ES2837392T3

ES2837392T3 - Anticuerpos anti-influenza A neutralizantes y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2837392T3
Application number: ES14850550T
Authority: ES
Inventors: Ebony Benjamin; Nicole Kallewaard-Lelay; Josephine Mary Mcauliffe; Frances Palmer-Hill; Leslie Wachter; Andy Yuan; Qing Zhu; Davide Corti; Antonio Lanzavecchia; Barbara Guarino; Anna Demarco
Original assignee: Humabs Biomed SA; MedImmune LLC
Current assignee: Humabs Biomed SA; MedImmune LLC
Priority date: 2013-10-02
Filing date: 2014-10-01
Publication date: 2021-06-30
Anticipated expiration: 2034-10-01
Also published as: US20220033480A1; AU2014329609A1; RU2019106487A; CN105848722B; JP7060653B2; TWI714933B; TWI794693B; LT3052192T; PL3052192T3; PT3052192T; AU2019261828A1; US20200109188A1; JP6535675B2; MX382043B; TW202112810A; JP2019187422A; JP2016538876A; CY1123558T1; TWI649333B; CN105848722A

Abstract

Anticuerpo aislado o fragmento de union del mismo que puede unirse a hemaglutinina del virus influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos un subtipo del grupo 2 del virus influenza A, en el que el anticuerpo o fragmento de union del mismo comprende una HCDR1 de SEQ ID NO.: 113, HCDR2 de SEQ ID NO.: 114, HCDR3 de SEQ ID NO.: 115, LCDR1 de SEQ ID NO.: 118, LCDR2 de SEQ ID NO.: 119 y LCDR3 5 de SEQ ID NO.: 120.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-influenza A neutralizantes y usos de los mismos

Campo de la invención

La invención se refiere a anticuerpos tal como se reivindican.

Antecedentes de la invención

Los virus influenza producen epidemias de gripe anuales y pandemias ocasionales, que suponen una amenaza significativa para la salud pública en todo el mundo. La infección por gripe estacional está asociada con 200,000 500,000 muertes cada año, particularmente en niños pequeños, pacientes inmunocoprometidos y ancianos. Las tasas de mortalidad normalmente aumentan adicionalmente durante estaciones con brotes de gripe pandémicos. Sigue habiendo una necesidad médica insatisfecha significativa de desarrollar agentes terapéuticos antivirales potentes para prevenir y tratar infecciones por influenza, en particular en poblaciones desatendidas.

Hay tres tipos de virus influenza, los tipos A, B y C. Los virus influenza A pueden infectar a una amplia variedad de aves y mamíferos, incluyendo seres humanos, cerdos, pollos y hurones. Los virus influenza A pueden clasificarse en subtipos basándose en variaciones alélicas en regiones antigénicas de dos genes que codifican para las glicoproteínas de superficie hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). HA es la glicoproteína de unión al receptor y fusión con la membrana, que media en el acoplamiento y la entrada del virus en células diana; HA es la diana primaria de las respuestas inmunitarias humorales. La proteína HA tiene una estructura trimérica y está compuesta por tres copias idénticas de un único precursor polipeptídico, HA0, que tras la maduración proteolítica, se escinde para dar un producto intermedio dependiente del pH, metaestable que contiene la cabeza globular (HA1) y la región de tallo (HA2). La "cabeza globular" distal a la membrana constituye la mayoría de la estructura de HA1 y contiene el bolsillo de unión a ácido siálico para la entrada del virus y los dominios antigénicos principales. La estructura de "tallo" proximal a la membrana, ensamblada a partir de HA2 y algunos residuos de HA1, contiene la maquinaria de fusión, que experimenta un cambio conformacional en el entorno de pH bajo de endosomas tardíos para desencadenar la fusión de membrana y la penetración en las células. El grado de homología de secuencias entre subtipos de influenza A es menor en la región de HA1 (homología del 34%-59% entre los subtipos) que en la región de HA2 (homología del 51%-80%). Los anticuerpos neutralizantes provocados por la infección por virus influenza se dirigen normalmente a la cabeza globular HA1 para impedir la unión al receptor viral y habitualmente son específicos de cepa. Rara vez se han identificado anticuerpos monoclonales que reaccionan de manera cruzada que seleccionan como diana la cabeza globular de HA (Krause J.C. et al. 2011 J. Virol.85; Whittle J. et al., 2011 PNAS 108; Ekiert DC et al., 2012 Nature 489; Lee PS et al., 2012 PNAS 109). En contraposición, la estructura de la región de tallo está relativamente conservada y se han identificado recientemente unos cuantos anticuerpos ampliamente neutralizantes que se unen al tallo HA impidiendo la etapa de fusión desencadenada por el pH para la entrada viral (Ekiert D.C. et al., 2009 Science 324; Sui J. et al., Nat Struct Mol Biol 16; Wrammert J et al., 2011 J Exp Med 208; Ekiert D. C et al., 2011 Science 333; Corti D et al., 2010 J Clin Invest 120; Throsby M 2008 PLoS One 3). La mayoría de los mismos anticuerpos neutralizantes reactivos con el tallo son o bien específicos frente a virus del grupo 1 o bien específicos frente a virus del grupo 2 de influenza A. Muy recientemente, se aislaron anticuerpos que se unen al tallo que reaccionaban de manera cruzada con virus de tanto el grupo 1 como el grupo 2 (Corti D. et al., 2011 Science 333; Li GM et al., 2012 PNAS 109 y Cyrille D et al., 2012 Science 337; Nakamura G et al., 2013, Cell Host & Microbe 14).

Hasta la fecha, no hay ningún anticuerpo en el mercado que neutralice o inhiba ampliamente toda la infección por virus influenza A o atenúe la enfermedad provocada por el virus influenza A. Por tanto, sigue habiendo la necesidad de nuevos anticuerpos que protejan frente a múltiples subtipos del grupo 1 y el grupo 2 del virus influenza A.

El documento WO2013011347 describe anticuerpos anti-influenza neutralizantes y usos de los mismos.

El documento 2010054007 describe colecciones de anticuerpos combinatorias y usos de los mismos.

El documento WO2007109742 describe métodos para humanizar anticuerpos y anticuerpos humanizados preparados de ese modo.

El documento WO2007117577 describe anticuerpos humanos de afinidad elevada para el receptor de IL-18 humana. Descripción de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones. La invención proporciona un anticuerpo frente al virus influenza A o un fragmento de unión del mismo tal como se reivindica que puede unirse a hemaglutinina del virus influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos un subtipo del grupo 2 del virus influenza A.

Preferiblemente, el anticuerpo o los fragmentos de unión de la invención pueden unirse a hemaglutinina del virus influenza A y neutralizar al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 subtipos del grupo 1 del virus influenza A y al menos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 subtipos del grupo 2 del virus influenza A. Además preferiblemente, el anticuerpo o los fragmentos de unión de la invención pueden unirse a hemaglutinina del virus influenza A y neutralizar al menos 5 subtipos del grupo 1 de del virus influenza A y al menos 1 ó 2 subtipos del grupo 2 del virus influenza A.

Los subtipos de hemaglutinina de virus influenza A pertenecen a dos agrupaciones filogenéticas principales, identificadas como grupo 1, que incluye los subtipos H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16 y H17 y grupo 2, que incluye los subtipos H3, H4, H7, H10, H14 y H15. En una realización, un anticuerpo o fragmento de unión según la invención puede unirse a y/o neutralizar uno o más subtipos del grupo 1 del virus influenza A seleccionados de H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16 y H17 y variantes de los mismos y uno o más subtipos del grupo 2 del virus influenza A seleccionados de H3, H4, H7, H10, H14 y H15 y variantes de los mismos. En otra realización, un anticuerpo o fragmento de unión según la invención puede unirse a y/o neutralizar los subtipos del grupo 1 del virus influenza A H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16 y H17 y los subtipos del grupo 2 del virus influenza A H3, H4, H7, H10, H14 y H15 . En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión puede unirse a y/o neutralizar los subtipos del grupo 1 H1, H2, H5, H6 y H9 los subtipos del grupo 2 H3 y H7. En una realización adicional, el anticuerpo o fragmento de unión puede unirse a y/o neutralizar los subtipos del grupo 1 H1, H2, H5 y H6 y los subtipos del grupo 2 H3 y H7.

La invención se basa en el aislamiento de un anticuerpo monoclonal (AcM) humano que se produce de manera natural a partir de células B de memoria de IgG que se recogieron de donantes individuales como materiales de partida. Se usó optimización para generar variantes de anticuerpos con características mejoradas, tal como se describe en la presente. Las variantes de anticuerpos optimizadas no se producen de manera natural; se generan utilizando técnicas recombinantes. Los anticuerpos o fragmentos de los mismos de la invención se unen a la región de tallo de HA y neutralizan la infección de más de un subtipo del virus influenza A, seleccionados de subtipos del grupo 1 y el grupo 2, respectivamente. Los anticuerpos de la invención, que son anticuerpos de unión al tallo de HA anti-influenza A, demostraron una amplitud de cobertura más amplia o una actividad neutralizante mejor contra virus influenza A en comparación con un anticuerpo de la bibliografía publicada (anticuerpo FI6v4, descrito en el documento (WO2013/011347A1) y mostrado en la tabla 6 del ejemplo 5. Adicionalmente, los anticuerpos de la invención son más eficaces que otro(s) AcM en el bloqueo de la maduración de HA tal como se muestra en la figura 1 del ejemplo 6.

Se describen en la presente los anticuerpos o fragmentos de unión del mismo que incluyen un conjunto de seis CDR en el que el conjunto de seis CDR se selecciona del grupo que consiste en:

(a) HCDR1 de SEQ ID NO.: 3, HCDR2 de SEQ ID NO.: 4, HCDR3 de SEQ ID NO.: 5, LCDR1 de SEQ ID NO.: 8, LCDR2 de SEQ ID NO.: 9, y LCDR3 de SEQ ID NO.: 10;

(b) HCDR1 de SEQ ID NO.: 13, HCDR2 de SEQ ID NO.: 14, HCDR3 de SEQ ID NO.: 15, LCDR1 de SEQ ID NO.: 18, LCDR2 de SEQ ID NO.: 19, LCDR3 de SEQ ID NO.: 20;

(c) HCDR1 de SEQ ID NO.: 23, HCDR2 de SEQ ID NO.: 24, HCDR3 de SEQ ID NO.: 25, LCDR1 de SEQ ID NO.: 28, LCDR2 de SEQ ID NO.: 29 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 30;

(d) HCDR1 de SEQ ID NO.: 33, HCDR2 de SEQ ID NO.: 34, HCDR3 de SEQ ID NO.: 35, LCDR1 de SEQ ID NO.: 38, LCDR2 de SEQ ID NO.: 39, y LCDR3 de SEQ ID NO.: 40;

(e) HCDR1 de SEQ ID NO.: 43, HCDR2 de SEQ ID NO.: 44, HCDR3 de SEQ ID NO.: 45, LCDR1 de SEQ ID NO.: 48, LCDR2 de SEQ ID NO.: 49, y LCDR3 de SEQ ID NO.: 50;

(f) HCDR1 de SEQ ID NO.: 53, HCDR2 de SEQ ID NO.: 54, HCDR3 de SEQ ID NO.: 55, LCDR1 de SEQ ID NO.: 58, LCDR2 de SEQ ID NO.: 59, y LCDR3 de SEQ ID NO.: 60;

(g) HCDR1 de SEQ ID NO.: 63, HCDR2 de SEQ ID NO.: 64, HCDR3 de SEQ ID NO.: 65, LCDR1 de SEQ ID NO.: 68, LCDR2 de SEQ ID NO.: 69, y LCDR3 de SEQ ID NO.: 70;

(h) HCDR1 de SEQ ID NO.: 73, HCDR2 de SEQ ID NO.: 74, HCDR3 de SEQ ID NO.: 75, LCDR1 de SEQ ID NO.: 78, LCDR2 de SEQ ID NO.: 79 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 80;

(i) HCDR1 de SEQ ID NO.: 83, HCDR2 de SEQ ID NO.: 84, HCDR3 de SEQ ID NO.: 85, LCDR1 de SEQ ID NO.: 88, LCDR2 de SEQ ID NO.: 89, LCDR3 de SEQ ID NO.: 90;

(j) HCDR1 de SEQ ID NO.: 93, HCDR2 de SEQ ID NO.: 94, HCDR3 de SEQ ID NO.: 95, LCDR1 de SEQ ID NO.: 98, LCDR2 de SEQ ID NO.: 99, y LCDR3 de SEQ ID NO.: 100;

(k) HCDR1 de SEQ ID NO.: 103, HCDR2 de SEQ ID NO.: 104, HCDR3 de SEQ ID NO.: 105, LCDR1 de SEQ ID NO.: 108, LCDR2 de SEQ ID NO.: 109 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 110;

(l) HCDR1 de SEQ ID NO.: 123, HCDR2 de SEQ ID NO.: 124, HCDR3 de SEQ ID NO.: 125, LCDR1 de SEQ ID NO.: 128, LCDR2 de SEQ ID NO.: 129, y LCDR3 de SEQ ID NO.: 130;

(m) HCDR1 de SEQ ID NO.: 133, HCDR2 de SEQ ID NO.: 134, HCDR3 de SEQ ID NO.: 135, LCDR1 de SEQ ID NO.: 138, LCDR2 de SEQ ID NO.: 139, y LCDR3 de SEQ ID NO.: 140; y

(n) HCDR1 de SEQ ID NO.: 143, HCDR2 de SEQ ID NO.: 144, HCDR3 de SEQ ID NO.: 145, LCDR1 de SEQ ID NO.: 148, LCDR2 de SEQ ID NO.: 149 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 150;

(o) un conjunto de seis CDR según uno cualquiera de (a) a (o) que comprenden una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos;

(p) un conjunto de seis CDR según uno cualquiera de (a) a (p) que comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 ó 24 ó 25 sustituciones de aminoácidos;

(q) un conjunto de seis CDR HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 según uno cualquiera de (a) a (q) que comprende:

(i) una HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 3 o menos sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con SEQ ID NO: 3;

(ii) una HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 5 o menos sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con SEQ ID NO:4;

(iii) una HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 6 o menos sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con SEQ ID NO:5;

(iv) una LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 5 o menos sustituciones de residuos de aminoácidos y/o una deleción en relación con SEQ ID NO:6;

(v) una LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 5 o menos sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con SEQ ID NO:7;

(vi) una LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a o que comprende 1 o menos sustituciones de residuos de aminoácidos en relación con SEQ ID NO:8;

(r) un conjunto de seis CDR HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3 según uno cualquiera de (a) a (r) que comprende:

(i) una HCDR1 en la que:

el residuo de Kabat 31 es S,

el residuo de Kabat 32 es N o Y,

el residuo de Kabat 33 es N, S o R,

el residuo de Kabat 34 es A,

el residuo de Kabat 35 es V o T,

el residuo de Kabat 35A es W

el residuo de Kabat 35B es N;

(ii) una HCDR2 en la que:

el residuo de Kabat 50 es R,

el residuo de Kabat 51 es T,

el residuo de Kabat 52 es Y,

el residuo de Kabat 52A es Y,

el residuo de Kabat 53 es R,

el residuo de Kabat 54 es S,

el residuo de Kabat 55 es K o G,

el residuo de Kabat 56 es W,

el residuo de Kabat 57 es Y,

el residuo de Kabat 58 es N o Y,

el residuo de Kabat 59 es D,

el residuo de Kabat 60 es Y,

el residuo de Kabat 61 es A,

el residuo de Kabat 62 es E, V o d,

el residuo de Kabat 63 es S o F,

el residuo de Kabat 64 es V o L,

el residuo de Kabat 65 es K ,

(iii) una HCDR3 en la que:

el residuo de Kabat 95 es S o G,

el residuo de Kabat 96 es G,

el residuo de Kabat 97 es H,

el residuo de Kabat 98 es I,

el residuo de Kabat 99 es T,

el residuo de Kabat 100 es V o E,

el residuo de Kabat 100A es F,

el residuo de Kabat 100B es G,

el residuo de Kabat 100C es V o L,

el residuo de Kabat 100D es N;

el residuo de Kabat 100E es V o I,

el residuo de Kabat 100F es D,

el residuo de Kabat 100G es A,

el residuo de Kabat 100F es F o Y,

el residuo de Kabat 101 es D,

el residuo de Kabat 102 es M, I o V;

(iv) una LCDR1 en la que:

el residuo de Kabat 24 es R,

el residuo de Kabat 25 es T, A o está ausente, el residuo de Kabat 26 es S o A,

el residuo de Kabat 27 es Q,

el residuo de Kabat 28 es S o R,

el residuo de Kabat 29 es L,

el residuo de Kabat 30 es S, N o R

el residuo de Kabat 31 es S,

el residuo de Kabat 32 es Y,

el residuo de Kabat 33 es L, T o D,

el residuo de Kabat 34 es H;

(v) una LCDR2 en la que:

el residuo de Kabat 50 es A,

el residuo de Kabat 51 es A, T o S,

el residuo de Kabat 52 es S o T,

el residuo de Kabat 53 es S o T,

el residuo de Kabat 54 es L o R,

el residuo de Kabat 55 es Q, L o G,

el residuo de Kabat 56 es S; y,

(vi) una LCDR3 en la que:

el residuo de Kabat 89 es Q,

el residuo de Kabat 90 es Q o L,

el residuo de Kabat 91 es S,

el residuo de Kabat 92 es R, y

el residuo de Kabat 93 es T.

Se describen en la presente anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos que comprenden un conjunto de seis CDR: HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, L^cDR2, LCDR3, en las que el conjunto de seis CDR se muestra en las tabla 11 y 13.

Las secuencias de anticuerpos variantes descritas en la presente pueden compartir una identidad de la secuencia de aminoácidos del 75% o más (por ejemplo, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98%, el 99% o más) con las secuencias mencionadas en la solicitud. La identidad de secuencia puede calcularse con respecto a la longitud completa de la secuencia de referencia (es decir, la secuencia mencionada en la solicitud).

El porcentaje de identidad, al que se hace referencia en la presente, puede ser tal como se determina utilizando BLAST versión 2.1.3 utilizando los parámetros por defecto especificados por el NCBI (el National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [matriz Blosum 62; penalización por apertura de hueco=l 1 y penalización por extensión de hueco=l].

También se describen en la presente anticuerpos variantes. Por tanto, también se incluyen variantes de las secuencias mencionadas en la solicitud dentro de la divulgación. Pueden obtenerse variantes de las secuencias de anticuerpos que tienen afinidad y/o potencia mejorada utilizando métodos conocidos en la técnica y se incluyen dentro de la divulgación. Por ejemplo, pueden utilizarse sustituciones de aminoácidos para obtener anticuerpos con afinidad mejorada adicional. Alternativamente, puede utilizarse la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos para mejorar la eficacia de la traducción en sistemas de expresión para la producción del anticuerpo. Además, también están dentro de la divulgación polinucleótidos que comprenden una secuencia optimizada para la especificidad del anticuerpo o la actividad neutralizante mediante la aplicación de un método de evolución dirigida a cualquiera de las secuencias de la invención.

Se describe en la presente un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que comprende una VH que tiene una identidad de al menos el 75% y/o una VL que tiene una identidad de al menos el 75% con una VH y/o una VL seleccionada del grupo que consiste en:

(a) VH de SEQ ID NO.: 2, y VL de SEQ ID NO.: 7,

(b) VH de SEQ ID NO.: 12, y

ID NO.: 17,

(c) VH de SEQ ID NO.: 22, y

NO.: 27,

(d) VH de SEQ ID NO.: 32,

EQ ID NO.: 37,

(e) VH de SEQ ID NO.: 42, y

NO.: 47,

(f) VH de SEQ ID NO.: 52, y VL de SEQ ID NO.: 57,

(g) VH de SEQ ID NO.: 62, y

NO.: 67,

(h) VH de SEQ ID NO.: 72, y VL de SEQ ID NO.: 77,

(i) VH de SEQ ID NO.: 82, y VL de SEQ ID NO.: 87,

(j) VH de SEQ ID NO.: 92, y VL de SEQ ID NO.: 97,

(k) VH de SEQ ID NO.: 102, y VL de SEQ ID NO.: 107,

(l) VH de SEQ ID NO.: 112, y VL de SEQ ID NO.: 117,

(m) VH de SEQ ID NO.: 122, y VL de SEQ ID NO.: 127,

O.: 137,

.: 144, y VL de SEQ ID

.: 147 y

.: 152 y VL de SEQ ID NO.: 157.

Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo tal como se reivindica puede comprender una VH de SEQ ID NO.: 112 y una VL de SEQ ID NO.: 117.

Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo tal como se describe en la presente puede comprender una VH y una VL seleccionadas del grupo que consiste en:

(a) VH de SEQ ID NO.: 2, y VL de SEQ ID NO.: 7,

(b) VH de SEQ ID NO.: 12, y VL de SEQ ID NO.: 17,

(c) VH de SEQ ID NO.: 22, y VL de SEQ ID NO.: 27,

(d) VH de SEQ ID NO.: 32, y VL de SEQ ID NO.: 37,

(e) VH de SEQ ID NO.: 42, y VL de SEQ ID NO.: 47,

(f) VH de SEQ ID NO.: 52, y VL de SEQ ID NO.: 57,

(g) VH de SEQ ID NO.: 62, y VL de SEQ ID NO.: 67,

(h) VH de SEQ ID NO.: 72, y VL de SEQ ID NO.: 77,

(i) VH de SEQ ID NO.: 82, y VL de SEQ ID NO.: 87,

(j) VH de SEQ ID NO.: 92, y VL de SEQ ID NO.: 97,

(k) VH de SEQ ID NO.: 102, y VL de SEQ ID NO.: 107,

(l) VH de SEQ ID NO.: 122, y VL de SEQ ID NO.: 127,

(m) VH de SEQ ID NO.: 132, y VL de SEQ ID NO.: 137,

(n) VH de SEQ ID NO.: 144, y VL de SEQ ID NO.: 147 y

(o) VH de SEQ ID NO.: 152 y VL de SEQ ID NO.: 157.

Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo según la invención puede seleccionarse del grupo que consiste en: una molécula de inmunoglobulina, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo humanizado, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv unido por disulfuro, un scFv, un anticuerpo de un solo dominio, un diacuerpo, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo específico doble y un anticuerpo biespecífico.

Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo según la invención puede comprender una VH que comprende una región de entramado de línea germinal humana, preferiblemente VH6-1 y/o una VL que comprende una región de entramado de línea germinal humana, preferiblemente VK1-39. Preferiblemente, un anticuerpo o fragmento de unión del mismo según la invención comprende una VH que comprende una región de entramado de línea germinal humana VH6-1 y/o una VL que comprende una región de entramado de línea germinal humana VK1-39. La región de entramado VH6 se utiliza rara vez en anticuerpos.

Un anticuerpo o fragmento de unión del mismo según la invención puede comprender una región Fc, preferiblemente el anticuerpo es una IgG1, IgG2 o IgG4 o un fragmento de unión de las mismas.

En una realización, un anticuerpo de la invención comprende un dominio constante de IgG humana que tiene una o más sustituciones de aminoácidos en relación con un dominio constante de IgG humana de tipo natural. Un anticuerpo de la invención puede comprender un dominio constante de IgG humana que tiene las sustituciones de aminoácidos M252Y, S254T y T256E ("YTE"), en el que los residuos de aminoácido se numeran según el índice de EU como en Kabat.

Se describe en la presente un anticuerpo frente al virus influenza A o un fragmento de unión del mismo que puede unirse a hemaglutinina del virus influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos un subtipo del grupo 2 del virus influenza A caracterizado porque el anticuerpo o fragmento de unión del mismo compite por la unión a hemaglutinina del virus influenza A con un anticuerpo de la invención, descrito anteriormente. Por consiguiente, se describe en la presente un anticuerpo, o fragmento del mismo, que se une al mismo epítopo que un anticuerpo de la invención, o un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de la invención.

Se describe en la presente un ácido nucleico aislado que codifica para un anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones. El ácido nucleico puede ser un ADNc. Se describen en la presnte secuencias de ácido nucleico que codifican para parte o toda de las cadenas ligera y pesada y CDR de los anticuerpos de la presente invención. Por tanto, se describen en la presente secuencias de ácido nucleico que codifican para parte o toda de las cadenas ligera y pesada y CDR de los anticuerpos de las reivindicaciones. Se proporcionan los números de SEQ ID para las secuencias de ácido nucleico que codifican para las CDR, regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos a modo de ejemplo de las reivindicaciones. Debido a la redundancia del código genético, existirán variantes de las mismas secuencias que codifican para las mismas secuencias de aminoácido.

Se describe en la presente un vector que comprende un ácido nucleico aislado de la divulgación; el vector puede ser un vector de expresión.

Se describe en la presente una célula huésped que comprende un ácido nucleico aislado o un vector de la divulgación. Las células huésped pueden ser líneas celulares de mamífero, tales como las derivadas de células HEK y CHO.

Se describe en la presente método para fabricar un anticuerpo o fragmento de la invención que comprende cultivar una célula huésped de la invención en condiciones adecuadas para la expresión del anticuerpo o fragmento del mismo. Tales métodos pueden comprender además aislar el anticuerpo o fragmento del mismo a partir del cultivo de células huésped y opcionalmente formular el anticuerpo aislado o fragmento para dar una composición.

La invención proporciona aún adicionalmente un anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona una composición que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones, histidina y NaCl a un pH en el intervalo de desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 6.5, preferiblemente a aproximadamente pH 6.0; aún más preferiblemente que comprende un anticuerpo o fragmento del mismo según la invención, histidina de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 mM y NaCl de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 0.2 M, a un pH en el intervalo de desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 6.5, preferiblemente a aproximadamente pH 6.0; lo más preferiblemente que comprende His 25 mM y NaCl 0.15 M a un pH en el intervalo de desde aproximadamente 5.5 hasta aproximadamente 6.5, por ejemplo, a aproximadamente pH 6.0. Adicionalmente, se describe en la presente:

- un anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones para su uso en la profilaxis o el tratamiento de la infección por influenza A en un sujeto;

- un anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones para su uso para impedir la etapa de fusión desencadenada por el pH para la entrada del virus influenza A en las células; o

- un anticuerpo o fragmento del mismo según las reivindicaciones para su uso para inhibir la maduración de HA del virus influenza A.

Los anticuerpos a modo de ejemplo descritos en la presente incluyen: Anticuerpo 3, anticuerpo 5, anticuerpo 6, anticuerpo 8, anticuerpo 10, anticuerpo 11, anticuerpo 12, anticuerpo 13, anticuerpo 14, anticuerpo 15.

La invención también proporciona el uso de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo según la invención en el diagnóstico in vitro de la infección por influenza A en un sujeto.

Descripción detallada

Introducción

La invención está definida por las reivindicaciones. Anticuerpos, incluyendo formas humanas, así como fragmentos, derivados/conjugados y composiciones de los mismos que se unen al tallo de hemaglutinina (HA) del virus influenza A y neutralizan los subtipos del grupo 1 y del grupo 2 de la infección por virus influenza A se describen en la presente; tales anticuerpos anti-tallo de HA del virus influenza A se denominan en la presente anticuerpos de las reivindicaciones. Tal como se utiliza en la presente, el término "neutralizar" se refiere a la capacidad de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo para unirse a un agente infeccioso, tal como virus influenza A, y reducir la actividad biológica, por ejemplo, la virulencia, del agente infeccioso. El requisito mínimo para la neutralización es la capacidad del anticuerpo, o fragmento de unión del mismo, para unirse al agente infeccioso. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención se une inmunoespecíficamente al menos a un epítopo o determinante antigénico especificado del virus influenza A. En una realización más particular, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención se une inmunoespecíficamente al menos a un epítopo o determinante antigénico especificado de la proteína de tallo de HA del virus influenza A.

Un anticuerpo puede neutralizar la actividad de un agente infeccioso, tal como el virus influenza A en diversos puntos durante el ciclo de vida del virus. Por ejemplo, un anticuerpo puede interferir con el acoplamiento del virus a una célula diana interfiriendo con la interacción del virus y uno o más receptores de la superficie celular. Alternativamente, un anticuerpo puede interferir con una o más interacciones tras el acoplamiento del virus con sus receptores, por ejemplo, interfiriendo con la internalización del virus mediante endocitosis mediada por receptor.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo neutraliza la actividad de influenza A interfiriendo con el proceso de fusión, por ejemplo, interfiriendo con la fusión de las membranas viral y endosómica. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo interfiere con el escisión mediada por proteasas de HA0, interfiriendo así con la maduración del virus y la formación del péptido de fusión viral HA2. Por ejemplo, en una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo interfiere con la escisión de HA0 mediada por proteasas, necesaria para la activación del virus influenza A.

Tal como se utilizan en la presente, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos", también conocidos como inmunoglobulinas, engloban anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos de camélidos, anticuerpos quiméricos, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos de anticuerpo que presentan la actividad biológica deseada (por ejemplo la parte de unión al antígeno), Fv unidos por disulfuro (dsFv), y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluyendo, por ejemplo, anticuerpos anti-Id frente a anticuerpos de la invención), intracuerpos y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. En particular, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen al menos un sitio de unión al antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier isotipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), subisotipo (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o alotipo (por ejemplo, Gm, por ejemplo, G1m(f, z, a o x), G2m(n), G3m(g, b o c), Am, Em, y Km(1, 2 o 3)).

Los anticuerpos humanos son habitualmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se une a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por varios dominios constantes (CH). Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante (CL) en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Las cadenas ligeras se clasifican o bien como cadenas lambda o bien como cadenas kappa basándose en la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera. El dominio variable de una cadena ligera kappa también puede indicarse en la presente como VK.

Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpo de longitud completa o intacto, fragmentos de anticuerpo, incluyendo fragmentos de unión al antígeno, anticuerpo de secuencia nativa o variantes de aminoácidos, anticuerpos humanos, humanizados, modificados postraduccionalmente, quiméricos o de fusión, inmunoconjugados y fragmentos funcionales de los mismos. Los anticuerpos pueden modificarse en la región Fc para proporcionar semivida en suero o funciones efectoras deseadas. Tal como se comenta en más detalle en las secciones a continuación, con las regiones Fc apropiadas, el anticuerpo desnudo unido sobre la superficie celular puede inducir citotoxicidad, por ejemplo, por medio de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o reclutando el complemento en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), o reclutando células citotóxicas no específicas que expresan uno o más ligandos efectores que reconocen el anticuerpo unido sobre el tallo de HA del virus influenza A y posteriormente provocan la fagocitosis de la célula en la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) o algún otro mecanismo. Alternativamente, cuando es deseable eliminar o reducir la función efectora, para minimizar los efectos secundarios o las complicaciones terapéuticas, pueden utilizarse otras determinadas regiones Fc. La región Fc de los anticuerpos de la presente invención puede modificarse para aumentar la afinidad de unión por FcRn y por tanto para aumentar la semivida en suero. Alternativamente, la región Fc puede conjugarse con PEG o albúmina para aumentar la semivida en suero o alguna otra conjugación que dé como resultado el efecto deseado.

Los presentes anticuerpos anti-tallo de HA del virus influenza A son útiles para su uso para diagnosticar, prevenir, tratar y/o aliviar uno o más síntomas de la infección por virus influenza A en un mamífero.

La invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo anti-tallo de HA del virus influenza A de las reivindicaciones y un portador. Para los fines de anticuerpos o fragmentos de unión tal como se reivindican para su uso para prevenir o tratar la infección por virus influenza A, pueden administrarse composiciones al paciente que necesita tal tratamiento. La invención también proporciona formulaciones que comprenden un anticuerpo anti-tallo de HA del virus influenza A de las reivindicaciones y un portador. En una realización, la formulación es una formulación terapéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable.

Se desciben en la presente anticuerpos o fragmentos de unión tal como se reivindican para su uso en métodos útiles para prevenir o tratar la infección por influenza A en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo al mamífero. Las composiciones terapéuticas de anticuerpo pueden administrarse a corto plazo (de manera aguda), de manera crónica o de manera intermitente tal como determine un médico.

Se describen en la presente artículos de fabricación que comprenden al menos un anticuerpo anti-tallo de HA del virus influenza A, tales como formas de dosificación estériles y kits. Se describen en la presente kits que contienen los anticuerpos para la detección y cuantificación de virus influenza A in vitro, por ejemplo, en un ELISA o una inmunotransferencia de tipo Western. Tal anticuerpo útil para la detección puede dotarse de un marcador tal como un radiomarcador o marcador fluorescente.

Terminología

Antes de describir la presente invención en detalle, debe entenderse que esta invención no se limita a composiciones específicas o etapas de procedimiento, ya que tales pueden variar. Debe indicarse que, tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, la forma singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos científicos y técnicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que interpreta comúnmente un experto en la técnica a la que se refiere esta descripción. Por ejemplo, el Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; y el Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a un experto un diccionario general de muchos de los términos utilizados en esta invención.

En la presente, se puede hacer referencia a los aminoácidos ya sea mediante sus símbolos de tres letras conocidos habitualmente o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. De modo similar, se puede hacer referencia a los nucleótidos mediante sus códigos de una única letra aceptados habitualmente.

La numeración de aminoácidos en el dominio variable, la región determinante de complementariedad (CDR) y las regiones de entramado (FR) de un anticuerpo sigue, a menos que se indique otra cosa, la definición de Kabat expuesta en Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), Utilizando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos o más aminoácidos correspondientes a un acortamiento o una inserción en una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de la cadena pesada puede incluir una inserción de un solo aminoácido (residuo 52a según Kabat) tras el residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, los residuos 82a, 82b, 82c, etc., según Kabat) tras el residuo 82 de FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada según Kabat "convencional". La alineación máxima de residuos de región de entramado requiere frecuentemente la inserción de residuos "espaciadores" en el sistema de numeración, que va a utilizarse para la región Fv. Además, la identidad de ciertos residuos individuales en cualquier número correspondiente a un sitio de Kabat dado puede variar de una cadena de anticuerpo a otra cadena de anticuerpo debido a la divergencia alélica o entre especies diferentes.

Anticuerpos anti-tallo de HA del virus influenza A

En determinadas realizaciones, los anticuerpos se aíslan y/o se purifican y/o son anticuerpos libres de pirógenos. El término "purificado" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a otras moléculas, por ejemplo molécula de polipéptido, de ácido nucleico que se han identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Por tanto, en una realización los anticuerpos de la invención son anticuerpos purificados en los que se han separado de uno o más componentes de su entorno natural. El término "anticuerpo aislado" tal como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otras moléculas de anticuerpo que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente al tallo de HA del virus influenza A está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos del tallo de HA del virus influenza A). Por tanto, en una realización los anticuerpos de las reivindicaciones son anticuerpos aislados en los que se han separado de anticuerpos con una especificidad diferente. Normalmente, un anticuerpo aislado es un anticuerpo monoclonal. Además, un anticuerpo aislado de la invención puede estar sustancialmente libre de uno o más otros materiales celulares y/o productos químicos y se denomina en la presente anticuerpo aislado y purificado. En una realización de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" se refiere a anticuerpos que tienen diferentes especificidades y que se combinan en una composición bien definida. A continuación se describen en más detalle métodos de producción y purificación/aislamiento de anticuerpos.

Los anticuerpos aislados de la presente invención comprenden secuencias de aminoácidos dadas a conocer en la presente codificadas por cualquier polinucleótido adecuado, o cualquier anticuerpo aislado o formulado.

Los anticuerpos de la invención se unen inmunoespecíficamente al menos a un epítopo especificado específico para la proteína de tallo de HA del virus influenza A. El término "epítopo", tal como se utiliza en la presente, se refiere a un determinante proteico capaz de unirse a un anticuerpo. Los epítopos incluyen habitualmente agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen habitualmente características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se diferencian en que la unión a los primeros, pero no a los segundos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo se une a un epítopo que se conserva entre al menos H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17, o todos los subtipos de HA de influenza A. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo se une a un epítopo que se conserva entre uno o más, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 subtipos del grupo 1 del virus influenza A seleccionados de H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 y H16 y uno o más, o al menos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 subtipos del grupo 2 seleccionados de H3, H4, H7, H10, H14 y H15.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo se une a al menos 17H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 o H17 o todos los subtipos de influenza A con una CE50 de entre aproximadamente 0.01 ug/ml y aproximadamente 5 ug/ml, o entre aproximadamente 0.01 ug/ml y aproximadamente 0.5 ug/ml, o entre aproximadamente 0.01 ug/ml y aproximadamente 0.1 ug/ml, o menor de aproximadamente 5 ug/ml, 1 ug/ml, 0.5 ug/ml, 0.1 ug/ml o 0.05 ug/ml. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo se une a uno o más, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 subtipos del grupo 1 del virus influenza A seleccionados de H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13 y H16 y uno o más, o al menos 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 subtipos del grupo 2 seleccionados de H3, H4, H7, H10, H14 y H15 con una CE50 de entre aproximadamente 0.01 ug/ml y aproximadamente 5 ug/ml, o entre aproximadamente 0.01 ug/ml y aproximadamente 0.5 ug/ml, o entre aproximadamente 0.01 ug/ml y aproximadamente 0.1 ug/ml, o menor de aproximadamente 5 ug/ml, 1 ug/ml, 0.5 ug/ml, 0.1 ug/ml o 0.05 ug/ml.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo reconoce un epítopo que es o bien un epítopo lineal o bien un epítopo continuo. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo reconoce un epítopo no lineal o conformacional. en una realización, el epítopo se ubica en la región de tallo altamente conservada de HA2. En una realización más particular, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo se une a un epítopo conformacional en la región de tallo altamente conservada de HA2. En una realización, el epítopo incluye uno o más aminoácidos seleccionados de: las posiciones 18, 19, 42, 45 en la región de tallo de HA2 (las posiciones se numeran según el sistema de numeración H3 tal como se describe en Weiss et al., J. Mol. Biol. (1990) 212, 737-761 (1990)) como residuos de contacto. En una realización más particular, el epítopo incluye uno o más aminoácidos seleccionados de 18, 19, 42 y 45 en la región de tallo de HA2 como residuos de contacto. En una realización adicional, el epítopo incluye los aminoácidos 18, 19, 42 y 45 en la región de tallo de HA2 como residuos de contacto. En una realización aún adicional, el epítopo incluye los aminoácidos 18, 19 y 42 en la región de tallo de HA2 como residuos de contacto.

El epítopo o epítopos reconocidos por el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención pueden tener varios usos. Por ejemplo, el epítopo en forma purificada o sintética puede utilizarse para generar respuestas inmunitarias (es decir, como una vacuna o para la producción de anticuerpos para otros usos) o para cribar sueros para detectar anticuerpos que reaccionan inmunológicamente con el epítopo. En una realización, un epítopo reconocido por el anticuerpos o fragmento de unión del mismo de la invención, o un antígeno que tiene un epítopo del mismo tipo puede utilizarse como vacuna para generar una respuesta inmunitaria. En otra realización, los anticuerpos y fragmentos de unión de la invención pueden utilizarse para monitorizar la calidad de las vacunas, por ejemplo determinando si el antígeno en una vacuna contiene el epítopo inmunogénico correcto en la conformación correcta.

Regiones variables

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo original" se refiere a un anticuerpo que está codificado por una secuencia de aminoácidos utilizada para la preparación de la variante o el derivado, definido en la presente. El polipéptido original puede comprender una secuencia de anticuerpo nativa (es decir, una variante que se produce de manera natural, incluyendo una variante alélica que se produce de manera natural) o una secuencia de anticuerpo con modificaciones de la secuencia de aminoácidos preexistentes (tales como inserciones, deleciones y/o sustituciones) de una secuencia que se produce de manera natural. El anticuerpo original puede ser un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. En realizaciones específicas, los anticuerpos de la invención son variantes del anticuerpo original. Tal como se utiliza en la presente, el término "variante" se refiere a un anticuerpo, que difiere en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de anticuerpo "original" en virtud de la adición, eliminación y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácido en la secuencia de anticuerpo original.

La porción de unión al antígeno de un anticuerpo comprende uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno. Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede ser llevada a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab , un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1 ; (ii) un fragmento F(ab')2 , un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región de bisagra ; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1 ; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH ; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv , VL y VH, están codificados por genes separados, pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un ligador sintético que permite que se produzcan como una única cadena proteica en la que los pares de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv); véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Se pretende que tales anticuerpos de cadena única también queden englobados en la expresión "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se someten a un cribado para determinar su utilidad del mismo modo que si fueran anticuerpos intactos. Pueden producirse partes de unión al antígeno mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante escisión enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

Los anticuerpos de la invención comprenden al menos un dominio de unión a antígeno, que comprende un dominio VH y un dominio VL descritos en la presente.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos purificados comprenden un VH y/o VL que tiene un porcentaje de identidad dado con al menos una de las secuencias de VH y/o VL dadas a conocer en la tabla 1. Tal como se utiliza en la presente, el término "porcentaje (%) de identidad de secuencia", que también incluye "homología" se define como el porcentaje de residuos de aminoácido o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido o nucleótidos las secuencias de referencia, tales como la secuencia de anticuerpo original , tras alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el porcentaje de identidad de secuencia máximo, y sin considerar ninguna sustitución conservativa como parte de la identidad de secuencia. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede producirse, además de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, o por medio de programas informáticos que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

Se describen en la presente anticuerpos que pueden comprender una secuencia de aminoácidos de VH que tiene una identidad de al menos el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o que tiene una identidad del 100% con las secuencias de aminoácidos de VH. Se describen en la presente anticuerpos que pueden tener una secuencia de aminoácidos de VH que tiene una identidad de al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o que tiene una identidad del 100% con la secuencia de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos de VH descritas en la presente.

Se describen en la presente anticuerpos que pueden comprender una secuencia de aminoácidos de VL que tiene una identidad de al menos el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95% o que tiene una identidad del 100% con las secuencias de aminoácidos de VL. Se describen en la presente anticuerpos que pueden tener una secuencia de aminoácidos de VL que tiene una identidad de al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o que tiene una identidad del 100% con las secuencias de aminoácidos de VL descritas en la presente.

Los anticuerpos tal como se reivindican pueden neutralizar uno o más subtipos del grupo 1 y uno o más subtipos del grupo 2 del virus influenza A, tal como se describe en la presente.

Regiones determinantes de complementariedad (CDR)

Aunque el dominio variable (VH y VL) comprende la región de unión al antígeno; la variabilidad no se distribuye uniformemente por los dominios variables de los anticuerpos. Está concentrada en segmentos denominados regiones determinantes de la complementariedad (CDR), tanto en los dominios variables de la cadena ligera (VL o VK) como de la cadena pesada (VH). Las porciones más conservadas de los dominios variables se denominan las regiones estructurales (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada una cuatro FR, que adoptan en gran medida una configuración en lámina p, conectadas por tres CDR, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. Las CDR en cada cadena se mantienen juntas en proximidad estrecha mediante la FR y, con las CDR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (véase, Kabat et al., citado anteriormente). Las tres CDR de la cadena pesada se denominan CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 y las tres CDR de la cadena ligera se denominan CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3. En la presente se emplea el sistema de numeración de Kabat. Como tal, CDR-H1 comienza en aproximadamente el aminoácido 31 (es decir, aproximadamente 9 residuos tras el primer residuo de cisteína), incluye aproximadamente 5-7 aminoácidos y termina en el siguiente residuo de tirosina. CDR-H2 comienza en el residuo decimoquinto tras el final de CDR- H1, incluye aproximadamente 16-19 aminoácidos y termina en el siguiente residuo de arginina o lisina. CDR-H3 comienza en aproximadamente el residuo de aminoácido trigésimo tercero tras el final de CDR-H2; incluye 3-25 aminoácidos; y termina en la secuencia W-G-X-G, en la que X es cualquier aminoácido. CDR-L1 comienza en aproximadamente el aminoácido 24 (es decir, tras un residuo de cisteína); incluye aproximadamente 10-17 residuos; y termina en el siguiente residuo de tirosina. CDR-L2 comienza en aproximadamente en el residuo decimoséptimo tras el final de CDR-L1 e incluye aproximadamente 7 residuos. CDR-L3 comienza en aproximadamente el residuo de aminoácido trigésimo tercero tras el final de CDR-L2; incluye 7-11 aminoácidos; y termina en la secuencia F-G-X-G, en la que X es cualquier aminoácido. Cabe destacar que las CDR varían considerablemente de un anticuerpo a otro (y por definición no exhibirán homología con las secuencias consenso de kabat).

Se describen en la presente anticuerpos anti-tallo de HA de influenza A neutralizantes que comprenden aminoácidos los aminoácidos en una secuencia que es sustancialmente la misma que una secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento. Las secuencias de aminoácidos que son sustancialmente las mismas que las secuencias descritas en el presente documento incluyen secuencias que comprenden sustituciones de aminoácidos conservativas, así como deleciones y/o inserciones de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos de por ejemplo, el anticuerpo 11, el anticuerpo 12, el anticuerpo 13, el anticuerpo 14 o el anticuerpo 15, o en una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 102, 112, 122, 132 o 142. Una sustitución de aminoácidos conservativa se refiere a la sustitución de un primer aminoácido por un segundo aminoácido que tiene propiedades químicas y/o físicas (por ejemplo, carga, estructura, polaridad, hidrofobicidad/hidrofilicidad) que son similares a los del primer aminoácido. Las sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un aminoácido por otro dentro de los siguientes grupos : lisina (K), arginina (R) e histidina (H); aspartato (D) y glutamato (E); asparagina (N), glutamina (Q), serina (S), treonina (T), tirosina (Y), K, R, H, D y E; alanina (A), valina (V), leucina (L), isoleucina (I), prolina (P), fenilalanina (F), triptófano (W), metionina (M), cisteína (C) y glicina (G); F, W y Y; C, S y T.

Regiones de entramado

Los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras comprenden cuatro regiones de entramado (FR1, FR2, FR3, FR4), que son las porciones más altamente conservadas de los dominios variables. Las cuatro FR de la cadena pesada se denominan FR-H1, FR-H2 y FR-H3 y las cuatro FR de la cadena ligera se denominan FR-L1, FR-L2, FR-L3 y FR-L4. El sistema de numeración de Kabat se usa en la presente, véase la tabla 1, Kabat et al, citado anteriormente. Como tal, FR-H1 comienza en la posición 1 y termina en aproximadamente el aminoácido 30, FR-H2 va aproximadamente desde el aminoácido 36 hasta el 49, FR-H3 va aproximadamente desde el aminoácido 66 hasta el 94 y FR-H4 va aproximadamente desde el aminoácido 103 hasta 113. FR-H1 comienza en el aminoácido 1 y termina en aproximadamente el aminoácido 23, FR-L2 va aproximadamente desde el aminoácido 35 hasta el 49, FR-L3 va aproximadamente desde el aminoácido 57 hasta el 88 y FR-L4 va aproximadamente desde el aminoácido 98 hasta el 107. En determinadas realizaciones, las regiones de entramado pueden contener sustituciones según el sistema de numeración de Kabat, por ejemplo, inserción en 106A en FR-L1. Además de sustituciones que se producen de manera natural, también pueden introducirse una o más alteraciones (por ejemplo, sustituciones) de residuos de FR en un anticuerpo de la invención, siempre que retenga la actividad neutralizante. En determinadas realizaciones, éstas dan como resultado una mejora u optimización en la afinidad de unión del anticuerpo para el tallo de HA del virus influenza A. Los ejemplos de residuos de región de entramado para modificar incluyen los que se unen de manera no covalente al antígeno directamente (Amit et al., Science, 233:747-753 (1986)); interaccionan con/afectan a la conformación de una CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)); y/o participan en la superficie de contacto VL-VH (patente estadounidense n.° 5,225,539).

En otra realización la FR puede comprender uno o más cambios de aminoácidos para los fines de "mutación de la línea germinal". Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos seleccionadas se comparan con secuencias de aminoácidos de cadenas pesadas y ligeras de la línea germinal y cuando determinados residuos de región de entramado de la de las cadenas VL y/o VH seleccionadas difieren de la configuración de la línea germinal (por ejemplo, como resultado de mutación somática de los genes de inmunoglobulina utilizados para preparar la biblioteca de fagos), puede ser deseable "someter a retromutación" los residuos de región de entramado alterados de los anticuerpos seleccionados a la configuración de la línea germinal (es decir, cambiar las secuencias de aminoácidos de región de entramado de los anticuerpos seleccionados de modo que sean iguales que las secuencias de aminoácidos de región de entramado de la línea germinal ). Tal "retromutación" (o "mutación de la línea germinal") de residuos de región de entramado puede lograrse mediante métodos de biología molecular convencionales para introducir mutaciones específicas (por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio; mutagénesis mediada por PCR, y similares).

Secuencias de nucleótidos que codifican para anticuerpos de la invención

Además de las secuencias de aminoácidos descritas anteriormente, se describen en la presente secuencias de nucleótidos que corresponden a las secuencias de aminoácidos y que codifican para los anticuerpos humanos de las reivindicaciones.

Se describen en la presente polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para un anticuerpo descrito en la presente o fragmentos del mismo. Éstas incluyen, pero sin carácter limitante, secuencias de nucleótidos que codifican para las secuencias de aminoácidos a las que se hizo referencia anteriormente. Por tanto, se describen en la presente secuencias de polinucleótido que codifican para regiones de entramado VH y VL que incluyen CDR y FR de anticuerpos descritos en la presente así como vectores de expresión para su expresión eficaz en células (por ejemplo, células de mamífero). A continuación se describen en más detalle métodos de preparación de los anticuerpos usando polinucleótidos.

Se describen en la presente polinucleótidos que se hibridan en condiciones de hibridación rigurosas o de menor rigurosidad, por ejemplo, tal como se define en el presente documento, con polinucleótidos que codifican para un anticuerpo de la invención descrito en la presente. El término "rigurosidad" tal como se usa en la presente se refiere a condiciones experimentales (por ejemplo temperatura y concentración de sal) de un experimento de hibridación para indicar el grado de homología entre la sonda y el ácido nucleico unido al filtro; cuando mayor es la rigurosidad, mayor será el porcentaje de homología entre la sonda y el ácido nucleico unido al filtro.

Las condiciones de hibridación rigurosas incluyen, pero sin carácter limitante, hibridación con ADN unido al filtro en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C seguido por uno o más lavados en 0.2X SSC/SDS al 0.1% a aproximadamente 50-65°C, condiciones de hibridación altamente rigurosas tales como hibridación con ADN unido al filtro en 6X SSC a aproximadamente 45°C seguido por uno o más lavados en 0.1X SSC/SDS al 0.2% a aproximadamente 65°C, o cualesquiera otras condiciones de hibridación conocidas por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. et al., eds. 1989 Current Protocols en Molecular Biology, vol. 1, Green Publishing Associates, Inc. y John Wiley and Sons, Inc., NY en las páginas 6.3.1 a 6.3.6 y 2.10.3).

Secuencias sustancialmente idénticas pueden ser secuencias polimórficas, es decir, secuencias alternativas o alelos en una población. Una diferencia alélica puede ser tan pequeña como un par de bases. Las secuencias sustancialmente idénticas también pueden comprender secuencias mutagenizadas, que incluyen secuencias que comprenden mutaciones silenciosas. Una mutación puede comprender uno o más cambios de residuos, una eliminación de uno o más residuos, o una inserción de uno o más residuos adicionales.

Los polinucleótidos pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos determinarse, mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos del anticuerpo se conoce, puede ensamblarse un polinucleótido que codifica para el anticuerpo a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, tal como se describe en Kutmeieret al., BioTechniques 17:242 (1994)), lo que, en resumen, implica la síntesis de oligonucleótidos solapantes que contienen porciones de la secuencia que codifica para el anticuerpo, el apareamiento y ligamiento de esos oligonucleótidos, y luego la amplificación de los oligonucleótidos ligados mediante PCR.

También puede generarse un polinucleótido que codifica para un anticuerpo a partir de ácido nucleico de una fuente adecuada si no está disponible un clon que contiene un ácido nucleico que codifica para un anticuerpo particular, pero la secuencia de la molécula de anticuerpo se conoce, puede sintetizarse químicamente un ácido nucleico que codifica para la inmunoglobulina u obtenerse de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpo, o una biblioteca de ADNc generada a partir de, o ácido nucleico, preferiblemente poliA+ARN, aislado de cualquier tejido o célula que expresa el anticuerpo, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo) mediante amplificación por PCR usando cebadores sintéticos que pueden hibridarse con los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación usando una sonda oligonucleotídica específica para la secuencia génica particular que va a identificarse, por ejemplo, un clon de ADNc de una biblioteca de ADNc que codifica para el anticuerpo. Entonces los ácidos nucleicos amplificados generados mediante PCR pueden clonarse en vectores de clonación que pueden replicarse usando cualquier método conocido en la técnica.

Una vez determinada la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos correspondiente del anticuerpo, puede manipularse la secuencia de nucleótidos del anticuerpo usando métodos bien conocidos en la técnica para la manipulación de secuencias de nucleótidos, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénesis dirigida al sitio, PCR, etc. (véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols en Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY), para generar anticuerpos que tienen una secuencia de aminoácidos diferente, por ejemplo para crear sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos.

Características de unión

Se describen en la presenteLos anticuerpos anti-tallo de HA del virus influenza A que se unen inmunoespecíficamente a al menos un epítopo especificado o determinantes antigénicos de proteína, péptido, subunidad, fragmento o porción de tallo HA del virus influenza A, o cualquier combinación de los mismos o bien exclusivamente o bien preferentemente con respecto a otros polipéptidos. El término "epítopo" o "determinante antigénico" tal como se usa en la presente se refiere a un determinante proteico que puede unirse a un anticuerpo, en el que el término "unión" en la presente se refiere preferiblemente a unión específica. Estos determinantes proteicos o epítopos consisten habitualmente en agrupaciones de superficie químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen habitualmente características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se diferencian en que la unión a los primeros, pero no a los segundos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. El término "epítopo discontinuo" tal como se usa en la presente, se refiere a un epítopo conformacional en un antígeno proteico que se forma a partir de al menos dos regiones separadas en la secuencia primaria de la proteína.

Las interacciones entre antígenos y anticuerpos son las mismas que para otras interacciones proteína-proteína no covalentes. En general, existen cuatro tipos de interacciones de unión entre antígenos y anticuerpos: (i) enlaces de hidrógeno, (ii) fuerzas de dispersión, (iii) fuerzas electrostáticas entre ácidos de Lewis y bases de Lewis y (iv) interacciones hidrófobas. Las interacciones hidrófobas son una fuerza impulsora principal para la interacción anticuerpoantígeno, y se basan en la repulsión del agua por grupos no polares en vez de atracción de moléculas (Tanford, 1978). Sin embargo, determinadas fuerzas físicas también contribuyen a la unión antígeno-anticuerpo, por ejemplo, el ajuste o complementariedad de conformaciones de epítopos con sitios de unión al anticuerpo diferentes. Además, otros materiales y antígenos pueden reaccionar de manera cruzada con un anticuerpo, compitiendo de ese modo por el anticuerpo libre disponible.

La medición de la constante de afinidad y la especificidad de unión entre el antígeno y el anticuerpo es un elemento fundamental en la determinación de la eficacia de los métodos profilácticos, terapéuticos, de diagnóstico y de investigación que usan los anticuerpos de la invención. "Afinidad de unión" se refiere en general a la fuerza de la suma total de las interacciones no covalentes entre un sitio de unión único de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su pareja de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique otra cosa, tal como se usa en la presente, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1:1 entre elementos de un par de unión (por ejemplo, un anticuerpo y un antígeno). La afinidad de una molécula X por s pareja Y puede representarse en general mediante la constante de disociación en equilibrio (Kd), que se calcula como la razón kf/kon. Véase, por ejemplo, Chen, Y., et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. La afinidad puede medirse mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluyendo los descritos y ejemplificados en la presente. Un ejemplo de un sistema disponible comercialmente para la caracterización cinética incluye la familia OCTET® de instrumentos. Los anticuerpos de baja afinidad generalmente se unen al antígeno lentamente y tienden a disociarse fácilmente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad generalmente se unen al antígeno más rápido y tienden a permanecer unidos más tiempo. Se conocen en la técnica una variedad de métodos de medición de la afinidad de unión, cualquiera de los cuales puede usarse para los fines de la presente invención.

La determinación de la afinidad de unión puede medirse usando las técnicas específicas descritas adicionalmente en la sección de ejemplos, y métodos conocidos en la técnica. Un método del mismo tipo incluye medir la constante de disociación "Kd" mediante un ensayo de unión a antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión de Fab del anticuerpo de interés y su antígeno tal como se describe mediante el siguiente ensayo que mide la afinidad de unión en disolución de Fab por el antígeno equilibrando Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125I) en presencia de una serie de titulación de antígeno no marcado, capturando luego el antígeno unido con una placa recubierta con anticuerpo anti-Fab (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para establecer las condiciones para el ensayo, se recubren placas de microtitulación (Dynex) durante la noche con 5 |jg/ml de un anticuerpo de captura anti-Fab (Cappel Labs) en carbonato de sodio 50 mM (H 9.6), y posteriormente se bloquean con albúmina sérica bovina al 2% (p/v) en PBS durante de dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23° C). En una placa no adsorbente (Nunc n.° 269620), se mezcla antígeno marcado con [125I] 100 pM o 26 pM con diluciones en serie de un Fab de interés (por ejemplo, consecuente con la evaluación de un anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599). El Fab de interés se incuba entonces durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un periodo más largo (por ejemplo, 65 horas) para garantizar que se alcanza el equilibrio. Después de eso, se transfieren las mezclas a la placa de captura para su incubación a temperatura ambiente (por ejemplo, durante una hora). Entonces se retira la disolución y se lava la placa ocho veces con Tween-20 al 0.1% en PBS. Cuando las placas se han secado, se añaden 150 jl/pocillo de centelleante (MicroScint-20; Packard), y se cuentan las placas en un contador gamma Topcount (Packard) durante diez minutos. Se eligen las concentraciones de cada Fab que proporcionan menos de o igual al 20% de la unión máxima para su uso en ensayos de unión de competición.

En otro caso, el valor de Kd puede medirse usando ensayos de resonancia de plasmón superficial utilizando un instrumento BIAcore™-2000 o BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) a 25° C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a "10 unidades de respuesta (UR). En resumen, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) según las instrucciones del proveedor. El antígeno se diluye acetato de sodio 110 mM , pH 4.8, en 5 ug/ml ("0.2 uM) antes de la inyección a una velocidad de flujo de 5 ul/minuto para lograr aproximadamente 10 unidades de respuesta (UR) de proteína acoplada. Tras la inyección del antígeno, se inyecta etanolamina IM para bloquear los grupos que no han reaccionado. Para mediciones cinéticas, se inyectan diluciones en serie de dos veces de Fab (de 0.78 nM a 500 nM) en PBS con Tween 20 al 0.05% (PBST) a 25° C a una velocidad de flujo de aproximadamente 25 ul/min. Las velocidades de asociación (kon) y las velocidades de disociación (koff) se calculan utilizando un modelo de unión de Langmuir uno a uno sencillo (BIAcore Evaluation Software versión 3.2) ajustando simultáneamente el sensograma de asociación y disociación.

Si la velocidad de asociación supera 106 M-1 S-1 mediante el ensayo de resonancia de plasmón superficial anterior, entonces las velocidad de asociación puede determinarse usando una técnica de extinción de fluorescencia que mide el aumento o la disminución en la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación=295 nm; emisión=340 nm, paso de banda de 16 nm) a 25° C de un anticuerpo anti-antígeno 20 nM (forma Fab) en PBS, pH 7.2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno tal como se mide en un espectrómetro, tal como un espectrofotómetro equipado con parada de flujo (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro SLM-Aminco de la serie 8000 (ThermoSpectronic) con una cubeta de agitación de color rojo. La "velocidad de asociación" o "kon" según esta invención también puede determinarse con la misma técnica de resonancia de plasmón superficial descrita anteriormente usando un instrumento BIAcore™-2000 o BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, N.J.) tal como se describió anteriormente.

Los métodos y reactivos adecuados para la determinación de las características de unión de un anticuerpo de la presente invención, o un derivado alterado/mutante del mismo (comentado a continuación), se conocen en la técnica y/o están disponibles comercialmente (patentes estadounidenses n.os 6,849,425; 6,632,926; 6,294,391; 6,143,574).

Además, el equipo y software diseñados para tales análisis cinéticos están disponibles comercialmente (por ejemplo, instrumentos Biacore® A100 y Biacore® 2000; Biacore International AB, Uppsala, Suecia).

En una realización, los anticuerpos de las presentes reivindicaciones, incluyendo fragmentos de unión o variantes de los mismos, también pueden describirse o especificarse en cuanto a su afinidad de unión por polipéptidos del virus influenza A. Normalmente, los anticuerpos con alta afinidad tienen una Kd de menos de 10-7 M. En una realización, los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos se unen a polipéptidos de influenza A, o fragmentos o variantes de los mismos, con una constante de disociación o Kd de menos de o igual a 5*10-7 M, 10-7 M, 5*10-8 M, 10-8 M, 5*10-9 M,

10-9 M, 5x10-1° M, 10-10 M, 5*10-11 M, 10-11 M, 5*10-12 M, 10-12 M, 5*10-13 M, 10-13 M, 5*10-14 M, 10-14 M, 5*10-15 M o

10-15 M. Los polipéptidos de influenza A pueden incluir polipéptidos de HA. En una realización más particular, los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos tal como se reivindican se unen a polipéptidos de influenza A, o fragmentos o variantes de los mismos, con una constante de disociación o Kd de menos de o igual a 5*10-10 M, 10-10 M,

5*10-11 M, 10-11 M, 5*10-12M o 10-12M. La invención engloba anticuerpos tal como se reivindican que se unen a polipéptidos de influenza A con una constante de disociación o Kd que está dentro de un intervalo entre cualquiera de los valores individuales mencionados.

En otra realización, los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de las reivindicaciones se unen a polipéptidos de influenza A o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad de disociación (koff) de menos de o igual a

5*10-2s-1, 10-2s-1, 5*10-3 s-1 o 10-3s-1, 5*10-4s-1, 10-4 s-1, 5*10-5 s-1, o 10-5 s-1, 5*10-6 s-1, 10-6 s-1, 5*10-7 s-1 o 10-7 s-1. En una realización más particular, los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de las reivindicaciones se unen a polipéptidos de influenza A o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad de disociación (koff) menor de o igual a 5*10-4 s-1, 10-4 s-1, 5*10-5 s-1, o 10-5 s-1, 5*10-6 s-1, 10-6 s-1, 5*10-7 s-1 o 10-7 s-1. Las reiv también engloban anticuerpos que se unen a polipéptidos de influenza A con una velocidad de disociación (koff) que está dentro de un intervalo entre cualquiera de los valores individuales mencionados.

En otra realización, los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de las reivindicaciones se unen a polipéptidos de influenza A o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad de asociación (kon) de más de o igual a 103

M-1 s-1, 5*103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1, 5*104 M-1 s-1, 105 M-1 s-1, 5*105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, 5*106 M-1 s-1, 107 M-1 s-1, o

5*107 M-1 s-1. En una realización más particular, los anticuerpos o fragmentos de unión de los mismos de las reivindicaciones se unen a polipéptidos de influenza A o fragmentos o variantes de los mismos con una velocidad de asociación (kon) mayor de o igual a 105 M-1 s-1, 5*105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, 5*106 M-1 s-1, 107 M-1 s-1 o 5*107 M-1 s-1. Las reivindicaciones engloban anticuerpos que se unen a polipéptidos de influenza A con una velocidad de asociación (kon) que está dentro de un intervalo entre cualquiera de los valores individuales mencionados.

En una realización, puede realizarse un ensayo de unión o bien como ensayos de unión directa o bien como ensayos de unión de competición. La unión puede detectarse usando ensayos ELISA convencionales o ensayos de citometría de flujo convencionales. En un ensayo de unión directa, se somete a prueba un anticuerpo candidato para detectar la unión a su antígeno relacionado. Por otro lado, el ensayo de unión de competición evalúa la capacidad de un anticuerpo candidato para competir con un anticuerpo conocido u otro compuesto que se une al tallo de HA del virus influenza A.

En general, se puede utilizar cualquier método que permita que pueda detectarse la unión de un anticuerpo con el tallo de HA del virus influenza A para detectar y medir las características de unión de los anticuerpos. Un experto en la técnica reconocerá estos métodos bien conocidos y por este motivo no se proporcionan en detalle en la presente. Estos métodos se utilizan también para someter a cribado un panel de anticuerpos para detectar los que proporcionan las características deseadas.

Un anticuerpo de las reivindicaciones puede unirse inmunoespecíficamente al tallo de HA del virus influenza A y puede ser capaz de neutralizar la infección por el virus influenza A. Pueden realizarse ensayos de neutralización tal como se describe en la presente en la sección de ejemplos o utilizando otros métodos conocidos en la técnica. El término "concentración inhibitoria al 50%" (abreviada como "CI50") representa la concentración de un inhibidor (por ejemplo, un anticuerpo de la invención) que se requiere para un 50% de neutralización del virus influenza A. Un experto habitual en la técnica entenderá que un valor de CI50 inferior corresponde a un inhibidor más potente.

En una realización, un anticuerpo o fragmento de unión del mismo según las reivindicaciones tiene una potencia de neutralización expresada como concentración inhibitoria al 50% (CI50 ug/ml) en el intervalo de desde aproximadamente

0.01 ug/ml hasta aproximadamente 50 ug/ml, o en el intervalo de desde aproximadamente 0.01 ug/ml hasta aproximadamente 5 ug/ml de anticuerpo, o en el intervalo de desde aproximadamente 0.01 ug/ml hasta aproximadamente 0.1 ug/ml de anticuerpo para la neutralización del virus influenza A en un ensayo de microneutralización. La mayor concentración de anticuerpo usada en el ensayo de microneutralización descrita en la presente fue de 50 ug/ml. La alta potencia de los anticuerpos de las reivindicaciones significa que pueden utilizarse concentraciones inferiores de anticuerpo para lograr el 50% de neutralización del virus influenza A.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de las reivindicaciones pueden inducir muerte celular. Un anticuerpo que "induce muerte celular" en uno que provoca que una célula viable se convierta en no viable. La muerte celular in vitro puede determinarse en ausencia del complemento y células efectoras inmunitarias para distinguir la muerte celular inducida por citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Por tanto, el ensayo para detectar muerte celular puede realizarse usando suero inactivado por calor (es decir, en ausencia del complemento) y en ausencia de células efectoras inmunitarias. Para determinar si el anticuerpo puede inducir muerte celular, puede evaluarse la pérdida de integridad de la membrana tal como se evalúa mediante la captación de yoduro de propidio (PI), azul trípano (véase Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)), 7AAD u otros métodos bien conocidos en la técnica en relación con células no tratadas.

En una realización específica, los anticuerpos de las reivindicaciones pueden inducir muerte celular por medio de apoptosis. Un anticuerpo que "induce apoptosis" es uno que induce muerte celular programada tal como se determina mediante unión de anexina V, fragmentación del ADN, contracción celular, dilatación del retículo endoplasmático, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptóticos). Están disponibles diversos métodos para evaluar los acontecimientos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidilserina (PS) puede medirse mediante la unión de anexina; la fragmentación del ADN puede evaluarse a través de marcadores de tamaño molecular del ADN; y la condensación nuclear/de cromatina junto con la fragmentación del ADN pueden evaluarse mediante cualquier aumento en células hipodiploides. Preferiblemente, el anticuerpo que induce apoptosis es uno que da como resultado de aproximadamente 2 a 50 veces, preferiblemente de aproximadamente 5 a 50 veces, y lo más preferiblemente de aproximadamente 10 a 50 veces de inducción de unión de anexina en relación con una célula no tratada en un ensayo de unión de anexina.

En otra realización específica, los anticuerpos de las reivindicaciones pueden inducir muerte celular por medio de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o citotoxicidad mediada por células dependiente del complemento (CDC) y/o fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP). La expresión de la actividad de ADCC y actividad de CDC de anticuerpos de la subclase de IgG1 humana implica generalmente la unión de la región Fc del anticuerpo a un receptor para un anticuerpo (a continuación en la presente denominado "FcyR") existente en la superficie de células efectoras tales como células citotóxicas, células citotóxicas naturales o macrófagos activados. Se pueden unir varios componentes del complemento. Con respecto a la unión, se ha sugerido que varios residuos de aminoácido en la región de bisagra y el segundo dominio de la región C (a continuación en la presente denominado "dominio Cy2") del anticuerpo son importantes (Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) y que una cadena de azúcar en el dominio C^y2 (Chemical Immunology, 65, 88 (1997)) es también importante.

Para evaluar la actividad de ADCC de un anticuerpo de interés , puede usarse un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en la patente estadounidense n.° 5,500,362. El ensayo puede realizarse también usando un kit disponible comercialmente, por ejemplo CytoTox 96 ® (Promega). Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen, pero sin carácter limitante células mononucleares de sangre periférica (PBMC), células citotóxicas naturales (NK) y líneas de células NK. Líneas de células NK que expresan un receptor de Fc transgénico (por ejemplo, CD16) y un péptido de señalización asociado (por ejemplo FC^eRI-^y) también pueden servir como células efectoras (documento WO 2006/023148). Por ejemplo, puede someterse a ensayo la capacidad de cualquier anticuerpo particular para mediar en la lisis mediante activación del complemente y/o ADCC. Las células de interés se hacen crecer y se marcan in vitro; el anticuerpo se añade al cultivo celular en combinación con células inmunitarias que pueden activarse mediante los complejos de antígeno-anticuerpo; es decir, células efectoras implicadas en la respuesta de ADCC. El anticuerpo también puede someterse a prueba para detectar activación del complemento. En cualquier caso, se detecta citólisis mediante la liberación del marcador de las células lisadas. El graso de lisis celular también puede determinarse detectando la liberación de proteínas citoplasmáticas (por ejemplo LDH) en el sobrenadante. De hecho, los anticuerpos pueden someterse a cribado usando el suero del propio paciente como fuente de complemento y/o células inmunitarias. Los anticuerpos que pueden mediar en la ADCC humana en la prueba in vitro pueden usarse entonces terapéuticamente en ese paciente particular. La actividad de ADCC de la molécula de interés también puede evaluarse in vivo, por ejemplo, un modelo animal tal como el dado a conocer en Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:652-656 (1998). Además, se conocen bien en la técnica técnicas para modular (es decir, aumentar o disminuir) el nivel de ADCC, y opcionalmente la actividad de CDC , de un anticuerpo (por ejemplo, patentes estadounidenses n.os 5,624,821; 6,194,551; 7,317,091). Los anticuerpos de las presentes reivindicaciones pueden ser capaces de o pueden haberse modificado para tener la capacidad de inducir ADCC y/o CDC. Pueden ponerse en práctica ensayos para determinar la función de ADCC usando células efectoras humanas para evaluar la función de ADCC humana. Tales ensayos también pueden incluir los destinados a someter a cribado para detectar anticuerpos que inducen, median en, potencian, bloquean la muerte celular mediante mecanismos necróticos y/o apoptóticos. Tales métodos, incluyendo ensayos que utilizan colorantes viables, métodos de detección y análisis de caspasas, y ensayos que miden roturas del ADN pueden utilizarse para evaluar la actividad apoptótica de células cultivadas in vitro con un anticuerpo de interés.

Producción de anticuerpos

Los siguiente describe técnicas a modo de ejemplo para la producción de los anticuerpos útiles en la presente invención.

Anticuerpos monoclonales

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica incluyendo el uso de hibridoma (Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., anticuerpos: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal anticuerpos y T-Cel1Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981), tecnologías recombinantes y de presentación en fagos, o una combinación de las mismas. El término "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos o aislados, por ejemplo, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se producen de manera natural que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Los anticuerpos monoclonales son sumamente específicos, están dirigidos contra un sitio antigénico único. Además, en contraposición a preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra el mismo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos porque pueden sintetizarse sin contaminación por otros anticuerpos. No debe interpretarse que el modificador "monoclonal" requiera la producción del anticuerpo mediante cualquier método particular. Lo siguiente es una descripción de métodos representativos para producir anticuerpos monoclonales que no se pretende que sea limitativa y puede usarse para producir, por ejemplo, anticuerpos de mamífero, quiméricos, humanizados, humanos, de dominio, diacuerpos, vaccicuerpos, lineales y multiespecíficos monoclonales.

Técnicas de hibridoma

Los métodos para producir y someter a cribado para detectar anticuerpos específicos utilizando la tecnología de hibridoma son rutinarios y se conocen bien en la técnica. En el método de hibridoma, se inmunizan ratones u otros animales huésped apropiados, tales como un hámster, tal como se describió anteriormente para provocar linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unirán específicamente al antígeno usado para la inmunización. Alternativamente, pueden inmunizarse linfocitos in vitro. Tras la inmunización, se aíslan los linfocitos y luego se fusionan con una línea celular de mieloma utilizando un agente de fusión o pareja de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal anticuerpos: Principies y Practice, págs. 59-103 (Academic Press, 1986)). En determinadas realizaciones, las células de mieloma seleccionadas son las que se fusionan eficazmente, soportan una producción de alto nivel estable del anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio de selección que las selecciona frente a las células originales no fusionadas. En un aspecto, las líneas celulares de mieloma son líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. EE.UU., y SP-2 y derivados, por ejemplo, células X63-Ag8-653 disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo, Rockville, Md. EE. UU. También se han descritos líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-ser humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

Una vez producidas células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseadas, los clones pueden subclonarse mediante procedimientos de dilución limitante y hacerse crecer por métodos convencionales (Goding, citado anteriormente). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden hacerse crecer in vivo como tumores ascíticos en un animal, por ejemplo, mediante inyección i.p. de las células en los ratones.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos de purificación de anticuerpos convencionales tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad (por ejemplo, usando proteína A o proteína G-Sepharose) o cromatografía de intercambio iónico, etiquetas de afinidad, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis, etc. A continuación se describen en más detalle métodos de purificación a modo de ejemplo.

Técnicas de ADN recombinante

Los métodos para producir y someter a cribado para detectar anticuerpos específicos utilizando la tecnología de ADN recombinante son rutinarios y se conocen bien en la técnica (por ejemplo patente estadounidense n.° 4,816,567). Puede aislarse y/o secuenciarse fácilmente ADN que codifica para los anticuerpos monoclonales utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas oligonucleotídicas que pueden unirse específicamente a genes que codifican para las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos murinos). Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que entonces se transfectan en células huésped tales como células E. coli , células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen por lo demás proteína de anticuerpo, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes. Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica para el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) y Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992). Tal como se describe a continuación para anticuerpos generados mediante presentación en fagos y humanización de anticuerpos, puede obtenerse ADN o material genético para anticuerpos recombinantes a partir de fuente(s) distinta(s) de hibridomas para generar anticuerpos de las reivindicaciones.

La expresión recombinante de un anticuerpo o variante del mismo requiere generalmente la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica para el anticuerpo. Se describen en la presente vectores que pueden replicarse que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica para una molécula de anticuerpo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de la cadena pesada o ligera de un anticuerpo o una porción del mismo, o una CDR de cadena pesada o ligera, operativamente unida a un promotor. Tales vectores pueden incluir la secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante de la molécula de anticuerpo (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5,981,216; 5,591,639; 5,658,759 y 5,122,464) y el dominio variable del anticuerpo puede clonarse en un vector del mismo tipo para la expresión de toda la cadena pesada, toda la cadena ligera, o tanto toda la cadena pesada como toda la cadena ligera.

Una vez transferido el vector de expresión a una célula huésped mediante técnicas convencionales, las células transfectadas se cultivan entonces mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo. Se describen en la presente células huésped que contienen un polinucleótido que codifica para un anticuerpo de la invención o fragmentos del mismo, o una cadena pesada o ligera del mismo, o una porción del mismo, o un anticuerpo de cadena sencilla de la invención, operativamente unido a un promotor heterólogo.

Para la expresión de anticuerpos bicatenarios, pueden coexpresarse vectores que codifican para las cadenas tanto pesada como ligera en la célula huésped para la expresión de toda la molécula de inmunoglobulina, tal como se detalla a continuación se describen en la presente.

Se conocen bien en la técnica líneas celulares de mamífero disponibles como huéspedes para la expresión de anticuerpos recombinantes e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), incluyendo sin carácter limitante células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), células de riñón epiteliales humanas 293, y varias otras líneas celulares. Diferentes células huésped tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento correctos del anticuerpo o porción del mismo expresado. Para este fin, pueden usarse células huésped eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcrito primario, la glicosilación y la fosforilación del producto génico. Tales células huésped de mamífero incluyen pero sin carácter limitante a células c Ho , VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, NS0 (una línea celular de mieloma murino que no produce de manera endógena ninguna cadena de inmunoglobulina funcional), SP20, CRL7O3O y HsS78Bst. Pueden utilizarse líneas celulares humanas desarrolladas mediante la inmortalización de linfocitos humanos para producir de manera recombinante anticuerpos monoclonales. Puede usare la línea celular humana PER.C6. (Crucell, Países Bajos) para producir de manera recombinante anticuerpos monoclonales.

Las líneas celulares adicionales que pueden utilizarse como huéspedes para la expresión de anticuerpos recombinantes incluyen, pero sin carácter limitante, células de insecto (por ejemplo Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4) o células de levadura (por ejemplo S. cerevisiae, Pichia, documento US7326681; etc.), células vegetales (documento US20080066200); y células de pollo (documento WO2008142124).

Se pueden expresar anticuerpos tal como se reivindican en una línea celular con expresión estable del anticuerpo. Puede utilizarse la expresión estable para la producción a largo plazo, de alto rendimiento de proteínas recombinantes. Por ejemplo, pueden generarse líneas celulares que expresan de manera estable la molécula de anticuerpo. Pueden transformarse células huésped con un vector modificado por ingeniería genética apropiadamente que comprende elementos de control de la expresión (por ejemplo, promotor, potenciador, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un gen de marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN foráneo, puede permitirse que las células crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido, y luego se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células que integran de manera estable el plásmido en sus cromosomas crezcan y formen focos que a su vez pueden clonarse y expandirse para dar líneas celulares. Se conocen bien en la técnica métodos para producir líneas celulares estables con un alto rendimiento y los reactivos generalmente están disponibles comercialmente.

Se pueden expresar anticuerpos de las reivindicaciones en una línea celular con expresión transitoria del anticuerpo. La transfección transitoria es un proceso en el que el ácido nucleico introducido en una célula no se integra en el genoma o ADN cromosómico de esa célula. Se mantiene de hecho como un elemento extracromosómico, por ejemplo, como un episoma, en la célula. Los procesos de transcripción del ácido nucleico del episoma no se ven afectados y se produce una proteína codificada por el ácido nucleico del episoma.

La línea celular, transfectada o bien de manera estable o bien transitoria, se mantiene en condiciones y medio de cultivo celular bien conocidos en la técnica dando como resultado la expresión y producción de anticuerpos monoclonales. Los medios de cultivo de células de mamífero pueden basarse en formulaciones de medios disponibles comercialmente, incluyendo, por ejemplo, DMEM o F12 de Ham.

Los medios de cultivo pueden modificarse para soportar aumentos tanto en el crecimiento celular como en la expresión de proteínas biológicas. Tal como se utiliza en la presente, los términos "medio de cultivo celular", "medio de cultivo" y "formulación del medio" se refieren a una solución nutritiva para el mantenimiento, el crecimiento, la propagación o la expansión de células en un entorno in vitro artificial fuera de un tejido u organismo multicelular. El medio de cultivo puede optimizarse para un uso de cultivo celular específico, por ejemplo, medio de crecimiento de cultivo celular que se formula para promover el crecimiento celular, o medio de producción de cultivo celular que se formula para promover la producción de proteína recombinante. Los términos nutriente, ingrediente y componente se usan indistintamente en la presente para referirse a los constituyentes que constituyen un medio de cultivo celular.

Líneas celulares pueden mantenerse utilizando un método alimentación discontinua. Tal como se utiliza en la presente, "método de alimentación discontinua" se refiere a un método mediante el cual a un cultivo celular con alimentación discontinua se le suministran nutrientes adicionales tras incubarse en primer lugar con un medio basal. Por ejemplo, un método de alimentación discontinua puede comprender añadir medios complementarios según un determinado programa de alimentación dentro de un periodo de tiempo dado. Por tanto, un "cultivo celular con alimentación discontinua" se refiere a un cultivo celular en el que las células, normalmente de mamífero, y el medio de cultivo se suministran al recipiente de cultivo inicialmente y se alimentan nutrientes de cultivo adicionales, de manera continua o en incrementos diferenciados, al cultivo durante el cultivo, con o sin recogida periódica de las células y/o el producto antes de la finalización del cultivo.

El medio de cultivo celular utilizado y los nutrientes contenidos en el mismo los conoce un experto en la técnica. El medio de cultivo celular puede comprender un medio basal y al menos un hidrolizado, por ejemplo, hidrolizado a base de soya, un hidrolizado a base de levadura o una combinación de los dos tipos de hidrolizados dando como resultado un medio basal modificado. Nutrientes adicionales pueden incluir sólo un medio basal, tal como un medio basal concentrado, o pueden incluir sólo hidrolizados, o hidrolizados concentrados. Los medios basales adecuados incluyen, pero sin carácter limitante medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), DME/F12, medio esencial mínimo (m Em ), medio basal de Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, medio esencial mínimo a (a-MEM), medio esencial mínimo de Glasgow (G-MEM), PF CHO (véase, por ejemplo, medio libre de proteína CHO (Sigma) o medio libre de suero EX-CELL™ 325 PF CHO para células CHO libre de proteína (SAFC Bioscience), y medio de Dulbecco modificado por Iscove. Otros ejemplos de medios basales que pueden utilizarse en la invención incluyen medio basal BME (Gibco-Invitrogen; véase también Eagle, H (1965) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 89, 36); medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, polvo) (Gibco-Invitrogen (n.° 31600); véase también Dulbecco y Freeman (1959) Virology 8, 396; Smith et al. (l960) Virology 12, 185. Tissue Culture Standards Committee, In Vitro 6:2, 93); medio C^mR^l1066 (Gibco-Invitrogen (n.° 11530); véase también Parker R. C. et al (1957) Special Publications, N.Y. Academy of Sciences, 5, 303).

El medio basal puede estar libre de suero, lo que significa que el medio no contiene suero (por ejemplo, suero bovino fetal (FBS), suero de caballo, suero de cabra o cualquier otro suero derivado de animal conocido por el experto en la técnica) o medios libres de proteínas animales o medios definidos químicamente.

El medio basal puede modificarse con el fin de eliminar determinados componentes no nutricionales que se encuentran en medio basal convencional, tales como diversos tampones orgánicos e inorgánicos, tensioactivo(s) y cloruro de sodio. La eliminación de tales componentes del medio celular basal permite un aumento de la concentración de los componentes nutricionales restantes, y puede mejorar el crecimiento celular y la expresión de proteínas globales. Además, pueden añadirse componentes omitidos de nuevo al medio de cultivo celular que contiene el medio celular basal modificado según los requisitos de las condiciones de cultivo celular. El medio de cultivo celular puede contener un medio celular basal modificado, y al menos uno de los siguientes nutrientes, una fuente de hierro, un factor de crecimiento recombinante; un tampón; un tensioactivo; un regulador de la osmolaridad; una fuente de energía; e hidrolizados no animales. Además, el medio celular basal modificado puede contener opcionalmente aminoácidos, vitaminas o una combinación de tanto aminoácidos como vitaminas. El medio basal modificado puede contener además glutamina, por ejemplo L-glutamina y/o metotrexato.

La producción de anticuerpos puede realizarse en gran cantidad mediante un procedimiento de biorreactor utilizando métodos de biorreactor de alimentación discontinua, continuo, de perfusión o de alimentación continua conocidos en la técnica. Loa biorreactores a gran escala tienen al menos 1000 litros de capacidad, preferiblemente de aproximadamente 1,000 a 100,000 litros de capacidad. Estos biorreactores pueden utilizar rotores de agitación para distribuir el oxígeno y los nutrientes. Biorreactores a pequeña escala se refiere generalmente a cultivar células en no más de aproximadamente 100 litros de capacidad volumétrica, y puede oscilar entre aproximadamente 1 litro y aproximadamente 100 litros. Alternativamente, pueden utilizarse biorreactores de uso único (SUB) para el cultivo o bien a gran escala o bien a pequeña escala.

La temperatura, el pH, la agitación, la aireación y la densidad de inóculo variarán dependiendo de las células huésped utilizada y la proteína recombinante que va a expresarse. Por ejemplo, un cultivo celular de proteína recombinante puede mantenerse a una temperatura de entre 30 y 45°C. El pH del medio de cultivo puede monitorizarse durante el procedimiento de cultivo de manera que el pH permanezca a un nivel óptimo, que puede estar para determinadas células huésped, dentro de un intervalo de pH de 6.0 a 8.0. Puede utilizarse un mezclado impulsado por rotor para tales métodos de cultivo para la agitación. La velocidad de rotación del rotor puede ser de aproximadamente 50 a 200 cm/s de velocidad de la punta, pero pueden utilizarse otros sistemas de ventilación u otros sistemas de mezclado/aireación conocidos en la técnica, dependiendo del tipo de célula huésped que está cultivándose. Se proporciona suficiente aireación como para mantener una concentración de oxígeno disuelto de aproximadamente el 20% al 80% de saturación de aire en el cultivo, de nuevo, dependiendo del huésped seleccionado que está cultivándose. Alternativamente, un biorreactor puede rociar aire u oxígeno directamente en el medio de cultivo. Existen otros métodos de suministro de oxígeno, incluyendo sistemas de aireación libres de burbujas que emplean aireadores de membrana de fibra hueca.

Técnicas de presentación en fagos

Pueden aislarse anticuerpos monoclonales o fragmentos de anticuerpo de bibliotecas de presentación en fagos de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991). En tales métodos, pueden aislarse anticuerpos sometiendo a cribado una biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante, preferiblemente una biblioteca de presentación en fagos de scFv, preparada utilizando ADNc de VL y VH humano preparado a partir de ARNm derivado de linfocitos humanos. Se conocen en la técnica metodologías para preparar y someter a cribado tales bibliotecas. Además de kits disponibles comercialmente para generar bibliotecas de presentación en fagos (por ejemplo, el Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, n.° de catálogo 27-9400-01; y el kit de presentación en fagos SurfZAP™ de Stratagene, n.° de catálogo 240612), pueden encontrarse ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para su uso para generar y someter a cribado bibliotecas de presentación de anticuerpos en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6,248,516; US 6,545,142; 6,291,158; 6,291,159; 6,291,160; 6,291,161; 6,680,192; 5,969,108; 6,172,197; 6,806,079; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,593,081; 6,582,915; 7,195,866. Por tanto, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales para la generación y el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

En los métodos de presentación en fagos, se presentan dominios de anticuerpos funcionales en la superficie de las partículas de fagos que portan las secuencias polinucleotídicas que los codifican. En una realización particular, tal fago puede utilizarse para presentar dominios de unión al antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humana o murina). Los fagos que expresan un dominio de unión al antígeno que se une al antígeno de interés pueden seleccionarse o identificarse con el antígeno, por ejemplo, utilizando antígeno marcado o antígeno unido a o capturado por una perla o superficie sólida. Los fagos utilizados en estos métodos son normalmente fagos filamentosos que incluyen dominios de unión a fd y M13 expresados a partir del fago con dominios de anticuerpo Fab, Fv o Fv estabilizado por disulfuros fusionados de manera recombinante con o bien el gen III o bien la proteína del gen VIII del fago.

Tal como se describió en las referencias anteriores, tras la selección del fago, pueden aislarse las regiones que codifican para el anticuerpo a partir del fago y utilizarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, tal como se describe en detalle a continuación. Por ejemplo, también pueden emplearse técnicas para producir de manera recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 utilizando métodos conocidos en la técnica tales como los dados a conocer en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988).

Los ejemplos de técnicas que pueden utilizarse para producir Fv de cadena sencilla y anticuerpos incluyen las descritas en las patentes estadounidenses n.os 4,946,778 y 5,258,498. Por tanto, pueden utilizarse técnicas descritas anteriormente y las bien conocidas en la técnica para generar anticuerpos recombinantes en los que el dominio de unión, por ejemplo scFv, se aisló de una biblioteca de presentación en fagos.

Purificación y aislamiento de anticuerpos

Una vez producida una molécula de anticuerpo mediante expresión en hibridoma o recombinante, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente mediante afinidad por los antígenos específicos proteína A o proteína G, y cromatografía en columna de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias polipeptídicas heterólogas (denominadas en la presente "etiquetas") para facilitar la purificación.

Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico o secretarse directamente al medio. Si el anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, los residuos particulados, o bien células huésped o bien fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, en primer lugar se concentran generalmente sobrenadantes de tales sistemas de expresión utilizando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Pellicon de Millipore. Puede incluirse un inhibidor de proteasas tal como ^pM^sF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, diálisis y/o cromatografía de afinidad o bien solas o bien en combinación con otras etapas de purificación. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en el anticuerpo y lo entenderá un experto en la técnica. La matriz a la que se une el ligando de afinidad es lo más a menudo agarosa, pero están disponibles otras matrices. Matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que pueden lograrse con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. También están disponibles otras técnicas para la purificación de proteínas tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre heparina, cromatografía con SEPHAROSE sobre una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de poli(ácido aspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE, precipitación con sulfato de amonio dependiendo del anticuerpo que va a recuperarse.

Tras cualquier etapa de purificación preliminar, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede someterse a cromatografía de interacción hidrófoba a pH bajo utilizando un tampón de elución a un pH de entre aproximadamente 2.5 - 4.5, y realizada a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, sal desde aproximadamente 0 -0.25 M).

Por tanto, en determinadas realizaciones, se proporcionan anticuerpos de las reivindicaciones que están sustancialmente purificados / aislados. En una realización, estos anticuerpos aislados / purificados expresados de manera recombinante pueden ser para su uso en un método, de tratamientos que se van a administrar a un paciente para mediar en un efecto profiláctico o terapéutico. Un producto profiláctico es un medicamento o un tratamiento diseñado y utilizado para prevenir que se produzca una enfermedad, trastorno o infección. Un producto terapéutico se refiere específicamente al tratamiento de una enfermedad, trastorno o infección particular. Una dosis terapéutica es la cantidad necesaria para tratar una enfermedad, trastorno o infección particular. En otra realización, estos anticuerpos aislados/purificados tal como se reivindican pueden ser para us uso en un método para diagnosticar la infección por virus influenza A.

Anticuerpos humanos

Pueden generarse anticuerpo humanos utilizando métodos bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con los anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes murinas o de rata. La presencia de tales proteínas derivadas de rata o murinas puede conducir al aclaramiento rápido de los anticuerpos o puede conducir a la generación de una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo por un paciente.

Pueden derivarse anticuerpos humanos mediante métodos in vitro. Los ejemplos adecuados incluyen pero sin carácter limitante presentación en fagos (MedImmune (anteriormente CAT), Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (anteriormente Proliferon), Affimed) presentación en ribosomas (MedImmune (anteriormente CAT)), presentación en levaduras, y similares. La tecnología de presentación en fagos (véase por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5,969,108) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in vitro, a partir de repertorios de genes de dominios variables (V) de inmunoglobulinas de donantes no inmunizados. Según esta técnica, se clonan genes de dominios V de anticuerpos en marco en un gen de proteína de recubrimiento o bien principal o bien secundaria de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpo funcionales sobre la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica para el anticuerpo que presenta esas propiedades. Por tanto, el fago imita algunas de las propiedades de células B. La presentación en fagos puede realizarse en una variedad de formatos, revisados en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Pueden utilizarse varias fuentes de segmentos de genes V para la presentación en fagos. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron una serie diversa de anticuerpos antioxazolona a partir de una biblioteca combinatoria al azar pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Puede construirse un repertorio de genes V de donantes humanos inmunizados y anticuerpos frente a una serie diversa de antígenos (incluyendo autoantígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Véanse, también, las patentes estadounidenses n.os 5,565,332 y 5,573,905.

Tal como se comentó anteriormente, también pueden generase anticuerpos humanos mediante células B activadas in vitro (véanse las patentes estadounidenses n.os 5,567,610 y 5,229,275).

Los genes de inmunoglobulinas experimentan diversas modificaciones durante la maduración de la respuesta inmunitaria, incluyendo recombinación entre segmentos génicos V, D y J, cambio de isotipo e hipermutación en las regiones variables. La recombinación e hipermutación somática con la base para la generación de diversidad de anticuerpos y maduración por afinidad, pero también pueden generar desventajas de secuencia que pueden hacer que la producción comercial de tales inmunoglobulinas como agentes terapéuticos sea difícil o aumentar el riesgo de inmunogenicidad del anticuerpo. En general, es probable que las mutaciones en regiones CDR contribuyan a una mejora de la afinidad y función, mientras que las mutaciones en regiones de entramado pueden aumentar el riesgo de inmunogenicidad. El riesgo puede reducirse revirtiendo las mutaciones de regiones de entramado a la línea germinal al tiempo que se garantiza que la actividad del anticuerpo no se ve afectada de manera adversa. Los procesos de diversificación también pueden generar algunas desventajas estructurales o estas desventajas estructurales pueden existir dentro de las secuencias de la línea germinal que contribuyen a los dominios variables de las cadenas pesada y ligera. Independientemente de la fuente, puede ser deseable eliminar posibles desventajas estructurales que pueden dar como resultado inestabilidad, agregación, heterogeneidad del producto o inmunogenicidad aumentada. Los ejemplos de desventajas no deseadas incluyen cisteínas no apareadas (lo que puede conducir al mezclado de los enlaces disulfuro, o a la formación de aductos de sulfhidrilo variables), sitios de glicosilación unidos a N (que dan como resultado heterogeneidad de la estructura y actividad), así como sitios de desamidación (por ejemplo, NG, NS), isomerización (DG), oxidación (metionina expuesta), e hidrólisis (DP).

Por consiguiente, con el fin de reducir el riesgo de inmunogenicidad y mejorar las propiedades farmacéuticas, puede ser deseable revertir una secuencia de región de entramado a la línea germinal, revertir una CDR a la línea germinal y/o eliminar una desventaja estructural.

Cuando un anticuerpo particular descrito en la presente difiere de su secuencia de línea germinal respectiva al nivel de aminoácidos, la secuencia del anticuerpo puede someterse a retromutación a la secuencia de línea germinal. Tales mutaciones correctoras se pueden producir en una, dos, tres o más posiciones, o una combinación de cualquiera de las posiciones mutadas, utilizando técnicas de uso común en la biológica molecular.

Fragmentos de anticuerpo

En determinadas realizaciones, los presentes anticuerpos tal como se reivindican son fragmentos de anticuerpo o anticuerpos que comprenden estos fragmentos. El fragmento de un anticuerpo comprende una porción del anticuerpo completo que generalmente es la región variable o de unión al antígeno de este. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fd y Fv. Diacuerpos; anticuerpos lineales (patente estadounidense n.° 5,641,870) moléculas de anticuerpo de cadena sencilla.

Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron por medio de digestión proteolítica de anticuerpos intactos usando técnicas bien conocidas en la técnica. Sin embargo, estos fragmentos pueden producirse ahora directamente mediante células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y scFv pueden expresarse todos en y secretarse a partir de E. coli, permitiendo así la fácil producción de grandes cantidades de los mismos fragmentos. En una realización, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas de fagos comentadas anteriormente. Alternativamente, también pueden recuperarse directamente fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). Según otro enfoque, pueden aislarse directamente fragmentos F(ab')2 a partir de un cultivo de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo resultarán evidentes para el experto en la técnica. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv). En determinadas realizaciones, el anticuerpo no es un fragmento Fab. Fv y scFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes; por tanto, son adecuadas para lograr una unión no específica reducida durante el uso in vivo. Pueden construirse proteínas de fusión de scFv para producir la fusión de una proteína efectora o bien en el extremo amino terminal o bien en el carboxilo terminal de un scFv.

En determinadas realizaciones, los presentes anticuerpos tal como se reivindican son anticuerpos de dominio, por ejemplo, anticuerpos que contienen las unidades de unión funcionales pequeñas de los anticuerpos, correspondientes a las regiones variables de las cadenas pesada (VH) o ligera (VL) de anticuerpos humanos. Los ejemplos de anticuerpos de dominio incluyen, pero sin carácter limitante, los de Domantis (véanse, por ejemplo, los documentos WO04/058821; WO04/081026; WO04/003019; WO03/002609; las patentes estadounidenses n.os 6,291,158; 6,582,915; 6,696,245; y 6,593,081).

En determinadas realizaciones de la invención, los presentes anticuerpos tal como se reivindican son anticuerpos lineales. Los anticuerpos lineales comprenden un par de segmentos Fd en tándem (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de unión al antígeno. Véase, Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995).

Otras modificaciones de la secuencia de aminoácidos

Además de los anticuerpos humanos, humanizados y/o quiméricos descritos anteriormente, se describen en la presente modificaciones adicionales y sus variantes y fragmentos de las mismas, de los anticuerpos de las reivindicaciones que comprenden uno o más residuos de aminoácido y/o sustituciones, adiciones y/o eliminaciones de polipéptido en el dominio ligero variable (VL) y/o dominio pesado variable (VH) y/o región Fc y modificaciones postraduccionales. Se incluyen en estas modificaciones conjugados de anticuerpos en los que un anticuerpo se ha unido covalentemente a un resto. Los restos adecuados para unirlos a los anticuerpos incluyen, sin carácter limitante, proteínas, péptidos, fármacos, marcadores y citotoxinas. Estos cambios en los anticuerpos pueden hacerse para alterar o ajustar finamente las características (bioquímicas, de unión y/o funcionales) de los anticuerpos según sea apropiado para el tratamiento y/o el diagnóstico de la infección por influenza A. Se conocen bien en la técnica métodos para formar conjugados, haciendo cambios de aminoácidos y/o polipéptidos y modificaciones postraduccionales, algunos de los cuales se describen a continuación.

Los cambios de aminoácidos en los anticuerpos dan como resultado necesariamente secuencias que son menos del 100% idénticas a las secuencias de anticuerpo identificadas anteriormente o secuencia de anticuerpo original. Los anticuerpos que tienen una identidad de secuencia de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 95% con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena o bien pesada o bien ligera de un anticuerpo se describen en la presente. Por tanto, se describe en la presente un anticuerpo modificado que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad o similitud de la secuencia de aminoácidos de al menos el 25%, el 35%, el 45%, el 55%, el 65%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con la secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena o bien pesada o bien ligera de un anticuerpo tal como se describe en la presente.

Se describe en la presente anticuerpo alterado que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad o similitud de la secuencia de aminoácidos de al menos el 25%, el 35%, el 45%, el 55%, el 65%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada o ligera CDR1, CDR2 o CDR3 de un anticuerpo tal como se describe en la presente.

Se describe en la presente un anticuerpo alterado que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad o similitud de la secuencia de aminoácidos de al menos el 25%, el 35%, el 45%, el 55%, el 65%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% con la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada o ligera FR1, FR2, FR3 o FR4 de un anticuerpo tal como se describe en la presente.

Pueden generarse anticuerpos alterados mediante una o más alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones, eliminaciones y/o adiciones) introducidas en una o más de las regiones variables del anticuerpo.

Las alteraciones de aminoácidos pueden introducirse en las regiones de entramado. Una o más alteraciones de los residuos de región de entramado pueden dar como resultado una mejora de la afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno. Esto puede ser especialmente cierto cuando estos cambios se hacen en anticuerpos humanizados en los que la región de entramado puede ser de una especie diferente de la de las regiones CDR. Los ejemplos de residuos de región de entramado para modificar incluyen los que se unen de manera no covalente al antígeno directamente (Amit et al., Science, 233:747-753 (1986)); interaccionan con/afectan a la conformación de una CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987)); y/o participan en la superficie de contacto VL-VH (patentes estadounidenses n.os 5,225,539 y 6,548,640).

Pueden alterarse desde aproximadamente uno hasta aproximadamente cinco residuos de región de entramado. Algunas veces, esto puede ser suficiente para producir un mutante de anticuerpo adecuado para su uso en ensayos preclínicos, incluso cuando ninguna de las regiones hipervariables se ha alterado Sin embargo, normalmente, un anticuerpo alterado comprenderá alteración/alteraciones de regiones hipervariables adicionales.

Un procedimiento útil para generar anticuerpos alterados se denomina "mutagénesis por barrido de alanina" (Cunningham y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)). En este método, uno o más de los residuos de regiones hipervariables se sustituyen por residuos de alanina o polialanina para alterar la interacción de los aminoácidos con el antígeno diana. El/los residuo(s) de regiones hipervariables que demuestra(n) sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces introduciendo mutaciones adicionales u otras en o para los sitios de sustitución. Por tanto, aunque el sitio para la introducción de una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la naturaleza de la mutación per se esté predeterminada. Los mutantes de Ala producidos del mismo modo se someten a cribado para determinar su actividad biológica tal como se describe en la presente.

La variante de sustitución puede implicar sustituir uno o más residuos de regiones hipervariables de un anticuerpo original (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano). Generalmente, el/las variante(s) resultante(s) seleccionada(s) para su desarrollo adicional tendrán propiedades biológicas mejoradas en relación con el anticuerpo original a partir del que se generan. Un modo conveniente para generar tales variantes de sustitución implica maduración por afinidad utilizando presentación en fagos (Hawkins et al., J. Mol. Biol., 254:889-896 (1992) y Lowman et al., Biochemistry, 30(45):10832-10837 (1991)). En resumen, se mutan varios sitios de regiones hipervariables (por ejemplo, 6-7 sitios) para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los mutantes de anticuerpo así generados se presentan de un modo monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto del gen III de M13 empaquetadas dentro de cada partícula. Los mutantes presentados en fagos se someten a cribado entonces para determinar su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se da a conocer en la presente.

Las mutaciones en secuencias de anticuerpos pueden incluir sustituciones, eliminaciones, incluyendo eliminaciones internas, adiciones, incluyendo adiciones que producen proteínas de fusión, o sustituciones conservativas de residuos de aminoácido dentro de y/o adyacentes a la secuencia de aminoácidos, pero que dan como resultado un cambio "silencioso", porque el cambio produce un anticuerpo funcionalmente equivalente. Pueden hacerse sustituciones de aminoácidos conservativas basándose en la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Además, glicina y prolina son residuos que pueden influir en la orientación de la cadena. Las sustituciones no conservativas supondrán el intercambio de un miembro de una de las mismas clases por un miembro de otra clase. Además, si se desea, pueden introducirse aminoácidos no clásicos o análogos químicos de aminoácidos como una sustitución o adición en la secuencia de anticuerpo. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero sin carácter limitante, los D-isómeros de los aminoácidos comunes, ácido a -aminoisobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, Y-Abu, £-Ahx, ácido 6-aminohexanoico, Aib, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminopropiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, p-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos de diseño tales como p-metilaminoácidos, Cametilaminoácidos, Na-metilaminoácidos análogos de aminoácidos en general.

Cualquier residuo de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del anticuerpo también puede sustituirse, generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula e impedir la reticulación aberrante. A la inversa, puede añadirse enlace(s) de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Regiones Fc variantes

Se sabe que variantes de la región Fc (por ejemplo, sustituciones y/o adiciones y/o eliminaciones de aminoácidos) potencian o disminuyen la función efectora del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5,624,821; 5,885,573; 6,538,124; 7,317,091; 5,648,260; 6,538,124; los documentos WO 03/074679; WO 04/029207; WO 04/099249; WO 99/58572; las publicaciones estadounidenses n.os 2006/0134105; 2004/0132101; 2006/0008883) y pueden alterar las propiedades farmacocinéticas (por ejemplo semivida) del anticuerpo (véanse las patentes estadounidenses 6,277,375 y 7,083,784). Por tanto, los anticuerpos de la invención pueden comprender una región Fc alterada (también denominada en la presente "región Fc variante") en la que se han hecho una o más alteraciones en la región Fc con el fin de cambiar las propiedades funcionales y/o farmacocinéticas de los anticuerpos. Tales alteraciones pueden dar como resultado una disminución o un aumento de la unión a Clq y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o de la unión a FcyR, para IgG, y de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), o fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP). Se describen en la presente anticuerpos descritos en la presente con regiones Fc variantes en las que se han hecho cambios para ajustar finamente la función efectora, potenciándola o disminuyéndola, proporcionando una función efectora deseada. Por consiguiente, los anticuerpos de las reivindicaciones pueden comprender una región Fc variante (es decir, regiones Fc que se han alterado tal como se comenta a continuación). Los anticuerpos de las reivindicaciones que comprenden una región Fc variante también se denominan en la presente "anticuerpos variantes de Fc". Tal como se usa en la presente, nativa se refiere a la secuencia original no modificada y el anticuerpo que comprende una región Fc nativa se denomina en la presente "anticuerpo de Fc nativa". Los anticuerpos con variantes de Fc pueden generarse mediante numerosos métodos muy conocidos por los expertos en la técnica. Los ejemplos no limitantes incluyen aislar las regiones codificantes de los anticuerpos (p. ej., de un hibridoma) y realizar una o más sustituciones deseadas en la región Fc de la región codificante del anticuerpo aislado. Alternativamente, la porción de unión al antígeno (por ejemplo, las regiones variables) de un anticuerpo pueden subclonarse en un vector que codifica para una región Fc variante. En una realización, la región Fc variante presenta un nivel similar de inducción de una función efectora en comparación con la región Fc nativa. En otra realización, la región Fc variante muestra una inducción mayor de la función efectora en comparación con la región Fc natural. Algunas realizaciones específicas de regiones Fc variantes se detallan a continuación. Los métodos para medir la función efectora son muy conocidos en la técnica.

La función efectora de un anticuerpo se modifica a través de cambios en la región Fc, incluyendo pero sin carácter limitante, sustituciones de aminoácidos, adiciones de aminoácidos, eliminaciones de aminoácidos y cambios en modificaciones postraduccionales en aminoácidos de Fc (por ejemplo, glicosilación). Los métodos descritos a continuación pueden utilizarse para ajustar finamente la función efectora de un presente anticuerpo, la razón de las propiedades de unión de la región Fc por el FcR (por ejemplo, afinidad y especificidad), dando como resultado un anticuerpo terapéutico con las propiedades deseadas.

Se sobreentiende que la región Fc tal como se emplea en la presente incluye los polipéptidos que comprenden la región constante de un anticuerpo, excluido el primer dominio de la región constante de la inmunoglobulina. Por lo tanto, Fc se refiere a los dos últimos dominios de la región constante de inmunoglobulina de IgA, IgD e IgG y a los tres últimos dominios de la región constante de inmunoglobulina de IgE e IgM y a la bisagra flexible del extremo N con estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (Cy2 y Cy3) y la bisagra entre Cgamma1 (Cy1) y Cgamma2 (Cy2). Aunque los límites de la región Fc pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de la IgG humana se define normalmente de modo que comprenda de los residuos C226 o P230 a su extremo carboxilo, donde la numeración es según el índice EU tal como se expone en Kabat. Fc se puede referir a esta región aislada o a esta región en el contexto de un anticuerpo, fragmento de un anticuerpo o proteína de fusión Fc. Se han observado polimorfismos en varias posiciones diferentes de Fc, incluidas, sin carácter limitante, las posiciones 270, 272, 312, 315, 356 y 358 tal como se numeran según el índice EU, y por lo tanto pueden existir ligeras diferencias entre la secuencia presentada y las secuencias de la técnica anterior.

En una realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan una afinidad de unión alterada por uno o más receptores de Fc incluyendo, pero sin carácter limitante FcRn, F^cyRI (CD64) incluyendo las isoformas F^cyRIA, F^cyRIB y F^cyRIC; FcyRII (Cd32 incluyendo las isoformas FcyRIIA, FcyRIiB y FcyRIiC); y FcyRIII (CD16, incluyendo las isoformas FcyRIIIA y F^cyRIIIB) en comparación con un anticuerpo de Fc nativa.

En una realización, un anticuerpo de Fc variante tiene una unión potenciada a uno o más ligandos de Fc en relación con un anticuerpo de Fc nativa. En otra realización, el anticuerpo variante de Fc presenta una afinidad aumentada o disminuida por un ligando de Fc que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o es entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, más o menos que la de un anticuerpo de Fc nativa. En otra realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan afinidades por un ligando de Fc que son al menos el 90%, al menos el 80%, al menos el 70%, al menos el 60%, al menos el 50%, al menos el 40%, al menos el 30%, al menos el 20%, al menos el 10%, o al menos el 5% más o menos que las de un anticuerpo de Fc nativa. En ciertas realizaciones, un anticuerpo con una variante de Fc tiene una mayor afinidad por un ligando de Fc. En otras realizaciones un anticuerpo variante de Fc tiene una afinidad disminuida por un ligando de Fc.

En una realización específica, un anticuerpo variante de Fc tiene una unión potenciada al receptor de Fc FcyRIIIA. En otra realización específica, un anticuerpo variante de Fc tiene una unión potenciada al receptor de Fc FcyRIIB. En una realización específica adicional, un anticuerpo variante de Fc tiene una unión potenciada a los receptores de Fc tanto FcyRIIIA como FcyRIIB. En determinadas realizaciones, los anticuerpos variantes de Fc que tienen una unión potenciada a FcyRIIIA no tienen un aumento concomitante en la unión al receptor FcyRIIB en comparación con un anticuerpo de Fc nativa. En una realización específica, un anticuerpo variante de Fc tiene una unión reducida al receptor de Fc FcyRIIIA. En una realización específica, un anticuerpo variante de Fc tiene una unión reducida al receptor de Fc FcyRIIB. Todavía en otra realización específica, un anticuerpo variante de Fc que presenta una afinidad alterada por FcyRIIIA y/o FcyRIIB tiene una unión potenciada al receptor de Fc FcRn. Aún en otra realización específica, un anticuerpo variante de Fc que presenta una afinidad alterada por FcyRIIIA y/o FcyRIIB tiene una unión alterada a C1q en relación con un anticuerpo de Fc nativa.

En una realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan afinidades por el receptor FcyRIIIA que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o es entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, más o menos que las de un anticuerpo de Fc nativa. En otra realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan afinidades por F^cyRIIIA que son al menos el 90%, al menos el 80%, al menos el 70%, al menos el 60%, al menos el 50%, al menos el 40%, al menos el 30%, al menos el 20%, al menos el 10%, o al menos el 5% más o menos que las de un anticuerpo de Fc nativa.

En una realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan afinidades por el receptor F^cyRIIB que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o es entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, más o menos que las de un anticuerpo de Fc nativa. En otra realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan afinidades por FcyRIIB que son al menos el 90%, al menos el 80%, al menos el 70%, al menos el 60%, al menos el 50%, al menos el 40%, al menos el 30%, al menos el 20%, al menos el 10%, o al menos el 5% más o menos que las de un anticuerpo de Fc nativa.

En una realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan afinidades aumentadas o disminuidas por C1q en relación con un anticuerpo de Fc nativa. En otra realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan afinidades por el receptor C1q que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces, o al menos 7 veces, o al menos 10 veces, o al menos 20 veces, o al menos 30 veces, o al menos 40 veces, o al menos 50 veces, o al menos 60 veces, o al menos 70 veces, o al menos 80 veces, o al menos 90 veces, o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o es entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, más o menos que las de un anticuerpo de Fc nativa. En otra realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan afinidades por C1q que son al menos el 90%, al menos el 80%, al menos el 70%, al menos el 60%, al menos el 50%, al menos el 40%, al menos el 30%, al menos el 20%, al menos el 10%, o al menos el 5% más o menos que las de un anticuerpo de Fc nativa. Todavía en otra realización específica, un anticuerpo variante de Fc que presenta una afinidad alterada por C1q tiene una unión potenciada al receptor de Fc FcRn. Aún en otra realización específica, un anticuerpo variante de Fc que presenta una afinidad alterada por C1a tiene una unión alterada a FcyRIIIA y/o FcyRIIB en relación con un anticuerpo de Fc nativa.

Se sabe bien en la técnica que los anticuerpos pueden dirigir el ataque y la destrucción a través de múltiples procedimientos conocidos conjuntamente en la técnica como funciones efectoras de anticuerpos. Uno de los mismos procesos, conocido como "citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la que Ig secretada unida sobre receptores de Fc (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, células citotóxicas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permite que estas células citotóxicas se unan específicamente a células que llevan antígeno y posteriormente destruyen las células con citotoxinas. Anticuerpos IgG de alta afinidad específicos dirigidos a la superficie de las células "arman" las células citotóxicas y se requieren para tal destrucción. La lisis de la célula es extracelular, requiere contacto célula a célula directo y no implica al complemento.

Otro proceso englobado por el término función efectora es la citotoxicidad dependiente del complemento (a continuación en la presente denominada "CDC") que se refiere a un acontecimiento bioquímico de destrucción celular por el sistema del complemento. El sistema del complemento es un sistema complejo de proteínas que se encuentran en el plasma sanguíneo normal que se combina con los anticuerpos para destruir bacterias patógenas y otras células foráneas.

Todavía otro proceso englobado por el término función efectora es la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) que se refiere a una reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan uno o más ligandos efectores reconocen el anticuerpo unido sobre una célula y posteriormente provocan la fagocitosis de la célula.

Se contempla que los anticuerpos variantes de Fc se caractericen mediante ensayos funcionales in vitro para determinar una o más funciones celulares efectoras mediadas por F^cyR. En determinadas realizaciones, los anticuerpos variantes de Fc tienen propiedades de unión o funciones celulares efectoras similares en modelos in vivo (tales como los descritos y dados a conocer en la presente) que las de los ensayos basados in vitro. Sin embargo, la presente invención no excluye anticuerpos variantes de Fc que no presentan el fenotipo deseado en ensayos basados in vitro pero presentan el fenotipo deseado in vivo.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo que comprende una variante de Fc tiene actividad de fagocitosis o citotoxicidad potenciada (por ejemplo, ADCC, CDC y ADCP) en relación con un anticuerpo que comprende una región Fc nativa. En una realización específica, un anticuerpo variante de Fc tiene una actividad de citotoxicidad o fagocitosis que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces o al menos 10 veces o al menos 50 veces o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o es entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, mayor que la de un anticuerpo de Fc nativa.

Alternativamente un anticuerpo variante de Fc tiene una actividad de citotoxicidad o fagocitosis reducida en relación con un anticuerpo de Fc nativa. En una realización específica, un anticuerpo variante de Fc tiene una actividad de citotoxicidad o fagocitosis que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces o al menos 10 veces o al menos 50 veces o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o es entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, menor que la de un anticuerpo de Fc nativa.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos variantes de Fc presentan actividades de ADCC disminuidas en comparación con un anticuerpo de Fc nativa. En otra realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan actividades de ADCC que son al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces o al menos 10 veces o al menos 50 veces o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o es entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces, menores que la de un anticuerpo de Fc nativa. Todavía en otra realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan actividades de ADCC que están reducidas en al menos el 10%, o al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos del 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al menos el 80%, o en al menos el 90%, o en al menos el 100%, o en al menos el 200%, o en al menos el 300%, o en al menos el 400%, o en al menos el 500%, en relación con un anticuerpo de Fc nativa. En determinadas realizaciones, los anticuerpos variantes de Fc no tienen actividad de ADCC detectable.

En realizaciones específicas, la reducción y/o supresión de la actividad de ADCC puede atribuirse a la afinidad reducida que anticuerpos variantes de Fc presentan por los ligandos y/o receptores de Fc.

En una realización alternativa, los anticuerpos variantes de Fc presentan actividades de ADCC aumentadas en comparación con un anticuerpo de Fc nativa. En otra realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan actividades de ADCC que son al menos 2 veces , o al menos 3 veces, o al menos 5 veces o al menos 10 veces o al menos 50 veces o al menos 100 veces mayores que las de un anticuerpo de Fc nativa. Todavía en otra realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan actividades de ADCC que están aumentadas en al menos el 10%, o al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos del 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al menos el 80%, o en al menos el 90%, o en al menos el 100%, o en al menos el 200%, o en al menos el 300%, o en al menos el 400%, o en al menos el 500%, en relación con un anticuerpo de Fc nativa. En realizaciones específicas, la actividad de ADCC aumentada puede atribuirse a la afinidad aumentada que anticuerpos variantes de Fc presentan por los ligandos y/o receptores de Fc.

En una realización específica, un anticuerpo de Fc variante tiene una unión potenciada al receptor de Fc F^cyRIIIA y tiene una actividad de ADCC potenciada en relación con anticuerpo de Fc nativa. En otras realizaciones, el anticuerpo variante de Fc tiene tanto una actividad de ADCC potenciada como una semivida en suero potenciada en relación con un anticuerpo de Fc nativa. En otra realización específica, un anticuerpo de Fc variante tiene una unión reducida al receptor de Fc F^cyRIIIA y tiene una actividad de ADCC reducida en relación con anticuerpo de Fc nativa. En otras realizaciones, el anticuerpo variante de Fc tiene tanto una actividad de ADCC reducida como una semivida en suero potenciada en relación con un anticuerpo de Fc nativa.

En determinadas realizaciones, la citotoxicidad está mediada por CDC en la que el anticuerpo variante de Fc tiene una actividad de CDC o bien potenciada o bien disminuida en relación con un anticuerpo de Fc nativa. La ruta de activación del complemento se inicia con la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula, un anticuerpo, por ejemplo, complejada con un antígeno semejante. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo de CDC, por ejemplo tal como se describe en Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163.

En una realización, los anticuerpos de la invención una actividad de ADCC aumentada en comparación con un anticuerpo de Fc nativa. En otra realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan una actividad de CDC que es al menos 2 veces, o al menos 3 veces, o al menos 5 veces o al menos 10 veces o al menos 50 veces o al menos 100 veces, o al menos 200 veces, o es entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 50 veces, o entre 25 veces y 100 veces, o entre 75 veces y 200 veces, o entre 100 y 200 veces mayor que la de un anticuerpo de Fc nativa. Todavía en otra realización, los anticuerpos variantes de Fc presentan una actividad de CDC que está aumentada en al menos el 10%, o al menos el 20%, o en al menos el 30%, o en al menos del 40%, o en al menos el 50%, o en al menos el 60%, o en al menos el 70%, o en al menos el 80%, o en al menos el 90%, o en al menos el 100%, o en al menos el 200%, o en al menos el 300%, o en al menos el 400%, o en al menos el 500%, en relación con un anticuerpo de Fc nativa. En realizaciones específicas, el aumento de la actividad de CDC puede atribuirse a la afinidad aumentada que anticuerpos variantes de Fc presentan por C1q.

Los anticuerpos de las reivindicaciones pueden presentar una actividad de CDC aumentada en comparación con un anticuerpo de Fc nativa en virtud de la tecnología COMPLEGENT® (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.), que potencia uno de los mecanismos de acción principales de un anticuerpo, CDC. Con un enfoque denominado quimerismo de isotipo, en el que porciones de IgG3, un isotipo de anticuerpo, se introducen en regiones correspondientes de IgG1, el isotipo convencional de los anticuerpos terapéuticos, la tecnología COMPLEGENT® potencia significativamente la actividad de CDC más allá de o bien IgG1 o bien IgG3, al tiempo que retiene las características deseables de IgG1, tales como ADCC, perfil PK y unión a proteína A. Además, puede utilizarse junto con la tecnología POTELLIGENT®, creando un AcM terapéutico incluso superior (ACCRETAMAB®) con actividades de ADCC y CDC potenciadas.

El anticuerpo variante de Fc de la invención puede tener una actividad de ADCC potenciada y una semivida en suero potenciada en relación con un anticuerpo de Fc nativa.

El anticuerpo variante de Fc de la invención puede tener una actividad de CDC potenciada y una semivida en suero potenciada en relación con un anticuerpo de Fc nativa.

El anticuerpo variante de Fc de la invención puede tener una actividad de ADCC potenciada, una actividad de CDC potenciada y una semivida en suero potenciada en relación con un anticuerpo de Fc nativa.

La semivida en suero de proteínas que comprenden regiones Fc se puede incrementar al aumentar la afinidad de unión de la región Fc por FcRn. El término "semivida del anticuerpo" tal como se usa en el presente documento significa una propiedad farmacocinética de un anticuerpo que es una medida del tiempo de supervivencia medio de las moléculas de anticuerpo tras su administración. La semivida del anticuerpo puede expresarse como en tiempo requerido para eliminar el 50 por ciento de una cantidad conocida de inmunoglobulina del cuerpo del paciente (u otro mamífero) o un compartimento específico del mismo, por ejemplo, tal como se mide en suero, es decir, semivida en circulación, o en otros tejidos. La semivida puede variar de una inmunoglobulina o clase de inmunoglobulina a otra. En general, un aumento de la semivida del anticuerpo genera un aumento en el tiempo de permanencia medio (TPM) en la circulación para el anticuerpo administrado.

El aumento en la semivida permite la reducción en la cantidad de fármaco administrada a un paciente así como la reducción de la frecuencia de administración. Para aumentar la semivida en suero del anticuerpo, puede incorporarse un epítopo de unión a receptor de salvamento en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) tal como se describe en la patente estadounidense n.° 5,739,277, por ejemplo. Tal como se usa en la presente, el término "epítopo de unión a receptor de salvamento" se refiere a un epítopo de la región Fc de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable del aumento de la semivida en suero in vivo de la molécula de IgG.

Alternativamente, pueden generarse anticuerpos de las reivindicaciones con semividas aumentadas modificando los residuos de aminoácido que se identifica que están implicados en la interacción entre la Fc y el receptor FcRn (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 6,821,505 y 7,083,784; y el documento WO 09/058492). Además, la semivida de los anticuerpos de la invención puede aumentarse mediante la conjugación a PEG o albúmina mediante técnicas ampliamente utilizadas en la técnica. En algunas realizaciones, los anticuerpos que comprenden regiones variantes de Fc de las reivindicaciones tienen una semivida aumentada de aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 100%, aproximadamente el 125%, aproximadamente el 150% o más en comparación con un anticuerpo que comprende una región Fc nativa. En algunas realizaciones, los anticuerpos que comprenden regiones Fc variantes tiene una semivida que es aproximadamente 2 veces, aproximadamente 3 veces, aproximadamente 4 veces, aproximadamente 5 veces, aproximadamente 10 veces, aproximadamente 20 veces, aproximadamente 50 veces o más, o entre 2 veces y 10 veces, o entre 5 veces y 25 veces, o entre 15 y 50 veces mayor, en comparación con un anticuerpo que comprende una región Fc nativa.

En una realización, la presente invención proporciona variantes de Fc, en las que la región Fc comprende una modificación (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos, inserciones de aminoácidos, eliminaciones de aminoácidos) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 221, 225, 228, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 250, 251, 252, 254, 255, 256, 257, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 279, 280, 284, 292, 296, 297, 298, 299, 305, 308, 313, 316, 318, 320, 322, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 339, 341, 343, 370, 373, 378, 392, 416, 419, 421, 428, 433, 434, 435, 436, 440 y 443 tal como se numeran mediante el índice EU tal como se expone en Kabat. Opcionalmente, la región Fc puede comprender una modificación en posiciones adicionales y/o alternativas conocidas por un experto en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5,624,821; 6,277,375; 6,737,056; 7,083,784; 7,317,091; 7,217,797; 7,276,585; 7,355,008; 2002/0147311; 2004/0002587; 2005/0215768; 2007/0135620; 2007/0224188; 2008/0089892; los documentos WO 94/29351; y WO 99/58572). Adicionalmente, se ejemplifican sustituciones específicas y posiciones de aminoácidos útiles en las tablas 2 y 6-10 del documento US 6,737,056; las tablas presentadas en la figura 41 del documento US 2006/024298; las tablas presentadas en las figuras 5, 12 y 15 del documento US 2006/235208; las tablas presentadas en las figuras 8, 9 y 10 del documento US 2006/0173170 y las tablas presentadas en las figuras 8-10, 13 y 14 del documento WO 09/058492.

En una realización específica, la presente invención proporciona una variante de Fc, en la que la región Fc comprende al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 221K, 221Y, 225E, 225K, 225W, 228P, 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 235A, 235D, 235R, 235W, 235P, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235E, 235F, 236E, 237L, 237M, 237P, 239D, 239E, 239N, 239Q, 239F, 239T, 239H, 239Y, 240I, 240A, 240T, 240M, 241W, 241L, 241Y, 241E, 241R, 243W, 243L 243Y, 243R, 243Q, 244H, 245A, 247L, 247V, 247G, 250E, 250Q, 251F, 252L, 252Y, 254S, 254T, 255L, 256E, 256F, 256M, 257C, 257M, 257N, 262I, 262A, 262T, 262E, 263I, 263A, 263T, 263M, 264L, 264I, 264W, 264T, 264R, 264F, 264M, 264Y, 264E, 265A, 265G, 265N, 265Q, 265Y, 265F, 265V, 265I, 265L, 265H, 265T, 266I, 266A, 266T, 266M, 267Q, 267L, 268E, 269H, 269Y, 269F, 269R, 270E, 280A, 284M, 292P, 292L, 296E, 296Q, 296D, 296N, 296S, 296T, 296L, 296I, 296H, 296G, 297S, 297D, 297E, 298A, 298H, 298I, 298T, 298F, 299I, 299L, 299A, 299S, 299V, 299H, 299F, 299E, 305I, 308F, 313F, 316D, 318A, 318S, 320A, 320S, 322A, 322S, 325Q, 325L, 325I, 325D, 325E, 325A, 325T, 325V, 325H, 326A, 326D, 326E, 326G, 326M, 326V, 327G, 327W, 327N, 327L, 328S, 328M, 328D, 328E, 328N, 328Q, 328F, 328I, 328V, 328T, 328H, 328A, 329F, 329H, 329Q, 330K, 330G, 330T, 330C, 330L, 330Y, 330V, 330I, 330F, 330R, 330H, 331G, 331A, 331L, 331M, 331F, 331W, 331K, 331Q, 331E, 331S, 331V, 331I, 331C, 331Y, 331H, 331R, 331N, 331D, 331T, 332D, 332S, 332W, 332F, 332E, 332N, 332Q, 332T, 332H, 332Y, 332A, 333A, 333D, 333G, 333Q, 333S, 333V, 334A, 334E, 334H, 334L, 334M, 334Q, 334V, 334Y, 339T, 370E, 370N, 378D, 392T, 396L, 416G, 419H, 421K, 428L, 428F, 433K, 433L, 434A, 424F, 434W, 434Y, 436H, 440Y y 443W tal como se numeran mediante el índice EU tal como se expone en Kabat. Opcionalmente, la región Fc puede comprender sustituciones de aminoácidos adicionales y/o alternativas conocidas por un experto en la técnica que incluyen pero sin carácter limitante las ejemplificadas en las tablas 2 y 6-10 del documento US 6,737,056; las tablas presentadas en la figura 41 del documento US 2006/024298; las tablas presentadas en las figuras 5, 12 y 15 del documento US 2006/235208; las tablas presentadas en las figuras 8, 9 y 10 del documento US 2006/0173170 y las tablas presentadas en las figuras 8, 9 y 10 del documento WO 09/058492.

En una realización específica, la presente invención proporciona un anticuerpo variante de Fc, en el que la región Fc comprende al menos una modificación (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos, inserciones de aminoácidos, eliminaciones de aminoácidos) en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 228, 234, 235 y 331 tal como se numeran mediante el índice EU tal como se expone en Kabat. En una realización, la modificación es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 228P, 234F, 235E, 235F, 235Y, y 331S tal como se numeran mediante el índice EU tal como se expone en Kabat.

En otra realización específica, la presente invención proporciona un anticuerpo variante de Fc, en el que la región Fc es una región Fc de IgG4 y comprende al menos una modificación en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 228 y 235 tal como se numeran mediante el índice EU tal como se expone en Kabat. Todavía en otra realización específica, la región Fc es una región Fc de IgG4 y los aminoácidos que no se producen de manera natural se seleccionan del grupo que consiste en 228P, 235E y 235Y tal como se numeran mediante el índice EU tal como se expone en Kabat.

En otra realización específica, la presente invención proporciona una variante de Fc, en la que la región Fc comprende al menos un aminoácido que se produce de manera no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 239, 330 y 332 tal como se numeran mediante el índice EU tal como se expone en Kabat. En una realización, la modificación es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 239D, 330L, 330Y y 332E tal como se numeran mediante el índice EU tal como se expone en Kabat.

En una realización específica, la presente invención proporciona un anticuerpo variante de Fc, en el que la región Fc comprende al menos un aminoácido que se produce de manera no natural en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 252, 254 y 256 tal como se numeran mediante el índice EU tal como se expone en Kabat. En una realización, la modificación es al menos una sustitución seleccionada del grupo que consiste en 252Y, 254T y 256E tal como se numeran mediante el índice EU tal como se expone en Kabat. En anticuerpos particularmente preferidos de la invención, la modificación es tres sustituciones 252Y, 254^ty 256E tal como se numeran mediante el índice EU tal como se expone en Kabat (conocida como "YTE"), véase el documento U.S. 7,083,784.

En determinadas realizacioneslas funciones efectoras provocadas por anticuerpos IgG dependen fuertemente del resto carbohidrato unido a la región Fc de la proteína (Claudia Ferrara et al., 2006, Biotechnology y Bioengineering 93:851-861). Por tanto, la glicosilación de la región Fc puede modificarse para aumentar o disminuir la función efectora (véanse, por ejemplo, Umana et al., 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; las patentes estadounidenses n.os 6,602,684; 6,946,292; 7,064,191; 7,214,775;7,393,683; 7,425,446; 7,504,256; las publicaciones estadounidenses n.os 2003/0157108; 2003/0003097; 2009/0010921; tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc. Princeton, N.J.); tecnología de modificación por ingeniería genética de la glicosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Suiza)). Por consiguiente, en una realización las regiones Fc de anticuerpos de la invención comprenden glicosilación alterada de residuos de aminoácido. En otra realización, la glicosilación alterada de los residuos de aminoácido da como resultado una función efectora disminuida. En otra realización, la glicosilación alterada de los residuos de aminoácido da como resultado una función efectora aumentada. En una realización específica, la región Fc tiene fucosilación reducida. En otra realización, la región Fc está afucosilada (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2005/0226867). En un aspecto, estos anticuerpos con función efectora aumentada, específicamente ADCC, tal como se generan en células huésped (por ejemplo, células CHO, Lemna minor) se modifican por ingeniería genética para producir un anticuerpo altamente desfucosilado con ADCC superior en más de 100 veces en comparación con el anticuerpo producido por las células parentales (Mori et al., 2004, Biotechnol Bioeng 88:901-908; Cox et al., 2006, Nat Biotechnol., 24:1591-7).

La adición de ácido siálico a los oligosacáridos en las moléculas de IgG puede potenciar su actividad antiinflamatoria y altera su citotoxicidad (Keneko et al., Science, 2006, 313:670-673; Scallon et al., Mol. Immuno. Marzo de 2007;44(7):1524-34. Los estudios a los que se ha hecho referencia anteriormente demuestran que las moléculas de IgG con sialilación aumentada tienen propiedades antiinflamatorias mientras que las moléculas de IgG con sialilación reducida tienen propiedades inmunoestimuladoras aumentadas (por ejemplo, actividad de ADCC aumentada). Por tanto, un anticuerpo puede modificarse con un perfil de sialilación apropiado para una aplicación terapéutica particular (publicación estadounidense n.° 2009/0004179 y publicación internacional n.° WO 2007/005786).

En una realización, las regiones Fc de anticuerpos de la invención comprenden un perfil de sialilación alterado en comparación con la región de Fc nativa. En una realización, las regiones Fc de anticuerpos de la invención comprenden un perfil de sialilación aumentado en comparación con la región Fc nativa. En otra realización, las regiones Fc de anticuerpos de la invención comprenden un perfil de sialilación disminuido en comparación con la región Fc nativa. En una realización, las variantes de Fc de la presente invención pueden combinarse con otras variantes de Fc conocidas tales como las dadas a conocer en Ghetie et al., 1997, Nat Biotech. 15:637-40; Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J. Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl. Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett. 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al, 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490); patentes estadounidenses n.os 5,624,821; 5,885,573; 5,677,425; 6,165,745; 6,277,375; 5,869,046; 6,121,022; 5,624,821; 5,648,260; 6,528,624; 6,194,551; 6,737,056; 7,122,637; 7,183,387; 7,332,581; 7,335,742; 7,371,826; 6,821,505; 6,180,377; 7,317,091; 7,355,008; 2004/0002587; y documento WO 99/58572. Otras modificaciones y/o sustituciones y/o adiciones y/o deleciones del dominio Fc resultarán fácilmente evidentes para un experto en la técnica.

Glucosilación

Además de la capacidad de la glucosilación para alterar la función efectora de los anticuerpos, la glucosilación modificada en la región variable puede alterar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. En una realización, se modifica el patrón de glucosilación en la región variable de los presentes anticuerpos. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación). La glucosilación se puede alterar, por ejemplo, para incrementar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones de los carbohidratos se pueden conseguir, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que provoquen la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de las regiones estructurales de la región variable para suprimir del mismo modo la glucosilación en dicho sitio. Una aglucosilación del mismo tipo puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Un enfoque del mismo tipo se describe en detalle adicional en las patentes estadounidenses n.os 5,714,350 y 6,350,861. También pueden realizarse una o más sustituciones de aminoácido que den como resultado la eliminación de un sitio de glucosilación presente en la región Fc (por ejemplo, asparagina 297 de IgG). Además, pueden producirse anticuerpos aglucosilados en células bacterianas que carecen de la maquinaria de glucosilación necesaria.

Conjugados de anticuerpo

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se conjugan o se unen covalentemente a una sustancia empleando métodos bien conocidos en la técnica. En una realización, la sustancia adherida es un agente terapéutico, un marcador detectable (denominado también en la presente una molécula indicadora) o un soporte sólido. Las sustancias adecuadas para unirlas a anticuerpos incluyen, sin carácter limitante, un aminoácido, un péptido, una proteína, un polisacárido, un nucleósido, un nucleótido, un oligonucleótido, un ácido nucleico, un hapteno, un fármaco, una hormona, un lípido, una estructura lipídica, un polímero sintético, una micropartícula polimérica, una célula biológica, un virus, un fluoróforo, un cromóforo, un tinte, una toxina, un hapteno, una enzima, un anticuerpo, un fragmento de un anticuerpo, un radioisótopo, matrices sólidas, matrices semisólidas y combinaciones de estos. En la técnica se conocen bien métodos de conjugación o unión covalente de otra sustancia a un anticuerpo.

En determinadas realizaciones , los anticuerpos de la invención se conjugan a un soporte sólido. Los anticuerpos pueden conjugarse a un soporte sólido como parte del procedimiento de selección y/o purificación y/o fabricación. Alternativamente, los anticuerpos de la invención pueden conjugarse a un soporte sólido como parte de un método de diagnóstico o composición. Un soporte sólido adecuado para su uso en la presente invención normalmente es sustancialmente insoluble en fases líquidas. Se dispone de un gran número de soportes y el experto habitual en la técnica los conoce. Por tanto, los soportes sólidos incluyen matrices sólidas y semisólidas, tales como aerogeles e hidrogeles, resinas, perlas, biochips (incluyendo biochips recubiertos con película fina), chip microfluídico, un chip de silicio, placas de múltiples pocillos (también denominadas placas de microtitulación o microplacas), membranas, metales conductores y no conductores, vidrio(incluyendo portaobjetos de microscopio) y soportes magnéticos. Ejemplos más específicos de soportes sólidos incluyen geles de sílice, membranas poliméricas, partículas, películas de plástico derivatizado, perlas de vidrio, algodón, perlas de plástico, geles de alímina, polisacáridos tales como Sepharose, poli(acrilato), poliestireno, poli(acrilamida), poliol, agarosa, agar, celulosa, dextrano, almidón, FICOLL, heparina, glucógeno, amilopectina, manano, inulina, nitrocelulosa, diazocelulosa, poli(cloruro de vinilo), polipropileno, polietileno (incluyendo poli(etilenglicol)), nailon, perla de látex, perla magnética, perla paramagnética, perla superparamagnética, almidón y similares.

En algunas realizaciones, el soporte sólido puede incluir un grupo funcional reactivo, incluyendo, sin carácter limitante, hidroxilo, carboxilo, amino, tiol, aldehído, halógeno, nitro, ciano, amido, urea, carbonato, carbamato, isocianato, sulfona, sulfonato, sulfonamida, sulfóxido, etc., para unirse a los anticuerpos de la invención.

Un soporte en fase sólida adecuado puede seleccionarse basándose en el uso final deseado y en la idoneidad para diversos protocolos de síntesis. Por ejemplo, cuando se desea la formación de un enlace amida para unir los anticuerpos de la invención al soporte sólido, pueden emplearse resinas útiles generalmente en síntesis de péptidos, tales como poliestireno(por ejemplo, resina PAM obtenida de Bachem Inc., Peninsula Laboratories, etc.), resina POLYHIPE™ (obtenida de Aminotech, Canadá), resina de poliamida (obtenida de Peninsula Laboratories), resina de poliestireno injertada con polietilenglicol (TentaGel™, Rapp Polymere, Tubingen, Alemania), resina de polidimetilacrilamida (disponible de Milligen/Biosearch, California), o perlas de PEGA (obtenidas de Polymer Laboratories).

En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se conjugan con marcadores para fines de diagnóstico y otros ensayos en los que puede detectarse el anticuerpo y/o sus ligando asociado. Un marcador conjugado con un anticuerpo usado en los presentes métodos y composiciones descritos en el presente documento, es cualquier resto químico, orgánico o inorgánico, que presenta un máximo de absorción a longitudes de onda mayores de 280 nm, y conserva sus propiedades espectrales cuando se une covalentemente a un anticuerpo. Los marcadores incluyen, sin limitación, un cromóforo, un fluoróforo, una proteína fluorescente, un colorante fosforescente, un colorante en tándem, una partícula, un hapteno, una enzima y un radioisótopo.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos se conjugan con un fluoróforo. Como tal, los fluoróforos usados para marcar anticuerpos de la invención incluyen, sin limitación; un pireno (incluyendo cualquiera de los compuestos derivados correspondientes dados a conocer en la patente estadounidense 5,132,432), un antraceno, un naftaleno, una acridina, un estilbeno, un indol o bencindol, un oxazol o benzoxazol, un tiazol o benzotiazol, un 4-amino-7-nitrobenz-2-oxa-1, 3-diazol (NBD), una cianina (incluyendo cualquier compuesto correspondiente en las patentes estadounidenses n.os 6,977,305 y 6,974,873), un carbocianuro (incluyendo cualquier compuesto correspondiente en los documentos estadounidenses con número de serie 09/557,275; las patentes estadounidenses n.os 4,981,977; 5,268,486; 5,569,587; 5,569,766; 5,486,616; 5,627,027; 5,808,044; 5,877,310; 6,002,003; 6,004,536; 6,008,373; 6,043,025; 6,127,134; 6,130,094; 6,133,445; y las publicaciones WO 02/26891, WO 97/40104, WO 99/51702, WO 01/21624; EP 1065 250 A1), un carboestirilo, una porfirina, un salicilato, un antranilato, un azuleno, un perileno, una piridina, una quinolina, un borapoliazaindaceno (incluyendo cualquier compuesto correspondiente dado a conocer en las patentes estadounidenses n.os 4,774,339; 5,187,288; 5,248,782; 5,274,113; y 5,433,896), un xanteno (incluyendo cualquier compuesto correspondiente dado a conocer en las patentes estadounidenses n.os 6,162,931; 6,130,101; 6,229,055; 6,339,392; 5,451,343; 5,227,487; 5,442,045; 5,798,276; 5,846,737; 4,945,171; documentos con números de serie 09/129,015 y 09/922,333), una oxazina (incluyendo cualquier compuesto correspondiente dado a conocer en la patente estadounidense n.° 4,714,763) o una benzoxazina, una carbazina (incluyendo cualquier compuesto correspondiente dado a conocer en la patente estadounidense n.° 4,810,636), una fenalenona, una cumarina (incluyendo un compuesto correspondiente dado a conocer en las patentes estadounidenses n.os 5,696,157; 5,459,276; 5,501,980 y 5,830,912), un benzofurano (incluyendo un compuesto correspondiente dado a conocer en las patentes estadounidenses n.os 4,603,209 y 4,849,362) y benzofenalenona (incluyendo cualquier compuesto correspondiente dado a conocer en la patente estadounidense n.° 4,812,409) y derivados de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, las oxazinas incluyen resorufinas (incluyendo cualquier compuesto correspondiente dado a conocer en el documento 5,242,805), aminooxazinonas, diaminooxazinas, y sus análogos benzosustituidos .

En una realización específica, los fluoróforos conjugados con los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen xanteno (rodol, rodamina, fluoresceína y derivados de los mismos) cumarina, cianina, pireno, oxazina y borapoliazaindaceno. En otras realizaciones, tales fluoróforos son xantenos sulfonatados, xantenos fluorados, cumarinas sulfonatadas, cumarinas fluoradas y cianinas sulfonatadas. También se incluyen colorantes vendidos con los nombres comerciales, y conocidos generalmente como, ALEXA FLUOR®, DyLight, colorantes CY®, BODIPY®, OREGON GREEN®, PACIFIC BLUE™, IRDYE®, FAM, FITC, y ROX™.

La elección del fluoróforo unido al anticuerpo determinará las propiedades de absorción y emisión de fluorescencia del anticuerpo conjugado. Las propiedades físicas de un marcador fluoróforo que puede usarse para anticuerpos y ligandos unidos a anticuerpos incluyen, sin carácter limitante, características espectrales (absorción, emisión y desplazamiento de Stoke), intensidad de fluorescencia, vida útil, polarización y velocidad de fotoblanqueo, o una combinación de los mismos. Todas estas propiedades físicas pueden usarse para distinguir un fluoróforo de otro, y permitir de ese modo análisis multiplexados. En determinadas realizaciones, el fluoróforo tiene un máximo de absorción a longitudes de onda mayores de 480 nm. En otras realizaciones, el fluoróforo absorbe a o cerca de 488 nm a 514 nm (particularmente adecuado para la excitación mediante la salida de la fuente de excitación de láser de ion argón) o cerca de 546 nm (particularmente adecuado para la excitación mediante una lámpara de arco de mercurio). En otra realización, un fluoróforo puede emitir en la NIR (región del infrarrojo cercano) para aplicaciones en tejido u organismo completo. Otras propiedades deseables del marcador fluorescente pueden incluir permeabilidad celular y baja toxicidad, por ejemplo si el marcaje del anticuerpo va a realizarse en una célula o en un organismo (por ejemplo, un animal vivo).

En determinadas realizaciones, una enzima es un marcador y se conjuga con un anticuerpo descrito en el presente documento. Las enzimas son marcadores deseables porque puede obtenerse la amplificación de la señal detectable dando como resultado una sensibilidad del ensayo aumentada. La propia enzima no produce una respuesta detectable, sino que funciona para descomponer un sustrato cuando se pone en contacto mediante un sustrato apropiado de manera que el sustrato convertido produce una señal fluorescente, colorimétrica o luminiscente. Las enzimas amplifican la señal detectable porque una enzima en un reactivo de marcaje puede dar como resultado que múltiples sustratos se conviertan en una señal detectable. El sustrato enzimático se selecciona para producir el producto medible preferido, por ejemplo, colorimétrico, fluorescente o quimioluminiscente. Tales sustratos se usan ampliamente en la técnica y el experto en la técnica los conoce bien.

En una realización, la combinación de sustrato colorimétrico o fluorogénico y enzima usa oxidorreductasas tales como peroxidasa del rábano y un sustrato tal como 3,3'-diaminobencidina(DAB) y 3-amino-9-etilcarbazol(AEC), que producen un color distintivo (marrón y rojo, respectivamente). Otros sustratos colorimétricos de oxidorreductasa que producen productos detectables incluyen, sin carácter limitante: 2,2-Azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), ofenilendiamina(OPD), 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), o-dianisidina, ácido 5-aminosalicílico, 4-cloro-1-naftol. Los sustratos fluorogénicos incluyen, sin carácter limitante, ácido homovanílico o ácido 4-hidroxi-3-metoxifenilacético, fenoxazinas reducidas y benzotiacinas reducidas, incluyendo el reactivo Amplex® Red y sus variantes (patente estadounidense n.° 4,384,042) e dihidroxantenos reducidos, incluyendo dihidrofluoresceínas (patente estadounidense n.° 6,162,931) y dihidrorrodaminas incluyendo dihidrorrodamina 123. Los sustratos de peroxidasa que son tiraminas (patentes estadounidenses n.os 5,196,306; 5,583,001 y 5,731,158) representan una clase única de sustratos de peroxidasa en la que pueden detectarse intrínsecamente antes de la acción de la enzima pero se “fijan en su sitio” mediante la acción de una peroxidasa en el proceso descrito como amplificación de señal de tiramida (TSA). Estos sustratos se utilizan ampliamente para marcar antígenos en muestras que son células, tejidos o matrices para su posterior detección mediante microscopía, citometría de flujo, exploración óptica y fluorometría.

En otra realización, una combinación de sustrato colorimétrico (y en algunos casos, fluorogénico) y enzima usa una enzima fosfatasa tal como una fosfatasa ácida, una fosfatasa alcalina o una versión recombinante de una fosfatasa del mismo tipo en combinación con un sustrato colorimétrico tal como fosfato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo (BCIP), fosfato de 6-cloro-3-indolilo, fosfato de 5-bromo-6-cloro-3-indolilo, fosfato de p-nitrofenilo o fosfato de onitrofenilo o con un sustrato fluorogénico tal como fosfato de 4-metilumbeliferilo, fosfato de 6,8-difluoro-7-hidroxi-4-metilcumarinilo (DiFMUP, patente estadounidense n^ 5,830,912), difosfato de fluoresceína, fosfato de 3-O-metilfluoresceína, fosfato de resorufina, fosfato de 9H-(1,3-dicloro-9,9-dimetilacridin-2-ona-7-ilo) (fosfato de DDAO ), o ELF 97, ELF 39 o fosfatos relacionados (patente estadounidense 5,316,906 y 5,443,986).

Las glucosidasas, en particular beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa y beta-glucosidasa, son enzimas adecuadas adicionales. Los sustratos colorimétricos apropiados incluyen, sin carácter limitante, beta-D-galactopiranósido de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (X-gal) y galactósidos, glucósidos y glucurónidos de indonilo similares, beta-D-galactopiranósido de o-nitrofenilo (ONPG) y beta-D-galactopiranósido de p-nitrofenilo. En una realización, los sustratos fluorogénicos incluyen beta-D-galactopiranósido de resorufina, digalactósido de fluoresceína (FDG), diglucurónido de fluoresceína y sus variantes estructurales (patentes estadounidenses n.os 5,208,148; 5,242,805; 5,362,628; 5,576,424 y 5,773,236), beta-D-galactopiranósido de 4-metilumbeliferilo, beta-D-galactopiranósido de carboxiumbeliferilo y beta-D-galactopiranósidos de cumarina fluorados (patente estadounidense n.° 5,830,912).

Las enzimas adicionales incluyen, sin carácter limitante, hidrolasas tales como colinesterasas y peptidasas, oxidasas tales como glucosa oxidasa y citocromo oxidasas, y reductasas para las que se conocen sustratos adecuados.

Las enzimas y sus sustratos apropiados que producen quimioluminiscencia se prefieren para algunos ensayos. Estos incluyen, sin carácter limitante, formas naturales y recombinantes de luciferasas y aequorinas. Son adicionalmente útiles lo sustratos que producen quimioluminiscencia para fosfatasas, glicosidasas y oxidasas tales como los que contienen dioxetanos estables, luminol, isoluminol y ésteres de acridinio.

En otra realización, también se utilizan haptenos tales como biotina como marcadores. La biotina es útil porque pueden funcionar en un sistema enzimático para amplificar adicionalmente la señal detectable, y puede funcionar como etiqueta que va a usarse en cromatografía de afinidad para fines de aislamiento. Para fines de detección, se usa un conjugado enzimático que tiene afinidad por biotina, tal como avidina-HRP. Posteriormente, se añade un sustrato de peroxidasa para producir una señal detectable.

Los haptenos también incluyen hormonas, fármaco de origen natural y sintéticos, contaminantes, alérgenos, moléculas afectoras, factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas, linfocinas, aminoácidos, péptidos, productos intermedios químicos, nucleótidos y similares.

En determinadas realizaciones, pueden conjugarse proteínas fluorescentes con los anticuerpos como marcador. Los ejemplos de proteína fluorescentes incluyen la proteína verde fluorescente (GFP) y las ficobiliproteínas y los derivados de las mismas. Las proteínas fluorescentes, especialmente la ficobiliproteína, son particularmente útiles para crear reactivo de marcaje marcados con colorante en tándem. Estos colorantes en tándem comprenden una proteína fluorescente y un fluoróforo con los fines de obtener un mayor desplazamiento de Stokes en el que los espectros de emisión se desplazan más lejos con respecto a la longitud de onda de los espectros de absorción de la proteína fluorescente. Esto es particularmente ventajoso para detectar una baja cantidad de antígeno en una muestra en la que la luz fluorescente emitida se optimiza al máximo, en otras palabras se reabsorbe poca o nada de la luz emitida por la proteína fluorescente. Para que esto funcione, la proteína fluorescente y el fluoróforo funcionan como una par de transferencia de energía en el que la proteína fluorescente emite a la longitud de onda a la que absorbe el fluoróforo y el fluoróforo emite a una longitud de onda más alejada de las proteínas fluorescentes de la que podría haberse obtenido sólo con la proteína fluorescente. Una combinación particularmente útil son las ficcobiliproteínas dadas a conocer en las patentes estadounidenses n.os 4,520,110; 4,859,582; 5,055,556 y los fluoróforos de sulforrodamina dados a conocer en las patente estadounidense n.° 5,798,276, o los fluoróforos de cianina sulfonados dados a conocer en las patentes estadounidenses n.os 6,977,305 y 6,974,873; o los derivados de xanteno sulfonados dados a conocer en la patente estadounidense n.° 6,130,101 y las combinaciones dadas a conocer en la patente estadounidense n.° 4,542,104. Alternativamente, el fluoróforo funciona como el donador de energía y la proteína fluorescente es el aceptor de energía. En determinadas realizaciones, el marcador es un isótopo radiactivo. Los ejemplos de materiales radiactivos adecuados incluyen, sin carácter limitante, yodo (121I, 123I, 125I, 131I), carbono (14C), azufre (35S), tritio (3H), indio (111In, 112In, 113mIn, 115mIn), tecnecio (99Tc, 99mTc), talio (201Ti), galio (68Ga, 67Ga), paladio (103Pd), molibdeno (99Mo), xenón (135Xe), flúor (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, y 97Ru. Tratamientos y usos médicos

Los anticuerpos y fragmentos de unión de los mismos de la invención y variantes de los mismos pueden ser para su uso en un método para el tratamiento de la infección por virus influenza A, para su uso en un método para la prevención de la infección por virus influenza A y/o para su uso en un método para la detección, el diagnóstico y/o el pronóstico de la infección por virus influenza A.

Los métodos de diagnóstico pueden incluir poner en contacto un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo con una muestra. Tales muestras pueden ser muestras de tejido tomadas de, por ejemplo, las fosas nasales, cavidades sinusales, glándulas salivales, pulmón, hígado, páncreas, riñón, oído, ojo, placenta, tubo digestivo, corazón, ovarios, hipófisis, glándulas suprarrenales, tiroides, cerebro o piel. Los métodos de detección, diagnóstico y/o pronóstico también pueden incluir la detección de un complejo antígeno/anticuerpo.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión del mismo para su uso en un método de tratamiento de un sujeto administrando al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo, según las reivindicaciones, o una composición farmacéutica que el anticuerpo o fragmento de unión del mismo. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo se purifica sustancialmente (es decir, está sustancialmente libre de sustancias que limitan su efecto o producen efectos secundarios no deseados). En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención se administra tras la exposición, o después de haberse expuesto el sujeto a virus influenza A o de haberse infectado con virus influenza A. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de las reivindicaciones se administra antes de la exposición, o a un sujeto que no se ha expuesto aún a virus influenza A o que no se ha infectado aún con virus influenza A. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de las reivindicaciones se administra a un sujeto que es seronegativo para uno o más subtipos de influenza A. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de las reivindicaciones se administra a un sujeto que es seropositivo para uno o más subtipos de influenza A. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de las reivindicaciones se administra a un sujeto en el plazo de 1, 2, 3, 4, 5 días desde la infección o la aparición de síntomas. En otra realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de las reivindicaciones puede administrarse a u sujeto después de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 días, y en el plazo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 días desde la infección o la aparición de síntomas.

En una realización, el método reduce la infección por virus influenza A en el sujeto. En otra realización, el método previene, reduce el riesgo o retarda la infección por virus influenza A en el sujeto. En ciertas realizaciones, el sujeto es un mamífero. En una realización más particular, el sujeto es un ser humano. En una realización, el sujeto incluye, sin carácter limitante, uno que corre particularmente el riesgo de o es propenso a la infección por el virus influenza A, incluyendo, por ejemplo, un sujeto inmunocomprometido.

El tratamiento puede ser un programa de una dosis única o un programa de múltiples dosis y el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención puede usarse en inmunización pasiva.

En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención se administra a un sujeto en combinación con uno o más medicamentos antivirales. En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención se administra a un sujeto en combinación con uno o más medicamentos antivirales de molécula pequeña. Los medicamentos de molécula pequeña incluyen inhibidores de neuraminidasa tales como oseltamivir (TAMIFLU®), zanamivir (RELENZA®) y adamantanos tales como amantadina y rimantadina.

En otra realización, la invención proporciona una composición para su uso como medicamento para la prevención o el tratamiento de una infección por el virus influenza A.

Se describe en la presente el uso de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención y/o una proteína que comprende un epítopo al que se une un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un sujeto y/o el diagnóstico en un sujeto.

Se describen en la presente anticuerpos y fragmentos de los mismos tal como se describe en la presente en un kit para el diagnóstico de la infección por el virus influenza A. Además, se describen en la presente epítopos que pueden unirse a un anticuerpo de la invención que pueden usarse en un kit para la monitorización de la eficacia de procedimientos de vacunación detectando la presencia de anticuerpos anti-virus influenza A protectores. Se describen en la presente anticuerpos, fragmento de anticuerpo, o variantes y derivados de los mismos, tal como se describe en la presente en un kit para monitorizar la fabricación de vacunas con la inmunogenicidad deseada.

La invención también proporciona un método de preparación de una composición farmacéutica, que incluye la etapa de mezclar un anticuerpo monoclonal con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal según la invención descrita en la presente.

Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar el anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención, incluyendo, sin carácter limitante, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes que pueden expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptor, construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retroviral u otro, administración de ácidos nucleicos desnudos mediante tecnología de administración mediante electroporación (tal como se describe en Muthumani et al., PLoS One. 31 de dic. de 2013;8(12):e84234. doi: 10.1371/journal.pone.0084234. eCollection 2013) etc. Los métodos de introducción incluyen, sin carácter limitante, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. Las composiciones se podrán administrar mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección intravenosa rápida, por absorción a través de los recubrimientos mucutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa intestinal y rectal, etc.) y se podrán administrar junto con otros agentes biológicamente activos, incluyendo, sin carácter limitante, composiciones antivirales de molécula pequeña. La administración puede ser sistémica o local. También se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente para formar un aerosol. En aún otra realización adicional, la composición puede administrarse en un sistema de liberación controlada.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas tal como se reivindican. Tales composiciones incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión del mismo de la invención, y un portador farmacéuticamente aceptable. La expresión “farmacéuticamente aceptable” usada en la presente significa que está aprobado por la agencia reguladora del gobierno federal o de un estado o que está enumerada en la farmacopea de los EE. UU. o en otra farmacopea reconocida de manera general para su uso en animales y, más particularmente, en seres humanos. El término “portador” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual se administra el agente terapéutico. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético tales como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. También se pueden emplear soluciones salinas y soluciones de glicerol y dextrosa acuosa como portadores líquidos, particularmente para las soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Si se desea, la composición también puede contener cantidades minoritarias de agentes humectantes o emulsionantes o agentes tamponantes del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación prolongada y similares. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores convencionales tales como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. En una realización, la composición farmacéutica contiene una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o fragmento de unión del mismo, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador de modo que se proporcione la forma para la administración apropiada al paciente. La formulación debe adecuarse al modo de administración.

Normalmente, para terapéutica con anticuerpos, la dosificación administrada a un paciente de entre aproximadamente 0.1 mg/kg y 100 mg/kg del peso corporal del paciente.

LISTA DE FIGURAS

La figura 1A muestra la unión del anticuerpo 3 y el anticuerpo 12 a la proteína HA expresada en superficie de subtipos H11, H12, H13, H16, H17, H4, H10, H14, y H15. Los histogramas representan el número de células frente a la intensidad de florescencia de la unión del anticuerpo a células transfectadas con HA en blanco o las células transfectadas de manera simulada en gris. La figura 1B muestra el porcentaje de inhibición de la fusión inducida a pH bajo de glóbulo rojos de pollo y A/Puerto Rico/8/34 en presencia de anticuerpo 3, anticuerpo 12 o MPE8v3 (anticuerpo frente a proteína de fusión viral no relevante) (Corti D et al., 2013, Nature 501). Las figura 1C y 1D muestran inmunotransferencias de H1 HA recombinante, sin escindir (HA0), tras digestión con tripsina durante 5, 10 ó 20 minutos. Las reacciones de digestión contenían o bien HA solo (entrada), o bien HA pretratado con FI6v4 (dado a conocer en el documento WO2013/011347A1), anticuerpo 3, FE17.23 (AcM específico de cabeza globular) (Corti D et al., 2010, J Clin Invest 120) o anticuerpo de control no relevante (IgG de ctrl.) en 1C, y HA solo (entrada), o HA pretratado con anticuerpo 3, anticuerpo 12, anticuerpo 14, anticuerpo de control no relevante (IgG de ctrl.) en 1D.

La figura 2 muestra el porcentaje de destrucción mediada por células NK de células MDCK infectadas por A/HK/8/68 en presencia de una cantidad creciente de anticuerpo 3, anticuerpo 11, anticuerpo 12, y anticuerpo 14.

La figura 3 muestra el porcentaje de macrófagos que fagocitaron células diana MDCK que expresan A/HK/8/68 HA en presencia de una cantidad creciente de anticuerpo 3, anticuerpo 11, anticuerpo 12, y anticuerpo 14 o control de isotipo no relevante (IgG de ctrl.)

La figura 4 muestra el porcentaje de destrucción dependiente de complemento de células MDCK infectadas por A/PR/8/34 en presencia de una cantidad creciente de anticuerpo 3, anticuerpo 11, anticuerpo 12 y anticuerpo 14.

La figura 5 muestra el porcentaje de animales supervivientes en cada grupo de un estudio cuando se administraron diferentes concentraciones de anticuerpo 3 o un anticuerpo de control no relevante (IgG de ctrl.) a ratones 4 horas antes de la infección con una dosis letal de virus influenza H1N1.

La figura 6 muestra el porcentaje de animales supervivientes en cada grupo de un estudio en que se administraron diferentes concentraciones de anticuerpo 3 o un anticuerpo de control no relevante (IgG de ctrl.) a ratones 4 horas antes de la infección con una dosis letal de virus influenza H3.

La figura 7 muestra el porcentaje de animales supervivientes en cada grupo cuando se infectaron ratones con una dosis letal de virus influenza H1N1 y se trataron en puntos de tiempo diferentes (1 y 2 días tras la infección) con 30 mg/kg de anticuerpo 3 o un anticuerpo de control no relevante (IgG de ctrl.)

La figura 8 muestra el porcentaje de animales supervivientes en cada grupo de un estudio en que se infectaron ratones con una dosis letal de virus influenza H3 y se trataron en puntos de tiempo diferente(3, 4 y 5 días tras la infección) con 30 mg/kg de anticuerpo 3 o un anticuerpo de control no relevante (IgG de ctrl.)

La figura 9 muestra el porcentaje de animales supervivientes en cada grupo de un estudio en que se infectaron ratones con una dosis letal de virus influenza H1N1 y se trataron en el día 1 tras la infección con 2 mg/kg de anticuerpo 3, anticuerpo 11, anticuerpo 12, anticuerpo 14 o un anticuerpo de control no relevante (IgG de ctrl.)

La figura 10 muestra el porcentaje de animales supervivientes en cada grupo de un estudio en que se infectaron ratones con una dosis letal de virus influenza H3 y se trataron en el día 2 tras la infección con 3 mg/kg de anticuerpo 3, anticuerpo 11, anticuerpo 12, anticuerpo 14 o un anticuerpo de control no relevante (IgG de ctrl.)

La figura 11 muestra el porcentaje de animales supervivientes en cada grupo de un estudio en que se infectaron ratones con una dosis letal de virus influenza H1N1 y se inició el tratamiento de oseltamivir 25 mg/kg BID durante 5 días , 10 mg/kg de anticuerpo 12 o 10 mg/kg de anticuerpo de control no relevante (IgG de ctrl.) en diferentes puntos de tiempo (4 h antes, 1 día después o 2 días después de la infección).

La figura 12 muestra el porcentaje de animales supervivientes en cada grupo de un estudio en que se infectaron ratones con una dosis letal de virus influenza H3 y se inició el tratamiento de oseltamivir oral 25 mg/kg dos veces al día (BID) durante 5 días, o dosis única de 10 mg/kg de anticuerpo 12, o 10 mg/kg de un anticuerpo de control no relevante (IgG de ctrl.) en diversos puntos de tiempo (1, 2, 3 ó 4 días tras la infección).

La figura 13 muestra el porcentaje de animales supervivientes en cada grupo en un estudio en que se infectaron ratones con una dosis letal de virus influenza H3 y se trataron con anticuerpo 12 a una dosis única de 2.5 mg/kg o 0.3 mg/kg, oseltamivir a 25 mg/kg BID durante 5 días, o una combinación de anticuerpo 12 a 2.5 mg/kg o 0.3 mg/kg y oseltamivir a 25 mg/kg BID durante 5 días a los 2 días tras la infección.

La figura 14 muestra el porcentaje de hurones supervivientes en cada grupo de un estudio tras infección con una dosis letal de virus influenza H5N1 y tratamiento con anticuerpo 12 a una dosis única de 25 mg/kg , oseltamivir 25 mg/kg durante 5 días o un anticuerpo de control no relevante (IgG de ctrl.) a 1, 2 ó 3 días tras la infección.

La figura 15 muestra una alineación de proteína HA2 de cepas de Influenza A usadas en selección de MARM.

Ejemplos

Ejemplo 1. Construcción y optimización de anticuerpos monoclonales humanos aislados de células de memoria

Se escogieron células B CD22+ IgG+ de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) crioconservadas de un donante seleccionado por tener altos títulos de anticuerpos heterosubtípicos y se inmortalizaron a 3 células/pocillo usando virus de Epstein Barr (EBV) y oligodesoxinucleótido CpG 2006 y células alimentadoras. Se recogieron sobrenadantes de cultivo que contenían anticuerpos tras 14 días y se examinaron mediante ensayo de unión de ELISA para determinar la actividad de unión frente a H5 (A/Vietnam/1203/04) y H7 (A/NLD/03) hemaglutinina (HA), respectivamente. Se encontró que cuatro clones de células B (anticuerpo 1, anticuerpo 4, anticuerpo 7 y anticuerpo 9) se unían específicamente a ambas HA y por tanto se recogieron. Se secuenciaron los genes de VH y VL de estos clones y se encontró que estaban relacionados clonalmente según el análisis de homología realizado en fragmentos V, D y J de VH y VL usando la base de datos de Kabat. Debe observarse que se encontró que VH del anticuerpo 4 tenía un sitio de nucleótido degenerado en la HCDR3 que codifica par o bien valina (codificada en el anticuerpo 5) o bien glutamato (codificado en el anticuerpo 6). Se clonaron los genes de VH y VL de los cuatro anticuerpos en vectores de expresión de IgG1 (modificaciones de secuencia minoritarias para facilitar la clonación y/u optimización de codones que dio como resultado los cinco anticuerpos; anticuerpo 3, anticuerpo 5, anticuerpo 6, anticuerpo 8 y anticuerpo 10; usados en los siguientes ejemplos) y se produjeron anticuerpos recombinantes mediante la transición transitoria de líneas celulares de mamífero derivadas de células HEK o CHO. Se recogieron los sobrenadantes de células transfectadas tras 7-10 días de cultivo y se purificaron por afinidad las IgG mediante cromatografía de proteína A, y se dializaron en PBS. Se optimizó adicionalmente el anticuerpo 3 para crear variantes en las que se cambiaron mutaciones somáticas codificadas no de línea germinal ubicadas en las regiones de entramado al aminoácido codificado de línea germinal, y las regiones CDR se sometieron a mutagénesis parsimoniosa. Se expresaron constructos de IgG completos que contenían diferentes mutaciones tal como se describió anteriormente y se examinaron los sobrenadantes brutos mediante ELISA para seleccionar clones que tenían actividad de unión aumentada a proteínas HA H3 y H1. Se realizó ELISA usando una concentración de recubrimiento de 0.15 |jg/ml de IgG de conejo anti-ser humano con el fin de capturar y normalizar IgG de los sobrenadantes, y luego se añadieron 0,5 g/ml de HA biotinilado subtipo H1 (A/California/7/04 (H1N1)) o subtipo H3 (A/Perth/16/09 (H3N2)) y se incubó durante una hora. Se detectó la unión mediante la adición de estreptavidina-HRP (1:5000), y se leyó el desarrollo de absorbancia a 450 nm. Se combinaron las mutaciones únicas beneficiosas que conferían mejor unión y se clonaron en una biblioteca combinatoria, que se expresó y se examinó mediante ELISA tal como se describió anteriormente. Este enfoque de biblioteca dio como resultado la creación de 5 variantes de anticuerpo adicionales que se caracterizaron adicionalmente (anticuerpos 11 15).

Ejemplo 2. El anticuerpo neutralizante anti-HA (Acn) se une a HA de diferentes subtipos

Para someter a prueba si el epítopo de los anticuerpos anti-HA se conserva entre HA de diferentes subtipos, se realizó un ensayo de unión de ELISA de reactividad cruzada. Ser recubrió una placa de ELISA Maxisorb de 384 pocillos (Nunc) durante la noche a 40C con HA recombinante (HAr) 0.5 ug/ml, subtipo H1 (A/California/7/09 (H1N1)), subtipo ^h2 (A/Swine/MO/06 (H2N3)), subtipo H3 (A/Perth/16/09 (H3N2)), subtipo H5 (A/Vietnam/1203/04(H5N1)), subtipo H6 (A/teal/HK/W312/97(H6N1)), subtipo H7 (A/Netherlands/219/03(H7N7)) y subtipo H9 (A/chicken/HK/G9/97(H9N2)) en PBS. Se lavó la placa con PBS que contenía Tween-20 al 0,1% v/v para retirar la proteína no recubierta y posteriormente se añadió disolución de bloqueo que contenía caseína al 1% (p/v) (Thermo Scientific) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Se desechó la disolución de bloqueo y se añadieron anticuerpos anti-HA diluidos en serie 3 veces en disolución de bloqueo (caseína-PBS (Thermo Scientific) y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Se lavó la placa tres veces y se detectaron los anticuerpos unidos usando un anticuerpo IgG de ratón anti-ser humano conjugado con peroxidasa (Jackson). Se calculó la actividad de unión del anticuerpo o bien midiendo la señal quimioluminiscente tras la adición de sustrato Supersignal Pico (Thermo Scientific) o bien midiendo el cambio de color a 450 nm tras la incubación con sustrato de un componente de tetrametilbencidina (TMB) (KPL) seguido por la adición de ácido sulfúrico 2 N para detener la reacción.

Tabla 1

Unión a HAr mediante ELISA (CE50, ug/ml)

H1 H2 H5 H6 H9 H3 H7

A/CA/7/09 A/swine/MO/06 A/VN/1203/04 A/HK/W312/97 A/HK/G9/97 A/Perth/16/09 A/NLD/219/03 Anticuerpo 3 0.026 0.028 0.022 0.043 0.012 0.019 0.020 Anticuerpo 5 0.045 0.048 0.041 0.047 >6 0.030 0.024 Anticuerpo 6 0.311 0.213 0.256 0.214 >6 0.064 0.116 Anticuerpo 8 0.069 0.058 0.044 0.091 >6 0.067 0.015 Anticuerpo 10 0.073 0.075 0.058 0.097 2.699 0.049 0.034

La tabla 1 muestra que todas las IgG anti-HA sometidas a prueba se unían a HA recombinante de los subtipos H1, H2, H3, H5, H6, H9 y h7. La HA recombinante de subtipo H9 se reconoció por el anticuerpo 3 y el anticuerpo 10, pero no por el anticuerpo 5, el anticuerpo 6 y el anticuerpo 8 a la concentración de anticuerpo superior sometida a prueba (6 ug/ml). Esto indica que los epítopos de la mayoría de estas IgG anti-HA se conservan entre moléculas de HA de diferente subtipos.

Tabla 2

Unión a HAr mediante ELISA (CE50, ug/ml)

H1 H2 H5 H6 H9 H3 H7

A/CA/7/09 A/swine/MO/06 A/VN/1203/04 A/HK/W312/97 A/HK/G9/97 A/Perth/16/09 A/NLD/219/03 Anticuerpo 0.045 0.095 0.099 0.072 0.171 0.129 0.258 3

Anticuerpo 0.085 0.126 0.168 0.129 0.164 0.176 0.553 11

Anticuerpo 0.059 0.088 0.084 0.083 0.098 0.028 0.061 12

Anticuerpo 0.050 0.062 0.080 0.097 0.161 0.023 0.049 13

Anticuerpo 0.048 0.079 0.061 0.073 0.095 0.030 0.064 14

Anticuerpo 0.028 0.042 0.035 0.043 0.065 0.032 0.035 15

La tabla 2 muestra que todas las variantes de IgG anti-HA sometidas a prueba se unían a HA recombinante de los subtipos del grupo 1 H1, H2, H5, H6 y H9 con valores de CE50 similares. Sin embargo, todas las variantes unidas a proteínas HA de grupo 2 (H3 y H7), el anticuerpo 11 y el anticuerpo 3 mostraron actividad disminuida con valores de CE50 aumentados en comparación con los anticuerpos 12-15.

Para ampliar estos resultados de unión para que incluyeran subtipos de HA más diversos, se realizaron estudios de unión adicionales usando una unión basada en citometría de flujo a células transfectadas con HA. En este ensayo, se transfectaron células HEK de manera transitoria con plásmidos que expresan HA de tipo natural de longitud completa de subtipo H4 A/duck/Czechoslovakia/56 (H4N6)), subtipo H10 (A/chicken/Germany/N49 (H10N7)), subtipo H11 (A/duck/Memphis/546/74 (H11N9)), subtipo H12 (A/duck/Alberta/60/76 (H12N5)), subtipo H13 (A/gull/Maryland/704/77 (H13N6)), subtipo H14 (A/mallard/Astrakhan/263/82 (H14N5)), subtipo H15 (A/shearwater/West Australia/2576/79 (H15N9)), subtipo H16 (A/black-headed gull/Sweden/2/99 (H16N3)) y subtipo H17 (A/little yellow-shouldered bat/Guatemala/164/2009 (H17N10)). Cuarenta y ocho horas tras la transfección, se separaron las células con tripsina, y se incubaron con 5 ug/ml de anticuerpo 3 o anticuerpo 12 en hielo durante 1 hora. Tras una hora de incubación, se tiñó entonces el anticuerpo unido a la proteína HA expresada en la superficie celular con una IgG de cabra anti-ser humano Daylight 649 (Jackson ImmunoResearch) y que se detectó mediante citometría de flujo. La figura 1A muestra el cambio en la intensidad de fluorescencia cuando el anticuerpo se une a células que expresan HA (blanco) frente a células transfectadas de manera simulada (gris) de cada uno de los subtipos. Se sometió a prueba el anticuerpo 3 unido a todas las HA con la excepción de H12, mientras que se sometió a prueba el anticuerpo 12 unido a todas las HA de ambos grupos (grupo 1 H11, H12, H13, H16, y H17 y grupo 2 H4, H10, H14, y H15)

Ejemplo 3 Caracterización cinética de la unión de HA a IgG1 de anticuerpo 3 y anticuerpo 5 usando Octet Se realizaron mediciones de afinidad usando un dispositivo Octet QK 384 Kinetic Analyzer de ForteBio (Menlo Park, CA) en placas inclinadas de 384 pocillos. Se diluyeron todos los reactivos en tampón Octet Kinetics (ForteBio). Se inmovilizaron HA con cola de His de diferentes subtipos: subtipo H1 (A/California/7/04 (H1N1)) y subtipo H3 (A/Perth/16/09 (H3N2)) sobre sensores anti-His a 10 |jg/mL. Entonces se monitorizaron la asociación/disociación de AcM anti-HA en diluciones de 2 veces a partir de 100 nM, más un control con AcM cero.

Se corrigieron los datos sin procesar de asociación y disociación por cualquier desviación en los controles de AcM cero, y luego se exportaron a GraphPad Prism (San Diego, CA) para ajustes de la curva de afinidad. Se ajustaron los datos usando ajuste de asociación/disociación global con un límite impuesto de > 5 x10-6 s-1. Tal como se muestra en la tabla 3, ambos anticuerpos tienen una unión de afinidad muy alta a H1 a nivel de pM con una velocidad de disociación lenta bajo el límite de detección. Se observaron Kon, Koff y Kd similares de ambos anticuerpos con el trímero de H3 a nivel de sub-nM.

Tabla 3

Análisis de unión cinética de AcM Pan A en HAr mediante Octet

H1 A/CA/7/09 H3 A/Perth/16/09

Kon (e5 M 'V ) Koff (e-6s-1) Kd (pM) Kon (e5 M'1s'1) Koff (e-6s-1) Kd (pM) Anticuerpo 3 5.3 <5 11 3.3 62 188 Anticuerpo 5 10 <5 5 2.6 88 338

Ejemplo 4 Actividad neutralizante de reactividad cruzada ^{in v itro} de IgG1 anti-HA contra virus de diferentes subtipos

Se modificó el ensayo de microneutralización (MNA) a partir de un ensayo de inhibición viral acelerado descrito anteriormente usando la actividad neuraminidasa (NA) como lectura (Hassantoufighi, A. et al. 2010, Vaccine 28:790). Brevemente, se realizó MNA en células MDCK que se cultivaron en medio MEM (Invitrogen) complementado con antibióticos, glutamina (medio MEM completo) y suero bovino fetal al 10% (v/v). Se añadieron 60 TCID50 (50% de dosis infecciosas de cultivo celular) de virus a diluciones de tres veces de anticuerpo en una placa de 384 pocillos en medio MEM completo que contenía tripsina 0.75 ug/ml (Worthington) en pocillos por duplicado, tras incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, se añadieron a la placa 2x104 células/pocillo. Tras la incubación en un incubador a 33oC 5% de CO2 durante aproximadamente 40 h, se midió la actividad NA añadiendo un sustrato marcado de manera fluorescente, ácido metilumbeliferil-N-acetil neuramínico (MU-NANA) (Sigma) a cada pocillo y se incubó a 37oC durante 1 h. Se cuantificó la replicación del virus mediante la actividad NA leyendo la fluorescencia en un fluorómetro Envison (PerkinElmer) usando los siguientes parámetros: excitación 355 nm, emisión 460 nm; 10 destellos por pocillo. El título de neutralización (concentración inhibidora al 50% [CI50]) se expresa como la concentración de anticuerpo final que redujo la señal de fluorescencia en un 50% en comparación con los pocillos de control. Las tablas 4 y 5 muestran virus influenza A neutralizados con anticuerpos anti-HA de diferentes subtipos sometidos a prueba: H1-PR34 (A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)); H1-PR34-OR (A/Puerto Rico/8/34 que contenía la mutación 274Y de NA (numeración de N2 ) que confiere resistencia a oseltamivir (H1N1)); H1-FM47 (A/Fort Monmouth/1/47 (H1N1)); H1-NJ76 (A/New Jersey/8/76 (H1N1)); H1-Kaw86 (A/Kawasaki/9/86 (H1N1)); H1-TX91 (caA/Texas/36/91 (H1N1)): H1-BJ95 (ca A/Beijing/262/95 (H1N1)); H1-Ncal99 (ca A/New Caledonia/20/99 (H1N1)); H1-SD07 (ca A/South Dakota/6/07 (H1N1)); H1-CA09 (ca A/California/7/09 (H1N1)); H1-CA09-OR (ca A/California/7/09 que contenían la mutación 274Y de NA (numeración de N2) que confiere resistencia a oseltamivir (H1N1)); H5-VN04 (ca A/Vietnam/1203/04 (H5N1)); H5-HK03 (ca A/Hong Kong/213/03 (H5N1)); H9-HK97 (ca A/chicken/Hong Kong/G9/97 (H9N2); H2-JP57 (ca A/Japan/57 (H2N2)); H2-MO06 (ca A/swine/Missouri/06 (H2N3)); H6-HK97 (ca A/teal/Hong Kong/W312/97 (H6N1)); H6-AB85 (ca A/mallard/Alberta/89/85 (H6N2)); H3-HK68 (A/Hong Kong/8/68 (H3N2)); H3-Vic75 (A/Victoria/3/75 (H3N2)); H3-LA87 (A/Los Angeles/7/09 (H3N2)); H3-SD93 (A/Shan dong/9/93 (H3N2)); H3-WH95 (ca A/Wuhan/359/95 (H3N2)); H3-Syd97 (ca A/Sydney/5/97 (H3N2)); H3-WH95-OR (ca A/Wuhan/359/95 que contenía la mutación 274Y de N^a(numeración de N2) que confiere resistencia a oseltamivir (H3N2)); H3-Pa99 (ca A/Panama/2007/99 (H3N2)); H3-Wy03 (A/Wyoming/03/03 (H3N2)); H3-WI05 (A/Wisconsin/67/05 (H3N2)); H3-Perth09 (ca A/Perth/16/09 (H3N2)), H3-VC11 (A/Victoria/361/11 (H3N2)); H7-NLD03 (ca A/Netherlands/219/03 (H7N7)); H7-BC04 (ca A/Brit. Columbia/CN-6/04 (H7N3-LP); H7-ANU13 (ca A/Anhui/1/13 (H7N9).

Tabla 4

Neutralización de virus infecciosos (CI50 ug/ml)

Virus Anticuerpo 3 Anticuerpo 5 Anticuerpo 6 Anticuerpo 8 Anticuerpo 10 H1-PR34 1.07 1.13 4.37 3.02 2.15 H1-FM47 0.92 0.86 3.04 1.37 1.11 H1-NJ76 1.41 1.64 2.60 2.26 0.15 H1-Kaw86 0.58 1.01 3.51 2.11 1.62 H1-TX91 0.60 0.76 2.20 0.70 0.48 H1-BJ95 3.41 5.06 20.86 10.60 4.46 H1-Ncal99 0.79 0.85 3.00 2.06 1.26 Grupo 1

H1-SD07 0.97 1.61 6.27 2.62 1.37 H1-CA09 2.19 2.52 5.56 4.50 1.62 H2-MO06 2.27 2.38 2.90 2.62 1.04 H5-VM04 2.11 2.60 8.87 3.90 2.21 H5-HK03 4.64 1.18 10.45 1.82 1.60 H6-HK97 1.77 2.27 3.23 2.97 1.05 H9-HK97 1.79 2.43 16.47 26.39 1.76 H3-HK68 0.68 0.39 2.04 2.82 0.85 H3-Vic75 0.75 0.57 1.09 3.83 0.91 H3-LA87 4.19 3.54 12.60 >50 4.59 H3-SD93 9.39 6.92 19.50 >50 11.65 H3-WH95 3.96 3.72 10.54 >50 8.70 H3-Syd97 3.75 3.03 6.54 >50 9.29 Grupo 2

H3-Pa99 17.74 16.74 25.82 >50 18.71 H3-Wy03 0.63 0.77 4.70 >50 1.52 H3-WI05 2.44 2.83 6.76 >50 4.46 H3-Perth09 1.49 2.22 5.03 >50 2.56 H7-NLD03 4.78 4.14 >50 12.75 3.80 H7-BC04 4.72 5.35 >50 14.69 3.59

La tabla 4 muestra que los anticuerpos anti-HA neutralizan todos los virus influenza A del grupo 1 sometidos a prueba. Todos los anticuerpos anti-HA excepto por el anticuerpo 8 demostraron actividad neutralizante frente a todos los virus influenza A H3 sometidos a prueba y todos los anticuerpos anti-HA excepto por el anticuerpo 6 mostraron actividad neutralizante frente a H7-NLD03 (ca A/Netherlands/219/03 (H7N7)); H7-BC04 (ca A/Brit. Columbia/CN-6/04 (H7N3-LP).

Tabla 5

Neutralización de virus infecciosos (CI50 ug/ml)

Virus Anticuerpo 3 Anticuerpo 11 Anticuerpo 12 Anticuerpo 13 Anticuerpo 14 Anticuerpo 15 Grupo 1 H1-PR34 2.17 0.88 1.07 1.30 1.25 1.47

H1-PR34-OR 1.39 0.73 0.69 0.88 0.83 0.90

H1-FM47 1.04 0.43 0.28 0.50 0.44 0.35

H1-NJ76 0.57 0.13 0.12 0.12 0.11 0.25

H1-Kaw86 1.01 0.53 0.28 0.41 0.35 0.48

H1-TX91 0.92 0.11 0.12 0.09 0.09 0.13

H1-BJ95 2.98 1.01 1.31 1.86 2.09 1.81

H1-Ncal99 1.16 0.66 0.61 0.77 0.67 0.79

H1-SD07 2.04 0.98 0.78 1.35 1.05 0.81

H1-CA09 2.07 0.90 0.98 1.23 1.07 1.17

H1-CA09-OR 2.10 0.87 0.84 1.05 1.23 1.35

H1-BS10 2.16 1.15 1.25 1.23 1.93 1.89

H2-JP57 0.46 0.31 0.35 0.47 0.67 0.33

H2-MO06 1.09 0.60 0.53 0.57 0.65 0.83

H5-VM04 1.19 0.57 0.31 0.56 0.33 0.28

H5-HK03 0.71 0.21 0.17 0.17 0.21 0.05

H6-AB85 0.69 0.24 0.32 0.29 0.26 0.19

H6-HK97 0.63 0.40 0.45 0.55 0.26 0.33

H9-HK97 1.18 0.36 0.31 0.29 0.44 0.35

Grupo 2 H3-HK68 1.37 0.46 0.42 0.44 0.65 0.50 H3-Vic75 1.12 0.46 0.32 0.43 0.44 0.35

H3-LA87 2.04 0.80 0.82 1.00 0.83 0.83

H3-SD93 3.57 1.11 1.32 1.56 1.57 1.43

H3-WH95 5.63 2.45 2.09 2.77 2.77 3.32

H3-WH95-OR 7.70 2.26 2.34 3.01 3.09 3.48

H3-Syd97 6.50 1.53 1.56 2.18 1.82 1.79 H3-Pa99 9.00 2.18 2.04 2.62 4.36 3.39

H3-WI05 2.62 1.07 1.09 1.19 1.19 1.30

H3-Perth09 1.30 0.17 0.25 0.28 0.47 0.50

H3-VC11 3.40 0.85 0.83 1.03 1.15 1.29

H7-NLD03 4.74 0.94 0.83 2.45 1.16 1.30

H7-BC04 2.95 0.71 0.78 0.96 0.86 1.25

H7-ANU13 4.26 nd 2.56 nd 2.12 nd La tabla 5 muestra que las variantes de anticuerpos (anticuerpos 11-15) son más eficaces que el anticuerpo 3 parental en la neutralización de todos los virus influenza A del grupo 1 y el grupo 2 sometidos a prueba con valores de CI50 reducidos. Además, los anticuerpos también neutralizaron 3 virus que tienen una mutación diseñada por ingeniería en la proteína NA que confiere resistencia a oseltamivir (OR).

Ejemplo 5. Actividad neutralizante de IgG anti-HA frente a virus H3N2 de origen porcino.

Se midió la actividad neutralizante de anticuerpo 3 anti-HA y variantes (anticuerpos 11-15) frente a virus H3N2 de origen porcinos de aparición reciente (A/Minnesota/11/2010 y A/Indiana/10/2011) en un ensayo de microneutralización tal como se describió en el ejemplo 4. Se usó el anticuerpo FI6v4 (descrito en el documento WO2013/011347A1) como anticuerpo de control. Tal como se muestra en la tabla 6 de dos experimentos independientes, el anticuerpo 3 y las variantes de anticuerpos (anticuerpos 11-15) fueron más eficaces que FI6v4 en la neutralización de virus H3N2 A/Indiana/10/2011 de origen porcino. El anticuerpo 3 y las variantes de anticuerpos neutralizaron de manera potente virus H3N2 A/Minnesota/11/2010 de origen porcino mientras que FI6v4 no logró neutralizar a la concentración más alta (50 ug/ml) de anticuerpo sometida a prueba.

Tabla 6

Actividad neutralizante (CI50 ug/ml)

Virus H3N2 FI6 v4 Anticuerpo 3 Anticuerpo 11 Anticuerpo 12 Anticuerpo 13 Anticuerpo 14 Anticuerpo 15 A/Minnesota/11/ >50 2.2 1.6 1.1 1.6 1.4 0.9 2010 de origen

porcino >50 4.2 1.5 1.2 1.4 2.3 2.7 A/Indiana/10/20 13.7 3.1 2.8 2.5 2.2 3.3 5.5 11 de origen

porcino 29.3 3.7 2.1 1.8 3.9 2.9 3.9

Ejemplo 6. El anticuerpo neutralizante anti-HA inhibe la fusión de influenza y la escisión de HA0 mediada por proteasa.

Para someter a prueba la inhibición de la fusión mediada por anticuerpo, se realizó un ensayo de fusión de glóbulos rojos inducida por pH bajo mediante un protocolo modificado descrito anteriormente (Wang T.T. et al., 2010 PLoS Pathog. 6). En resumen, se incubó virus A/Puerto Rico/8/34 (10 x 106 TCID50) con glóbulos rojos humanos (concentración de glóbulos rojos final del 2%) en hielo durante 10 minutos. Se incubaron diluciones de anticuerpo 3, anticuerpo 12 y un anticuerpo no relevante MPE8v3 con virus durante 30 minutos a TA. Después se añadieron los glóbulos rojos a la mezcla de virus-anticuerpo durante 30 minutos a 37°C y finalmente se añadió tampón de acetato de sodio (0.5 M, pH 5.0) durante 45 minutos adicionales a 37°C. Se centrifugaron las muestras durante 6 minutos a 400xg y se incubaron durante 45 minutos adicionales a TA y después se centrifugaron de nuevo durante 6 minutos a 400xg para sedimentar los glóbulos rojos. Después se transfirieron los sobrenadantes a una placa de ELISA para determinar la cantidad de NADPH liberado midiendo la absorbancia a 540 nm (figura 1B). El resultado mostró que el anticuerpo 3 y el anticuerpo 12 inhibían de manera potente la fusión viral mientras que MPE8v3, un anticuerpo monoclonal humano frente a la proteína de fusión de un paramixovirus (Corti et al., 2013 Nature 501), no podía inhibir la fusión inducida por pH bajo.

Para someter a prueba el bloqueo mediado por anticuerpo de la maduración de HA, se incubó HA recombinante de A/New Caledonia/20/99 (H1N1) durante 40 minutos con anticuerpo 3, FI6v4, FE17.23 o un anticuerpo de control de isótopo a una razón molar de 15:1 (AcM:HA). Después se expuso la mezcla de anticuerpo-HA a 2.5 ug/ml de tripsina tratada con TPCK y se incubó durante 5, 10 y 20 minutos a 370C. Se separaron las muestras en un gel de poliacrilamida y después se transfirieron a membrana de nitrocelulosa para análisis por inmunotransferencia de tipo Western usando un AcM humano biotinilado (FO32) (AcMhub) que reconoce HA2 y HA0 de cepas de influenza A (figura 1C). El resultado mostró que el anticuerpo 3 era más potente que FI6v4 en el bloqueo de la escisión de HA0 mediada por proteasa. En cambio, FE17.23, un anticuerpo monoclonal humano que reconoce la cabeza globular de HA y un anticuerpo de control no pudieron inhibir la escisión de HA0 mediada por proteasa. En un experimento se parado se comparó la inhibición de la escisión de proteasa del anticuerpo 12 y el anticuerpo 14 en comparación con el anticuerpo 3 usando las mismas condiciones descritas anteriormente (figura 1D). Los resultados mostraron que el anticuerpo 12, anticuerpo 13, tenían una capacidad similar para bloquear la escisión de proteasa que la del anticuerpo 3.

Ejemplo 7. Los anticuerpos anti-HA muestran función efectora de Fc

Los anticuerpos tienen el potencial para aclarar células infectadas por virus mediante función efectora de Fc tal como citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP) y destrucción dependiente de complemento (CDC). Para confirmar que los anticuerpos anti-HA mostraban actividad ADCC; se sometió a prueba su capacidad para destruir células infectadas por virus en presencia de linfocitos citolíticos naturales (NK). Se realizó el ensayo de ADCC con células MDCK infectadas con A/Hong Kong/8/68 a una MOI de 20. Se incubaron células infectadas con una serie de dilución de anticuerpo y después se incubaron con células NK purificadas que se seleccionaron de manera negativa a partir de PBMC humanas (Miltenyi), a una razón de efector con respecto a diana de 6:1. Se incubaron las mezclas de células infectadas, anticuerpo y células NK durante 4 horas y se midió la destrucción de células mediante liberación de LDH (Roche). La figura 2 muestra que los cuatro anticuerpos anti tallo de HA mostraban destrucción dependiente de la dosis de células MDCK infectadas.

Para medir la capacidad de los anticuerpos anti-HA para mediar en la fagocitosis, se usaron células MDCK transfectadas de manera estable con la HA derivada de A/Hong Kong/8/68 como células diana. Se aislaron monocitos humanos a partir de PBMC y se cultivaron durante 7 días en presencia de M-CSF para que se diferenciaran para dar macrófagos. Se marcaron de manera fluorescente los macrófagos humanos y las células diana que expresaban HA de color violeta y verde, respectivamente (CellTrace Violet o CSFE, Invitrogen). Se incubaron efector y células diana marcadas a una razón de 6:1 en presencia de una serie de dilución de anticuerpo durante 2 horas y después se analizaron mediante citometría de flujo. Se midió la fagocitosis en porcentaje como el porcentaje de macrófagos teñidos de violeta que también eran positivos para las células diana verdes (doble positivo). La figura 3 muestra que todos los anticuerpos anti-HA mostraron niveles similares de ADCP, tal como se esperaba el anticuerpo de control no específico no mostró fagocitosis.

Para medir la capacidad de los anticuerpos anti-HA para trabajar con complemento para mediar en la destrucción de células infectadas, se realizó un ensayo de CDC. En este ensayo, se infectaron células MDCK con A/Puerto Rico/8/34 a una MOI de 2, se incubaron con una serie de dilución de anticuerpo y complemento derivado de un conejo (Cedarlane) a una razón de efector con respecto a diana de 1:18. Se midió la destrucción celular mediante liberación de LDH (Roche). La figura 4 muestra que todos los anticuerpos anti-HA mostraron la capacidad para mediar en la destrucción celular en presencia de complemento.

Ejemplo 8. Efecto profiláctico y terapéutico de anticuerpos anti-HA

Se evaluó la eficacia de protección de anticuerpo neutralizante humano (AcN) frente a infección por virus influenza en un modelo de ratón BALB/c de seis a ocho semanas de edad (Harlan Laboratories). Se trataron los ratones con dosis diferentes de AcN o bien antes o bien después de exposición viral letal.

Actividad profiláctica (figures 5 y 6) A ratones en grupos de 8 se les administró anticuerpo 3 como una única inyección intraperitoneal (i.p.) a dosis de 0.1, 0.3, 1, 3 y 10 mg/kg, o IgG de control no relevante de isotipo humana a 10 mg/kg en volúmenes de 100 pl. Cuatro horas tras la administración de la dosis, se inoculó a los ratones por vía intranasal 7 veces la dosis mortal para ratones al cincuenta por ciento (7 DLR50) de A/California/7/09 (H1N1) (H1-CA09) o 7:1 de A/PR/8:A/HK/8/68 HA (H3N1) (H3-HK68) reagrupados en un volumen de 50 pl. Se pesaron los ratones en el día o un día antes de la exposición a virus y se monitorizaron diariamente durante 14 días para determinar la pérdida de peso y la supervivencia (se sacrificaron los ratones con una pérdida de peso corporal > 25%). El anticuerpo 3 confirió protección de una manera dependiente de la dosis. La inyección i.p. de 1 mg/kg o más de anticuerpo 3 proporcionó una protección completa en animales expuestos a H1-CA09 (figura 5) y H3-HK68 (figura 6). Una dosis de anticuerpo inferior (0.3 mg/kg) también fue altamente protectora con una protección del 90%. Tal como se esperaba, ninguno de los ratones que recibieron el AcM de control de isotipo a 10 mg/kg sobrevivió la exposición letal de infección.

Actividad terapéutica (figures 7 y 8) Se inocularon a los ratones 3 DLR50 de H1-CA09 y se les inyectó anticuerpo 3 a las 24 y 48 horas tras la infección (h.t.i.) (figura 7) o con 5 DLR50 de H3-HK68 a las 72, 96 y 120 h.t.i. (figura 8). El tratamiento i.p. con 30 mg/kg de anticuerpo 3 a las 24 y 48 h.t.i. protegió al 75-100% de los ratones expuestos a H1-CA09, u a las 72 y 96 h.t.i. protegió al 87.5-100% de los ratones expuestos a H3-HK68. El tratamiento con la misma dosis de anticuerpo de control de isotipo no relevante a las 0 o 24 h.t.i. En modelos de H1 y H3 no logró proteger a los ratones frente a la exposición letal con una tasa de supervivencia del 0 o el 12.5%, respectivamente.

Actividad terapéutica de variantes del anticuerpo 3 (figuras 9 y 10) Se inocularon a los ratones 3 DLR50 de H1-CA09 y se les inyectaron anticuerpos 24 h.t.i. (figure 9) o se les inocularon 7 DLR50 de H3-HK68 y se les inyectaron anticuerpos 48 h.t.i. (figura 10). El tratamiento i.p. con 2 mg/kg de anticuerpo 3 y AcM variantes (anticuerpo 11, anticuerpo 12 y anticuerpo 14) protegió al 87.5-100% de los ratones expuestos a H1-CA09, y una dosis de 3 mg/kg de los diferentes AcN protegió al 50-87.5% de los ratones expuestos a H3-HK68. Tal como se esperaba, el tratamiento con la misma dosis de anticuerpo de control de isotipo no relevante a las 24 ó 48 h.t.i en modelos de H1 y H3 no logró proteger a los ratones con una tasa de supervivencia del 0 o el 12.5%, respectivamente.

Ejemplo 9. Efecto terapéutico de anticuerpos anti-HA e inhibidor de molécula pequeña oseltamivir

Para comparar directamente la eficacia de protección de AcN anti-HA con inhibidor de neuraminidasa (NA) de molécula pequeña, oseltamivir, y el efecto de la terapia de combinación, se usó el modelo de infección murino de influenza descrito en el ejemplo 8.

Comparación terapéutica de AcN anti-HA y oseltamivir (figuras 11 y 12) Se inocularon a los ratones 3 DLR50 de H1-CA09 y se trataron con 10 mg/kg de anticuerpo 12 ó 25mg/kg BID durante 5 días de oseltamivir iniciado 4 h antes, 1 día o 2 días tras la infección (figura 11). El tratamiento con anticuerpo 12 antes de y 1 día después de la infección protegió al 100% de los ratones expuestos a H1-CA09, mientras que todos los animales tratados con oseltamivir sucumbieron a la infección. Todos los animales tratados con la misma dosis de control de isotipo no relevante 4 horas antes de la infección murieron con una tasa de supervivencia del 0%. Adicionalmente, se inocularon a los ratones 7 DLR50 de H3-HK68 y después se trataron con 10 mg/kg de anticuerpo 12 ó 25 mg/kg BID durante 5 días de oseltamivir iniciado 1, 2, 3 ó 4 días tras la infección (figura 12). Los animales tratados con anticuerpo 12 1, 2 ó 3 días tras la infección mostraron una tasa de supervivencia del 100%, mientras que el tratamiento con oseltamivir en esos mismos puntos de tiempo sólo mostró una tasa de supervivencia del 60%-20%. Tal como se esperaba, los ratones tratados con la misma dosis de anticuerpo de control de isotipo no relevante 1 día tras la infección sucumbieron a la infección con una tasa de supervivencia del 10%.

Combinación terapéutica de AcN anti-HA y oseltamivir (figura 13) Para evaluar el efecto aditivo de la combinación de AcM anti-HA con oseltamivir, se inocularon a los ratones 7 DLR50 de H3-HK68 y se trataron con una concentración inferior a la óptima de anticuerpo 12 (2.5 ó 0.3 mg/kg), oseltamivir a 25 mg/kg BID durante 5 días o una combinación de anticuerpo 12 (2.5 ó 0.3 mg/kg) y oseltamivir a 25 mg/kg BID durante 5 días, en el día 3 tras la infección (figura 13). El tratamiento o bien con anticuerpo 12 o bien con oseltamivir solo únicamente protegió al 10-20% de los animales mientras que el tratamiento con los 2.5 mg/kg de anticuerpo 12 en combinación con oseltamivir protegió al 80%, y 0.3 mg/kg de anticuerpo 12 en combinación con oseltamivir protegió al 50% de los animales.

Ejemplo 10. Efecto terapéutico de anticuerpos anti-HA e inhibidor de molécula pequeña frente a infección por influenza H5N1 en el hurón

Se evaluó la eficacia de protección de AcN anti-HA y oseltamivir frente a una infección por virus influenza altamente patogénico en hurones seronegativos para influenza de cinco a seis meses de edad (Triple F Farms). Se expusieron todos los hurones por vía intranasal a 1 DL90 de virus influenza aviar altamente patogénico A/VN/1203/04 (H5N1) en 1.0 mL (aproximadamente 0.5 mL/narina), y después se trataron o bien con una única dosis de anticuerpo 12 a 25 mg/kg o bien con oseltamivir a 25 mg/kg BID durante 5 días iniciado 1, 2 ó 3 días tras la infección. Se calculó la supervivencia en porcentaje para cada grupo (n=7) (figura 14). Se protegieron los hurones tratados con anticuerpo 12 iniciado 1, 2 y 3 días tras la infección, así como aquellos tratados con oseltamivir 1 día tras la infección, teniendo una tasa de supervivencia del 100%. Sin embargo, cuando se inició el tratamiento con oseltamivir 2 y 3 días tras la infección, los hurones sólo tuvieron una supervivencia del 71% (día medio de muerte 12) y una supervivencia del 29% (día medio de muerte 9), respectivamente. Tal como se esperaba, los animales tratados con 25 mg/kg de un anticuerpo de control de isotipo no relevante 1 días tras la infección no lograron vivir con una tasa de supervivencia del 0%.

Ejemplo 11. Identificación de epítopos mediante selección de mutantes resistentes a anticuerpo monoclonal (MARM).

Se aislaron mutantes resistente a anticuerpo usando dos métodos diferentes a partir de tres virus H3N2. S incubó H3N2 A/Aichi/2/68 (Aichi/68) con altas concentraciones de anticuerpo 12 (125xCI50) durante 1 hora antes de que se adsorbiera la mezcla de virus y anticuerpo en células MDCK a 30,000 TCID50 por pocillo en 10 x placas de 96 pocillos y se cultivaron en presencia del anticuerpo 12 (10XCI50). Se aislaron 3 supuestos MARM de HK2/68 del anticuerpo 12 que presentaban el efecto citopático (CPE) sobre las células infectadas hasta 3 días después de la infección. Se amplificó el gen de HA mediante RT-PCR y posteriormente se secuenció. El análisis de secuencia reveló 2 sustituciones no sinónimas en comparación con la secuencia parental (tabla 7). Estos dos cambios de nucleótidos codifican respectivamente para sustituciones de un único aminoácido de isoleucina (I) a arginina (R); y de ácido aspártico (D) a tirosina (Y) en las posiciones de aminoácido 18 y 19 en la región de tallo altamente conservada de HA2. Alternativamente, se propagaron un pase en serie de virus influenza H3N2, A/Wisconsin/67/2005 (WI05) y ca A/Panama/2007/1999 (Pa99) en presencia de cantidades crecientes del anticuerpo 12 desde 2-5XCI50 hasta 100XCI50. Se subclonaron posibles mutantes de escape mediante dilución limitada y se sometieron sus genes de HA relacionados a análisis de secuencia. Se identificaron los cambios de un único aminoácido de D a Y en la posición 19 y de glutamina (Q) a R en la posición 42 en HA2. Además, se observaron mutaciones dobles con la sustitución de aminoácido de histina (H) a Q en la posición 156 en HA1 en combinación con D19Y, o de D a asparagina (N) en la posición 19 en combinación con cambio de aminoácido de I a N en el residuo 45 en HA2; o de alanina (A) a treonina (T) en la posición 196 en HA1 en combinación con Q42R (tabla 7). De manera similar, cuando se sometió a pases en serie Pa99 en presencia de concentraciones del anticuerpo 12 de hasta 100 x CI50, se seleccionó la sustitución de un único aminoácido en el residuo 42 (Q42R) y 45 (I45T) de HA2 (tabla 7). Se utilizaron las variantes de MARM representativas mostradas en la tabla 7 en un ensayo de microneutralización para evaluar adicionalmente la susceptibilidad fenotípica de estos MARM a neutralización por el anticuerpo 12. Los resultados mostraron que los MARM de WI05 seleccionados in vitro que contenían las mutaciones D19Y, H156Q/D19Y, D19N/I45N, Q42R o A196T/Q42R; los MARM de Pa99 que contenían Q42R o I45T, y MARM de Aichi/68 que albergaban las mutaciones D19Y o I18R eran menos susceptibles a neutralización por anticuerpos, oscilando los aumentos en los valores de CI50 calculados entre >8 veces para clones resistentes a Pa99 hasta >180 veces para variantes resistentes a WI05 en comparación con sus cepas de tipo natural parentales, respectivamente (tabla 8). Para evaluar el efecto de estas sustituciones de aminoácido sobre la susceptibilidad a la neutralización por el anticuerpo 12, se generaron variantes de H3 A/Hong Kong/1-5/68 (rHK68) recombinantes que codificaban para mutaciones individuales y se evaluaron usando un ensayo de microneutralización. Tal como se muestra en la tabla 9, las variantes de H3 rHK68_I18R y rHK68_D19Y mostraron resistencia al anticuerpo 12 a la mayor concentración sometida a prueba (~200 |jg/mL) y confirieron una reducción >130 veces en la susceptibilidad a la neutralización por el anticuerpo 12 en comparación con el virus rHK68 de tipo natural. Los cambios de un único aminoácido Q42R en rHK68 dieron como resultado reducciones moderadas de aproximadamente 8 veces en la susceptibilidad a la neutralización por el anticuerpo 12. Sin embargo, las sustituciones de aminoácido (K156Q, A196T, I45N o I45T) identificadas en las proteínas de HA de MARM seleccionados no alteraron la susceptibilidad de virus HK68 recombinantes que codifican para tales sustituciones con respecto al anticuerpo 12 en el ensayo de microneutralización. Estos resultados sugieren que el anticuerpo 12 reconoce epítopos conformacionales en una región de tallo altamente conservada de HA2 y aminoácidos en las posiciones 18, 19, 42 ó 45 son residuos de contacto clave.

Tabla 7. Sustituciones de aminoácido identificadas en HA de H3 de cepas resistentes al anticuerpo 12

Tabla 8. Susceptibilidad de variantes resistentes de H3 a la neutralización (Neut) por el anticuerpo 12

Virus H3N2 parental ^{Cambios de aminoácido en HA de}Prom. Neut. Veces de cambio en relación con el _{MARM sometidos a prueba}(Mg/ml) virus de tipo natural

Tabla 9. Susceptibilidad de variantes de H3 rHK68 a la neutralización (Neut) por el anticuerpo 12 mutación de virus reagrupado Prom. Neut. (|jg/ml) veces de cambio en relación con el virus de tipo natural

Diver encia

Ċ

D ivergencia

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo aislado o fragmento de unión del mismo que puede unirse a hemaglutinina del virus influenza A y neutralizar al menos un subtipo del grupo 1 y al menos un subtipo del grupo 2 del virus influenza A, en el que el anticuerpo o fragmento de unión del mismo comprende una HCDR1 de SEQ ⁱD NO.: 113, HCDR2 de SEQ ID NO.: 114, HCDR3 de SEQ ID NO.: 115, LCDR1 de SEQ ID NO.: 118, LCDR2 de SEQ ID NO.: 119 y LCDR3 de SEQ ID NO.: 120.

2. Anticuerpo o fragmento de unión del mismo según la reivindicación 1, que comprende una VH de SEQ ID NO.: 112, y VL de SEQ ID NO.: 117.

3. Composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

4. Composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende His 25 mM y NaCl 0.15 M a pH 6.0.

5. Anticuerpo o fragmento de unión del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, para su uso en la profilaxis o el tratamiento de la infección por influenza A en un sujeto.

6. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 5 para su uso en combinación con una composición antiviral de molécula pequeña.

7. Anticuerpo para su uso según la reivindicación 6, en el que la composición antiviral de molécula pequeña:

(1) es un inhibidor de neuramidasa o una adamantina; y/o

(2) se selecciona de oseltamivir, zanamivir, amantadina, rimantadina, y combinaciones de los mismos.