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JP3653093B2 - 人化抗体 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は，マウスモノクローナル抗体L243によって認識されるエピトープに対して特異性を有する人化抗体，上記抗体の製造方法，上記抗体を含有する医薬組成物，および上記抗体の医学的使用に関する．
人化抗体分子の語は，非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有する分子であって，その分子の残りの免疫グロブリン由来部分はヒト免疫グロブリンから誘導される分子を記述するのに用いられる．抗原結合部位は，ヒト定常部ドメインに融合された完全可変部であっても，また可変部ドメイン中の適当なヒトフレームワーク領域にグラフトされた相補性決定領域（CDR）のみであってもよい．
発明の背景
ゲノムの主要組織適合性複合系領域にコードされたタンパク質は免疫学的認識の多くの局面に関与している．すべての哺乳動物そして多分すべての脊椎動物が基本的には同等なMHC系を有し，免疫応答遺伝子はMHCに連結していることが知られている．
ヒトでは，主要組織適合性複合系は，染色体６上のHLA遺伝子集団である．主要な領域はD,B,C,およびＡである.D領域は，免疫系の細胞間の協調ならびに相互作用に関与するクラスIIタンパク質の遺伝子を含有する．多くの疾患がHLA遺伝子集団のＤ領域に関連することが見出されてきた．現在までの研究で，大部分の自己免疫疾患を含めて著しく多様な疾患との関連が明らかにされている（たとえば，欧州特許第68790号参照）．欧州特許第68790号には，ヒトにおいて,HLA−Ｄ領域のようなMHCのある種の領域の特定の対立遺伝子に関連する疾患を,MHC−クラスII抗原に特異的なモノクローナル抗体によって制御される免疫応答（単数または複数）を選択的に抑制することによる制御が示唆されている．
L243は，インビトロで免疫機能のとくに強力な抑制を示し，すべてのHLA−DRに対し単形性であることから，自己免疫疾患のような疾病の処置にとくに有用であろうと考えられるマウスIgG2A抗−HLA DR抗体である．
最も利用しやすいモノクローナル抗体は齧歯類起源の抗体であるが，それらは本来，ヒトには抗原性を示し，したがってHAMA（ヒト抗−マウス抗体）応答と呼ばれる望ましくない免疫応答を生じることがある．そのため，ヒトの治療剤としての齧歯類モノクローナル抗体の使用には，ヒト対象がその抗体に対して免疫応答を装備しそれを完全に排除するかまたは少なくともその効果を減弱するという事実による固有の限界がある．
これまで，ヒトにおいて抗原性の低い非ヒトMabを作成する多くの提案がなされてきた．このような技術は総称して「人化」技術と呼ぶことができる．これらの技術には一般に，抗体分子のポリペプチド鎖をコードするDNA配列を操作する組み換えDNA技術が包含される．簡単な形の人化にはマウス抗体の定常部のヒト抗体からの定常部による置換がある［Murrisonら（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81 6851−55;Whittleら（1987）Prot.Eng.1 499−505］．キメラ抗体に対するHAMA応答レベルの低下から，抗原結合部位の外側の可変部をさらに人化することによりこれらの領域に対する応答を排除して有害な応答をさらに減弱できる可能性が期待される．
抗体のさらに複雑な形の人化にはマウス抗体の結合部位を構成するアミノ酸をヒト抗体可変部のフレームワーク中に挿入するような可変部ドメインの再設計が含まれる．人化には多くのクラスにおける全抗原結合性の再構築が考慮されるに至っている［Coら（1990）J.Immunol.148 1149−1154;Coら（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 2869−2873およびCarterら（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89 4285−4289およびRoutledgeら（1990）Eur.J.Immunol.21 2717−2725ならびに国際特許明細書WO91/09967;WO91/09968およびWO92/11383］．
したがって,L243の人化はヒトにおける免疫原性の低下を招来し，従来ヒトにおけるマウス抗体の使用に際して考慮されてきたHAMA応答の可能性という問題が克服されることが予測できる．
本発明者らは今回，マウスモノクローナル抗体L243によって認識されるエピトープに対して特異性を有する組み換え抗体分子を調製した．
発明の要約
第一の態様によれば，本発明はDRα鎖に依存する抗原決定基に対して特異性を有する組み換え抗体分子を提供する．
組み換え抗体分子の語は組み換えDNA技術を用いて製造される抗体を意味して用いられる．この抗体は好ましくは人化抗体たとえばキメラまたはCDRグラフト抗体である．
第一の態様の好ましい実施態様においては，本発明はマウスモノクローナル抗体L243によって認識されるエピトープに対して特異性を有する組み換え抗体分子を提供する．
本発明の第一の態様の好ましい実施態様においては，マウスモノクローナル抗体L243によって認識されるエピトープに対して特異性を有する人化抗体分子であって，可変部ドメインの少なくとも１個の相補性決定領域（CDR）がマウスモノクローナル抗体L243（Mab L243）に由来し人化抗体分子の残りの免疫グロブリン誘導部分はヒト免疫グロブリンまたはその類縁体から誘導される抗原結合部位を有し，上記人化抗体分子はエフェクターまたはレポーター分子と接合していてもよい人化抗体分子を提供する．
人化抗体分子はキメラ人化抗体から構成されてもまたCDRグラフト人化抗体であってもよい．人化抗体分子がCDRグラフト人化抗体からなる場合は，重鎖および／または軽鎖可変部ドメインは１個または２個のみがMab L243由来のCDRから構成されてもよいが，好ましくは３個すべての重鎖および軽鎖CDRがMab L243から誘導される．
上述のようにL243は以前にLampson ＆ Levy［J.Immunol.（1980）125,293］により報告されたモノクローナル抗体である．この抗体の軽鎖および重鎖可変部のアミノ酸配列は以下の図１および２に示す.L243はAmerican Type Culture Collection,Rockville,Maryland,USAに受入番号ATCC HB55として寄託されている．
発明の詳細な説明
本発明の人化抗体はそれにエフェクターまたはレポーター分子が結合していてもよい．たとえば，重金属原子をキレートするための巨大環状分子またはトキシンたとえばリシンが共有結合架橋構造によって人化抗体に結合していてもよい．また，組み換えDNA技術の操作を用いて，完全抗体分子のFcフラグメント,CH3もしくはCH2ドメインが機能性非免疫グロブリンタンパク質たとえば酵素またはトキシン分子によって置換されているかまたはペプチド結合によってそれに結合している人化抗体分子を製造することもできる．
本発明の人化抗体は，完全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子；そのフラグメントたとえばFab,Fab',（Fab'）2,もしくはFvフラグメント；単一鎖抗体フラグメントたとえば単一鎖Fv,軽鎖もしくは重鎖モノマーもしくはダイマー;2,3,4もしくはそれ以上の抗体もしくはそれらのフラグメントからなり，それらが連結構造によって互いに結合してなる多価のモノ特異的抗原結合タンパク質；またはこれらのいずれかもしくはMab L243と同一の特異性を有する他の分子のフラグメントもしくは類縁体から構成されることができる．
好ましい実施態様においては，抗体は完全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子からなる．
人化抗体分子の残りの非L243免疫グロブリン由来部分は任意の適当なヒト免疫グロブリンから誘導することができる．たとえば，人化抗体分子がCDRグラフト人化抗体分子である場合は，抗原結合領域が誘導されるドナー抗体のクラス／タイプを考慮して適当な可変部フレームワーク配列を使用することができる．用いられるヒト−フレームワークの種類はドナー抗体と同一／類似のクラス／タイプのものであることが好ましい．フレームワークは，とくにCDRと空間的に近接するかまたは隣接した位置でドナー抗体配列との相同性が最大／至適になるように選択されるのが有利である.CDRグラフト抗体の構築に使用できるヒトフレームワークの例には.LAY,POM,TUR,TEI,KOL,NEWM,REIおよびEUがあり，たとえば重鎖にKOLおよびNEWM,軽鎖にREIまたは重鎖および軽鎖の両者にEUが用いられる．
適当なヒトフレームワークの選択のための別の操作には，非ヒトフレームワークの軽鎖のフレームワーク領域を,Kabatら（1991）［Sequences of Proteins of Immunological Interest,5版］によって同定された４つのヒト軽鎖サブグループのフレームワーク領域とアラインさせる操作が包含される．非ヒト抗体軽鎖に最も相同な軽鎖サブグループについてのコンセンサス配列が選択される．
非ヒト抗体とコンセンサスヒトグループ軽鎖配列のフレームワーク残基の間の差を，公開国際特許出願WO91/09967号に記載されているようにして，それらがもつ抗原結合への寄与の可能性について分析する．この分析に基づいて，同定された残基の一部またはすべてを変化させることができる．非ヒト重鎖CDRを容認する適当なフレームワークの選択についても同じ操作が行われる．
L243CDRグラフト軽鎖を構築するためにはヒトサブグループ１コンセンサス配列がとくに適していることが見出され，またL243グラフト重鎖の構築にもヒトサブグループ１コンセンサス配列がとくに適当であることが見出された．
人化抗体分子の軽鎖または重鎖可変部ドメインは必要に応じて，ヒト軽鎖または重鎖定常部ドメインに融合させることができる（本明細書において用いられる「重鎖定常部ドメイン」の語はとくに指示のない限り，ヒンジ部を包含すると理解すべきである）．人化抗体分子のヒト定常部ドメインは，存在する場合には，その抗体に提案される機能とくに必要なエフェクター機能の欠如を考慮して選択することができる．たとえば，重鎖可変部に融合させる重鎖定常部ドメインは，ヒトIgA,IgGまたはIgMドメインとすることができる．好ましくはヒトIgGドメインが使用される．軽鎖可変部に融合させることができる軽鎖ヒト定常部ドメインには，ヒトλまたはヒトκ鎖が包含される．
ヒト定常部ドメインの類縁体も代替として有利に使用できる．これらには，相当するヒトドメインよりも１個または２個以上多い付加アミノ酸を含有する定常部ドメインまたはヒトドメインに存在するアミノ酸の１個または２個以上を欠失または変化させた定常部ドメインが包含される．このようなドメインはたとえばオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発によって得られる．
人化抗体分子の残部はヒト免疫グロブリンからのタンパク質配列のみで構成される必要はない．たとえばヒト免疫グロブリン鎖の部分をコードするDNA配列がポリペプチドエフェクターまたはレポーター分子のアミノ酸配列をコードするDNA配列に融合されている遺伝子を構築することができる．
本発明者らは,L243抗体のCH2ドメインのＮ−末端領域における１個または２個以上の残基を修飾することにより，変化前の抗体に比較して補体結合能の変化した抗体が産生されることを見出した．
変化させることが好ましいアミノ酸残基はアミノ酸位置231〜239,好ましくはアミノ酸位置234〜239にある．
とくに好ましい実施態様においては，変化させるアミノ酸残基はLeu 235および／またはGly 237である．
抗体が補体を結合する能力に関連して用いられた場合の本明細書で使用される「変化」の語は通常，出発した無変化抗体に比較して抗体の補体結合能が低下することを指示する．変化させる適当なアミノ酸を選択することにより，たとえば残基Leu 235を変化させることにより，その補体結合能が実質的に低下した抗体を製造することが可能である．たとえばアミノ酸残基Gly 237を変化させることにより，無変化抗体に比較して中程度の補体結合能を有する抗体を製造することも可能である．
本明細書で用いられる補体結合を「実質的に」低下させるの句は，ヒト補体結合が野生型抗体に認められるレベルの好ましくは≦30％，さらに好ましくは≦20％，とくに好ましくは≦10％であることを意味する．
CH2ドメインのＮ−末端領域における１個または２個以上のアミノ酸残基の変化により，好ましくは抗体はFcR Iには有意に結合せず,FcR III受容体に結合するようになる．
本明細書で用いられる残基のナンバーリングは,Kabatら［（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest,5版,United States Department of Health and Hnman Services］に記載のEuインデックスに従う．
位置235におけるロイシンのグルタミン酸またはアラニンによる置換の変化はインビトロで最小毒性を示す強力な免疫抑制L243抗体の製造にとくに有効であることが見出された．
位置237におけるグリシンのアラニンによる置換の変化は中等度の補体結合能を有する抗体，すなわち補体結合レベルが野生型抗体に認められるレベルのほぼ15〜80％，好ましくは20〜60％，とくに好ましくは20〜40％の抗体を産生することが見出された．
残基（単数または複数）は，本明細書に記載したのと類似の方法を用いて，たとえばその側鎖に不適当な機能を有する他のアミノ酸残基またはアミノ酸誘導体によって置換することができた．これはたとえば，その側鎖の荷電および／または極性を変化させることによって達成できる．
FcR I結合に関して用いられる「有意に」の語はFcR Iに対する抗体の結合が通常，無変化抗体に認められるレベルの≦20％，とくに好ましくは≦10％であることを意味する．
本発明の抗体をコードするDNA配列の調製には分子生物学の標準技術が使用できる．所望のDNA配列は，オリゴヌクレオチド合成技術を用いて完全にまたは部分的に合成することができる．必要の応じて，部位特異的突然変異誘発およびポリメラーゼチェーン反応（PCR）技術を使用することもできる．
適当な方法には，たとえば,"PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification"（1989）,H.A.Erlich編,Stockholm Press,N.Y.and Londonに記載されているようなPCRストランド重複操作およびPCR突然変異誘発ならびにオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発［Kramerら,Nucl.Acid.Res.12 9441（1984）］が包含される．適当な技術は公開欧州特許EP307434Bにも開示されている．
補体結合能が変化した改変L243は，たとえば235のような残基の欠失，またはたとえば分子内の適当な位置へのグリコシル化部位の挿入によって製造できる．このような技術は本技術分野においてよく知られていて，たとえば公開欧州特許出願EP−307434の教示を参照されたい．
改変L243はまた，イソタイプの異なる抗体の低位ヒンジ部を交換することによって製造することもできる．たとえば,G1/G2低位ヒンジ部の交換では補体結合が排除される．
G1/G2低位ヒンジ部の交換においては,CH2ドメインのＮ−末端領域の231〜238領域における残基が変化した抗体を生じる．この場合,1個または２個以上の残基が変化または欠失する．
本発明の第二の態様によれば，本発明の第一の態様の人化抗体を製造する方法において，
ａ）可変部ドメインの少なくとも１個のCDRがL243 Mabに由来し，その抗体鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分はヒト免疫グロブリンから誘導される可変ドメインからなる抗体重鎖または軽鎖をコードするDNA配列を有するオペロンを発現ベクター内に製造し，
ｂ）可変部ドメインの少なくとも１個のCDRがMab L243に由来し，その抗体鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分はヒト免疫グロブリンから誘導される可変ドメインからなる相補性抗体軽鎖または重鎖をコードするDNA配列を有するオペロンを発現ベクター内に製造し，
ｃ）両オペロンで宿主細胞をトランスフェクトし，
ｄ）トランスフェクトされた細胞系を培養して人化抗体分子を産生させる，ことからなる方法を提供する．
本発明のこの態様の好ましい実施態様においては，少なくとも１個の発現ベクターは，その抗体のCH2ドメインのＮ−末端領域の１個または２個以上のアミノ酸残基が相当する無変化抗体におけるアミノ酸残基から変化している抗体重鎖をコードするDNA配列を含有する．
CH2ドメインのＮ−末端領域における変化は，全非修飾抗体が発現されたのちに，部位特異的突然変異誘発のような技術を用いて作成されてもよい．
細胞系は，軽鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含有する第一のベクターおよび重鎖由来のポリペプチドをコードするオペロンを含有する第二のベクターの２つのベクターによってトランスフェクトすることができる．これらのベクターは，コード配列および選択マーカーに関する部分を除いて，各ポリペプチド鎖が可能な限り同等に発現されることを保証するために，同一であることが好ましい．
別法として，軽鎖および重鎖由来のポリペプチドの両者および選択マーカーをコードするオペロンを包含する単一のベクターを使用することもできる．
CH2ドメインのＮ−末端領域における変化，たとえば分子のCH2ドメインの位置235における変化は，人化の任意の便利な段階で，たとえばCDRグラフト過程で導入することができる．それは可変部ドメインが重鎖にグラフトされたのちに導入するのが便利である．
さらに他の態様においては，本発明はまた，本発明の抗体の重鎖および軽鎖をコードするDNA配列，これらのDNA配列を含有するクローニングおよび発現ベクター，これらのDNA配列でトランスフォームされた宿主細胞，ならびにこれらのDNA配列をトランスフォームされた宿主細胞内で発現させることからなる重鎖または軽鎖および抗体分子の製造方法を包含する．
ベクターを構築する一般方法としてはトランスフェクション法および培養法がそれ自体よく知られている［たとえばManiatisら（1982）Molecular Cloning,Cold Spring Harbor,New YorkおよびPrimrose ＆ Old（1980）Principles of Gene Manipulation,Blackwell,Oxfordならびに以下の実施例参照］．
L243軽鎖および重鎖可変部ドメインのアミノ酸配列をコードするDNA配列（および相当する推定アミノ酸配列）はそれぞれ以下の図１および２に示す．
ヒト免疫グロブリン配列をコードするDNAは任意の適当な方法で得ることができる．たとえばLAY,POM,KOL,REI,EU,TUR,TEIおよびNEWMのような好ましいヒトアクセプターフレームワークのアミノ酸配列は本技術分野の研究者には広く利用可能である．同様にヒト軽鎖および重鎖サブグループに対するコンセンサス配列も本技術分野の研究者には利用可能である．
CDRグラフト生成物をコードするDNA配列の調製には分子生物学の標準的技術が使用できる．所望のDNA配列はオリゴヌクレオチド合成技術を用いて完全にまたは部分的に合成することができる．必要に応じて，部位特異的突然変異誘発およびポリメラーゼチェーン反応（PCR）技術を用いることもできる．たとえばオリゴヌクレオチド特異的合成［Jonesら（1986）Nature 321 522−525］，また予め存在する可変部ドメイン領域のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発［Verhoeyenら（1988）Science 239 1534−1536およびReichmannら（1988）Nature 332 323−327］を使用することができる．
ギャップを有するオリゴヌクレオチドのT4DNAポリメラーゼを用いる酵素的充填［Queenら（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 10029−10033;国際特許出願WO90/07861］を使用することもできる．
キメラまたはCDRグラフト重鎖および軽鎖をコードするDNA配列の発現には任意の適当な宿主細胞／ベクター系が使用できる．細菌たとえば大腸菌および他の微生物系は，抗体フラグメントたとえばFv,FabおよびFab'フラグメントならびに単一鎖抗体フラグメントたとえば単一鎖Fvの発現にとくに有利に使用できる．真核細胞たとえば哺乳動物宿主細胞発現系も本発明の抗体を得るために，とくに大きなキメラまたはCDRグラフト抗体生成物の製造に使用することができる．適当な哺乳動物宿主細胞としては,COS細胞およびCHO細胞［Bebbington CRら（1991）Methods 2 136−145］，ならびに骨髄腫またはハイブリドーマ細胞系たとえばNSO細胞［Bebbington CRら（1992）Bio/Technology 10 169−175］がある.CHO細胞の使用はとくに好ましい．
本発明の人化抗体は，重鎖および軽鎖可変部ドメインが,Mab L243の全可変部ドメイン，またMab L243のCDRの１つ，一部もしくはすべてがグラフトされたヒト可変部ドメインのフレームワーク領域のいずれで構成されていてもよい．すなわち，人化抗体はキメラ人化抗体またはCDRグラフト人化抗体とすることができる．
人化抗体分子がCDRグラフト人化抗体である場合には,CDRに加えて，特定の可変部フレームワーク残基が非ヒトすなわちL243マウス残基に相当するように変化させることができる．本発明のCDRグラフト人化抗体には，好ましくは，本発明者らの国際特許明細書WO−Ａ−91/09967において定義されたCDRグラフト人化抗体が包含される.WO−Ａ−91/09967における開示は引用により本明細書に導入される．
好ましくは，重鎖のCDRは,CDR1（31〜35）,CDR2（59〜65）およびCDR3（95〜102）のすべてにおいてL243残基に相当する．好ましくは，軽鎖のCDRは,CDR1（24〜34）,CDR2（50〜56）およびCDR3（89〜97）のすべてにおいてL243残基に相当する．これに加えて，重鎖は残基27,67,69,71,72および75の１つまたは２つ以上でマウスL243残基をもっていてもよい．同様に，軽鎖は残基45,49,70および71の１つまたは２つ以上でマウスL243残基をもっていてもよい．
本発明はさらに，ヒトサブグループコンセンサス配列１およびL243ドナー抗原結合部位から誘導されるアクセプターフレームワークからなる可変部ドメインを有し，この場合フレームワークは位置27,67,69,71,72および75の１つまたは２つ以上でL243ドナー残基からなるCDRグラフト人化抗体重鎖を提供する．
本発明はさらに，ヒトサブグループコンセンサス配列１およびL243ドナー抗原結合部位から誘導されるアクセプターフレームワークからなる可変部ドメインを有し，この場合フレームワークは位置45,49,70および71の１つまたは２つ以上でL243ドナー残基からなるCDRグラフト人化抗体軽鎖を提供する．
重鎖はさらにマウスL243残基を，残基2,9,11,16,17,20,38,43,46,80,81,82,82a,82b,83,84,89,91,108および109の１つまたは２つ以上にもっていてもよい．
軽鎖はさらにマウスL243残基を，残基9,13,17,18,37,40,43,45,48,49,72,74,76,80,84,85,100,103および104の１つまたは２つ以上にもっていてもよい．
本発明の人化抗体は，完全抗体，または上に説明したように，そのフラグメント，モノマーもしくはダイマー，または多価のモノ特異的抗原結合タンパク質であってもよい．この後者の群のある種の化合物は，それらが高い結合活性を有する点でとくに有利である．たとえば，国際特許明細書WO92/01472参照．この教示は本明細書に導入する．
すなわち本発明のさらに特定の態様によれば,2,3,4個もしくはそれ以上の抗体もしくはそれらのフラグメントからなり，それらが連結構造によって互いに結合してなる多価モノ特異的抗原結合タンパク質であり，そのタンパク質は天然の免疫グロブリンではなく，上記抗体またはそのフラグメントはマウスMab L243によって認識されるエピトープに対する特異性を有し，上記抗原結合タンパク質はエフェクターまたはレポーター分子と接合していてもよいタンパク質を提供する．
本発明のこの態様においては，各抗体またはそのフラグメントは，好ましくは上に定義した人化抗体またはそのフラグメントであり，多価モノ特異的抗原結合タンパク質はしたがって人化多価モノ特的抗原結合タンパク質である．しかしながら，非人化たとえばマウス多価モノ特異的抗原結合タンパク質も考慮することが可能であり，本発明はこれらにも及ぶことを理解すべきである．
多価抗原結合タンパク質は好ましくは，互いに連結構造によって結合した2,3もしくは４個の抗体またはそれらのフラグメントからなる．
本発明の抗体によって処置できる免疫疾患には，たとえば，関節疾患たとえば強直性脊柱炎，若年性関節リウマチ，慢性関節リウマチ；神経性疾患たとえば多発性硬化症；膵臓疾患たとえば糖尿病，若年発症型糖尿病；胃腸管疾患たとえば慢性活動型肝炎，セリアック病，潰瘍性大腸炎，クローン病，悪性貧血；皮膚疾患たとえば乾癬；アレルギー疾患たとえば喘息および移植関連症状たとえば移植片対宿主病および同種移植片拒絶反応が包含される．他の疾患としては，欧州特許第68790号に記載された疾患が包含される．
本発明はまた本発明の抗体を含有する治療用および診断用組成物を包含する．このような組成物は通常，本発明の抗体を医薬的に許容される，たとえばインビボ用の賦形剤，希釈剤または担体とともに含有する．
すなわち，本発明のさらに他の態様においては，本発明の抗体を医薬的に許容される賦形剤，希釈剤または担体と配合して含有する治療用，医薬用または診断用組成物が提供される．
本発明はまた，本発明の抗体を医薬的に許容される賦形剤，希釈剤または担体とともに混合することからなる治療用，医薬用または診断用組成物の製造方法を提供する．
抗体および組成物は，それらが使用される治療に応じて適当な形態および量で投与することができる．
治療用，医薬用または診断用組成物は任意の適当な投与形態，好ましくはたとえば注射または輪液，たとえば単回注射または連続輪液による非経口投与に適した形態とすることができる．製品が注射または輪液用である場合には，それは油性または水性ビヒクル中懸濁液，溶液または乳化液の形態とすることが可能で，処方補助剤たとえば懸濁剤，防腐剤，安定化剤および／または分散剤を含有させることができる．
別法として，抗体または組成物は，使用前に適当な滅菌液体で再構築する乾燥剤形とすることもできる．
抗体または組成物が経口投与に適している場合には，処方には活性成分のほかに，添加剤たとえば，デンプンたとえば馬鈴薯，トーモロコシもしくは小麦デンプンまたはセルロースもしくはデンプン誘導体たとえば微結晶セルロース；シリカ；各種糖たとえばラクトース；炭酸マグネシウムおよび／またはリン酸カルシウムを含有させることができる．経口製剤が投与用である場合には，それは患者の消化系に十分耐えうることが望ましい．この目的では処方中に粘液形成物質および樹脂を包含させることが望ましい．抗体または組成物を胃液に不溶性のカプセル中に処方することによって耐用性を改良することも望ましい．抗体または組成物を制御放出製剤中に包含させることも好ましい．
抗体または組成物が経直腸投与に適している場合には，結合剤および／または潤滑剤，たとえば重合グリコール，ゼラチン，ココア脂または他の植物性ワックスまた油脂を含有させることができる．
治療的および診断的使用は通常，本発明の抗体の有効量をヒト対象に投与することからなる．投与する正確な用量は，抗体の用途，ならびに患者の年齢，性別および状態に応じて変動するが，通常は約0.1mg〜1000mgたとえば約1mg〜500mgの範囲である．抗体は単回用量の投与としてもよく，また長時間連続的に投与することもできる．投与は必要に応じて反復することができる．
抗体および組成物は，それらが使用される治療に応じて，任意の適当な形態および量で投与することができる．抗体の投与量は，処置される状態の本質および抗体が予防的に用いられるのかまたは現存する状態の処置に使用されるのかに依存する．用量はまた，患者の年齢および状態に応じて選択される．本発明の抗体の治療用量はたとえば，好ましくは１回治療用量として0.1〜25mg/kg体重，とくに好ましくは１回治療用量として0.1〜10mg/kg体重である．
抗体は，適当な経路による投与のための慣用の実務に従って製剤化することが可能で，一般的には，たとえば静脈内，腹腔内または筋肉内投与経路のための液体剤形（たとえば，医薬的に許容される滅菌緩衝液中抗体溶液）とすることができる．
本発明を単に例示の目的で，以下に図面を参照しながら説明する．
図1:L243 Vl領域のアミノ酸配列を示す．
図2:L243 Vh領域のアミノ酸配列を示す．
図3:プラスミドpMR15.1の図解的な地図を示す．
図4:L243−gL1のVl領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す．
図5:L243−gL2のVl領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す．
図6:プラスミドpMR14の図解的な地図を示す．
図7:L243−gHのVh領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す．
図8:プラスミドｐγ１の図解的な地図を示す．
図9:L243グラフト対FITC−キメラL243についての競合アッセイの結果のグラフを示す．
Figure 0003653093
図10:L243γ４についてのスキャチャード分析のグラフを示す．
Figure 0003653093
図11:ADCCにより測定したキメラおよびグラフトL243のFcR III結合のグラフを示す．
Figure 0003653093
図12:L243イソタイプ系列MLRのグラフを示す．
Figure 0003653093
図13:L243イソタイプ系列TTレスポンスのグラフを示す．
Figure 0003653093
図14:ヒトＣ−γ１のヒンジ部およびCH2領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す．
図15:ADCCにより測定したキメラ，グラフトおよびグラフト［L235E］L243のFcR III結合のグラフを示す．
Figure 0003653093
図16:MLRによって測定したCDRグラフトL243の免疫抑制活性のグラフを示す．
Figure 0003653093
図17:CDRグラフトL243およびグラフト［L235E］L243 TTリコールレスポンスのグラフを示す．
Figure 0003653093
図18:CDRグラフトL243およびCDRグラフト［L235E］L243の補体誘導細胞傷害有効性のグラフを示す．
Figure 0003653093
図19:以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す．
ａ）クローン43
ｂ）クローン183
ｃ）クローン192
図20:プラスミドｐγ２の図解的な地図を示す．
発明の特異的実施態様の詳細な説明
例１
遺伝子クローニングおよび発現
L243ハイブリドーマ細胞からのRNAの調製
総RNAは以下に記載する３×107L243ハイブリドーマ細胞から調製した．細胞は生理食塩水で洗浄し,RNAzol（106細胞あたり0.2ml）に溶解した．クロロホルム（ホモジネート2mlあたり0.2ml）を加え，混合物を15秒間烈しく振盪し，ついで15分間氷上に放置した．得られた水相および有機相をエッペンドルフ遠心機により15分間遠心分離して分離し，水相から等容量のイソプロパノールの添加によってRNAを沈殿させた.15分間氷上に置いたのち，遠心分離によってRNAをペレット化し,70％エタノールで洗浄し，滅菌したRNA分解酵素を含まない水に溶解した.RNAの収量は350μｇであった．
L243軽鎖のアミノ酸配列の決定
成熟L243軽鎖の最初の９個のアミノ酸の配列はNH2−DIQMTQSPASと決定された．
L243 VhおよびVlのPCRクローニング
L243重鎖および軽鎖の可変部のcDNA遺伝子を逆転写酵素を用いて合成して，総RNA中に存在するmRNAの一本鎖cDNAコピーを作成し，ついでこのcDNAを特異的オリゴヌクレオチドプライマーによりポリメラーゼチェーン反応（PCR）に付した．
ａ）cDNA合成
cDNAは，以下の試薬を含有する反応混合物20μｌ中で合成した．すなわち,50mMトリス塩酸塩pH8.3,75mM塩化カリウム,10mMジチオスレイトール,3mM塩化マグネシウム，各デオキシリボヌクレシド三リン酸0.5mM,20単位のRNAsin,2μｇのL243RNAおよび20単位のモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素である.42℃で60分間インキュベートしたのち,95℃に５分間加熱して反応を停止させた．
ｂ）PCR
cDNAのアリコートを，重鎖および軽鎖に対するプライマーの組合せを使用してPCRに付した．重鎖および軽鎖の5'プライマーのヌクレオチド配列は，それぞれ，表１および２に示す．すべて，それらの5'末端からの６ヌクレオチドに始まる制限部位，それに続いて，得られたmRNAの至適翻訳を可能にする配列:GCCGCCACC,イニシエーターコドンおよびさらに20〜30ヌクレオチドを含有するこれらの配列は，既知のマウス抗体のリーダーペプチド配列に基づくコンピレーションである［Kabatら（1991）in Sequences of Proteins of Immunological Interest,第５版−United States Department of Health and Human Services］.3'プライマーは表３に示す．軽鎖プライマーは抗体のＶ−Ｃ連結部にまたがって,Vl PCRフラグメントのクローニングを容易にする酵素Spl1の制限部位を含む．重鎖3'プライマーは抗体のＶ−Ｃ連結部にまたがるように設計された混合物である．最初の23ヌクレオチドはヒトＣ−γ1,2,3および４遺伝子の開始部と同一で，これらのヒトイソタイプに共通するApa1制御部位を包含する．プライマーの3'領域は既知のマウス抗体に見出される配列［Kabat EA,Wu TT,Perry HM,Gottesman KS ＆ Foeller L;In:Sequences of Proteins of Immunological Interest,第５版,US Department of Health and Human Services（1991）］に基づく混合配列を含有する．
上述のプライマーの組合せによりVhおよびVlについてのPCR生成物を適当な発現ベクター（下記参照）へ直接クローン化してキメラ（マウス−ヒト）重鎖および軽鎖を生成させ，これらの遺伝子を哺乳動物細胞内で発現させて所望のイソタイプのキメラ抗体を産生させることが可能になる．
PCRのためのインキュベーション（20μｌ）は次のように設定した．各反応混合物には,10mMトリス塩酸塩pH8.3,1.5mM塩化マグネシウム,50mM塩化カリウム,0.01％w/vゼラチン，各デオキシリボヌクレシド三リン酸0.25mM.1〜6pmole 5'プライマーミックス（表４）,6pmol 3'プライマー,1μｌのcDNAおよび0.25単位のTaqポリメラーゼを含有させた．反応混合物は95℃で５分間インキュベートしたのち,94℃で１分間,55℃で１分間および72℃で１分間のサイクルに付した.30サイクル後，各反応混合物のアリコートをアガロースゲル上電気泳動によって分析した.5'プライマーミックスB1,B2,B3およびB5を含む反応では完全長Vlフラグメントに一致するサイズのバンドが生成したが,B9を含む反応では期待されたサイズのVh遺伝子のフラグメントが生成した.B1プライマーによって生成されたバンドは以前の結果で，このバンドはハイブリドーマ細胞によって産生された軽鎖偽似遺伝子に相当することが示されていたので，さらに追跡することはしなかった．
ｃ）PCRフラグメントの分子クローニング
B2,B3およびB5の反応で生成されたDNAフラグメントを酵素BstB1およびSpl1で消化し，エタノール沈殿によって濃縮し,1.4％アガロースゲル上電気泳動に付し,400塩基対の範囲でDNAバンドを回収した．これらをBstB1およびSpl1で予め制限酵素処理したベクターpMR15.1（図３）内にライゲートした．ライゲーション後，混合物を大腸菌LM1035にトランスフォームし，得られた細菌コロニーからのプラスミドをBstB1およびSpl1での消化により挿入体についてスクリーニングした．各ライゲーションから挿入体をもつ代表例については，さらにヌクレオチド配列決定によって分析した．
同様に,B9の反応で生成し,Hind IIIおよびApa1で消化したDNAフラグメントは,Hind IIIおよびApa1で予め制限酵素処理したベクター14（図６）中にクローン化した．この場合も，挿入体をもつ代表例はヌクレオチド配列決定によって分析した．
ｄ）ヌクレオチド配列分析
反応B9からのVh挿入体を含有する２つの単離体からのプラスミド（pE1701およびpE1702）はプライマーR1053（pMR14中のHCMVの3'領域内をプライムする）およびR720（ヒトＣγ４の5'領域内をプライムし,pMR14上のDNA挿入体によるスクリーニングを可能にする）を用いて配列決定を行った.pE1701内のL243Vhの決定されたヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列は図２に示す.pE1701中のVh挿入体についてのヌクレオチド配列は，ヌクレオチド20（pE1701ではＡ）とヌクレオチド426（pE1701ではＡ）を除いてpE1702の配列と同一であった．これらの２つの相違はそれぞれ，シグナルペプチドとVhのＪ領域にあり，調べた２つのクローンは異なるプライマーの使用によりPCR段階でオリゴヌクレオチドの混合物から生じた独立の単離体であることが指示される．
軽鎖クローンの分析にはR1053によるプライミングから誘導された配列を調べた．反応B2（クローン183）,B3（クローン43）およびB5（クローン192）から生じたVl遺伝子のヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列は図19に示す．推定されるタンパク質配列の比較を以下に示す．
ｉ）クローン182,183,43および45はすべてVl遺伝子をコードし，これはシグナルペプチドを除去した場合には,L243軽鎖についてのアミノ酸配列決定分析で決定された配列（上記参照）と同一の配列の軽鎖を生成する．
ii）クローン182および183は20アミノ酸のシグナルペプチドをコードするVl遺伝子を含んでいるが，クローン43および45中のVl遺伝子は異なるセットのオリゴヌクレオチドによるプライミングから得られ,15アミノ酸のみのリーダー配列をもっている．
iii）クローン192はL243 Vlをコードしていない．抗体配列のデーターベースの検索（Kabat,1991）から，クローン192はその代わりに,L243ハイブリドーマの産生に用いられたNS1骨髄種融合パートナーによって合成された軽鎖,MOPC21のVl遺伝子を含んでいることが指示される．
iv）クローン182と183はヌクレオチド26（クローン182ではT,クローン183ではＣ）を除いて同一である．この差はPCRにおける異なるプライマーの使用によって説明が可能で，クローン182と183は同じ遺伝子からの独立した単離体であることが指示される．完全Vl遺伝子のヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列は図１に示す．
ヒトγ１および２イソタイプの構築
L243 Vh遺伝子は，ヒトＣγ１およびＣγ２遺伝子（図８および20）を含むベクター，それぞれｐγ１およびｐγ２中Hind III−Apa1フラグメントにサブクローニングした．
ヒトイソタイプ変異体
ベクターｐγ１中に含有されるヒトＣγ１内の残基235をロイシンからグルタミン酸またはアラニンのいずれかに，また残基237をグリシンからアラニンに変化させるために,PCR突然変異誘発を用いた．ヒトＣγ１の低位ヒンジ部もヒトＣγ２の相当する領域によって置換した．これらの置換を行うには以下のオリゴヌクレオチドを使用した．
Ｉ）L235E変化
Figure 0003653093
II）L235A変化
Figure 0003653093
III）L237A変化
Figure 0003653093
IV）低位ヒンジ領域の交換
Figure 0003653093
PCR突然変異誘発を用いRAられた他のオリゴヌクレオチド
Figure 0003653093
R4732およびR4912は，ヒトＣγ１（図14）内のそれぞれヌクレオチド834〜858およびヌクレオチド1156〜1137の間をプライムする．
PCR突然変異誘発の一般的戦略は次の通りであった．各アミノ酸変化について，所望の置換を含有するDNAフラグメントを発生させるために２ラウンドのPCRを用いた．これらのフラグメントはついで，酵素Bgl IIおよびSty1によって制限酵素処置を行い,pγ１ベクター内の野生型配列（図８）を含有する相当するフラグメントを置換するために使用した．
第一ラウンドのPCRでは，以下の試薬を含有する反応混合物（20μｌ）を調製した．すなわち10mMトリス塩酸塩pH8.3,1.5mM塩化マグネシウム,50mM塩化カリウム,0.01％ゼラチン,0.25mMの各デオキシリボヌクレシド三リン酸,50μｇのｐγ1DNA,0.4単位のTaqポリメラーゼ，および6pmolの各プライマ−を含有させた．プライマ−には以下の組合せを用いた．
Figure 0003653093
94℃で１分間,55℃で１分間および72℃で１分間により30サイクル後，反応混合物をクロロホルムで抽出し，新たに合成されたDNAをエタノールで沈殿させ，水に溶解させ,1,4％アガロースゲル上電気泳動に付した.DNAフラグメントを含むゲルスライスをゲルから切り出し,DNAをMermaid（登録商標）キット（Stratech Scientific Ltd.,Luton,England）を用いてアガロースから回収し,20μｌの滅菌水中に溶出させた．
第二ラウンドのPCRでは,100μｌの反応混合物に10mMトリス塩酸塩pH8.3,1.5mM塩化マグネシウム,50mM塩化カリウム,0.01％のゼラチン,0.25mMの各デオキシリボヌクレシド三リン酸,2単位のTaqポリメラーゼ，第一ラウンドの反応からのDNAフラグメントの各ペア1/20,およびR4732およびR4912それぞれ30pmolを含有させた.30サイクル後（上記参照），反応混合物をフェノール／クロロホルム（1/1）で抽出し，エタノールで沈殿させた．フラグメントをBgl IIおよびSty1で消化させ,1.4％アガロースゲル上電気泳動に付し,250塩基対のDNAバンドを上述の場合と同様にゲルスライスから回収した．
これらの,Bgl II−Sty1フラグメントは，ヒトＣγ１のCH2ドメインのＣ末端部分および全CH3ドメインを含有する830Sty1−EcoR Iフラグメント，ならびにｐγ１（図８参照）からのBgl II−EcoR Iベクターとの三者ライゲーションによりライゲートした.LM1035にトランスフォームしたのち，得られたコロニーからのプラスミドミニプレパレーションをBgl II−Sty1フラグメントの存在についてスクリーニングし，各体表例をヌクレオチド配列分析用に採取した．これから，所望の配列を含有するプラスミドが同定され，以後の言及のために次のように命名した．
ｐγ１［L235E］残基235にグルタミン酸を含有
ｐγ１［L235A］残基235にアラニンを含有
ｐγ１［G237A］残基237にアラニンを含有
ｐγ１［g1→g2］Ｃγ低位ヒンジ部を含有
上記プラスミドをそれぞれHind IIIとApa1で制限酵素処理し,L243Vhを含有するHind III−Apa1フラグメントを挿入して以下のプラスミドを製造した．
L243γ１［L235E］
L243γ１［L235A］
L243γ１［G237A］
L243γ１［g1→g2］
キメラL243抗体の製造
生物学的評価のための抗体は，リン酸カルシウム沈殿法を用いてチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞へコトランスフェクトしたのち，適当な重鎖および軽鎖の一過性発現により製造した．
トランスフェクションの前日にCHO−L761細胞のセミコンフルーエントなフラスコをトリプシン処理し，細胞を数え,T75フラスコにそれぞれ107個の細胞をセットした．
翌日，トランスフェクションの３時間前に培養培地を交換した．トランスフェクションには,50μｇの各重鎖および軽鎖発現ベクターを含む0.25Mリン酸カルシウム1.25mlを,1.25mlの２×HBS（水1liter中16.36gmの食塩,11.9gm HEPESならびに0.4gm Na2HPO4をNaOHでpH7.1に調整）と混合してリン酸カルシウム沈殿を調製し，直ちに細胞を含む培地中に添加した.CO2インキュベーター中37℃に３時間放置したのち，培地と沈殿を除去し，リン酸緩衝食塩溶液（PBS）中15％グリセロール15mlを添加して細胞に１分間ショックを与えた．グリセロールを除去し，細胞を１回PBSにて洗浄し,10mMの酪酸ナトリウムを含む培地25ml中で48〜96時間インキュベートした．抗体はプロテインＡ−Sepharoseに結合させ，溶出させることにより精製した．抗体濃度はヒトIgELISA（下記参照）を用いて測定した．
ELISA
ELISAでは,Nunc ELISAプレートをコーティング緩衝液（15mM炭酸ナトリウム,35mM炭酸水素ナトリウム,pH6.9）中５μg/mlのポリクローナルヤギ抗−ヒトFcフラグメント特異的抗体のＦ（ab）２フラグメント（Jackson Immuno−research,コード109−006−098）によって一夜４℃でコートした.5分間蒸留水で洗浄して結合しなかった抗体を除去した．定量すべきサンプルならびに精製標準を接合緩衝液（0.1Mトリス塩酸塩pH7.0,0.1M食塩,0.2％v/v Tween20,0.2％w/v Hammerstenカゼイン）中に約１μg/mlに希釈した．サンプルは２倍希釈でマイクロタイターウエル中に適下し，各ウエル中の最終容量を0.1mlとし，プレートを室温で振盪しながら１時間インキュベートした．最初のインキュベーション工程後，プレートを蒸留水で10回洗浄し，ついで前回と同様１時間,0.1mlのマウスモノクローナル抗−ヒトκ（クローンGD12）ペルオキシダーゼ接合抗体（The Binding Site,コードMP135）と接合緩衝液中1:700に希釈してインキュベートした．プレートを蒸留水で再び清浄し，基質溶液（0.1ml）を各ウエルに添加した．基質溶液は150μｌのN,N,N,N−テトラメチルベンチジン（DMSO中10mg/ml）,150μｌ過酸化水素（30％溶液）を10mlの0.1M酢酸ナトリウム／クエン酸ナトリウムpH6.0中に含有する．プレートは５〜10分間,630nmにおける吸収が最大標準について約1.0に達するまで展開した．プレートリーダーを用いて630nmにおける吸収を測定し，サンプルの濃度を標準の場合の滴定曲線と比較することにより決定した．
Figure 0003653093
Figure 0003653093
Figure 0003653093
Figure 0003653093
例２
L243はヒトMHCクラスIIに対して作成されたマウスモモクローナル抗体である.L243 VlおよびVhのヌクレオチドおよびアミノ酸配列はそれぞれ図１および２に示す．以下の例はL243抗体の人化（CDRグラフト）を説明する．
L243軽鎖のCDRグラフト
L243軽鎖のフレームワーク領域の,4つのヒト軽鎖サブグループのフレームワーク領域［Kabat EA,Wu TT,Perry HM,Gottesman KS ＆ Foeller C,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第５版］とのアラインメントにより,L243はヒト軽鎖サブグループ１における抗体に最も相同であることが明らかにされた．したがって,CDRグラフト軽鎖の構築には，選択されるフレームワーク領域はヒトグループ１コンセンサス配列のフレームワーク領域に相当させた.L243のフレームワーク領域とコンセンサスヒトグループ１軽鎖のアミノ酸配列の比較を以下に示す.2つの配列間には21の相違（下線を付す）のあることが明らかである．
これらのフレームワークの相違のいずれが抗原の結合に寄与しているかの分析（公開された国際特許出願WO91/09967参照）から，検討すべき４つの残基が同定された．これらは，位置45,49,70および71である．この分析に基づき,2つのバージョンのCDRグラフト軽鎖を構築した．これらの第一の軽鎖は残基45,49,70および71がL243の軽鎖に由来するL243−gL1であり，第二の軽鎖はすべての残基がヒトコンセンサスのL243−gL2である．
軽鎖残基
残基37（Gln→Arg）および残基48（Ile→Val）は将来のすべてのグラフト分子に包含されることになる．
軽鎖の比較
Figure 0003653093
CDRグラフト軽鎖L243−gL1の構築
L243−gL1の構築は以下に詳細を示す．キメラ軽鎖のフレームワーク領域に変化を導入するために，以下のオリゴヌクレオチドを，ポリメラーゼチェーン反応（PCR）に使用した．
Figure 0003653093
各20μｌの３つの反応混合物には，それぞれ10mMトリス塩酸塩pH8.3,1.5mM塩化マグネシウム,50mM塩化カリウム,0.01％w/vゼラチン，各デオキシリボヌクレシド三リン酸0.25mM,0.1μｇのキメラL243軽鎖DNA,6pmolのR5043/R5044またはR5045/R5046またはR5047/R5048および0.25単位のTaqポリメラーゼを含有するようにセットした．反応混合物は,94℃で１分間,55℃で１分間および72℃で１分間のサイクルに付した.30サイクル後，各反応混合物をアガロースゲル上で電気泳動によって分析し,PCRフラグメントをゲルから切り取って,Mermaidキット（Stratech ScientificLtd.,Luton,Englandにより供給）を用いて回収した．
これらのアリコートをついで第二ラウンドのPCRに付した.100μｌの反応混合物には10mMトリス塩酸塩pH8.3,1.5mM塩化マグネシウム,50mM塩化カリウム,0.01％w/vのゼラチン，第一の反応セットからの３種のPCRフラグメントそれぞれ1/10,30pmolのR5043およびR5048ならびに2.5単位のTaqポリメラーゼを含有させた．反応温度は上述の通りとした.PCR後，混合物をフェノール／クロロホルム，ついでクロロホルムで抽出し，エタノールで沈殿させた．エタノール沈殿を遠心分離によって回収し，適当な緩衝液に溶解して，酵素BstE IIおよびSpl Iで制限酵素処理した．得られた生成物を最後にアガロースゲル上電気泳動に付し,270塩基対のDNAフラグメントをゲルスライスから回収し，予め同じ酵素で消化したベクターpMR15.1（図３）内にライゲートした．
ライゲーション混合物を用い大腸菌LM1035をトランスフォームし，得られたコロニーをPCR,制限酵素消化およびヌクレオチド配列決定によって分析した.L243−gL1のVl領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図４に示す．
CDRグラフト軽鎖L243−gL2の構築
L243−gL2はPCRを用いてL243−gL1から構築した．以下のオリゴヌクレオチドをアミノ酸変化の導入のために使用した．
Figure 0003653093
各20μｌの２つの反応混合物はそれぞれ,10mMトリス塩酸塩pH8.3,1.5mM塩化マグネシウム,50mM塩化カリウム,0.01％w/vゼラチン,0.25mMの各デオキシリボヌクレシド三リン酸,0.1μg L243−gL1,6pmol R1053/R5350またはR5349/R684および0.25単位のTaqポリメラーゼを含有するようにセットした．反応混合物は,94℃で１分間,55℃で１分間および72℃で１分間のサイクルに付した.30サイクル後，各反応混合物をアガロースゲル上電気泳動によって分析し,PCRフラグメントをゲルから切り取り,Mermaidキットを用いて回収した．
これらのアリコートをついで第二ラウンドのPCRに付した.100μｌの反応混合物には10mMトリス塩酸塩pH8.3,1.5mM塩化マグネシウム,50mM塩化カリウム,0.01％w/vゼラチン，第一の反応セットからのPCRフラグメントそれぞれ1/5,30pmolのR1053およびR684ならびに2.5単位のTaqポリメラーゼを含有させた．反応温度は上述のようにした.PCR後，混合物をフェノール／クロロホルムついでクロロホルムで抽出し，エタノールで沈殿させた．エタノール沈殿を遠心分離により回収し，適当な緩衝液に溶解し，酵素BstE IIおよびSpl Iで制限酵素処理した．得られた生成物を最後にアガロースゲル上電気泳動に付し,270塩基対のDNAフラグメントをゲルスライスから回収し，予め同じ酵素で消化したベクターpMR15.1（図３）内にライゲートした．
ライゲーション混合物を用い大腸菌LM1035をトランスフォームし，得られたコロニーをPCR,制限酵素消化およびヌクレオチド配列決定によって分析した.L243−gL2のVl領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は図５に示す．
L243重鎖のCDRグラフト
L243重鎖のCDRグラフトは軽さについて記載したのと同じ戦略を用いて達成された.L243重鎖はサブグルー１に属するヒト重鎖と最も相同であることが見出され，したがって,L243重鎖のアクセプトのためにはヒトグループ１フレームワークのコンセンサス配列を選択した．
この２つの構造体のフレームワーク領域の比較を以下に示す．これからL243はヒトコンセンサスと28の位置（下線を付す）で相違することがわかる．これらのいずれが抗原結合に寄与しているかの分析から，残基27,67,69,71,72および75のみが,CDRグラフト重鎖,L243−gHに保持された．
重鎖残基
残基２（Val→Ile）および残基46（Glu→Lys）は将来のすべてのグラフト分子に包含されることになる．これらの２つの残基に加えて,L243−gH中に存在するマウス残基67はヒトコンセンサス残基へ戻されることになった．すなわち,Phe→Valの変化である．
重鎖の比較
Figure 0003653093
CDRグラフト重鎖L243−gHの構築
L243−gHは適当なプライマ−の存在下に重複オリゴヌクレオチドをPCRに付して組み立てられた.PCRには以下のオリゴヌクレオチドが用いられた．
Figure 0003653093
アッセンブリー反応混合物50μｌは,10mMトリス塩酸塩pH8.3,1.5mM塩化マグネシウム,50mM塩化カリウム,0.01％w/vゼラチン,0.25のmM各デオキシリボヌクレシド三リン酸,R4897〜R4905各1pmol,R3004およびR3005各10pmolおよび2.5単位のTaqポリメラーゼを含有した．反応混合物は,94℃で１分間,55℃で１分間および72℃で１分間のサイクルに付した.30サイクル後，反応混合物をフェノール／クロロホルムついでクロロホルムで抽出し，エタノールで沈殿させた．遠心分離後,DNAを適当な制限緩衝液に溶解して,Hind IIIおよびApa Iで消化した．得られたフラグメントをアガロースゲルから単離し，予め同じ酵素で消化したベクターpMR14（図６）内にライゲートした.pMR14はヒトγ４重鎖定常部を含有し，したがってこのベクターから発現する重鎖はγ４イソタイプということになる．ライゲーション混合物を用いて大腸菌LM1035をトランスフォームし，得られた細菌コロニーを制限酵素消化およびヌクレオチド配列決定分析によってスクリーニングした．この方法で,L243−gHの正しい配列を含有するプラスミドが確認された（図７）．
キメラおよびCDRグラフトL243重鎖のγ１バージョンの 構築
L243重鎖のヒトγ１バージョンは，マウスおよびCDRグラフト重鎖両者の可変部をHind III−Apa Iフラグメントとしてベクターｐγ１（図８）内に移送することによって構築された．このベクターはヒトγ１重鎖定常部を含有する．
CDRグラフト遺伝子の活性の評価
CDRグラフト遺伝子の活性はそれらを哺乳動物細胞内で発現させ，新たに合成された抗体を生成し定量化することによって評価した．この方法論は以下に説明し，続いて抗体の生物学的特性表示に用いられる生化学的および細胞ベースのアッセイについて説明する．
ａ）CHO細胞における遺伝子発現
キメラおよびCDRグラフトL243は，重鎖および軽鎖対を，チャイニーズハムスター卵巣（CHO）にリン酸カルシウム沈殿法を用いてコトランスフェクトしたのち，一過性に発現させることにより生物学的評価のために産生させた．
トランスフェクションの前日にCHO−L761細胞［Cockett MI,Bebbington CR ＆ Yarranton GT,1991,Nucl.Acids Res.19,319−325］のセミコンフルーエントなフラスコをトリプシン処理し，細胞を数え,T75フラスコにそれぞれ107個の細胞をセットした．翌日，トランスフェクションの３時間前に培養培地を交換した．トランスフェクションには,50μｇの各重鎖および軽鎖発現ベクターを含む0.25Mリン酸カルシウム1.25mlを,1.25mlの２×HBS（水1liter中16.36gm食塩,11.9gm HEPESおよび0.4gm Na2HPO4をNaOHでpH7.1に調整）と混合してリン酸カルシウム沈殿を調製し，直ちに細胞を含む培地中に添加した.CO2インキュベーター中37℃に３時間放置したのち培地と沈殿を除去し，リン酸緩衝食塩溶液（PBS）中15％グリセロール15mlを添加して細胞に１分間ショックを与えた．グリセロールを除去し，細胞を１回PBSにて洗浄し,10mMの酪酸ナトリウムを含む培地25ml中で48〜96時間インキュベートした．抗体はプロテインＡ−Sepharoseに結合させ，溶出させて精製した．抗体濃度はヒトIgELISA（下記参照）を用いて測定した．
ｂ）ELISA
ELISAでは,Nunc ELISAプレートをコーティング緩衝液（15mM炭酸ナトリウム,35mM炭酸水素ナトリウム,pH6.9）中５μg/mlのポリクローナルヤギ抗−ヒトFcフラグメント特異的抗体のＦ（ab）２フラグメント（Jackson Immuno−research,コード109−006−098）によって一夜４℃でコートした.5分間蒸留水で洗浄して結合しなかった抗体を除去した．定量すべきサンプルならびに精製標準を接合緩衝液（0.1Mトリス塩酸塩pH7.0,0.1M食塩,0.2％v/v Tween20,0.2％w/v Hammerstenカゼイン）中に約１μg/mlに希釈した．サンプルは２倍希釈でマイクロタイターウエル中に滴下し，各ウエル中の最終容量を0.1mlとし，プレートを室温で振盪しながら１時間インキュベートした．最初のインキュベーション工程後，プレートを蒸留水で10回洗浄し，ついで前回と同様１時間,0.1mlのマウスモノクローナル抗−ヒトκ（クローンGD12）ペルオキシダーゼ接合抗体（The Binding Site,コードMP135）と接合緩衝液中1:700に希釈してインキュベートした．プレートを蒸留水で再び洗浄し，基質溶液（0.1ml）を各ウエルに添加した．基質溶液は150μｌのN,N,N,N−テトラメチルベンチジン（DMSO中10mg/ml）,150μｌ過酸化水素（30％溶液）を10mlの0.1M酢酸ナトリウム／クエン酸ナトリウムpH6.0中に含有する．プレートは５〜10分間,630nmにおける吸収が最大標準について約1.0に達するまで展開した．プレートリーダーを用いて630nmにおける吸収を測定し，サンプルの濃度を標準の場合の滴定曲線と比較することにより決定した．
ｃ）競合アッセイ
このアッセイの原理は，抗原結合部位がマウスからヒトフレームワークに正しくトランスフェクトされたならば,CDRグラフト抗体は，標識キメラ抗体と等しくヒトMHCクラスIIへの結合で競合するという点にある．抗原結合能に何らかの変化があればこの系で明らかにされることになる．
キメラL243はWoodらの方法［Wood T,Thompson S ＆ Goldstein G（1965）,J.Immunol,95,225−229］を用いてフルオレセイン（FITC）で標識した．すべての希釈，操作およびインキュベーションは0.1％ナトリウムアジドおよび５％ウシ胎児血清（Sigma,UK）を含有するリン酸緩衝食塩水（PBS,Gibco,UK）中で行った.RBポリスチレン管（2052 12×75mm Falcon,UK）中で抗体の希釈系列100μｌを一定量のFITC−標識抗体（予め測定された至適濃度で）とプレミックスし,5×104インディケーター細胞（高レベルのHLA−DRをもつJY Bリンパ芽球細胞系）に添加した．細胞および抗体を一緒に４℃で30分間インキュベートし,2回洗浄し，結合はFluorescence Activated Cell Scaner（FACS Becton Dickinson）を用いて明らかにした．適宜分析後，蛍光強度の中央値を抗体濃度に対してプロットした．
図９は,L243重鎖および軽鎖の組合せがJY細胞への結合に関しFITC−標識キメラL243と競合する能力を比較する．すべての組合せが有効なコンピーターであったが,CDRグラフト重鎖または軽鎖を含有する組合せにはキメラ抗体自体と同程度に有効なものはなかった．すなわち，組合せcH/gL1,gH/cLおよびgH/gL1は，このアッセイにおいて，キメラL243のそれぞれ89％,78％および64％の効果を示した．
ｄ）スキャチャード分析によるアフィニティー定数の測 定
L243抗体をPBS,5％ウシ胎児血清,0.1％ナトリウムアジド中10μg/mlから1.5倍希釈で（各150μｌ）で滴下したのち，各滴下点につき５×104のJY細胞を加え氷上で１時間インキュベートした．細胞は前もって計数し，洗浄し，サンプルと同じメジウムに懸濁した．インキュベーション後，細胞を5mlの上記メジウムで洗浄し，遠心分離し，上清は捨てた．結合した抗体は100μｌの1/100希釈FITC接合抗−ヒトFcモノクローナル抗体（The Binding Site;コードMF001）の添加によって明らかにされた．細胞をついで氷上で１時間インキュベートし，次に過剰のFITC接合体を前述の場合と同様に洗浄して除去した．細胞を同じ緩衝液250μｌに分散し，細胞あたりの蛍光強度の中央値をFACScan（Becton Dickinson）で測定し，標準ビーズを用い（Flow Cytometry Standard Corporation）検量した．このようにして各抗体濃度で細胞あたりの結合抗体数を確立してスキャチャードプロットを作成した．計算に際してはL243に対するFITC接合体の結合価は1:1,F/P比は3.36（製造業者により示された値）と推定した．
キメラL243（cH/cL）,L243−gH/L243−gL1およびL243−gH/L243−gL2のアフィニティーを比較したスキャチャードプロットを図10に示す．キメラL243の見掛けのKdは4.1nMであったのに対し,gL1およびgL2を含むCDRグラフト抗体では見掛けのKdはそれぞれ6.4nMおよび9.6nMであった.2つのCDRグラフト軽鎖をもつ抗体のKd値の差はL243−gL1では保持された母体軽鎖からの残基45,49,70および71の寄与を反映するものである．
ｅ）抗体依存性の細胞誘導細胞傷害作用
キメラおよびCDRグラフトL243が抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）を誘導する能力を比較した．実験の原理は，抗体のFcがFc受容体をもつ細胞傷害可能なエフェクター細胞と相互作用できれば，抗体はそれらの同族抗原をもつ標的細胞の溶解を誘導するというものである．
エフェクター細胞は各実験毎に新たに調製した．ヒト静脈血をヘパリン含有無エンドトキシンチューブに吸引した．末梢血単核球（PBMC）を密度勾配遠心分離により製造業者（Pharmacia）の説明書に従い調製した.PBMCは2mMグルタミン（Gibco,UK）および10％ウシ胎児血清を含むRPMI1640メジウム（Gibco）中１×107細胞/mlに調整した．すべての操作，希釈ならびにインキュベーションはこのメジウムで行った．
標的細胞（JY,上記参照）は1mCi Na51Crにより，室温で１時間,15分毎に攪拌して標識した．ついで細胞を10回洗浄して遊離の放射標識を除去し,2×106細胞/mlに再懸濁した．抗体の希釈系列25μｌを二重に滅菌Ｕ底96ウエルマイクロタイタープレート（Falcon.UK）に調製した．メジウムのみを含む対照ウエルも設け，アッセイのバックグランドを与える標識の自然放出を確立した．標的51Cr標識JY細胞はすべてのウエルに10μｌを添加した．同数のJY細胞を２％トリトンＸ−100水溶液を含むウエルにも加え,100％放出値を確立した．標的細胞および抗体を一緒にインキュベートし，室温で30分後に，すべてのウエル（100％を除く）にエフェクター細胞を添加し，さらに４時間37℃でインキュベートした.100μｌのEDTA/食塩水を加えて殺細胞作用を停止させ，マイクロタイタープレートを2000×ｇで遠心分離して無傷の細胞をペレット化し，上清100μｌを採取してガンマーカウンターで計測した．
％細胞溶解は，すべての値からバックグランドを差し引いて計算して，それを調整された最大放出の百分率として表した．再測定値間の変動は５％未満であった．％細胞溶解をついで抗体濃度に対してプロットした．
キメラ（cH/cL）およびCDRグラフト（gH/gL1）L243ヒトγ１イソタイプの上記アッセイでの比較を図11に示す．両抗体とも，細胞溶解の効果的なメディエーターであり，最大活性は抗体濃度100ng/ml未満で達成された。２つの抗体の間に有意の差はなかった．
ｆ）免疫機能試験
エクソビボＴ細胞機能試験は,MHC−IIとＴ細胞受容体の間の相互作用がＴ細胞の活性化に必須の要求である場合に行われた．キメラおよびCDRグラフトL243抗体は，ナイーブおよびメモリー両Ｔ細胞の活性化を測定する混合リンパ球反応，ならびにメモリーＴ細胞応答のみを測定する破傷風トキソイドに対するリコール応答で比較した．
１）混合リンパ球反応
この実験の原理は，ある固体からの白血球を異なるHLA対立遺伝子を発現する他の個体の白血球と混合した場合，それらは互いに他を異物として認識し，リンパ球が活性化されることである．この活性化は一次的に,T細胞上のCD3/TcR複合体と抗原提示細胞上のMHCクラスII分子との間の相互作用に依存する.L243はこの反応を阻害することが知られている．
白血球は各実験毎に新たに調製する.2例の個体からヒト静脈血をヘパリン含有無エンドトキシンチューブに吸引する．末梢血単核球（PBMC）は密度勾配遠心分離機により製造業者（Pharmacia）の説明書に従って調製する.PBMCは2mMグルタミン（Gibco,UK）,100μg/mlのペニシリン／ストレプトマイシンおよび10％ウシ胎児血清を含むRPMI1640メジウム（Gibco,UK）中２×106細胞/mlに調整する．すべての操作，希釈およびインキュベーションはこのメジウムで行われる．一方の個体からのPBMCは3000radで照射する．これらの細胞は他の個体のPBMCからの応答を刺激するために用いられる．
抗体の希釈系列100μｌを三重に滅菌Ｕ底96ウエルマイクロタイタープレート（Falcon.UK）中に調整する．メジウムの単独もしくは100nMシクロスポリン（Sandimmum,Sandoz）を含む対照ウエルも設け，それぞれ最大応答および最大阻害を確立する．照射されたスティミュレーターおよびレスポンダーの同数を一緒に混合し,100μｌを各ウエルに添加する．スティミュレーターおよびレスポンダー単独のウエルも対照として設ける．実験は,37℃，湿度100％および５％CO2において５日間インキュベートすることにより行う．応答は，培養の最後の18時間における細胞増殖を１μCi/ウエルの3H−チミジン（Amersham,UK）とインキュベートし，ガラスフィルターマット上に収穫し，ベーターカウンターを用いてカウントすることにより評価して測定する．
キメラおよびCDRグラフトL243のγ１イソタイプの,T細胞活性化のインヒビターとしての有効性を比較するためにMLRを実施した場合,2つの抗体の間には有意差は認められなかった（図12）．いずれの抗体100ng/mlを用いてもMLRの90％を越える阻害が認められた．
２）破傷風トキソイドに対するＴ細胞リコール応答
キメラおよびCDRグラフトL243が二次応答を抑制する能力は破傷風トキシンに対するリコール応答を用いて評価した．この実験の原理は，破傷風トキソイド（TT）で以前に免疫処置した個体からのＴリンパ球がエクソビボで再暴露された場合にTTに応答することにある．この活性化はＴ細胞上のCD3/TcR複合体と抗原を有しそれを提示する細胞上のMHCクラスII分子との間の相互作用に依存する.L243はこの反応を阻害することが知られている．
PBMCは上述のようにして調製する．抗体の希釈系列100μｌを三重に滅菌Ｕ底96ウエルマイクロタイタープレートに調製する．前もって実験によって決定した至適濃度のTTを含む液50μｌをすべてのウエルに加える．メジウムのみまたは100nMシクロスポリンを含む対照ウエルも設け，それぞれ最大応答および最大阻害を確立する．ついで50μｌのPBMCを各ウエルに添加する．実験は,37℃，湿度100％および５％CO2において７日間インキュベートすることにより行う．応答は，培養の最後の18時間における細胞増殖を１μCi/ウエルの3H−チミジンとインキュベートし，ガラスフィルターマット上に収穫し，ベーターカウンターを用いてカウントすることにより評価して測定する．
キメラおよびCDRグラフトL243のヒトγ１イソタイプの,TT応答阻害能を比較する実験の結果は図13に示す．いずれの抗体もTTに対するＴ細胞応答の効果的なインヒビターであり，両者の滴定曲線は識別できなかった．
例３
位置235に変化があるCDRグラフトL243,すなわち［L235E］の抗体依存性細胞傷害作用（ADCC）誘導能は，基本的に例２に記載と同様にして測定した．結果は図15に示す．
同様に,CDRグラフトL243［L235E］抗体は，基本的に例２に記載と同様にして，混合リンパ球反応および破傷風トキソイドに対するリコール応答について試験した．結果は図16および17に示す．
抗体依存性補体誘導細胞傷害作用
L243の遺伝子操作変異体のヒト補体結合能を，抗体依存性補体誘導細胞傷害作用の技術を用いて評価した．
この実験の原理は，抗体のFcが（通常，古典的）補体カスケードの成分と相互作用できれば，抗体はそれらの同族抗原をもつ標的細胞の補体溶解を誘導するというものである．
これらの実験における補体の起源は，新たに無エンドトキシンガラス瓶に吸引したヒト静脈血であり，ついで37℃で１時間放置して凝血させる．血餅をガラスから脱着させ，ついで４℃で２時間インキュベートして元に戻させる．血餅を除去し,1000gで遠心分離して残った赤血球から血清を分離する．いったん調製されたならば，血清は，とくに見るべき効力の劣化はなく−20℃で１カ月まで保存できる．
すべての操作，希釈およびインキュベーションは,2mMグルタミン（Gibco,UK）ならびに10％ウシ胎児血清（Sigma,UK）を含有するRPMI1640メジウム（Gibco UK）中で行う．標的細胞（高いHLA−DRレベルを有するJY,Bリンパ芽球細胞系）は1mCi Na51Crにより，室温で１時間,15分毎に攪拌して標識する．ついで細胞を３回洗浄して遊離の放射標識を除去し,2×106/mlに再懸濁する．抗体の希釈系列25μｌを二重にＶ底96ウエルマイクロタイタープレート（ICN/Flow,UK）に調製する．メジウムのみを含む対照ウエルも設け，アッセイのバックグランドを与える標識の自然放出を確立する．標的51Cr標識JY細胞はすべてのウエルに10mlを添加する．同数のJY細胞を２％トリトンＸ−100水溶液を含むウエルにも加え,100％放出値を確立する．標的細胞および抗体を一緒にインキュベートし，室温で１時間後に，すべてのウエル（100％を除く）に補体のソースとして血清を添加し，さらに１時間室温でインキュベートする．ついで100ml4℃のEDTA食塩水を加えて殺細胞作用を停止させ，マイクロタイタープレートを2000gで遠心分離して無傷の細胞をペレットし，上清100μｌを採取してガンマーカウンターで計測する．
％細胞溶解は，すべての値からバックグランドを差し引いて計算し，ついでそれを，調整された最大放出の百分率として表す．再測定値間の変動は５％未満である．％細胞溶解をついで抗体濃度に対してプロットする．
結果（バックグランドを差し引いていない）は図18に示す．

Claims (8)

  1. マウスモノクローナル抗体L243によって認識されるエピトープに対して特異性を有する人化CDRグラフト抗体分子であって、
    マウスモノクローナル抗体L243に由来する相補性決定領域（CDR）と、ヒトグループコンセンサス配列１に由来するヒトアクセプターのフレームワークであって位置２、27、46、69、71、72および75における該L243ドナー残基を含むフレームワークとを有する重鎖、およびマウスモノクローナル抗体L243に由来する相補性決定領域（CDR）と、ヒトグループコンセンサス配列１に由来するヒトアクセプターのフレームワークであって位置45、49、70および71における該L243ドナー残基を含むフレームワークとを有する軽鎖からなる、
    上記人化CDRグラフト抗体分子。
  2. マウスモノクローナル抗体L243に由来する相補性決定領域（CDR）と、ヒトグループコンセンサス配列１に由来するヒトアクセプターのフレームワークであって位置２、27、46、69、71、72および75における該L243ドナー残基を含むフレームワークとを有する人化CDRグラフト抗体重鎖。
  3. マウスモノクローナル抗体L243に由来する相補性決定領域（CDR）と、ヒトグループコンセンサス配列１に由来するヒトアクセプターのフレームワークであって位置45、49、70および71における該L243ドナー残基を含むフレームワークとを有する人化CDRグラフト抗体軽鎖。
  4. 請求項２に記載の人化CDRグラフト抗体重鎖および／または請求項３に記載の人化CDRグラフト抗体軽鎖をコードするDNA配列。
  5. 請求項４に記載のDNA配列を含むクローニングまたは発現ベクター。
  6. 請求項５に記載のクローニングまたは発現ベクターによってトランスフォームされた宿主細胞。
  7. マウスモノクローナル抗体L243によって認識されるエピトープに対して特異性を有する人化CDRグラフト抗体分子を製造する方法であって、請求項４に記載のDNA配列を請求項６に記載のトランスフォームされた宿主細胞内で発現させることからなる上記方法。
  8. マウスモノクローナル抗体L243によって認識されるエピトープに対して特異性を有する人化CDRグラフト抗体分子を製造する方法であって、
    ａ）マウスモノクローナル抗体L243に由来する相補性決定領域（CDR）と、ヒトグループコンセンサス配列１に由来するヒトアクセプターのフレームワークであって位置２、27、46、69、71、72および75における該L243ドナー残基を含むフレームワークとを有する抗体重鎖、またはマウスモノクローナル抗体L243に由来する相補性決定領域（CDR）と、ヒトグループコンセンサス配列１に由来するヒトアクセプターのフレームワークであって位置45、49、70および71における該L243ドナー残基を含むフレームワークとを有する抗体軽鎖をコードするDNA配列を有するオペロンを発現ベクター内に製造し、
    ｂ）マウスモノクローナル抗体L243に由来する相補性決定領域（CDR）と、ヒトグループコンセンサス配列１に由来するヒトアクセプターのフレームワークであって位置２、27、46、69、71、72および75における該L243ドナー残基を含むフレームワークとを有する相補性抗体重鎖、またはマウスモノクローナル抗体L243に由来する相補性決定領域（CDR）と、ヒトグループコンセンサス配列１に由来するヒトアクセプターのフレームワークであって位置45、49、70および71における該L243ドナー残基を含むフレームワークとを有する相補性抗体軽鎖をコードするDNA配列を有するオペロンを発現ベクター内に製造し、
    ｃ）両オペロンで宿主細胞をトランスフェクトし、次いで
    ｄ）トランスフェクトされた細胞系を培養して人化CDRグラフト抗体分子を産生させる、
    ことからなる上記方法。
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