使用の５または６日後に増殖応
答のピークが得られる。ハイブリッド粒子で免疫化した
双方のアカゲザルにおいてＨＩＶ／ＨＢｓＡＦＩ及びＨ
ＢｓＡｙに対する最大増殖応答は２回目の注射後に観察
され、天然ＨＢｓＡりによる刺激後に得られる応答より
も常に大きい。
Ｂ（第７図）またはＴの双方のレベルでＨＢｓＡｙに対
してＭａｃ ＨがＭａｃ Ｓよりも有意に応答する。３
回目の免疫化後の増殖応答は２回目の注射後の増殖応答
よりも低い、しかしながら３回目の注射の３箇月後には
十分なレベルの抗原反応細胞が回収されると考えられる
（Ｍａｅ、Ｈ）、ブースター免疫化はＰＢＬ増殖応答を
少し増加させる。
してＭａｃ ＨがＭａｃ Ｓよりも有意に応答する。３
回目の免疫化後の増殖応答は２回目の注射後の増殖応答
よりも低い、しかしながら３回目の注射の３箇月後には
十分なレベルの抗原反応細胞が回収されると考えられる
（Ｍａｅ、Ｈ）、ブースター免疫化はＰＢＬ増殖応答を
少し増加させる。
１１１Ｖに対する双方のアカゲザルのＰＢＬ増殖応答に
は大きい違いが観察される。 Ｍａｃ ＳのＰＢＬは３
回目の注射及びブースター注射の後に限って有意に増殖
するが、Ｍａｃ ＨのＰＢＬは免疫化過程のいかなる時
点でもＨＩＶに対して有意に増殖する。
は大きい違いが観察される。 Ｍａｃ ＳのＰＢＬは３
回目の注射及びブースター注射の後に限って有意に増殖
するが、Ｍａｃ ＨのＰＢＬは免疫化過程のいかなる時
点でもＨＩＶに対して有意に増殖する。
ＨＢｓＡｙに関して観察されたように、ＨＩＶに対する
増殖応答はブースターによって大きく増加はしないが最
終注射後３箇月間は同じレベルに維持される（Ｍａｃ
Ｈ）、従って、ブースター投与を遅らせる免疫プロトコ
ルを採用し得る。
増殖応答はブースターによって大きく増加はしないが最
終注射後３箇月間は同じレベルに維持される（Ｍａｃ
Ｈ）、従って、ブースター投与を遅らせる免疫プロトコ
ルを採用し得る。
ＨＩＶ及びＨＢｓＡｇに対するＭａｃ ＳのＰＢＬ応答
はより低く最終注射の３箇月後に喪失する。これは恐ら
くワクチン接種によってこれらの動物中で誘発された抗
原反応細胞が少ないためであろう。
はより低く最終注射の３箇月後に喪失する。これは恐ら
くワクチン接種によってこれらの動物中で誘発された抗
原反応細胞が少ないためであろう。
され（Ｍａｃ ）Ｉ）、刺激指数（ＳＩ）が５２日目ま
では同等であることが判明する。５２日１ＧごなるとＨ
ＢｓＡｇ特異的Ｔ細胞の数が有意に増加する。
では同等であることが判明する。５２日１ＧごなるとＨ
ＢｓＡｇ特異的Ｔ細胞の数が有意に増加する。
これらの結果は、アカゲザルにおいてＨｌ及びＨＢｓＡ
ｙに対する細胞媒介免疫応答がハイブリッドＨＩＶ／Ｈ
ＢｓＡｇ粒子によるワクチン接種後に誘発され、この応
答の速度が動物毎に違うことを証明する。
ｙに対する細胞媒介免疫応答がハイブリッドＨＩＶ／Ｈ
ＢｓＡｇ粒子によるワクチン接種後に誘発され、この応
答の速度が動物毎に違うことを証明する。
ＣＯ２結合部位を含むＨＩＶ ｇｐ１２０エンベロープ
タンパク質（＾＾３８４〜４７２）のフラグメントを保
有するＨＢｓＡｇ粒子を使用して融合タンパク質の両方
の成分（ＨＢｓＡｇ及びＨＩＶ）に対する抗体及びＴ細
胞応答が得られた。
タンパク質（＾＾３８４〜４７２）のフラグメントを保
有するＨＢｓＡｇ粒子を使用して融合タンパク質の両方
の成分（ＨＢｓＡｇ及びＨＩＶ）に対する抗体及びＴ細
胞応答が得られた。
ＨＢｓＡｙ粒子はＨＩＶエピトープを存在させるすぐれ
た担体であり、免疫されたアカゲザルでｇｐ１２０エン
ベロープタンパク質の機能ドメインに対する体液性免疫
応答及びＴ細胞媒介免疫応答を誘発し得る。
た担体であり、免疫されたアカゲザルでｇｐ１２０エン
ベロープタンパク質の機能ドメインに対する体液性免疫
応答及びＴ細胞媒介免疫応答を誘発し得る。
本発明の別の特徴及び特性は図面からも明らかであろう
。
。
ＬＩＬ、ＨＩＶのエンベロープの遺伝子のフラグメント
の発現及びクローニングベクターを示す。
の発現及びクローニングベクターを示す。
Ｈ１３ｔｇ１３０はｔｌｌＶのＤＮ＾フラグメントのク
ローニングベクターである。斜線領域はβガラクトシダ
ーゼの遺伝子のＮ末端部を示す。この領域に多重クロー
ニング部位を有するアダプターが検出される。
ローニングベクターである。斜線領域はβガラクトシダ
ーゼの遺伝子のＮ末端部を示す。この領域に多重クロー
ニング部位を有するアダプターが検出される。
Ｅｌ：ＥｃｏＲＩ 、Ｓｍ：Ｓｍａ Ｉ 、 Ｓｓ：Ｓ
ｓｔ Ｉ 、 ＥＶ ：ＥｃｏＲＶ、Ｓｐ：Ｓｐｈ Ｉ
、に：Ｋｐｎ Ｉ 、Ｘｂ：Ｘｂａ Ｉ 、Ｈ：旧ｎ
ｄＤＩ、Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｓａ：Ｓａｌ Ｉ 、Ｐ：Ｐ
ｓｔ ｒ 。
ｓｔ Ｉ 、 ＥＶ ：ＥｃｏＲＶ、Ｓｐ：Ｓｐｈ Ｉ
、に：Ｋｐｎ Ｉ 、Ｘｂ：Ｘｂａ Ｉ 、Ｈ：旧ｎ
ｄＤＩ、Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｓａ：Ｓａｌ Ｉ 、Ｐ：Ｐ
ｓｔ ｒ 。
ＰＳＶＳ、 ｐＨ２ｓ、 ｐｓＶ２ｓ及びｐＳＶＳ Ｘ
Ｌハ発現ヘクターである。
Ｌハ発現ヘクターである。
Ｘｈ：Ｘｈｏ Ｉ 。
第」」Ａｕ−１ＨＢｓＡｙと融合した）ＩＩＶエンベロ
ープフラグメントのアミノ酸配列を概略的に示す０番号
系は参考文献（３）の＾ＬＴＺＯＮ等の論文に拠る。黒
丸及び矢印は夫々グリコシレージョン可能部位及び保存
システィンに対応する。４つのペプチドの配列はＨＩＶ
Ｉ及びＨＩＶ２の単離物中で保存された領域を示す。
ープフラグメントのアミノ酸配列を概略的に示す０番号
系は参考文献（３）の＾ＬＴＺＯＮ等の論文に拠る。黒
丸及び矢印は夫々グリコシレージョン可能部位及び保存
システィンに対応する。４つのペプチドの配列はＨＩＶ
Ｉ及びＨＩＶ２の単離物中で保存された領域を示す。
」１団（、ＨＢｓＡｇの組換え粒子のウェスタンプロッ
ト分析を示す９組換え粒子Ｎｏ、２（＾）、Ｎｏ、８（
Ｂ）及びＮｏ、６（Ｃ）を、ｔ ：５００に希釈した抗
ｐ４９ａ血清（ラインＡ１、Ｂ１及びＣＩ）、抗ペプチ
ド５抗血清（ライン＾２）、抗ペプチド６抗血清（ライ
ン８２）、１：２５に希釈した抗ペプチド７抗血清（ラ
インＢ３）及び１：２００に希釈したモノクローナル抗
体１８／７（ラインＣ２）と反応させた。サイズをキロ
ダルトンで示す。
ト分析を示す９組換え粒子Ｎｏ、２（＾）、Ｎｏ、８（
Ｂ）及びＮｏ、６（Ｃ）を、ｔ ：５００に希釈した抗
ｐ４９ａ血清（ラインＡ１、Ｂ１及びＣＩ）、抗ペプチ
ド５抗血清（ライン＾２）、抗ペプチド６抗血清（ライ
ン８２）、１：２５に希釈した抗ペプチド７抗血清（ラ
インＢ３）及び１：２００に希釈したモノクローナル抗
体１８／７（ラインＣ２）と反応させた。サイズをキロ
ダルトンで示す。
１支ｌ庚、中和試験を示す、ウサギを組換え体Ｎｏ、８
（ｏ・・・０）またはプレ免疫血清（ｏ−ｏ）で免疫化
して得られた抗血清を１＝５０に希釈しこの抗血清で種
々のウィルス標本（Ａ、Ｂ及びＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ
中相の速度を試験した ３Ｈ三リン酸チミジンの取り込
みによって逆転写酵素活性（ｃｐｓ）を測定した。
（ｏ・・・０）またはプレ免疫血清（ｏ−ｏ）で免疫化
して得られた抗血清を１＝５０に希釈しこの抗血清で種
々のウィルス標本（Ａ、Ｂ及びＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ
中相の速度を試験した ３Ｈ三リン酸チミジンの取り込
みによって逆転写酵素活性（ｃｐｓ）を測定した。
グラフＤの各点は次の式で計算されたＡ、Ｂ及びＣに対
するＲＴ阻害の％を示す。
するＲＴ阻害の％を示す。
１旦」−集、組換え体Ｎ０１８に対するウサギの免疫血
清によるＨＩＶの中和を示す、異なる２つの単離物ＬＡ
Ｖ ＢＲＵ（○、・）及びＬＡＶ ＥＬＩ（Δｉ）を使
用し細胞培養物中のウィルスの中和を知るなめにプレ免
疫血清（実線）及び免疫血清（点線）を試験した。７〜
１０日後に細胞培養物の上清中の逆転写酵素活性を測定
した。
清によるＨＩＶの中和を示す、異なる２つの単離物ＬＡ
Ｖ ＢＲＵ（○、・）及びＬＡＶ ＥＬＩ（Δｉ）を使
用し細胞培養物中のウィルスの中和を知るなめにプレ免
疫血清（実線）及び免疫血清（点線）を試験した。７〜
１０日後に細胞培養物の上清中の逆転写酵素活性を測定
した。
Ｕ、レトロライｌレスＳＩＶｍａｅ、 ＨＩＶ−２及び
ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質の配列を示す。
ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質の配列を示す。
第６図の配列中の線は配列の位置合わせを示すだけであ
る。従ってこの線は化学的な意味をもたない。
る。従ってこの線は化学的な意味をもたない。
［、ハイブリッドＨＢｓＡｇ粒子（Ｓ−Ｈ）または天然
ＨＢｓＡｙ粒子（＾）で免疫化したアカゲザル（ｗ＋ａ
ｃａｑｕｅ）の抗体価を示す。
ＨＢｓＡｙ粒子（＾）で免疫化したアカゲザル（ｗ＋ａ
ｃａｑｕｅ）の抗体価を示す。
Ｍａｃ Ｓ及びＨに対して精製ＨＩＶ／ＨＢｓＡｇを毎
回１０μｇまたは１５μｇの投与量で０．２４．７０．
１６７及び２０３日目活性射しな、 Ｍａｃ Ａに対し
ては精製血漿由来のＨＢｓＡｙ粒子を毎回１５ｕ、の投
与量で０．２１．４３．１６５日目１注射した。１回目
の投与は完全フロインドアジュバント中で与え、２回目
の投与は不完全フロインドアジュバント中で与えた。
Ｍａｃ Ｓ及びＨに対する４回目の投与はアジュバント
を用いないで行なった。
回１０μｇまたは１５μｇの投与量で０．２４．７０．
１６７及び２０３日目活性射しな、 Ｍａｃ Ａに対し
ては精製血漿由来のＨＢｓＡｙ粒子を毎回１５ｕ、の投
与量で０．２１．４３．１６５日目１注射した。１回目
の投与は完全フロインドアジュバント中で与え、２回目
の投与は不完全フロインドアジュバント中で与えた。
Ｍａｃ Ｓ及びＨに対する４回目の投与はアジュバント
を用いないで行なった。
注射後の種々の時点で得られた血清標本を系列希釈し、
ＥＬＩＳＡ試験によってＨＢｓＡｌＦまたはＨＩＶ特異
的抗体を試験した。プレ免疫血清で得られた値の３倍の
吸光値（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｌｕｅ）を示した
血清希釈度の逆数で力価を示す、各点は４つの測定値の
平均である。
ＥＬＩＳＡ試験によってＨＢｓＡｌＦまたはＨＩＶ特異
的抗体を試験した。プレ免疫血清で得られた値の３倍の
吸光値（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｌｕｅ）を示した
血清希釈度の逆数で力価を示す、各点は４つの測定値の
平均である。
ｍはリンパ球の抗原刺激を示す。
ＨＩＶ／ＨＢｓＡｇで３回免疫したＭａｃｌｌまたは［
ＩＢｓ八ｙへｈ口 ３回免疫したＭａｃ＾（対照動物）のヘパリン化血液か
らＦｉｃｏｌｌ、ｆｌｙｐａｑｕｅ遠心によってＦＢＩ
、を単離した。
ＩＢｓ八ｙへｈ口 ３回免疫したＭａｃ＾（対照動物）のヘパリン化血液か
らＦｉｃｏｌｌ、ｆｌｙｐａｑｕｅ遠心によってＦＢＩ
、を単離した。
１０％の熱失活ブール正常ヒト血清式Ｂを補充したＲＰ
Ｍｌ １６−４０培地にＰＢＬを１．５Ｘ １０’細胞
／１１１で懸濁させ、９６ウエルプレートの３つの丸底
ウェルに各０，１ｚ１をいれた。 ＰＢＬを、０．１ｘ
１のシヨ糖濃度勾配精製１１１ＶＩ及び塩化セシウム勾
配で連続２回精製したＨＢｓｈで刺激した。各抗原を種
々の濃度で検定した。刺激の４日または５日後にＰＢＬ
の各ウニ／１を１μＣｉの３Ｈ−チミジンで６時間標識
し、細胞を採集して、取り込まれた３Ｈ−チミジンのｃ
ｐＩｌｌをト（体シンチレーションカウンティングで測
定した。
Ｍｌ １６−４０培地にＰＢＬを１．５Ｘ １０’細胞
／１１１で懸濁させ、９６ウエルプレートの３つの丸底
ウェルに各０，１ｚ１をいれた。 ＰＢＬを、０．１ｘ
１のシヨ糖濃度勾配精製１１１ＶＩ及び塩化セシウム勾
配で連続２回精製したＨＢｓｈで刺激した。各抗原を種
々の濃度で検定した。刺激の４日または５日後にＰＢＬ
の各ウニ／１を１μＣｉの３Ｈ−チミジンで６時間標識
し、細胞を採集して、取り込まれた３Ｈ−チミジンのｃ
ｐＩｌｌをト（体シンチレーションカウンティングで測
定した。
ＩＪ−（１）アカゲザルのＰＢＬ増殖応答の追跡を示す
。
。
免疫化前、２回目及び３回目の免疫化後、図示の日程の
ブースターの前後にリンパ球を採取した。
ブースターの前後にリンパ球を採取した。
矢印は動物を免疫化した日を示す、外来抗原に応答して
３Ｈ−チミジンを取り込むリンパ球の能力を第８図同様
にモニターし、刺激細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン
のｃｐｌｌを非刺激細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン
のｃｐｍによって除算して刺激指数（Ｓ、１．）を計算
した。これらの実験において、バックグラウンドｃｐｍ
は１００〜２４５０ｃｐｍの範囲であった。 Ｃｏｎ＾
に対する幼若化応答のｓ、ｒ、は５〜１２９の範囲であ
った。
３Ｈ−チミジンを取り込むリンパ球の能力を第８図同様
にモニターし、刺激細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン
のｃｐｌｌを非刺激細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジン
のｃｐｍによって除算して刺激指数（Ｓ、１．）を計算
した。これらの実験において、バックグラウンドｃｐｍ
は１００〜２４５０ｃｐｍの範囲であった。 Ｃｏｎ＾
に対する幼若化応答のｓ、ｒ、は５〜１２９の範囲であ
った。
本発明の好ましい粒子の免疫原性はまた、前記に定義し
た組換えベクターの発現の際に予想されるＨＩＶ由来の
ペプチドのグリコシレージョンに起因すると考えられる
。
た組換えベクターの発現の際に予想されるＨＩＶ由来の
ペプチドのグリコシレージョンに起因すると考えられる
。
前記においてＨＩＶの免疫原アミノ酸配列及びＴ４リン
パ球のＣＤ４レセプターとの結合部位は多くの場合、Ｈ
ＩＶの表面糖タンパク質またはトランスメンプラン糖タ
ンパク質に属する共通配列に由来した。勿論、これらの
配列の各々は、ＨＩＶの天然タンパク胃中の互いに離間
した領域に由来してもよい、後者の場合、該配列は好ま
しくは、ＨＩＶのゲノムの対応領域によってコードされ
る２つの配列の発現によって得られる組換え配列または
組換えポリペプチドから成る。このＨＩＶは種々の単離
物に属するＨＩＶでもよい。
パ球のＣＤ４レセプターとの結合部位は多くの場合、Ｈ
ＩＶの表面糖タンパク質またはトランスメンプラン糖タ
ンパク質に属する共通配列に由来した。勿論、これらの
配列の各々は、ＨＩＶの天然タンパク胃中の互いに離間
した領域に由来してもよい、後者の場合、該配列は好ま
しくは、ＨＩＶのゲノムの対応領域によってコードされ
る２つの配列の発現によって得られる組換え配列または
組換えポリペプチドから成る。このＨＩＶは種々の単離
物に属するＨＩＶでもよい。
前記においてはまた、ＨＩＶから得られる種々の単離物
中に十分に保存されたＨＩＶ由来の配列の使用が好まし
いと説明した。しかしながら勿論、単離物によってはそ
れほど十分には保存されない配列を使用することも可能
である。このような仮説のもとに本発明はまた、前記に
定義したような粒子組成物において、粒子が共通アミノ
酸配列と共に種々の単離物に対応する糖タンパク質の領
域を含むことによって識別される組成物に係る。
中に十分に保存されたＨＩＶ由来の配列の使用が好まし
いと説明した。しかしながら勿論、単離物によってはそ
れほど十分には保存されない配列を使用することも可能
である。このような仮説のもとに本発明はまた、前記に
定義したような粒子組成物において、粒子が共通アミノ
酸配列と共に種々の単離物に対応する糖タンパク質の領
域を含むことによって識別される組成物に係る。
最後に本発明は、本発明の範囲で同定されるＨＩＶ由来
の好ましいアミノ酸配列、従って、前記配列をコードす
るＤＮ＾配列（また化学的合成によって産生され同様の
免疫原特性を有するポリペプチド、及び、天然配列であ
るかまたはヌクレオチド合成によって産生された配列で
あるかにかがわりなく、これらのポリペプチドをコード
するすべての核酸配列）に係る。
の好ましいアミノ酸配列、従って、前記配列をコードす
るＤＮ＾配列（また化学的合成によって産生され同様の
免疫原特性を有するポリペプチド、及び、天然配列であ
るかまたはヌクレオチド合成によって産生された配列で
あるかにかがわりなく、これらのポリペプチドをコード
するすべての核酸配列）に係る。
特に、前記アミノ酸配列は、細菌支持体として大腸菌を
含み、ＨＩＶの前記ペプチド配列を細菌の表面に集中し
て含むワクチンの活性成分の製造に使用され得る。かか
るワクチンの製造には、１９８７年３月６日出願の欧州
特許公開第０２４２，２４３号に記載の方法を使用し得
る。
含み、ＨＩＶの前記ペプチド配列を細菌の表面に集中し
て含むワクチンの活性成分の製造に使用され得る。かか
るワクチンの製造には、１９８７年３月６日出願の欧州
特許公開第０２４２，２４３号に記載の方法を使用し得
る。
表二
下意乙の文献’Ｉｉ ｑＱ細４１１：Ｊ＋用二八へ４の
ｌ゛爲る；表２ ：ｆｌｌＶまたはＨＩＶエンベロープ
糖タンパク質で刺激後にＨＩＶ／ＨＢｓＡｙ粒子で免疫
化したアカゲザルＨのＰＢＬの増殖応答 ａ）ＰＢＬをシー１１Ｍ勾配精製ＨＩＶ、感染培養物か
ら精製したｇｐ１８０のイムノシームまたはワクシニア
ウィルス系中で産生じた精製組換えＨｐ１６０で第８図
のごとく５日間刺激した。
ｌ゛爲る；表２ ：ｆｌｌＶまたはＨＩＶエンベロープ
糖タンパク質で刺激後にＨＩＶ／ＨＢｓＡｙ粒子で免疫
化したアカゲザルＨのＰＢＬの増殖応答 ａ）ＰＢＬをシー１１Ｍ勾配精製ＨＩＶ、感染培養物か
ら精製したｇｐ１８０のイムノシームまたはワクシニア
ウィルス系中で産生じた精製組換えＨｐ１６０で第８図
のごとく５日間刺激した。
ｂ）抗原刺激後に取り込まれた３Ｈ−チミジンのａｐｅ
ｓｃ）Ｓ、Ｉ 、 ：刺激指数 １、 八１ｌａｎ、Ｊ、Ｓ、 ｅｔ ａｌ、（１９
８５） ５ｃｉｅｎｃｅ ２２８． １０９１−１
０９３゜２、 Ｒｏｂｅｙ、劉Ｇ、 ｅｔ ａｌ、（１
９８５） ５ｃｉｅｎｃｅ ２２８．５９３−５９５゜
３、 Ａ１１ｚｏｎ、Ｍ、 ｅｔ ａｌ （１９８６）
Ｃｅ１ｌ ４６．６３−７４゜４、５ｔａｒｃｉｃｈ
、 Ｂ、Ｒ，ｅｔ ａｌ （１９８６） Ｃｅ１ｌ ４
５，６３７−６４８．５、 ＭｃＤｏｕｇａｌ、 Ｊ、
Ｓ、 ｅｔ ａｌ （１９８６） ５ｃｉｅｎｃｅ ２
３１．３８２−３８５゜６、 Ｒｏｂｅｙ、 Ｗ、Ｇ、
ｅｔ ａｌ （１９８６） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、 ｋｃａａ、 Ｓｃｉ、 υ５Ａ８３．７０２３
−７０２７゜ ７、 Ｌａ５ｋｙ、Ｌ、Ａ、 ｅｔ ａｌ （１９８Ｇ
） ５ｃｉｅｎｃｅ ２３３．２０９−２１２゜Ｂ、
Ｐｕｔｎｅｙ、 Ｓ、Ｄ、 ｅｔ ａｌ （１９８６）
５ｃｉｅｎｃｅ ２３４．１３９２−１３９５゜９、
Ｃｈａｎｈ、 Ｔ、Ｃ，ａｔ ａｌ （１９８６）
ＥＭＢＯＪ、 ５．３０６５−３０７１゜１０、 Ｔｉ
ｏｌｌａｉｓ、 Ｐ、 ｅｔ ａｌ （１９８５） Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１７，４８９−４９５゜１１、 Ｍｉｃ
ｈｅｌ、 Ｍ、Ｌ、 ｅｔ ａｌ （１９８４）Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ｓｃ）Ｓ、Ｉ 、 ：刺激指数 １、 八１ｌａｎ、Ｊ、Ｓ、 ｅｔ ａｌ、（１９
８５） ５ｃｉｅｎｃｅ ２２８． １０９１−１
０９３゜２、 Ｒｏｂｅｙ、劉Ｇ、 ｅｔ ａｌ、（１
９８５） ５ｃｉｅｎｃｅ ２２８．５９３−５９５゜
３、 Ａ１１ｚｏｎ、Ｍ、 ｅｔ ａｌ （１９８６）
Ｃｅ１ｌ ４６．６３−７４゜４、５ｔａｒｃｉｃｈ
、 Ｂ、Ｒ，ｅｔ ａｌ （１９８６） Ｃｅ１ｌ ４
５，６３７−６４８．５、 ＭｃＤｏｕｇａｌ、 Ｊ、
Ｓ、 ｅｔ ａｌ （１９８６） ５ｃｉｅｎｃｅ ２
３１．３８２−３８５゜６、 Ｒｏｂｅｙ、 Ｗ、Ｇ、
ｅｔ ａｌ （１９８６） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、 ｋｃａａ、 Ｓｃｉ、 υ５Ａ８３．７０２３
−７０２７゜ ７、 Ｌａ５ｋｙ、Ｌ、Ａ、 ｅｔ ａｌ （１９８Ｇ
） ５ｃｉｅｎｃｅ ２３３．２０９−２１２゜Ｂ、
Ｐｕｔｎｅｙ、 Ｓ、Ｄ、 ｅｔ ａｌ （１９８６）
５ｃｉｅｎｃｅ ２３４．１３９２−１３９５゜９、
Ｃｈａｎｈ、 Ｔ、Ｃ，ａｔ ａｌ （１９８６）
ＥＭＢＯＪ、 ５．３０６５−３０７１゜１０、 Ｔｉ
ｏｌｌａｉｓ、 Ｐ、 ｅｔ ａｌ （１９８５） Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１７，４８９−４９５゜１１、 Ｍｉｃ
ｈｅｌ、 Ｍ、Ｌ、 ｅｔ ａｌ （１９８４）Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ ８１，７７０Ｂ−７７１２゜
り１０−９１８゜
１４、 Ｘ１ｅｎｙ、Ｍ、Ｐ、 ｅｔ ａｌ （１９８
３） Ｇｅｎｅ ２６．９１−９９゜１５、ｔＪｒｌａ
ｕｂ、Ｇ、ｅｔ、ａｌ （１９８０）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ。
３） Ｇｅｎｅ ２６．９１−９９゜１５、ｔＪｒｌａ
ｕｂ、Ｇ、ｅｔ、ａｌ （１９８０）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ７７、 ４２１６−４２２０゜１６、
Ｐａｒｋｅｒ、 Ｂ、Ａ、 ｅｔ ａｌ （１９７９）
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、３１，３６０−３６９゜１７、 Ｓｕ
ｂｒａｍａｎｉ、５．（１９８１） Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ ａｎ＋５ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １
゜８シト８６４゜ １８、Ｍｉｃｈｅｌ、 Ｍ、Ｌ、 ｅｔ ａｌ （１９
８５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３．５Ｅｉ１−
５６６゜１９、Ｇｅｒｉｎ、 Ｊ、Ｌ、 ｅｔ ａ
ｌ （１９８３）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ８０．２３６５−２３６９＋ ２０、 Ｈａｅｒｍａｎｎ、 Ｋ、Ｈ，ｅｔ ａｌ （
１９８４）Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ５２，３９６−４０２
゜２１、’Ｃｈａｒｂｉｔ、Ａ、ｅｔ ａｌ （１９
８７１Ｊ、工ｍｎ＋ｕｎｏｌｏｇｙ １３９，１６５
８−１６６４゜２２、Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、Ｌ、ｅｔ
ａｌ （１９８４） 工ｎ Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ｃ
ｅｌｌＬｅｕｋｅｍｉａ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｖｉｒｕ
ｓ、ｅｄ、Ｇａ１ｌｏ、Ｒ，Ｃ，、Ｅｓ５ｅｘ、Ｍ、＆
Ｇｒｏｓｓ、’Ｌ、（Ｃｏｌｃｌ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｚｉ
ｎｇＨａｘｂｏｘ、Ｎｅｗ−Ｙｏｚｋ）、ｐｐ、３Ｇ３
−３７０゜２３、Ｒｅｙ、Ｍ、Ａ、ｅｔ ａｌ （１
９８４）Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａ辷
１ｏｎｓ １２１，１２Ｇ−１３３゜２４、Ｍａｄｄ
ｏｎ、Ｐ−Ｊ、ｅｔ ａｌ （１９８６）Ｃｅ’ｌｌ
４７，３３３−３４１３゜２５、 Ｌａ５ｋｙ、 Ｌ
、Ａ、 ｅｔ ａｌ （１９８７） Ｃｅ１ｌ ５０
． ９７５−９８５゜２Ｇ、Ｇａ１ｌａｈｅｒ、Ｗ、Ｒ
，ｅｔ ａｌ （１９Ｂ？）Ｃｅｌｌ ５０，３２７
−３２８゜２７、 Ｍｉｌｉｃｈ、 Ｄ、Ｒ，ｅヒａ
ｌ （１９８６）Ｊ、Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 １６４
，５３２−５４７゜２８、 Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、
Ｐ、 ａｔ ａｌ（１９８５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ ３． ３２３−３２６゜２９、 Ｄｅｌｐｅ
ｙｒｏｕｘ、 Ｆ、 ｅｔ ａｌ（１９８６） ５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２３３． ４７２−４７５゜３０、 Ｃｅａ
ｓｅ、 ）Ｃ，Ｂ、ｅｔ ａｌ （１９８７） Ｐｗｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８４゜４２
４９−４２５３゜ ３１、 Ｋｒｏｈｎ、 Ｋ、Ｄ ｅｔ ａｌ
（１９８７） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｅａｄ、ｓｃ
ｉ、ｔ）Ｓ入 ８４゜４９９４−４９９８゜ ３２、 Ｘｏｗａｌｓｋｉ、 Ｍ、 ｅｔ ａｌ（１
９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７． １３５１−１３５
５゜（以ド余白）
Ｐａｒｋｅｒ、 Ｂ、Ａ、 ｅｔ ａｌ （１９７９）
Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、３１，３６０−３６９゜１７、 Ｓｕ
ｂｒａｍａｎｉ、５．（１９８１） Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ ａｎ＋５ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １
゜８シト８６４゜ １８、Ｍｉｃｈｅｌ、 Ｍ、Ｌ、 ｅｔ ａｌ （１９
８５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３．５Ｅｉ１−
５６６゜１９、Ｇｅｒｉｎ、 Ｊ、Ｌ、 ｅｔ ａ
ｌ （１９８３）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃｉ、ＵＳＡ８０．２３６５−２３６９＋ ２０、 Ｈａｅｒｍａｎｎ、 Ｋ、Ｈ，ｅｔ ａｌ （
１９８４）Ｊ、 Ｖｉｒｏｌ、 ５２，３９６−４０２
゜２１、’Ｃｈａｒｂｉｔ、Ａ、ｅｔ ａｌ （１９
８７１Ｊ、工ｍｎ＋ｕｎｏｌｏｇｙ １３９，１６５
８−１６６４゜２２、Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒ、Ｌ、ｅｔ
ａｌ （１９８４） 工ｎ Ｈｕｍａｎ Ｔ−Ｃ
ｅｌｌＬｅｕｋｅｍｉａ／Ｌｙｍｐｈｏｍａ Ｖｉｒｕ
ｓ、ｅｄ、Ｇａ１ｌｏ、Ｒ，Ｃ，、Ｅｓ５ｅｘ、Ｍ、＆
Ｇｒｏｓｓ、’Ｌ、（Ｃｏｌｃｌ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ Ｓｐｚｉ
ｎｇＨａｘｂｏｘ、Ｎｅｗ−Ｙｏｚｋ）、ｐｐ、３Ｇ３
−３７０゜２３、Ｒｅｙ、Ｍ、Ａ、ｅｔ ａｌ （１
９８４）Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａ辷
１ｏｎｓ １２１，１２Ｇ−１３３゜２４、Ｍａｄｄ
ｏｎ、Ｐ−Ｊ、ｅｔ ａｌ （１９８６）Ｃｅ’ｌｌ
４７，３３３−３４１３゜２５、 Ｌａ５ｋｙ、 Ｌ
、Ａ、 ｅｔ ａｌ （１９８７） Ｃｅ１ｌ ５０
． ９７５−９８５゜２Ｇ、Ｇａ１ｌａｈｅｒ、Ｗ、Ｒ
，ｅｔ ａｌ （１９Ｂ？）Ｃｅｌｌ ５０，３２７
−３２８゜２７、 Ｍｉｌｉｃｈ、 Ｄ、Ｒ，ｅヒａ
ｌ （１９８６）Ｊ、Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 １６４
，５３２−５４７゜２８、 Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、
Ｐ、 ａｔ ａｌ（１９８５） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ ３． ３２３−３２６゜２９、 Ｄｅｌｐｅ
ｙｒｏｕｘ、 Ｆ、 ｅｔ ａｌ（１９８６） ５ｃｉ
ｅｎｃｅ ２３３． ４７２−４７５゜３０、 Ｃｅａ
ｓｅ、 ）Ｃ，Ｂ、ｅｔ ａｌ （１９８７） Ｐｗｏ
ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ ８４゜４２
４９−４２５３゜ ３１、 Ｋｒｏｈｎ、 Ｋ、Ｄ ｅｔ ａｌ
（１９８７） Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｅａｄ、ｓｃ
ｉ、ｔ）Ｓ入 ８４゜４９９４−４９９８゜ ３２、 Ｘｏｗａｌｓｋｉ、 Ｍ、 ｅｔ ａｌ（１
９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７． １３５１−１３５
５゜（以ド余白）
第１図は、ＨＩＶのエンベロープの遺伝子のフラグメン
トの発現及びクローニングベクターの説明図、第２図は
、）ＨＢｓＡｇと融合したＨＩＶエンベロープフラグメ
ントのアミノ酸配列の概略図、第３図は、ＨＢｓＡｇの
組換え粒子のウェスタンプロット分析を示す図、第４図
は、ウサギを組換え体Ｎｏ、８（ｏ・・・Ｏ）またはプ
レ免疫血清（ｏ−ｏ）で免疫化して得られた抗血清を１
：５０に希釈しこの抗血清で種々のウィルス標本（Ａ、
Ｂ及びＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ中和の速度を試験した結
果を示すグラフ、第５図は、組換え体Ｎｏ。 ８に対するウサギの免疫血清によるＨＩＶの中和を示す
グラフ、第６図は、レトロウィルスＳＩＶｍａｃ、ＨＩ
Ｖ−２及びＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質の配列
、第７図は、ハイブリッド）ＩＢｓＡｇ粒子（Ｓ４１）
または天然ＨＢｓＡｇ粒子（＾）で免疫化したアカゲザ
ル（＋５ａｃａｑｕｅ）の抗体価を示すグラフ、第８図
はリンパ球の抗原刺激を示すグラフ、第９図はアカゲザ
ルのＰＢＬ増殖応答の追跡を示すグラフである。 １．４．斥俣入 上眉壜人 アンステイテユ・バストクール アンスナイ千】−・ナレｔ？ｌし・ト１ヤラ・１ン千・
コニ・トカ・う・ ルシエルン工・Ａ＋”ｌかし ｍ４々釈亀 ＦＩ６．５ ヤ釈１ Ａｎｎｉｅ ↑↑↑ ↑ ＦＩ［３，９八
トの発現及びクローニングベクターの説明図、第２図は
、）ＨＢｓＡｇと融合したＨＩＶエンベロープフラグメ
ントのアミノ酸配列の概略図、第３図は、ＨＢｓＡｇの
組換え粒子のウェスタンプロット分析を示す図、第４図
は、ウサギを組換え体Ｎｏ、８（ｏ・・・Ｏ）またはプ
レ免疫血清（ｏ−ｏ）で免疫化して得られた抗血清を１
：５０に希釈しこの抗血清で種々のウィルス標本（Ａ、
Ｂ及びＣ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ中和の速度を試験した結
果を示すグラフ、第５図は、組換え体Ｎｏ。 ８に対するウサギの免疫血清によるＨＩＶの中和を示す
グラフ、第６図は、レトロウィルスＳＩＶｍａｃ、ＨＩ
Ｖ−２及びＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質の配列
、第７図は、ハイブリッド）ＩＢｓＡｇ粒子（Ｓ４１）
または天然ＨＢｓＡｇ粒子（＾）で免疫化したアカゲザ
ル（＋５ａｃａｑｕｅ）の抗体価を示すグラフ、第８図
はリンパ球の抗原刺激を示すグラフ、第９図はアカゲザ
ルのＰＢＬ増殖応答の追跡を示すグラフである。 １．４．斥俣入 上眉壜人 アンステイテユ・バストクール アンスナイ千】−・ナレｔ？ｌし・ト１ヤラ・１ン千・
コニ・トカ・う・ ルシエルン工・Ａ＋”ｌかし ｍ４々釈亀 ＦＩ６．５ ヤ釈１ Ａｎｎｉｅ ↑↑↑ ↑ ＦＩ［３，９八
Claims (34)
- （１）Ｂ型肝炎ウィルスの主要表面抗原のＳ領域及び任
意にプレＳ領域の全部または一部に対応する核酸フラグ
メントを含み、コンピテント真核細胞宿主に導入される
と、これによって形質転換された細胞宿主の培養の際に
、ＨＢｓＡｇ抗原の本質的な形態学的特徴を有する粒子
の産生を誘発しかつ好ましくは該粒子を培地に分泌させ
得る組換えベクターにおいて、 一ベクターが更に、ＨＩＶ族のレトロウィルスに対する
中和抗体を誘発するかまたはかかる抗体によって認識さ
れ得る免疫原アミノ酸配列をコードする外来ヌクレオチ
ド配列を含み、該アミノ酸配列が、Ｂリンパ球によって
認識され得る少なくとも１つのエピトープとＴリンパ球
によって認識され得る少なくとも１つのリンパ球とを含
み、−前記外来ヌクレオチド配列が、前記プレＳ領域に
挿入されるかまたは前記プレＳ領域の全部または一部に
置換していることを特徴とする組換えベクター。 - （２）外来ヌクレオチド配列が、更にＣＤ４レセプター
との結合部位を少なくとも１つ含む免疫原アミノ酸配列
をコードしていることを特徴とする請求項１に記載の組
換えベクター。 - （３）前記核酸フラグメントが、真核細胞宿主のポリメ
ラーゼによって認識されるプロモーターのコントロール
下に配置されていることを特徴とする請求項１または２
に記載の組換えベクター。 - （４）プロモーターがＳＶ４０由来のプロモーターであ
ることを特徴とする請求項３に記載の組換えベクター。 - （５）挿入ヌクレオチド配列がプレＳ領域の全部に置換
していることを特徴とする請求項１から４のいずれか一
項に記載の組換えベクター。 - （６）外来ヌクレオチド配列がプレＳ領域のプレＳ２部
分に挿入されていることを特徴とする請求項１から４の
いずれか一項に記載の組換えベクター。 - （７）挿入配列の両側のプレＳ２領域が実質的に欠失し
ていることを特徴とする請求項６に記載の組換えベクタ
ー。 - （８）挿入された外来ヌクレオチド配列が以下のアミノ
酸配列 【遺伝子配列があります】 〔Ｘ１、Ｚ１；Ｘ２、Ｚ２及びＸ３、Ｚ３の対は、ＣＯ
ＯＨもしくはＮＨ＿２基を示すか、または通常は上記配
列を含むレトロウィルスＳＩＶ、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−
１の糖タンパク質中で上記配列の対応中央部に正常に夫
々結合したアミノ酸配列を示す〕 の１つをコードする配列を含むことを特徴とする請求項
１から７のいずれか一項に記載の組換えベクター。 - （９）挿入された外来ヌクレオチド配列が以下の配列 【遺伝子配列があります】 の１つの全部または一部をコードすることを特徴とする
請求項１から８のいずれか一項に記載の組換えベクター
。 - （１０）ベクターｐＭ２Ｓに由来することを特徴とする
請求項６に記載の組換えベクター。 - （１１）ベクターｐＳＶ２Ｓに由来することを特徴とす
る請求項７に記載の組換えベクター。 - （１２）ＨＢｓＡｇ粒子の本質的な形態学的特徴を有し
、Ｂ型肝炎ウィルスのゲノムのＳ領域に対応するアミノ
酸配列（Ｓ）及び任意に前記アミノ酸配列（Ｓ）の上流
のプレＳ領域に対応するアミノ酸配列の全部または一部
の本質的部分を粒子表面に露出して含む組換え粒子にお
いて、 前記組換え粒子が更に、ＨＩＶ族のレトロウィルスに対
する中和抗体を誘発するかまたはかかる抗体によって認
識され得る免疫原アミノ酸配列を含み、該配列自体が、
Ｂリンパ球によって認識され得る少なくとも１つのエピ
トープまたはＴリンパ球によって認識され得る少なくと
も１つのエピトープを含み、前記免疫原アミノ酸配列は
プレＳアミノ酸配列に挿入されるかまたはプレＳタンパ
ク質の全部または一部に置換していることを特徴とする
組換え粒子。 - （１３）免疫原アミノ酸配列が更に、ヒトＴ４リンパ球
のＣＤ４レセプターとの結合部位を含むことを特徴とす
る請求項１２に記載の組換え粒子。 - （１４）免疫原アミノ酸配列が、Ｂ型肝炎ウィルスのゲ
ノムのプレＳ２領域によってコードされるアミノ酸配列
に挿入されるか、またはプレＳ２アミノ酸配列の全部ま
たは一部に置換していることを特徴とする請求項１２ま
たは１３に記載の組換え粒子。 - （１５）プレＳ２アミノ酸配列が実質的に欠失している
ことを特徴とする請求項１２または１３に記載の組換え
粒子。 - （１６）ヒト病原性のＨＩＶレトロウィルスのクラスの
レトロウィルスに対する防御抗体の￥ｉｎ￥￥ｖｉｖｏ
￥産生を誘発し得る免疫原活性を有することを特徴とす
る請求項１２から１５のいずれか一項に記載の組換え粒
子。 - （１７）Ｂ型肝炎ウィルスに対する中和抗体の￥ｉｎ￥
￥ｖｉｖｏ￥産生を誘発する能力を実質的に喪失してい
ることを特徴とする請求項１２から１６のいずれか一項
に記載の組換え粒子。 - （１８）挿入された免疫原アミノ酸配列が以下の配列 【遺伝子配列があります】 〔Ｘ１、Ｚ１；Ｘ２、Ｚ２及びＸ３、Ｚ３の対は、ＣＯ
ＯＨもしくはＮＨ＿２基を示すか、または通常は上記配
列を含むレトロウィルスＳＩＶ、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−
１の糖タンパク質中で上記配列の対応中央部に正常に夫
々結合したアミノ酸配列を示す〕 から選択されていることを特徴とする請求項１２から１
７のいずれかに記載の組換え粒子。 - （１９）挿入された免疫原アミノ酸配列が以下の配列 【遺伝子配列があります】 から選択されていることを特徴とする請求項１２から１
８のいずれかに記載の組換え粒子。 - （２０）培養の際に請求項１２から１９のいずれか一項
の粒子を分泌し得るように、請求項１から１１のいずれ
かに記載の組換えベクターによって形質転換されている
ことを特徴とする真核細胞由来の細胞宿主。 - （２１）哺乳類細胞であることを特徴とする請求項２０
に記載の細胞宿主。 - （２２）酵母であることを特徴とする請求項２０に記載
の細胞宿主。 - （２３）以下のフラグメント 【遺伝子配列があります】 〔Ｘ１、Ｚ１；Ｘ２、Ｚ２及びＸ３、Ｚ３の対は、ＣＯ
ＯＨもしくはＮＨ＿２基を示すか、または通常は上記配
列を含むレトロウィルスＳＩＶ、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−
１の糖タンパク質中で上記配列の対応中央部に正常に夫
々結合したアミノ酸配列を示す〕 から選択されることを特徴とする免疫原アミノ酸フラグ
メント。 - （２４）以下の連鎖 【遺伝子配列があります】 の１つの全部または一部を含むことを特徴とする請求項
２３に記載のフラグメント。 - （２５）請求項２３または２４の免疫原アミノ酸配列の
１つをコードすることを特徴とする核酸。 - （２６）請求項１２から１９のいずれか一項の組換え粒
子から形成された活性成分を、薬剤として許容されるビ
ヒクルと共に含むことを特徴とするＨＩＶ族のレトロウ
ィルスの感染予防用ワクチン組成物。 - （２７）−任意に真核細胞宿主のポリメラーゼによつて
認識されるプロモーターのコントロール下に、ＨＩＶ族
のレトロウィルスに対する中和抗体を誘発するかまたは
かかる抗体によって認識され得、かつＢリンパ球によっ て認識され得る少なくとも１つのエピトープとＴリンパ
球によって認識され得る少なくとも１つのエピトープと
任意にレセプターＣＤ４へ結合部位とを有する免疫アミ
ノ酸配列をコードする外来ヌクレオチド配列と、Ｂ型肝
炎ウイルスのゲノムのＳ領域及び任意にプレＳ領域の全
部または一部に対応するヌクレオチド連鎖との￥ｉｎ￥
￥ｖｉｔｒｏ￥組換えを行ない、 −形成された上記成分含有の組換えベクターを回収する
段階を含むことを特徴とする組換えベクターの製造方法
。 - （２８）免疫原アミノ酸配列が、請求項１から１１のい
ずれか一項に定義したインサートに対応することを特徴
とする請求項２７に記載の方法。 - （２９）被験者から採取した生物媒体中の中和抗体の存
在を検出するＨＩＶレトロウィルス感染の診断用組成物
において、該組成物が、請求項１８または１９の組換え
粒子及び／または請求項２３または２４の免疫原フラグ
メントまたはかかる成分の混合物を含むことを特徴とす
る組成物。 - （３０）被験者から採取した生物媒体中の中和抗体の存
在を検出するＨＩＶ感染の￥ｉｎ￥￥ｖｉｔｒｏ￥診断
試験において、 −請求項２９の組成物と被検生物媒体とを適当な条件下
に接触させ、 −抗原−抗体複合体の形成を検出する段階を含むことを
特徴とする診断試験。 - （３１）−請求項１から１１のいずれか一項の組換えベ
クターによって所定の細胞宿主を形質転換し、−形質転
換した細胞宿主を適当な培地で培養し、−形成された組
換え粒子を回収することを特徴とする請求項１２から１
９のいずれかに記載の組換え粒子の産生方法。 - （３２）抗体、特にワクチン接種後の中和抗体を￥ｉｎ
￥￥ｖｉｔｒｏ￥検出するための免疫試験抗原としての
単独または混合物の形態の請求項２３または２４の免疫
原アミノ酸フラグメントの使用。 - （３３）生物媒体中のＨＩＶレトロウィルスに対する抗
体の存在を￥ｉｎ￥￥ｖｉｔｒｏ￥定量するため、特に
ワクチン接種後の中和抗体を定量するために、 −後で定量できるように標識した請求項２３または２４
の免疫原アミノ酸フラグメントと被検生物媒体とを反応
が生起する適当な条件下に接触させ、−媒体と反応した
前記フラグメントを定量する段階を含むことを特徴とす
る定量方法。 - （３４）生物媒体中の抗ＨＩＶ抗体、特にワクチン接種
後の中和抗体を￥ｉｎ￥￥ｖｉｔｒｏ￥診断するために
、−請求項２３または２４の免疫原アミノ酸フラグメン
トと、 −抗原−抗体反応の現出に適した手段とを含むことを特
徴とする診断用キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8810336A FR2635532B1 (fr) | 1988-07-29 | 1988-07-29 | Particules hbsag recombinantes hybrides : caracteristiques morphologiques de l'antigene hbsag contenant 1 sequence immunogene induisant des anticorps neutralisants diriges contre hiv ou susceptible d'etre reconnue par de tels anticorps; sequences nucleotidiques codant pour de telles particules; vaccins les contenant |
| FR8810336 | 1988-07-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02211881A true JPH02211881A (ja) | 1990-08-23 |
Family
ID=9368968
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1196422A Pending JPH02211881A (ja) | 1988-07-29 | 1989-07-28 | ＨＩＶに対する中和抗体を誘発するかまたはかかる抗体によって認識され得る免疫原配列を含むＨＢｓＡｇ抗原の形態学的特徴を有する組換えハイブリッドＨＢｓＡｇ粒子、かかる粒子をコードするヌクレオチド配列及び核粒子を含むワクチン |
Country Status (7)
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|---|---|
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| JP (1) | JPH02211881A (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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-
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- 1989-07-28 PT PT91316A patent/PT91316B/pt not_active IP Right Cessation
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| EP0354109B1 (fr) | 1996-04-17 |
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