CN102844044B - 氯毒素多肽和结合物及其应用 - Google Patents

Abstract

赖氨酸减少的氯毒素多肽，可以用来产生单一种类的氯毒素结合物。包含这样的氯毒素多肽的结合物及其药物组合物。使用这样的组合物和/或结合物的方法。

Description

氯毒素多肽和结合物及其应用

背景技术

氯毒素是来自蝎以色列金蝎（Leiurius quinquestriatus）的毒液的肽成分，其已表明可以特异性地结合于肿瘤细胞。氯毒素已用作靶向剂来将细胞毒性剂和/或成像剂递送到各种肿瘤，包括转移性瘤和脑瘤如恶性胶质瘤。例如，氯毒素已被结合于放射性同位素碘-131，并且这样的氯毒素结合物已表明是有效的抗肿瘤治疗剂。其它氯毒素结合物，包括融合蛋白，如连接于皂草素的氯毒素-GST融合蛋白也已表明，可以显著和选择性地杀伤肿瘤细胞。

发明内容

氯毒素可以潜在地结合于各种各样的任何制剂，包括细胞毒性剂和/或成像剂。虽然当前可用的氯毒素结合物已经证明具有抗肿瘤特性，但本发明包括确认：更多的氯毒素结合物可以提供许多优点。仅举一个例子，不同的氯毒素结合物可以具有它们自己的若干药物动力学特性，其可以特别适用于给定肿瘤类型和/或患者。另外，本发明确定了某些类型的氯毒素结合物的潜在问题的先前未记载的来源，其源于以下事实：野生型氯毒素多肽(和上述多肽的许多变体)包含超过一个的在此处可以发生结合（或共轭）的位点。因而本发明提供了以下见解：用来产生与氯毒素的结合物的化学反应经常产生结合物物质的混合物。至少在一些实施方式中，上述不同物质可以具有不同的特性。另外，重现用上述氯毒素结合物混合物获得的发现的努力可以受阻于以下挑战：在制备中再现不同物质的分布。质量控制、以及甚至分析可以是困难或不可能的。

本发明提供了新类型的氯毒素结合物，并确定了对于其它氯毒素结合物可能遇到的问题的来源。即，本发明认识到，许多先前的氯毒素结合物是通过将感兴趣的部分或实体化学结合于氯毒素多肽来制备。根据本发明，认识到，至少在一些情况下，上述方式产生结合物的混合群体，其中多个感兴趣的部分或实体在不同的点或位置结合于氯毒素。本发明包括以下确认：上述混合物可能难以表征和/或重现，并且可以显示不同的特性(例如，药物动力学特性)，这些差异可以是不可预测的。本发明包括以下确认：例如，在治疗和/或诊断应用中，可以更期望仅包含单一氯毒素结合物的制剂而不是包含结合物的混合物的制剂。

本发明还提供了对于已确定的问题来源的解决方案。例如，本发明提供了赖氨酸减少的氯毒素多肽，其可以产生单一种类的结合物。在某些实施方式中，提供了赖氨酸减少的氯毒素多肽。在多个方面，提供了氯毒素结合物，其包含具有不超过一个可用作结合位点的赖氨酸的氯毒素多肽(“单一赖氨酸氯毒素结合物”)，包含上述结合物的药物组合物，以及应用上述结合物的方法。在一些实施方式中，提供了没有赖氨酸残基的赖氨酸减少的氯毒素多肽。

在某些实施方式中，本发明提供了制备和应用赖氨酸减少的氯毒素多肽和其结合物的方法。在一些实施方式中，提供的赖氨酸减少的氯毒素多肽和/或其结合物可以用于医药(例如，在各种治疗和/或诊断背景中)。

定义

如在本文中所使用的，在提及数目时，术语“约”和“大约”，在本文中用来包括这样的数目，其是在任一方向(大于或小于)20%、10%、5%、或1%的范围内，除非另有说明或根据上下文明显的(除非这样数目将超过可能值的100%)。

如在本文中所使用的，术语“特征序列元件”或“序列元件”是指相邻氨基酸的一段序列，通常至少5个氨基酸，例如，至少5-50、5-25、5-15或5-10个氨基酸，其显示与另一个多肽至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。在一些实施方式中，特征序列元件参与或赋予多肽功能。在一些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽包含特征序列元件。在一些这样的实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽包含一个特征序列元件，为TTDHQMAR(SEQ ID NO:29)。

在本文中可互换使用术语“化疗剂”、“抗癌剂”和“抗癌药物”。它们是指药物，其用来治疗癌症或癌性病症。传统上将抗癌药物分类为：放射性同位素(例如，碘-131、镥-177、铼-188、钇-90)、毒素(例如，白喉、假单胞菌、蓖麻蛋白、白树素)、酶、用来激活药物的酶、辐射增敏药物、干扰RNA、超抗原、抗血管生成剂、烷化剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、植物生物碱、插入抗生素（intercalating antibiotics）、芳香酶抑制剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、生物反应调节剂、抗激素、和抗雄激素药。上述抗癌剂的实例包括但不限于BCNU、顺铂、吉西他滨、羟基脲、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱、丙卡巴肼、氨烯咪胺、六甲蜜胺、甲氨蝶呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨、喷司他丁、阿糖胞苷、阿扎胞苷、依托泊苷、替尼泊苷、伊立替康多西他赛、多柔比星、柔红霉素、放线菌素D、伊达比星、普卡霉素、丝裂霉素、博来霉素、他莫昔芬、氟他胺、亮丙立德、戈舍瑞林、氨鲁米特、阿那曲唑、安吖啶、天冬酰胺酶、米托蒽醌、米托坦和氨磷汀。

如在本文中所使用的，术语“氯毒素”是指长度为36个氨基酸并且具有氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的肽。如在本文中所使用的，术语“氯毒素”包括分离自蝎Leiuriusquinquestriatusr或其它生物体（其中可以发现氯毒素）的毒液的氯毒素、以及重组和合成的氯毒素。

如在本文中所使用的，词组“氯毒素结合物”是指共价键结合感兴趣的一个或多个实体或部分的氯毒素多肽。在一些实施方式中，感兴趣的实体不是多肽，和/或并不连接在多肽链内。在一些实施方式中，感兴趣的实体连接于氨基酸侧链。在一些实施方式中，经由赖氨酸残基，感兴趣的实体连接于氯毒素多肽。

如在本文中所使用的，词组“氯毒素多肽”是指多肽，其显示与氯毒素(SEQ ID NO:1)至少45%的整体序列同一性（overall sequence identity），并具有24至40个氨基酸的长度。在一些实施方式中，氯毒素多肽与SEQ ID NO:1具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的整体序列同一性。在一些实施方式中，氯毒素多肽与SEQ ID NO:1具有至少65%的整体序列同一性。在一些实施方式中，氯毒素多肽与SEQ ID NO:1具有至少91%的整体序列同一性。在一些实施方式中，氯毒素多肽与SEQ ID NO:1具有至少94%的整体序列同一性。在一些实施方式中，氯毒素多肽与SEQ ID NO:1具有至少97%的整体序列同一性。在一些实施方式中，氯毒素多肽进一步与SEQ ID NO:1共享至少一个特征序列元件。在一些实施方式中，特征序列元件是TTDHQMAR(SEQ ID NO:29)。在一些实施方式中，氯毒素多肽具有24至40个氨基酸的长度。在一些实施方式中，“氯毒素多肽”包括一个或多个另外的氨基酸序列段（stretch），通常在C端和/或N端，和/或作为插入在序列内的不连续的区组（block）。通常，上述另外的序列段的长度为约3至约1000个氨基酸。在一些实施方式中，另外的序列段的长度为约3-100、3-90、3-80、3-70、3-60、3-50、3-40、3-30或3-20个氨基酸。在一些实施方式中，另外的序列段的长度为约或小于20个氨基酸、约或小于15个氨基酸、或约或小于10个氨基酸。在一些实施方式中，另外的序列段包含一个或多个已知标记。在一些实施方式中，另外的序列段包含细胞毒性剂。

如在本文中所使用的，词组“联合治疗”是指将两种或更多种活性剂给予相同主体，以致主体同时暴露于两种制剂。本领域技术人员将明了，可以期望地以单剂量、或以多剂量，例如相隔预定间隔，或预定模式，来给予任何单种制剂。联合治疗并不需要同时给予两种或更多种活性剂的各自剂量，只要接收剂量的主体同时暴露于两种制剂。联合治疗也不需要通过相同途径来给予两种或更多种活性剂。在一些实施方式中，与单独给予时的剂量或频率相比，以降低的剂量和/或频率，给予在联合治疗中给予的至少两种活性剂的一种或两种。

当用来描述在氨基酸或核苷酸序列内的位置或部位（位点）时，在本文中，如在本领域中所理解的那样来使用词组“对应于”。如本领域中众所周知的，可以利用标准的生物信息学工具，包括程序如BLAST、ClustalX、Sequencher等，来对比两个或更多氨基酸或核苷酸序列。即使两个或更多序列不能完全匹配和/或并不具有相同长度，但仍然可以进行序列对比，并且，如果需要的话，可以产生“共有”序列。确实，用于序列对比的程序和算法通常容忍可限定水平的差异，包括插入、缺失、倒位、多态性、点突变等。这样的序列对比可以有助于确定在一个核苷酸序列中的哪些位置对应于在其它核苷酸序列中的哪些位置。

如在本文中所使用的，词组“给药方案”是指多个单位剂量(通常大于一种)的组合，单位剂量相隔一段时间单独给予。用于特定药剂或组合物的推荐的一组剂量(即，量、定时、给予途径等)构成其给药方案。

如在本文中所使用的，术语“有效量”和“有效剂量”是指任何量或剂量的化合物或组合物，其足以以可接受的效益/风险比来实现其预期目的，即，在组织或主体中所期望的生物或药物反应。例如，在本发明的某些实施方式中，目的可以是：抑制血管生成，引起新生血管的消退，干扰另一种生物活性分子的活性，引起肿瘤的消退，抑制转移，降低转移的程度等。有关预期目的可以是客观的(即，可以通过某个测试或标记加以测量)或主观的(即，主体（受试者）产生一个指征或感到效果)。通常以可以包括多个单位剂量的给药方案来给予治疗有效量。对于任何特定药剂，治疗有效量(和/或在有效给药方案中的适当的单位剂量)可能会有所不同，例如，取决于给予途径，取决于和其它药剂的组合。在一些实施方式中，用于任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)可以取决于各种因素，包括：待治疗的障碍和障碍的严重性；所采用的具体药剂的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体药剂的给予时间、给予途径、和/或排泄或代谢的速率；治疗的持续时间；和如在医疗领域中众所周知的类似因素。

如在本文中所使用的，在本文中可互换使用术语“荧光团”、“荧光部分”、“荧光标记”、“荧光染料”和“荧光标记部分”。它们是指在溶液中并在用适当波长的光激发以后，发射光的分子。各种各样的结构和特性的许多荧光染料适用于本发明的实施。类似地，用于荧光标记核酸的方法和材料是已知的(参见，例如，R.P.Haugland,“Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992-1994”,5^th Ed.,a1994,Molecular Probes,Inc.)。在选择荧光团时，往往可取的是，荧光分子高效率地吸收光和发射荧光(即，分别高摩尔吸光系数和荧光量子产率)并且是不感光的(即，在光激发以后，在进行分析所需的时间内，它并不经历显著降解)。

如在本文中所使用的，术语“抑制”是指防止某事发生、拖延某事发生、和/或降低某事发生的程度或可能性。因此，“抑制血管生成”和“抑制新生血管的形成”用来包括预防、延迟、和/或降低发生血管生成的可能性以及降低新血管的数目、生长速率、大小等。

在本文中，术语“标记的”和“用可检测剂或部分标记的”可互换地用来指明，可以可视化一种实体(例如，赖氨酸减少的氯毒素多肽或氯毒素结合物)，例如在结合于另一种实体(例如，新生肿瘤组织)以后。可以选择可检测剂或部分，以致它产生信号，其可以加以测量并且其强度与结合实体的量有关(例如，正比)。用于标记和/或检测蛋白质和肽的各种各样的系统在本领域中是已知的。可以通过掺入标记、或结合于标记来制备标记蛋白和肽，其中上述标记可以通过光谱方式、光化学方式、生化方式、免疫化学方式、电子方式、光学方式、化学方式或其它方式来检测。标记或标记部分可以是直接可检测的(即，它并不需要任何进一步的反应或操作以成为可检测的，例如，荧光团是直接可检测的)，或它可以是间接可检测的(即，通过反应或结合于可检测的另一种实体，其是可检测的，例如，半抗原在与适当的包含报道子如荧光团的抗体反应以后，通过免疫染色是可检测的)。适宜的可检测剂包括但不限于放射性核素、荧光团、化学发光剂、微颗粒、酶、比色标记、磁性标记、半抗原、分子标灯、适体标灯等。

如在本文中所使用的，术语“黄斑变性”是指这样的病况，其导致在视野中心(斑)视力的丧失，这是由于对视网膜的损害。已知存在若干形式的黄斑变性，并且除另有指明，术语“黄斑变性”包括所有形式。“湿性黄斑变性”(还称作新生血管性或渗出性形式)是指这样的黄斑变性，其涉及来自在视网膜后面的脉络膜的血管生长。在湿性黄斑变性中，视网膜有时可以脱离。在“干性黄斑变性”(还称作非渗出性形式)中，称作玻璃疣的细胞碎片累积在视网膜和脉络膜之间，但没有发生血管形成。“年龄相关性黄斑变性”(ARMD)是指黄斑变性的最常见形式，其通常在生命后期开始于在斑中的典型的黄色沉积物。可以以黄斑变性的湿性或干性形式来发生ARMD。

如在本文中所使用的，术语“转移”是指肿瘤细胞从一个器官或组织扩散到另一个位置。该术语还指肿瘤组织，由于转移的结果，其形成在新的位置。“转移性癌症”是扩散自它的最初、或初始位置的癌症，并且还可以称作“继发性癌症”或“继发性肿瘤”。通常，转移性肿瘤是以它们源自的原发性肿瘤的组织来命名。因此，已转移到肺的乳癌还可以被称作“转移性乳癌”，即使一些癌细胞位于肺中。

如在本文中所使用的，词组“单一赖氨酸氯毒素多肽”是指一种氯毒素多肽，其仅具有一个赖氨酸残基可用作结合位点（或结合部位）。在一些实施方式中，单一赖氨酸氯毒素多肽仅具有一个赖氨酸残基。在一些实施方式中，单一赖氨酸氯毒素多肽具有超过一个的赖氨酸残基，但仅其中一个赖氨酸残基可用作用于结合的部位。在一些这样的实施方式中，在一些赖氨酸上的一个或多个阻挡基团使它们不能用作用于结合的部位。

如在本文中所使用的，术语“新生血管”是指新形成的尚未完全成熟的血管，即，并不具有完全形成的具有紧密的细胞连接的内皮衬里或围绕平滑肌细胞的完全层。如在本文中所使用的，术语“新血管”用来指在新生血管中的血管。

在本文中，可互换使用术语“药剂”、“治疗剂”和“药物”。它们是指可有效地治疗、抑制、和/或检测疾病、障碍、或临床状况的物质、分子、化合物、制剂、因子或组合物。

在本文中，“药物组合物”定义为组合物，其包含有效量的至少一种活性组分(例如，可以或不能加以标记的赖氨酸减少的氯毒素多肽或氯毒素结合物)、和至少一种药用载体。

如在本文中所使用的，当在与过程有关的一种或多种症状或特征的发展以前给予制剂(例如，治疗剂如氯毒素结合物)时，当用来指制剂对过程(例如，血管生成、转移、癌症进展等)的作用时，术语“预防”是指降低上述过程的程度和/或延迟上述过程的发作。

如在本文中所使用的，术语“原发性肿瘤”是指这样的肿瘤，其是在肿瘤首次出现的原始部位，即，相对于已扩散的肿瘤。

术语“前药”是指化合物，在体内给予以后，其被代谢或以其它方式转化成化合物的生物、医药或治疗上的活性形式。可以设计前药以改变化合物的代谢稳定性或转运特性，掩蔽副作用或毒性，改善化合物的香味，和/或改变化合物的其它特性或性能。借助于体内药效学过程和药物代谢的知识，在确定了药物活性化合物以后，制药领域的技术人员通常可以设计化合物的前药(Nogrady,“Medicinal Chemistry A Biochemical Approach”,1985,Oxford University Press:N.Y.,pages 388-392)。用于选择和制备适宜前药的程序在本领域中也是已知的。在一些实施方式中，前药是一种化合物，其到它的活性形式的转化(在体内给予以后)涉及酶催化。

术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用，并且是指各种长度的氨基酸序列，处于它们的中性(不带电荷)形式或作为盐，未修饰的或通过糖基化、侧链氧化、或磷酸化加以修饰的。在某些实施方式中，氨基酸序列是全长天然蛋白质。在其它实施方式中，氨基酸序列是全长蛋白质的较小片段。在另外的实施方式中，通过连接于氨基酸侧链的另外的取代基，如糖基单位、脂质，或无机离子如磷酸盐，以及与链的化学转化有关的修饰，如硫氢基的氧化，来修饰氨基酸序列。因而，术语“蛋白质”(或它的等效术语)用来包括全长天然蛋白质的氨基酸序列，其受到那些并不改变其特定性能的修饰。尤其是，术语“蛋白质”包括蛋白质同种型（isoform），即，由相同基因编码的变体，但其差异在于它们的pI或MW、或两者。上述同种型可以在它们的氨基酸序列上有差异(例如，由于可变剪接或有限的蛋白水解)，或可替换地，可以产生自有差别的翻译后修饰(例如，糖基化、酰化或磷酸化)。

如在本文中所使用的，词组“赖氨酸减少的氯毒素多肽”是指具有比氯毒素(SEQID NO:1)更少的赖氨酸残基和/或具有比氯毒素更少的可用作结合部位（site，位点）的赖氨酸残基的氯毒素多肽。在某些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽具有不超过一个赖氨酸残基。在一些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽仅具有一个赖氨酸残基。在某些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽具有不超过一个赖氨酸残基可用作用于结合的部位。在一些实施方式中，在赖氨酸减少的氯毒素多肽中，除一个赖氨酸残基以外，所有其它赖氨酸残基已被修饰，以致它们不可用作用于结合的部位。在一些实施方式中，在赖氨酸减少的氯毒素多肽中的所有赖氨酸残基已被修饰，以致它们不可用作用于结合的部位。在一些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽包含可用于结合的单个部位。

当用来指血管和/或脉管系统(包括新生血管和/或新血管)时，术语“消退（regress）”在本文中用来指退缩、收缩等。

术语“主体”和“个体”在本文中可互换使用。它们是指人或另一种哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类)，其可以患有或易受疾病或障碍(例如，癌症、黄斑变性等)，但可以或可以不患有疾病或障碍。在许多实施方式中，主体是人。在许多实施方式中，主体是患者。除非另有说明，术语“个体”和“主体”并不指明特定年龄，因而包括成年人、儿童、和新生儿。

如在本文中所使用的，术语“易感的”是指对于某事，即，疾病、障碍、或病症(如，例如，癌症、转移性癌症、黄斑变性、类风湿性关节炎等)，和在一般群体中所观测到的相比，具有增加的风险和/或倾向(通常基于遗传倾向性、环境因素、个人史、或它们的组合)。该术语考虑到，对于病症“易感的”个体可以从没有被确诊为患有病症。

如在本文中所使用的，术语“全身给予”是指给予制剂，以致制剂变得以显著量广泛分布于体中并在血液中具有生物效应，例如，它的预期的效果，和/或经由血管系统达到它的所期望的作用部位。典型的全身给予途径包括通过(1)将制剂直接引入血管系统或(2)口服、肺途径、或肌内途径来给予制剂，进入血管系统，然后经由血液被携带到一个或多个所期望的作用部位。

如在本文中所使用的，术语“治疗”是指部分或完全地减轻、改善、缓解特定疾病、障碍、和/或病症的一种或多种症状或特点，延迟它们的发作，抑制它们的进展，降低它们的严重性，和/或降低它们的发生率。例如，“治疗”癌症可以是指抑制肿瘤细胞的存活、生长、和/或扩散，预防、延迟、和/或降低发生转移和/或复发的可能性，和/或降低转移灶的数目、生长速率、大小等。可以对并不呈现疾病、障碍、和/或病症的体征的主体和/或对仅呈现疾病、障碍、和/或病症的早期体征的主体给予治疗，以降低发展与疾病、障碍、和/或病症有关的病理特征的风险。在一些实施方式中，治疗包括将药物组合物递送给主体。

如在本文中所使用的，词组“单位剂量”是指离散量的药物组合物，其包含预定量的活性组分(例如，治疗剂)。活性组分的量通常等于将给予主体的活性组分的剂量和/或上述剂量的适宜份数如，例如，上述剂量的一半或三分之一。

具体实施方式

I.赖氨酸减少的氯毒素多肽

如表1所示和如SEQ ID NO:1中所列，氯毒素是36个氨基酸肽，其在SEQ ID NO:1的位置15、23、和27具有三个赖氨酸残基。在某些实施方式中，本发明提供了氯毒素多肽，其具有数目减少的赖氨酸残基(“赖氨酸减少的氯毒素多肽”)。在某些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽具有对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中赖氨酸减少的氯毒素多肽具有与SEQ ID NO:1的至少45%的整体序列同一性（overall sequence identity）以及24至40个氨基酸残基的长度。在一些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽与SEQ ID NO:1具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的整体序列同一性。在一些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽与SEQ ID NO:1具有至少65%的整体序列同一性。在一些实施方式中，氯毒素多肽与SEQ IDNO:1具有至少91%的整体序列同一性。例如，在36个氨基酸残基中的33个处，赖氨酸减少的氯毒素多肽的氨基酸序列可以与氯毒素相同(即，~91.7%序列同一性)。在一些实施方式中，氯毒素多肽与SEQ ID NO:1具有至少94%的整体序列同一性。例如，在氨基酸序列方面，在36个氨基酸残基的34个处，赖氨酸减少的氯毒素多肽可以与氯毒素相同(即，~94.4%序列同一性)。在一些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽与SEQ ID NO:1具有至少97%的整体序列同一性。例如，在氨基酸序列方面，在36个氨基酸残基的35个处，赖氨酸减少的氯毒素多肽可以与氯毒素相同(即，~97.2%序列同一性)。在一些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽是和/或包含33、34、35、36、37、或38个氨基酸的一段序列，该序列对应于氯毒素的序列或显示与氯毒素的序列至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的整体序列同一性。

表1示出氯毒素的序列和典型的赖氨酸减少的氯毒素多肽的序列。表1并不是用来限制而是用来说明由本发明提供的某些典型的赖氨酸减少的氯毒素多肽。

表1：氯毒素和典型的赖氨酸减少的氯毒素多肽的序列

在某些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽具有不超过一个赖氨酸可用作用于结合的部位。在一些这样的实施方式中，一个赖氨酸是可用的并且它是在氯毒素多肽内的位置，其对应于在氯毒素中存在赖氨酸的位置(即，SEQ ID NO:1的位置15、23或27)。在一些实施方式中，可用的单一赖氨酸是在SEQ ID NO:1的位置15。在一些实施方式中，可用的单一赖氨酸是在SEQ ID NO:1的位置23。在一些实施方式中，可用的单一赖氨酸是在SEQ IDNO:1的位置27。在一些实施方式中，单一赖氨酸存在于本发明的赖氨酸减少的氯毒素多肽中，其位置对应于氯毒素中并不包含赖氨酸残基的部位(即，并不在对应于SEQ ID NO:1的位置15、23或27任一位置的位置)。

在某些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽缺少对应于SEQ ID NO:1的位置15、23、或27的至少一个氨基酸残基。

在某些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽完全缺少赖氨酸残基。(参见，例如，SEQ ID NO:2、5、6、24、25和26)。在一些实施方式中，在氯毒素中的通常发现赖氨酸残基处氨基酸丢失。在一些实施方式中，另一个氨基酸残基和/或氨基酸衍生物替代通常在氯毒素中发现的一个或多个赖氨酸残基。换句话说，在多肽中，对应于SEQ ID NO:1的位置15、23或27的至少一个氨基酸残基不是赖氨酸。除多肽通常包括的19种其它天然存在的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、和缬氨酸)以外，还可以使用各种取代物。取代物的非限制性实例包括其它天然存在的氨基酸、非天然存在的氨基酸如D-氨基酸，和氨基酸衍生物。其它天然存在的氨基酸的非限制性实例包括β-丙氨酸、肉碱、瓜氨酸、胱氨酸、γ-氨基丁酸、羟脯氨酸、鸟氨酸、和牛磺酸。(对于天然存在的氨基酸和氨基酸衍生物的另外的实例，参见，例如，Wagner and Musso(1983),“NewNaturally Occuring Amino Acids,”Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,22:816-828，其全部内容以引用方式结合于本文。)在一些实施方式中，精氨酸和/或丙氨酸替代一个或多个赖氨酸残基。

在一些实施方式中，其中赖氨酸减少的氯毒素多肽完全缺少赖氨酸残基，赖氨酸减少的氯毒素多肽的一个末端或两个末端(即，N端和/或C端)可以用作用于化学结合的部位。末端的可用性可以取决于所采用的特定的结合化学性能，在一些实施方式中，其中赖氨酸减少的氯毒素多肽完全缺少赖氨酸残基，仅在N端的α氨基可用作结合位点。

在超过一个的赖氨酸残基被替代的实施方式中，相同或不同的氨基酸残基或氨基酸衍生物可以用来替代赖氨酸残基。相同氨基酸残基已用来替代赖氨酸残基的非限制性实例，参见，例如，SEQ ID NO:17-22，以及不同的氨基酸残基已用来替代赖氨酸残基的非限制性实例，参见，例如，SEQ ID NO:23。

在一些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽在序列中仅具有一个赖氨酸(“单一赖氨酸氯毒素多肽”)。在一些实施方式中，这样的氯毒素多肽具有赖氨酸残基，其在赖氨酸残基通常存在于氯毒素中的位置，例如，在对应于SEQ ID NO:1的位置15、23、或27的位置处(关于非限制性实例，参见，例如，SEQ ID NO:14-23)。在一些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽在赖氨酸残基通常存在于氯毒素中(即，SEQ ID NO:1的位置15、23、和27)位置处并不具有任何赖氨酸残基，但在并不对应于SEQ ID NO:1的任何位置15、23、和27的位置处具有赖氨酸残基。如同根本没有赖氨酸的氯毒素多肽，单一赖氨酸氯毒素多肽可以在对应于SEQ ID NO:1的位置15、23和27的一个或多个位置处丢失氨基酸，和/或在对应于SEQ IDNO:1的位置15、23和27的一个或多个位置处可以具有氨基酸或氨基酸衍生物取代。

在一些实施方式中，提供的赖氨酸减少的氯毒素多肽具有包括一个或超过一个以上的赖氨酸残基的氨基酸序列，然而，当和氯毒素比较时，具有数目减少的可用于结合的赖氨酸。在一些实施方式中，在本文提供的赖氨酸减少的氯毒素多肽中的一个或多个赖氨酸残基变得不可用作结合位点，虽然它们存在于氯毒素多肽中。例如，可以共价或非共价修饰一个或多个赖氨酸残基，以致一个或多个赖氨酸残基被阻止参与化学结合反应，从而留下比3、2或1更少的(即，”减少的”赖氨酸)赖氨酸残基可用作结合位点。在这种方式中可以采用的对赖氨酸残基的共价修饰的非限制性实例包括聚乙二醇化(即，通过连接聚乙二醇聚合物进行的修饰)、甲基化(包括二和三甲基化)、和其它烷基的连接。在某些实施方式中，可以在εNH₂基团处，修饰一个或多个赖氨酸残基。例如，如果给定的R基团(例如，丁基、丙基、或乙基)用来共价修饰赖氨酸残基，那么εNH₂基团可以被修饰为NR₂或NR₃基团。

表2列出可以用来产生赖氨酸减少的氯毒素多肽的修饰方案的一些非限制性实例。

表2：典型的修饰方案

在某些实施方式中，在赖氨酸减少的氯毒素多肽的合成过程中，在适当的步骤期间，通过结合入修饰赖氨酸(其中已经封闭可结合位点)来封闭特定的赖氨酸残基。修饰赖氨酸可容易地在商业上获得并且可以通过本领域已知的常规方法来合成。在这种方式中可以使用的修饰赖氨酸的非限制性实例包括但不限于二取代的赖氨酸或三取代的赖氨酸(例如，N,N-R₂-赖氨酸或N,N,N-R₃-赖氨酸，其中R是阻挡基团)和具有连接于它们的短PEG分子的赖氨酸。R可以是任何基团，当共价连接于赖氨酸时，其将用于阻止赖氨酸残基参与化学结合（或共轭）反应。例如，烷基(例如，丁基、甲基、和乙基)可以用作阻挡基团。例如，在合成期间，使用了N,N-二甲基-赖氨酸和/或N,N,N-三甲基-赖氨酸。

在某些实施方式中，封闭赖氨酸减少的氯毒素多肽的一个末端或两个末端(即，N端和/或C端)，以防止末端参与化学结合（或共轭）反应。例如，在一些实施方式中，使用了结合化学性能，其中至少一个末端（如果它未被封闭）将参与结合反应。用于封闭多肽的N端和/或C端的各种方法在本领域中是已知的，包括但不限于，通过在胺处添加烷基的共价修饰(例如，甲基化)。

用于合成赖氨酸减少的氯毒素多肽（如本文描述的）的方法在本领域中是已知的。在一些肽合成方法中，一个氨基酸(或氨基酸衍生物)的氨基连接于另一个氨基酸(或氨基酸衍生物)的羧基，该羧基通过它和试剂如二环己基碳二亚胺(DCC)的反应来活化。当自由氨基和活化羧基起化学反应时，会形成肽键并释放二环己基脲。在这样的方法中，可以封闭(“保护”)其它潜在活性基团(如N端氨基酸或氨基酸衍生物的α-氨基和C端氨基酸或氨基酸衍生物的羧基)，以使其避免参与化学反应。因而，仅特定的活性基团进行反应，以致形成所期望的产物。可用于此目的阻挡基团包括但不限于用来保护胺基团的叔丁氧羰基(t-Boc)和苯甲酰氧基羰基；以及用来保护羧基的简单酯(如甲基和乙基)和苄酯。通常可以借助于留下完好的肽键的处理(例如，用稀酸进行的处理)来随后除去阻挡基团。可以重复保护反应基团（其不应反应）、耦合以形成肽键、和对反应基团进行去保护的过程。可以通过将氨基酸依次加入一个生长的肽链来合成肽。按照本发明，液相和固相肽合成方法均是适用的。在固相肽合成方法中，通常通过将C端氨基酸连接于基质来将生长肽链连接于不溶性基质(如，例如，聚苯乙烯珠)。在合成结束时，可以利用并不破坏肽键的剪切试剂，如氢氟酸(HF)来从基质释放肽。此时，还通常除去保护基团。按照本发明，还可以使用自动化的、高通量、和/或平行肽合成方法。关于肽合成方法的更多信息，参见，例如，Merrifield (1969)“Solid-phase peptide synthesis,”Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol.,32:221-96；Fridkin et al.(1974)Annu Rev Biochem.,43(0):419-43；Merrifield(1997)“Conceptand Early Development of Solid Phase Peptide Synthesis,”Methods inEnzymology，289:3-13；Sabatino et al.(2009)“Advances in automatic,manual andmicrowave-assisted solid-phase peptide synthesis,”Curr Opin Drug DiscovDevel.,11(6):762-70，上述各自的全部内容以引用方式结合于本文。

在一些实施方式中，连同如本文描述的(例如，用另一个氨基酸或氨基酸衍生物来替代赖氨酸残基和/或在氯毒素中正常发现赖氨酸残基处缺少赖氨酸残基)其它方式一起来修饰赖氨酸残基。

在一些实施方式中，在合成结束时，并没有除去在N端的保护基团。留下保护基团可以，例如，用来产生具有封闭N端的赖氨酸减少的氯毒素多肽，从而在特定化学结合（或共轭）方案中限制可用于结合（或共轭）的位点（或部位）。

II.氯毒素结合物

在某些实施方式中，提供了氯毒素结合物，其包含与一个或多个实体或部分结合的赖氨酸减少的氯毒素多肽。本发明的氯毒素结合物可以包括任何长度的多肽，其包含如本文描述的赖氨酸减少的氯毒素多肽。

A.结合（conjugation）

在一些实施方式中，经由赖氨酸残基和/或经由赖氨酸减少的氯毒素多肽的末端，一个或多个实体或部分与赖氨酸减少的氯毒素多肽结合。在一些这样的实施方式中，实体或部分可以连接于赖氨酸减少的氯毒素多肽的位置受限于可用作结合部位的赖氨酸残基的数目。例如，在单一赖氨酸氯毒素多肽中的单个可用的赖氨酸残基处可以连接实体或部分。

在一些实施方式中，在赖氨酸减少的氯毒素多肽的N端或C端结合实体或部分。在一些这样的实施方式中，在氯毒素内的任何“天然”位置(例如，对应于位置15、23和27的位置)，赖氨酸减少的氯毒素多肽并不具有可用于结合的任何赖氨酸残基。

在一些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽共价结合一个或多个实体或部分。如本领域技术人员将明了的，可以直接或间接地(例如，通过接头)连接赖氨酸减少的氯毒素多肽和一个或多个实体和/或部分。

各种结合（或共轭）化学性能在本领域中是已知的并且可以用于本发明的实施。在某些实施方式中，一个或多个实体或部分连接于赖氨酸残基的氨基。在一些实施方式中，结合化学性能是基于NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)/EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)化学性能。在一些实施方式中，结合（或共轭）化学性能是基于硫醇化化学性能，即，利用硫醇化剂如Traut试剂和/或2-亚氨基硫烷（2-Iminothiolane）。

在某些实施方式中，直接共价地连接赖氨酸减少的氯毒素多肽和一个或多个实体或部分。可以通过各种方式的任何一种，例如，经由酰胺键、酯键、碳-碳键、二硫键、氨基甲酸酯键、醚键、硫醚键、脲键、胺键、或碳酸酯键，来实现上述直接共价结合。可以例如，通过利用在实体或部分上和/或在赖氨酸减少的氯毒素多肽上存在的官能团实现上述共价结合。可以使用的适宜的官能团包括但不限于胺、酐、羟基、羧基、硫醇等。在某些实施方式中，活化未来结合物的一部分的官能团，用于耦合于未来结合物的其它部分。例如，活化剂，如碳二亚胺，可以用来实现这样的耦合。各种各样的活化剂在本领域中是已知的并且适用于形成预备的结合物。

在一些实施方式中，经由接头基团，彼此间接共价连接赖氨酸减少的氯毒素多肽和一个或多个实体或部分。可以通过利用在本领域中众所周知的若干稳定的双官能剂的任何一种，包括均官能剂和杂官能剂，来实现上述间接共价键。关于上述制剂的非限制性实例，参见，例如，Pierce Catalog and Handbook。双官能剂的应用不同于活化剂的应用：前者导致连接部分存在于获得的结合物中，而后者导致在反应中所涉及的两个部分之间的直接耦合。双官能剂的作用可以是便于在两个否则惰性部分之间的反应。可替换地或另外，可以选择双官能剂，其变成反应产物的一部分，以致它将一定程度的构象灵活性赋予结合物。例如，双官能剂可以包含含有若干原子的直烷基链，例如，2至10个碳原子。可替换地或另外，可以选择双官能剂，以致在赖氨酸减少的氯毒素多肽和一个或多个实体或部分之间形成的键是可切割的，例如，可水解的。(关于上述接头的非限制性实例，参见，例如，美国专利号5,773,001、5,739,116和5,877,296，其各自的内容以引用方式结合于本文)。当结合于赖氨酸减少的氯毒素多肽的实体或部分是治疗部分（观测到其从赖氨酸减少的氯毒素多肽水解后具有更高活性）时，可以，例如，使用这样的接头。用来实现切割的典型的机制包括在溶酶体(腙、缩醛、和顺乌头酸样酰胺)的酸性pH值中的水解，通过溶酶体酶(例如，组织蛋白酶和其它溶酶体酶)的肽切割，以及二硫化物的还原。另外的切割机制包括在细胞外或细胞内生理pH值下的水解。当用来将一个或多个实体或部分连接于赖氨酸减少的氯毒素多肽的交联剂是可生物降解/可生物蚀解实体如葡聚糖（polydextran）等时，可以应用这种机制。

例如，对于包含一个或多个治疗部分的结合物，可以使含腙结合物具有引入的羰基，其可以提供所期望的药物释放性能。还可以使结合物具有接头，该接头包括具有在一端的二硫基和在另一端的肼衍生物的烷基链。

还有可能在溶酶体的酸性环境中切割包含不同于腙的官能团的接头。例如，可以用硫醇反应接头来制备结合物，上述硫醇反应接头包含不同于腙的细胞内可切割的基团，如酯、酰胺、和缩醛/缩酮。还可以使用制备自5至7元环酮的缩酮，其中上述5至7元环酮具有一个氧原子连接于实体或部分以及另一个氧原子连接于接头，用于连接于赖氨酸减少的氯毒素多肽。

pH值敏感类接头的另外的实例是顺乌头酸（cis-aconitate），其具有并列于酰胺基团的羧酸基团。羧酸会加速在酸性溶酶体中的酰胺水解。还可以使用这样的接头，其可以借助于若干其它类型的结构实现类似类型的水解速率加速。

借助于溶酶体酶的肽的酶水解还可以用来从结合物释放实体或部分。例如，可以经由酰胺键，将赖氨酸减少的氯毒素多肽连接于对氨基苄醇，然后在苄醇和实体或部分之间可以形成氨基甲酸酯或碳酸酯。赖氨酸减少的氯毒素多肽的切割导致氨基苄基氨基甲酸酯或碳酸酯的瓦解，以及实体或部分的释放。作为另外的实例，可以通过接头而不是氨基甲酸酯的瓦解来切割苯酚。作为又一实例，二硫反应用来引发对巯基苄基氨基甲酸酯或碳酸酯的瓦解。

许多治疗部分，尤其是抗癌剂，在水中具有很小的（如果有的话）溶解度，其会限制在结合物上的药物负荷（由于治疗部分的聚集）。用来克服上述问题的一种方式是将增溶基团加入接头。可以使用借助于由PEG(聚乙二醇)和二肽构成的接头制备的结合物，包括，例如，那些具有PEG二酸硫羟酸、或连接于赖氨酸减少的氯毒素结合物的马来酰亚胺酸、二肽间隔子，和结合于实体或部分的酰胺的结合物。结合PEG基团的方式可以有利于克服药物负荷的聚集和限制。

在其中在氯毒素结合物内的实体或部分是蛋白质、多肽、或肽的实施方式中，氯毒素结合物可以是融合蛋白。融合蛋白是一种分子，其包含通过共价键并经由它们的单独肽主链加以连接的两种或更多种蛋白质、多肽、或肽。可以本领域已知的任何适宜方法来产生在本发明的方法中所使用的融合蛋白。例如，它们可以通过直接蛋白质合成方法并利用多肽合成仪来产生。可替换地，可以利用锚定引物来进行基因片段的PCR扩增，其中锚定引物导致在两个连续基因片段之间的互补突出端，上述连续基因片段可以随后被退火和再扩增以产生嵌合基因序列。可以通过标准的重组方法来获得融合蛋白(参见，例如，Maniatis etal.“Molecular Cloning：A Laboratory Manual,”2^nd Ed.,1989,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring,N.Y.，其全部内容以引用方式结合于本文)。这些方法通常包括(1)构造编码所期望的融合蛋白的核酸分子；(2)将核酸分子插入重组表达载体；(3)用适宜的宿主细胞来转化表达载体；以及(4)在宿主细胞中表达融合蛋白。如在本领域中已知的，可以直接从培养基或通过细胞的溶解，来回收和分离通过上述方法产生的融合蛋白。用于纯化由转化宿主细胞产生的蛋白质的许多方法在本领域中是众所周知的。这些方法包括但不限于沉淀、离心、凝胶过滤、和柱层析(例如，离子交换、反相、和亲和柱层析)。已描述了其它纯化方法(参见，例如，Deutscher et al.“Guide to Protein Purification”inMethods in Enzymology,1990,vol.192,Academic Press，其全部内容以引用方式结合于本文)。

在某些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽是非共价结合于一个或多个实体或部分。非共价结合的实例包括但不限于疏水相互作用、静电相互作用、偶极相互作用、范德华相互作用、和氢键合。

不管在毒素部分和治疗剂之间的结合的特性，结合通常是选择性的、特异性的、并足够强，以致在转运到和进入细胞以前或期间，结合物并不解离。可以利用本领域技术人员已知的任何化学、生化、酶、或基因连接，来实现在赖氨酸减少的氯毒素多肽和一个或多个实体或部分之间的结合。

如本领域技术人员可以容易明了的，本发明的结合物可以包含任何数目的赖氨酸减少的氯毒素多肽和任何数目的实体或部分（通过任何数目的不同方式，彼此结合）。它的预期目的和在特定的应用范围中所期望的性能将影响结合物的设计。将赖氨酸减少的氯毒素多肽关联或结合于实体或部分以形成结合物的方法的选择是本领域技术人员所了解的并且通常取决于所期望的结合（或关联，association）的特性(即，共价与非共价和/或可切割的（可分开的，cleavable）与不可切割的)、赖氨酸减少的氯毒素多肽和实体/部分的特性、化学官能团的存在和特性，等。

B.实体/部分

如上所述，在某些实施方式中，氯毒素结合物包含一种或多种非氯毒素实体。可以采用任何的各种实体或部分。

1.治疗实体/部分

在某些实施方式中，提供的结合物包含一个或多个治疗实体或部分，如在下文和在国际专利公开号WO 2009/021136 Al中所描述的，其全部内容以引用方式结合于本文。

a.抗癌剂

在一些实施方式中，一个或多个治疗实体或部分包含抗癌剂。适宜的抗癌剂包括任何的种类繁多的物质、分子、化合物、制剂或因子，其对于癌细胞是直接或间接有毒的或有害的，包括，例如，细胞毒性剂。适用于实施本发明的抗癌剂可以是合成或天然的。抗癌剂可以包含单分子或不同分子的复合物。

适宜的抗癌剂可以属于任何的各种类型的化合物，包括但不限于小分子、肽、糖类、类固醇、抗体、融合蛋白、反义多核苷酸、核酶、小干扰RNA、模拟肽等。类似地，适宜的抗癌剂可以属于任何的各种类型的抗癌剂，包括但不限于烷化剂、抗代谢药物、抗有丝分裂抗生素、生物碱抗肿瘤剂、激素和抗激素、干扰素、非类固醇抗炎药、和各种其它抗肿瘤剂。

特别适宜的抗癌剂是由于较差选择性/特异性对癌细胞引起不期望的副作用的制剂；不经历或经历较差的细胞摄取和/或细胞保留的制剂；与细胞耐药性有关的制剂；以及由于较差水溶性、聚集等而不能容易配制来给予癌症患者的制剂。

下文详细描述可以用于本发明的结合物中的适宜抗癌剂的实例。

不良水溶性抗癌药物

在某些实施方式中，在本发明的结合物内的抗癌剂是不良（较差，poorly）水溶性化合物。如本领域技术人员将认识到的，各种各样的不良水溶性抗癌剂适用于本发明。

例如，抗癌剂可以选自紫杉烷，在治疗许多实体肿瘤（其是其它抗肿瘤剂难治的）中，其被认为是有效的制剂。两种目前已获得批准的紫杉烷是紫杉醇(TAXOL^TM)和多西他赛(TAXOTERE^TM)。紫杉醇、多西他赛、和其它紫杉烷通过增强微管蛋白（在纺锤体微管的形成中的一种必要蛋白质）的聚合作用来起作用。微管蛋白的聚合作用导致形成非常稳定的、非功能性小管，其抑制细胞复制并导致细胞死亡。

紫杉醇具有很差水溶性，因而在实践中不能用水配制来用于静脉内给予。利用CREMOPHOR EL^TM(聚氧乙基化蓖麻油)作为药物载体，已开发了TAXOL^Tm的一些配方，用于注射或静脉输注。然而，CREMOPHOR^TMEL本身具有毒性，并且被认为至少部分地造成上述制剂有关的超敏反应(严重的皮疹、荨麻疹、潮红、呼吸困难、心动过速等)。为了避免这样的副作用，经常连同包含CREMOPHOR^TM的紫杉醇配方一起规定术前用药。多西他赛，其是紫杉醇的类似物，类似于紫杉醇，是难溶于水的。目前最优选的用来溶解多西他赛的制药用溶剂是聚山梨酯80(TWEEN 80)。除了在患者中引起超敏反应以外，TWEEN 80不能和PVC递送器具一起使用，这是因为它倾向于沥滤邻苯二甲酸二乙基己酯，其是高毒性的。

根据本发明的包含紫杉烷和氯毒素多肽的结合物可以用作一种改进的递送方法来避免使用在患者中诱导不良反应的溶剂和载体。

在一些实施方式中，在氯毒素结合物内的抗癌剂可以属于抗生素的烯二炔（enediyne）家族。作为家族，烯二炔抗生素是特别有力的抗肿瘤剂。一些成员比阿霉素（最有效的、临床使用的抗肿瘤抗生素之一）更有力1000倍(Y.S.Zhen et al.,J.Antibiot.,1989,42:1294-1298)。例如，在本发明的结合物内的抗癌剂可以是烯二炔家族的成员刺孢霉素。检测刺孢霉素（最初分离自土壤微生物Micromonospora echinosporassp.calichensis的肉汤提取物），以筛选有力的DNA损伤剂(M.D.Lee et al.,J.Am.Chem.Soc.,1987,109:3464-3466；M.D.Lee et al.,J.Am.Chem.Soc.,1987,109:3466-3468；W.M.Maiese et al.,J.Antibiot.,1989,42:558-563；M.D.Lee et al.,J.Antibiot.,1989,42:1070-1087)。

刺孢霉素的特点在于，通过糖基键连接于寡糖链的复杂的、刚性双环烯二炔烯丙基三硫化物核心结构。寡糖部分包含若干取代的糖衍生物、和取代的四氢吡喃环。已报道，包含核心(或糖苷配基)的烯二炔和刺孢霉素的碳水化合物部分在这些分子的生物活性中履行不同的作用。一般认为，核心部分切割DNA，而刺孢霉素的寡糖部分则用作识别和递送系统并引导药物到双链DNA小沟，在其中药物锚定本身(“Enediyne Antibiotics asAntitumor Agents”,Doyle and Borders,1995,Marcel-Dekker:New York;)。双链DNA切割是一种损类型伤，其对于细胞而言通常是不可修复的或不容易修复的并且往往是致命的。

由于它们的化学和生物特性，在临床前模型中，已测试刺孢霉素的若干类似物作为潜在的抗肿瘤剂。并没有追求将它们开发为单剂疗法，这是因为延迟毒性，其限制了用于治疗的治疗剂量范围。然而，它们的效力使它们特别可用于靶向化疗。

适宜的不良水溶性抗癌剂的其它实例包括他莫昔芬和BCNU。他莫昔芬已在不同程度上成功用来治疗各种雌激素受体阳性的癌如乳癌、子宫内膜癌、前列腺癌、卵巢癌、肾癌、黑素瘤、结肠直肠肿瘤、硬纤维瘤、胰腺癌、和垂体瘤。除了受限于较差水溶性以外，利用他莫昔芬进行的化疗还可以引起副作用如细胞耐药性。BCNU(1，3-二(2-氯乙基)-1-亚硝基脲)因其抗肿瘤特性而众所周知，并且，自从1972年以来，它已由国家癌症研究所指定用于抵抗脑瘤、结肠癌、霍奇金病、肺癌和多发性骨髓瘤。然而，这种抗癌药物的有效利用也受限于它的低溶解性。

伴有抗药性的抗癌剂

在本发明的某些实施方式中，氯毒素结合物包含伴有抗药性的抗癌剂。如在本文中所使用的，术语“伴有抗药性的抗癌剂”是指癌细胞对其具有抗性或可以产生抗性的任何化疗剂。如上所述，对抗癌剂的抗性可以起因于许多因素并且可以通过不同的机制来起作用。给予本发明的包含赖氨酸减少的氯毒素多肽和伴有抗药性的抗癌剂的结合物可以增强抗癌剂的细胞摄取并携带它进入肿瘤细胞，例如，抗性肿瘤细胞。

任何的各种各样的伴有抗药性的抗癌剂适用于本发明。例如，伴有抗药性的抗癌剂可以是甲氨蝶呤。甲氨蝶呤，一种广泛使用的抗癌药物，是叶酸的类似物并阻止在四氢叶酸的合成中的重要步骤，其中四氢叶酸本身是在胸苷酸的合成中所采用的化合物的关键来源，上述胸苷酸是一种结构单元，其是特异的，因而对于DNA合成是尤为关键的。甲氨蝶呤诱导的药物抗性与上述药物的细胞摄取的缺乏相关联。

适宜抗癌剂的其它实例包括嘌呤和嘧啶类似物，其伴有抗药性，这是由于药物的不足的细胞内活化（通过酶活性的丧失）。这样的嘌呤类似物的一个实例是6-巯嘌呤(6-MP)。6-MP的肿瘤细胞抗性的常见原因是酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)的丧失，该酶将6-MP激活成它的相应的核苷酸，6-巯基磷酸核糖嘌呤(6-MPRP)，药物的致命形式。不受限于理论，推测，如果可以将6-MPRP本身引入细胞，则可以克服抗性。虽然这种化合物是市售的，但它还没有治疗上用于癌症治疗，这是由于不能将它适当地转运到活细胞。6-MPRP与根据本发明的赖氨酸减少的氯毒素多肽的结合（或关联）将显著增加它穿过细胞膜的能力。硫鸟嘌呤是伴随有抗药性（由于缺少酶HGPRT）的抗癌剂的另一个实例。

伴有抗药性（由于不足的细胞内活化）的嘧啶类似物的实例包括阿糖胞苷和阿糖腺苷，其通过酶脱氧胞苷激酶(DOCK)分别被活化成致命形式二磷酸胞苷（或二磷酸胞嘧啶）和二磷酸腺苷。可以将赖氨酸减少的氯毒素多肽耦合于上述嘧啶类似物的活化形式以增强它们的细胞摄取并克服细胞耐药性。

伴有抗药性的抗癌剂的其它实例包括但不限于5-氟尿嘧啶、氟脱氧尿苷、胞嘧啶、阿拉伯糖苷、长春碱、长春新碱、柔红霉素、多柔比星、放射菌素、和博来霉素。

其它抗癌剂

在一些实施方式中，抗癌剂选自由（仅举几例）烷基化药物(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、异环磷酰胺)、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤)、嘌呤拮抗剂和嘧啶拮抗剂(例如，6-巯嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨)、纺锤体毒物(例如，长春碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉醇)、鬼臼毒素(例如，依托泊苷、伊立替康、托泊替康)、抗生素(例如，多柔比星、博来霉素、丝裂霉素)、亚硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀)、无机离子(例如，顺铂、卡铂)、酶(例如，天冬酰胺酶)、和激素(例如，他莫昔芬、亮丙立德、氟他胺、和甲地孕酮)组成的组。对于更新的癌症疗法的更全面的讨论参见网站，其地址是http://，紧随其后是www.cancer.gov/，FDA批准的肿瘤药物的清单参见网站，其地址是http://，紧随其后是“www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm”，以及The Merck Manual,SeventeenthEd.1999，其全部内容以引用方式结合于本文。

核酸试剂

在某些实施方式中，氯毒素结合物包含核酸试剂。

已表明，许多癌症和肿瘤与不同程度的基因损伤，如点突变、基因缺失、或重复相关。已开发了用于治疗癌症的许多新策略，如那些已称作“反义”、“反基因”和“RNA干扰”的新策略，来调节基因的表达(A.Kalota et al.,Cancer Biol.Ther.,2004,3:4-12；Y.Nakata et al.,Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.,2005,15:163-182；V.Wacheck andU.Zangmeister-Wittke,Crit.Rev.Oncol.Hematol.,2006,59:65-73；A.Kolata et al.,Handb.Exp.Pharmacol.,2006,173:173-196)。这些方式采用，例如，反义核酸、核酶、三联体试剂、或短干扰RNA(siRNA)，来阻止靶基因的特定mRNA或DNA的转录或翻译，其中通过用反义核酸来掩蔽mRNA或用三联体试剂来掩蔽DNA，通过用核酶来切割核苷酸序列，或通过破坏mRNA，通过涉及RNA-干扰的复杂的机制。在许多这些策略中，主要地寡核苷酸用作活性剂，虽然也已使用小分子和其它结构。虽然用于调节基因表达的基于寡核苷酸的策略具有用于治疗一些癌症的较大潜力，但寡核苷酸的药理应用已主要受阻于这些化合物无效递送到它们在癌细胞内的作用部位。(P.Herdewijn et al.,Antisense Nucleic Acids Drug Dev.,2000,10:297-310；Y.Shoji and H.Nakashima,Curr.Charm.Des.,2004,10:785-796；A.WTong et al.,Curr.Opin.Mol.Ther.,2005,7:114-124)。

在某些实施方式中，提供的氯毒素结合物包含赖氨酸减少的氯毒素多肽和核酸分子，其可用作治疗剂(例如，抗癌剂)。核酸的各种化学类型和结构形式可以适用于上述策略。它们包括，借助于非限制性实例，DNA，包括单链(ssDNA)和双链(dsDNA)；RNA，包括但不限于ssRNA、dsRNA、tRNA、mRNA、rRNA、酶RNA；RNA:DNA杂交体，三链DNA(例如，与短寡核苷酸结合的dsDNA)等。

在一些实施方式中，核酸试剂的长度为约5至2000个寡核苷酸。在一些实施方式中，核酸试剂的长度为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多核苷酸。在一些实施方式中，核酸试剂的长度小于约2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、45、40、35、30、25、20或更少核苷酸。

在一些实施方式中，核酸试剂包含启动子和/或其它序列（其调节转录）。在一些实施方式中，核酸试剂包含复制起点和/或调节复制的其它序列。在一些实施方式中，核酸试剂并不包括启动子和/或复制起点。

适用于实施本发明的核酸抗癌剂包括那些核酸抗癌剂，其靶向与肿瘤发生和细胞生长或细胞转化有关的基因(例如，原癌基因，其编码刺激细胞分裂的蛋白质)，生成血管/抗血管生成基因，肿瘤抑制基因(其编码抑制细胞分裂的蛋白质)，编码与肿瘤生长和/或肿瘤转移有关的蛋白质的基因，和自杀基因(其诱导细胞凋亡或其它形式的细胞死亡)，尤其是在快速分裂细胞中最具活性的自杀基因。

与肿瘤发生和/或细胞转化有关的基因的实例包括MLL融合基因、BCR-ABL、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、Bc1-2、AML1-ETO、AML1-MTG8、Ras、Fos PDGF、RET、APC、NF-1、Rb、p53、MDM2等；过表达基因如多耐药基因；细胞周期蛋白；β-联蛋白；端粒酶基因；c-myc、n-myc、Bc1-2、Erb-B1和Erb-B2；和突变基因如Ras、Mos、Raf、和Met。肿瘤抑制基因的实例包括但不限于p53、p21、RB1、WT1、NF1、VHL、APC、DAP激酶、p16、ARF、神经纤维瘤蛋白、和PTEN。能够由可用于抗癌疗法的核酸试剂靶向的基因的实例包括编码与肿瘤转移有关的蛋白质的基因如整联蛋白、选择蛋白、和金属蛋白酶；编码促进新血管形成的蛋白质的抗血管生成基因如血管内皮生长因子(VEGF)或VEGFr；编码抑制新血管形成的蛋白质的抗血管生成基因如内皮细胞抑素、血管生长抑素、和VEGF-R2；和编码蛋白质的基因如白细胞介素、干扰素、成纤维细胞生长因子(α-FGF和β-FGF)、胰岛素样生长因子(例如，IGF-1和IGF-2)、血小板衍生生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(例如，TGF-α和TGF-β)、表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、干细胞因子和它的受体c-Kit(SCF/c-Kit)配体、CD40L/CD40、VLA-4VCAM-1、ICAM-1/LFA-1、hyalurin/CD44等。如本领域技术人员将明了的，上述实例不是排他性的。

适用于本发明的核酸试剂可以具有任何的各种应用，包括，例如，用作抗癌剂或其它治疗剂、探针、引物等。核酸试剂可以具有酶活性(例如，核酶活性)、基因表达抑制活性(例如，作为反义或siRNA剂等)、和/或其它活性。核酸试剂本身可以是活性的或可以是递送活性核酸试剂的载体(例如，通过递送核酸的复制和/或转录)。对于本说明书的目的来说，如果它们编码或用其它方式递送治疗活性剂，则认为上述载体核酸是“治疗剂”，即使它们本身并不具有治疗活性。

在某些实施方式中，氯毒素结合物包含核酸治疗剂，其包含或编码反义化合物。在本文中，术语“反义化合物或试剂”、“反义寡聚物”、“反义寡核苷酸”、和“反义寡核苷酸类似物”可互换使用，并且是指核苷酸碱基和亚基-亚基主链的序列，通过沃森-克里克碱基配对，其便于反义化合物杂交于在RNA中的靶序列，以形成在靶序列内的RNA低聚物异型双链。低聚体可以具有在靶序列内的准确的序列互补性或接近互补性。这样的反义寡聚物可以阻止或抑制包含靶序列的mRNA的翻译，或抑制基因转录。反义寡聚物可以结合于双链或单链序列。

适用于实施本发明的反义寡核苷酸的实例包括，例如，在以下评述中提及的那些反义寡核苷酸：R.A Stahel et al.,Lung Cancer,2003,41:S81-S88；K.F.Pirollo etal.,Pharmacol.Ther.,2003,99:55-77；A.C.Stephens and R.P.Rivers,Curr.Opin.Mol.Ther.,2003,5:118-122；N.M.Dean and C.F.Bennett,Oncogene,2003,22:9087-9096；N.Schiavone et al.,Curr.Pharm.Des.,2004,10:769-784；L.Vidal et al.,Eur.J.Cancer,2005,41:2812-2818；T.Aboul-Fadl,Curr.Med.Chem.,2005,12:2193-2214；M.E.Gleave and B.P.Monia,Nat.Rev.Cancer,2005,5:468-479；Y.S.Cho-Chung,Curr.Pharm.Des.,2005,11:2811-2823；E.Rayburn et al.,Lett.Drug Design &Discov.,2005,2:1-18；E.R.Rayburn et al.,Expert Opin.Emerg.Drugs,2006,11:337-352；I.Tamm and M.Wagner，Mol.Biotechnol.,2006,33:221-238(各自的全部内容以引用方式结合于本文)。

适宜的反义寡核苷酸的实例包括，例如奥利默森（oblimersen）钠(还称作Genasense^TM或G31239，由Genta,Inc.,Berkeley Heights,NJ开发)，一种硫代磷酸低聚体，其靶向bc1-2mRNA的起始密码子区。Bc1-2是细胞凋亡的有效抑制剂并且过度表达在许多癌症中，包括滤泡性淋巴瘤、乳癌、结肠癌、前列腺癌、和中间/高等级淋巴瘤(C.A.Stein etal.,Semin.Oncol.,2005,32:563-573；S.R.Frankel,Semin.Oncol.,2003,30:300-304)。其它适宜的反义寡核苷酸包括GEM-231(HYB0165,Hybridon,Inc.,Cambridge,MA)，其是针对cAMP-依赖性蛋白激酶A(PKA)的混合主链寡核苷酸(S.Goel et al.,Clin.Cancer Res.,203,9:4069-4076)；Affinitak(ISIS 3521或aprinocarsen,ISIS pharmaceuticals,Inc.,Carlsbad,CA)，PKCα的一种反义抑制剂；OGX-011(Isis 112989,Isis Pharmaceuticals,Inc.)，相对于簇蛋白（涉及细胞周期、组织重建、脂质转运、和细胞死亡的调节的糖蛋白）的一种2′-甲氧基乙基修饰反义寡核苷酸，并且其过度表达在乳腺癌、前列腺癌和结肠癌中；ISIS 5132(Isis 112989,Isis Pharmaceuticals,Inc.)，一种硫代磷酸寡核苷酸，其互补于c-raf-1mRNA的3′-未翻译区的序列(S.P.Henry et al.,Anticancer Drug Des.,1997,12:409-420；B.P.Monia et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1996,93:15481-15484；C.M.Rudin et al.,Clin.Cancer Res.,2001,7:1214-1220)；ISIS 2503（IsisPharmaceuticals,Inc.），人H-rasmRNA表达的一种硫代磷酸寡核苷酸反义抑制剂(J.Kurreck,Eur.J.Biochem.,2003,270:1628-1644)；靶向凋亡蛋白的X-连接抑制剂(XIAP)的寡核苷酸，其阻止很大一部分的凋亡途径，如GEM 640(AEG 35156,AegeraTherapeutics Inc.和Hybridon,Inc.)或靶向存活蛋白，凋亡蛋白的抑制剂(IAP)，如ISIS23722（Isis Pharmaceuticals,Inc.），2′-O-甲氧基乙基嵌合寡核苷酸；MG98，其靶向DNA甲基转移酶；以及GTI-2040（Lorus Therapeutics,Inc.Toronto，加拿大），一种20-聚体寡核苷酸，其互补于在人核糖核苷酸还原酶的R2小亚基成分的mRNA中的编码区。

其它适宜的反义寡核苷酸包括反义寡核苷酸，其是相对于Her-2/neu、c-Myb、c-Myc、和c-Raf所开发(参见，例如，A.Biroccio et al.,Oncogene,2003,22；6579-6588;Y.Lee et al.,Cancer Res.,2003,63:2802-2811；B.Lu et al.,Cancer Res.,2004,64:2840-2845；K.F.Pirollo et al.,Pharmacol.Ther.,2003,99:55-77；和A.Rait et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,2003,1002:78-89)。

在某些实施方式中，本发明的氯毒素结合物包含核酸抗癌剂，其包含或编码干扰RNA分子。术语“干扰RNA”和“干扰RNA分子”在本文中可互换使用是指这样的RNA分子，其可以抑制或下调基因表达或沉默基因（以序列特异性方式），例如通过介导RNA干扰(RNAi)。RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)触发的进化上保守的、序列特异性机制，其诱导互补性靶单链mRNA的降解和相应的翻译序列的“沉默”(McManus and Sharp,2002,NatureRev.Genet.,2002,3:737)。通过将较长dsRNA链进行酶切割形成长度约21-23个寡核苷酸的生物活性“短干扰RNA”(siRNA)序列，RNAi来发挥作用(Elbashir et al.,Genes Dev.,2001,15:188)。RNA干扰已成为一种有希望的用于治疗癌症的方法。

适用于实施本发明的干扰RNA可以提供为若干形式的任何一种。例如，干扰RNA可以提供为以下一种或多种：分离的短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、或短发夹RNA(shRNA)。

适用于本发明的干扰RNA分子的实例包括，例如，在以下评论（综论）中引述的iRNA：O.Milhavet et al.,Pharmacol.Rev.,2003,55:629-648；F.Bi et al.,Curr.Gene.Ther.,2003,3:411-417；P.Y.Lu et al.,Curr.Opin.Mol.Ther.,2003,5:225-234；I.Friedrich et al.,Semin.Cancer Biol.,2004,14:223-230；M.Izquierdo,CancerGene Ther.,2005,12:217-227；P.Y.Lu et al.,Adv.Genet.,2005,54:117-142；G.R.Devi,Cancer Gene Ther.,2006,13:819-829；M.A.Behlke,Mol.Ther.,2006,13:644-670；和L.N.Putral et al.,Drug News Perspect.,2006,19:317-324(各自的全部内容以引用方式结合于本文)。

适宜的干扰RNA分子的其它实例包括但不限于p53干扰RNA（例如，T.R.Brummelkamp et al.,Science,2002,296:550-553；M.T.Hemman et al.,Nat.Genet.,2003,33:396-400）；靶向bcr-abl融合体的干扰RNA，该bcr-abl融合体相关与慢性髓性白血病和急性成淋巴细胞白血病的发展(例如，M.Scherr et aL,Blood,2003,101:1566-1569；M.J.Li et al.,Oligonucleotides,2003,13:401-409)；干扰RNA，其抑制NPM-ALK的表达，上述NPM-ALK是一种蛋白质，其存在于75%的间变性大细胞淋巴瘤中并导致与肿瘤形成有关的组成性活性激酶的表达(U.Ritter et al.,Oligonucleotides,2003,13:365-373)；靶向癌基因的干扰RNA，癌基因例如Raf-1（T.F.Lou et al.,Oligonucleotides,2003,13:313-324）、K-Ras(T.R.Brummelkamp et al.,Cancer Cell,2002,2:243-247)、erbB-2(G.Yanget al.,J.Biol.Chem.,2004,279:4339-4345)；靶向b-联蛋白的干扰RNA，b-联蛋白的过度表达导致T细胞因子靶基因的反式激活，这被认为是在结肠直肠癌中的主要转化事件(M.van de Wetering et al.,EMBO Rep.,2003,4:609-615)。

在某些实施方式中，氯毒素结合物包含核酸治疗剂，其是核酶。如在本文中所使用的，术语“核酶”是指催化RNA分子，其可以以靶特异性方式切割其它RNA分子。核酶可以用来下调感兴趣的基因的任何不受欢迎的产物的表达。可以用于实施本发明的核酶的实例包括但不限于ANGIOZYME^TM（RPI.4610,Sima Therapeutics,Boulder,CO）、靶向人、小鼠、和大鼠血管内皮生长因子受体(VEGFR)-1mRNA的保守区的核酶、和Herzyme（Sima Therapeutics）。

光敏剂

在某些实施方式中，在氯毒素结合物中的实体或部分包含在光动力疗法(PDT)中使用的光敏剂。在PDT中，在将光敏剂局部或全身给予患者以后，用由在待治疗的组织或器官中的光敏剂吸收的光进行照射。光敏剂的光吸收会产生反应性物质(例如，自由基)，其对细胞是有害的。为了获得最大功效，光敏剂通常具有适用于给予的形式，并且还具有在靶部位可以容易经历细胞内化的形式，相对于正常组织，其经常具有一定程度的选择性。

虽然作为简单水溶液的一部分已成功递送一些光敏剂(例如，QLT,Inc.,Vancouver,BC，加拿大)，但这样的水溶液不能适用于疏水性光敏剂药物，如那些具有基于四或多吡咯结构的药物。这些药物具有内在的通过分子堆积进行聚集的倾向，其导致光敏化过程的功效的显着降低(Siggel et al.,J.Phys.Chem.,1996,100:2070-2075)。用来最大限度地减少聚集的方式包括脂质体配方（例如，用于苯并卟啉衍生物一元酸A，BPDMA,QLT,Inc.,Vancouver，加拿大；以及酞花菁锌，CIBA-Geigy,Ltd.,Basel，瑞士），和光敏剂与生物相容性嵌段共聚物（Peterson et al.,Cancer Res.,1996,56:3980-3985）和/或抗体（Omelyanenko et al.,Int.J.Cancer，1998,75:600-608）的结合。

包含与光敏剂结合（或关联）的赖氨酸减少的氯毒素多肽的氯毒素结合物可以在PDT中用作新的递送系统。除减少光敏剂聚集以外，根据本发明的光敏剂的递送还呈现其它优点如增加的对靶组织/器官的特异性和光敏剂的细胞内化。

适用于本发明的光敏剂包括任何的各种合成和自然发生的分子，其具有可用于PDT的光敏特性。在某些实施方式中，光敏剂的吸收光谱是在可见光范围内，通常在350nm和1200nm之间，优选在400nm和900nm之间，例如，在600nm和900nm之间。可以耦合于根据本发明的毒素的适宜的光敏剂包括但不限于卟啉和卟啉衍生物(例如，二氢卟酚、菌绿素、异菌绿素、酞菁、和萘酞菁)；金属卟啉，金属酞青，当归根素，chalcogenapyrrillium染料，叶绿素，香豆素，黄素和相关化合物如咯嗪和核黄素，富勒烯，脱镁叶绿甲酯一酸，鲍光过敏素，花青(例如，部花青540)，脱镁叶绿素，sapphyrins，texaphyrins，红紫素，porphycenes，噻吩嗪（phenothiaziniums），亚甲蓝衍生物，萘二甲酰亚胺（naphthalimides），尼罗蓝衍生物，醌，苝醌(例如，金丝桃素、竹红菌竹素、和尾孢菌素)，补骨脂素，醌，类视黄醇，罗丹明，噻吩，verdins，呫吨染料(例如，曙红、藻红、玫瑰红)，卟啉的二聚体和寡聚体形式，和前药如5-氨基乙酰丙酸(R.W.Redmond and J.N.Gamlin,Photochem.Photobiol.,1999,70:391-475)。

适用于本发明的典型的光敏剂包括在美国专利号5,171,741、5,171,749、5,173,504、5,308,608、5,405,957、5,512,675、5,726,304、5,831,088、5,929,105、和5,880,145中描述的那些光敏剂(上述各个专利的全部内容以引用方式结合于本文)。

辐射敏化剂

在某些实施方式中，氯毒素结合物包含辐射敏化剂。如在本文中所使用的，术语“辐射敏化剂”是指使肿瘤细胞对放射疗法更加敏感的分子、化合物或剂。将辐射敏化剂给予接收放射疗法的患者通常导致放射疗法的效果的增强。理想地，辐射敏化剂仅对靶细胞施加其功能。为了易于使用，辐射敏化剂还应能够发现靶细胞，即使它是全身给予。然而，当前可用的辐射敏化剂对于肿瘤通常不是选择性的，并且它们在哺乳动物体内是通过扩散加以分布。本发明的氯毒素结合物可以作为用于辐射敏化剂的新的递送系统。

各种辐射敏化剂在本领域中是已知的。适用于本发明的辐射敏化剂的实例包括但不限于紫杉醇卡铂、顺铂、和奥沙利铂（Amorino et al,Radiat.Oncol.Investig.1999;7:343-352；Choy,Oncology,1999,13:22-38；Safran et al.,Cancer Invest.,2001,19:1-7；Dionet et al.,Anticancer Res.,2002,22:721-725；Cividalli et al.,Radiat.Oncol.Biol.Phys.,2002,52:1092-1098）；吉西他滨（Choy,Oncology,2000,14:7-14；Mornex and Girard,Annals of Oncology,2006,17:1743-1747）；依他硝唑（Inanami et al.,Int.J.Radiat.Biol.,2002,78:267-274）；米索硝唑（Tamulevicius et al.,Br.J.Radiology,1981,54:318-324；Palcic et al.,Radiat.Res.,1984,100:340-347）；替拉扎明(Masunaga et al.,Br.J.Radiol.,2006,79:991-998；Rischin et al.,J.Clin.Oncol.,2001,19:535-542；Shulman et al.,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.,1999,44:349-353)；以及核酸基衍生物，例如，卤化嘌呤或嘧啶，如5-氟脱氧尿嘧啶（Buchholz et al.,Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.,1995,32:1053-1058）。

放射性同位素

在某些实施方式中，氯毒素结合物包含放射性同位素。适宜的放射性同位素的实例包括任何α-、β-或γ-发射体，当位于肿瘤部位时，其导致细胞破坏（S.E.Order,"Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use ofRadiolabeled Antibody in Cancer Therapy",Monoclonal Antibodies for CancerDetection and Therapy,R.W.Baldwin et al.(Eds.),Academic Press,1985）。上述放射性同位素的实例包括但不限于碘-131(¹³¹I)、碘-125(¹²⁵I)、铋-212(²¹²Bi)、铋-213(²¹³Bi)、砹-211(²¹¹At)、铼-186(¹⁸⁶Re)、铼-188(¹⁸⁸Re)、磷-32(³²P)、钇-90(⁹⁰yY)、钐-153(¹⁵³Sm)、和镥-177(¹⁷⁷Lu)。

超抗原

在某些实施方式中，氯毒素结合物包含超抗原或其生物活性部分。超抗原构成一组细菌和病毒蛋白，其极其有效地激活大部分的T细胞群体。超抗原直接结合于主要组织相容性复合体(MHC)而无需加以处理。事实上，超抗原未经处理地结合在MHC II类分子上的抗原结合槽（groove）的外侧，从而避免在常规肽结合位点处的大多数多态性。

基于超抗原的肿瘤治疗方法已开发用于治疗实体肿瘤。在这种方式中，靶向部分，例如，抗体或抗体片段，结合于超抗原，从而提供靶向超抗原。如果抗体或抗体片段识别到肿瘤相关抗原，则结合于肿瘤细胞的靶向超抗原可以触发超抗原-活化的细胞毒性T细胞以便直接通过超抗原依赖性细胞介导的细胞毒性来杀伤肿瘤细胞（参见，例如，etal.(1996)“Antibody-targeted superantigens in cancer immunotherapy,”Immunotechnology，2(3):151-162，其全部内容以引用方式结合于本文）。

基于超抗原的肿瘤疗法已取得了一些成功。例如，在结肠直肠癌和胰腺癌的临床试验中已研究了与野生型葡萄球菌肠毒素A(SEA)的融合蛋白（Giantonio et al.,J.Clin.Oncol.,1997,15:1994-2007；Alpaugh et aL,Clin.Cancer Res.,1998,4:1903-1914；Cheng et aL,J.Clin.Oncol.,2004,22:602-609；各自的全部内容以引用方式结合于本文）；已研究肠毒素基因簇(egc)的葡萄球菌超抗原用于治疗非小细胞肺癌（Terman etal.,Clin.Chest Med.,2006,27:321-324，其全部内容以引用方式结合于本文），以及已评价了葡萄球菌肠毒素B用于浅表性膀胱癌的膀胱内免疫治疗（Perabo et al.,Int.J.Cancer,2005,115:591-598，其全部内容以引用方式结合于本文）。

超抗原或其生物活性部分可以与赖氨酸减少的氯毒素多肽结合（或关联）以形成根据本发明的氯毒素结合物，并用于疗法，例如，抗癌疗法（如本文描述的）。

适用于本发明的超抗原的实例包括但不限于肠毒素基因簇的葡萄球菌肠毒素(SE)（例如，葡萄球菌肠毒素A(SEA)或葡萄球菌肠毒素E（SEE））、化脓链球菌外毒素(SPE)、金黄色葡萄球菌中毒性休克综合征毒素(TSST-1)、链球菌致有丝分裂外毒素(SME)、链球菌超抗原(SSA)、和葡萄球菌超抗原。如本领域技术人员已知的，上述所列超抗原的三维结构可以获自Protein Data Bank。类似地，以上所列超抗原和其它超抗原的核酸序列和氨基酸序列可以获自GenBank。

前药激活酶

在某些实施方式中，本发明的氯毒素结合物可以用于导向酶前药疗法。在导向酶前药疗法中，将定向/靶向酶和前药给予主体，其中靶向酶特异性地位于主体身体的一部分，此处它将前药转化成活性药物。可以以一个步骤(通过靶向酶)或以超过一个的步骤将前药转化成活性药物。例如，可以通过靶向酶将前药转化成活性药物的前体。然后，可以将前体转化成活性药物，例如，通过一种或多种另外的靶向酶的催化活性，给予主体的一种或多种非靶向酶，在主体中或在主体中的靶部位处自然存在的一种或多种酶(例如，蛋白酶、磷酸酶、激酶或聚合酶)，通过给予主体的制剂，和/或通过非酶催化的化学过程（例如，氧化、水解、异构化、差向异构化等）。

不同方式已用来将酶定向/靶向于感兴趣的部位。例如，在ADEPT(抗体导向酶前药疗法)中，将针对肿瘤抗原设计/开发的抗体连接于酶并注射入主体，从而导致酶与肿瘤的选择性结合。当在肿瘤和正常组织酶水平之间鉴别足够时，将前药给予主体。仅在肿瘤内，通过酶，将前药转化成它的活性形式。通过抗体的肿瘤特异性和通过延迟前药给予直到在肿瘤和正常组织酶水平之间存在较大差异来实现选择性。早期临床试验是有前景的并且表明，ADEPT可以有效地治疗所有实体癌，对其而言，肿瘤相关或肿瘤特异性抗体是已知的。还已经用编码前药激活酶的基因来靶向肿瘤。这种方式已被称作病毒导向酶前药疗法(VDEPT)或更一般地称作GDEPT(基因导向酶前药疗法)，并且在实验室系统中已显示良好的结果。导向酶前药疗法的其它变通方式包括PDEPT（聚合物导向酶前药疗法）、LEAPT（凝集素导向酶活化前药疗法）、和CDEPT（梭菌导向酶前药疗法）。可以以类似方式来使用根据本发明的结合物，其包含与赖氨酸减少的氯毒素多肽结合的前药激活酶。

适用于本发明的酶/前药/活性药物组合的非限制性实例描述于，例如，Bagshaweet al.,Current Opinions in Immunology,1999,11:579-583；Wilman,“Prodrugs inCancer Therapy”,Biochemical Society Transactions,14:375-382,615^th Meeting,Belfast,1986；Stella et al.,″Prodrugs:A Chemical Approach To Targeted DrugDelivery",in″Directed Drug Delivery",Borchardt et al.,(Eds),pp.247-267(HumanaPress,1985)。酶/前药/活性抗癌药物组合的非限制性实例描述于，例如，Rooseboom etal.,Pharmacol.Reviews,2004,56:53-102。

前药激活酶的实例包括但不限于硝基还原酶、细胞色素P450、嘌呤-核苷磷酸化酶、胸苷激酶、碱性磷酸酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、羧肽酶、青霉素酰胺酶、β-内酰胺酶、胞嘧啶脱氨酶、和蛋氨酸γ-裂解酶。

通过借助于前药激活酶来激活前药可以体内形成的抗癌药物的实例包括但不限于5-(氮丙啶-1-基)-4-羟基-氨基-2-硝基-苯甲酰胺、异磷酰胺氮芥、磷酰胺氮芥、2-氟腺嘌呤、6-甲基嘌呤、更昔洛韦-三磷酸寡核苷酸、依托泊苷、丝裂霉素C、对[N，N-二(2-氯乙基)氨基]苯酚(POM)、多柔比星、噁唑烷酮、9-氨基喜树碱、芥子、甲氨蝶呤、苯甲酸芥子、多柔比星、阿霉素、红比霉素、洋红霉素、博来霉素、埃斯波霉素、美法仑、岩沙海葵毒素、4-去乙酰基长春碱-3-羧酸酰肼、二胺芥子、4′-羧基邻苯二甲酰基(1,2-环己烷-二胺)铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、甲基硒醇、和硫代碳酰氟（carbonothionic difluoride）。

b.抗血管生成剂

在某些实施方式中，在本发明的氯毒素结合物内的治疗剂(例如，抗癌剂)包含抗血管生成剂。适用于本发明的抗血管生成剂包括这样的任何分子、化合物、或因子，其阻止、抑制、减慢、或减轻血管生成的过程、或通过从已经存在的血管发展来形成新血管的过程。这样的分子、化合物、或因子可以通过阻止、抑制、减慢、或减轻在血管生成中所涉及的任何步骤来阻止血管生成，包括(但不限于)以下步骤：(1)原始血管的膜的溶解，(2)内皮细胞的迁移和增殖，和(3)通过迁移细胞，新脉管系统的形成。

抗血管生成剂的实例包括但不限于贝伐单抗塞来考昔内皮细胞抑素、沙利度胺、EMD121974(西仑吉肽)、TNP-470、角鲨胺、考布他汀A4、干扰素-α、抗VEGF抗体、SU5416、SU6668、PTK787/2K 22584、Marimistal、AG3340、COL-3、新伐司他、和BMS-275291。

抗血管生成剂可以用于各种治疗范围内，包括但不限于抗癌疗法和黄斑变性的疗法。

如本领域技术人员将明了的，本文引述的治疗剂的具体实例仅代表非常少量的适用于实施本发明的治疗剂。

2.可检测的实体/部分

在某些实施方式中，提供的结合物包含一种或多种可检测的实体或部分，即，结合物“标记”有上述实体或部分。在一些这样的实施方式中，上述结合物可用于诊断应用。

任何的各种各样的可检测剂可以用于实施本发明。适宜的可检测剂包括但不限于：各种配体、放射性核素；荧光染料；化学发光剂(如，例如，吖啶酯、稳定的二氧杂环丁烷等)；生物发光剂；光谱可解析无机荧光半导体纳米晶体(即，量子点)；微颗粒；金属纳米颗粒(例如，金、银、铜、铂等)；纳米簇；顺磁性金属离子；酶；比色标记(如，例如，染料、胶体金等)；生物素；异羟洋地黄毒甙元；半抗原；和蛋白质，为此，抗血清或单克隆抗体是可用的。

a.放射性和/或顺磁性同位素或离子

在某些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽标记有放射性和/或顺磁性同位素或离子。例如，可以同位素标记赖氨酸减少的氯毒素多肽(即，可以包含一种或多种原子，其已被与通常存在于自然界中的原子质量或质量数具有不同的原子质量或质量数的原子替代)或同位素可以连接于赖氨酸减少的氯毒素多肽。可以结合入赖氨酸减少的氯毒素多肽的同位素的非限制性实例包括氢、碳、氟、磷、铜、镓、钇、锝、铟、碘、铼、铊、铋、砹、钐、和镥的同位素(即，³H、¹³C、¹⁴C、¹⁸F、³²P、³⁵S、⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁹⁰Y、^99MTc、¹¹¹In、¹²⁵I、¹²³I、¹²⁹I、¹³¹I、¹³⁵I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁷Re、²⁰¹Tl、²¹²Bi、²¹¹At、¹⁵³Sm、¹⁷⁷Lu)。

在某些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽包含通过单光子发射计算机化断层显像(SPECT)或正电子发射断层显像(PET)可检测的放射性同位素。这样的放射性核素的实例包括但不限于碘-131(¹³¹I)、碘125(¹²⁵I)、铋-212(²¹²Bi)、铋-213(²¹³Bi)、砹-221(²²¹At)、铜-67(⁶⁷Cu)、铜-64(⁶⁴Cu)、铼-186(¹⁸⁶Re)、铼-188(¹⁸⁸Re)、磷-32(³²P)、钐-153(¹⁵³Sm)、镥-177(¹⁷⁷Lu)、锝-99m(^99mTc)、镓-67(⁶⁷Ga)、铟-111(¹¹¹In)、和铊-201(²⁰¹Tl)。

在某些实施方式中，用通过γ照相机可检测的放射性同位素来标记赖氨酸减少的氯毒素多肽。上述放射性同位素的实例包括但不限于碘-131(¹³¹I)、和锝-99m(^99mTc)。

在某些实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽标记有顺磁性金属离子，其在磁共振成像(MRI)中是良好的对比增强剂。上述顺磁性金属离子的实例包括但不限于钆III(Gd3+)、铬III(Cr3+)、镝III(Dy3+)、铁III(Fe3+)、锰II(Mn2+)、和镱III(Yb3+)。在某些实施方式中，标记部分包含钆III(Gd3+)。钆是FDA认可的用于MRI的造影剂，其累积在异常组织中，从而引起在磁共振图像上的这些异常区域变得非常明亮(增强的)。已知钆可以在身体的不同区域的正常和异常组织之间提供很大的对比，尤其是在脑部中。

在某些实施方式中，用通过核磁共振波谱法(MRS)可检测的稳定的顺磁性同位素来标记赖氨酸减少的氯毒素多肽。适宜的稳定的顺磁性同位素的实例包括但不限于碳-13(¹³C)和氟-19(¹⁹F)。

在一些实施方式中，通过螯合，金属同位素非共价连接于赖氨酸减少的氯毒素结合物。螯合的实例包括金属同位素与融合于赖氨酸减少的氯毒素多肽的多His区的螯合。

在一些实施方式中，通过共价键合或通过螯合，将金属如钆(Gd)并入赖氨酸减少的氯毒素多肽（如上所述）。

b.荧光染料

在某些实施方式中，用荧光染料来标记赖氨酸减少的氯毒素多肽。具有各种各样的化学结构和物理特性的许多已知的荧光染料适用于本发明的实施。适宜的荧光染料包括但不限于荧光素和荧光素染料(例如，异硫氰酸荧光素或FITC、萘基荧光素、4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM等)、羰花青、部花青、苯乙烯染料、氧杂菁染料、藻红素、藻红、曙红、罗丹明染料（例如，羧基四甲基罗丹明或TAMRA、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、丽丝胺罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明(TMR)等）、香豆素和香豆素染料(例如，甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨基甲基香豆素(AMCA)等)、俄勒冈绿染料(例如，俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514等)、德克萨斯红、德克萨斯红-X、SPECTRUM RED^Tm、SPECTRUM GREEN^Tm、花青染料(例如，CY-3^TM、CY-5^TM、CY-3.5^Tm、CY-5.5^TM等)、ALEXA FLUOR^Tm染料(例如，ALEXA FLUOR^TM 350、ALEXA FLUOR^Tm 488、ALEXA FLUOR^Tm 532、ALEXA FLUOR^TM546、ALEXA FLUOR^Tm 568、ALEXA FLUOR^Tm 594、ALEXAFLUOR^Tm633、ALEXA FLUOR^Tm 660、ALEXA FLUOR^TM 680等)、BODIPY^Tm染料(例如，BODIPY^Tm FL、BODIPY^Tm R6G、BODIPY^TM TMR、BODIPY^TmTR、BODIPY^TM 530/550、BODIPY^TM 558/568、BODIPY^TM564/570、BODIPY^TM 576/589、BODIPY^TM 581/591、BODIPY^TM 630/650、BODIPY^Tm 650/665等)、IR染料(例如，IRD40、IRD 700、IRD 800等)等。关于适宜的荧光染料的更多实例和用于将荧光染料连接（或耦合）于其它化学实体如蛋白质和肽的方法，参见，例如，"The Handbook ofFluorescent Probes and Research Products",9^th Ed.,Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR。荧光标记剂的有利特性包括高摩尔吸光系数、高荧光量子产率、和光稳定性。在一些实施方式中，标记荧光团呈现在可见区(即，在400和750nm之间)而不是在光谱的紫外线范围(即，低于400nm)中的吸收波长和发射波长。

c.酶

在某些实施方式中，用酶来标记赖氨酸减少的氯毒素多肽。适宜的酶的实例包括但不限于在ELISA中使用的那些酶，例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶等。其它实例包括β-葡糖醛酸糖苷酶、β-D-葡糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶等。可以利用接头基团如碳二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等，将酶结合于赖氨酸减少的氯毒素多肽。

本领域技术人员将认识到，在一些实施方式中，特定的非氯毒素实体或部分可以用于一个以上的目的。例如，一个部分可以既具有治疗目的又具有诊断目的。仅举一个例子，在治疗各种肿瘤（包括恶性胶质瘤）中，在氯毒素结合物内的放射性碘如¹³¹I已用作放射性标记和细胞毒性治疗剂。

III.药物组合物

可以以本身和/或以药物组合物的形式来给予本文描述的氯毒素结合物。在一些实施方式中，提供了药物组合物，其包含有效量的至少一种氯毒素结合物和至少一种药用载体。

根据本发明，可以以为了实现至少一种期望的结果所必要的或足够的量和时间来给予氯毒素结合物或其药物组合物。例如，可以给予一定量的本发明的药物组合物并持续一定时间，以致它杀伤癌细胞，减小肿瘤尺寸，抑制肿瘤生长或转移，治疗各种白血病，和/或延长患有那些疾病的哺乳动物(包括人类)的存活时间，或以其它方式产生临床益处。

可以利用有效实现所期望的疗效的任何量和任何给予途径来给予本发明的药物组合物。

给予的药物组合物的确切量将因主体不同而不同，并取决于主体的物种、年龄、和一般状态，病症的严重性等(见下文)。

最佳药剂剂型可以取决于给予途径和所期望的剂量。这样的剂型可以影响所给予的化合物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。

可以将本发明的药物组合物配制成单位剂型，以易于给予和获得均匀的剂量。如在本文中所使用的，措辞"单位剂型"是指物理上分离的氯毒素结合物的单位(具有或没有一种或多种另外的制剂)，用于待治疗的患者。然而，应当明了，本发明的组合物的每日总使用量将在合理的医疗判断的范围内由主治医师确定。

在用一种或多种适当的生理上可接受的载体或赋形剂配制成所期望的剂量以后，可以通过任何适宜的途径，将本发明的药物组合物给予人类或其它哺乳动物。各种递送系统是已知的并且可以用来给予上述组合物，包括片剂、胶囊剂、可注射溶液等。用于给予的方法包括但不限于皮肤途径、皮内途径、肌内途径、腹腔内途径、静脉内途径、皮下途径、鼻内途径、肺途径、硬膜外途径、眼途径、和口服途径。可以通过任何方便或其它适当途径来给予组合物，例如，通过输注或推注，通过借助于上皮或粘膜皮肤内层的吸收(例如，口腔、粘膜、直肠和肠粘膜等)并且可以连同其它生物活性剂一起给予。给予可以是全身和/或局部的。

可以按照已知技术并利用适宜的分散或湿润剂和悬浮剂，来配制注射制剂，例如，无菌注射水性或油性悬浮液。无菌注射制剂还可以是在无毒性、胃肠道外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、混悬剂或乳剂，例如，作为在2,3-丁二醇中的溶液。在可以使用的可接受的载体和溶剂中有水、林格氏液、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的、固定油常规地用作溶液或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的固定油，包括合成的单甘油酯或甘油二酯。在注射剂型的制备中，还可以使用脂肪酸如油酸。无菌液体载体可用于无菌液体形式组合物（用于胃肠道外给予）。

可以，例如，通过借助于保留细菌过滤器的过滤，或通过掺入无菌固体组合物（可以在使用前将其溶解或分散在无菌水或其它无菌注射介质中）形式的灭菌剂，来对注射剂型进行灭菌。可以通过，例如，静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射或皮下注射，来给予液体药物组合物（其是无菌溶液或悬浮液）。注射可以经由单推送或通过逐步输注(例如，30分钟静脉输注)。在必要时，组合物可以包括局部麻醉剂以缓解在注射部位的疼痛。

为了延长药物效果，经常期望放慢在皮下或肌内注射以后的药物吸收。这可以通过使用具有较差水溶性的结晶或无定形材料的液体悬浮液来实现。于是，药物的吸收速率取决于它的溶解速率，其相应地可以取决于晶体大小和晶形。可替换地，通过将药物溶解或悬浮于油载体中来延迟胃肠道外给予剂型的吸收。通过在可生物降解聚合物如聚交酯-聚乙醇酸交酯中形成药物的微囊化基质来制备可注射长效制剂形式。取决药物与聚合物的比率和所采用的特定聚合物的特性，可以控制药物释放速率。其它可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。还可以通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体(还称作脂囊泡)或微乳中来制备长效注射剂型。

用于口服的液体剂型包括但不限于药用乳剂、微乳、溶液、混悬剂、糖浆剂、酏剂、和加压组合物。除活性组分(即，结合物)以外，液体剂型可以包含在本领域中通常使用的惰性稀释剂如，例如，水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺，油（尤其是棉子油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油、和麻油），甘油，四氢糠醇，聚乙二醇和山梨聚糖的脂肪酸酯、和它们的混合物。除惰性稀释剂以外，口服组合物还可以包括佐剂如湿润剂、悬浮剂、防腐剂、甜味剂、增香剂、和芳香剂、增稠剂、着色剂、粘度调节剂、稳定剂或渗透压调节剂。用于口服的液体载体的适宜实例包括水(部分地包含如上所述的添加剂，例如，纤维素衍生物，如羧甲基纤维素钠溶液)，醇(包括一元醇和多元醇如乙二醇)和它们的衍生物，以及油(例如，分馏椰子油和花生油)。

用于口服的固体剂型包括，例如，胶囊剂、片剂、丸剂、散剂、和颗粒剂。在这样的固体剂型中，活性组分与至少一种惰性的、生理上可接受的赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙以及以下的一种或多种混合：(a)填料或填充剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、和硅酸；(b)粘合剂如，例如，羧基甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、和阿拉伯胶；(c)保湿剂如甘油；(d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐、和碳酸钠；(e)溶液阻滞剂如石蜡；(f)吸收加速剂如季铵化合物；(g)湿润剂，例如，十六醇和甘油单硬脂酸酯；(h)吸收剂如白陶土和膨润土；以及(i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、和它们的混合物。适用于固体制剂的另外的或可替换的赋形剂包括表面改性剂如非离子型和阴离子型表面改性剂。表面改性剂的典型实例包括但不限于泊洛沙姆188、苯扎氯胺、硬脂酸钙、十八醇十六醇混合物、聚西托醇乳化蜡、山梨坦酯、胶态二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、硅酸镁铝、和三乙醇胺。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，剂型还可以包含缓冲剂。固体载体/固体剂型的量将有很大的不同。在一些实施方式中，固体载体/固体剂型的量为约25mg至约1g。

在利用这样的赋形剂如乳糖（lactose）或乳糖（milk sugar）以及高分子量聚乙二醇等的软和硬填充明胶胶囊中，类似类型的固体成分还可以用作填充剂。可以用包衣和外壳如肠溶衣、控释涂层和在药物配制领域中众所周知的其它涂层来制备片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂、和颗粒剂的固体剂型。它们可以可选地包含乳浊剂并且还可以是这样的成分，以致它们仅在、或优先在肠道的某个部分中释放活性组分（可选地以延迟方式）。可以使用的包埋成分的实例包括聚合物质和蜡。

在某些实施方式中，可以期望将本发明的组合物局部给予需要治疗的区域。这可以例如，通过在手术过程中局部输注、局部应用、通过注射、借助于导管、借助于栓剂、或通过皮肤贴剂或支架或其它植入物，来实现。

可以将用于局部给予的一些组合物配制成凝胶剂、软膏剂、洗剂、或乳膏剂，其可以包括载体如水、甘油、醇、丙二醇、脂肪醇、甘油三酯、脂肪酸酯、或矿物油。其它局部载体包括液状石油、棕榈酸异丙酯、聚乙二醇、乙醇(95%)、在水中的聚氧乙烯单月桂酸酯(5%)、或在水中的十二烷基硫酸钠(5%)。必要时，可以添加其它物质如抗氧化剂、保湿剂、粘度稳定剂、和类似试剂。还可以包括经皮渗透促进剂如月桂氮卓酮。

另外，在某些情况下，可以将组合物安置在透皮装置内，其中上述透皮装置被放置在皮肤上、皮肤中、或皮肤下。这样的装置包括贴剂、植入物、和注射剂，通过被动或主动释放机制，其将化合物释放到皮肤上。透皮给予包括穿过身体表面和身体通道的内衬（包括上皮和粘膜组织）的所有给予。可以利用在洗剂、乳膏剂、泡沫、贴剂、混悬剂、溶液、和栓剂(直肠和阴道)中的本发明的组合物来进行上述给予。

可以例如，通过使用包含活性组分和载体的透皮贴剂，来完成透皮给予，其中上述载体对皮肤是无毒的，并且便于将供全身吸收的至少一些活性组分经由皮肤递送到血流。载体可以采取任何数目的形式如乳膏剂和软膏剂、糊剂、凝胶剂、和闭塞装置。乳膏剂和软膏剂可以是粘性液体或水包油或油包水型的半固体乳液。由分散在石油或亲水性石油（包含活性组分）中的吸收性散剂构成的糊剂也可以是适宜的。各种闭塞装置可以用来将活性组分释放到血流中如半渗透膜，其覆盖包含活性组分（有或没有载体）的储器，或覆盖包含活性组分的基质。

栓剂剂型可以制备自传统材料，包括可可脂，并且添加或没有添加蜡以改变栓剂的熔点，和甘油。还可以使用水溶性栓剂基质，如各种分子量的聚乙二醇。

用于产生各种剂型的材料和方法在本领域中是已知的，并且可以适合于实施本发明。

包胶剂

在一些实施方式中，本发明提供的组合物包括一种或多种包胶剂（囊封剂，encapsulating agent）。一般而言，包胶剂可以是任何生理耐受剂，其可以用来包埋实体如结合物或部分。“包埋的”是指，包胶剂可以包围或封闭实体，或"包埋的"实体可以部分或全部地被埋置在包含包胶剂的材料内。

在一些实施方式中，包胶剂是部分(如治疗部分)的一部分，以及赖氨酸减少的氯毒素多肽结合于包胶剂。在一些这样的实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽结合于包胶剂的外表面。在一些这样的实施方式中，赖氨酸减少的氯毒素多肽暴露于包胶剂的外部的环境。赖氨酸减少的氯毒素多肽可以通过直接相互作用(其可以是非共价或共价的)来结合于包胶剂，或它可以经由接头来结合于包胶剂。

在一些实施方式中，通过包胶剂来封闭包含赖氨酸减少的氯毒素多肽和部分(例如，治疗部分)的结合物。可以将结合物部分或全部地封闭在由包胶剂限定和/或产生的空间或环境(例如，水环境)内。在一些实施方式中，将结合物至少部分地埋置在包胶剂内。例如，如果包胶剂包含脂质膜，则可以将结合物至少部分地埋置在膜中的脂质分子内或脂质分子之间。在一些实施方式中，将结合物全部埋置在包胶剂内。

各种类型的包胶剂在本领域中是已知的，如同利用上述包胶剂来包埋药物、生物分子等的方法是已知的。在某些实施方式中，包胶剂包含具有核心和表面的小颗粒。这样的包胶剂包括但不限于脂质体、胶束、微颗粒、纳米颗粒等。

脂质体通常为大约球形双层结构或囊泡并且由天然或合成的磷脂膜构成。脂质体可以进一步包含其它膜成分如胆固醇和蛋白质。脂质体的内部核心通常包含水溶液。可以将治疗剂和/或结合物溶解于水溶液。如前面提到的，可以将治疗剂和结合物埋置在脂质体的膜内。脂质体可以尤其用于递送制剂如核酸试剂(如上文描述的那些核酸试剂)，包括抑制性RNA如siRNA。

胶束类似于脂质体，不同之处在于它们通常形成自磷脂的单层并且缺少内部水溶液。按照本发明，也可以使用被制备成包括内部水溶液的反胶束。

在一些实施方式中，颗粒是微颗粒，其至少一个尺寸平均为小于约1μm。例如，颗粒的最小尺寸可以平均为约100nm、约120nm、约140nm、约160nm、约180nm、约200nm、约220nm、约240nm、约260nm、约280nm、约300nm、约320nm、约340nm、约360nm、约380nm、约400nm、约420nm、约440nm、约460nm、约480nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm、约850nm、约900nm、或约950nm。

在一些实施方式中，颗粒是纳米颗粒，其至少一个尺寸平均为小于约100μm。例如，颗粒的最小尺寸可以平均为约1nm、约2nm、约3nm、约4nm、约5nm、约6nm、约7nm、约8nm、约9nm、约10nm、约11nm、约12nm、约13nm、约14nm、约15nm、约16nm、约17nm、约18nm、约19nm、约20nm、约22nm、约24nm、约26nm、约28nm、约30nm、约32nm、约34nm、约36nm、约38nm、约40nm、约42nm、约44nm、约46nm、约48nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm、约75nm、约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、或约99nm。

在一些实施方式中，颗粒的核心包含具有磁共振活性的材料，其在诊断和/或治疗应用中可以是有利的。具有磁共振活性的材料包括金属和它们的氧化物，如包含铝、钴、铟、铁、铜、锗、锰、镍、锡、钛、钯、铂、硒、硅、银、锌等的金属。

在一些实施方式中，治疗剂包含核酸。可以将核酸全部封闭在包胶剂内。在一些实施方式中，将核酸试剂埋置在包胶剂内。例如，包胶剂可以是脂质体并且可以将核酸试剂封闭在脂质体内。可以将核酸试剂至少部分地埋置（embed）在脂质体的脂质分子内。

药物包或试剂盒

在另一个方面，本发明提供了药物包或试剂盒，该药物包或试剂盒包括一个或多个容器(例如，小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶)，其包含如本文描述的药物组合物的一种或多种成分，从而允许给予本发明的氯毒素结合物。

IV.使用氯毒素结合物的方法

在某些实施方式中，提供了方法，该方法包括以下步骤：将包含如本文描述的氯毒素结合物的组合物给予患有或怀疑患有肿瘤的个体，以致结合物特异性地结合于肿瘤。在一些实施方式中，上述方法可用于癌症的治疗和/或诊断。在一些实施方式中，上述方法可用于降低以下可能性：个体将发展肿瘤；在个体中的一个或多个肿瘤将增加尺寸；在个体中的一个或多个肿瘤将转移；和/或癌症将进展（通过任何其它措施(如临床分期)）。

在某些实施方式中，提供了方法，该方法包括以下步骤：将包含如本文描述的氯毒素结合物的组合物给予患有或怀疑患有疾病或病症的个体，上述疾病或病症的特点在于异常的血管生成，以致氯毒素结合物降低血管生成的程度。在一些实施方式中，氯毒素结合物防止新生血管的形式。在一些实施方式中，氯毒素结合物引起现有的（原有的，existing）新生血管消退（regress）。

A.剂量和给予

可以按照包括单剂量或在一段时间内的多个剂量的方案来给予根据本发明的组合物。

可以利用可有效实现预期的效果(例如，治疗、诊断等)的任何给予途径来给予氯毒素结合物、或其药物组合物。在本发明的某些实施方式中，全身递送氯毒素结合物(或其药物组合物)。典型的全身给予途径包括但不限于肌内途径、静脉内途径、肺途径、和口服途径。还可以，例如，通过输注或推注，或通过借助于上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔、粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收，来进行全身给予。在某些实施方式中，静脉内给予氯毒素结合物。

可替换地或另外地，还可以使用其它给予途径。在某些实施方式中，通过某种途径来给予氯毒素结合物，上述途径选自由静脉内途径、颅内途径(包括腔内途径)、肌内途径、瘤内途径、皮下途径、眼内途径、眼周途径、局部应用或它们的组合组成的组。

如下面所讨论的，可以期望在眼新血管形成疾病中降低血管生成的程度。在一些实施方式中，可以将氯毒素结合物递送到眼部。可以，例如，利用眼内和/或眼周途径如玻璃体内注射、球结膜下注射等来实现到眼部的递送。还可以，例如，利用滴眼剂，来实现氯毒素剂对眼部的局部应用。

眼给予途径可以特别用于眼新血管形成疾病如黄斑变性的治疗。

可以每日、每周(或以某些其它的多天间隔)一次或多次，或按照间歇性时间表，来给予。例如，可以基于每周，每天一次或多次给予组合物，时间为数周(例如，4-10周)。可替换地，可以每日给予组合物，时间为数天(例如，1-10天)，接着数天(例如，1-30天)没有给予，并重复上述周期给定次数(例如，2-10个周期)。在一些实施方式中，给予至少2、至少3、至少4、至少5、或至少6个剂量。在一些实施方式中，每周给予组合物，至少2周、3周、4周、5周、或6周。

可以以任何方便的方式、或以多种方式的任何组合，来进行给予，如通过注射(皮下、静脉内、肌内、腹腔内等)、口服、和/或腔内给予。

取决于给予途径，可以按照待治疗主体的器官功能、体重、或体表面积来计算有效剂量。按照在人临床试验中观测到的药物动力学数据，本领域技术人员可以容易地优化适当剂量。最后的剂量方案可以由主治医师确定，其中考虑到影响药物作用的各种因素，例如，药物的比活性、损伤的严重性、患者的响应性、患者的年龄、状况、体重、性别和饮食、任何目前感染的严重性、给予时间、是否使用伴随疗法、和其它临床因素。

典型剂量为约1.0pg/kg体重至约100mg/kg体重。(在本文中剂量表示为结合物的赖氨酸减少的氯毒素多肽部分的重量。)

例如，对于全身给予，典型的剂量为约100.0ng/kg体重至约10.0mg/kg体重。例如，在静脉内给予氯毒素结合物的某些实施方式中，制剂的剂量可以包括给予一个或多个剂量，其包含约0.001mg/kg至约5mg/kg，例如，约0.001mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约4mg/kg、约0.02mg/kg至约3mg/kg、约0.03mg/kg至约2mg/kg或约0.03mg/kg至约1.5mg/kg的氯毒素。例如，在一些实施方式中，可以给予一个或多个剂量的氯毒素结合物，各自包含约0.002mg/kg、约0.004mg/kg、约0.006mg/kg、约0.008mg/kg、约0.009mg/kg、约0.01mg/kg、约0.02mg/kg或大于0.02mg/kg的氯毒素。在一些实施方式中，可以给予一个或多个剂量的氯毒素结合物，各自包含约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.09mg/kg、约1.0mg/kg或大于1.0mg/kg的氯毒素。在一些实施方式中，可以给予一个或多个剂量的氯毒素结合物，各自包含约0.05mg/kg、约0.10mg/kg、约0.15mg/kg、约0.20mg/kg、约0.25mg/kg、约0.30mg/kg、约0.35mg/kg、约0.40mg/kg、约0.45mg/kg、约0.50mg/kg、约0.55mg/kg、约0.60mg/kg、约0.65mg/kg、约0.70mg/kg、约0.75mg/kg、约0.80mg/kg、约0.85mg/kg、约0.90mg/kg、约0.95mg/kg、约1.0mg/kg、或大于约1mg/kg的氯毒素。在其它实施方式中，可以给予一个或多个剂量的氯毒素结合物，各自包含约1.0mg/kg、约1.05mg/kg、约1.10mg/kg、约1.15mg/kg、约1.20mg/kg、约1.25mg/kg、约1.3mg/kg、约1.35mg/kg、约1.40mg/kg、约1.45mg/kg、约1.50mg/kg、或大于约1.50mg/kg的氯毒素。在这样的实施方式中，治疗可以包括给予单剂量的氯毒素结合物或给予2剂量、3剂量、4剂量、5剂量、6剂量或大于6剂量。可以以1天间隔、2天间隔、3天间隔、4天间隔、5天间隔、6天间隔、7天间隔、或大于7天的间隔(例如，10天、2周、或大于2周)来给予两个连续剂量。

关于经由微输注来直接给予至部位，典型的剂量为约1ng/kg体重至约1mg/kg体重。

在局部给予氯毒素结合物的某些实施方式中，尤其是在腔内给予脑部的情况下，结合物的剂量可以包括给予包含约0.01mg至约100mg的氯毒素多肽的一个或多个剂量，例如，约0.05至约50mg、约0.1mg至约25mg、约0.1mg至约10mg、约0.1mg至约5mg、或约0.1mg至约1.0mg。例如，在某些实施方式中，可以给予一个或多个剂量的氯毒素结合物，各自包含约1mg、约1.5mg、约2mg、约2.5mg、约3mg、约3.5mg、约4mg、约4.5mg或约5mg的赖氨酸减少的氯毒素多肽。在一些实施方式中，可以给予一个或多个剂量的氯毒素结合物，各自包含约0.1mg、约0.15mg、约0.2mg、约0.25mg、约0.3mg、约0.35mg、约0.4mg、约0.45mg、约0.5mg、约0.55mg、约0.6mg、约0.65mg、约0.7mg、约0.75mg、约0.8mg、约0.85mg、约0.9mg、约0.95mg或约1mg的赖氨酸减少的氯毒素多肽。在一些实施方式中，治疗可以包括给予单剂量的氯毒素结合物或给予2剂量、3剂量、4剂量、5剂量、6剂量或大于6剂量。可以以1天间隔、2天间隔、3天间隔、4天间隔、5天间隔、6天间隔、7天间隔、或大于7天的间隔(例如，10天、2周、或大于2周)来给予两个连续剂量。在一些实施方式中，给予多剂量，并且对于每个剂量，所给予的赖氨酸减少的氯毒素多肽的量是不相同的。例如，在一些实施方式中，可以将剂量从一个剂量调节(例如，逐步增加或降低)到另一个剂量，如由主治医生确定的。

应当明了，可以连同另外的疗法一起来采用本发明的药物组合物(即，可以在一种或多种所期望的治疗或医疗程序的同时、以前、或随后，给予根据本发明的治疗)。在这样的联合方案中所采用的疗法(治疗和/或程序)的特定组合将考虑到所期望的治疗和/或程序与待实现的所期望的疗效的相容性。

例如，可以连同其它方法（或程序）一起来采用本发明的方法和组合物，上述其它方法包括手术、放射疗法(例如，γ-辐射、质子束放射疗法、电子束放射疗法、质子疗法、短程治疗、和全身放射性同位素)、内分泌疗法、体温过高和冷冻疗法。

可替换地或另外，可以连同其它制剂一起来采用本发明的方法和组合物，减弱任何有害效应(例如，止吐药)，和/或连同其它认可的化疗药物一起来采用本发明的方法和组合物，上述其它认可的化疗药物包括但不限于烷基化药物(氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、异环磷酰胺)、抗代谢物(甲氨蝶呤)、嘌呤拮抗剂和嘧啶拮抗剂(6巯嘌呤、5氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他滨)、纺锤体毒物(长春碱、长春新碱、长春瑞滨、紫杉醇)、鬼臼毒素(依托泊苷、伊立替康、托泊替康)、抗生素(多柔比星、博来霉素、丝裂霉素)、亚硝基脲(卡莫司汀、洛莫司汀)、无机离子(顺铂、卡铂)、酶(天冬酰胺酶)、和激素(他莫昔芬、亮丙立德、氟他胺、和甲地孕酮)（仅举几例）。对于更新的癌症疗法的更全面的讨论，参见http:// www.cancer.gov/，FDA批准的肿瘤药物的清单参见http://www.fda.gov/cder/cancer/ druglistframe.htm，和The Merck Manual,Seventeenth Ed.1999，其全部内容以引用方式结合于本文。

还可以连同细胞毒性剂的一种或多种另外的组合（作为治疗方案的一部分）一起来采用本发明的方法和组合物。在一些实施方式中，细胞毒性剂的另外的组合选自：CHOPP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松、和丙卡巴肼)；CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、和泼尼松)；COP(环磷酰胺、长春新碱、和泼尼松)；CAP-BOP(环磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博来霉素、长春新碱、和泼尼松)；m-BACOD(甲氨蝶呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松、和亚叶酸)；ProMACE-MOPP(泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、氮芥、长春新碱、泼尼松、和丙卡巴肼)；ProMACE-CytaBOM(泼尼松、甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、阿糖胞苷、博来霉素、和长春新碱)；MACOP-B(甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、泼尼松、博来霉素、和亚叶酸)；MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松、和丙卡巴肼)；ABVD(阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春碱、和达卡巴嗪)；MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松和丙卡巴肼)，其和ABV(阿霉素/多柔比星、博来霉素、和长春碱)交替使用；MOPP(氮芥、长春新碱、泼尼松、和丙卡巴肼)，其和ABVD(阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春碱、和达卡巴嗪)交替使用；Ch1VPP(苯丁酸氮芥、长春碱、丙卡巴肼、和泼尼松)；IMVP-16(异环磷酰胺、甲氨蝶呤、和依托泊苷)；MIME(甲基-gag、异环磷酰胺、甲氨蝶呤、和依托泊苷)；DHAP(地塞米松、高剂量阿糖胞苷、和顺铂)；ESHAP(依托泊苷、甲泼尼龙、高剂量阿糖胞苷、和顺铂)；CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、泼尼松、和博来霉素)；CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷、和泼尼松)；CVP-1(环磷酰胺、长春新碱、和泼尼松)，ESHOP(依托泊苷、甲泼尼龙、高剂量阿糖胞苷、长春新碱和顺铂)；EPOCH(依托泊苷、长春新碱、和多柔比星，96小时，并具有推注剂量的环磷酰胺和口服的泼尼松)，ICE(异环磷酰胺、环磷酰胺、和依托泊苷)，CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、泼尼松、和博来霉素)，CHOP-B(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、泼尼松、和博来霉素)，CEPP-B(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、和博来霉素)，和P/DOCE(表柔比星或多柔比星、长春新碱、环磷酰胺、和泼尼松)。

B.指征

本发明的组合物和方法可以用于各种抗增生和/或抗血管生成用途（背景，context）以治疗和/或诊断疾病或病症。

1.抗增生用途（或背景）

在某些实施方式中，本发明的组合物和方法用来治疗和/或诊断涉及不受控细胞增殖的病症，如原发性和/或转移性癌症，和其它癌性病症。例如，本发明的组合物和方法可用于减小实体肿瘤的尺寸、抑制肿瘤生长或转移、治疗各种淋巴癌、和/或延长患有这些疾病的哺乳动物(包括人类)的存活时间。

根据本发明，可以治疗和/或诊断的癌症和癌性病症的实例包括但不限于,脑部和中枢神经系统的肿瘤(例如，脑膜、脑部、脊髓、脑神经和CNS的其它其它的肿瘤，如成胶质细胞瘤或髓母细胞瘤)；头和/或颈部癌症、乳腺肿瘤、循环系统的肿瘤(例如，心脏、纵隔和胸膜、和其它胸内器官、血管瘤、以及肿瘤相关血管组织)；血液和淋巴系统的肿瘤(例如，霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、艾滋病相关性淋巴瘤、恶性免疫增生性疾病、多发性骨髓瘤、恶性浆细胞肿瘤、淋巴样白血病、髓性白血病、急性或慢性淋巴细胞白血病、单核细胞白血病、特定细胞类型的其它白血病、未指定细胞类型的白血病、淋巴、造血和相关组织的未指定恶性肿瘤，如弥漫性大细胞性淋巴瘤、T细胞淋巴瘤或皮肤T细胞淋巴瘤)；排泄系统的肿瘤(例如，肾、肾盂、输尿管、膀胱、和其它泌尿器官)；胃肠道的肿瘤(例如，食管、胃、小肠、结肠、结肠直肠、直肠乙状结肠连接部、直肠、肛门、和肛管)；涉及肝和肝内胆管、胆囊、和胆道的其它部分、胰、和其它消化器官的肿瘤；口腔的肿瘤(例如，唇、舌、牙龈、口底、腭、腮腺、唾液腺、扁桃体、口咽、鼻咽、脓样窦、咽下部、和口腔的其它部位)；生殖系统的肿瘤(例如，阴门、阴道、子宫颈、子宫、卵巢、和与雌性生殖器有关的其它部位、胎盘、阴茎、前列腺、睾丸、和与雄性生殖器有关的其它部位)；呼吸道的肿瘤(例如，鼻腔、中耳、副鼻窦、喉、气管、支气管和肺，如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)；骨骼系统的肿瘤(例如，四肢的骨和关节软骨、骨关节软骨和其它部位)；皮肤的肿瘤(例如，皮肤的恶性黑素瘤、非黑素瘤皮肤癌、皮肤的基底细胞癌、皮肤的鳞状细胞癌、间皮瘤、卡波西肉瘤)；和涉及其它组织的肿瘤，包括周围神经和自主神经系统、结缔组织和软组织、腹膜后腔和腹膜、眼和胚外结构、甲状腺、肾上腺、和其它内分泌腺和相关结构，淋巴结的继发性和未指定恶性肿瘤，呼吸和消化系统的继发性恶性肿瘤和其它部位的继发性恶性肿瘤。

在一些实施方式中，肿瘤是皮肤黑色素瘤或眼内黑色素瘤。在一些实施方式中，肿瘤是转移性黑素瘤。在一些实施方式中，肿瘤是非小细胞肺癌。在一些实施方式中，肿瘤是结肠或结肠直肠癌。

在一些实施方式中，组合物和方法可用于治疗和/或诊断神经外胚层肿瘤。(参见，例如，美国专利号6,667,156，其全部内容以引用方式结合于本文。)在一些实施方式中，神经外胚层肿瘤是胶质瘤。(参见，例如，美国专利号5,905,027、6,028,174、6,319,891、6,429,187、和6,870,029、以及国际专利申请公开WO03/101475A2、WO09/021136A1、和WO2009/140599，各自的全部内容以引用方式结合于本文。)本发明的组合物和方法可以用于的胶质瘤的类型包括但不限于多形性胶质母细胞瘤(WHO(世卫组织)IV级)、间变型星形细胞瘤(WHO III级)、低级胶质瘤(WHO II级)、毛细胞型星形细胞瘤(WHO I级)、少突神经胶质瘤、神经节瘤、脑脊膜瘤、和室管膜瘤。在一些实施方式中，神经外胚层肿瘤选自由髓母细胞瘤、成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、黑素瘤、周围性原始神经外胚层肿瘤、肺的小细胞肺癌、尤因肉瘤、和在脑部中的脑转移瘤组成的组。

在本发明的某些实施方式中，组合物和方法用于肉瘤的治疗和/或诊断。在一些实施方式中，本发明的组合物和方法用于治疗和/或诊断膀胱癌、乳癌、慢性淋巴瘤白血病、头部和颈部癌症、子宫内膜癌、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、和前列腺癌。在一些实施方式中，肉瘤选自由前列腺癌或乳癌组成的组。(参见，例如，国际专利申请公开W003/101474A1、W003/10475A2、和WO 2009/140599，各自的全部内容以引用方式结合于本文。)在一些实施方式中，肉瘤是胰腺癌。

在本发明的某些实施方式中，组合物和方法可用于治疗和/或诊断骨髓增生性疾病(例如，骨髓起源的肿瘤)和/或淋巴细胞增生性疾病(例如，淋巴起源的肿瘤)。(参见，例如，国际专利申请公开W005/099774，其全部内容以引用方式结合于本文。)

本发明的组合物和方法可用于的骨髓增生性疾病的类型包括但不限于真性红细胞增多(PV)、自发性凝血细胞增多(ET)、原因不明性骨髓外化生(AMM)(还称作特发性骨髓纤维化(IMF))、和慢性髓细胞源性白血病(CML)。

在一些实施方式中，本发明的组合物和方法用来治疗和/或诊断淋巴细胞增生性疾病。在一些实施方式中，淋巴细胞增生性疾病是非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，淋巴细胞增生性疾病是B细胞肿瘤，如，例如，前体B细胞成淋巴细胞白血病/淋巴瘤或成熟B细胞肿瘤。成熟B细胞肿瘤的非限制性类型包括B细胞慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、多毛细胞白血病、结外边缘区B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、结性边缘区淋巴瘤、弥漫性大B细胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、浆细胞瘤、和浆细胞性骨髓瘤。

在一些实施方式中，本发明的组合物和方法用来治疗T细胞肿瘤。T细胞肿瘤的非限制性类型包括T细胞幼淋巴细胞白血病、T细胞大颗粒淋巴细胞白血病、NK细胞白血病、结外NK/T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿病、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、肠病型肠T细胞淋巴瘤、肝脾γ-δT细胞淋巴瘤、血管成免疫细胞性T细胞淋巴瘤、周围T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤、和成人T细胞淋巴瘤。

利用本发明的组合物和方法能够治疗的肿瘤可以是用其它化疗剂难治的。当在本文中用于提及肿瘤时，术语"难治的"是指，在用不同于本发明的组合物的至少一种化疗剂进行治疗以后，在这样的化疗剂治疗以后，肿瘤(和/或其转移灶)没有显示或仅显示弱抗增生反应(即，没有或仅弱抑制肿瘤生长)，即，用其它(优选标准的)化疗剂根本不能治疗或仅具有不令人满意的结果的肿瘤。在提及治疗难治肿瘤等的情况下，本发明应理解为不仅包括(i)其中在患者的治疗中一种或多种化疗剂已失败的肿瘤，而且包括(ii)通过其它方式，例如，活组织检查和培养（在有化疗剂存在的条件下），已显示为难治的肿瘤。

2.抗血管生成用途（或背景）

已表明氯毒素可以施加抗血管生成性能。参见，例如，国际专利申请公开W02009/117018，其全部内容以引用方式结合于本文。在某些实施方式中，本发明的组合物和方法用来治疗、诊断、和/或缓解疾病或病症，例如癌症(包括转移性癌症，如上所述)、眼新血管形成(如黄斑变性)、炎性疾病(如关节炎)等。在一些实施方式中，病症或疾病的特点在于脉络膜新生血管形成。上述病症或疾病的实例包括但不限于黄斑变性(包括湿性黄斑变性、年龄相关性黄斑变性等)、近视、眼外伤、弹性假黄色瘤、和它们的组合。

在年龄65和以上的美国人中，黄斑变性是视力丧失和视觉缺失的首要原因。通常以年龄相关形式发生黄斑变性(经常称作AMD或ARMD)，虽然也发生青少年黄斑变性。在AMD/ARMD中，斑（负责尖锐的、中央视觉的视网膜的部分）会变性。黄斑变性通常被诊断为干性(非新生血管性)或湿性(新生血管性)。

在干性黄斑变性中，微黄色斑点（称作玻璃疣）开始累积来自不断恶化组织（大部分围绕斑）的沉积物或碎屑。中央视力丧失通常逐步发生并且并不和在湿性黄斑变性中的视力丧失一样严重。

如"新生血管性"名称所提示的，湿性黄斑变性的特点在于例如，在斑中，异常生长的新血管。这样的新血管可以在视网膜下方生长，从而渗漏血液和液体。这样的渗漏可以引起对光敏感的视网膜细胞（其死亡并在中央视觉中产生盲点）的永久损害。可以将湿性黄斑变性进一步分成两类。在湿性黄斑变性的隐性形式中，在视网膜下方的新血管生长并不是明显的并且渗漏不太明显，通常导致较不严重的视力不足。在湿性黄斑变性的经典形式中，血管生长和伤疤具有在视网膜下方可以观测到的非常清楚的、界定的轮廓。经典的湿性黄斑变性还称作经典的脉络膜新生血管形成并且通常导致更严重的视力丧失。

鉴于血管生成在湿性黄斑变性（其包括许多AMD/ARMD病例）中的作用，本发明的组合物和方法可以用于治疗、诊断、和/或改善上述障碍。目前用于湿性黄斑变性的治疗方法涉及血管生成抑制剂如Lucentis^TM、Macugen^TM、和/或Visudyne^TM，可选地结合光动力疗法(PDT)，以将药物靶向特定细胞。光凝固术，其中高能量激光束用来在具有异常血管的视网膜的区域中产生小烧伤，也用来治疗湿性黄斑变性。

在一些实施方式中，将氯毒素结合物(或其药物组合物)给予患有湿性黄斑变性和/或年龄相关性黄斑变性的主体。在患有湿性黄斑变性的主体中，主体可以患有隐性或经典形式。在一些实施方式中，氯毒素结合物引起现有的新生血管的消退。在一些实施方式中，氯毒素结合物防止新血管的出现。在某些实施方式中，氯毒素结合物结合于用于湿性黄斑变性的其它治疗，如光凝固术，用其它血管生成抑制剂进行的治疗，光动力疗法等。

在一些实施方式中，连同一种或多种治疗方案（推荐用于治疗与血管生成有关的疾病、障碍、或病症）一起或作为治疗方案的一部分，来给予如本文描述的氯毒素剂。仅给出几个实例，用于治疗癌症的推荐方案可以参见网站，其具有URL www.cancer.gov，国家癌症研究所的网站。用于治疗黄斑变性的推荐方案可以参见网站，其具有URL www.mayoclinicorg/macular-degeneration/treatment.html。治疗方案可以包括化疗、手术、和/或放射疗法。

实施例

实施例1：赖氨酸减少的氯毒素多肽的合成

可以利用固相肽合成(SPPS)来合成具有如表1和表2所示的氨基酸序列SEQ IDNO.1-28的赖氨酸减少的氯毒素多肽。用接头来处理较小的、固体和多孔珠，借助接头，在合成期间将合成的多肽共价连接于珠。从而将新生多肽固定在固相上并在洗涤步骤中得到保留。

耦合（或连接，coupling）和去保护的反复循环用来产生具有序列SEQ ID NO:1-28的多肽。在耦合和去保护的每个循环中，将连接于固相的肽或多肽的自由N端胺耦合于单个氨基酸单位，该单个氨基酸单位在它的N端受到Fmoc（9H-芴-9-基甲氧基羰基）保护基团的保护。然后，在碱性条件下如在二甲基甲酰胺中的20%哌啶，对在生长的肽/多肽链上的此单位进行去保护，以产生新的N端胺，其可以在下一轮的耦合-去保护中连接于另外的氨基酸。

在已完成所有循环（根据需要）以后，利用三氟乙酸，从珠上切割多肽。

为了产生另外的赖氨酸减少的氯毒素多肽，按照表2，在赖氨酸处，通过聚乙二醇化，来修饰具有SEQ ID NO:1、11、12和13的氨基酸序列的多肽。

实施例2：测定赖氨酸减少的氯毒素多肽的结合活性

已表明，氯毒素选择性地结合于许多不同的肿瘤类型，包括U251胶质瘤细胞和PC3前列腺癌细胞。在本实施例中，如在实施例2中描述的所产生的赖氨酸减少的氯毒素多肽标记有生物素并测定结合活性。分别用U251胶质瘤细胞和PC3前列腺癌细胞（获自亚汇合细胞培养物）孵育每种生物素化的赖氨酸减少的氯毒素多肽。在孵育以后，利用商用试剂盒并按照制造商的指示，用抗生物素蛋白-HRP(辣根过氧化物酶)来染色细胞。氯毒素用作阳性染色对照，以及没有多肽的孵育反应用作阴性染色对照。具有氨基酸序列（和氯毒素的氨基酸序列相比其是不规则的（杂乱的，scrambled））的肽还可以用作阴性染色对照。阳性染色（如HRP的有色反应产物的存在所表明的）用作生物素化赖氨酸减少的氯毒素多肽的结合的指征。

然后，在竞争性结合测定中（其中未标记氯毒素用作竞争剂），测试(以标记形式)呈现结合于U251或PC3细胞的赖氨酸减少的氯毒素多肽。鉴定了这样的赖氨酸减少的氯毒素多肽，在有增加量的氯毒素存在的条件下，其呈现降低水平的结合。

为了量化结合的细胞的百分比，在用生物素化多肽孵育以后，使用耦合于荧光染料如FITC或德克萨斯红的抗生物素蛋白而不是抗生物素蛋白-HRP来染色细胞，然后通过FACS(荧光-活化细胞分选)来分析细胞。

实施例3：赖氨酸减少的氯毒素多肽的结合活性的另外的测定

进一步测定在实施例2中确定为与氯毒素竞争性地结合到U251和/或PC3细胞上的赖氨酸减少的氯毒素多肽与更广泛的细胞类型的结合活性，以获得更全面的结合分布。

表3列出细胞系和原代培养细胞，在与赖氨酸减少的氯毒素多肽的结合测定中，可以测试其任何一种或其任何组合。表3所列的细胞系和原代培养细胞包括来自人、大鼠、和小鼠的胶质瘤和非胶质瘤细胞系。

表3：可以对其测试结合的原代细胞和肿瘤细胞系

实施例4：单一赖氨酸氯毒素多肽与紫杉醇的结合

将在实施例1中合成的并在实施例2和/或3中可选测定结合的一种或多种单一赖氨酸氯毒素多肽结合（共轭）于紫杉醇，其本身是不溶于水的抗癌治疗剂。紫杉醇是有丝分裂抑制剂。

将赖氨酸减少的氯毒素多肽和在PBS中的紫杉醇-酯-接头羧基实体(例如，NHS/EEDQ)反应，然后孵育。通过高效液相色谱法(HPLC)和质谱法(MS)来分析来自纯化的最终产物的样品，以证实产生了单种结合物（或共轭物）。通过确定饱和浓度和溶出率来测试获得的结合物的水溶性。鉴定（或确定，identify）水溶性的结合物，供进一步分析（作为药物候选物）。

实施例5：赖氨酸减少的氯毒素多肽与吉西他滨的结合（或共轭）

如在实施例1中所描述的来合成没有赖氨酸残基的赖氨酸减少的氯毒素多肽(参见，例如，SEQ ID NO:2、5和6)并如实施例2和/或3描述的可选地测定结合。经由N端，将赖氨酸减少的氯毒素多肽结合于吉西他滨(Gemzar^TM)，一种核苷类似物。

实施例6：氯毒素结合物的体外结合测定

如在实施例2和3中描述的，可以单独测试来自实施例4和5的氯毒素结合物与肿瘤细胞系的结合（如针对赖氨酸减少的氯毒素多肽所描述的）。

实施例7：氯毒素结合物的体外细胞毒性测定

用表3所列的一种或多种细胞系，测试氯毒素结合物（获自实施例4和5并如在实施例6中所描述的可选地测试结合）的细胞毒性。通过在不同浓度的氯毒素结合物中进行孵育，将在培养物中的细胞暴露于氯毒素结合物。在暴露1.5小时以后，测量细胞生存力并计算活细胞的百分比与氯毒素结合物的摩尔浓度的曲线。为了比较，用单独的细胞毒性剂(例如，来自实施例4的紫杉醇或来自实施例5的替莫唑胺)分别孵育细胞，并计算针对生存力的类似的剂量反应曲线。

实施例8：氯毒素结合物的体内摄取

可以利用原位放射性标记肽(标记有¹³C、²H、或¹⁵N等)和/或放射性标记实体/部分进行的成像，纳米颗粒和磁共振成像，和/或近红外染料和生物光子成像，来评估本发明的氯毒素结合物的体内摄取。抗氯毒素多肽抗体也可以用来检测在组织中的摄取。

实施例9：赖氨酸减少的氯毒素多肽抑制细胞侵入的生物活性

利用Trans-well迁移测定来测试赖氨酸减少的氯毒素多肽(或其结合物)抑制肿瘤细胞的侵入的能力。在这种测定中，在有或没有赖氨酸减少的氯毒素多肽(或其结合物)存在的条件下，将肿瘤细胞平皿培养在trans-well的上室上，然后用生长因子如VEGF或PDGF来刺激细胞的迁移。在细胞培养基中孵育大约24小时以后，除去停留在trans-well过滤器的上侧上的非迁移细胞，然后染色在下侧上的迁移细胞，供可视化。将迁移细胞计数为侵入指数。与氯毒素具有类似生物活性的修饰的氯毒素变体被认为是保留功能活性。

实施例10：在体内乳癌肿瘤模型中的氯毒素结合物

用体内乳癌模型测试了氯毒素结合物的治疗活性。在此实施例中，通过将MDA-MB-468乳腺癌细胞异种移植到受体小鼠所产生的小鼠肿瘤模型用来测试在实施例4中产生的紫杉醇-氯毒素结合物对肿瘤生长的影响。

以3.7mg/kg的紫杉醇剂量静脉内注射忍受胁腹肿瘤的小鼠，每周三次，总共8个剂量。在这些实验中所使用的结合物的浓度是"亚治疗的"，这是因为，使用非结合紫杉醇的相同给药方案不足以具有疗效。一组小鼠仅注射盐水，作为对照。另一组小鼠的注射剂量为3.7mg/kg的紫杉醇。利用测径器来监测肿瘤生长，以在治疗间隔期间和以后测量肿瘤的长度和宽度。将肿瘤随时间的生长作图为原始肿瘤尺寸与时间的百分比。

其它实施方式

对于本领域技术人员来说，根据本文披露的本发明的说明或实施，本发明的其它实施方式将是显而易见的。上述说明和实施例仅是示例性的，而本发明的真正范围则由权利要求来限定。

Claims (39)

1.一种氯毒素多肽，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，对应于SEQ ID NO:1的位置15的残基不为赖氨酸，对应于SEQ ID NO:1的位置23的残基不为赖氨酸，除上述位置15和23外，所述氯毒素多肽的其它位置的残基与SEQ ID NO:1对应位置的残基相同，使得所述氯毒素多肽仅含一个赖氨酸，所述赖氨酸的位置对应于SEQ ID NO:1的位置27。

2.根据权利要求1中所述的氯毒素多肽，其中，对应于SEQ ID NO:1的位置15或位置23的至少一个氨基酸残基是丙氨酸或精氨酸。

3.根据权利要求1中所述的氯毒素多肽，缺少对应于SEQ ID NO:1的位置15或位置23的至少一个氨基酸。

4.根据权利要求1中所述的氯毒素多肽，其中所述氯毒素多肽包括至少一个共价修饰。

5.根据权利要求4所述的氯毒素多肽，其中所述的氯毒素多肽被共价修饰以包括以下至少一种基团：

PEG(聚乙二醇)基团、PEG二酸硫羟酸基团、马来酰亚胺酸基团、二肽间隔物基团、以及酰胺基团。

6.一种结合物，包含如前述任一权利要求所限定的至少一种氯毒素多肽，其中，所述氯毒素多肽与至少一个包含抗癌剂的治疗部分结合，其中，经由单一赖氨酸或经由所述氯毒素多肽的N端，所述治疗部分共价结合于所述氯毒素多肽。

7.根据权利要求6所述的结合物，其中，所述氯毒素多肽和所述治疗部分是直接或通过接头共价结合的。

8.根据权利要求6所述的结合物，其中，所述抗癌剂选自由以下组成的组：

BCNU、顺铂、吉西他滨、羟基脲、紫杉醇、替莫唑胺、托泊替康、氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱、丙卡巴肼、氨烯咪胺、六甲蜜胺、甲氨蝶呤、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨、喷司他丁、阿糖胞苷、阿扎胞苷、依托泊苷、替尼泊苷、伊立替康、多西他赛、多柔比星、柔红霉素、放线菌素D、伊达比星、普卡霉素、丝裂霉素、博来霉素、他莫昔芬、氟他胺、亮丙立德、戈舍瑞林、氨鲁米特、阿那曲唑、安吖啶、天冬酰胺酶、米托蒽醌、米托坦和氨磷汀。

9.根据权利要求6所述的结合物，其中，所述抗癌剂是由对癌细胞呈现差的选择性/特异性的抗癌剂、呈现癌细胞差的摄取的抗癌剂、在癌细胞中呈现差的保留的抗癌剂、呈现差的水溶性的抗癌剂、在癌细胞中经历过早失活的抗癌剂、在癌细胞中经历受损激活的抗癌剂、经历广泛的细胞降解的抗癌剂、以及伴有抗药性的抗癌剂组成的组中的成员。

10.根据权利要求9所述的结合物，其中，所述抗癌剂呈现差的水溶性。

11.根据权利要求6中所述的结合物，其中，所述抗癌剂是紫杉烷。

12.根据权利要求11中所述的结合物，其中，所述紫杉烷选自由紫杉醇以及多西他赛组成的组。

13.根据权利要求6所述的结合物，其中，所述治疗部分是由放射性同位素、前药激活酶、辐射敏化剂、核酸分子、超抗原、抗血管生成剂、烷化剂、嘌呤拮抗剂、嘧啶拮抗剂、植物生物碱、嵌入抗生素、芳香酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、生长因子抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、生物反应调节剂、抗激素、和抗雄激素药组成的组中的成员。

14.根据权利要求6所述的结合物，其中，所述治疗部分是酶。

15.根据权利要求6所述的结合物，其中，所述治疗部分是抗代谢物。

16.根据权利要求6所述的结合物，其中，所述治疗部分是细胞周期抑制剂。

17.根据权利要求13所述的结合物，其中，所述核酸分子包括酶RNA、RNA:DNA杂交体、三链DNA、ssRNA、dsRNA、tRNA、或mRNA。

18.根据权利要求13所述的结合物，其中，所述核酸分子包括DNA或rRNA。

19.根据权利要求6所述的结合物，其中，所述氯毒素多肽共价连接于包含聚合物的部分。

20.根据权利要求19所述的结合物，其中，所述聚合物是聚乙二醇。

21.根据权利要求20所述的结合物，其中，所述聚乙二醇经由所述氯毒素多肽的氨基端连接到所述氯毒素多肽。

22.一种药物组合物，包含有效量的至少一种根据权利要求6中所述的结合物、或其生理耐受盐，以及至少一种药用载体。

23.一种包含权利要求6中所述的结合物的组合物用于制造用于治疗以下各项的药物的用途：(a)患有或怀疑患有肿瘤的个体，以致所述结合物特异性地结合于所述肿瘤，所述肿瘤为神经外胚层肿瘤或选自由前列腺癌、乳癌、皮肤黑素瘤或眼内黑素瘤、转移性肿瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、结肠直肠癌以及胰腺癌组成的组，或(b)患有或怀疑患有疾病或病症的个体，以致所述氯毒素结合物降低血管生成的程度，其中所述疾病或病症的特点在于异常的血管生成。

24.根据权利要求23所述用途，其中，所述肿瘤是神经外胚层肿瘤、和胶质瘤，所述神经外胚层肿瘤选自由髓母细胞瘤、成神经细胞瘤、嗜铬细胞瘤、黑素瘤、周围性原始神经外胚层肿瘤、小细胞肺癌、尤因肉瘤、脑转移瘤组成的组。

25.根据权利要求24所述用途，其中，所述胶质瘤选自由多形性胶质母细胞瘤、间变型星形细胞瘤、低级胶质瘤、毛细胞型星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、神经节瘤、脑脊膜瘤、和室管膜瘤组成的组。

26.根据权利要求23所述的用途，其中，所述肿瘤选自由前列腺癌、乳癌、皮肤黑素瘤或眼内黑素瘤、转移性肿瘤、非小细胞肺癌、结肠癌、结肠直肠癌以及胰腺癌组成的组。

27.根据权利要求26所述的用途，其中，所述转移性肿瘤是转移性黑素瘤。

28.根据权利要求23所述的用途，其中，所述氯毒素结合物防止新生血管的形成，或引起现有的新生血管消退。

29.根据权利要求23所述的用途，其中，所述疾病或病症是黄斑变性或炎性疾病。

30.根据权利要求29所述的用途，其中，所述炎性疾病是类风湿性关节炎。

31.一种包含根据权利要求1中所述的至少一种氯毒素多肽的结合物，其中所述氯毒素多肽与至少一种可检测部分或靶向部分结合，其中经由单一赖氨酸或经由所述氯毒素多肽的N端，所述可检测部分或靶向部分与所述氯毒素多肽共价结合。

32.根据权利要求31所述的结合物，其中所述氯毒素多肽和所述可检测部分或靶向部分直接地或通过接头共价地结合。

33.根据权利要求31所述的结合物，其中所述可检测部分选自由以下组成的列表：

配体、放射性核素、荧光染料、化学发光剂、生物发光剂、量子点、微颗粒、金属纳米颗粒、纳米簇、顺磁性金属离子、酶、比色标记、生物素、异羟洋地黄毒甙元、以及半抗原。

34.根据权利要求33所述的结合物，其中所述放射性核素选自由以下组成的组：

碘-131(¹³¹I)、碘-125(¹²⁵I)、铋-212(²¹²Bi)、铋-213(²¹³Bi)、砹-211(²¹¹At)、铜-67(⁶⁷Cu)、铜-64(⁶⁴Cu)、铼-186(¹⁸⁶Re)、铼-188(¹⁸⁸Re)、磷-32(³²P)、钐-153(¹⁵³Sm)、镥-177(¹⁷⁷Lu)、锝-99m(^99mTc)、镓-67(⁶⁷Ga)、铟-111(¹¹¹In)、以及铊-201(²⁰¹Tl)。

35.根据权利要求33所述的结合物，其中所述顺磁性金属选自由以下组成的组：

钆III(Gd³⁺)、铬III(Cr³⁺)、镝III(Dy³⁺)、铁III(Fe³⁺)、锰II(Mn²⁺)、和镱III(Yb³⁺)。

36.根据权利要求31所述的结合物，其中所述靶向部分包括抗体或抗体片段。

37.一种根据权利要求31中所述的结合物的用途，用于制造用于使组织成像的药物。

38.一种根据权利要求31中所述的结合物的用途，用于制造用于检测受试者体内癌症的药物。

39.根据权利要求38所述的用途，其中所述药物用于在手术期间检测肿瘤。