JP3623479B2 - 小型化されたインビトロ増幅アッセイを行うための装置および方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
（発明の背景）
本出願は、米国特許仮出願第６０／１４０，４７７号（１９９９年６月２２日出願）に対する優先権を主張する。その開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、微量分析的および微量合成的な分析および手法を行うための方法および装置に関する。特に、本発明は、遺伝学的、生化学的および生物分析的なプロセスを超小型化することに関する。詳細には、本発明は、一体化かつ小型化されたサンプル調製、核酸増幅および核酸検出アッセイを行うための装置および方法を提供する。これらのアッセイは、法医学、生命科学研究ならびに臨床的および分子的な診断法（これらに限定されない）を含む様々な目的のために行うことができる。本発明は、細菌培養物および細胞培養物ならびに全血および処理された組織を含む目的とする様々な液状サンプルについて使用することができる。本発明の微量システム装置を使用する広範囲の任意のそのような微量分析的または微量合成的なプロセスを行うための方法もまた提供される。
【０００３】
２．関連技術の背景
宿主細胞からのＤＮＡの抽出および単離は現代の分子生物学の土台である。あるタイプのＤＮＡ、すなわち、細菌のプラスミドＤＮＡは、細菌、酵母および哺乳動物細胞に遺伝物質を挿入するための便利なベクターとして特に有用である。生物から単離されたＤＮＡは、プラスミドＤＮＡに連続した状態で共有結合させることによって挿入され、その後、細菌細胞などの細胞に導入され、そして増殖させることができる。それによって、非常に多くのコピー数のプラスミドがそれぞれの細胞において作製される。これらのプラスミドは、様々な実験目的または治療目的のために十分な量のＤＮＡを（ミリグラムまでの量が工業規模では製造され得るが、典型的には数マイクログラムの程度で）得るために都合良く採取することができる。プラスミドＤＮＡを採取することは、細胞からのその取り出しおよび細胞のゲノムＤＮＡ内容物からの単離として規定され、生命科学研究、診断法、治療法および他の適用における有用性は増大している。
【０００４】
現在、ＤＮＡの抽出および単離は、手作業、またはロボットによるサンプル調製装置の使用のいずれかによって行われている。いずれの場合においても、様々な技術および材料が使用されている（例えば、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキットおよびＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液ミニキットハンドブック、１９９９、Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｘ−Ｖｏｌｍｅｒ−Ｓｔｒａｓｓｅ ４、４０７２４、Ｈｉｌｄｒｅｎ、ドイツ；Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＆Ｄｏｌｙ、１９７９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５１３〜１５２２を参照のこと）。典型的には、細胞が、場合により、プロテアーゼまたはプロテイナーゼＫなどのタンパク質消化酵素を含有する表面活性剤（界面活性剤）溶液中で最初にインキュベーションされる。これらは細胞を溶解し、それによりＤＮＡを溶液中に放出させる。これは、ヌクレアーゼを不安定化させ、そして混入しているＲＮＡを加水分解するためにアルカリ性条件下で頻繁に行われている。その後、ＤＮＡは、他の細胞構成成分から分離しなければならない。これは、例えば、タンパク質および他の細胞破片の選択的な沈殿化、（フェノールおよびクロロホルムを使用する）有機化学品による抽出、およびＤＮＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む数多くの異なる分離プロトコルを使用して行われる。プラスミドＤＮＡはまた、混在する細胞（細菌のゲノムＤＮＡ）から単離しなければならない。ろ過法はプラスミドＤＮＡ溶液をもたらし得るが、ＤＮＡを溶媒和するために必要とされる溶液は、通常、ＤＮＡの所望する最終的な適用には適していない。結果として、プラスミドＤＮＡはエタノール沈殿によってこれらの溶液から取り出されるか、あるいは固相分離が使用される。これは、（ガラスまたはシリカを使用するアフィニティー結合法の場合には特に、）溶媒のｐＨおよび塩濃度をさらに変化させることを必要とする。これらの工程に必要とされる技術には、高価な一組の装置およびその熟練した操作者を必要とするピペット操作、送液、ろ過、洗浄および遠心分離が含まれる。自動化されたシステムのさらなる条件には、サンプル容器の取扱いに関するサンプル移動およびロボット工学が含まれる。
【０００５】
この議論は、ＤＮＡサンプルの調製（特に、プラスミドＤＮＡの調製）を行うためのより効率的で、迅速かつ安価な自動化された方法および装置がこの分野で求められていることを例示している。
【０００６】
一体化された遺伝子分析の領域では、サンプル調製、ＰＣＲ、およびリアルタイム蛍光法またはハイブリダイゼーション法による検出を一体化することがある程度の発達を遂げている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ他、１９９８、「一体化された遺伝子分析における進歩」、Ｐｒｏｃ．Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ’９８、Ｈａｒｒｉｓｏｎ＆ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ編、Ｋｌｕｗｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１１頁〜１６頁）。これらのシステムは、流体が処理されるマイクロフルーイディックデバイスと連携しなければならないポンプおよび弁などの肉眼的な流体取扱いシステムに頼っている。
【０００７】
しかし、ＤＮＡ（特に、プラスミドＤＮＡ）を採取するために細胞培養物を処理することができる装置および方法が求められている。
【０００８】
生物学および生化学の分野においては、分析手法は、周囲温度よりも高い温度での生物学的サンプルおよび反応混合物をインキュベーションすることを頻繁に必要とする。さらに、多くの生物分析的および生合成的な技術は、連続的に、あるいは反応スキームまたはプロトコルの経過にわたって２つ以上の温度でインキュベーションすることを必要とする。
【０００９】
そのような生物分析反応の一例がポリメラーゼ連鎖反応である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸配列の増幅および検出を可能にする技術である。米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ他）および同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）を参照のこと。この技術は、例えば、ＤＮＡ配列分析、プローブ作製、核酸配列のクローニング、部位特異的変異誘発、遺伝子変異の検出、ウイルス感染の診断、分子的「指紋識別」、ならびに生物学的流体および他の提供源における汚染微生物のモニターリングを含む広範囲の生物学的適用を有する。ポリメラーゼ連鎖反応は、標的の変性、プライマーのアニーリング、およびポリメラーゼによって媒介される伸長の反復した過程またはサイクルを含む；この反応プロセスにより、特定の標的配列の指数関数的な増幅が得られる。
【００１０】
ＰＣＲを小型化して自動化する方法は、広範囲の分析的な環境において、特に、非常に多数のサンプルを同時に分析しなければならない状況において、あるいは分析されるサンプルが少量である場合には望ましい。
【００１１】
ＰＣＲに加えて、米国特許第４，９８８，６１７号（ＬａｎｄｅｇｒｅｎおよびＨｏｏｄ）に開示されているリガーゼ連鎖反応を含む他のインビトロ増幅手法が知られており、先行技術において都合良く使用されている。より一般的には、核酸ハイブリダイゼーションおよび配列決定などの生物工学の分野で知られているいくつかの重要な方法は、サンプル分子を含有する溶液の温度を制御された様式で変化させることに依存している。これらの方法の実施を自動化して小型化することは、この分野における望まれる目標である。
【００１２】
自動化されたＰＣＲを行うために製造された機械的な自動化流体取扱いシステムおよび装置が先行技術において開示されている。
【００１３】
米国特許第５，３０４，４８７号（１９９４年４月１９日発行、Ｗｉｌｄｉｎｇ他）には、微量スケールの分析装置における流体取扱いが教示されている。
【００１４】
国際特許出願公開ＷＯ９３／２２０５３（１９９３年１１月１１日公開、ペンシルベニア大学）には、微細加工された検出構造体が開示されている。
【００１５】
国際特許出願公開ＷＯ９３／２２０５８（１９９３年１１月１１日公開、ペンシルベニア大学）には、ポリヌクレオチド増幅を行うための微細加工された構造体が開示されている。
【００１６】
Ｗｉｌｄｉｎｇ他（１９９４、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０：４３〜４７）は、シリコンに微細加工された直線流路における流体の操作を開示している。
【００１７】
Ｋｏｐｐ他（１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０：１０４６）は、異なる温度の領域を交互に使用してインビトロ増幅反応を行うためのマイクロチップを開示している。
【００１８】
ＰＣＲおよび他の温度依存的な生物分析反応を行うための先行技術において開示された合成マイクロチップの１つの欠点は、流路を通ってマイクロチップ上の流体を移動させるシステム、および１０μｍ〜１００μｍの範囲の直径を有するリザーバーを設計することが困難であった。これは、部分的には、これらのマイクロチップの構成要素の小さなサイズを通って流体を移動させるための高圧ポンプ手段を必要とするためである。先行技術のマイクロチップのこれらの無力性は、ＰＣＲおよび他の生物分析プロセスを小型化して自動化することに関してこれらの装置の有用性を制限している。
【００１９】
従って、特にＤＮＡサンプルの一体化されたサンプル調製および分析を提供するデバイスおよび方法がこの分野では求められている。この要求は、高コストおよび複雑な自動化（典型的にはロボットによる）システムによって現在悩まされている高処理能分析の場合には特に深刻である。ＤＮＡサンプル調製および分析の一体化は、非常に熟練した操作者を要求する多数の複雑な技術が必要な、この分野における現在の必要性がそれによって減少する場合には特に有用である。重要なことは、ＤＮＡ分析の場合、サンプル調製法およびインビトロ増幅法を一体化することは、汚染およびサンプル持ち越しの可能性を最小限にする。これは、この分野で使用されている様々なインビトロ増幅反応などの高感度技術では特に重要である。
【００２０】
本発明者の何人かにより、微量システムプラットホームと、回転によって、従って、マイクロプラットホームに埋め込まれた微小流路を通過する流体の動きを駆動させるためにプラットホームの回転から生じる向心力を利用することによって前記プラットホームを操作する微量操作デバイスとが開発された。これらは、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）に開示されている。これらのそれぞれの開示は参考として明示的に組み込まれる。
【００２１】
（発明の要約）
本発明は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）に開示されているような微量システムプラットホームを提供する（これらはそれぞれの開示は参考として明示的に組み込まれる）。
【００２２】
本発明は、微量スケールのプロセスをマイクロプラットホーム上で行うための装置および方法を提供する。それにより、流体は、プラットホームの回転から生じる向心力によって駆動されるので、規定された流路においてプラットホーム上を移動する。この微量システムプラットホームは、一体化および小型化されたサンプル調製、核酸増幅および核酸検出アッセイを行うために提供される。本発明の装置の第１の要素は、回転可能な構造体であるマイクロプラットホームであり、最も好ましくは、流体（サンプル）入口ポート、流体光学的な微小流路、試薬リザーバー、回収チャンバー、検出チャンバーおよびサンプル出口ポート（これらは「マイクロフルーイディック構造体」と総称的に呼ばれる）を含むディスクである。ディスクは、プラットホームのマイクロフルーイディックス構造体を通過する流体の動きを可能にする向心加速度を生じさせるために約１ｒｐｍ〜約３０，０００ｒｐｍの速度で回転させられる。本発明のディスクはまた、好ましくは、空気出口ポートおよび空気移動流路を含む。空気出口ポートおよび特に空気移動流路は、流体が空気を追い出すための手段を提供し、従って、ディスク上における流体の阻害されない動きが確保される。ディスク、および最も好ましくはプラットホームの面は、それに含有される流体の温度を周囲温度よりも高い温度に上げるための加熱エレメントをも含むことができる。ディスク上の特定部位には、好ましくは、流体が分析されることを可能にするエレメントもまた含まれる。
【００２３】
本発明のプラットホームの好ましい実施形態は、マイクロフルーイディックスディスクとともに回転するプラテンである。このプラテンは、最も好ましくは、抵抗加熱エレメント、熱電気的な（ペルチェ）素子、温度センサー、アッセイオプティクスおよびマイクロプロセッサーならびに他のエレクトロニクス構成要素を含む印刷された回路ボード盤である。回転中のプラテンと、固定された電源、モーター制御器、温度制御器およびコンピューターとの電気的な連絡は、最も好ましくは、スリップリングアセンブリーを介して達成される。マイクロフルーイディックディスクをプラテンの表面に取り付けて、ディスクおよびプラテンを一緒に回転させることによって、マイクロフルーイディック構造体全体における流体の分布および流速、ならびにマイクロフルーイディックディスクの局在化領域における流体の温度を制御することができる。
【００２４】
好ましい実施形態において、マイクロフルーイディックスディスクの一方の面はプラテンの一方の面に取り付けられ、そしてマイクロフルーイディックスディスク内の特定位置における流体の温度はプラテンとディスクとの温度交換によって制御される。代わりの実施形態において、マイクロフルーイディックディスクは、ディスクと、プラテンを含む熱調節エレメントとの間で温度交換を行わせるエレメントをそれぞれが含む２つのプラテンの間に配置される。好ましい実施形態において、プラテンは、それに埋め込まれているか、またはそれに取り付けられている抵抗加熱エレメント、ペルチェ素子および温度センサーを有する印刷された回路ボード盤である。代わりの実施形態において、マイクロフルーイディックディスク内の熱調節は、抵抗ヒーターを含む層を永続的にディスクに直節結合させることによって達成される；この場合、ディスク内の流体は、抵抗加熱エレメントによって周囲温度よりも高い温度に加熱され、そしてディスクを回転させることによって、また熱を環境に放出することによって周囲温度と等しい温度またはそれよりも高い温度に冷却される。プラテンの場合のように、この複合的なディスクと、電源、温度制御器およびコンピューターとの電気的な連絡は、最も好ましくは、スリップリングアセンブリーを介して達成される。
【００２５】
第１の局面において、本発明は、細胞からのＤＮＡの抽出、単離および精製を行うために、一体化および小型化されたサンプル調製を行うためのデバイスおよび方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明のデバイスおよび方法は、細菌細胞からプラスミドＤＮＡを単離するために特に提供される。
【００２６】
本発明のプラスミドＤＮＡサンプル調製プラットホームは、下記の機能を行うために提供される：細菌細胞からの遊離ＤＮＡに対するサンプル処理；得られた溶液をろ過して、細菌細胞フラグメントを除くこと；マトリックスに対するＤＮＡ結合を促進させる溶媒条件を使用しての結合マトリックスへの溶液の添加；結合したＤＮＡの洗浄、およびさらなる分析方法に適合し得る溶液による元の溶液の置換；ならびに好適な溶媒における結合マトリックスからのＤＮＡの溶出。このようにして溶出されたＤＮＡは、この分野で知られている方法を使用して、単離することができ、あるいはインビトロで増幅することができ、あるいは配列決定することができる。下記にさらに詳しく記載されているように、プラスミドＤＮＡサンプル調製を行うマイクロフルーイディック構造体を含む本発明のプラットホームが提供される。これらのマイクロ構造体は、明瞭化するために、１つのマクロ構造体に関して例示されている。しかし、多数のそのようなプラスミドＤＮＡ調製マイクロフルーイディック構造体を含むプラットホームが本発明によって提供される。この場合、マイクロフルーイディック構造体は、プラットホームのサイズと、本明細書中に開示されているようなマイクロフルーイディックス構造体を含むチャンバーおよびリザーバーの容量能とによって決定される密度でプラットホームの表面に配列させられる。
【００２７】
第２の局面において、本明細書中に記載されているようなマイクロフルーイディックス構造体を有する本発明が、インビトロ増幅反応を行うために一体化された一組の生化学的プロセスを行うために提供される。これらのプロセスには、細菌細胞または哺乳動物細胞からＤＮＡを単離するためのサンプル処理；ＰＣＲに適切な溶液条件に溶液条件を調節するためのサンプル調整；調整されたサンプルをＰＣＲ試薬（デオキシリボースヌクレオチド、ポリメラーゼ酵素、プライマーおよび適切な塩、緩衝液および添加剤を含む）と混合すること；ＰＣＲを行うための熱サイクル処理が含まれる。
【００２８】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明のディスクには、プラットホームが数個のサンプルを同時に処理して増幅することができる多数のマイクロフルーイディックス構造体が提供される。これらの実施形態において、一組の生化学的反応を行うためのマイクロフルーイディックス構造体の配置の多数の複製体がディスク上に配置され、そしてサンプル入口ポートまたはリザーバーがそれぞれの複製体に提供され、それによって多数のサンプルを処理することができる。さらに、サンプルＤＮＡが増幅される部分は、ディスク上に配置されたマイクロフルーイディックス構造体の個々の複製体のそれぞれにおいて提供される増幅プライマーを選ぶことによって独立的になり得る。これによって、特定サンプルの「多重的」な増幅が可能になる。あるいは、同じプライマーを、各サンプルのＤＮＡにおいて同じ標的フラグメントを増幅するために多数のサンプルを平行して処理するために提供することができる。増幅サイクルの各工程のために使用される温度、温度勾配速度および保持時間を含む独立した熱サイクル処理プロフィルを、マイクロフルーイディックス構造体のそれぞれについて、あるいは処理サンプルのそれぞれについて装置に対して個々にプログラム化することができる。
【００２９】
本発明は、多数の異なるサンプルの同時かつ独立的な熱サイクル処理、特定サンプルからの異なるフラグメントの独立した増幅、またはその両方を都合良く可能にする。この特徴はまた、ディスクに配置された多数のマイクロフルーイディックス構造体に対する反応パラメーターを変化させ、それにより同時に多数の実験を同時に行うことによって、迅速かつ１回の実験で１つのサンプルまたはアンプリコンに対する熱サイクル処理パラメーターを使用者が最適化することを可能にする。マイクロフルーイディックス構造体の特定の複製体は、プラットホーム上の他の複製体からマイクロフルーイディック的に隔てられて配置され得るので、すべてよりも少ない数のマイクロフルーイディックス構造体を含む部分を別個に使用することができ、そして残りの部分を将来の使用のためにそのままにしておくことができる。
【００３０】
本発明のプラットホームの代わりの実施形態において、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行、これは参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されているような計量用構造体が、多数の混合用構造体のそれぞれに試薬の一部を分配するために使用される。この場合、それぞれの混合用構造体が多数のサンプルリザーバーの１つに流体的に接続されており、それによって、サンプルと共通試薬との平行した処理および混合が可能である。このことは、自動化された試薬分配機構に対する必要性を低下させ、（多数の反応チャンバーに試薬を分配することと同時に行われ得る）試薬の分注に必要とされる時間の量を減らし、そして外部から加えられた電動的手段を使用することなく少量（ｎＬ〜μＬ）の容量の送達を可能にする。
【００３１】
本発明のプラットホーム上における多数の回収チャンバーのアセンブリーはまた、単純化された検出器を使用することができ、それによって、個々の回収／検出チャンバーのそれぞれを、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ技術ととも使用されるこの分野において十分に開発された機構を使用して走査することができる。最後に、本発明のプラットホームには、この分野で知られている液体送達手段（マイクロピペットなど）に適合し得る、サンプルおよび試薬をぞれぞれ充填するためのサンプル進入ポートおよび試薬進入ポートが提供される。
【００３２】
本発明のディスクは、遠心力による分析装置の分野において存在する利点を上回る利点をいくつか有する。第一に、流れが、流体流路の大きさが小さいために層流であるということである；これにより、混合および洗浄などのプロセスのより良好な制御が可能になる。第二に、微細加工によってもたらされる小さな寸法により、より大きな肉眼的システムの場合よりもはるかに広い範囲の回転速度にわたって、そしてその場合よりも大きな信頼性とともに、毛管力に依存した「受動的」な弁操作の使用が可能になる。小型化の既に記載された利点がこれに付加される。
【００３３】
本発明は、流体を移動させるために向心加速度が使用されるマイクロフルーイディックスディスクを使用することによって、現在の技術における様々な問題を解決する。流体を含有する構成要素が、少ない容量を含有するように、従って、アッセイを行うために必要とされる試薬コスト、反応時間および生物学的材料の量が少なくなるように構築されることは、本発明のマイクロフルーイディックプラットホームの利点である。流体を含有する構成要素がシールされること、従って、種々の流体の示差的な蒸発および試薬濃度において生じる変化による実験誤差がなくなることもまた利点である。本発明のマイクロフルーイディックスデバイスは完全に包まれているので、蒸発および光学的変動はともに無視できるレベルにまで低下する。本発明のプラットホームはまた、都合のよいことに「受動的」な混合および弁操作が可能である。すなわち、混合および弁操作が、プラットホーム上の構成要素の構造的な配置（形状、長さ、回転軸に対するプラットホーム表面における位置、および下記において議論されているような濡れ性などの構成要素の内部表面の表面性状など）、およびプラットホーム回転の力学（速度、加速度、方向および方向の変化）の結果として行われ、そしてアッセイの時間設定および試薬送達の制御が可能になる。
【００３４】
本発明のデバイスはまた、ＰＣＲなどのインビトロ増幅反応を行うために、より単純で、変動により強く、かつより経済的なサンプル調製を行う。サンプル処理の機構的な局面はすべて、所定の速度でディスクを回転させる１つのモーターを使用して行われ、それによって流体は微小流路および他のマイクロフルーイディックス構造体を通ってディスク上を移動させられる。これは、ロボットによるピペット操作装置または他の流体移動機構（処理プレートを異なる「装置」に送達するための自動化）またはその両方を含む現在のサンプル調製法よりも好都合である。
【００３５】
本発明は、都合のよいことに、サンプル調製をＰＣＲに対する熱サイクル処理と一体化し、それによってさらなる流体移動工程を省いている。これは、汚染または流体損失の可能性を最小限にする。
【００３６】
本発明のプラットホームは、少なくとも３つの方法で自動化に対する要求を低下させる。第一に、送達される流体の正確な計量に対する要求が、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は参考として本明細書中に明示的に組み込まれる）においてより詳しく記載されているようなディスク上の計量用構造体を使用することによって緩和される。アッセイに必要とされる容量のわずかに過剰なおおよその容量が充填され、そしてディスクを回転させて、適切なマイクロフルーイディック構造体の使用による流体の計量を可能にすることによって、高密度のマイクロタイタープレートアッセイについて従来必要とされるよりもはるかに簡便な（そして安価な）流体送達技術を用いることができる。
【００３７】
第二に、マイクロフルーイディックプラットホームにおける流体「送達」事象の総数が、マイクロタイタープレートに対して少なくなる。プラットホーム上で行われるすべてのアッセイで使用される共通試薬（試薬溶液、緩衝液および酵素基質など）を小分けして分注するマイクロフルーイディック構造体を使用することによって、手作業によるか、または自動化されたピペット操作工程の数が（アッセイの複雑性に依存して）少なくとも半減する。デバイスに対する流体移動を少なくすることにより、総アッセイ時間を少なくすることができる。これらの構造体の例が共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）に開示されている（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００３８】
本発明はまた、試薬をサンプルと混合し、そして得られた反応混合物を洗浄するためのプラットホーム上の手段を提供する。これにより、アッセイ回収チャンバー（１つまたは２つ以上）を別の「洗浄」装置に移す必要性がなくなる。これはまた、アッセイデバイスの操作を少なくし、そして制御され、かつ一体化された流体処理を提供することも少なくする。
【００３９】
本明細書中に開示されている発明は、サンプルおよび供給源に関して柔軟であり、細菌、動物の全血、組織および細胞供給源から核酸を単離することができる。本発明は迅速であり、既存の「自動化された」核酸調節法よりも約５０％以上迅速である。このシステムの核酸生成物は、この分野で知られている方法と等しい品質であるか、またはそれ以上の品質である。このシステムは簡便であり、容易に使用することができ、そして操作者の変動性に依存しないので変動に対して強い。さらに、開示されたプラットホームおよびシステムは自給式で一体型であり、それにより操作者の取扱いおよび誤りの両方が最小限になる。
【００４０】
本発明の装置のいくつかの好ましい実施形態を、本出願の下記の節に、そして図面においてさらに詳しく記載する。
【００４１】
（好適な実施形態の詳細な説明）
本発明は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されているようなマイクロプラットホームおよび微量操作デバイスを提供する。これらは、生物学的サンプルの微量分析的および微量合成的なアッセイを行うのに適合している。
【００４２】
本発明のために、用語「サンプル」は、より複雑な混合物の構成成分として単離または検出されるか、あるいは前駆体種から合成される任意の流体、溶液または混合物を包含することが理解される。特に、用語「サンプル」は、目的とする任意の生物学的な種を包含することが理解される。用語「生物学的サンプル」または用語「生物学的流体サンプル」は、血液、血漿、血清、リンパ、唾液、涙、脳脊髄液、尿、汗、植物抽出物および野菜抽出物、精液ならびに腹水（これらに限定されない）を含む任意の生物学的に由来するサンプルを意味することが理解される。
【００４３】
本発明のために、用語「向心力によって駆動される流体の微量操作装置」は、分析的な遠心分離器およびローター、微量スケールの遠心力による分離装置、そして最も詳しくは、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されているような微量システムプラットホームおよびディスクの取扱い装置を含むものとする。
【００４４】
本発明のために、用語「微量システムプラットホーム」は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、向心力によって駆動されるマイクロフルーイディックスアレイを含むものとする。
【００４５】
本発明のために、「毛管」、「微小毛管」および「微小流路」の用語は、相互に交換可能であること、そして適する場合には濡れ性または非濡れ性のいずれかの材料から組み立てられることが理解される。
【００４６】
本発明のために、「試薬リザーバー」、「アッセイチャンバー」、「流体保持チャンバー」、「回収チャンバー」および「検出チャンバー」の用語は、流体を含む本発明の微量システムプラットホームにおける規定された容量を意味することが理解される。本明細書中に提供されているこれらの構造体の容量能は約２ｎＬから約１０００μＬまでである。
【００４７】
本発明のために、用語「流入ポート」および用語「流体入口ポート」は、流体をプラットホームに加えるための手段を含む本発明の微量システムプラットホームにおける開口部を意味することが理解される。
【００４８】
本発明のために、用語「流出ポート」および用語「流体出口ポート」は、流体をプラットホームから取り出すための手段を含む本発明の微量システムプラットホームにおける規定された容量を意味することが理解される。
【００４９】
本発明のために、用語「毛管接合」は、流体の流れを遅らせるか、または促進させるために表面力または毛管力が利用される毛管または他の流体経路における領域を意味することが理解される。毛管接合は、流体的に接続されている（微小流路などの）フルーイディックス構成要素である、（プラットホーム層内において垂直的に）より大きな深さおよび／または（プラットホーム層内において水平的に）より大きな幅を有する親水性基体におけるポケット、凹部またはチャンバーとして提供される。接触角が９０ｏよりも小さい流体（大部分のプラスチック、ガラスおよびシリカを用いて作製されたプラットホーム表面における水溶液など）の場合、流れは、流路の断面が毛管接合の境界において増大するに従って妨げられる。流れを妨げる力は、流路断面の大きさに逆比例し、そして液体の表面張力に正比例し、流路を含む材料と接触している流体の接触角のコサインが乗算される毛管圧力によってもたらされる。本発明による微小流路における毛管現象に関連する力は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１２日発行）および共同所有で同時係属中の米国特許出願第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）（これらはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）において議論されている。
【００５０】
毛管接合は、少なくとも３通りの方法で組み立てることができる。１つの実施形態において、毛管接合は、１つの構成要素の横方向の大きさの１つまたは２つがもう一方の構成要素の横方向の大きさよりも大きい２つの構成要素の接合部において形成される。一例として、「濡れる」材料または「濡れ性」材料から作製されたマイクロフルーイディックス構成要素では、そのような接合は、共同所有で同時係属中の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）、第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）および同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）に記載されているように毛管の拡大部において生じる。毛管を通る流体の流れは、そのような接合において阻害される。一方、「濡れない」材料または「非濡れ性」材料から作製された構成要素の接合において、チャンバーまたはリザーバーから毛管への出口などの流体経路内の狭窄部は、流れを阻害する毛管接合をもたらす。一般に、構成要素の大きさが（チャンバーなどの）より大きな大きさから（毛管などの）小さい大きさに変化するときに毛管接合が形成される非濡れ性のシステムとは対照的に、濡れ性のシステムでは、構成要素の大きさが（毛管などの）小さい大きさから（チャンバーなどの）より大きな大きさに変化するときに毛管接合が形成されることが理解される。
【００５１】
毛管接合の第２の実施形態が、毛管または流路の示差的な表面処理を有する構成要素を使用して形成される。例えば、親水性（すなわち、濡れ性）の流路は、疎水性（すなわち、非濡れ性）の別の領域を有するように処理することができる。そのような流路を流れる流体は親水性領域を通ってそのように流れるが、流体−蒸気のメニスカスが疎水性域に突き当たったときに流れは妨げられる。
【００５２】
本発明による毛管接合の第３の実施形態が、横方向の大きさおよび表面性状の両方において変化を有する構成要素に提供される。そのような接合の一例が、より大きな横方向の大きさを有する疎水性の構成要素（微小流路またはリザーバー）への微小流路の開口部である。当業者は、本発明による毛管接合が、それらの横方向の大きさにおける種々のサイズ、種々の親水性的な性質、またはその両方を有する構成要素の接合部においてどのように作製され得るかを理解している。
【００５３】
本発明のために、用語「毛管作用」は、本発明のローターまたはプラットホームにおいて流体に加えられる回転運動または向心力が存在しない状態における流体の流れを意味することが理解され、部分的または完全な濡れ性の表面に起因する。
【００５４】
本発明のために、用語「毛管微小弁」は、毛管接合を含む毛管微小流路を意味することが理解される。それによって、流体の流れが妨げられ、そして流体に圧力を加えることにより、典型的には本発明のローターまたはプラットホームを回転させることにより生じる向心力に駆動され得る。毛管微小弁は、接合部における流体に対する流体力学的圧力を増大させることによって、最も好ましくはプラットホームの回転速度を増大させることによって乗り越えることができる毛管接合を含むことが理解される。
【００５５】
本発明のために、用語「犠牲弁」は、流体の流路から除かれ得る柔軟な材料から作製されることが好ましい弁を意味することが理解される。好ましい実施形態において、前記犠牲弁はワックス弁であり、そして赤外線照射を含む様々な加熱手段のいずれかを使用して加熱することによって、最も好ましくは、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（参考として組み込まれる）に記載されているように、プラットホームの表面に位置しているか、またはプラットホームの表面に埋め込まれている加熱エレメントを作動させることによって流体の流路から除かれる。
【００５６】
本発明のために、用語「流体的に連絡している」または用語「流体的に接続されている」により、流体が構成要素間を流れることができるように機能的に相互に接続されている構成要素が規定されることを目的とする。好ましい実施形態において、プラットホームは回転可能なプラットホームを含み、より好ましくはディスクを含む。それによって、ディスク上における流体の動きが、ディスクが回転したときの向心力によって駆動される。
【００５７】
本発明のために、用語「空気移動流路」は、プラットホーム上の構成要素（微小流路、チャンバーおよびリザーバーなど）と連続しているプラットホーム表面のポートであって、流体の動きによってプラットホームおよびローターの構成要素から空気を追い出すことができる通気孔および微小流路を含むプラットホーム表面のポートを含むことが理解される。
【００５８】
本発明のマイクロプラットホーム（好ましくは「ディスク」であり、これ以降は「ディスク」とまとめて示される；本発明のために、「マイクロプラットホーム」、「微量システムプラットホーム」および「ディスク」の用語は交換可能であると見なされる）は、１つまたは多数の微量合成的または微量分析的なシステム（これは本明細書中では「マイクロフルーイディックス構造体」と呼ばれる）を含むために提供される。そのようなマイクロフルーイディックス構造体は、ディスクが回転したときに流体が構成要素間を流れることを可能にするように機能的に相互に相互に接続されている、本明細書中にさらに詳しく記載されているような関連した構成要素の組合せを含む。これらの構成要素は、下記に記載されているように、ディスクに対して一体的に微細加工され得るか、あるいはディスクに取り付けられているか、またはディスクに置かれているか、またはディスクと接触しているか、またはディスクに埋め込まれているモジュールとして微細加工され得る。本発明のために、用語「微細加工された」は、サブミリメートルのスケールでこれらの構造体が製造され得るプロセスをいう。このようなプロセスには、当業者が熟知している成形、フォトリソグラフィー、エッチング、プレス加工および他の手段が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明はまた、本発明のディスクを操作するための微量操作デバイスを含む。この場合、ディスクは、流体の流れをディスク上において生じさせる向心力を提供するデバイス内で回転させられる。従って、デバイスは、制御された回転速度でディスクを回転させるための手段、ディスクの回転を開始および停止させるための手段、そして好都合には、ディスクの回転方向を変化させるための手段を提供する。電気機械式手段および制御手段の両方が、本明細書中においてさらに記載されているように、本発明のデバイスの構成要素として提供される。使用者インターフェース手段（キーパッドおよびディスプレイなど）もまた、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）においてさらに記載されているように提供される。
【００６０】
温度制御エレメントが、プラットホームの温度を、その上にある流体をインキュベーションしているときに制御するために提供される。従って、本発明は、加熱ランプ、直接的なレーザーヒーター、ペルチェ熱ポンプ、抵抗ヒーター、超音波ヒーターおよびマイクロ波励起ヒーターを含む加熱エレメント、ならびにペルチェ素子およびヒートシンク、放射的な熱喪失を容易にする放射ヒートフィンおよび他の構成要素を含む冷却エレメントを提供する。熱素子は、好ましくは、特定の領域または多数の領域にわたってプラットホームの温度を制御するために配置される。好ましくは、加熱エレメントおよび冷却エレメントは、マイクロフルーイディックス構成要素（最も好ましくは、本明細書中に記載されているような微小流路）と熱的に接触している熱調節層をプラットホーム表面に含む本発明のプラットホームを含む。プラットホームにおける任意の特定領域（好ましくは、特定の温度調節されている領域のいずれかにおける微小流路）の温度は、抵抗温度素子（ＲＴＤ）、サーミスター、液晶複屈折センサーによって、あるいはＩＲ特異的検出器を使用する赤外線測定によってモニターされ、そしてフィードバック制御システムによって調節することができる。本発明の微量システムプラットホームにおける温度制御は、最も好ましくは、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されている方法およびデバイスを使用して達成される。
【００６１】
好ましい実施形態において、微量システムプラットホーム表面の様々な部分は、米国特許第６，０６３，５８９号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されているような一体的な加熱エレメントを使用して制御される温度の領域（「熱領域」または「熱アレイ」と呼ばれる）を提供するために変更される。より好ましい実施形態において、微量システムプラットホーム表面のそのような部分は、熱制御エレメントのアレイで構成され、最も好ましくは、異なる温度を有するプラットホーム表面の作製された隣接領域である。好ましい実施形態において、プラットホームはまた、共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されているような他の構成要素、最も好ましくは、流路およびおよび微小流路を含み、それによって、流体は、異なる温度を有する異なる領域のそれぞれを少なくとも１回横切るか、またはより好ましくは数回横切る。これらの実施形態において、時間流体の量は、任意の特定の熱領域に含まれ、従って、任意の特定の温度において、領域内の流路の経路長、流路の水力直径の二乗、およびプラットホームの回転速度の二乗に依存する。好ましい実施形態において、アレイは、互いに隣接する異なる温度の少なくとも２つまたは３つの領域を含む。いくつかの実施形態において、熱領域は矩形の形状であり、一方、他の実施形態では、熱領域は、回転軸から遠位の位置における環直径が回転軸から近位の位置よりも大きい楔形状である。
【００６２】
本発明のプラットホームの好ましい実施形態において、本発明のプラットホームの表面に組み立てられた高い温度の熱アレイおよび領域は、熱的な加熱エレメントを含む。好ましい実施形態において、この熱的な加熱エレメントは抵抗ヒーターエレメントまたはサーモフォイルヒーターであり、これは電気的に絶縁されているプラスチックに包まれたエッチングフォイル加熱エレメントである（Ｍｉｎｃｏから得られるＫａｐｔｏｎ）。本発明のプラットホームを含む抵抗ヒーターエレメントは、共同所有の米国特許第６．０６３，５８７号に記載されている通りである。簡単に記載すると、前記抵抗ヒーターエレメントは、導電性インクおよび抵抗性インクでスクリーン印刷され得る電気的に不活性な基板を組み合わせて含む。この場合、導電性インクは一定のパターンでスクリーン印刷され、そして抵抗性インクは導電性インクパターンの上に所定のパターンでスクリーン印刷され、抵抗性インクは導電性インクと電気的に接触しており、そして導電性インクに加えられた電気的電位により、電流が抵抗性インクを横切って流れ、抵抗性インクにより熱が発生する。そのような構造体は、「電気的に抵抗性のパッチ」として本明細書中では定義される。好ましくは、導電性インクは、銀の導電性インクであり、Ｄｕｐｏｎｔ５０２８、Ｄｕｐｏｎｔ５０２５、Ａｃｈｅｓｏｎ４２３ＳＳ、Ａｃｈｅｓｏｎ４２６ＳＳおよびＡｃｈｅｓｏｎ ＳＳ２４８９０などであり、抵抗性インクは、例えば、Ｄｕｐｏｎｔ７０８２、Ｄｕｐｏｎｔ７１０２、Ｄｕｐｏｎｔ７２７１、Ｄｕｐｏｎｔ７２７８またはＤｕｐｏｎｔ７２８５あるいはＰＴＣ（正の温度係数）インクである。代わりの実施形態において、抵抗ヒーターエレメントは、抵抗インクパターンおよび導電性インクパターンの上にスクリーン印刷された誘電インクをさらに含むことができる。
【００６３】
本発明は、回転させることができる分析的／合成的な微容量アッセイプラットホームである特に改変されたマイクロプラットホームと、回転の結果としてプラットホーム上の向心力から生じる流体の動きがプラットホーム上に達成されるようにプラットホームを操作する微量操作デバイスとの組合せを含む。本発明のプラットホームは円形のディスクであることが好ましく、かつ好都合である。しかし、プラットホーム上の流体を求心性にするように回転し得るプラットホームはどれも、本発明の範囲に含まれるものとする。本発明の微量操作デバイスは、共同所有で同時係属中の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）においてさらに詳しく記載されている。
【００６４】
流体（試薬、サンプルおよび他の液体成分を含む）の動きは、プラットホームの回転による向心加速度によって制御される。微量システムプラットホーム上における特定のマイクロフルーイディックス構造体に適切な速度および圧力のもとで流体が流れるために必要とされる向心加速度の大きさは、プラットホームの有効半径、微小流路の内径、回転方向に対するプラットホーム上の微小流路の位置角度、およびプラットホームの回転速度（これらに限定されない）を含む様々な要因によって決定される。本発明の方法のいくつかの実施形態において、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、計量されない量の流体（サンプルまたは試薬溶液のいずれか）がプラットホームに加えられ、そして計量された量が流体リザーバーから微小流路に移される。好ましい実施形態において、本発明のプラットホームに供給される流体サンプルの計量された量は約１ｎＬ〜約５００μＬである。これらの実施形態において、１つまたは多数の計量用毛管を含む計量用マニホールドが、マイクロフルーイディックス構造体の複数の構成要素に流体を分配するために提供される。
【００６５】
本発明のプラットホームの構成要素は互いに流体的に接続されている。好ましい実施形態において、流体的な接続は、本発明のプラットホームの表面を含む微小流路によって提供される。微小流路のサイズは、特定の適用によって、そして本発明のプラットホームおよび方法の個々の実施形態のそれぞれに必要とされる流体の量および送達速度によって最適に決定される。微小流路のサイズは、０．１μｍから、ディスクの厚さ（例えば、約１ｍｍ）に近い値にまで変化させることができる。好ましい実施形態において、微小流路の内径は０．５μｍ〜約５００μｍである。微小流路およびリザーバーの形状は、必要に応じて、台形状、円形状または他の幾何形状であり得る。微小流路は、好ましくは、約０．１ｍｍ〜２５ｍｍの厚さを有する微量システムプラットホームに埋め込まれる。この場合、プラットホームの厚さ寸法にわたる微小流路の断面寸法は１ｍｍ未満であり、そしてプラットホームの前記断面寸法の１パーセント〜９０パーセントとすることができる。サンプルリザーバー、試薬リザーバー、反応チャンバー、回収チャンバー、検出チャンバーならびにサンプル入口ポートおよびサンプル出口ポートは、好ましくは、約０．１ｍｍ〜２５ｍｍの厚さを有する微量システムプラットホームに埋め込まれる。この場合、プラットホームの厚さ寸法にわたる微小流路の断面寸法はプラットホームの前記断面寸法の１パーセント〜７５パーセントとすることができる。好ましい実施形態において、そのような流路を通る流体の送達が、所望する構成要素の間における流体の動きを駆動させるために十分な時間および回転速度でプラットホームを同時に回転させることによって達成される。
【００６６】
入口および出口（流入および流出）のポートは、流体成分の導入または取り出しのために使用される本発明のマイクロプラットホームの構成要素である。流入ポートは、サンプルおよび試薬をディスク上に置くか、またはディスクに注入することができるように提供される。これらのタイプのポートは、一般にはディスクの中心の方に配置される。出口ポートもまた、生成物をディスクから取り出すことができるように提供される。ポートの形状および設計は、特定の適用に従って変化する。例えば、サンプル入口ポートは、特に、毛管作用によってサンプルがディスク内に効率的に吸い込まれることが可能であるように設計される。さらに、ポートは、自動化されたサンプル／試薬の充填または生成物の取り出しが可能であるように構成され得る。進入ポートおよび流出ポートは、最も好都合にはアレイ状に提供され、それによって多数のサンプルがディスクに加えられるか、またはマイクロプラットホームからの生成物の取り出しを行うことができる。
【００６７】
本発明のプラットホームのいくつかの実施形態において、入口ポートおよび出口ポートは、プラットホームのリザーバーに流体を送達する手動ピペッターまたは他の手段を使用することに適合する。代替的で、好都合な実施形態において、プラットホームは、自動化された流体充填デバイスを使用することに適合する。そのような自動化されたデバイスの一例が、プラットホームの表面に沿って半径方向の方向で動くロボットアームに位置する１個のピペットヘッドである。この実施形態において、プラットホームは、適切なリザーバーに向かうために半径方向に移動するピペットヘッドの下部に方位角方向で回転モーターの中心軸に割り出しすることができる。
【００６８】
ディスク上の空気取扱いシステムには空気移動流路も含まれる。それによって、流体の動きにより、空気が、流体を含有する微小流路に接続し、流体の運動方向に対して逆行する流路を通って追い出され、それにより、流体の動きをさらに駆動する陽圧がもたらされる。
【００６９】
ディスクなどの本発明のプラットホームおよびそのようなプラットホームを含むマイクロフルーイディックス構成要素は、好都合には、個々の適用に適した様々な組成および表面コーティング物を有して提供される。プラットホームの組成は、構造的条件、製造プロセスおよび試薬の適合性／化学的抵抗性の関数である。詳細には、無機の結晶性材料または非晶質材料（例えば、シリコン、シリカ、石英）、不活性な金属から、あるいはプラスチック（例えば、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、アセトニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ）、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリプロピレンおよびメタロセン）などの有機材料から製造されるプラットホームが提供される。このようなプラットホームは、下記に記載されているように非修飾の表面または修飾された表面とともに使用され得る。プラットホームはまた、ポリウレタンおよびポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）などの熱硬化性材料から作製することができる。これらの材料のコンポジットまたは組合せから作製されたプラットホームまたは本発明によって提供される：例えば、プラットホームの検出チャンバーを含む光学的に透明なガラス表面がその中に埋め込まれているプラスチック材料から製造されたプラットホーム。あるいは、異なる材料から作製された層から構成されるプラットホームを作製することができる。これらの材料の表面の性質は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されているように特定の適用に対して改変することができる。
【００７０】
好ましくは、ディスクには、微細加工された機械的、光学的および流体工学的な制御要素が、例えば、プラスチック、シリカ、石英、金属またはセラミックスから作製されたプラットホーム上に組み込まれる。これらの構造体は、下記においてさらに詳しく記載されているように、成形、フォトリソグラフィー、エッチング、プレス加工または他の適切な手段によって、サブミリメートルのスケールで組み立てられる。マイクロフルーイディックスおよびリザーバーの個々の組合せ、または共有されるそのようなリザーバーがそれらに流体的に接続されて提供される多数のマイクロフルーイディックス構造体を含むプラットホームもまた本発明によって包含されることもまた認識される。そのようなプラットホームの一例が図１に示されている。
【００７１】
プラットホームの製造および組み立て
本発明の微量システムプラットホームを含む基板に埋め込まれたマイクロフルーイディックス構造体が提供される。プラットホームは、好ましくは、ともに結合される別個の構成要素を含有する層として製造され、そして組み立てられる。図１に例示されているように、本発明のプラットホームの例示された実施形態は、リザーバー層およびマイクロフルーイディックス層の２つの層を含む。さらなる層を有するプラットホームもまた本発明の範囲に含まれる。
【００７２】
プラットホームのリザーバー層は、アクリル、ポリスチレン、ポリカーボネートまたはポリエチレンなどの熱可塑性材料から製造される。そのような材料の場合、製造方法には、機械加工および従来の射出成形が含まれる。射出成形の場合、プラットホームの特徴を規定するために使用される金型インサートは、この分野で知られている機械加工、放電加工および他の手段の標準的な方法を使用して作製することができる。
【００７３】
プラットホームのリザーバー層はまた、熱、放射線または他のエネルギー源にさらされるまでは液体形態で存在する熱硬化性材料または他の材料から製造することができる。熱硬化性材料の例には、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、ポリウレタンまたはエポキシ樹脂が含まれる。典型的には、これらの材料は２成分で製造者から得られる：この２成分は所定の割合で一緒に混合され、金型に射出されるか、または金型に注がれ、そして熱を与えて、プレポリマー液に存在するモノマーの架橋を開始させ、そして完了させる。プレポリマー液を金型に迅速に射出し、その後、その部分を架橋または硬化させるプロセスは、反応射出形成（ＲＩＭ）と呼ばれることが多い。プレポリマー液を金型に注ぎ、その後、その部分を架橋または硬化させるプロセスは、注型と呼ばれることが多い。ＲＩＭ用または注型用の金型インサートは、この分野で知られている機械加工、放電加工および他の手段の標準的な方法を使用して作製することができる。
【００７４】
プラットホームのマイクロフルーイディックス層もまた、アクリル、ポリスチレン、ポリカーボネートまたはポリエチレンなどの熱可塑性材料から製造することができる。流路およびキュベットの大きさは、リザーバー層に見出される大きさよりもはるかに小さくすることができるので、これらの材料を用いた典型的な製造方法には、機械加工および従来の射出成形だけでなく、圧縮／射出成形および型押しまたは圧印加工もまた含まれる。射出成形の場合、プラットホームのこの層の特徴を規定するために使用される金型インサートは、機械加工または放電加工などの従来の方法を使用して作製することができる。従来の方法では細かすぎて作製することができない特徴を有する金型インサートの場合には、様々な微細加工技術が使用される。これらには、パターンがフォトレジストおよびフォトマスクの使用によりシリコンウエハー基板上に作製されるシリコン微細加工が含まれる（Ｍａｄｏｕ、１９９７、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）。シリコンウエハーがエッチング剤に付されると、フォトレジストは、フォトレジスト下のシリコンへのエッチング剤の侵入を妨げ、同時に、エッチングをシリコンの露出領域において生じさせることができる。このようにして、パターンがシリコンにエッチングされ、このパターンは、型押しによって直接的に微細加工されたプラスチック部品を作製するために使用することができる。このプロセスにおいて、エッチングされたシリコンは、高圧のもと、プラスチックのガラス転移温度に近い温度で平坦な熱可塑性シートと接触させられる。その結果、パターンがプラスチックにネガで移される。
【００７５】
エッチングされたシリコンはまた、例えば、金属ニッケルを使用する電気メッキによって金属の金型インサートを作製するためにも使用することができる。異方性または等方性の湿式エッチングあるいは深部反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）などの様々な技術のいずれかを使用してエッチングされたシリコンは、金属性金型の基部として役立ち得る。ニッケルのシード層がシリコン上に蒸発により蒸着される：電気伝導性のシード層が形成されると、従来の電気メッキ技術を使用して厚いニッケル層を組み立てることができる。典型的には、その後、シリコンは除かれる（Ｌａｒｓｓｏｎ、１９９７、Ｍｉｃｒｏ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｂｕｌｌ．１：３）。その後、インサートは、従来の射出成形または圧縮／射出成形において使用される。
【００７６】
金型インサートのためにシリコンを微細加工することに加えて、金型は、シリコンをエッチングすることなくフォトリソグラフィーを使用して代わりに作製することができる。フォトレジストのパターンが、シリコン上に、または他の適切な基板上に作製される。シリコンを微細加工する場合のようにシリコンウエハーをエッチングするのではなくむしろ、フォトレジストパターンおよびシリコンが、この分野で知られている電気メッキ、熱気相蒸着または他の手段によって金属化される。金属の浮き彫りパターンは、その後、上記に記載されているような圧印加工、射出成形または圧縮／射出成形の金型として役立つ。
【００７７】
プラットホームのマイクロフルーイディック層もまた、リザーバー層の製造に関して上記に記載されているように熱硬化性材料を使用して製造することができる。この場合、マイクロフルーイディックス層の熱硬化物に対する金型パターンは、上記に記載されているように調製される。反応−射出成形および注型は射出成形の高い圧力および温度を必要としないので、より広範囲の金型パターンを使用することができる。シリコンまたは金属金型インサートの使用に加えて、記載されているようなフォトレジストパターンはまた、金型浮き彫りそのものとして使用することができる。フォトレジストは射出成形の高い圧力および温度に耐えられないが、注型またはＲＩＭのより穏やかな条件は著しい損傷をもたらさない。
【００７８】
プラットホームの組み立ては、マイクロフルーイディック層のリザーバー層への位置決めおよび取り付けを含む。プラットホーム上のマイクロフルーイディックス構造体が本明細書中に記載されているようなアッセイを行うことに関して有用であるためには、リザーバー層内のいくつかのマイクロフルーイディックス経路をマイクロフルーイディックス層内のいくつかのマイクロフルーイディックス経路に接続しなければならない。これらのマイクロフルーイディックス経路の位置決めは、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層における基点マーカーの光学的アラインメントによって、あるいはピンを有するマイクロフルーイディック層における穴もしくは凹部、またはリザーバー層における突起した特徴の機械的なアラインメントによって達成され得る。位置決めの必要な許容差は、マイクロフルーイディックス層におけるマイクロフルーイディックス経路よりもはるかに大きくなるようにリザーバー層内のマイクロフルーイディックス経路を設計することによって、またはその逆によって緩和され得る。
【００７９】
取り付けは、コンフォーマルシール、ヒートシールまたは融合結合、両面接着テープまたはヒートシール可能なフィルムを用いた結合、紫外線（ＵＶ）硬化性接着剤または熱硬化性接着剤を用いた結合、化学的結合、または溶媒を用いた結合を含む多くの方法で達成され得る。
【００８０】
コンフォーマルシールに必要な条件は、層の一方または両方がエラストマー材料から作製されていること、そして結合させる表面が、２つの層の物理的接触を制限し得るほこりまたは破片を有しないことである。好ましい組み立て方法では、エラストマー性のマイクロフルーイディックス層が堅いリザーバー層に関して位置決めされ、その後、堅いリザーバー層に押し付けられる。エラストマー性のマイクロフルーイディックス層は、好都合にはシリコーンから作製することができ、堅いリザーバー層は、好都合にはアクリルまたはポリカーボネートから作製することができる。手動圧により、層をファンデルワールス力によって接着させることができる。
【００８１】
ヒートシールまたは融合結合に必要な条件は、リザーバー層およびマイクロフルーイディックス層の両方が熱可塑性材料から作製されていること、そしてシールが、非晶質ポリマーの場合には層材料の両方のガラス転移温度よりも高い温度で生じること、あるいは半結晶性ポリマーの場合には層材料の両方の融解温度よりも高い温度で生じることである。好ましい組み立て方法では、マイクロフルーイディックス層がリザーバー層に関して位置決めされ、その後、リザーバー層に押し付けられる。その後、このコンポジットディスクは、２つの平坦な加熱されたブロックの間に置かれ、圧力が、加熱されたブロックによってこのコンポジットに加えられる。コンポジットディスクの各面における温度対時間プロフィルを調節することによって、そしてコンポジットシステムに加えられる圧力対時間プロフィルを調節することによって２つの層の結合を可能にして、それぞれの層における特徴の変化を最小限にする時間−温度−圧力プロフィルを決定することができる。例えば、２５０ｐｓｉの一定圧力のもとでアクリルのガラス転移温度のすぐ上の温度に室温から１時間かけて２つのアクリル製ディスクを加熱することは、２５０μｍ幅のフルーイディック流路の最小変動を考慮する１つの方法である。別の組み立て方法において、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層の結合表面が放熱ランプで非接触様式で別々に加熱され、そして結合表面がそれらのガラス転移温度に達したときに、マイクロフルーイディックス層がリザーバー層に関して位置決めされて、リザーバー層に押し付けられる。
【００８２】
両面接着テープまたはヒートシール可能なフィルムを使用して、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層を結合させることができる。結合させる前に、流体的な連絡を２つの層の間で可能にする穴が最初にテープ（またはフィルム）に開けられ、テープ（またはフィルム）がリザーバー層に関して位置決めされて、リザーバー層に貼り付けられ、そしてマイクロフルーイディックス層がテープ（またはフィルム）／リザーバー層コンポジットに関して位置決めされて、テープ（またはフィルム）／リザーバー層コンポジットに貼り付けられる。ヒートシール可能なフィルムを表面に結合させるためには、フィルムの温度を、非晶質ポリマーの場合にはフィルムの接着剤ポリマー材料のガラス転移温度よりも高い温度に、あるいは半結晶性ポリマーの場合にはフィルムの接着剤ポリマー材料の融解温度よりも高い温度に上げることが必要である。接着テープまたはヒートシール可能なフィルムを用いた結合の場合、十分な結合が、典型的には手動圧で達成され得る。
【００８３】
光重合性ポリマー（例えば、ＵＶ硬化性接着剤）または熱硬化性ポリマーを使用して、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層を接着させることができる。１つの方法において、この接着剤が層の一方または両方に塗布される。塗布方法には、塗装、スプレー、浸せき塗装またはスピンコーティングが含まれる。接着剤を塗布した後、層が組み立てられ、そして接着剤の架橋または硬化を開始させて完了させるために紫外線または熱にさらされる。別の方法では、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層はそれぞれ、接着剤のためにのみ使用され得る１組の流体流路とともに製造される。これらの流路は、例えば、アッセイのために使用される流体流路またはキュベットを取り囲むことができる。マイクロフルーイディックス層がリザーバー層に関して位置決めされ、そしてリザーバー層に押し付けられる。接着剤が様々な指定流路にピペットで注入され、そして接着剤でこれらの流路が満たされた後、組み立てられたシステムは、接着剤の架橋または硬化を行わせる紫外線または熱にさらされる。
【００８４】
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはシリコーンが最初に酸素プラズマにさらされ、その後、同様に処理されたシリコーン表面に周囲の環境で押し付けられた場合、２つの表面は接着される。プラズマ処理によってシリコーンの表面はシラノール表面に変換され、そしてこれらの表面が一緒にされたときにシラノール基がシロキサン結合に変換されると考えられる（Ｄｕｆｆｙ他、１９９８、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：４９７４〜４９８４）。この化学的な結合方法は、シリコーンのマイクロフルーイディックス層およびリザーバー層を接着させるために使用される。
【００８５】
溶媒結合に必要な条件は、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層の両方の結合表面が揮発性溶媒で溶媒和され得るか、または可塑化され得ることである。溶媒結合の場合、結合表面は適切な溶媒和流体がそれぞれ塗装されるか、または適切な溶媒和蒸気にさらされ、その後に位置決めがなされ、一緒に押し付けられる。可塑化により、ポリマー分子をより可動性にすることができ、そして表面を接触させたときにポリマー分子は絡み合う；溶媒が蒸発すると、ポリマー分子はもはや可動性ではなく、分子は絡まったままであり、それにより、物理的な結合が２つの表面の間にもたらされる。別の方法では、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層がそれぞれ、溶媒のためにのみ使用され得る１組の流体流路とともに製造され、そして上記に記載されているようにＵＶ硬化性接着剤または熱硬化性接着剤によって層が結合されるのと非常に類似して層が結合させられる。
【００８６】
組み立てられると、マイクロフルーイディックマニホールドの内側表面をパリレンコーティング剤で不動態化することができる。パリレンは、組み立て後のマイクロフルーイディックデバイスの内側の流体接触表面にバリア層を形成する気相蒸着型コンフォーマルポリマーコーティング剤である。このコーティング剤により、流体と、デバイスを組み立てるために使用された材料との間における物質の何らかの交換を防げる不透過性層が形成される。低い温度の気相蒸着方法を使用することにより、デバイスをその最終形態で製造し、その後、不動態化することができる。この不動態化法は、アッセイの性能を向上させるために使用することができる。特に、接着剤がディスクの組み立てにおいて使用される場合、接着剤物質（またはプラスチック基板またはカバー）によって流体が汚染される可能性がある。接着剤から染み出る妨害物質、または接着剤による物質の吸着および結合は、化学反応または生化学的反応を妨害し得る。これは、高温ではより大きな問題になり得るか、あるいは溶媒の場合には強酸または強塩基が必要になる。
【００８７】
温度制御エレメントを含む電気的または電子的なプラテンの組み立て
本発明は、熱サイクル処理用チャンバーおよび犠牲弁などのマイクロフルーイディックス構造体に対応するようにプラテンに配置された温度制御エレメントを含む電気的または電子的なプラテンを提供する。プラテンおよびマイクロフルーイディックス構造体は、それぞれのプラットホーム層に構成要素を相互に正しく配置させるための基点または他の位置決め物を使用してアラインメントされる。
【００８８】
本発明はまた、プラテンおよびマイクロフルーイディックプラットホームを回転させるための微量操作装置を提供し、これは、電気的接触がデバイスと回転中のプラテンとの間で維持されることを可能にするスリップリング構造体を回転中心軸または回転軸において含むことが最も好ましい。温度制御エレメントは、抵抗ヒーターおよびペルチェ素子を含むサーミスターおよび加熱エレメントを使用してディスク表面の特定位置において任意の特定温度を維持するためにデバイスにおいて提供される。このデバイスは、マイクロフルーイディックスディスクの回転を制御し、そしてマイクロフルーイディックスディスクと一緒に回転するプラテンに対する電気的シグナルをリアルタイムで分配し、かつ受け取る。
【００８９】
デバイスとプラテンとの関係を図２０に例示する。図に関して、プラテン５０９が、２４チャンネルのスリップリング（Ｌｉｔｔｏｎ社から市販、パーツ番号ＡＣ６０２３−２４）を含む中心軸５１０に挿入されている。中心軸の周りにおけるプラテンの回転は、Ｍｉｃｒｏｍｏ社から市販されているエンコーダー（パーツ番号３５５７Ｋ０１２ＣＲ）などのエンコーダーをも含むことが好ましい駆動モーター５０７によって駆動ベルト５０８を介して制御される。駆動モーター５０７は、駆動モーター動力線５０５、および適用される場合にはエンコーダーシグナル配線５０６を介してデバイスによって制御される。
【００９０】
デバイスは、ＰＣなどのコンピューターを含むことが最も好ましいマイクロプロセッサー５０１によって制御される。プラットホームの回転は、例えば、Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ社（パーツ番号ＰＩＣ−ＳＥＲＶＯ）から市販されているようなサーボモーター制御器５０３によって制御される。サーボモーター５０３は、Ｓｋｙｎｅｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ社（パーツ番号ＡＲＣ−２１３３）から市販されている電源５０４を備えている。サーボモーターは、例えば、ＰＣのＣＯＭポートに接続されたシリアルポート変換器（パーツ番号Ｚ２３８−４８５、Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ社）を使用するインターフェースを介してＰＣによって制御される。
【００９１】
プラテンに対する電気出力を制御するために制御システムを有するデバイスもまた提供される。複線ケーブル５１１により、スリップリングは、温度センサー配線５１２によってＰＣ内の市販のＡ／Ｄボード盤（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｂｏａｒｄｓ、パーツ番号ＣＩＯ−ＤＡＳ１６００）に接続されている比例・積分・微分（ＰＩＤ）回路に接続される分岐ボード盤５１７に接続される。この回路は、下記においてより詳細に開示されているプラテン表面のサーミスターからの温度データを受け取り、そしてプログラム可能な電流源５１５および電源５１６によって温度制御エレメントに対する電流送達を制御する。
【００９２】
プラテン自体は図２１に平面図で示されている。プラテンは、電子的エレメント（電気リード線、サーミスター、ペルチェ素子、マイクロフルーイディックスディスクとの熱接触を提供するための青銅ブロック、および熱を消散させるための放射フィンを含む）が取り付けられている印刷された回路ボード盤５５１から組み立てられることが最も好ましい。
【００９３】
図２１は、ペルチェ素子５５４とともに図に例示されているプラテンにおける温度制御エレメントの配置を示している。プラテンは、マイクロフルーイディックスディスクにおけるマイクロフルーイディックス構造体に対応させるためにプラテン表面に配置された青銅の熱接点５５２および５５３を有する。青銅の接点５５２は、温度検知エレメントを収容するために、その中に埋め込まれた溝５５５を有する。それぞれの組合せにおける熱接点との間には、ペルチェ素子５５４が配置されている。図には、青銅の熱接点５５７および５５８、溝５５９ならびにペルチェ素子５５８を含む別の温度制御エレメントもまた例示されている。これらのエレメントを配置することにより、特定のマイクロフルーイディックス構造体の多数の構成要素（例えば、熱サイクル処理用チャンバーおよび溶解チャンバーなど）の温度制御および加熱が可能になる。
【００９４】
プラテンにおける温度制御エレメントを制御する電気リード線は、図２２においてより詳細に示されている。ペルチェ素子５５４は、６０７および６０８を介して接続されているリード線６０１および６０５によって制御される。溝５５５に含有されるサーミスター６０６は、６０９および６１０を介して接続されているリード線６００および６０２によって制御される（すなわち、温度情報が、加熱時または冷却時のサーミスターにおける電流の流れに対する抵抗の変化の形態でＰＣ内の温度制御エレメントに伝えられる）。同様に、ペルチェ素子５５８は、６１２および６１３を介して接続されているリード線６０３および６０５によって制御される。溝５５９に含有されるサーミスター６１１は、６１４および６１５を介して接続されているリード線６０２および６０４によって制御される（すなわち、温度情報が、加熱時または冷却時のサーミスターにおける電流の流れに対する抵抗の変化の形態でＰＣ内の温度制御エレメントに伝えられる）。プラテン上のエレメントとスリップリングとの電気的接続を構築することにおいて、同じリード線を「アース」として使用すること（例えば、サーミスター６０６およびサーミスター６１１との間のリード線６０２に対する共通した接続を参照のこと）は、エレメントあたりに使用される接続の数を保存し、プラテンあたり８個までのエレメントの制御を可能にする。
【００９５】
温度制御エレメントの構造が図２３に断面で示されている。ペルチェ素子５５４は、プラテン表面５５１において青銅の接点５５２と５５３との間に配置され、そしてボルト６５３および６５４を用いてつながれる。青銅の接点５５２および５５３は、ペルチェ素子５５４に対して、そしてペルチェ素子５５４にから熱を移動させるための熱源およびヒートシンクとして作用する。マイクロフルーイディックディスクは青銅の接点５５２に位置する。ディスクを加熱するとき、ペルチェ素子５５４の上部表面が青銅の接点５５２を加熱し、青銅の接点５５３が冷却される。ディスクを冷却するとき、ペルチェ素子５５４の上部表面が青銅の接点５５４を冷却し、青銅の接点５５３を加熱する。さらなるアルミニウムヒートシンク６５２が、青銅の接点５５３と熱的に接触した状態で配置される。これにより、さらなるヒートシンク能力がもたらされ、ペルチェ素子５５４の性能が高められる。アルミニウムのヒートシンク６５２は、ねじ６５１および６５５を使用してプラテン５５１に取り付けられる。青銅の接点５５２は、サーミスターの温度感度を増大させるアルミナが満たされたエポキシ樹脂６５０を含有するくぼみにサーミスター６０６を含有する。熱グリースが、部品間の熱接触を増大させるために、部品５５２、５５４、５５３および６５２の間に塗布される。
【００９６】
本発明のプラテンを使用する際、本発明のプラットホームは、青銅の接点とプラスチックのマイクロフルーイディックス層との間に熱グリースを使用して組み立てられる。あるいは、青銅の接点が、柔軟なプラスチックのマイクロフルーイディックス層に機械的に固定されている凸状の層として提供される。
【００９７】
本発明のプラテンの代わりの実施形態には、１つまたは多数のマイクロプロセッサーを含むいわゆる「インテリジェント」プラテンが含まれ、それによって、スリップリングと、プラテンの基板を含む印刷された回路ボード盤との間の接続の組合せを減らすことができる。ＢＡＳＩＣ ＳＴＡＭＰ ＩＩの埋め込み型制御器などの一体化された回路パッケージは、プラテンの電気回路を介するシグナルの分配を制御するためにＰＣによって事前にプログラムすることができる。それによって、入力電源とアースとの接続のみがスリップリングとプラテンとの間に必要となるだけである。
【００９８】
ＤＮＡサンプル調製プラットホーム
本発明は、細菌細胞または真核生物（最も好ましくは哺乳動物）細胞からプラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを調製するためのＤＮＡサンプル適用プラットホームを提供する。本発明のこの局面は、本明細書中では単一のマイクロフルーイディックス構造体について記載される。しかし、多数のこれらのマイクロフルーイディックス構造体を含むプラットホームが提供され、そして本発明によって包含される。この場合、本明細書中に記載されている多数のマイクロフルーイディックス構造体がプラットホーム上に提供されている。
【００９９】
次に本発明をより十分に説明するために図を参照すると、図１４は、マイクロフルーイディックディスクのサンプル処理構造の１つの実施形態を詳細に例示している。向きに関して、ディスクの中心は図の上方にある。チャンバー１００５は、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さを有し、幅が約０．７ｃｍ〜１．５ｃｍで、長さが約０．４ｃｍ〜約０．８ｃｍであり、かつサンプル入力チャンバーおよび混合チャンバーの組合せにおいて約５０μＬ〜約１．０ｍＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：１．４３１５ｃｍ、長さ：０．７８７９ｃｍ）を有する。チャンバー内には、ディスク回転時に、特に、方向を迅速かつ／または反復的に変化させるディスク回転時に、チャンバー内に乱流的な流体の動きを生じさせるために、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの幅および約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの長さ（幅：０．１１５５ｃｍ、長さ：０．３７２０ｃｍ）である混合用バッフル１００６が存在する。回転の中心から最も半径方向に最も離れたチャンバー１００５内の位置には、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さを有するスロット１００８（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：１．０５３７ｃｍ、長さ：０．０７９４ｃｍ）が存在し、スロットには、フィルター１００９が設置されたフリット材が含まれる。フリット材はＰｏｒｅｘ、Ｘ−４５８８（７０μｍの細孔サイズ）によって製造され、フィルターはＷｈａｔｍａｎろ紙＃５４であり、これは、ディスクにおいてフリット材から半径方向のさらに外側に置かれる。フリット材は、この適用においては、多孔質メンブランとして液体を通過させるが、沈殿物を保持するフィルターとして作用する。この場合のろ紙は、最終ろ過工程として使用されている；フリットは沈殿物の大部分をろ過するが、ろ紙は、沈殿物をほとんど通り抜けさせないより細かい細孔サイズを有する。チャンバー１００５はまた、傾斜部１００７を備えている。この傾斜部は、プラットホームの深さが半径方向の外向き方向で減少し、かつチャンバーの底から約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍ（深さ：０．２２８６ｃｍ）の深さまで隆起して、フィルター用スロット１００８の内側縁を形成している；スロットの内側部分の深さ（深さ：０．１５２４ｃｍ）はチャンバー１００５の底とディスクの上部表面との中間であり、従って、十分な速度でディスクが回転したときに流体が通り抜けるすき間を形成する。流入ポート１０１５は、約０．００１ｃｍ〜０．２ｃｍの深さ、０．０１２５ｃｍ〜約０．０２５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．２１１８ｃｍ）を有する微小流路１０１４を介してチャンバー１００５に流体的に接続されている。流入ポート１０１５は、好ましくは、ピペッターおよびその自動化された実施形態などのフルーイディックス充填デバイスに適合する。
【０１００】
フィルター１００９の半径方向の遠位側において、チャンバー１００５からの半径方向の外向きの出口が、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０１ｃｍ〜約０．０２５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法（深さ：０．０５０８ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．２６３１ｃｍ）を有する微小流路１０１０に流体的に接続されている。微小流路１０１４は、犠牲弁１０１２の縁を規定するポケット１０１１に流体的に接続されている。このポケット１０１１は、プラットホーム表面における約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの深さ、約０．０４ｃｍ〜約０．０８ｃｍの長さ、および約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの断面寸法（深さ：０．１０１６ｃｍ、幅：０．１０６０ｃｍ、長さ：０．０７６２ｃｍ）を有し、その半径方向の遠位端には、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行、これは参考として組み込まれる）においてより詳しく示されているようなワックスまたは他の材料を使用して好ましくは作製される犠牲弁１０１２、および融解したワックスが流路を阻止することなく再固化する再結晶化チャンバー１０１３が存在する。犠牲弁１０１２は、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．１０５６ｃｍ）を有し、再結晶化チャンバー１０１３は、約０．７５ｃｍ〜約０．１５ｃｍの深さ、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの長さ、および約０．１ｃｍ〜約０．２ｃｍの幅の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．２０３１ｃｍ、長さ：０．２３５１ｃｍ）。本明細書中においてより十分に開示されているように、犠牲弁１０１２は、加熱エレメント（最も好ましくは、抵抗ヒーターまたはペルチェ素子）と熱的に接触している。この場合、弁を含むワックスは、ヒーターを作動させることによって融解される。好ましい実施形態において、ヒーターは、プラットホーム層内において、弁の下部に、最も好ましくは弁の直下に組み立てられるか、あるいは、ヒーターが弁の上方または下方にあるように、最も好ましくは弁のすぐ上方またはすぐ下方にあるように配置された別のプラテンを含む。微小流路１０１１および再結晶化チャンバー１０１３は、犠牲弁１０１２の長さを規定するために役立ち、そしてワックスは、溶融状態で堆積したときに、１０１１および１０１３の開口部によって流路のこの短い長さに自然に制限される。
【０１０１】
溶解液リザーバー１０１６が、回転軸からチャンバー１００５と実質的には同じ距離でディスク上に半径方向に配置されている。溶解液リザーバー１０１６は、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜０．２５ｃｍの深さ、約０．１８ｃｍ〜０．３６ｃｍの幅、および約０．３ｃｍ〜約０．８ｃｍの長さを有し、かつ約２５μＬ〜約３００μＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：０．３５７９ｃｍ（上部）および０．５５３６ｃｍ（底部）、長さ：０．７２９２ｃｍ）を有し、微小流路１０１７を介してチャンバー１００５に流体的に接続されている。溶解液は、最も好ましくは、微小流路１０１７を介して溶解液リザーバー１０１６に流体的に接続されている流入ポート１０１９を使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これらの構造体において、流入ポート１０１９は、好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施形態などのフルーイディックス充填デバイスに適合する。微小流路１０１７は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０５０８ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．４８４５ｃｍ）。
【０１０２】
沈殿化剤緩衝液リザーバー１０２０もまた、回転軸からチャンバー１００５と実質的には同じ距離でディスク上に半径方向に配置されている。沈殿化剤緩衝液リザーバー１０２０は、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜０．２５ｃｍの深さを有し、幅が約０．４ｃｍ〜０．８ｃｍで、長さが約０．２５ｃｍ〜０．５０ｃｍであり、かつ約３５μＬ〜約４００μＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：０．７３４９ｃｍ、長さ：０．４９６０ｃｍ）を有し、微小流路１０２３を介してチャンバー１００５に流体的に接続されている。沈殿化剤緩衝液リザーバー１０２０と微小流路１０２３との間には、犠牲弁１０２１および再結晶化チャンバー１０２２が存在し、これらは、実質的には、犠牲弁１０１２および再結晶化チャンバー１０１３に関して上記に記載されているように配置されている。沈殿化剤緩衝液溶液は、最も好ましくは、微小流路１０２４を介して沈殿化剤緩衝液リザーバー１０２０に流体的に接続されている流入ポート１０２５を使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これらの構造体において、流入ポート１０２０は、好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施形態などのフルーイディックス充填デバイスに適合する。微小流路１０２４は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０５０８ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．４８４５ｃｍ）。
【０１０３】
犠牲弁１０１２に対して半径方向の遠位には、微小流路１０２６が存在する。これは、それによってチャンバー１００５に流体的に接続されている。微小流路１０２６は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０２５ｃｍ〜約０．０５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．７０６０ｃｍ）。微小流路１０２６は結合カラム１０２７に流体的に接続されており、これはＤＮＡ親和性マトリックスをさらに含む。結合カラム１０２７は、約０．１０ｃｍ〜０．２ｃｍの深さ、約０．３ｃｍ〜約０．６５ｃｍの長さ、約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約５μＬ〜約２０μＬの容量能（深さ：０．１８７５ｃｍ、幅：０．３５１１ｃｍ（底部）、０．０４ｃｍ（上部）、長さ：０．５７２７ｃｍ）を有する。結合カラム１０２７はまた、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さを有し、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さで、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの断面寸法であるマトリックス材用スロット１０２８を含み、そして約５μＬ〜約１５μＬの容量能（深さ：０．２３８３ｃｍ、幅：０．５０８２ｃｍ、長さ：０．０９２１ｃｍ）を有する。これは、組み立てられたときに、フリットによって構造的に支持されたマトリックス材１０２９を含有する。結合材は、ＤＮＡの水和殻が破棄されるカオトロピック性の塩溶液中にＤＮＡが存在するときにＤＮＡと結合するガラス繊維であるＷｈａｔｍａｎガラス繊維フィルター（ＧＦ−Ｆ）からなる。フリット材は、この場合には、柔軟すぎて構造体内において自身を支持することができないガラスフィルターに対して固体の担体支持材を提供する固体の多孔質材料（７０μｍの細孔サイズ）である。結合カラム１０２７はまた、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さを有し、約１．７５ｃｍ〜約３．５ｃｍの長さで、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：３．１９５５ｃｍ）である空気移動流路１０５１と、空気通気孔１０５２とを備えている。これらは、流体を空気移動流路１０５１に流れ込ませることなく流体がそれらを通って流れたときに、空気を結合カラムから追い出すことができるように組み立てられる。
【０１０４】
プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法を有し、かつ約０．１ｃｍ〜約０．２ｃｍの長さ（深さ：０．０５０８ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．２０４１ｃｍ）である微小流路１０３０が、犠牲弁１０３２の縁を規定するポケット１０３１に流体的に接続されている。このポケットは、プラットホーム表面における約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの深さ、約０．０４ｃｍ〜約０．０８ｃｍの長さ、および約０．０６ｃｍ〜約０．１２ｃｍの断面寸法（深さ：０．１０１６ｃｍ、幅：０．１１２１ｃｍ、長さ：０．０７６２ｃｍ）を有する。ポケット１０３１は、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法を有し、かつ約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さであり（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．０８７６ｃｍ）、そして犠牲弁１０１２および１０２１に関して上記に記載されているように組み立てられる犠牲弁流路１０３２によってサンプル回収リザーバー１０５３から分離されている。サンプル回収リザーバー１０５３は、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さ、約０．３ｃｍ〜約０．６ｃｍの長さ、および約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約２０μＬ〜約２５０μＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：０．６１３２ｃｍ、長さ：０．３７４８ｃｍ）を有する。サンプル回収リザーバーは空気移動流路１０５４および空気通気孔１０５５を備えている。空気移動流路１０５４は、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さを有し、約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの長さで、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法である（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．３３１６ｃｍ）。これらの構造体は、流体を空気移動流路１０５４に流れ込ませることなく流体がそれらを通って流れたときに、空気を結合カラムから追い出すことができるように組み立てられる。
【０１０５】
ポケット１０３１から半径方向の内側には、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０２５ｃｍ〜約０．５０ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさ（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．４１９５ｃｍ）を有する微小流路１０３３がつながる。いくつかの実施形態において、微小流路１０３３は、流体による濡れに対して抵抗性を有する疎水性表面を提供するように処理される。この微小流路の区域に沿って、微小流路の方向を半径方向の外側に向け、そして廃棄物リザーバー１０３４に至る屈曲部が存在する。廃棄物リザーバー１０３４は、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの深さ、約０．３ｃｍ〜約０．６ｃｍの長さ、および約２．５ｃｍ〜約５．０ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約３５０μＬ〜約１．５ｍＬの容量能（深さ：０．２７９４ｃｍ、幅：４．４７８３ｃｍ、長さ：０．５６８７ｃｍ）を有する。廃棄物リザーバーは空気移動流路１０３５および空気通気孔１０９９を備えている。空気移動流路１０３５は、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さを有し、かつ約０．５ｃｍ〜約１．０ｃｍの長さで、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法である（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．９２４０ｃｍ）。これらの構造体は、流体を空気移動流路１０３５に流れ込ませることなく流体がそれらを通って流れたときに、空気を結合カラムから追い出すことができるように組み立てられる。
【０１０６】
プラットホームのサンプル調製マイクロ構造体はまた、第１および第２の洗浄リザーバー１０３６および１０４７を含む。第１の洗浄リザーバー１０３６は、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さ、約０．２３ｃｍ〜約０．４６ｃｍの長さ、および約０．７５ｃｍ〜約１．５ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約５０μＬ〜約６００μｍＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：１．３３５７ｃｍ、長さ：０．４６００ｃｍ）を有する。このリザーバーは、微小流路１０３９によって微小流路１０２６に流体的に接続されている。微小流路１０３９は、実質的には犠牲弁１０１２および再結晶化チャンバー１０１３に関して上記に記載されているように配置された犠牲弁１０３７および再結晶化チャンバー１０３８によって遮断されている。犠牲弁１０３７は、約０．０１ｃｍ〜約０．０３ｃｍ、約０．０８ｃｍ〜約０．１２ｃｍの長さ、および約０．０１ｃｍ〜約０．０３ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．１００７ｃｍ）。再結晶化チャンバー１０３８は、約０．１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．２１２６ｃｍ、長さ：０．２３０２ｃｍ）。微小流路１０３９は、約０．０１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．３ｃｍ〜約０．６ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．５９１０ｃｍ）。第１の洗浄液は、最も好ましくは、微小流路１０４１を介して沈殿化剤緩衝液リザーバー１０３６に流体的に接続されている流入ポート１０４０を使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これらの構造体において、流入ポート１０４０は、好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施形態などのフルーイディックス充填デバイスに適合する。微小流路１０４１は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．２５２１ｃｍ）。
【０１０７】
第１の洗浄リザーバー１０４７は、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さ、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ、および約０．７５ｃｍ〜約１．５ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約７５μＬ〜約８５０μｍＬの容量能（深さ：０．２３８８ｃｍ、幅：１．４１８０ｃｍ、長さ：０．５０６５ｃｍ）を有する。このリザーバーは、微小流路１０５０によって微小流路１０２６に流体的に接続されている。微小流路１０５０は、実質的には犠牲弁１０１２および再結晶化チャンバー１０１３に関して上記に記載されているように配置された犠牲弁１０４８および再結晶化チャンバー１０４９によって遮断されている。犠牲弁１０４８は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．１０２３ｃｍ）。再結晶化チャンバー１０４９は、約０．７５ｃｍ〜約１．５ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．２１７９ｃｍ、長さ：０．２４３５ｃｍ）。微小流路１０５０は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．３７２４ｃｍ）。第２の洗浄液は、最も好ましくは、微小流路１０５６を介して沈殿化剤緩衝液リザーバー１０４７に流体的に接続されている流入ポート１０５７を使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これらの構造体において、流入ポート１０５７は、好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施形態などのフルーイディックス充填デバイスに適合する。微小流路１０５６は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．４３４７ｃｍ）。
【０１０８】
溶出緩衝液リザーバー１０４２が、回転の中心から、第１または第２の洗浄リザーバー１０３６および１０４７よりも遠位の半径方向に配置される。溶出緩衝液リザーバー１０４２は、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．４ｃｍ〜約０．８ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約２０μＬ〜約２５０μＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：０．７３０８ｃｍ、長さ：０．２７８７ｃｍ）を有する。このリザーバーは、微小流路１０４４によって微小流路１０２６に流体的に接続されている。微小流路１０４４は、実質的には犠牲弁１０１２および再結晶化チャンバー１０１３に関して上記に記載されているように配置された犠牲弁１０５８および再結晶化チャンバー１０４３によって遮断されている。犠牲弁１０５８は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．１０１２ｃｍ）。再結晶化チャンバー１０４３は、約０．０７５ｃｍ〜約０．１５ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．２１２６ｃｍ、長さ：０．２３０２ｃｍ）。微小流路１０４４は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０２５ｃｍ〜約０．０５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．８５８６ｃｍ）。第２の洗浄液は、最も好ましくは、微小流路１０５６を介して沈殿化剤緩衝液リザーバー１０４７に流体的に接続されている流入ポート１０５７を使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これらの構造体において、流入ポート１０５７は、好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施形態などのフルーイディック充填デバイスに適合する。微小流路１０５６は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約１．０ｃｍ〜約２．０ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：１．６６２３ｃｍ）。
【０１０９】
本明細書中に開示されているようなマイクロフルーイディックス構造体は、好ましくは、別の層であり得るか、または本明細書中に開示されているように別個のプラテンエレメントとして提供され得るヒーター層と熱的に接触して操作される。
【０１１０】
ヒーター層がプラテン自体の別個の層を含むプラットホームの実施形態において、ヒーター層は、リザーバー層をシールし、それによってそのディスクの表面におけるポケットから離れて包まれたチャンバーを形成すること、そして電気リード線およびヒーターのアレイによって局所的な加熱を提供することの両方に役立つ。ヒーター層１１０１およびその構成要素構造体が図１５に例示されている。ヒーター層１１０１は、ヒーター層の表面に配置された、約０．０５ｃｍ〜約０．０７ｃｍの幅（幅：０．０５０８ｃｍ）および約１ｃｍ〜１０ｃｍの長さを有する印刷されたか、またはそれでなければ蒸着された電気リード線１１０４が存在する柔軟なプラスチックシート１１０２（最も好ましくは、ＩＣＩから市販されている、約０．００７６２ｃｍの厚さを有するマイラーシート）からなる。ヒーター１１０８もまた、柔軟なプラスチックシート１１０２に印刷されているか、またはそれでなければ蒸着されており、約０．１ｃｍ〜約１ｃｍの幅（幅：０．６８９１ｃｍ〜０．２０３２ｃｍ）および約０．１ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ（長さ：０．２０３２ｃｍ〜０．２０６７ｃｍ）を有する。電気リード線１１０４は、好ましくは、銀系インクなどの導電性材料から組み立てられ、一方、ヒーター１１０８は、好ましくは、炭素系インクなどの抵抗性材料から組み立てられる（マイラーシート上の印刷体は約１０μｍの厚さを有する）。電気回路は、微量操作装置においてピンアセンブリーによって接続され得るヒーター層の中心近くに配置された、約０．１ｃｍ〜０．２ｃｍの半径（半径：０．１３９７ｃｍ）を有する接点パッド１１０５からなる；これらのピンが接触している場合、装置によって１つの部分が形成され、そしてヒーター層によってもう一方の部分が形成される閉じた電気回路が形成され得る。ヒーター層と装置との間におけるこれらのタイプの電気的接続は、共同所有の米国特許第６．０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行、これは参考として本明細書中に組み込まれる）においてより詳しく開示されている。リード線１１０６は、電流の共通した供給源またはシンクを形成する。リード線１１０７は、ヒーターエレメント１１０８を通ってこの共通リード線から分岐し、次いで様々なパッド１１０５に接続される。高電圧源が個々のヒーターに対応するパッドに加えられ、そして１１０６と結合した接点パッドがアースされた場合、電気電流が、リード線、およびエネルギーを消散して発熱する抵抗エレメントを通って流れる。
【０１１１】
最後に、いくつかの実施形態において、プラットホームはまた、ヒーターをその後に使用して、より効率的に加熱するためにプラットホームを断熱するのに役立つ基層１２０１を含む。基層１２０１の構造は単に、本発明の微量操作デバイスのローターまたは中心軸と一致させるための中心孔１２０２（約１ｃｍ〜１．５ｃｍの半径を有する：半径：１．４３５１ｃｍ）を有する断熱性物質である。
【０１１２】
本発明のＤＮＡ調製プラットホームの使用において、細胞培養物（特に、細菌細胞培養物）がプラットホームに加えられ、そしてプラスミドＤＮＡが、細胞溶解；プラスミドＤＮＡの細菌細胞破片、細胞タンパク質および細胞ゲノムＤＮＡからの分離；緩衝液交換を行い、それによって単離プラスミドＤＮＡのその後の使用と適合しない単離溶液の成分を除くために洗浄される親和性マトリックスにおけるプラスミドＤＮＡの捕捉；プラスミドＤＮＡの溶出および回収によって単離される。
【０１１３】
本発明のプラスミドＤＮＡ調製プラットホームのマイクロフルーイディックス構造体を通過する流体の動きの順序が図１７に例示されている。プラットホームの使用を説明することにおいて、マイクロフルーイディックス構造体、試薬およびサンプルのサイズおよび量が例示的な実施形態ではかっこ内に示されている。
【０１１４】
使用されるプラットホームを準備するために、試薬溶液が下記のように加えられる。下記溶液の量がプラットホームに加えられる：約２５μＬ〜約３００μＬ（５０μＬ）のアルカリ細胞溶解液が、流入ポート１０１９および微小流路１０１８を使用してリザーバー１０１６に充填される；約２０μＬ〜約２５０μＬ（４０μＬ）の溶出緩衝液が、流入ポート１０４６および微小流路１０４５を使用してリザーバー１０４２に充填される；約５０μＬ〜約６００μＬ（１００μＬ）の第１の洗浄液が、流入ポート１０４０および微小流路１０４１を使用してリザーバー１０３６に充填される；約７５μＬ〜約８５０μＬ（１５０μＬ）の第２の洗浄液が、流入ポート１０５７および微小流路１０５６を使用してリザーバー１０４７に充填される；そして約３５μＬ〜約４００μＬ（７０μＬ）の沈殿化溶液が、流入ポート１０２５および微小流路１０２４を使用してリザーバー１０２０に充填される。
【０１１５】
その後、サンプルが、細菌培養物の約２５μＬ〜約３００μＬ（５０μＬ）の量で、流入ポート１０１５および流路１０１４を介してチャンバー１００５に加えられる。
【０１１６】
その後、プラットホームが、本明細書中に記載されているようにヒーターを作動させるために、微量操作デバイスの中に置かれ、好ましくは、本明細書中および共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行、これは参考として組み込まれる）に記載されているようにスリップリングを含むローターに置かれる。ヒーター層を伴う実施形態において、スリップリングアセンブリーのピンはヒーター層のパッド１１０５と接触させられる。これらの実施形態において、アライメント用の溝１００３は、図１５に示されているように、ディスクに対するスリップリングアセンブリーの向きを設定するために役立つ。ヒーター層が、スリップリングのピンによってヒーター層のピンマークがそろうような方法でフルーイディックス層とともにアラインメントされる。
【０１１７】
その後、ディスクは、リザーバー１０１６から微小流路１０１７を通ってチャンバー１００５内に至るアルカリ細胞溶解液の流体の流れが駆動されるのに十分な約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍの第１の回転速度に加速される。その後、プラットホームは、急激な正および負（すなわち、前方向および後方向）の角加速度に供され、それにより、混合を行うためにその角速度を増減させることによって攪拌される。混合用バッフル１００６は、図に例示されているように、流体の大部分に対して折り返される長い部分に流体を引き入れることによって流体を「薄層化」する流体内の円運動を生じさせるのに役立つ。流体は繰り返し薄層化されるので均質化される。微細加工されない大きな容量およびシステムの場合、十分な角加速度により、チャンバー１００５内の流れもまた、混合を助ける乱流になる。
【０１１８】
均質な混合を達成するために十分な時間（これは、サンプル量およびチャンバー１００５のサイズに依存しており、従って経験的に決定される）の後、サンプル内の細菌は溶解を受け、ＤＮＡが溶液中に放出される。その後、ディスクの回転速度は約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍ（？？？）の第２の回転速度で維持され、そして毛管１０２１内のワックス弁が、この弁と熱的に接触している対応するヒーターパッドに電圧を加えることによって融解される。熱は、ワックスを融解し、そして流れる流体が融解したワックスを毛管から再結晶化チャンバー１０２２内に移動させるのに十分な時間にわたって加えられる。角速度は、沈殿化溶液のすべてが混合チャンバー内に移動させられるまで維持される。
【０１１９】
その後、ディスクは、混合のために、上記に記載されているように再度攪拌される。沈殿化溶液の作用は、均質な溶解混合物のゲノムＤＮＡ、タンパク質および細胞破片成分を沈殿させることである。この沈殿化は、フィルター１００９によって捕捉され得る凝集物を生じさせる。これは、上記および本文の組み立ての部分に記載されているように、Ｐｏｒｅｘフリット材Ｘ−４５８８（７０μｍの細孔サイズ）およびＷｈａｔｍａｎろ紙＃５４から構成される。
【０１２０】
十分な混合の後、ディスクの回転速度は約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍの第３の回転速度で維持され、その後、毛管１０１２内のワックス弁が、この弁と熱的に接触している対応するヒーターパッドに電圧を加えることによって融解される。熱は、ワックスを融解し、そして流れる流体が融解したワックスを毛管から再結晶化チャンバー１０１３内に移動させるのに十分な時間にわたって加えられる。角速度は、流体のすべてが混合チャンバーから毛管１０１０、１０１２および１０２６を通って結合カラム１０２７内に移動させられるまで維持される。細胞破片および望まれない沈殿物はフィルター１００９上に捕捉される。
【０１２１】
プラットホームは、流体が向心加速度によって結合マトリックスを通って移動させられるのでこの角速度で回転させられる。微小毛管１０３２は犠牲弁によって阻止されているので、流体は、流路の表面処理の疎水性に打ち勝つ向心力によって誘導される圧力によって微小流路１０３３内に移動させられる。その後、流体は廃棄物チャンバー１０３４に送達される。
【０１２２】
プラットホームの回転は、典型的には多孔質材料である結合チャンバー１０２７内のマトリックス１０２８をすべての流体が通過するまで維持される。廃棄物チャンバー１０３４に流体的に接続されている微小流路１０３３の端はプラットホームの回転軸からチャンバーの反対側の端よりも遠位にあるので、結合チャンバー１０２７、微小流路１０３０およびポケット１０３１からサイフォン吸上げ作用によってすべての流体を引き寄せることができる。これは、様々な工程の工程間の汚染または逆流を減らす利点を有する。
【０１２３】
流体のすべてがマトリックス１０２８を通って移動させられると、プラスミドＤＮＡはそれに結合する。典型的には、これらのマトリックス材は、ＤＮＡの負電荷を引き寄せる正の電荷を示す。ＤＮＡとマトリックスとの電荷の違いを利用する、ディスク上に提供されている親和性マトリックスには、いくつかの異なるタイプが存在する。けいそう土、精製シリカ樹脂、ＤＥＡＥならびにガラス繊維フィルターを含むイオン交換樹脂ならびにシリカおよびガラス繊維はともに、電荷の違いを使用してＤＮＡと結合する能力をディスク上において明らかにするために使用されている。その後、プラットホームは約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍの第４の回転速度で回転させられ、同時に、熱が毛管１０３７内のワックス弁に加えられ、第１の洗浄液が、結合カラム１０２７に流体的に接続されている微小流路１０３９、次いで微小流路１０２６を通って放出される。この流体は、前記に記載されているように、結合マトリックスを通って廃棄物チャンバー内に移動させられる。この洗浄は、マトリックス材内に捕捉されている溶解液および沈殿化溶液の成分を除くことを目的としている。
【０１２４】
その後、リザーバー１０４７内に含有されている第２の洗浄液が、その犠牲弁１０４８の融解によって放出され、流体は微小流路１０５０および１０２６を通って結合チャンバー１０２７内に流れ、結合チャンバー１０２７を洗浄して、マトリックス１０２８を通って廃棄物チャンバー１０３４に至る。
【０１２５】
これらの処理の後、マトリックスに結合しているプラスミドＤＮＡは、サンプル調製工程において使用された他の流体および材料を微量含有するだけである。その後、プラットホームは約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍの第５の回転速度で回転させられ、そして毛管１０３２内の犠牲弁が、熱を加えることによって開けられ、結合チャンバー１０２７内のマトリックス１０２８とサンプル回収リザーバー１０５３との流体接続が開けられる。熱は、毛管１０５８内の犠牲弁にも加えられる。溶出緩衝液は、微小流路１０４４および１０２６ならびに結合カラム１０２７を通って、最も詳細には、マトリックス１０２８を通って移動させられる。微小流路１０３２は開いているので、流体は優先的にサンプル回収リザーバー１０５３内に流れる。これらの条件のもとにおいて、微小流路１０３３のトポグラフィー、その疎水性コーティング、またはその両方は、好都合なことに、流体が廃棄物リザーバー１０３４に流れることを妨げる。疎水性コーティングもまた、好都合なことに、微小流路１０３３を通ってサンプル回収チャンバー１０５３内への廃棄溶液の逆流を妨げる。
【０１２６】
その後、プラットホームは停止させられ、そして単離されたプラスミドＤＮＡを含有する流体サンプルがポート１０５５および微小流路１０５４を介して回収される。
【０１２７】
サンプル調製およびインビトロ増幅の一体化プラットホーム
本発明はまた、ＤＮＡサンプル調製、インビトロ増幅および生成物の回収または分析を含む一体化された１組の生化学的反応を行うことができるマイクロフルーイディックス構造体を有するプラットホームを提供する。本発明のこの局面は、本明細書中では１つのマイクロフルーイディックス構造体について記載される。しかし、多数のこれらのマイクロフルーイディックス構造体を含むプラットホームが提供され、本発明によって包含される。この場合、本明細書中に記載されている多数のマイクロフルーイディックス構造体がプラットホーム上に提供されている。
【０１２８】
次に、本発明をより詳しく説明するために図面を参照すると、図１は、多数のインビトロ増幅反応を行うためのディスクの一例の分解図を示している。このプラットホームの例示された実施形態は、６つの個々のサンプルについて６つの独立したサンプル調製およびＰＣＲ操作を行うことができる。より多くのサンプル数、ならびにサンプルの分割および／または組合せに対してプラットホームの能力が拡大される本発明の別の実施形態は容易であり、下記に議論されている。ここに示されたディスクにより、一般的な形態の９６個のアッセイが行われる：第１の流体Ａが第２の流体Ｂと混合され、
このディスクは、マイクロフルーイディックス構造体を所定の半径でディスクの周りに繰り返すことによって、そして異なる半径位置のところに設置するために構造体を改変することによって、同一のアッセイが行われ得ることを例示する。このようにして、アッセイを行うためのマイクロフルーイディックス構造体でディスクの表面を完全に覆うことが可能である。行うことができるアッセイの最大数は、再現性よく操作され得る流体の容量、すなわち、ディスクが製造され得る最小の再現可能な大きさに依存し、そして小容量の流体を、都合のよい回転速度で微小流路を通って移動させるために必要とされる流体力学的圧力の量に依存する。これらの事項を考慮に入れると、６ｃｍの半径を有する円形プラットホームにおいて、１ｎＬ〜５ｎＬの容量を有する１０，０００を越えるアッセイが行われ得ることが見積もられる。
【０１２９】
図１において、ディスク１００は、マイクロフルーイディックスディスク２０１、シール層３０１、および１つまたは２つ以上の熱シール層４０１の少なくとも３つの構成要素を含む。いくつかの実施形態において、マイクロフルーイディックスディスク２０１はさらに、少なくとも２つの構成要素層の組合せとして提供される。この場合、リザーバー層５０１がマイクロフルーイディックス層６０１に結合している。これらの実施形態において、リザーバー層の底面は、下記に記載されているマイクロフルーイディックスディスクと一致している場合、閉じた流路およびリザーバーの完全なネットワークを形成し、これを介して、流体が、中心軸の周りにおけるプラットホームの回転によって生じる向心力の推進力のもとで流れる。すべての実施形態において、流体の流れは、アッセイにおける様々な成分流体の混合、ならびにサンプルリザーバーおよび試薬リザーバーから混合用構造体を通ってアッセイ回収チャンバー内への流体の移動を可能にする。さらに、流体の流れが、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行、これは参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されている構造体を使用して、インキュベーション工程および洗浄工程を含むように達成され得る。約１ｎＬ／ｓ〜約１０００μＬ／ｓの流体流速が約４ｒｐｍ〜約３０，０００ｒｐｍの回転速度で達成される。好ましくは、「受動」的な弁または毛管弁が、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されているようにプラットホーム内における流体の流れを制御するために使用される。本発明のプラットホームの操作において、回転によって誘導される静水圧と、小さな流路およびオリフィスにおいて及ぼされる毛管圧との競合が、回転に依存したゲート操作システムまたは弁操作システムを提供するために利用される。流体がプラットホームの外縁に向かって配置された検出チャンバー内に入った後、シグナル（最も好ましくは、光学的シグナル）が検出される。
【０１３０】
プラットホーム１００は、好ましくは、ディスクの形状で提供され、約１０ｍｍ〜約５０ｍｍの直径および約０．１ｍｍ〜約２５ｍｍの厚さを有する円形の平面状プラットホームである。マイクロフルーイディックスディスク２０１の構造を図２に示す。図２には、「底」面が、本発明のプラットホームのこの実施形態をより明瞭に例示するために示されている。
【０１３１】
マイクロフルーイディックスディスク２０１は、好ましくは、ディスクの形状で提供され、約１０ｍｍ〜約５０ｍｍの直径および約０．１ｍｍ〜約２５ｍｍの厚さを有する円形の平面状プラットホームである。このディスクは、好ましくは、約１ｍｍ〜約２０ｍｍの直径を有する中心軸に固定するための中心孔２０２を含む。中心孔２０２は、中心軸に対する接続のために押出し成形された取り付け部品によって置き換えることができ、あるいは完全に存在しなくてもよく、そのような場合、中心軸に対する位置決めおよび接続は、プラットホーム表面の別の部分を使用して達成される。マイクロフルーイディックスディスク２０１はまた、プラットホームが中心軸に載せられたときに、プラットホーム上方の固定用取り付け具が、プラットホームの上部表面と接触することなくプラットホームの上部表面の近くに置かれることを可能にする溝２０３などの位置決め構造体を含むことができる。この特徴を有する実施形態において、ディスクが低ｒｐｍで回転すると、固定用取り付け具におけるピン（好ましくは、スプリング付きピン）が溝内を滑り、固定用取り付け具を捕まえる。従って、これにより、プラットホームの向きがそれに関して決定される。別の実施形態において、プラットホームは、「ホームフラッグ」２０４、すなわち、プラットホームの表面に配置されて、ディスクが回転したときに発光体／フォトダイオードの対によって検知することができ、従って、装置に関してディスクの向きを決定することを可能にする反射縞または吸収縞を含む。
【０１３２】
図３には、ディスクの中心が図の上方にあるマイクロフルーイディックスディスクの断面の分解図が例示されている。リザーバー２０４、２０５および２０６は、それぞれ、流体サンプル、細胞アルカリ溶解液および中和緩衝液を含有するように設計されている。リザーバー２０４および２０５は、ディスク上におけるそれらの半径位置および範囲が同一であるように設計され、そしてリザーバー内に置かれる流体の所望する比に等しい比を形成する断面積（すなわち、プラットホーム内の深さｘ横方向の大きさ）を有する。それぞれのリザーバーは、ディスクの中心に近い位置においてリザーバー内に設置された充填孔（それぞれ、２０７、２０８および２０９）を有する。それぞれのリザーバーは、約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍの幅、約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍの長さ、および約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍの厚さの大きさを有し、そして約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有する。充填孔２０７、２０８および２０９は、好ましくは、マイクロピペッターなどの自動化された充填デバイス、例えば、１．５ｍｍのチップ直径を有する標準的な２００μＬのプラスチック製ピペットチップ；直径１ｍｍのマイクロピペッターチップ；圧電的またはセラミックスの液滴送達システム（ＩＶＥＫ Ｃｏｒｐ．（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶＴ）によって販売されているものなど）；インクジェット型流体送達システムに適合した大きさを有する。圧電的送達またはインクジェット送達などの非接触的な送達システムの場合、ポートの大きさは、液滴のサイズより数倍大きくなければならない（例えば、１ｎＬの液滴の場合には０．２ｍｍ）。
【０１３３】
リザーバー２０４の反対側の端は、プラットホーム表面における深さがリザーバーとは異なる深さで好ましくは組み立てられる微小流路２１０に流体的に接続されている。この微小流路は、プラットホーム表面における深さが微小流路２１０とは異なる深さで好ましくは組み立てられる毛管２１１において終了する。毛管２１１は、ディスクの中心に対してリザーバーの内端よりも近位に位置する空気通気孔２１２において終了する。リザーバー２０５は、回転軸に対して遠位にあるリザーバー内の位置において微小流路２１３に流体的に接続されている。微小流路２１３もまた、微小流路２１０について記載されているように、毛管２１１において終了する。微小流路２１０および２１３の組み立てならびに毛管２１１に対するこれらの微小流路の接続は、リザーバー２０４および２０５からの流体の流れによって空気を追い出することができるが、毛管２１１の断面積は、小さすぎて、液状の流体がそれらを通って流れることができないように組み立てられる。リザーバー２０６は、毛管接合２１５において終了する微小流路２１４に流体的に接続されている。
【０１３４】
微小流路２１０および２１３は、混合用微小流路２１６に流体的に接続され、（サンプルを含有するために本明細書中では例示される）リザーバー２０４の内容物と（アルカリ細胞溶解液を含有するために本明細書中では例示される）リザーバー２０５の内容物との混合を可能にする。混合用微小流路は、混合物が微小流路の長さ方向の範囲を横切るときに種々の溶液の混合をもたらすように構成される。混合の程度は、流体の流速および混合用微小流路の長さ方向の範囲に依存し、２つの流体が接触して一緒に混合される時間の量に比例する。混合の程度はまた、混合用微小流路の横方向の広がりに依存し、そして混合される流体の拡散定数にさらに依存する。有用な範囲の粘度を有する流体を混合するために十分な長さを有する混合用微小流路を収容するために、混合用微小流路は、示されているように提供される。混合は、回転方向に対して直交するが、回転軸に対してより近位の位置から回転軸に対してより遠位の位置にまでプラットホーム表面上の半径方向に広がるプラット表面上の経路を横切るように数回曲げるために微小流路を構成することによって促進させられる。混合用微小流路２１６は約１ｍｍ〜約１００ｍｍの長さを有する。その長さは、いくつかの場合には曲げを使用することによって達成される。
【０１３５】
デバイス内の混合は拡散によって促進させられる。２つの小容量ＡおよびＢが１つの容器に加えられたとき、ＡからＢへの拡散および／またはＢからＡへの拡散は混合をもたらす。この混合に必要とされる時間の量は、混合が所望される溶液内の分子の拡散定数、および分子が拡散しなければならない距離に依存する。例えば、拡散定数Ｄを有する分子を含む０．５マイクロリットルの溶液Ａを、１辺が１ｍｍのリザーバーに加える。その拡散定数もまたＤである分子を含む溶液Ｂを加える。これらの溶液は、最初、それらを仕切る境界を有する容量を占める。流体が非常に混和しやすい場合でさえ、完全に均質な溶液を生じさせるための拡散時間はほぼ、ｔ＝２ｘ２／Ｄである。ｘ＝０．０５ｃｍ（０．５ｍｍ）およびＤ＝１０−５ｃｍ２／ｓの場合、混合時間は５００秒であり、これは、大部分の反応に関して受け入れられないほど長い時間である。この混合時間は、例えば、機械的な攪拌によって短くすることができるが、攪拌は、小さな構造体内に制限された流体において得ることは困難である。これは、流体の流れが層状であり、そして混合を促進することが知られている乱流的な渦を含有しないからである。流体Ａを１ｍｍ３の容器に入れ、次いで溶液Ｂを入れる代わりに、流体ＡおよびＢが、横方向の大きさがｄである長くて薄い毛管に並んで入れられた場合、混合に関連する時間ははるかに短くなる。例えば、ｄが１００ミクロンである場合、混合時間ｔは２０秒である。デバイスの混合用流路は、流体流ＡおよびＢを毛管微小流路内に同時に注入することによって長い毛管内への流体の導入をまねる。これらの流体は、最初に、流路を並んで下方向に流れる。プラットホームの回転によって生じる遠心力により流体が微小流路を通って押し出されると、拡散が流体間で生じる。十分に狭い直径で、十分な長さの毛管、および十分に小さい送液速度を選ぶことによって、送液時に流路内に存在するＡおよびＢの総容量のＡおよびＢの一部を混合させることができる。
【０１３６】
これらの選択は、流体が流路を横切るために必要な時間の量に等しい、混合に必要な時間を設定することによって決定され得る。拡散に必要な時間は、
【数１】
である（式中、ωは流路の横方向のサイズである）。流路を横切るために必要な時間の量は単に、流体の速度で除算された流路の長さである。この場合、速度は、共同所有で同時係属中の米国特許出願第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）およびＤｕｆｆｙ他（１９９９、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１：４６６９〜４６７８）に記載されているように計算される：
【数２】
式中、流体の性質は密度ρおよび粘度ηであり、ΔＲおよび＜Ｒ＞は、向心加速度にさらされている流体の半径に沿った広がりおよび平均半径位置であり、ｌおよびｄＨは流路の長さおよび水力直径である。ｔｔがｔｍに少なくとも等しいか、またはそれよりも大きくなるように変数を選ぶことによって、微小流路内の混合が保証される。
【０１３７】
混合用微小流路は、回転軸に対して遠位にあるその端においてリザーバー２１７に流体的に接続されている。リザーバー２１７は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有し、そして回転軸に対して近位にあるリザーバーの端に空気移動毛管２２０および空気通気孔２２１を備えている。これにより、流体が混合用微小流路２１６を通って流れ、リザーバー２１７に送達されるときに、空気をリザーバーから追い出すことができる。
【０１３８】
混合用微小流路は、回転軸に対して遠位にあるその端においてリザーバー２１７に流体的に接続されている。リザーバー２１７は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有し、そして回転軸に対して近位にあるリザーバーの端に空気移動毛管２２０および空気通気孔２２１を備えている。これにより、流体が混合用微小流路２１６を通って流れ、リザーバー２１７に送達されるときに、空気をリザーバーから追い出することができる。
【０１３９】
毛管接合２１５は、微小流路２１８流体的に接続されている。図３に例示されているように、この微小流路は、リザーバー２０４および２０５からリザーバー２１７への流体の送達、そしてリザーバー２０７からリザーバー２１９への流体の送達が同時かつ調和して達成されることを最も容易に可能にするために、混合用微小流路２１６と同じ長さおよび直径を有するように構成されることが好ましい。代わりの実施形態において、混合が微小流路２１８において生じないので、混合用微小流路２１６とは異なる長さを有する微小流路２１８が提供される。別の代わりの実施形態において、流体がリザーバー２１９に直接充填される。リザーバー２１９は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが０．０５ｍｍ〜約５ｍｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有し、そして回転軸に対して近位にあるリザーバーの端に空気移動毛管２２０および空気通気孔２２１を備えている。これにより、流体が混合用微小流路２１８を通って流れ、リザーバー２１９に送達されるときに、空気をリザーバーから追い出すことができる。リザーバー２１７および２１９は、ディスクにおけるそれらの半径位置が同一であるように設計され、リザーバー内に置かれる流体の所望する比に等しい比を形成する断面積（すなわち、プラットホーム内の深さｘ横方向の大きさ）を有する。
【０１４０】
リザーバー２１７は、約０．１５ｃｍ〜約０．３０ｃｍの長さ（長さ：０．２５５２ｃｍ）を有する微小流路２２２に流体的に接続されており、毛管接合２２３において終了する。毛管接合の反対側には、約０．０１５ｃｍ〜約０．０３０ｃｍの長さ（長さ：０．０２１８ｃｍ）を有し、かつ空気移動毛管２２５において終了する微小流路２２４が存在する。空気移動毛管２２５は、毛管２２７によって拡大容量２２８に接続されている；あるいは、いくつかの実施形態では、拡大容量２２８は空気通気孔２２８によって置き換えられる。微小流路２２２および２２４の組み立てならびに毛管２２７に対するこれらの微小流路の接続は、リザーバー２１７および２１９からの流体の流れによって空気を追い出すことができるが、毛管２２７の断面積は、小さすぎて、液状の流体がそれらを通って流れることができないように組み立てられる。これらの構造体は、図４においてより詳しく例示されている。
【０１４１】
リザーバー２１９は、約０．２０ｃｍ〜約０．４０ｃｍの長さ（長さ：０．３２０５ｃｍ）を有する微小流路２２６に流体的に接続されており、空気移動毛管２２５において終了し、それとの毛管接合を形成している。微小流路２２６の深さおよび幅は、毛管２２５につながる場合、好ましくは、微小流路２２２および２２４の深さおよび幅とは異なる。
【０１４２】
微小流路２２４および２２６は、リザーバー２１７および２１９からの流体の混合を確実にするために混合用微小流路２１６と同様に設計されている混合用微小流路２２９に流体的に接続されている。混合用微小流路２２９は、約１ｍｍ〜約１００ｍｍの長さ（その長さは、いくつかの場合には曲げを使用することによって達成される）を有し、そして空気通気孔２３１をも含有するリザーバー２３０において終了する。リザーバー２３０は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが０．０５ｍｍ〜約５ｍｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有する。リザーバー２３０は微小流路２３２に流体的に接続されており、これは、半径方向の内側の方向でプラットホーム表面に配置され、かつ空気移動毛管２３３において終了する。微小流路２３２と毛管２３３との間の接合２９９は、下記においてより詳しく記載されているように、毛管停止（ｐｉｎｎｉｎｇ）（弁調節）作用を実質的に阻害するために、滑らかに広がる拡大部を伴って設計されている。この接合２９９は混合用微小流路２３４に流体的に接続されており、その半径方向の内側端は拡大容量２３５内において終了する。リザーバー２３６は、回転軸からリザーバー２３０と同じ半径距離のところに配置されている。リザーバー２３６は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが０．０５ｍｍ〜約５ｍｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有する。好ましい実施形態において、回転軸から半径方向のより遠位にあるリザーバー２３６の部分２３７は、回転軸に対して半径方向のより近位にある部分２３８のプラットホーム表面内の深さより浅いプラットホーム表面内の深さを有する。リザーバー２３６もまた充填ポートとして役立つ空気通気孔２３９を含む。
【０１４３】
約０．１５ｃｍ〜０．３ｃｍの長さ（長さ：０．２５ｃｍ）および約０．００１ｃｍ〜約０．０２ｃｍの断面積の大きさを有する微小流路２４０は、空気移動毛管２３３を伴うリザーバー２３６に毛管接合２９８において流体的に接続されている。毛管接合２９９とは対照的に、この微小流路の結合は、「停止（ｐｉｎｎｉｎｇ）」作用をもたらすように設計されている。すなわち、接合により、流体の流れが阻害される。微小流路２４０は、逆行方向（すなわち、回転軸に向かって逆向き）にフレア状の開口部が続く制限部２９７を含有するように設計されており、毛管２３３に接続される。毛管接合の代わりの実施形態は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）および共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／９１０，７２６（１９９７年８月１２日出願）（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）においてより詳しく開示されている通りである。
【０１４４】
約１ｍｍ〜約１００ｍｍの長さを有する混合用微小流路２３４は、その長さはいくつかの場合には曲げを使用することによって達成されることが最も好ましく、熱サイクル処理用チャンバー２４１において終了する。熱サイクル処理用チャンバー２４１のプラットホーム表面内の深さは、より詳しくは下記に開示されているように、サイクル処理の熱的条件によって決定される。図３に示されているように、熱サイクル処理用チャンバー２４１の回転軸に近い方の部分が、空気通気孔２４３において終了する空気流路２４２に接続されている。このチャンバーはまた、熱サイクル処理用チャンバー２４１の直径よりも大きな直径を有する凹部である断熱用空気ポケット２４５をディスク２０１の反対側の面に含む。
【０１４５】
図５には、熱サイクル処理用チャンバーの領域における組み立てられたディスクが断面で例示されている。外向きの半径方向が矢印によって示されている。熱サイクル処理用チャンバー２４１は、示されているように、ディスク２０１の面における凹部であり、流路２３４が回転軸から半径方向の遠位の位置において進入する。シール層３０１が、熱サイクル処理用チャンバー２４１を覆うために、下記に示されているように提供される。断熱用空気ポケット２４５が、シール層３０１によって覆われてプラットホーム２０１の表面に示されている。
【０１４６】
本発明の微量システムプラットホームは、インビトロ増幅反応を行うために、最も好ましくは、ＤＮＡ単離、増幅（最も好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する増幅）、およびディスク上での検出またはディスク以外での検出（例えば、従来のゲル電気泳動を使用する検出）を行うための増幅フラグメントの単離を含む一体化された１組の生化学的反応を行うために提供される。
【０１４７】
本発明のプラットホームのこの使用が図１〜図５に示されている；この使用は本開示および実施例から当業者によって理解されるが、プラットホームの機能は下記に明示的に記載される。
【０１４８】
本発明のプラットホームは、最も好ましくは、細菌細胞または真核生物細胞を含有する未処理の生物学的流体または予め最大に希釈された生物学的流体、あるいは細菌培養物または真核生物（最も好ましくは哺乳動物細胞）培養物のサンプル、あるいは哺乳動物細胞を含む血液などの生物学的流体を受け入れ、そして細胞からのＤＮＡ放出および増幅（最も好ましくは、ＰＣＲによる増幅）の工程によってこれらの流体を処理する。
【０１４９】
流体サンプルが流入ポート２０７を介してリザーバー２０４に加えられ、アルカリ細胞溶解液（一例において、ＮａＯＨ）が流入ポート２０８を介してリザーバー２０５に加えられ、調整用または中和用の緩衝液溶液（一例において、ＴｒｉｓＨＣｌ）が流入ポート２０９を介してリザーバー２０６に加えられる。濃度が約２００μＭである各デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、１ユニット〜１０ユニットのポリメラーゼ（最も好ましくは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼ）、ならびにサンプル中の標的ＤＮＡの量および酵素に適切な緩衝液および塩（特に、ＭｇＣｌ２）（塩化マグネシウムの量は、典型的には、この塩の濃度に対する増幅反応の感度のために経験的に決定される）のバランスの取れた混合物を含む増幅溶液が、流入ポート２３９を介してリザーバー２３７に加えられる。これは図９ａに示されている。その後、プラットホームは、本明細書中に、そしてより詳しくは共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号ならびに共同所有で同時係属中の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；および同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）（これらは参考として組み込まれる）に記載されている微量操作デバイスに載せられる。プラットホームは、ディスク上のマイクロフルーイディックス構造体の設置および大きさによって決定される様式でディスク上における流体の流れを駆動させるために回転させられる。例示的な回転プロフィルが図８に示されている。示されているように、プラットホームは、最初に、角加速度α１で、（図８において４００ｒｐｍよりもわずかに大きな）初期回転速度ω１にまで緩やかに加速される。回転は、サンプルおよびアルカリ細胞溶解液が微小流路２１０および２１３に進入し、その後、それらが、微小流路２１１を伴う毛管接合において停止させられる（本明細書中において使用されているように「止められる」）まで流れることを可能にするのに十分な時間（図８において約１０秒間）にわたって維持される。同様に、リザーバー２０６内の流体は、毛管接合２１５において止められるまで微小流路２１４内に流れる。その後、ディスクは角加速度α２で速度ω２（図８において約１８００ｒｐｍ）にまで急速に加速され、これは（図８に示されているように）所定の期間にわたって維持され得る。この速度での回転によって誘導される圧力により、微小流路２１１において止められている一方または両方の流体は、微小流路の狭いすき間を越えて、もう一方の流体と接触させられるか、またはもう一方の流体を「濡らす」；これにより、このときに接触している流体を回転速度ω３（図８において約５００ｒｐｍ）の推進力のもとで混合用微小流路２１６内に排出させることができる。
【０１５０】
図３に示されているように、微小流路２１０は、微小流路２１３よりも大きな断面積を有しており、結果として、この微小流路よりも小さな毛管圧を支える。その結果、サンプル流体は、最初に微小流路２１１にまたがるすき間を埋める。
【０１５１】
同時に、流体をリザーバー２０４および２０５から混合用リザーバー２１６内へ駆動させる速度の増大はまた、毛管接合２１５に打ち勝ち、それによって、リザーバー２０６から混合用リザーバー２１６内への流体の流れが駆動される。
【０１５２】
リザーバー２０４、２０５および２０６からの流体の流れを妨げる毛管接合を乗り越えると、回転速度は、加速度α３で速度ω３（図３において約５００ｒｐｍ）にまで減らされる；好ましい実施形態において、加速率α３は、実質的には加速率α２に等しい（しかし、この場合は減速であるので、逆の符号を有する）；これは図に示されている。このより低い速度において、混合用微小流路２１６内への流れを駆動させる全体的な圧力が低下する。混合用微小流路２１６は狭くて長いために、混合用微小流路２１６は、流れに対してかなりの水力抵抗を示す。この低速度において、リザーバー２０４と２０５における流体間の圧力差（例えば、これは、例えば、異なる容量を有するこれらのリザーバーによって引き起こされ得る）は、流体が混合用微小流路２１６内に流れるときに「釣り合う」。例えば、リザーバー２０４からの流体が、リザーバー２０５からの流体が流れるよりも早く最初に流れる場合、リザーバー２０４における半径方向の流体の広がりは、大部分の時間でリザーバー２０５における広がりよりも少なくなる；従って、微小流路２１１において及ぼされる圧力は、リザーバー２０５内の流体によって及ぼされる圧力よりも低くなり、その結果、リザーバー２０５内の流体の流速はリザーバー２０４内の流体の流速に対して増大し、半径方向における流体の広がりたは水頭の「均衡」がもたらされる。その結果、流体は、これらのリザーバーの断面積比に等しい厳密な比率で進入する。流体によって追い出される空気は、流路２２０を通って空気通気孔２２１に逃される。図９ｂには、回転速度ω３におけるある時刻での状況が例示されている。
【０１５３】
リザーバー２０６から混合用微小流路２１９を通る並行した流体の流れが、回転速度ω３において達成される。通常の場合、混合が実際には生じないので、微小流路２１８の形状は、それを通って押し出される流体が大きすぎる回転速度でチャンバー２１９を満たさない限り（すなわち、速度がω３に低下しないうちは）重要ではない。
【０１５４】
回転速度ω３における回転は、リザーバー２０４、２０５および２０６からリザーバー２１７および２１９への流体の流れを駆動させる。リザーバー２０４および２０５からの流体の混合比における変化を防止することに加えて、それよりも低い速度は、リザーバー２１７および２１９の外側端において及ぼされる圧力が、流体を保持するように設計された毛管接合を流体が通り抜けられないほど十分に低いことを意味する。
【０１５５】
十分な時間が、リザーバー２０４、２０５および２０６からリザーバー２１７および２１９への流体の流れを押し出すために過ぎた場合、回転速度は、さらに加速度α４でω４に減らされる。これは、図８には、４００ｒｐｍよりもわずかに小さいことが示されている。ディスク上における流体のこの配置が図９ｃに示されている。その後、熱が、サンプルおよびアルカリ細胞溶解緩衝液の混合物を含有するリザーバー２１７に加えられる。８５℃〜９５℃の間で行われるこの加熱工程は６０秒間〜１２０秒間にわたって加えられ、これは、細菌の細胞壁または哺乳動物細胞の原形質膜を破壊するには十分であり、それによって、ＤＮＡが溶液中に放出される。アルカリ細胞溶解液もまた、ポリメラーゼ酵素の活性を妨害し得る、血液サンプルに見出されるヘモグロブリンなどのタンパク質を変性させる作用を有する。
【０１５６】
その後、速度は、図８に示されているようにα５でω５（約８００ｒｐｍ）にまで急速に上げられ、これにより、毛管接合２２３および２２６において保持されている流体は、毛管圧を乗り越えたときに接触する。２２３の断面積が２２６の断面積よりも大きく、溶解物が最初に流れることを保証するマイクロフルーイディックス構造体が提供される。これらの流体は、接触した状態で、上記に記載されているように混合用微小流路２２９内に流れ、混合される；速度は、溶解物流体および中和液の制御された混合のために加速度α６でω６（図８において約５００ｒｐｍ）に減らされる。図９ｄには、リザーバー２３０内への流体混合物の動きが例示されている。図９ｅには、流体が押し出された後の流体の配置が例示されている。
【０１５７】
細胞溶解物および中和緩衝液の混合物がリザーバー２３０内に移されたとき、プラットホームの速度はα７で速度ω７（図８において約１２００ｒｐｍ）に上げられる。この加速は、典型的には、他の加速と比較して穏やかである（これは、図８に示されている加速度プロフィルのより小さい傾きによって示される）；これは、チャンバー２３０および２３７ならびに毛管接合２３３および２４０の設計は、図９ｆに示されているように非常に小さい「圧力水頭」を示すからである。遠心力による毛管接合における圧力は、次式によって表される：
【数３】
式中、ρは流体の密度であり、ωは角速度＝２πｘ速度（ｒｐｍ）ｘ６０であり、＜Ｒ＞は流体の回転中心に対する平均位置であり、ΔＲは毛管接合の半径位置の内向き半径方向における流体の広がりである。幾何形状は、例えば、リザーバーの底部から半径方向の外向きに出る流路に対してΔＲが小さくなるように設計されているので、与えられた回転速度における圧力は、かなり低くすることができる。これは、リザーバー２３６におけるＰＣＲ反応混合物を、微小流路２３３を有する毛管接合を越えて非常に大きく移動させるために、そして速度プロフィルにおける早い段階の急激な加速および減速の途中でさえも流体を保持することを可能にするのに必要とされる回転速度を作るという利点を有する。これに対して、微小流路２３３内への微小流路２３２の出口は、前進するメニスカスの停止を防止するために、フレア状に開いており、少なくとも１つの滑らかな縁を提供する。その結果、流体は保持されず、微小流路２３３内に移動して、保持されたＰＣＲ反応混合物を濡らす。回転速度が徐々に上げられると、流体は混合用微小流路２３４内に押し出される。図９ｇに示されているように、リザーバー２３０および２３６内の流体位置に対する微小流路２３３および微小流路２４０の接合の形状により、流体は、部分的にはサイフォン吸上げ作用によって混合用微小流路２３４内に引き入れられる。中和された細胞溶解物およびＰＣＲ反応混合物は、拡散によって混合を生じさせるのに十分な時間にわたって混合用微小流路２３４において接触している；図８に示されているように、この混合は、比較的大きな速度（約１２００ｒｐｍ）で行われる。
【０１５８】
図９ｈには、ディスクの最終的なマイクロフルーイディックス状態が例示されている。すべての流体が熱サイクル処理用チャンバー２４１に送達されている。プラットホームの速度は、緩やかな加速と同様である遅い減速プロフィルα８で回転速度ω８（図８において約５００ｒｐｍ）に下げられる。
【０１５９】
熱サイクル処理が、様々な熱サイクル処理プロトコルおよび温度プロフィルを使用して熱サイクル処理用チャンバー２４１において行われる。そのような温度プロフィルの例は下記を含む：
１．二本鎖ＤＮＡを変性させるために高い温度（例えば、約９５℃）で反応混合物を保持すること
２．１サイクルの工程を行うこと、ただし、ｎサイクルの場合、下記の工程が、ｎ−１回、同一的に繰り返される：
ａ）プライマーを一本鎖ＤＮＡにアニーリングさせるために、温度を、一時的に、あるいはアニーリング期間にわたってアニーリング温度（例えば、４５℃〜７５℃）に低下させること
ｂ）温度を、一時的に、あるいはより好ましくは、増幅プライマーの伸長を可能にするプライマー伸長期間とともに伸長温度（例えば、６０℃〜７０℃）に上げること；および
ｃ）増幅されたフラグメントの変性温度に温度を上げること。
【０１６０】
必要に応じて、最後の反応工程は、混合物をアニーリング温度に下げ、その後、熱サイクル処理用チャンバーの温度を、すべての伸長生成物について伸長反応を実質的に完了させるのに十分な時間にわたって伸長温度に上げることを含む。
【０１６１】
その後、サンプルの温度は、通常、反応を停止させるために室温以下に下げられる。
【０１６２】
次に、私が理解しているように、熱サイクル処理用チャンバーは単に、断熱層によって覆われた大きなリザーバーである。正しいか？
下記の実施例は、本発明のいくつかの好ましい実施形態をさらに例示することを目的とし、決して限定するものではない。
【０１６３】
実施例１
大腸菌に由来するゲノムＤＮＡのサンプル調製およびＰＣＲ
図１〜図４に示されているようなマイクロフルーイディックスプラットホームを使用して、大腸菌のサンプルからＤＮＡ標的を調製し、増幅した。回転プロフィルおよび熱サイクル処理を制御するために使用された装置の様々な局面は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されている。本実施例において使用された装置は、「好適な実施形態の詳細な説明」において上記に記載されている。
【０１６４】
マイクロフルーイディックス構造体を、Ｌｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社のＶＭＣ５０００フライス盤を操作するＬｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社の「Ｂｅｎｃｈｍａｎ」ソフトウエア（Ｌｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＨ）を使用するコンピューター／数値コード加工を使用してアクリルを加工することによって製造した。その後、ディスクを、沸騰した塩化メチレンからの蒸気をさらすことによって蒸気研磨して、加工マークを除き、そして加工された表面を滑らかにした。両面テープ（７９５３ＭＰ（１．５−０．５−１．５）など）の層をディスクの加工面に貼り付けた。テープは、貼り付ける前に型切断されたか、あるいは貼り付け後に熱サイクル処理用チャンバーの開口部から切り取られた。これは、テープの接着剤における知られているＰＣＲ阻害剤にさらされる可能性を最小限にするために行われた。その後、マイラー（ＩＣＩ）の層を両面テープに貼り、ディスクの流体構造体のシールを完全にした。多くの場合、その後、ディスクは、共同所有で同時係属中の米国特許出願第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願、これは参考として組み込まれる）においてより詳しく開示されている方法を使用してパリレンにさらすことによって不動態化された。
【０１６５】
サンプル調製およびＰＣＲのために使用された溶液は、アルカリ細胞溶解液、中和緩衝液、および特定の標的配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含有するＰＣＲ反応混合物であった。
【０１６６】
大腸菌の懸濁物をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で供給した。これは、標準的な実験室用分光光度計での６００ｎｍの吸光度を使用して計算されるように２．７ｘ１０９細胞／ｍｌ〜３．３ｘ１０９細胞／ｍｌの細胞濃度を有していた：所望する細胞数を達成するための培養物の希釈物を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培養液を使用して作製し、その後、脱イオン水で４０倍に希釈した。
【０１６７】
使用したアルカリ細胞溶解液は１０ｍＭのＮａＯＨであり、中和緩衝液は１６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）であった。ＰＣＲ反応混合物は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のＲｅａｄｙ−ｔｏ−ＧｏビーズまたはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＴａｑ２０００のいずれかであった。Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏビーズを再懸濁して、２５μＬの最終容量にした。両方の系は、適切な塩および安定化剤とともに２００μＭの各ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭのＭｇＣｌ２の最終濃度をもたらす。この混合物に、目的とするプライマーを、反応における各プライマーが２０ｐｍｏｌの濃度で加えた。これらのプライマーは、大腸菌ゲノムのランダムに選択された３００塩基対（ｂｐ）の非コード配列を規定するプライマー対であるＥｃｏＣｔｌ、またはｌａｃＩリプレッサータンパク質に対する４２２ｂｐコドンを規定するプライマー対であるｌａｃＩであった。
【０１６８】
ＥｃｏＣｔｌ−Ｆ配列：５’−ＡＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＴＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１）；
ＥｃｏＣｔｌ−Ｒ配列：５’−ＧＴＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣＣＧＣ−３’（配列番号２）；
ＬａｃＩ−Ｆ配列：５’−ＣＣＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＧＧＣＣＣ−３’（配列番号３）；
ＬａｃＩ−Ｒ配列：５’−ＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＡＡＣＡ−３’（配列番号４）。
【０１６９】
プライマーはすべて、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から得た。
【０１７０】
ＰＣＲプロトコルは、Ｒｕｄｂｅｃｋ＆Ｄｉｓｓｉｎｇ（１９９８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２５：５８８〜５９２）から改変した。ＰＣＲプロトコルは下記の工程からなる：５μＬのサンプルを５μＬのＮａＯＨと混合すること；混合物を約９５℃に１２０秒間加熱して、細胞を溶解すること；溶解物を５μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中和緩衝液と混合すること；および中和された混合物を、選択されたプライマーを含有する１０μＬのＰＣＲ反応混合物と混合すること。その後、この最終溶液を熱サイクル処理に供した。
【０１７１】
コントロールの反応を、上記のサンプル調製工程を手作業で行うことによって実験台において従来的に行った。熱サイクル処理を、ホットボンネットサーマルサイクラーを用いるＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のモデルＰＴＣ−１００において行った。この反応に対するサイクル処理パラメーターは下記の通りであった：
【表１】
同様のプロフィルを、プラットホームを使用して用いた。使用した勾配率または温度変化率は、使用した熱電気素子がサイクル処理に供された場合に「できる限り早い」ことを可能にした。脱ハイブリダイゼーション、アニーリングおよび伸長に対する一定の温度時間は、従来的に行われたコントロールについて使用された温度時間とほぼ等価であったが、ディスクにおける流体の応答は、ディスクを熱電気構成要素とつなげるために使用された金属ブロックに埋め込まれた温度センサーの応答よりも遅いことが認識される。
【０１７２】
適切な容量を、図３に示されているチャンバー２０４、２０５、２０６および２３６に充填した後、ディスクを装置のプラテンに載せた。ディスクの中心孔が、ねじ切られたねじを覆ってプラテンの軸に置かれた。熱グリースを、ディスクと熱電気構成要素との良好な熱的接触を保証するために使用した。保持用のねじを使用して、ディスクを所定位置に保持した。
【０１７３】
使用した回転プロフィルは下記の工程からなった：
【表２】
その後、上記に記載されているような熱サイクル処理プロフィルを、プラテンおよびディスクを５００ｒｐｍで回転させながら使用した。
【０１７４】
代表的なアッセイの結果を図１０に示す。この図は、従来のＰＣＲ装置と比較される、本発明のプラットホームによって得られたＤＮＡフラグメントの（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されているような）従来のゲル電気泳動分析を表している。これらの結果は、本発明のプラットホームにおいてＰＣＲを行うことにより、従来的に増幅されたフラグメントとの比較によって決定されるように正しいサイズを有する増幅された標的フラグメントが、従来の熱サイクル処理装置を使用して増幅されたフラグメントの収量に等しい収量で得られたことを明らかにしている。
【０１７５】
ＰＣＲ産物フラグメントの収量を、照明源（ニコン、超高圧水銀ランプ電源、モデルＨＢ−１０１０１ＡＦ）を用いるエピ蛍光顕微鏡を使用して定量的に評価した。典型的な収量は、実験台方法と比較して６０％〜１００％の収量である（２００００コピーの標的出発材料を用いて３５ｎｇ〜４０ｎｇ）。
【０１７６】
上記に記載された装置によるサイクル処理において、主として蒸発による容量損失は、典型的には、２５μＬの反応に関して、総投入容量の約２０％であり、典型的な回収量は約２０μＬである。この容量損失は増幅の経過とともに徐々に生じている。蒸発物の大部分は、サイクル処理チャンバーのすぐ上方の流路内に凝縮し、そしてサイクル処理チャンバー内に回転させて戻すために十分な液体が集まるまで集められる。
【０１７７】
ディスク上でサンプルを熱サイクル処理することによる多重化もまた、大腸菌サンプルを用いて明らかにされた。２００００個の細胞を、上記に記載されたプロトコルに従って実験台において溶解し、ＰＣＲ試薬と混合した。使用されたプライマーは、上記に記載されたＥｃｏＣｔｌプライマーおよびｌａｃＩプライマーであった。サンプルをサイクル処理チャンバー内にピペットで直接入れ、上記に概略されているパラメーターを使用してサイクル処理した。速度プロフィルもまた、プロフィルのサイクル処理部分について上記の通りであった：温度サイクル処理の継続期間中は５００ｒｐｍ。熱サイクル処理された多重サンプルに対する典型的な結果を図２７に見出すことができる。ＰＣＲ産物フラグメントの収量を、上記に記載されているように、照明源を用いるエピ蛍光顕微鏡を使用して定量的に評価した。ディスクから回収されたＰＣＲフラグメントの収量は、一般に、実験台での収量の約７０％であった。これは、単一アンプリコンサンプルの収量の範囲内である。
【０１７８】
実施例２
ウシ血液に由来するゲノムＤＮＡのサンプル調製およびＰＣＲ
実施例１に示されている実験を、全血サンプルを使用して繰り返した。これらの実験において、ヘパリン処理されたウシ血液を脱イオン水で１：４０に希釈した。ウシ血液の白血球（ＷＢＣ）の正確な数は測定されなかったが、平均値は約５ｘ１０６細胞／ｍｌであることが知られている。
【０１７９】
使用したアルカリ細胞溶解液、中和溶液およびＰＣＲ試薬は、上記に記載されている通りであった。ＰＣＲ反応混合物には、目的とするプライマー対が加えられた。プライマー対はβ−アクチンの２８９ｂｐコドンを規定する。
【０１８０】
β−アクチン−Ｆ配列：５’−ＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡ−３’（配列番号５）
β−アクチン−Ｒ配列：５’−ＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣ−３’（配列番号６）。
【０１８１】
使用した一般的なプロトコルは、上記に記載されているプロトコルと同様であった。白血球は細菌よりも頑丈ではないので、選ばれた溶解温度は９１℃であった。
【０１８２】
使用した回転プロフィルは、実施例１に記載されている通りである。
【０１８３】
熱サイクル処理パラメーターは下記の通りであった：
【表３】
典型的な結果を図１１に示す。この図は、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（上記）に記載されているような）従来のゲル電気泳動分析を示している。これらの結果は、本発明のプラットホームにおいてＰＣＲを行うことにより、従来的に増幅されたフラグメントとの比較によって決定されるように正しいサイズを有する増幅された標的フラグメントが、従来の熱サイクル処理装置を使用して増幅されたフラグメントの収量に等しい収量で得られたことを明らかにしている。
【０１８４】
実施例３
大腸菌に由来するｐＴｒｃＨｉｓＡプラスミドＤＮＡのサンプル調製およびＰＣＲ
図１４に示されているプラットホームを、大腸菌のサンプルを処理して、プラスミドＤＮＡの単離および精製を行うために使用した。回転プロフィルおよび熱サイクル処理の制御のために使用された装置は、記載されている通りであった。回転プロフィルおよび熱サイクル処理を制御するために使用された装置は、パーソナルコンピューター、ＰＣとサーボ制御型駆動モーターとのインターフェース電子工学、およびＰＣとスクリーン印刷回路とのインターフェース電子工学からなった。この例の場合、中心軸は、エンコーダーを有するサーボ制御型ＤＣモーター（Ｍｉｃｒｏｍｏ、パーツ番号３５５７ＫＯ１２ＣＲ）によって駆動される。シリアルポート変換器（Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ、パーツ番号Ｚ２３２−４８５）およびモーター制御ボード盤（Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ、ＰＩＣ−ＳＥＲＶＯ）は、ＰＣとモーターとの連絡インターフェースを提供する。スリップリング（Ｌｉｔｔｏｎ、パーツ番号ＡＣ６０２３−２４）は、回転中のプラットホームと固定された電源との電気的な接続を提供した。
【０１８５】
マイクロフルーイディックスディスクは、上記に記載されているようにコンピューター／数値コード加工を使用してアクリルを加工することによって製造された。その後、ディスクを、沸騰した塩化メチレンからの蒸気をさらすことによって蒸気研磨して、加工マークを除き、そして加工された表面を滑らかにした。
【０１８６】
融点が約５４℃であるパラフィンワックスの弁を、少量の融解ワックスを犠牲弁の毛管にピペットで入れ、そしてワックスが固化する前に平らな縁でワックスを素早く平坦に押し付けることによって挿入した。過剰量を流路の端からふき取り、流路の両端における余分なワックスを、Ｅｘａｃｔｏの刃を使用して切り取った。ディスクを（下記に記載されているように）完全に組み立てた後、５Ｖをワックス弁に対応するリード線のそれぞれに加えて、ワックスを流路内で融解させ、そして再度結晶化させた。これにより、ワックスが流路の断面を連続的に覆うことができる。
【０１８７】
１枚のＷｈａｔｍａｎろ紙＃５４および１片のフリット材（Ｐｏｒｅｘから得られる：＃Ｘ−４５８８、７０μｍの細孔サイズを有する）を、チャンバー１００５の底にあるスロットの幅に切断した。ろ紙およびフリット材を、「光る」面をろ紙の方に向かせてスロットに挿入した。フリット材をディスクの中心に最も近いスロットの側面に置いた。ろ紙の向きは重要ではなかった。その後、ろ紙およびフリット材の高さを、ディスクの高さと等しくなるように切断した。
【０１８８】
１枚のガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎから得られるＧＦ−Ｆ、住所）および１片のフリット材を、上記のように、結合チャンバー１０２７内のスロット１０２９の幅に切断した。ガラス繊維フィルターをスロット内に置き、その後、フリット材を、光る面をガラス繊維フィルターの方に向かせてディスクの端に最も近い側面においてガラス繊維の背後に挿入した。その後、両方の材料の高さを、ディスクの高さと等しくなるように切断した。
【０１８９】
フッ素化されたコーティング剤（Ｃｙｔｏｎｉｘ、パーツ番号ＭＥ０００）Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｏａｔを流路Ｘ、Ｙ、Ｚに塗った。過剰なＰｅｒｆｌｕｏｒｏｃｏａｔをディスクの周囲の領域からふき取り、その後、Ｅｘａｃｔｏの刃などの鋭利物を流路に走らせ、流路が詰まっていないことを確保した。その後、フッ素化されたコーティング剤を硬化させるために、ディスクを約７０℃で１時間硬化させた。
【０１９０】
その後、１片の接着剤（３Ｍ、パーツ番号７９５３ＭＰ）をディスクの全面にわたって置き、チャンバーのすべての縁の周りを注意深くシールした。銀導電性インクおよび炭素抵抗性インクがワックス弁および結合カラムの位置に対応しているマイラーシートをディスクとともにアラインメントして、フルーイディックス構造体に向いたインクを含有する面と接着した。最後に、同じ３Ｍテープの別のシートをマイラーシート表面の裏側全体に置き、（断熱性基層を含む）加工していないアクリルディスクを、マイラー層に対する構造的一体性を得るためにテープのこの層に対して配置した。
【０１９１】
プラスミドＤＮＡを、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培養液で増殖させたトランスフェクション大腸菌の一晩培養物から得られる、ＣＲＰインサートを含有するｐＴｒｃＨｉｓベクターを有する大腸菌細菌培養物の約４０μＬの懸濁物から単離した。使用した懸濁物の容量には、約１ｘ１０８個〜約１．５ｘ１０８個の細胞が４０マイクロリットルのサンプルに含有されていた。使用した試薬溶液は、Ｑｉａｇｅｎ社のミニプレップキット（ＱＩＡｐｒｅｐ ミニプレップハンドブック、Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｘ−Ｖｏｌｍｅｒ−Ｓｔｒａｓｓｅ ４、４０７２４ Ｈｉｌｄｒｅｎ、ドイツ）から改変したか、あるいは原料から作製した。アルカリ細胞溶解液は、ミニプレップキットにおける溶液Ｐ２に対応する、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ； 重量対容量）を含む２００ｍＭのＮａＯＨであった。沈殿化溶液は、ミニプレップキットにおける溶液Ｎ３に対応する、１．０Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）および３Ｍグアニジン塩酸塩であった：この溶液は溶解混合物のｐＨを調節して、大きなゲノムＤＮＡフラグメント、ＳＤＳおよびタンパク質を沈殿させる；さらに、カオトロピック性の塩はＤＮＡの水和殻を破壊し、ＤＮＡをケイ酸物質に結合させることができる。第１および第２の洗浄液は７０％エタノール／水（ｖ／ｖ）であり、ミニプレップキットにおける溶液ＰＥに対応する；この溶液により、残留する塩がガラス繊維マトリックスから除かれた。溶出緩衝液は、０．１ＸのＴＥ（この場合、ＴＥは１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および１ｍＭのＥＤＴＡである）であり、結合したプラスミドＤＮＡをガラス繊維マトリックスから溶出させた。
【０１９２】
実験台コントロールおよび本発明のプラットホームの使用に対するプロセス工程はともに下記の通りであった：
（１）サンプル（約５０マイクロリットル）をアルカリ細胞溶解液（約５０マイクロリットル）と混合して、溶解させる
（２）得られた溶液を沈殿化溶液（約７０マイクロリットル）と混合する
（３）流体をろ過して、沈殿物および細胞破片を除く
（４）結合マトリックス（ガラス繊維フィルター）に加える
（５）エタノール／水（７０％ｖ／ｖ）の２回連続した洗浄を行う（最初の洗浄には約１００マイクロリットルを使用し、２回目の洗浄工程には約１５０マイクロリットルを使用する）
（６）プラスミドＤＮＡを、４０マイクロリットルの０．１Ｘ ＴＥ液を使用して溶出する。
【０１９３】
工程（１）〜（６）はＱｉａｇｅｎ社のミニプレッププロトコルからの改変である：発表されたプロトコルからの変更は溶液の容量割合だけである。上記に列記された容量を実験台コントロールおよびディスクの両方に使用した。実験台コントロールに対する材料および手順は、ミニプレップキットの場合と同様である；本発明のディスクは、下記の工程によって流体を負荷した後に操作された：
１）１０００ＲＰＭに加速する。アルカリ細胞溶解液をリザーバー１０１６から混合用チャンバー１００５に流す（図１７ａ〜図１７ｃに示す；矢印により記されるωは回転方向を示す（反時計回りであるように自由に選ばれる））。
【０１９４】
２）完全な停止および５００ｒｐｍ／ｓの加速を使用して５分間攪拌して、溶液およびサンプルを混合する（図１７ｄ〜図１７ｅに示す）。
【０１９５】
３）１０００ＲＰＭに加速する。
【０１９６】
４）１０２１における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加える。沈殿化溶液を１００５に移動させる（図１７ｆ）。
【０１９７】
５）上記の工程（２）のように混合する。
【０１９８】
６）１０００ＲＰＭに加速する。１０１２における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加える。溶液を１００５から結合カラム１０２７に放出させる（図１７ｇ）。沈殿混合物がガラスフィルターを通って廃棄物チャンバー１０３４に完全に移動するのに十分な時間にわたって１０００ＲＰＭで維持する。
【０１９９】
７）１０３７における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加え、第１の洗浄液を放出させる。第１の洗浄液がガラス繊維を通って廃棄物チャンバー１０３４内に完全に入るまで回転速度を１０００ＲＰＭで維持する（図１７ｇに示す）。
【０２００】
８）１０４８における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加え、第２の洗浄液を放出させる。第２の洗浄液がガラス繊維を通って廃棄物チャンバー１０３４内に完全に入るまで回転速度を１０００ＲＰＭで維持する（図１７ｈに示す）。
【０２０１】
９）１０３２における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加え、サンプル回収チャンバーを開ける。
【０２０２】
１０）５秒後、１０５８における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加え、溶出緩衝液を放出させる。
【０２０３】
１１）洗浄されたすべての溶出緩衝液がガラス繊維フィルターを通ってサンプル回収チャンバー内に入るまで、プラットホームの回転を１０００ｒｐｍで維持する。さらなる溶出緩衝液が微小流路１０３２を通って流れていることが見えなくなった後、プラットホームの回転速度を少なくともさらに１分間維持する（図１７ｊ〜ｋに示す）。
【０２０４】
１２）ポート１０５５を使用してプラットホームから流体サンプルを取り出す。
【０２０５】
実験台コントロールおよび本発明のディスクで処理されたサンプルの両方について、回収された流体をＳｐｅｅｄｖａｃで乾燥した（Ｓａｖａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｄｒｙｉｎｇは、分析される液体の容量を少なくする（そして濃度を増大させる）ために役立つ）；これは残留エタノールをも除く。その後、乾燥サンプルを１０マイクロリットルの脱イオン水に再懸濁した。場合により、９塩基切断酵素であるＡｌｗＮ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）などの制限酵素を使用して、サンプルを消化した。この酵素は、残留する塩に対して敏感であり、その結果、サンプルの清浄度の試験として役立つ。すべての場合において、未消化サンプルのすべてまたは一部のいずれかを、１ＸＴＢＥ緩衝液における１％アガロースゲルでの臭化エチジウムゲル電気泳動を使用して分離した。得られたバンドは、サイズラダーと比較したときにサンプル中のプラスミドＤＮＡのサイズを示している。より大きなゲノムＤＮＡは、サンプルに混入している場合にはゲルのウエル内に視認される。消化されたサンプルの場合、未切断バンドが残らないサンプルの完全な切断により、サンプルの清浄度が示される。
【０２０６】
図１８には、いくつかの異なる制限酵素を使用することによるサンプルの純度を例示するゲルが示されている。最初に、ゲル上の単独で泳動された未切断サンプルにより、プラスミドが、サンプル自体に塩をほとんど含まないいくつかの異なる配座異性体で示されている。プラスミドをＥｃｏＲＶ酵素で切断した。この酵素はプラスミドを線状化して、すべての配座異性体をラダーに対して１つのサイズで泳動させる。これにより、すべての配座異性体が切断され得ることが明らかにされる。第２の消化は、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの両方の部位を使用する二重消化であった。これらの部位はＣＲＰインサートの両端に含まれ、２つの長いフラグメントと６５３塩基のインサートフラグメントとを生じさせる。消化としての最後はＡｌｗＮ１であった。これは９塩基切断酵素であり、生成物中の塩混入に対して非常に敏感である。これらのアッセイの結果により、本発明のプラットホームを使用して得られたプラスミドＤＮＡは、品質および純度において、従来の実験台方法を使用して単離されたプラスミドＤＮＡに匹敵し得ることが明らかにされる。
【０２０７】
図１９には、ゲノムＤＮＡ混入に対するアッセイの結果が示されている。ＰＣＲが、プラスミド特異的プライマーならびに大腸菌ゲノムＤＮＡのフラグメントに特異的なプライマーを使用して行われる。陰性コントロールおよび陽性コントロールにはゲノムＤＮＡおよびゲノムプライマーを使用した。最初の増幅シリーズは、プラスミド特異的プライマーを使用して、プラスミドのテンプレートＤＮＡが減少する量で増幅された予想されるフラグメントを示す。第２の増幅シリーズは、ゲノムＤＮＡプライマーおよびプラスミドＤＮＡテンプレートを使用するゲノムＤＮＡフラグメントの増幅（またはその非存在）を示す。
【０２０８】
理解され得るように、連続した１０倍希釈物は、１：１０００希釈までのプラスミド特異的プライマーを使用して有意なＰＣＲ産物をもたらしている。１：１００００希釈においてのみ、増幅がほとんど得られなかった。逆に、ゲノムＤＮＡ特異的プライマーは、サンプル自体および１：１０希釈の場合にだけ増幅を示している。これらの観測結果は、ゲノムＤＮＡに対してプラスミドが約１０００倍過剰であることを示している。
【０２０９】
実施例４
大腸菌に由来するゲノムＤＮＡのＰＣＲ
図６、図７、図２４、図２５および図２６に示されているようなマイクロフルーイディックスプラットホームを使用して、大腸菌のサンプルからＤＮＡ標的を増幅した。
【０２１０】
図６は、マイクロフルーイディックスプラットホームの２つの主要な構成要素の分解図を示している。加工されたフルーイディックスディスク７０１が、スクリーン印刷された電気回路ディスク７１０に結合される。
【０２１１】
図７は、フルーイディックスディスク内における８個のサイクル処理用チャンバー７０３の配置を示している。熱サイクル処理用チャンバーは円形であり、７ｍｍの直径および０．５ｍｍの深さを有する。各チャンバーは反応混合物充填流路７０４および空気流路７０２を有する。両方の流路は０．５ｍｍ幅×０．５ｍｍ深さである。空気流路は、回転させて反応チャンバーに戻される前に蒸気が冷えて、その壁に沿って凝縮した場合の加熱時の液体損失を防止することを助ける。
【０２１２】
図２４は、抵抗ヒーターがどのように電気回路ディス上に配置されているかを示している。抵抗ヒーターパッチ７１３は、１辺が１０ｍｍの正方形である。ヒーターの大きさは、サイクル処理チャンバーにおける熱勾配を最小限にするために、サイクル処理チャンバーの大きさよりも大きくなるように選ばれた。電流は、陽極７１２およびアース７１１のリード線を介してヒーターに供給される。
【０２１３】
図２５は、サイクル処理チャンバー、結合層および抵抗ヒーターの断面図である。フルーイディックスディスク７０１が、０．１ｍｍ厚のマイラーシート７２６（ＩＣＩ、パーツ番号ＳＴ５０５）に両面テープ７２７（３Ｍ、パーツ番号７９５３ＭＰ）を使用して合わせられる。両面テープは、テープからの反応汚染を最小限にするために、反応チャンバーの下部の領域から除かれている。マイラー層７２６が、電気回路層７１０に両面テープ７２３を使用して合わせられる。これらの２つの層は、反応チャンバーの配置が抵抗ヒーターの配置とそろうことを保証するために半径方向にアラインメントされる。熱伝導性エラストマー７２４（Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ、パーツ番号ＣＰＵ Ｐａｄ）が、サイクル処理チャンバーにおける考えられる熱勾配を最小限にするために抵抗ヒーター７１３とマイラーシート７２６との間に挿入される。サイクル処理の温度制御のために使用される０．１ｍｍの熱電対７２５（Ｏｍｅｇａ、パーツ番号ＣＨＡＬ００５−Ｋ型）が、マイラーシート７２６と伝導性エラストマー７２４との間に挿入される。電気回路層７１０が、底部のポリカーボネート支持ディスク７２１に両面テープ７２２を使用して合わせられる。
【０２１４】
マイクロフルーイディックス構造体を、Ｌｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社のＶＭＣ５０００フライス盤を操作する「Ｂｅｎｃｈｍａｎ」ソフトウエア（Ｌｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＨ）を使用してポリカーボネートディスクを加工することによって製造した。構造体は、コンピューター製図プログラムを使用して設計され、コンピューター機械コードに変換された。ディスクは、エタノールで、次いで空気で清浄化され、その後、沸騰した塩化メチレンからの蒸気をさらすことによって研磨され、表面の不完全性が除かれた。
【０２１５】
電気回路ディスクは、当業者によって知られ、そして第６，０６３，５８９号において詳細に開示されているスクリーン印刷技術を用いて製造された。炭素系抵抗インク（Ｄｕｐｏｎｔ、７１０２／７０８２混合物）を使用して、抵抗ヒーターを印刷し、そして銀系インク（Ｄｕｐｏｎｔ、５０２８）を使用して、導電性リード線を０．１ｍｍ厚のマイラーシート上に印刷した。
【０２１６】
回転プロフィルおよび熱サイクル処理を制御するために使用された装置は、パーソナルコンピューター、ＰＣとサーボ制御型駆動モーターとのインターフェース電子工学、およびＰＣとスクリーン印刷回路とのインターフェース電子工学からなった。この例の場合、中心軸は、エンコーダーを有するサーボ制御型ＤＣモーター（Ｍｉｃｒｏｍｏ、３５５７ＫＯ１２ＣＲ）によって駆動される。シリアルポート変換器（Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ、Ｚ２３２−４８５）およびモーター制御ボード盤（Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ、ＰＩＣ−ＳＥＲＶＯ）は、ＰＣとモーターとの連絡インターフェースを提供する。スリップリング（Ｌｉｔｔｏｎ、ＡＣ６０２３−２４）は、回転中のプラットホームと固定された電源との電気的な接続を提供した。熱電対によって測定される温度依存性電圧は、小型の転送器（Ｏｍｅｇａ、パーツ番号ＴＸ９１Ａ）を使用して電流に変換され、スリップリングを介して出力された。この電流は、ＰＣ内の市販のアナログ／デジタルボード盤（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｂｏａｒｄｓ、パーツ番号ＣＩＯ−ＤＡＳ１６００）によって電圧に変換されて読み取られた。抵抗ヒーターにかかる電圧はまた、スリップリングを介して加えられ、温度を所望する温度にするために変化させられた。
【０２１７】
定電力制御ループが、反応チャンバーの温度を制御するために使用された。経験的なデータは、６０℃〜１００℃の温度を維持するためには０．４Ｗ〜１．２Ｗの電力が必要であることを示していた。この例において、ＰＣのソフトウエア制御プログラムは熱電対の温度を読み取り、設定点の温度に比例した制御電圧を出力する。この電圧は、抵抗ヒーターと直列になっている定電力回路に入力された。温度が上昇すると、ヒーター抵抗が増大した。一定の電力を維持するために、回路はその出力電流を低下させた。ゼロ出力における冷却が、プラットホームの露出面からの対流によってもたらされ、そしてディスクを５００ｒｐｍの一定速度で回転させることによって助けられた。加熱速度は１．５℃／秒もの大きさであり、冷却速度は１．０℃／秒であった。
【０２１８】
ディスクは、ディスク７０５内の中心孔を介してモーターの中心軸に取り付けられた。スリップリングが、ねじを使用してディスクの上部に固定された。スリップリングは、適切な電力制御および温度測定のリード線が接続されるように電気回路層とともに並べられた。
【０２１９】
ＰＣＲ溶液は、脱イオン水、大腸菌のゲノムテンプレート（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、大腸菌ゲノムＤＮＡのβ−ガラクトシダーゼコドンの２１５塩基対部分を増幅するプライマー組ＥＢＧＡ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、およびＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からなった。ＥＢＧＡフォワード配列は５’−ＡＣＣＴＧＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号７）によって示され、ＥＢＧＡリバース配列は５’−ＣＧＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＴＴＡＴＴＣＴＣ−３’（配列番号８）によって示される。変性温度、アニーリング温度、伸長温度は、それぞれ、９５℃、６０℃および７２℃であるように選ばれた。ＰＣソフトウエアの設定値は、１００℃、６０℃および７２℃であった。設定値と得られた温度との差は、反応チャンバーの下部にある熱電対の位置およびディスクによる温度勾配に基づいて予想される。
【０２２０】
図２６には、このシステムで３０サイクルを行った後におけるゲル電気泳動結果が示されている。これらの結果は、このゲルで示されているように、市販のサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、モデル番号ＰＴＣ−１００）で行われた増幅と比較して勝っている。
【０２２１】
前記の開示は本発明のいくつかの特定の実施形態を強調していること、そしてそれらに対して均等論的な改変または代替はすべて本発明の精神および範囲に含まれることを理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の微量システムプラットホームの分解斜視図を示す。
【図２】図２は、図１に分解斜視図で示された微量システムプラットホームの１つの構成要素であるマイクロフルーイディックス層の平面図を示す。
【図３】図３は、図２に例示されたマイクロフルーイディックス層の断面の細部である。
【図４】図４は、図３に例示された構造体の一領域の細部を示す。
【図５】図５は、熱サイクル処理用チャンバーの近傍における図１の微量システムプラットホームの断面図である。
【図６】図６は、マイクロフルーイディックスディスクおよび印刷された回路の分解斜視図を示す。
【図７】図７は、図６に示されたマイクロフルーイディックスディスクの平面図を例示する。
【図８】図８は、実施例１および実施例２における微量システムプラットホームを通過する流体の動きを行わせるために使用される速度プロフィルの回転速度（ｒｐｍ）対時間を例示する。
【図９】図９は、図８の速度プロフィルによって駆動される流体の動きの順序を例示する。
【図１０】図１０は、大腸菌から単離されたＤＮＡに含有される標的フラグメントのＰＣＲ増幅のゲル電気泳動分析の写真である。
【図１１】図１１は、ウシ血液から単離されたＤＮＡに含有される標的フラグメントのＰＣＲ増幅のゲル電気泳動分析の写真である。
【図１２】図１２は、ＤＮＡサンプル調製ディスクの分解斜視図を示す。
【図１３】図１３は、図１２に示されたこのディスクの平面図である。
【図１４】図１４は、プラスミドＤＮＡ調製プラットホームに対するマイクロフルーイディックス構造体の平面図を示す。
【図１５】図１５は、プラスミドＤＮＡ調製プラットホームに対する加熱層の平面図を示す。
【図１６】図１６は、プラスミドＤＮＡ調製プラットホームに対する基層の平面図を示す。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｋは、プラスミドＤＮＡ調製プラットホームに対するマイクロフルーイディックス構造体を通過する流体の動きを例示する。
【図１８】図１８は、従来的に調製されたプラスミドＤＮＡ（コントロール）、または本発明のプラスミドＤＮＡ調製プラットホームを使用して調製されたプラスミドＤＮＡの制限酵素消化プロフィルのゲル電気泳動分析の写真である。写真において、外側のレーンはサイズマーカーである。
【図１９】図１９は、本発明のプラスミドＤＮＡ調製プラットホームを使用して、プラスミドＤＮＡまたは細菌ゲノムＤＮＡに特異的なプライマーを使用するインビトロ増幅反応のゲル電気泳動分析の写真である。写真において、テンプレートＤＮＡの量は、左側から右側に移動する各組の増幅反応において少なくなる；外側のレーンはサイズマーカーである。
【図２０】図２０は、本発明の電気的プラテンおよび制御エレメントの平面ダイアグラムである。
【図２１】図２１は、本発明の電気的プラテンにおける温度制御エレメントの平面ダイアグラムである。
【図２２】図２２は、プラテンおよび温度制御エレメントの印刷された回路ボード盤における電気リード線間の電気的接続の平面ダイアグラムである。
【図２３】図２３は、ペルチェ素子を含む本発明による温度制御エレメントの構造体の断面図である。
【図２４】図２４は、図６に示された電気的回路層の平面図を示す。
【図２５】図２５は、図６に示されたディスクに対する断面図を示す。
【図２６】図２６は、図６に示されたディスクを使用して大腸菌サンプルから増幅されたＤＮＡ標的のゲル電気泳動分析の写真である。
【図２７】図２７は、熱サイクル処理用チャンバーで行われた多重ＰＣＲの例を示す。
（発明の背景）
本出願は、米国特許仮出願第６０／１４０，４７７号（１９９９年６月２２日出願）に対する優先権を主張する。その開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、微量分析的および微量合成的な分析および手法を行うための方法および装置に関する。特に、本発明は、遺伝学的、生化学的および生物分析的なプロセスを超小型化することに関する。詳細には、本発明は、一体化かつ小型化されたサンプル調製、核酸増幅および核酸検出アッセイを行うための装置および方法を提供する。これらのアッセイは、法医学、生命科学研究ならびに臨床的および分子的な診断法（これらに限定されない）を含む様々な目的のために行うことができる。本発明は、細菌培養物および細胞培養物ならびに全血および処理された組織を含む目的とする様々な液状サンプルについて使用することができる。本発明の微量システム装置を使用する広範囲の任意のそのような微量分析的または微量合成的なプロセスを行うための方法もまた提供される。
【０００３】
２．関連技術の背景
宿主細胞からのＤＮＡの抽出および単離は現代の分子生物学の土台である。あるタイプのＤＮＡ、すなわち、細菌のプラスミドＤＮＡは、細菌、酵母および哺乳動物細胞に遺伝物質を挿入するための便利なベクターとして特に有用である。生物から単離されたＤＮＡは、プラスミドＤＮＡに連続した状態で共有結合させることによって挿入され、その後、細菌細胞などの細胞に導入され、そして増殖させることができる。それによって、非常に多くのコピー数のプラスミドがそれぞれの細胞において作製される。これらのプラスミドは、様々な実験目的または治療目的のために十分な量のＤＮＡを（ミリグラムまでの量が工業規模では製造され得るが、典型的には数マイクログラムの程度で）得るために都合良く採取することができる。プラスミドＤＮＡを採取することは、細胞からのその取り出しおよび細胞のゲノムＤＮＡ内容物からの単離として規定され、生命科学研究、診断法、治療法および他の適用における有用性は増大している。
【０００４】
現在、ＤＮＡの抽出および単離は、手作業、またはロボットによるサンプル調製装置の使用のいずれかによって行われている。いずれの場合においても、様々な技術および材料が使用されている（例えば、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキットおよびＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液ミニキットハンドブック、１９９９、Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｘ−Ｖｏｌｍｅｒ−Ｓｔｒａｓｓｅ ４、４０７２４、Ｈｉｌｄｒｅｎ、ドイツ；Ｂｉｒｎｂｏｉｍ＆Ｄｏｌｙ、１９７９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．７：１５１３〜１５２２を参照のこと）。典型的には、細胞が、場合により、プロテアーゼまたはプロテイナーゼＫなどのタンパク質消化酵素を含有する表面活性剤（界面活性剤）溶液中で最初にインキュベーションされる。これらは細胞を溶解し、それによりＤＮＡを溶液中に放出させる。これは、ヌクレアーゼを不安定化させ、そして混入しているＲＮＡを加水分解するためにアルカリ性条件下で頻繁に行われている。その後、ＤＮＡは、他の細胞構成成分から分離しなければならない。これは、例えば、タンパク質および他の細胞破片の選択的な沈殿化、（フェノールおよびクロロホルムを使用する）有機化学品による抽出、およびＤＮＡアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む数多くの異なる分離プロトコルを使用して行われる。プラスミドＤＮＡはまた、混在する細胞（細菌のゲノムＤＮＡ）から単離しなければならない。ろ過法はプラスミドＤＮＡ溶液をもたらし得るが、ＤＮＡを溶媒和するために必要とされる溶液は、通常、ＤＮＡの所望する最終的な適用には適していない。結果として、プラスミドＤＮＡはエタノール沈殿によってこれらの溶液から取り出されるか、あるいは固相分離が使用される。これは、（ガラスまたはシリカを使用するアフィニティー結合法の場合には特に、）溶媒のｐＨおよび塩濃度をさらに変化させることを必要とする。これらの工程に必要とされる技術には、高価な一組の装置およびその熟練した操作者を必要とするピペット操作、送液、ろ過、洗浄および遠心分離が含まれる。自動化されたシステムのさらなる条件には、サンプル容器の取扱いに関するサンプル移動およびロボット工学が含まれる。
【０００５】
この議論は、ＤＮＡサンプルの調製（特に、プラスミドＤＮＡの調製）を行うためのより効率的で、迅速かつ安価な自動化された方法および装置がこの分野で求められていることを例示している。
【０００６】
一体化された遺伝子分析の領域では、サンプル調製、ＰＣＲ、およびリアルタイム蛍光法またはハイブリダイゼーション法による検出を一体化することがある程度の発達を遂げている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ他、１９９８、「一体化された遺伝子分析における進歩」、Ｐｒｏｃ．Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ’９８、Ｈａｒｒｉｓｏｎ＆ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ編、Ｋｌｕｗｅｒ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１１頁〜１６頁）。これらのシステムは、流体が処理されるマイクロフルーイディックデバイスと連携しなければならないポンプおよび弁などの肉眼的な流体取扱いシステムに頼っている。
【０００７】
しかし、ＤＮＡ（特に、プラスミドＤＮＡ）を採取するために細胞培養物を処理することができる装置および方法が求められている。
【０００８】
生物学および生化学の分野においては、分析手法は、周囲温度よりも高い温度での生物学的サンプルおよび反応混合物をインキュベーションすることを頻繁に必要とする。さらに、多くの生物分析的および生合成的な技術は、連続的に、あるいは反応スキームまたはプロトコルの経過にわたって２つ以上の温度でインキュベーションすることを必要とする。
【０００９】
そのような生物分析反応の一例がポリメラーゼ連鎖反応である。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸配列の増幅および検出を可能にする技術である。米国特許第４，６８３，１９５号（Ｍｕｌｌｉｓ他）および同第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ）を参照のこと。この技術は、例えば、ＤＮＡ配列分析、プローブ作製、核酸配列のクローニング、部位特異的変異誘発、遺伝子変異の検出、ウイルス感染の診断、分子的「指紋識別」、ならびに生物学的流体および他の提供源における汚染微生物のモニターリングを含む広範囲の生物学的適用を有する。ポリメラーゼ連鎖反応は、標的の変性、プライマーのアニーリング、およびポリメラーゼによって媒介される伸長の反復した過程またはサイクルを含む；この反応プロセスにより、特定の標的配列の指数関数的な増幅が得られる。
【００１０】
ＰＣＲを小型化して自動化する方法は、広範囲の分析的な環境において、特に、非常に多数のサンプルを同時に分析しなければならない状況において、あるいは分析されるサンプルが少量である場合には望ましい。
【００１１】
ＰＣＲに加えて、米国特許第４，９８８，６１７号（ＬａｎｄｅｇｒｅｎおよびＨｏｏｄ）に開示されているリガーゼ連鎖反応を含む他のインビトロ増幅手法が知られており、先行技術において都合良く使用されている。より一般的には、核酸ハイブリダイゼーションおよび配列決定などの生物工学の分野で知られているいくつかの重要な方法は、サンプル分子を含有する溶液の温度を制御された様式で変化させることに依存している。これらの方法の実施を自動化して小型化することは、この分野における望まれる目標である。
【００１２】
自動化されたＰＣＲを行うために製造された機械的な自動化流体取扱いシステムおよび装置が先行技術において開示されている。
【００１３】
米国特許第５，３０４，４８７号（１９９４年４月１９日発行、Ｗｉｌｄｉｎｇ他）には、微量スケールの分析装置における流体取扱いが教示されている。
【００１４】
国際特許出願公開ＷＯ９３／２２０５３（１９９３年１１月１１日公開、ペンシルベニア大学）には、微細加工された検出構造体が開示されている。
【００１５】
国際特許出願公開ＷＯ９３／２２０５８（１９９３年１１月１１日公開、ペンシルベニア大学）には、ポリヌクレオチド増幅を行うための微細加工された構造体が開示されている。
【００１６】
Ｗｉｌｄｉｎｇ他（１９９４、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４０：４３〜４７）は、シリコンに微細加工された直線流路における流体の操作を開示している。
【００１７】
Ｋｏｐｐ他（１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０：１０４６）は、異なる温度の領域を交互に使用してインビトロ増幅反応を行うためのマイクロチップを開示している。
【００１８】
ＰＣＲおよび他の温度依存的な生物分析反応を行うための先行技術において開示された合成マイクロチップの１つの欠点は、流路を通ってマイクロチップ上の流体を移動させるシステム、および１０μｍ〜１００μｍの範囲の直径を有するリザーバーを設計することが困難であった。これは、部分的には、これらのマイクロチップの構成要素の小さなサイズを通って流体を移動させるための高圧ポンプ手段を必要とするためである。先行技術のマイクロチップのこれらの無力性は、ＰＣＲおよび他の生物分析プロセスを小型化して自動化することに関してこれらの装置の有用性を制限している。
【００１９】
従って、特にＤＮＡサンプルの一体化されたサンプル調製および分析を提供するデバイスおよび方法がこの分野では求められている。この要求は、高コストおよび複雑な自動化（典型的にはロボットによる）システムによって現在悩まされている高処理能分析の場合には特に深刻である。ＤＮＡサンプル調製および分析の一体化は、非常に熟練した操作者を要求する多数の複雑な技術が必要な、この分野における現在の必要性がそれによって減少する場合には特に有用である。重要なことは、ＤＮＡ分析の場合、サンプル調製法およびインビトロ増幅法を一体化することは、汚染およびサンプル持ち越しの可能性を最小限にする。これは、この分野で使用されている様々なインビトロ増幅反応などの高感度技術では特に重要である。
【００２０】
本発明者の何人かにより、微量システムプラットホームと、回転によって、従って、マイクロプラットホームに埋め込まれた微小流路を通過する流体の動きを駆動させるためにプラットホームの回転から生じる向心力を利用することによって前記プラットホームを操作する微量操作デバイスとが開発された。これらは、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）に開示されている。これらのそれぞれの開示は参考として明示的に組み込まれる。
【００２１】
（発明の要約）
本発明は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）に開示されているような微量システムプラットホームを提供する（これらはそれぞれの開示は参考として明示的に組み込まれる）。
【００２２】
本発明は、微量スケールのプロセスをマイクロプラットホーム上で行うための装置および方法を提供する。それにより、流体は、プラットホームの回転から生じる向心力によって駆動されるので、規定された流路においてプラットホーム上を移動する。この微量システムプラットホームは、一体化および小型化されたサンプル調製、核酸増幅および核酸検出アッセイを行うために提供される。本発明の装置の第１の要素は、回転可能な構造体であるマイクロプラットホームであり、最も好ましくは、流体（サンプル）入口ポート、流体光学的な微小流路、試薬リザーバー、回収チャンバー、検出チャンバーおよびサンプル出口ポート（これらは「マイクロフルーイディック構造体」と総称的に呼ばれる）を含むディスクである。ディスクは、プラットホームのマイクロフルーイディックス構造体を通過する流体の動きを可能にする向心加速度を生じさせるために約１ｒｐｍ〜約３０，０００ｒｐｍの速度で回転させられる。本発明のディスクはまた、好ましくは、空気出口ポートおよび空気移動流路を含む。空気出口ポートおよび特に空気移動流路は、流体が空気を追い出すための手段を提供し、従って、ディスク上における流体の阻害されない動きが確保される。ディスク、および最も好ましくはプラットホームの面は、それに含有される流体の温度を周囲温度よりも高い温度に上げるための加熱エレメントをも含むことができる。ディスク上の特定部位には、好ましくは、流体が分析されることを可能にするエレメントもまた含まれる。
【００２３】
本発明のプラットホームの好ましい実施形態は、マイクロフルーイディックスディスクとともに回転するプラテンである。このプラテンは、最も好ましくは、抵抗加熱エレメント、熱電気的な（ペルチェ）素子、温度センサー、アッセイオプティクスおよびマイクロプロセッサーならびに他のエレクトロニクス構成要素を含む印刷された回路ボード盤である。回転中のプラテンと、固定された電源、モーター制御器、温度制御器およびコンピューターとの電気的な連絡は、最も好ましくは、スリップリングアセンブリーを介して達成される。マイクロフルーイディックディスクをプラテンの表面に取り付けて、ディスクおよびプラテンを一緒に回転させることによって、マイクロフルーイディック構造体全体における流体の分布および流速、ならびにマイクロフルーイディックディスクの局在化領域における流体の温度を制御することができる。
【００２４】
好ましい実施形態において、マイクロフルーイディックスディスクの一方の面はプラテンの一方の面に取り付けられ、そしてマイクロフルーイディックスディスク内の特定位置における流体の温度はプラテンとディスクとの温度交換によって制御される。代わりの実施形態において、マイクロフルーイディックディスクは、ディスクと、プラテンを含む熱調節エレメントとの間で温度交換を行わせるエレメントをそれぞれが含む２つのプラテンの間に配置される。好ましい実施形態において、プラテンは、それに埋め込まれているか、またはそれに取り付けられている抵抗加熱エレメント、ペルチェ素子および温度センサーを有する印刷された回路ボード盤である。代わりの実施形態において、マイクロフルーイディックディスク内の熱調節は、抵抗ヒーターを含む層を永続的にディスクに直節結合させることによって達成される；この場合、ディスク内の流体は、抵抗加熱エレメントによって周囲温度よりも高い温度に加熱され、そしてディスクを回転させることによって、また熱を環境に放出することによって周囲温度と等しい温度またはそれよりも高い温度に冷却される。プラテンの場合のように、この複合的なディスクと、電源、温度制御器およびコンピューターとの電気的な連絡は、最も好ましくは、スリップリングアセンブリーを介して達成される。
【００２５】
第１の局面において、本発明は、細胞からのＤＮＡの抽出、単離および精製を行うために、一体化および小型化されたサンプル調製を行うためのデバイスおよび方法を提供する。好ましい実施形態において、本発明のデバイスおよび方法は、細菌細胞からプラスミドＤＮＡを単離するために特に提供される。
【００２６】
本発明のプラスミドＤＮＡサンプル調製プラットホームは、下記の機能を行うために提供される：細菌細胞からの遊離ＤＮＡに対するサンプル処理；得られた溶液をろ過して、細菌細胞フラグメントを除くこと；マトリックスに対するＤＮＡ結合を促進させる溶媒条件を使用しての結合マトリックスへの溶液の添加；結合したＤＮＡの洗浄、およびさらなる分析方法に適合し得る溶液による元の溶液の置換；ならびに好適な溶媒における結合マトリックスからのＤＮＡの溶出。このようにして溶出されたＤＮＡは、この分野で知られている方法を使用して、単離することができ、あるいはインビトロで増幅することができ、あるいは配列決定することができる。下記にさらに詳しく記載されているように、プラスミドＤＮＡサンプル調製を行うマイクロフルーイディック構造体を含む本発明のプラットホームが提供される。これらのマイクロ構造体は、明瞭化するために、１つのマクロ構造体に関して例示されている。しかし、多数のそのようなプラスミドＤＮＡ調製マイクロフルーイディック構造体を含むプラットホームが本発明によって提供される。この場合、マイクロフルーイディック構造体は、プラットホームのサイズと、本明細書中に開示されているようなマイクロフルーイディックス構造体を含むチャンバーおよびリザーバーの容量能とによって決定される密度でプラットホームの表面に配列させられる。
【００２７】
第２の局面において、本明細書中に記載されているようなマイクロフルーイディックス構造体を有する本発明が、インビトロ増幅反応を行うために一体化された一組の生化学的プロセスを行うために提供される。これらのプロセスには、細菌細胞または哺乳動物細胞からＤＮＡを単離するためのサンプル処理；ＰＣＲに適切な溶液条件に溶液条件を調節するためのサンプル調整；調整されたサンプルをＰＣＲ試薬（デオキシリボースヌクレオチド、ポリメラーゼ酵素、プライマーおよび適切な塩、緩衝液および添加剤を含む）と混合すること；ＰＣＲを行うための熱サイクル処理が含まれる。
【００２８】
いくつかの好ましい実施形態において、本発明のディスクには、プラットホームが数個のサンプルを同時に処理して増幅することができる多数のマイクロフルーイディックス構造体が提供される。これらの実施形態において、一組の生化学的反応を行うためのマイクロフルーイディックス構造体の配置の多数の複製体がディスク上に配置され、そしてサンプル入口ポートまたはリザーバーがそれぞれの複製体に提供され、それによって多数のサンプルを処理することができる。さらに、サンプルＤＮＡが増幅される部分は、ディスク上に配置されたマイクロフルーイディックス構造体の個々の複製体のそれぞれにおいて提供される増幅プライマーを選ぶことによって独立的になり得る。これによって、特定サンプルの「多重的」な増幅が可能になる。あるいは、同じプライマーを、各サンプルのＤＮＡにおいて同じ標的フラグメントを増幅するために多数のサンプルを平行して処理するために提供することができる。増幅サイクルの各工程のために使用される温度、温度勾配速度および保持時間を含む独立した熱サイクル処理プロフィルを、マイクロフルーイディックス構造体のそれぞれについて、あるいは処理サンプルのそれぞれについて装置に対して個々にプログラム化することができる。
【００２９】
本発明は、多数の異なるサンプルの同時かつ独立的な熱サイクル処理、特定サンプルからの異なるフラグメントの独立した増幅、またはその両方を都合良く可能にする。この特徴はまた、ディスクに配置された多数のマイクロフルーイディックス構造体に対する反応パラメーターを変化させ、それにより同時に多数の実験を同時に行うことによって、迅速かつ１回の実験で１つのサンプルまたはアンプリコンに対する熱サイクル処理パラメーターを使用者が最適化することを可能にする。マイクロフルーイディックス構造体の特定の複製体は、プラットホーム上の他の複製体からマイクロフルーイディック的に隔てられて配置され得るので、すべてよりも少ない数のマイクロフルーイディックス構造体を含む部分を別個に使用することができ、そして残りの部分を将来の使用のためにそのままにしておくことができる。
【００３０】
本発明のプラットホームの代わりの実施形態において、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行、これは参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されているような計量用構造体が、多数の混合用構造体のそれぞれに試薬の一部を分配するために使用される。この場合、それぞれの混合用構造体が多数のサンプルリザーバーの１つに流体的に接続されており、それによって、サンプルと共通試薬との平行した処理および混合が可能である。このことは、自動化された試薬分配機構に対する必要性を低下させ、（多数の反応チャンバーに試薬を分配することと同時に行われ得る）試薬の分注に必要とされる時間の量を減らし、そして外部から加えられた電動的手段を使用することなく少量（ｎＬ〜μＬ）の容量の送達を可能にする。
【００３１】
本発明のプラットホーム上における多数の回収チャンバーのアセンブリーはまた、単純化された検出器を使用することができ、それによって、個々の回収／検出チャンバーのそれぞれを、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ技術ととも使用されるこの分野において十分に開発された機構を使用して走査することができる。最後に、本発明のプラットホームには、この分野で知られている液体送達手段（マイクロピペットなど）に適合し得る、サンプルおよび試薬をぞれぞれ充填するためのサンプル進入ポートおよび試薬進入ポートが提供される。
【００３２】
本発明のディスクは、遠心力による分析装置の分野において存在する利点を上回る利点をいくつか有する。第一に、流れが、流体流路の大きさが小さいために層流であるということである；これにより、混合および洗浄などのプロセスのより良好な制御が可能になる。第二に、微細加工によってもたらされる小さな寸法により、より大きな肉眼的システムの場合よりもはるかに広い範囲の回転速度にわたって、そしてその場合よりも大きな信頼性とともに、毛管力に依存した「受動的」な弁操作の使用が可能になる。小型化の既に記載された利点がこれに付加される。
【００３３】
本発明は、流体を移動させるために向心加速度が使用されるマイクロフルーイディックスディスクを使用することによって、現在の技術における様々な問題を解決する。流体を含有する構成要素が、少ない容量を含有するように、従って、アッセイを行うために必要とされる試薬コスト、反応時間および生物学的材料の量が少なくなるように構築されることは、本発明のマイクロフルーイディックプラットホームの利点である。流体を含有する構成要素がシールされること、従って、種々の流体の示差的な蒸発および試薬濃度において生じる変化による実験誤差がなくなることもまた利点である。本発明のマイクロフルーイディックスデバイスは完全に包まれているので、蒸発および光学的変動はともに無視できるレベルにまで低下する。本発明のプラットホームはまた、都合のよいことに「受動的」な混合および弁操作が可能である。すなわち、混合および弁操作が、プラットホーム上の構成要素の構造的な配置（形状、長さ、回転軸に対するプラットホーム表面における位置、および下記において議論されているような濡れ性などの構成要素の内部表面の表面性状など）、およびプラットホーム回転の力学（速度、加速度、方向および方向の変化）の結果として行われ、そしてアッセイの時間設定および試薬送達の制御が可能になる。
【００３４】
本発明のデバイスはまた、ＰＣＲなどのインビトロ増幅反応を行うために、より単純で、変動により強く、かつより経済的なサンプル調製を行う。サンプル処理の機構的な局面はすべて、所定の速度でディスクを回転させる１つのモーターを使用して行われ、それによって流体は微小流路および他のマイクロフルーイディックス構造体を通ってディスク上を移動させられる。これは、ロボットによるピペット操作装置または他の流体移動機構（処理プレートを異なる「装置」に送達するための自動化）またはその両方を含む現在のサンプル調製法よりも好都合である。
【００３５】
本発明は、都合のよいことに、サンプル調製をＰＣＲに対する熱サイクル処理と一体化し、それによってさらなる流体移動工程を省いている。これは、汚染または流体損失の可能性を最小限にする。
【００３６】
本発明のプラットホームは、少なくとも３つの方法で自動化に対する要求を低下させる。第一に、送達される流体の正確な計量に対する要求が、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は参考として本明細書中に明示的に組み込まれる）においてより詳しく記載されているようなディスク上の計量用構造体を使用することによって緩和される。アッセイに必要とされる容量のわずかに過剰なおおよその容量が充填され、そしてディスクを回転させて、適切なマイクロフルーイディック構造体の使用による流体の計量を可能にすることによって、高密度のマイクロタイタープレートアッセイについて従来必要とされるよりもはるかに簡便な（そして安価な）流体送達技術を用いることができる。
【００３７】
第二に、マイクロフルーイディックプラットホームにおける流体「送達」事象の総数が、マイクロタイタープレートに対して少なくなる。プラットホーム上で行われるすべてのアッセイで使用される共通試薬（試薬溶液、緩衝液および酵素基質など）を小分けして分注するマイクロフルーイディック構造体を使用することによって、手作業によるか、または自動化されたピペット操作工程の数が（アッセイの複雑性に依存して）少なくとも半減する。デバイスに対する流体移動を少なくすることにより、総アッセイ時間を少なくすることができる。これらの構造体の例が共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）に開示されている（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００３８】
本発明はまた、試薬をサンプルと混合し、そして得られた反応混合物を洗浄するためのプラットホーム上の手段を提供する。これにより、アッセイ回収チャンバー（１つまたは２つ以上）を別の「洗浄」装置に移す必要性がなくなる。これはまた、アッセイデバイスの操作を少なくし、そして制御され、かつ一体化された流体処理を提供することも少なくする。
【００３９】
本明細書中に開示されている発明は、サンプルおよび供給源に関して柔軟であり、細菌、動物の全血、組織および細胞供給源から核酸を単離することができる。本発明は迅速であり、既存の「自動化された」核酸調節法よりも約５０％以上迅速である。このシステムの核酸生成物は、この分野で知られている方法と等しい品質であるか、またはそれ以上の品質である。このシステムは簡便であり、容易に使用することができ、そして操作者の変動性に依存しないので変動に対して強い。さらに、開示されたプラットホームおよびシステムは自給式で一体型であり、それにより操作者の取扱いおよび誤りの両方が最小限になる。
【００４０】
本発明の装置のいくつかの好ましい実施形態を、本出願の下記の節に、そして図面においてさらに詳しく記載する。
【００４１】
（好適な実施形態の詳細な説明）
本発明は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されているようなマイクロプラットホームおよび微量操作デバイスを提供する。これらは、生物学的サンプルの微量分析的および微量合成的なアッセイを行うのに適合している。
【００４２】
本発明のために、用語「サンプル」は、より複雑な混合物の構成成分として単離または検出されるか、あるいは前駆体種から合成される任意の流体、溶液または混合物を包含することが理解される。特に、用語「サンプル」は、目的とする任意の生物学的な種を包含することが理解される。用語「生物学的サンプル」または用語「生物学的流体サンプル」は、血液、血漿、血清、リンパ、唾液、涙、脳脊髄液、尿、汗、植物抽出物および野菜抽出物、精液ならびに腹水（これらに限定されない）を含む任意の生物学的に由来するサンプルを意味することが理解される。
【００４３】
本発明のために、用語「向心力によって駆動される流体の微量操作装置」は、分析的な遠心分離器およびローター、微量スケールの遠心力による分離装置、そして最も詳しくは、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されているような微量システムプラットホームおよびディスクの取扱い装置を含むものとする。
【００４４】
本発明のために、用語「微量システムプラットホーム」は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、向心力によって駆動されるマイクロフルーイディックスアレイを含むものとする。
【００４５】
本発明のために、「毛管」、「微小毛管」および「微小流路」の用語は、相互に交換可能であること、そして適する場合には濡れ性または非濡れ性のいずれかの材料から組み立てられることが理解される。
【００４６】
本発明のために、「試薬リザーバー」、「アッセイチャンバー」、「流体保持チャンバー」、「回収チャンバー」および「検出チャンバー」の用語は、流体を含む本発明の微量システムプラットホームにおける規定された容量を意味することが理解される。本明細書中に提供されているこれらの構造体の容量能は約２ｎＬから約１０００μＬまでである。
【００４７】
本発明のために、用語「流入ポート」および用語「流体入口ポート」は、流体をプラットホームに加えるための手段を含む本発明の微量システムプラットホームにおける開口部を意味することが理解される。
【００４８】
本発明のために、用語「流出ポート」および用語「流体出口ポート」は、流体をプラットホームから取り出すための手段を含む本発明の微量システムプラットホームにおける規定された容量を意味することが理解される。
【００４９】
本発明のために、用語「毛管接合」は、流体の流れを遅らせるか、または促進させるために表面力または毛管力が利用される毛管または他の流体経路における領域を意味することが理解される。毛管接合は、流体的に接続されている（微小流路などの）フルーイディックス構成要素である、（プラットホーム層内において垂直的に）より大きな深さおよび／または（プラットホーム層内において水平的に）より大きな幅を有する親水性基体におけるポケット、凹部またはチャンバーとして提供される。接触角が９０ｏよりも小さい流体（大部分のプラスチック、ガラスおよびシリカを用いて作製されたプラットホーム表面における水溶液など）の場合、流れは、流路の断面が毛管接合の境界において増大するに従って妨げられる。流れを妨げる力は、流路断面の大きさに逆比例し、そして液体の表面張力に正比例し、流路を含む材料と接触している流体の接触角のコサインが乗算される毛管圧力によってもたらされる。本発明による微小流路における毛管現象に関連する力は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１２日発行）および共同所有で同時係属中の米国特許出願第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）（これらはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）において議論されている。
【００５０】
毛管接合は、少なくとも３通りの方法で組み立てることができる。１つの実施形態において、毛管接合は、１つの構成要素の横方向の大きさの１つまたは２つがもう一方の構成要素の横方向の大きさよりも大きい２つの構成要素の接合部において形成される。一例として、「濡れる」材料または「濡れ性」材料から作製されたマイクロフルーイディックス構成要素では、そのような接合は、共同所有で同時係属中の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）、第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）および同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）に記載されているように毛管の拡大部において生じる。毛管を通る流体の流れは、そのような接合において阻害される。一方、「濡れない」材料または「非濡れ性」材料から作製された構成要素の接合において、チャンバーまたはリザーバーから毛管への出口などの流体経路内の狭窄部は、流れを阻害する毛管接合をもたらす。一般に、構成要素の大きさが（チャンバーなどの）より大きな大きさから（毛管などの）小さい大きさに変化するときに毛管接合が形成される非濡れ性のシステムとは対照的に、濡れ性のシステムでは、構成要素の大きさが（毛管などの）小さい大きさから（チャンバーなどの）より大きな大きさに変化するときに毛管接合が形成されることが理解される。
【００５１】
毛管接合の第２の実施形態が、毛管または流路の示差的な表面処理を有する構成要素を使用して形成される。例えば、親水性（すなわち、濡れ性）の流路は、疎水性（すなわち、非濡れ性）の別の領域を有するように処理することができる。そのような流路を流れる流体は親水性領域を通ってそのように流れるが、流体−蒸気のメニスカスが疎水性域に突き当たったときに流れは妨げられる。
【００５２】
本発明による毛管接合の第３の実施形態が、横方向の大きさおよび表面性状の両方において変化を有する構成要素に提供される。そのような接合の一例が、より大きな横方向の大きさを有する疎水性の構成要素（微小流路またはリザーバー）への微小流路の開口部である。当業者は、本発明による毛管接合が、それらの横方向の大きさにおける種々のサイズ、種々の親水性的な性質、またはその両方を有する構成要素の接合部においてどのように作製され得るかを理解している。
【００５３】
本発明のために、用語「毛管作用」は、本発明のローターまたはプラットホームにおいて流体に加えられる回転運動または向心力が存在しない状態における流体の流れを意味することが理解され、部分的または完全な濡れ性の表面に起因する。
【００５４】
本発明のために、用語「毛管微小弁」は、毛管接合を含む毛管微小流路を意味することが理解される。それによって、流体の流れが妨げられ、そして流体に圧力を加えることにより、典型的には本発明のローターまたはプラットホームを回転させることにより生じる向心力に駆動され得る。毛管微小弁は、接合部における流体に対する流体力学的圧力を増大させることによって、最も好ましくはプラットホームの回転速度を増大させることによって乗り越えることができる毛管接合を含むことが理解される。
【００５５】
本発明のために、用語「犠牲弁」は、流体の流路から除かれ得る柔軟な材料から作製されることが好ましい弁を意味することが理解される。好ましい実施形態において、前記犠牲弁はワックス弁であり、そして赤外線照射を含む様々な加熱手段のいずれかを使用して加熱することによって、最も好ましくは、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（参考として組み込まれる）に記載されているように、プラットホームの表面に位置しているか、またはプラットホームの表面に埋め込まれている加熱エレメントを作動させることによって流体の流路から除かれる。
【００５６】
本発明のために、用語「流体的に連絡している」または用語「流体的に接続されている」により、流体が構成要素間を流れることができるように機能的に相互に接続されている構成要素が規定されることを目的とする。好ましい実施形態において、プラットホームは回転可能なプラットホームを含み、より好ましくはディスクを含む。それによって、ディスク上における流体の動きが、ディスクが回転したときの向心力によって駆動される。
【００５７】
本発明のために、用語「空気移動流路」は、プラットホーム上の構成要素（微小流路、チャンバーおよびリザーバーなど）と連続しているプラットホーム表面のポートであって、流体の動きによってプラットホームおよびローターの構成要素から空気を追い出すことができる通気孔および微小流路を含むプラットホーム表面のポートを含むことが理解される。
【００５８】
本発明のマイクロプラットホーム（好ましくは「ディスク」であり、これ以降は「ディスク」とまとめて示される；本発明のために、「マイクロプラットホーム」、「微量システムプラットホーム」および「ディスク」の用語は交換可能であると見なされる）は、１つまたは多数の微量合成的または微量分析的なシステム（これは本明細書中では「マイクロフルーイディックス構造体」と呼ばれる）を含むために提供される。そのようなマイクロフルーイディックス構造体は、ディスクが回転したときに流体が構成要素間を流れることを可能にするように機能的に相互に相互に接続されている、本明細書中にさらに詳しく記載されているような関連した構成要素の組合せを含む。これらの構成要素は、下記に記載されているように、ディスクに対して一体的に微細加工され得るか、あるいはディスクに取り付けられているか、またはディスクに置かれているか、またはディスクと接触しているか、またはディスクに埋め込まれているモジュールとして微細加工され得る。本発明のために、用語「微細加工された」は、サブミリメートルのスケールでこれらの構造体が製造され得るプロセスをいう。このようなプロセスには、当業者が熟知している成形、フォトリソグラフィー、エッチング、プレス加工および他の手段が含まれるが、これらに限定されない。
【００５９】
本発明はまた、本発明のディスクを操作するための微量操作デバイスを含む。この場合、ディスクは、流体の流れをディスク上において生じさせる向心力を提供するデバイス内で回転させられる。従って、デバイスは、制御された回転速度でディスクを回転させるための手段、ディスクの回転を開始および停止させるための手段、そして好都合には、ディスクの回転方向を変化させるための手段を提供する。電気機械式手段および制御手段の両方が、本明細書中においてさらに記載されているように、本発明のデバイスの構成要素として提供される。使用者インターフェース手段（キーパッドおよびディスプレイなど）もまた、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）においてさらに記載されているように提供される。
【００６０】
温度制御エレメントが、プラットホームの温度を、その上にある流体をインキュベーションしているときに制御するために提供される。従って、本発明は、加熱ランプ、直接的なレーザーヒーター、ペルチェ熱ポンプ、抵抗ヒーター、超音波ヒーターおよびマイクロ波励起ヒーターを含む加熱エレメント、ならびにペルチェ素子およびヒートシンク、放射的な熱喪失を容易にする放射ヒートフィンおよび他の構成要素を含む冷却エレメントを提供する。熱素子は、好ましくは、特定の領域または多数の領域にわたってプラットホームの温度を制御するために配置される。好ましくは、加熱エレメントおよび冷却エレメントは、マイクロフルーイディックス構成要素（最も好ましくは、本明細書中に記載されているような微小流路）と熱的に接触している熱調節層をプラットホーム表面に含む本発明のプラットホームを含む。プラットホームにおける任意の特定領域（好ましくは、特定の温度調節されている領域のいずれかにおける微小流路）の温度は、抵抗温度素子（ＲＴＤ）、サーミスター、液晶複屈折センサーによって、あるいはＩＲ特異的検出器を使用する赤外線測定によってモニターされ、そしてフィードバック制御システムによって調節することができる。本発明の微量システムプラットホームにおける温度制御は、最も好ましくは、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されている方法およびデバイスを使用して達成される。
【００６１】
好ましい実施形態において、微量システムプラットホーム表面の様々な部分は、米国特許第６，０６３，５８９号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されているような一体的な加熱エレメントを使用して制御される温度の領域（「熱領域」または「熱アレイ」と呼ばれる）を提供するために変更される。より好ましい実施形態において、微量システムプラットホーム表面のそのような部分は、熱制御エレメントのアレイで構成され、最も好ましくは、異なる温度を有するプラットホーム表面の作製された隣接領域である。好ましい実施形態において、プラットホームはまた、共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されているような他の構成要素、最も好ましくは、流路およびおよび微小流路を含み、それによって、流体は、異なる温度を有する異なる領域のそれぞれを少なくとも１回横切るか、またはより好ましくは数回横切る。これらの実施形態において、時間流体の量は、任意の特定の熱領域に含まれ、従って、任意の特定の温度において、領域内の流路の経路長、流路の水力直径の二乗、およびプラットホームの回転速度の二乗に依存する。好ましい実施形態において、アレイは、互いに隣接する異なる温度の少なくとも２つまたは３つの領域を含む。いくつかの実施形態において、熱領域は矩形の形状であり、一方、他の実施形態では、熱領域は、回転軸から遠位の位置における環直径が回転軸から近位の位置よりも大きい楔形状である。
【００６２】
本発明のプラットホームの好ましい実施形態において、本発明のプラットホームの表面に組み立てられた高い温度の熱アレイおよび領域は、熱的な加熱エレメントを含む。好ましい実施形態において、この熱的な加熱エレメントは抵抗ヒーターエレメントまたはサーモフォイルヒーターであり、これは電気的に絶縁されているプラスチックに包まれたエッチングフォイル加熱エレメントである（Ｍｉｎｃｏから得られるＫａｐｔｏｎ）。本発明のプラットホームを含む抵抗ヒーターエレメントは、共同所有の米国特許第６．０６３，５８７号に記載されている通りである。簡単に記載すると、前記抵抗ヒーターエレメントは、導電性インクおよび抵抗性インクでスクリーン印刷され得る電気的に不活性な基板を組み合わせて含む。この場合、導電性インクは一定のパターンでスクリーン印刷され、そして抵抗性インクは導電性インクパターンの上に所定のパターンでスクリーン印刷され、抵抗性インクは導電性インクと電気的に接触しており、そして導電性インクに加えられた電気的電位により、電流が抵抗性インクを横切って流れ、抵抗性インクにより熱が発生する。そのような構造体は、「電気的に抵抗性のパッチ」として本明細書中では定義される。好ましくは、導電性インクは、銀の導電性インクであり、Ｄｕｐｏｎｔ５０２８、Ｄｕｐｏｎｔ５０２５、Ａｃｈｅｓｏｎ４２３ＳＳ、Ａｃｈｅｓｏｎ４２６ＳＳおよびＡｃｈｅｓｏｎ ＳＳ２４８９０などであり、抵抗性インクは、例えば、Ｄｕｐｏｎｔ７０８２、Ｄｕｐｏｎｔ７１０２、Ｄｕｐｏｎｔ７２７１、Ｄｕｐｏｎｔ７２７８またはＤｕｐｏｎｔ７２８５あるいはＰＴＣ（正の温度係数）インクである。代わりの実施形態において、抵抗ヒーターエレメントは、抵抗インクパターンおよび導電性インクパターンの上にスクリーン印刷された誘電インクをさらに含むことができる。
【００６３】
本発明は、回転させることができる分析的／合成的な微容量アッセイプラットホームである特に改変されたマイクロプラットホームと、回転の結果としてプラットホーム上の向心力から生じる流体の動きがプラットホーム上に達成されるようにプラットホームを操作する微量操作デバイスとの組合せを含む。本発明のプラットホームは円形のディスクであることが好ましく、かつ好都合である。しかし、プラットホーム上の流体を求心性にするように回転し得るプラットホームはどれも、本発明の範囲に含まれるものとする。本発明の微量操作デバイスは、共同所有で同時係属中の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）においてさらに詳しく記載されている。
【００６４】
流体（試薬、サンプルおよび他の液体成分を含む）の動きは、プラットホームの回転による向心加速度によって制御される。微量システムプラットホーム上における特定のマイクロフルーイディックス構造体に適切な速度および圧力のもとで流体が流れるために必要とされる向心加速度の大きさは、プラットホームの有効半径、微小流路の内径、回転方向に対するプラットホーム上の微小流路の位置角度、およびプラットホームの回転速度（これらに限定されない）を含む様々な要因によって決定される。本発明の方法のいくつかの実施形態において、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されているように、計量されない量の流体（サンプルまたは試薬溶液のいずれか）がプラットホームに加えられ、そして計量された量が流体リザーバーから微小流路に移される。好ましい実施形態において、本発明のプラットホームに供給される流体サンプルの計量された量は約１ｎＬ〜約５００μＬである。これらの実施形態において、１つまたは多数の計量用毛管を含む計量用マニホールドが、マイクロフルーイディックス構造体の複数の構成要素に流体を分配するために提供される。
【００６５】
本発明のプラットホームの構成要素は互いに流体的に接続されている。好ましい実施形態において、流体的な接続は、本発明のプラットホームの表面を含む微小流路によって提供される。微小流路のサイズは、特定の適用によって、そして本発明のプラットホームおよび方法の個々の実施形態のそれぞれに必要とされる流体の量および送達速度によって最適に決定される。微小流路のサイズは、０．１μｍから、ディスクの厚さ（例えば、約１ｍｍ）に近い値にまで変化させることができる。好ましい実施形態において、微小流路の内径は０．５μｍ〜約５００μｍである。微小流路およびリザーバーの形状は、必要に応じて、台形状、円形状または他の幾何形状であり得る。微小流路は、好ましくは、約０．１ｍｍ〜２５ｍｍの厚さを有する微量システムプラットホームに埋め込まれる。この場合、プラットホームの厚さ寸法にわたる微小流路の断面寸法は１ｍｍ未満であり、そしてプラットホームの前記断面寸法の１パーセント〜９０パーセントとすることができる。サンプルリザーバー、試薬リザーバー、反応チャンバー、回収チャンバー、検出チャンバーならびにサンプル入口ポートおよびサンプル出口ポートは、好ましくは、約０．１ｍｍ〜２５ｍｍの厚さを有する微量システムプラットホームに埋め込まれる。この場合、プラットホームの厚さ寸法にわたる微小流路の断面寸法はプラットホームの前記断面寸法の１パーセント〜７５パーセントとすることができる。好ましい実施形態において、そのような流路を通る流体の送達が、所望する構成要素の間における流体の動きを駆動させるために十分な時間および回転速度でプラットホームを同時に回転させることによって達成される。
【００６６】
入口および出口（流入および流出）のポートは、流体成分の導入または取り出しのために使用される本発明のマイクロプラットホームの構成要素である。流入ポートは、サンプルおよび試薬をディスク上に置くか、またはディスクに注入することができるように提供される。これらのタイプのポートは、一般にはディスクの中心の方に配置される。出口ポートもまた、生成物をディスクから取り出すことができるように提供される。ポートの形状および設計は、特定の適用に従って変化する。例えば、サンプル入口ポートは、特に、毛管作用によってサンプルがディスク内に効率的に吸い込まれることが可能であるように設計される。さらに、ポートは、自動化されたサンプル／試薬の充填または生成物の取り出しが可能であるように構成され得る。進入ポートおよび流出ポートは、最も好都合にはアレイ状に提供され、それによって多数のサンプルがディスクに加えられるか、またはマイクロプラットホームからの生成物の取り出しを行うことができる。
【００６７】
本発明のプラットホームのいくつかの実施形態において、入口ポートおよび出口ポートは、プラットホームのリザーバーに流体を送達する手動ピペッターまたは他の手段を使用することに適合する。代替的で、好都合な実施形態において、プラットホームは、自動化された流体充填デバイスを使用することに適合する。そのような自動化されたデバイスの一例が、プラットホームの表面に沿って半径方向の方向で動くロボットアームに位置する１個のピペットヘッドである。この実施形態において、プラットホームは、適切なリザーバーに向かうために半径方向に移動するピペットヘッドの下部に方位角方向で回転モーターの中心軸に割り出しすることができる。
【００６８】
ディスク上の空気取扱いシステムには空気移動流路も含まれる。それによって、流体の動きにより、空気が、流体を含有する微小流路に接続し、流体の運動方向に対して逆行する流路を通って追い出され、それにより、流体の動きをさらに駆動する陽圧がもたらされる。
【００６９】
ディスクなどの本発明のプラットホームおよびそのようなプラットホームを含むマイクロフルーイディックス構成要素は、好都合には、個々の適用に適した様々な組成および表面コーティング物を有して提供される。プラットホームの組成は、構造的条件、製造プロセスおよび試薬の適合性／化学的抵抗性の関数である。詳細には、無機の結晶性材料または非晶質材料（例えば、シリコン、シリカ、石英）、不活性な金属から、あるいはプラスチック（例えば、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）、アセトニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ）、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリプロピレンおよびメタロセン）などの有機材料から製造されるプラットホームが提供される。このようなプラットホームは、下記に記載されているように非修飾の表面または修飾された表面とともに使用され得る。プラットホームはまた、ポリウレタンおよびポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）などの熱硬化性材料から作製することができる。これらの材料のコンポジットまたは組合せから作製されたプラットホームまたは本発明によって提供される：例えば、プラットホームの検出チャンバーを含む光学的に透明なガラス表面がその中に埋め込まれているプラスチック材料から製造されたプラットホーム。あるいは、異なる材料から作製された層から構成されるプラットホームを作製することができる。これらの材料の表面の性質は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されているように特定の適用に対して改変することができる。
【００７０】
好ましくは、ディスクには、微細加工された機械的、光学的および流体工学的な制御要素が、例えば、プラスチック、シリカ、石英、金属またはセラミックスから作製されたプラットホーム上に組み込まれる。これらの構造体は、下記においてさらに詳しく記載されているように、成形、フォトリソグラフィー、エッチング、プレス加工または他の適切な手段によって、サブミリメートルのスケールで組み立てられる。マイクロフルーイディックスおよびリザーバーの個々の組合せ、または共有されるそのようなリザーバーがそれらに流体的に接続されて提供される多数のマイクロフルーイディックス構造体を含むプラットホームもまた本発明によって包含されることもまた認識される。そのようなプラットホームの一例が図１に示されている。
【００７１】
プラットホームの製造および組み立て
本発明の微量システムプラットホームを含む基板に埋め込まれたマイクロフルーイディックス構造体が提供される。プラットホームは、好ましくは、ともに結合される別個の構成要素を含有する層として製造され、そして組み立てられる。図１に例示されているように、本発明のプラットホームの例示された実施形態は、リザーバー層およびマイクロフルーイディックス層の２つの層を含む。さらなる層を有するプラットホームもまた本発明の範囲に含まれる。
【００７２】
プラットホームのリザーバー層は、アクリル、ポリスチレン、ポリカーボネートまたはポリエチレンなどの熱可塑性材料から製造される。そのような材料の場合、製造方法には、機械加工および従来の射出成形が含まれる。射出成形の場合、プラットホームの特徴を規定するために使用される金型インサートは、この分野で知られている機械加工、放電加工および他の手段の標準的な方法を使用して作製することができる。
【００７３】
プラットホームのリザーバー層はまた、熱、放射線または他のエネルギー源にさらされるまでは液体形態で存在する熱硬化性材料または他の材料から製造することができる。熱硬化性材料の例には、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、ポリウレタンまたはエポキシ樹脂が含まれる。典型的には、これらの材料は２成分で製造者から得られる：この２成分は所定の割合で一緒に混合され、金型に射出されるか、または金型に注がれ、そして熱を与えて、プレポリマー液に存在するモノマーの架橋を開始させ、そして完了させる。プレポリマー液を金型に迅速に射出し、その後、その部分を架橋または硬化させるプロセスは、反応射出形成（ＲＩＭ）と呼ばれることが多い。プレポリマー液を金型に注ぎ、その後、その部分を架橋または硬化させるプロセスは、注型と呼ばれることが多い。ＲＩＭ用または注型用の金型インサートは、この分野で知られている機械加工、放電加工および他の手段の標準的な方法を使用して作製することができる。
【００７４】
プラットホームのマイクロフルーイディックス層もまた、アクリル、ポリスチレン、ポリカーボネートまたはポリエチレンなどの熱可塑性材料から製造することができる。流路およびキュベットの大きさは、リザーバー層に見出される大きさよりもはるかに小さくすることができるので、これらの材料を用いた典型的な製造方法には、機械加工および従来の射出成形だけでなく、圧縮／射出成形および型押しまたは圧印加工もまた含まれる。射出成形の場合、プラットホームのこの層の特徴を規定するために使用される金型インサートは、機械加工または放電加工などの従来の方法を使用して作製することができる。従来の方法では細かすぎて作製することができない特徴を有する金型インサートの場合には、様々な微細加工技術が使用される。これらには、パターンがフォトレジストおよびフォトマスクの使用によりシリコンウエハー基板上に作製されるシリコン微細加工が含まれる（Ｍａｄｏｕ、１９９７、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ）。シリコンウエハーがエッチング剤に付されると、フォトレジストは、フォトレジスト下のシリコンへのエッチング剤の侵入を妨げ、同時に、エッチングをシリコンの露出領域において生じさせることができる。このようにして、パターンがシリコンにエッチングされ、このパターンは、型押しによって直接的に微細加工されたプラスチック部品を作製するために使用することができる。このプロセスにおいて、エッチングされたシリコンは、高圧のもと、プラスチックのガラス転移温度に近い温度で平坦な熱可塑性シートと接触させられる。その結果、パターンがプラスチックにネガで移される。
【００７５】
エッチングされたシリコンはまた、例えば、金属ニッケルを使用する電気メッキによって金属の金型インサートを作製するためにも使用することができる。異方性または等方性の湿式エッチングあるいは深部反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）などの様々な技術のいずれかを使用してエッチングされたシリコンは、金属性金型の基部として役立ち得る。ニッケルのシード層がシリコン上に蒸発により蒸着される：電気伝導性のシード層が形成されると、従来の電気メッキ技術を使用して厚いニッケル層を組み立てることができる。典型的には、その後、シリコンは除かれる（Ｌａｒｓｓｏｎ、１９９７、Ｍｉｃｒｏ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｂｕｌｌ．１：３）。その後、インサートは、従来の射出成形または圧縮／射出成形において使用される。
【００７６】
金型インサートのためにシリコンを微細加工することに加えて、金型は、シリコンをエッチングすることなくフォトリソグラフィーを使用して代わりに作製することができる。フォトレジストのパターンが、シリコン上に、または他の適切な基板上に作製される。シリコンを微細加工する場合のようにシリコンウエハーをエッチングするのではなくむしろ、フォトレジストパターンおよびシリコンが、この分野で知られている電気メッキ、熱気相蒸着または他の手段によって金属化される。金属の浮き彫りパターンは、その後、上記に記載されているような圧印加工、射出成形または圧縮／射出成形の金型として役立つ。
【００７７】
プラットホームのマイクロフルーイディック層もまた、リザーバー層の製造に関して上記に記載されているように熱硬化性材料を使用して製造することができる。この場合、マイクロフルーイディックス層の熱硬化物に対する金型パターンは、上記に記載されているように調製される。反応−射出成形および注型は射出成形の高い圧力および温度を必要としないので、より広範囲の金型パターンを使用することができる。シリコンまたは金属金型インサートの使用に加えて、記載されているようなフォトレジストパターンはまた、金型浮き彫りそのものとして使用することができる。フォトレジストは射出成形の高い圧力および温度に耐えられないが、注型またはＲＩＭのより穏やかな条件は著しい損傷をもたらさない。
【００７８】
プラットホームの組み立ては、マイクロフルーイディック層のリザーバー層への位置決めおよび取り付けを含む。プラットホーム上のマイクロフルーイディックス構造体が本明細書中に記載されているようなアッセイを行うことに関して有用であるためには、リザーバー層内のいくつかのマイクロフルーイディックス経路をマイクロフルーイディックス層内のいくつかのマイクロフルーイディックス経路に接続しなければならない。これらのマイクロフルーイディックス経路の位置決めは、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層における基点マーカーの光学的アラインメントによって、あるいはピンを有するマイクロフルーイディック層における穴もしくは凹部、またはリザーバー層における突起した特徴の機械的なアラインメントによって達成され得る。位置決めの必要な許容差は、マイクロフルーイディックス層におけるマイクロフルーイディックス経路よりもはるかに大きくなるようにリザーバー層内のマイクロフルーイディックス経路を設計することによって、またはその逆によって緩和され得る。
【００７９】
取り付けは、コンフォーマルシール、ヒートシールまたは融合結合、両面接着テープまたはヒートシール可能なフィルムを用いた結合、紫外線（ＵＶ）硬化性接着剤または熱硬化性接着剤を用いた結合、化学的結合、または溶媒を用いた結合を含む多くの方法で達成され得る。
【００８０】
コンフォーマルシールに必要な条件は、層の一方または両方がエラストマー材料から作製されていること、そして結合させる表面が、２つの層の物理的接触を制限し得るほこりまたは破片を有しないことである。好ましい組み立て方法では、エラストマー性のマイクロフルーイディックス層が堅いリザーバー層に関して位置決めされ、その後、堅いリザーバー層に押し付けられる。エラストマー性のマイクロフルーイディックス層は、好都合にはシリコーンから作製することができ、堅いリザーバー層は、好都合にはアクリルまたはポリカーボネートから作製することができる。手動圧により、層をファンデルワールス力によって接着させることができる。
【００８１】
ヒートシールまたは融合結合に必要な条件は、リザーバー層およびマイクロフルーイディックス層の両方が熱可塑性材料から作製されていること、そしてシールが、非晶質ポリマーの場合には層材料の両方のガラス転移温度よりも高い温度で生じること、あるいは半結晶性ポリマーの場合には層材料の両方の融解温度よりも高い温度で生じることである。好ましい組み立て方法では、マイクロフルーイディックス層がリザーバー層に関して位置決めされ、その後、リザーバー層に押し付けられる。その後、このコンポジットディスクは、２つの平坦な加熱されたブロックの間に置かれ、圧力が、加熱されたブロックによってこのコンポジットに加えられる。コンポジットディスクの各面における温度対時間プロフィルを調節することによって、そしてコンポジットシステムに加えられる圧力対時間プロフィルを調節することによって２つの層の結合を可能にして、それぞれの層における特徴の変化を最小限にする時間−温度−圧力プロフィルを決定することができる。例えば、２５０ｐｓｉの一定圧力のもとでアクリルのガラス転移温度のすぐ上の温度に室温から１時間かけて２つのアクリル製ディスクを加熱することは、２５０μｍ幅のフルーイディック流路の最小変動を考慮する１つの方法である。別の組み立て方法において、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層の結合表面が放熱ランプで非接触様式で別々に加熱され、そして結合表面がそれらのガラス転移温度に達したときに、マイクロフルーイディックス層がリザーバー層に関して位置決めされて、リザーバー層に押し付けられる。
【００８２】
両面接着テープまたはヒートシール可能なフィルムを使用して、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層を結合させることができる。結合させる前に、流体的な連絡を２つの層の間で可能にする穴が最初にテープ（またはフィルム）に開けられ、テープ（またはフィルム）がリザーバー層に関して位置決めされて、リザーバー層に貼り付けられ、そしてマイクロフルーイディックス層がテープ（またはフィルム）／リザーバー層コンポジットに関して位置決めされて、テープ（またはフィルム）／リザーバー層コンポジットに貼り付けられる。ヒートシール可能なフィルムを表面に結合させるためには、フィルムの温度を、非晶質ポリマーの場合にはフィルムの接着剤ポリマー材料のガラス転移温度よりも高い温度に、あるいは半結晶性ポリマーの場合にはフィルムの接着剤ポリマー材料の融解温度よりも高い温度に上げることが必要である。接着テープまたはヒートシール可能なフィルムを用いた結合の場合、十分な結合が、典型的には手動圧で達成され得る。
【００８３】
光重合性ポリマー（例えば、ＵＶ硬化性接着剤）または熱硬化性ポリマーを使用して、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層を接着させることができる。１つの方法において、この接着剤が層の一方または両方に塗布される。塗布方法には、塗装、スプレー、浸せき塗装またはスピンコーティングが含まれる。接着剤を塗布した後、層が組み立てられ、そして接着剤の架橋または硬化を開始させて完了させるために紫外線または熱にさらされる。別の方法では、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層はそれぞれ、接着剤のためにのみ使用され得る１組の流体流路とともに製造される。これらの流路は、例えば、アッセイのために使用される流体流路またはキュベットを取り囲むことができる。マイクロフルーイディックス層がリザーバー層に関して位置決めされ、そしてリザーバー層に押し付けられる。接着剤が様々な指定流路にピペットで注入され、そして接着剤でこれらの流路が満たされた後、組み立てられたシステムは、接着剤の架橋または硬化を行わせる紫外線または熱にさらされる。
【００８４】
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）またはシリコーンが最初に酸素プラズマにさらされ、その後、同様に処理されたシリコーン表面に周囲の環境で押し付けられた場合、２つの表面は接着される。プラズマ処理によってシリコーンの表面はシラノール表面に変換され、そしてこれらの表面が一緒にされたときにシラノール基がシロキサン結合に変換されると考えられる（Ｄｕｆｆｙ他、１９９８、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：４９７４〜４９８４）。この化学的な結合方法は、シリコーンのマイクロフルーイディックス層およびリザーバー層を接着させるために使用される。
【００８５】
溶媒結合に必要な条件は、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層の両方の結合表面が揮発性溶媒で溶媒和され得るか、または可塑化され得ることである。溶媒結合の場合、結合表面は適切な溶媒和流体がそれぞれ塗装されるか、または適切な溶媒和蒸気にさらされ、その後に位置決めがなされ、一緒に押し付けられる。可塑化により、ポリマー分子をより可動性にすることができ、そして表面を接触させたときにポリマー分子は絡み合う；溶媒が蒸発すると、ポリマー分子はもはや可動性ではなく、分子は絡まったままであり、それにより、物理的な結合が２つの表面の間にもたらされる。別の方法では、マイクロフルーイディックス層およびリザーバー層がそれぞれ、溶媒のためにのみ使用され得る１組の流体流路とともに製造され、そして上記に記載されているようにＵＶ硬化性接着剤または熱硬化性接着剤によって層が結合されるのと非常に類似して層が結合させられる。
【００８６】
組み立てられると、マイクロフルーイディックマニホールドの内側表面をパリレンコーティング剤で不動態化することができる。パリレンは、組み立て後のマイクロフルーイディックデバイスの内側の流体接触表面にバリア層を形成する気相蒸着型コンフォーマルポリマーコーティング剤である。このコーティング剤により、流体と、デバイスを組み立てるために使用された材料との間における物質の何らかの交換を防げる不透過性層が形成される。低い温度の気相蒸着方法を使用することにより、デバイスをその最終形態で製造し、その後、不動態化することができる。この不動態化法は、アッセイの性能を向上させるために使用することができる。特に、接着剤がディスクの組み立てにおいて使用される場合、接着剤物質（またはプラスチック基板またはカバー）によって流体が汚染される可能性がある。接着剤から染み出る妨害物質、または接着剤による物質の吸着および結合は、化学反応または生化学的反応を妨害し得る。これは、高温ではより大きな問題になり得るか、あるいは溶媒の場合には強酸または強塩基が必要になる。
【００８７】
温度制御エレメントを含む電気的または電子的なプラテンの組み立て
本発明は、熱サイクル処理用チャンバーおよび犠牲弁などのマイクロフルーイディックス構造体に対応するようにプラテンに配置された温度制御エレメントを含む電気的または電子的なプラテンを提供する。プラテンおよびマイクロフルーイディックス構造体は、それぞれのプラットホーム層に構成要素を相互に正しく配置させるための基点または他の位置決め物を使用してアラインメントされる。
【００８８】
本発明はまた、プラテンおよびマイクロフルーイディックプラットホームを回転させるための微量操作装置を提供し、これは、電気的接触がデバイスと回転中のプラテンとの間で維持されることを可能にするスリップリング構造体を回転中心軸または回転軸において含むことが最も好ましい。温度制御エレメントは、抵抗ヒーターおよびペルチェ素子を含むサーミスターおよび加熱エレメントを使用してディスク表面の特定位置において任意の特定温度を維持するためにデバイスにおいて提供される。このデバイスは、マイクロフルーイディックスディスクの回転を制御し、そしてマイクロフルーイディックスディスクと一緒に回転するプラテンに対する電気的シグナルをリアルタイムで分配し、かつ受け取る。
【００８９】
デバイスとプラテンとの関係を図２０に例示する。図に関して、プラテン５０９が、２４チャンネルのスリップリング（Ｌｉｔｔｏｎ社から市販、パーツ番号ＡＣ６０２３−２４）を含む中心軸５１０に挿入されている。中心軸の周りにおけるプラテンの回転は、Ｍｉｃｒｏｍｏ社から市販されているエンコーダー（パーツ番号３５５７Ｋ０１２ＣＲ）などのエンコーダーをも含むことが好ましい駆動モーター５０７によって駆動ベルト５０８を介して制御される。駆動モーター５０７は、駆動モーター動力線５０５、および適用される場合にはエンコーダーシグナル配線５０６を介してデバイスによって制御される。
【００９０】
デバイスは、ＰＣなどのコンピューターを含むことが最も好ましいマイクロプロセッサー５０１によって制御される。プラットホームの回転は、例えば、Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ社（パーツ番号ＰＩＣ−ＳＥＲＶＯ）から市販されているようなサーボモーター制御器５０３によって制御される。サーボモーター５０３は、Ｓｋｙｎｅｔ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ社（パーツ番号ＡＲＣ−２１３３）から市販されている電源５０４を備えている。サーボモーターは、例えば、ＰＣのＣＯＭポートに接続されたシリアルポート変換器（パーツ番号Ｚ２３８−４８５、Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ社）を使用するインターフェースを介してＰＣによって制御される。
【００９１】
プラテンに対する電気出力を制御するために制御システムを有するデバイスもまた提供される。複線ケーブル５１１により、スリップリングは、温度センサー配線５１２によってＰＣ内の市販のＡ／Ｄボード盤（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｂｏａｒｄｓ、パーツ番号ＣＩＯ−ＤＡＳ１６００）に接続されている比例・積分・微分（ＰＩＤ）回路に接続される分岐ボード盤５１７に接続される。この回路は、下記においてより詳細に開示されているプラテン表面のサーミスターからの温度データを受け取り、そしてプログラム可能な電流源５１５および電源５１６によって温度制御エレメントに対する電流送達を制御する。
【００９２】
プラテン自体は図２１に平面図で示されている。プラテンは、電子的エレメント（電気リード線、サーミスター、ペルチェ素子、マイクロフルーイディックスディスクとの熱接触を提供するための青銅ブロック、および熱を消散させるための放射フィンを含む）が取り付けられている印刷された回路ボード盤５５１から組み立てられることが最も好ましい。
【００９３】
図２１は、ペルチェ素子５５４とともに図に例示されているプラテンにおける温度制御エレメントの配置を示している。プラテンは、マイクロフルーイディックスディスクにおけるマイクロフルーイディックス構造体に対応させるためにプラテン表面に配置された青銅の熱接点５５２および５５３を有する。青銅の接点５５２は、温度検知エレメントを収容するために、その中に埋め込まれた溝５５５を有する。それぞれの組合せにおける熱接点との間には、ペルチェ素子５５４が配置されている。図には、青銅の熱接点５５７および５５８、溝５５９ならびにペルチェ素子５５８を含む別の温度制御エレメントもまた例示されている。これらのエレメントを配置することにより、特定のマイクロフルーイディックス構造体の多数の構成要素（例えば、熱サイクル処理用チャンバーおよび溶解チャンバーなど）の温度制御および加熱が可能になる。
【００９４】
プラテンにおける温度制御エレメントを制御する電気リード線は、図２２においてより詳細に示されている。ペルチェ素子５５４は、６０７および６０８を介して接続されているリード線６０１および６０５によって制御される。溝５５５に含有されるサーミスター６０６は、６０９および６１０を介して接続されているリード線６００および６０２によって制御される（すなわち、温度情報が、加熱時または冷却時のサーミスターにおける電流の流れに対する抵抗の変化の形態でＰＣ内の温度制御エレメントに伝えられる）。同様に、ペルチェ素子５５８は、６１２および６１３を介して接続されているリード線６０３および６０５によって制御される。溝５５９に含有されるサーミスター６１１は、６１４および６１５を介して接続されているリード線６０２および６０４によって制御される（すなわち、温度情報が、加熱時または冷却時のサーミスターにおける電流の流れに対する抵抗の変化の形態でＰＣ内の温度制御エレメントに伝えられる）。プラテン上のエレメントとスリップリングとの電気的接続を構築することにおいて、同じリード線を「アース」として使用すること（例えば、サーミスター６０６およびサーミスター６１１との間のリード線６０２に対する共通した接続を参照のこと）は、エレメントあたりに使用される接続の数を保存し、プラテンあたり８個までのエレメントの制御を可能にする。
【００９５】
温度制御エレメントの構造が図２３に断面で示されている。ペルチェ素子５５４は、プラテン表面５５１において青銅の接点５５２と５５３との間に配置され、そしてボルト６５３および６５４を用いてつながれる。青銅の接点５５２および５５３は、ペルチェ素子５５４に対して、そしてペルチェ素子５５４にから熱を移動させるための熱源およびヒートシンクとして作用する。マイクロフルーイディックディスクは青銅の接点５５２に位置する。ディスクを加熱するとき、ペルチェ素子５５４の上部表面が青銅の接点５５２を加熱し、青銅の接点５５３が冷却される。ディスクを冷却するとき、ペルチェ素子５５４の上部表面が青銅の接点５５４を冷却し、青銅の接点５５３を加熱する。さらなるアルミニウムヒートシンク６５２が、青銅の接点５５３と熱的に接触した状態で配置される。これにより、さらなるヒートシンク能力がもたらされ、ペルチェ素子５５４の性能が高められる。アルミニウムのヒートシンク６５２は、ねじ６５１および６５５を使用してプラテン５５１に取り付けられる。青銅の接点５５２は、サーミスターの温度感度を増大させるアルミナが満たされたエポキシ樹脂６５０を含有するくぼみにサーミスター６０６を含有する。熱グリースが、部品間の熱接触を増大させるために、部品５５２、５５４、５５３および６５２の間に塗布される。
【００９６】
本発明のプラテンを使用する際、本発明のプラットホームは、青銅の接点とプラスチックのマイクロフルーイディックス層との間に熱グリースを使用して組み立てられる。あるいは、青銅の接点が、柔軟なプラスチックのマイクロフルーイディックス層に機械的に固定されている凸状の層として提供される。
【００９７】
本発明のプラテンの代わりの実施形態には、１つまたは多数のマイクロプロセッサーを含むいわゆる「インテリジェント」プラテンが含まれ、それによって、スリップリングと、プラテンの基板を含む印刷された回路ボード盤との間の接続の組合せを減らすことができる。ＢＡＳＩＣ ＳＴＡＭＰ ＩＩの埋め込み型制御器などの一体化された回路パッケージは、プラテンの電気回路を介するシグナルの分配を制御するためにＰＣによって事前にプログラムすることができる。それによって、入力電源とアースとの接続のみがスリップリングとプラテンとの間に必要となるだけである。
【００９８】
ＤＮＡサンプル調製プラットホーム
本発明は、細菌細胞または真核生物（最も好ましくは哺乳動物）細胞からプラスミドＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを調製するためのＤＮＡサンプル適用プラットホームを提供する。本発明のこの局面は、本明細書中では単一のマイクロフルーイディックス構造体について記載される。しかし、多数のこれらのマイクロフルーイディックス構造体を含むプラットホームが提供され、そして本発明によって包含される。この場合、本明細書中に記載されている多数のマイクロフルーイディックス構造体がプラットホーム上に提供されている。
【００９９】
次に本発明をより十分に説明するために図を参照すると、図１４は、マイクロフルーイディックディスクのサンプル処理構造の１つの実施形態を詳細に例示している。向きに関して、ディスクの中心は図の上方にある。チャンバー１００５は、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さを有し、幅が約０．７ｃｍ〜１．５ｃｍで、長さが約０．４ｃｍ〜約０．８ｃｍであり、かつサンプル入力チャンバーおよび混合チャンバーの組合せにおいて約５０μＬ〜約１．０ｍＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：１．４３１５ｃｍ、長さ：０．７８７９ｃｍ）を有する。チャンバー内には、ディスク回転時に、特に、方向を迅速かつ／または反復的に変化させるディスク回転時に、チャンバー内に乱流的な流体の動きを生じさせるために、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの幅および約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの長さ（幅：０．１１５５ｃｍ、長さ：０．３７２０ｃｍ）である混合用バッフル１００６が存在する。回転の中心から最も半径方向に最も離れたチャンバー１００５内の位置には、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さを有するスロット１００８（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：１．０５３７ｃｍ、長さ：０．０７９４ｃｍ）が存在し、スロットには、フィルター１００９が設置されたフリット材が含まれる。フリット材はＰｏｒｅｘ、Ｘ−４５８８（７０μｍの細孔サイズ）によって製造され、フィルターはＷｈａｔｍａｎろ紙＃５４であり、これは、ディスクにおいてフリット材から半径方向のさらに外側に置かれる。フリット材は、この適用においては、多孔質メンブランとして液体を通過させるが、沈殿物を保持するフィルターとして作用する。この場合のろ紙は、最終ろ過工程として使用されている；フリットは沈殿物の大部分をろ過するが、ろ紙は、沈殿物をほとんど通り抜けさせないより細かい細孔サイズを有する。チャンバー１００５はまた、傾斜部１００７を備えている。この傾斜部は、プラットホームの深さが半径方向の外向き方向で減少し、かつチャンバーの底から約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍ（深さ：０．２２８６ｃｍ）の深さまで隆起して、フィルター用スロット１００８の内側縁を形成している；スロットの内側部分の深さ（深さ：０．１５２４ｃｍ）はチャンバー１００５の底とディスクの上部表面との中間であり、従って、十分な速度でディスクが回転したときに流体が通り抜けるすき間を形成する。流入ポート１０１５は、約０．００１ｃｍ〜０．２ｃｍの深さ、０．０１２５ｃｍ〜約０．０２５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．２１１８ｃｍ）を有する微小流路１０１４を介してチャンバー１００５に流体的に接続されている。流入ポート１０１５は、好ましくは、ピペッターおよびその自動化された実施形態などのフルーイディックス充填デバイスに適合する。
【０１００】
フィルター１００９の半径方向の遠位側において、チャンバー１００５からの半径方向の外向きの出口が、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０１ｃｍ〜約０．０２５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法（深さ：０．０５０８ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．２６３１ｃｍ）を有する微小流路１０１０に流体的に接続されている。微小流路１０１４は、犠牲弁１０１２の縁を規定するポケット１０１１に流体的に接続されている。このポケット１０１１は、プラットホーム表面における約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの深さ、約０．０４ｃｍ〜約０．０８ｃｍの長さ、および約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの断面寸法（深さ：０．１０１６ｃｍ、幅：０．１０６０ｃｍ、長さ：０．０７６２ｃｍ）を有し、その半径方向の遠位端には、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行、これは参考として組み込まれる）においてより詳しく示されているようなワックスまたは他の材料を使用して好ましくは作製される犠牲弁１０１２、および融解したワックスが流路を阻止することなく再固化する再結晶化チャンバー１０１３が存在する。犠牲弁１０１２は、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．１０５６ｃｍ）を有し、再結晶化チャンバー１０１３は、約０．７５ｃｍ〜約０．１５ｃｍの深さ、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの長さ、および約０．１ｃｍ〜約０．２ｃｍの幅の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．２０３１ｃｍ、長さ：０．２３５１ｃｍ）。本明細書中においてより十分に開示されているように、犠牲弁１０１２は、加熱エレメント（最も好ましくは、抵抗ヒーターまたはペルチェ素子）と熱的に接触している。この場合、弁を含むワックスは、ヒーターを作動させることによって融解される。好ましい実施形態において、ヒーターは、プラットホーム層内において、弁の下部に、最も好ましくは弁の直下に組み立てられるか、あるいは、ヒーターが弁の上方または下方にあるように、最も好ましくは弁のすぐ上方またはすぐ下方にあるように配置された別のプラテンを含む。微小流路１０１１および再結晶化チャンバー１０１３は、犠牲弁１０１２の長さを規定するために役立ち、そしてワックスは、溶融状態で堆積したときに、１０１１および１０１３の開口部によって流路のこの短い長さに自然に制限される。
【０１０１】
溶解液リザーバー１０１６が、回転軸からチャンバー１００５と実質的には同じ距離でディスク上に半径方向に配置されている。溶解液リザーバー１０１６は、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜０．２５ｃｍの深さ、約０．１８ｃｍ〜０．３６ｃｍの幅、および約０．３ｃｍ〜約０．８ｃｍの長さを有し、かつ約２５μＬ〜約３００μＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：０．３５７９ｃｍ（上部）および０．５５３６ｃｍ（底部）、長さ：０．７２９２ｃｍ）を有し、微小流路１０１７を介してチャンバー１００５に流体的に接続されている。溶解液は、最も好ましくは、微小流路１０１７を介して溶解液リザーバー１０１６に流体的に接続されている流入ポート１０１９を使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これらの構造体において、流入ポート１０１９は、好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施形態などのフルーイディックス充填デバイスに適合する。微小流路１０１７は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０５０８ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．４８４５ｃｍ）。
【０１０２】
沈殿化剤緩衝液リザーバー１０２０もまた、回転軸からチャンバー１００５と実質的には同じ距離でディスク上に半径方向に配置されている。沈殿化剤緩衝液リザーバー１０２０は、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜０．２５ｃｍの深さを有し、幅が約０．４ｃｍ〜０．８ｃｍで、長さが約０．２５ｃｍ〜０．５０ｃｍであり、かつ約３５μＬ〜約４００μＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：０．７３４９ｃｍ、長さ：０．４９６０ｃｍ）を有し、微小流路１０２３を介してチャンバー１００５に流体的に接続されている。沈殿化剤緩衝液リザーバー１０２０と微小流路１０２３との間には、犠牲弁１０２１および再結晶化チャンバー１０２２が存在し、これらは、実質的には、犠牲弁１０１２および再結晶化チャンバー１０１３に関して上記に記載されているように配置されている。沈殿化剤緩衝液溶液は、最も好ましくは、微小流路１０２４を介して沈殿化剤緩衝液リザーバー１０２０に流体的に接続されている流入ポート１０２５を使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これらの構造体において、流入ポート１０２０は、好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施形態などのフルーイディックス充填デバイスに適合する。微小流路１０２４は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０５０８ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．４８４５ｃｍ）。
【０１０３】
犠牲弁１０１２に対して半径方向の遠位には、微小流路１０２６が存在する。これは、それによってチャンバー１００５に流体的に接続されている。微小流路１０２６は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０２５ｃｍ〜約０．０５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．７０６０ｃｍ）。微小流路１０２６は結合カラム１０２７に流体的に接続されており、これはＤＮＡ親和性マトリックスをさらに含む。結合カラム１０２７は、約０．１０ｃｍ〜０．２ｃｍの深さ、約０．３ｃｍ〜約０．６５ｃｍの長さ、約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約５μＬ〜約２０μＬの容量能（深さ：０．１８７５ｃｍ、幅：０．３５１１ｃｍ（底部）、０．０４ｃｍ（上部）、長さ：０．５７２７ｃｍ）を有する。結合カラム１０２７はまた、プラットホーム表面における約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さを有し、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さで、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの断面寸法であるマトリックス材用スロット１０２８を含み、そして約５μＬ〜約１５μＬの容量能（深さ：０．２３８３ｃｍ、幅：０．５０８２ｃｍ、長さ：０．０９２１ｃｍ）を有する。これは、組み立てられたときに、フリットによって構造的に支持されたマトリックス材１０２９を含有する。結合材は、ＤＮＡの水和殻が破棄されるカオトロピック性の塩溶液中にＤＮＡが存在するときにＤＮＡと結合するガラス繊維であるＷｈａｔｍａｎガラス繊維フィルター（ＧＦ−Ｆ）からなる。フリット材は、この場合には、柔軟すぎて構造体内において自身を支持することができないガラスフィルターに対して固体の担体支持材を提供する固体の多孔質材料（７０μｍの細孔サイズ）である。結合カラム１０２７はまた、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さを有し、約１．７５ｃｍ〜約３．５ｃｍの長さで、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：３．１９５５ｃｍ）である空気移動流路１０５１と、空気通気孔１０５２とを備えている。これらは、流体を空気移動流路１０５１に流れ込ませることなく流体がそれらを通って流れたときに、空気を結合カラムから追い出すことができるように組み立てられる。
【０１０４】
プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法を有し、かつ約０．１ｃｍ〜約０．２ｃｍの長さ（深さ：０．０５０８ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．２０４１ｃｍ）である微小流路１０３０が、犠牲弁１０３２の縁を規定するポケット１０３１に流体的に接続されている。このポケットは、プラットホーム表面における約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの深さ、約０．０４ｃｍ〜約０．０８ｃｍの長さ、および約０．０６ｃｍ〜約０．１２ｃｍの断面寸法（深さ：０．１０１６ｃｍ、幅：０．１１２１ｃｍ、長さ：０．０７６２ｃｍ）を有する。ポケット１０３１は、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法を有し、かつ約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さであり（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．０８７６ｃｍ）、そして犠牲弁１０１２および１０２１に関して上記に記載されているように組み立てられる犠牲弁流路１０３２によってサンプル回収リザーバー１０５３から分離されている。サンプル回収リザーバー１０５３は、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さ、約０．３ｃｍ〜約０．６ｃｍの長さ、および約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約２０μＬ〜約２５０μＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：０．６１３２ｃｍ、長さ：０．３７４８ｃｍ）を有する。サンプル回収リザーバーは空気移動流路１０５４および空気通気孔１０５５を備えている。空気移動流路１０５４は、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さを有し、約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの長さで、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法である（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．３３１６ｃｍ）。これらの構造体は、流体を空気移動流路１０５４に流れ込ませることなく流体がそれらを通って流れたときに、空気を結合カラムから追い出すことができるように組み立てられる。
【０１０５】
ポケット１０３１から半径方向の内側には、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０２５ｃｍ〜約０．５０ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさ（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．４１９５ｃｍ）を有する微小流路１０３３がつながる。いくつかの実施形態において、微小流路１０３３は、流体による濡れに対して抵抗性を有する疎水性表面を提供するように処理される。この微小流路の区域に沿って、微小流路の方向を半径方向の外側に向け、そして廃棄物リザーバー１０３４に至る屈曲部が存在する。廃棄物リザーバー１０３４は、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの深さ、約０．３ｃｍ〜約０．６ｃｍの長さ、および約２．５ｃｍ〜約５．０ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約３５０μＬ〜約１．５ｍＬの容量能（深さ：０．２７９４ｃｍ、幅：４．４７８３ｃｍ、長さ：０．５６８７ｃｍ）を有する。廃棄物リザーバーは空気移動流路１０３５および空気通気孔１０９９を備えている。空気移動流路１０３５は、プラットホーム表面における約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さを有し、かつ約０．５ｃｍ〜約１．０ｃｍの長さで、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法である（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．９２４０ｃｍ）。これらの構造体は、流体を空気移動流路１０３５に流れ込ませることなく流体がそれらを通って流れたときに、空気を結合カラムから追い出すことができるように組み立てられる。
【０１０６】
プラットホームのサンプル調製マイクロ構造体はまた、第１および第２の洗浄リザーバー１０３６および１０４７を含む。第１の洗浄リザーバー１０３６は、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さ、約０．２３ｃｍ〜約０．４６ｃｍの長さ、および約０．７５ｃｍ〜約１．５ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約５０μＬ〜約６００μｍＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：１．３３５７ｃｍ、長さ：０．４６００ｃｍ）を有する。このリザーバーは、微小流路１０３９によって微小流路１０２６に流体的に接続されている。微小流路１０３９は、実質的には犠牲弁１０１２および再結晶化チャンバー１０１３に関して上記に記載されているように配置された犠牲弁１０３７および再結晶化チャンバー１０３８によって遮断されている。犠牲弁１０３７は、約０．０１ｃｍ〜約０．０３ｃｍ、約０．０８ｃｍ〜約０．１２ｃｍの長さ、および約０．０１ｃｍ〜約０．０３ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．１００７ｃｍ）。再結晶化チャンバー１０３８は、約０．１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．２１２６ｃｍ、長さ：０．２３０２ｃｍ）。微小流路１０３９は、約０．０１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．３ｃｍ〜約０．６ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．５９１０ｃｍ）。第１の洗浄液は、最も好ましくは、微小流路１０４１を介して沈殿化剤緩衝液リザーバー１０３６に流体的に接続されている流入ポート１０４０を使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これらの構造体において、流入ポート１０４０は、好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施形態などのフルーイディックス充填デバイスに適合する。微小流路１０４１は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．２５２１ｃｍ）。
【０１０７】
第１の洗浄リザーバー１０４７は、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さ、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ、および約０．７５ｃｍ〜約１．５ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約７５μＬ〜約８５０μｍＬの容量能（深さ：０．２３８８ｃｍ、幅：１．４１８０ｃｍ、長さ：０．５０６５ｃｍ）を有する。このリザーバーは、微小流路１０５０によって微小流路１０２６に流体的に接続されている。微小流路１０５０は、実質的には犠牲弁１０１２および再結晶化チャンバー１０１３に関して上記に記載されているように配置された犠牲弁１０４８および再結晶化チャンバー１０４９によって遮断されている。犠牲弁１０４８は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．１０２３ｃｍ）。再結晶化チャンバー１０４９は、約０．７５ｃｍ〜約１．５ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．２１７９ｃｍ、長さ：０．２４３５ｃｍ）。微小流路１０５０は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．２ｃｍ〜約０．４ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．３７２４ｃｍ）。第２の洗浄液は、最も好ましくは、微小流路１０５６を介して沈殿化剤緩衝液リザーバー１０４７に流体的に接続されている流入ポート１０５７を使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これらの構造体において、流入ポート１０５７は、好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施形態などのフルーイディックス充填デバイスに適合する。微小流路１０５６は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．２５ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．４３４７ｃｍ）。
【０１０８】
溶出緩衝液リザーバー１０４２が、回転の中心から、第１または第２の洗浄リザーバー１０３６および１０４７よりも遠位の半径方向に配置される。溶出緩衝液リザーバー１０４２は、約０．１ｃｍ〜約０．２５ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．４ｃｍ〜約０．８ｃｍの断面寸法の大きさを有し、かつ約２０μＬ〜約２５０μＬの容量能（深さ：０．２２８６ｃｍ、幅：０．７３０８ｃｍ、長さ：０．２７８７ｃｍ）を有する。このリザーバーは、微小流路１０４４によって微小流路１０２６に流体的に接続されている。微小流路１０４４は、実質的には犠牲弁１０１２および再結晶化チャンバー１０１３に関して上記に記載されているように配置された犠牲弁１０５８および再結晶化チャンバー１０４３によって遮断されている。犠牲弁１０５８は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０５ｃｍ〜約０．１ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：０．１０１２ｃｍ）。再結晶化チャンバー１０４３は、約０．０７５ｃｍ〜約０．１５ｃｍの深さ、約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの長さ、および約０．１５ｃｍ〜約０．３ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．２１２６ｃｍ、長さ：０．２３０２ｃｍ）。微小流路１０４４は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約０．０２５ｃｍ〜約０．０５ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．１５２４ｃｍ、幅：０．０５０８ｃｍ、長さ：０．８５８６ｃｍ）。第２の洗浄液は、最も好ましくは、微小流路１０５６を介して沈殿化剤緩衝液リザーバー１０４７に流体的に接続されている流入ポート１０５７を使用して使用前にプラットホームに新しく加えられる。これらの構造体において、流入ポート１０５７は、好ましくは、ピペッターまたはその自動化された実施形態などのフルーイディック充填デバイスに適合する。微小流路１０５６は、約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの深さ、約１．０ｃｍ〜約２．０ｃｍの長さ、および約０．００１ｃｍ〜約０．２ｃｍの断面寸法の大きさを有する（深さ：０．０２５４ｃｍ、幅：０．０２５４ｃｍ、長さ：１．６６２３ｃｍ）。
【０１０９】
本明細書中に開示されているようなマイクロフルーイディックス構造体は、好ましくは、別の層であり得るか、または本明細書中に開示されているように別個のプラテンエレメントとして提供され得るヒーター層と熱的に接触して操作される。
【０１１０】
ヒーター層がプラテン自体の別個の層を含むプラットホームの実施形態において、ヒーター層は、リザーバー層をシールし、それによってそのディスクの表面におけるポケットから離れて包まれたチャンバーを形成すること、そして電気リード線およびヒーターのアレイによって局所的な加熱を提供することの両方に役立つ。ヒーター層１１０１およびその構成要素構造体が図１５に例示されている。ヒーター層１１０１は、ヒーター層の表面に配置された、約０．０５ｃｍ〜約０．０７ｃｍの幅（幅：０．０５０８ｃｍ）および約１ｃｍ〜１０ｃｍの長さを有する印刷されたか、またはそれでなければ蒸着された電気リード線１１０４が存在する柔軟なプラスチックシート１１０２（最も好ましくは、ＩＣＩから市販されている、約０．００７６２ｃｍの厚さを有するマイラーシート）からなる。ヒーター１１０８もまた、柔軟なプラスチックシート１１０２に印刷されているか、またはそれでなければ蒸着されており、約０．１ｃｍ〜約１ｃｍの幅（幅：０．６８９１ｃｍ〜０．２０３２ｃｍ）および約０．１ｃｍ〜約０．５ｃｍの長さ（長さ：０．２０３２ｃｍ〜０．２０６７ｃｍ）を有する。電気リード線１１０４は、好ましくは、銀系インクなどの導電性材料から組み立てられ、一方、ヒーター１１０８は、好ましくは、炭素系インクなどの抵抗性材料から組み立てられる（マイラーシート上の印刷体は約１０μｍの厚さを有する）。電気回路は、微量操作装置においてピンアセンブリーによって接続され得るヒーター層の中心近くに配置された、約０．１ｃｍ〜０．２ｃｍの半径（半径：０．１３９７ｃｍ）を有する接点パッド１１０５からなる；これらのピンが接触している場合、装置によって１つの部分が形成され、そしてヒーター層によってもう一方の部分が形成される閉じた電気回路が形成され得る。ヒーター層と装置との間におけるこれらのタイプの電気的接続は、共同所有の米国特許第６．０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行、これは参考として本明細書中に組み込まれる）においてより詳しく開示されている。リード線１１０６は、電流の共通した供給源またはシンクを形成する。リード線１１０７は、ヒーターエレメント１１０８を通ってこの共通リード線から分岐し、次いで様々なパッド１１０５に接続される。高電圧源が個々のヒーターに対応するパッドに加えられ、そして１１０６と結合した接点パッドがアースされた場合、電気電流が、リード線、およびエネルギーを消散して発熱する抵抗エレメントを通って流れる。
【０１１１】
最後に、いくつかの実施形態において、プラットホームはまた、ヒーターをその後に使用して、より効率的に加熱するためにプラットホームを断熱するのに役立つ基層１２０１を含む。基層１２０１の構造は単に、本発明の微量操作デバイスのローターまたは中心軸と一致させるための中心孔１２０２（約１ｃｍ〜１．５ｃｍの半径を有する：半径：１．４３５１ｃｍ）を有する断熱性物質である。
【０１１２】
本発明のＤＮＡ調製プラットホームの使用において、細胞培養物（特に、細菌細胞培養物）がプラットホームに加えられ、そしてプラスミドＤＮＡが、細胞溶解；プラスミドＤＮＡの細菌細胞破片、細胞タンパク質および細胞ゲノムＤＮＡからの分離；緩衝液交換を行い、それによって単離プラスミドＤＮＡのその後の使用と適合しない単離溶液の成分を除くために洗浄される親和性マトリックスにおけるプラスミドＤＮＡの捕捉；プラスミドＤＮＡの溶出および回収によって単離される。
【０１１３】
本発明のプラスミドＤＮＡ調製プラットホームのマイクロフルーイディックス構造体を通過する流体の動きの順序が図１７に例示されている。プラットホームの使用を説明することにおいて、マイクロフルーイディックス構造体、試薬およびサンプルのサイズおよび量が例示的な実施形態ではかっこ内に示されている。
【０１１４】
使用されるプラットホームを準備するために、試薬溶液が下記のように加えられる。下記溶液の量がプラットホームに加えられる：約２５μＬ〜約３００μＬ（５０μＬ）のアルカリ細胞溶解液が、流入ポート１０１９および微小流路１０１８を使用してリザーバー１０１６に充填される；約２０μＬ〜約２５０μＬ（４０μＬ）の溶出緩衝液が、流入ポート１０４６および微小流路１０４５を使用してリザーバー１０４２に充填される；約５０μＬ〜約６００μＬ（１００μＬ）の第１の洗浄液が、流入ポート１０４０および微小流路１０４１を使用してリザーバー１０３６に充填される；約７５μＬ〜約８５０μＬ（１５０μＬ）の第２の洗浄液が、流入ポート１０５７および微小流路１０５６を使用してリザーバー１０４７に充填される；そして約３５μＬ〜約４００μＬ（７０μＬ）の沈殿化溶液が、流入ポート１０２５および微小流路１０２４を使用してリザーバー１０２０に充填される。
【０１１５】
その後、サンプルが、細菌培養物の約２５μＬ〜約３００μＬ（５０μＬ）の量で、流入ポート１０１５および流路１０１４を介してチャンバー１００５に加えられる。
【０１１６】
その後、プラットホームが、本明細書中に記載されているようにヒーターを作動させるために、微量操作デバイスの中に置かれ、好ましくは、本明細書中および共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行、これは参考として組み込まれる）に記載されているようにスリップリングを含むローターに置かれる。ヒーター層を伴う実施形態において、スリップリングアセンブリーのピンはヒーター層のパッド１１０５と接触させられる。これらの実施形態において、アライメント用の溝１００３は、図１５に示されているように、ディスクに対するスリップリングアセンブリーの向きを設定するために役立つ。ヒーター層が、スリップリングのピンによってヒーター層のピンマークがそろうような方法でフルーイディックス層とともにアラインメントされる。
【０１１７】
その後、ディスクは、リザーバー１０１６から微小流路１０１７を通ってチャンバー１００５内に至るアルカリ細胞溶解液の流体の流れが駆動されるのに十分な約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍの第１の回転速度に加速される。その後、プラットホームは、急激な正および負（すなわち、前方向および後方向）の角加速度に供され、それにより、混合を行うためにその角速度を増減させることによって攪拌される。混合用バッフル１００６は、図に例示されているように、流体の大部分に対して折り返される長い部分に流体を引き入れることによって流体を「薄層化」する流体内の円運動を生じさせるのに役立つ。流体は繰り返し薄層化されるので均質化される。微細加工されない大きな容量およびシステムの場合、十分な角加速度により、チャンバー１００５内の流れもまた、混合を助ける乱流になる。
【０１１８】
均質な混合を達成するために十分な時間（これは、サンプル量およびチャンバー１００５のサイズに依存しており、従って経験的に決定される）の後、サンプル内の細菌は溶解を受け、ＤＮＡが溶液中に放出される。その後、ディスクの回転速度は約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍ（？？？）の第２の回転速度で維持され、そして毛管１０２１内のワックス弁が、この弁と熱的に接触している対応するヒーターパッドに電圧を加えることによって融解される。熱は、ワックスを融解し、そして流れる流体が融解したワックスを毛管から再結晶化チャンバー１０２２内に移動させるのに十分な時間にわたって加えられる。角速度は、沈殿化溶液のすべてが混合チャンバー内に移動させられるまで維持される。
【０１１９】
その後、ディスクは、混合のために、上記に記載されているように再度攪拌される。沈殿化溶液の作用は、均質な溶解混合物のゲノムＤＮＡ、タンパク質および細胞破片成分を沈殿させることである。この沈殿化は、フィルター１００９によって捕捉され得る凝集物を生じさせる。これは、上記および本文の組み立ての部分に記載されているように、Ｐｏｒｅｘフリット材Ｘ−４５８８（７０μｍの細孔サイズ）およびＷｈａｔｍａｎろ紙＃５４から構成される。
【０１２０】
十分な混合の後、ディスクの回転速度は約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍの第３の回転速度で維持され、その後、毛管１０１２内のワックス弁が、この弁と熱的に接触している対応するヒーターパッドに電圧を加えることによって融解される。熱は、ワックスを融解し、そして流れる流体が融解したワックスを毛管から再結晶化チャンバー１０１３内に移動させるのに十分な時間にわたって加えられる。角速度は、流体のすべてが混合チャンバーから毛管１０１０、１０１２および１０２６を通って結合カラム１０２７内に移動させられるまで維持される。細胞破片および望まれない沈殿物はフィルター１００９上に捕捉される。
【０１２１】
プラットホームは、流体が向心加速度によって結合マトリックスを通って移動させられるのでこの角速度で回転させられる。微小毛管１０３２は犠牲弁によって阻止されているので、流体は、流路の表面処理の疎水性に打ち勝つ向心力によって誘導される圧力によって微小流路１０３３内に移動させられる。その後、流体は廃棄物チャンバー１０３４に送達される。
【０１２２】
プラットホームの回転は、典型的には多孔質材料である結合チャンバー１０２７内のマトリックス１０２８をすべての流体が通過するまで維持される。廃棄物チャンバー１０３４に流体的に接続されている微小流路１０３３の端はプラットホームの回転軸からチャンバーの反対側の端よりも遠位にあるので、結合チャンバー１０２７、微小流路１０３０およびポケット１０３１からサイフォン吸上げ作用によってすべての流体を引き寄せることができる。これは、様々な工程の工程間の汚染または逆流を減らす利点を有する。
【０１２３】
流体のすべてがマトリックス１０２８を通って移動させられると、プラスミドＤＮＡはそれに結合する。典型的には、これらのマトリックス材は、ＤＮＡの負電荷を引き寄せる正の電荷を示す。ＤＮＡとマトリックスとの電荷の違いを利用する、ディスク上に提供されている親和性マトリックスには、いくつかの異なるタイプが存在する。けいそう土、精製シリカ樹脂、ＤＥＡＥならびにガラス繊維フィルターを含むイオン交換樹脂ならびにシリカおよびガラス繊維はともに、電荷の違いを使用してＤＮＡと結合する能力をディスク上において明らかにするために使用されている。その後、プラットホームは約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍの第４の回転速度で回転させられ、同時に、熱が毛管１０３７内のワックス弁に加えられ、第１の洗浄液が、結合カラム１０２７に流体的に接続されている微小流路１０３９、次いで微小流路１０２６を通って放出される。この流体は、前記に記載されているように、結合マトリックスを通って廃棄物チャンバー内に移動させられる。この洗浄は、マトリックス材内に捕捉されている溶解液および沈殿化溶液の成分を除くことを目的としている。
【０１２４】
その後、リザーバー１０４７内に含有されている第２の洗浄液が、その犠牲弁１０４８の融解によって放出され、流体は微小流路１０５０および１０２６を通って結合チャンバー１０２７内に流れ、結合チャンバー１０２７を洗浄して、マトリックス１０２８を通って廃棄物チャンバー１０３４に至る。
【０１２５】
これらの処理の後、マトリックスに結合しているプラスミドＤＮＡは、サンプル調製工程において使用された他の流体および材料を微量含有するだけである。その後、プラットホームは約５００ｒｐｍ〜約１５００ｒｐｍの第５の回転速度で回転させられ、そして毛管１０３２内の犠牲弁が、熱を加えることによって開けられ、結合チャンバー１０２７内のマトリックス１０２８とサンプル回収リザーバー１０５３との流体接続が開けられる。熱は、毛管１０５８内の犠牲弁にも加えられる。溶出緩衝液は、微小流路１０４４および１０２６ならびに結合カラム１０２７を通って、最も詳細には、マトリックス１０２８を通って移動させられる。微小流路１０３２は開いているので、流体は優先的にサンプル回収リザーバー１０５３内に流れる。これらの条件のもとにおいて、微小流路１０３３のトポグラフィー、その疎水性コーティング、またはその両方は、好都合なことに、流体が廃棄物リザーバー１０３４に流れることを妨げる。疎水性コーティングもまた、好都合なことに、微小流路１０３３を通ってサンプル回収チャンバー１０５３内への廃棄溶液の逆流を妨げる。
【０１２６】
その後、プラットホームは停止させられ、そして単離されたプラスミドＤＮＡを含有する流体サンプルがポート１０５５および微小流路１０５４を介して回収される。
【０１２７】
サンプル調製およびインビトロ増幅の一体化プラットホーム
本発明はまた、ＤＮＡサンプル調製、インビトロ増幅および生成物の回収または分析を含む一体化された１組の生化学的反応を行うことができるマイクロフルーイディックス構造体を有するプラットホームを提供する。本発明のこの局面は、本明細書中では１つのマイクロフルーイディックス構造体について記載される。しかし、多数のこれらのマイクロフルーイディックス構造体を含むプラットホームが提供され、本発明によって包含される。この場合、本明細書中に記載されている多数のマイクロフルーイディックス構造体がプラットホーム上に提供されている。
【０１２８】
次に、本発明をより詳しく説明するために図面を参照すると、図１は、多数のインビトロ増幅反応を行うためのディスクの一例の分解図を示している。このプラットホームの例示された実施形態は、６つの個々のサンプルについて６つの独立したサンプル調製およびＰＣＲ操作を行うことができる。より多くのサンプル数、ならびにサンプルの分割および／または組合せに対してプラットホームの能力が拡大される本発明の別の実施形態は容易であり、下記に議論されている。ここに示されたディスクにより、一般的な形態の９６個のアッセイが行われる：第１の流体Ａが第２の流体Ｂと混合され、
このディスクは、マイクロフルーイディックス構造体を所定の半径でディスクの周りに繰り返すことによって、そして異なる半径位置のところに設置するために構造体を改変することによって、同一のアッセイが行われ得ることを例示する。このようにして、アッセイを行うためのマイクロフルーイディックス構造体でディスクの表面を完全に覆うことが可能である。行うことができるアッセイの最大数は、再現性よく操作され得る流体の容量、すなわち、ディスクが製造され得る最小の再現可能な大きさに依存し、そして小容量の流体を、都合のよい回転速度で微小流路を通って移動させるために必要とされる流体力学的圧力の量に依存する。これらの事項を考慮に入れると、６ｃｍの半径を有する円形プラットホームにおいて、１ｎＬ〜５ｎＬの容量を有する１０，０００を越えるアッセイが行われ得ることが見積もられる。
【０１２９】
図１において、ディスク１００は、マイクロフルーイディックスディスク２０１、シール層３０１、および１つまたは２つ以上の熱シール層４０１の少なくとも３つの構成要素を含む。いくつかの実施形態において、マイクロフルーイディックスディスク２０１はさらに、少なくとも２つの構成要素層の組合せとして提供される。この場合、リザーバー層５０１がマイクロフルーイディックス層６０１に結合している。これらの実施形態において、リザーバー層の底面は、下記に記載されているマイクロフルーイディックスディスクと一致している場合、閉じた流路およびリザーバーの完全なネットワークを形成し、これを介して、流体が、中心軸の周りにおけるプラットホームの回転によって生じる向心力の推進力のもとで流れる。すべての実施形態において、流体の流れは、アッセイにおける様々な成分流体の混合、ならびにサンプルリザーバーおよび試薬リザーバーから混合用構造体を通ってアッセイ回収チャンバー内への流体の移動を可能にする。さらに、流体の流れが、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行、これは参考として本明細書中に組み込まれる）に開示されている構造体を使用して、インキュベーション工程および洗浄工程を含むように達成され得る。約１ｎＬ／ｓ〜約１０００μＬ／ｓの流体流速が約４ｒｐｍ〜約３０，０００ｒｐｍの回転速度で達成される。好ましくは、「受動」的な弁または毛管弁が、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されているようにプラットホーム内における流体の流れを制御するために使用される。本発明のプラットホームの操作において、回転によって誘導される静水圧と、小さな流路およびオリフィスにおいて及ぼされる毛管圧との競合が、回転に依存したゲート操作システムまたは弁操作システムを提供するために利用される。流体がプラットホームの外縁に向かって配置された検出チャンバー内に入った後、シグナル（最も好ましくは、光学的シグナル）が検出される。
【０１３０】
プラットホーム１００は、好ましくは、ディスクの形状で提供され、約１０ｍｍ〜約５０ｍｍの直径および約０．１ｍｍ〜約２５ｍｍの厚さを有する円形の平面状プラットホームである。マイクロフルーイディックスディスク２０１の構造を図２に示す。図２には、「底」面が、本発明のプラットホームのこの実施形態をより明瞭に例示するために示されている。
【０１３１】
マイクロフルーイディックスディスク２０１は、好ましくは、ディスクの形状で提供され、約１０ｍｍ〜約５０ｍｍの直径および約０．１ｍｍ〜約２５ｍｍの厚さを有する円形の平面状プラットホームである。このディスクは、好ましくは、約１ｍｍ〜約２０ｍｍの直径を有する中心軸に固定するための中心孔２０２を含む。中心孔２０２は、中心軸に対する接続のために押出し成形された取り付け部品によって置き換えることができ、あるいは完全に存在しなくてもよく、そのような場合、中心軸に対する位置決めおよび接続は、プラットホーム表面の別の部分を使用して達成される。マイクロフルーイディックスディスク２０１はまた、プラットホームが中心軸に載せられたときに、プラットホーム上方の固定用取り付け具が、プラットホームの上部表面と接触することなくプラットホームの上部表面の近くに置かれることを可能にする溝２０３などの位置決め構造体を含むことができる。この特徴を有する実施形態において、ディスクが低ｒｐｍで回転すると、固定用取り付け具におけるピン（好ましくは、スプリング付きピン）が溝内を滑り、固定用取り付け具を捕まえる。従って、これにより、プラットホームの向きがそれに関して決定される。別の実施形態において、プラットホームは、「ホームフラッグ」２０４、すなわち、プラットホームの表面に配置されて、ディスクが回転したときに発光体／フォトダイオードの対によって検知することができ、従って、装置に関してディスクの向きを決定することを可能にする反射縞または吸収縞を含む。
【０１３２】
図３には、ディスクの中心が図の上方にあるマイクロフルーイディックスディスクの断面の分解図が例示されている。リザーバー２０４、２０５および２０６は、それぞれ、流体サンプル、細胞アルカリ溶解液および中和緩衝液を含有するように設計されている。リザーバー２０４および２０５は、ディスク上におけるそれらの半径位置および範囲が同一であるように設計され、そしてリザーバー内に置かれる流体の所望する比に等しい比を形成する断面積（すなわち、プラットホーム内の深さｘ横方向の大きさ）を有する。それぞれのリザーバーは、ディスクの中心に近い位置においてリザーバー内に設置された充填孔（それぞれ、２０７、２０８および２０９）を有する。それぞれのリザーバーは、約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍの幅、約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍの長さ、および約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍの厚さの大きさを有し、そして約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有する。充填孔２０７、２０８および２０９は、好ましくは、マイクロピペッターなどの自動化された充填デバイス、例えば、１．５ｍｍのチップ直径を有する標準的な２００μＬのプラスチック製ピペットチップ；直径１ｍｍのマイクロピペッターチップ；圧電的またはセラミックスの液滴送達システム（ＩＶＥＫ Ｃｏｒｐ．（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、ＶＴ）によって販売されているものなど）；インクジェット型流体送達システムに適合した大きさを有する。圧電的送達またはインクジェット送達などの非接触的な送達システムの場合、ポートの大きさは、液滴のサイズより数倍大きくなければならない（例えば、１ｎＬの液滴の場合には０．２ｍｍ）。
【０１３３】
リザーバー２０４の反対側の端は、プラットホーム表面における深さがリザーバーとは異なる深さで好ましくは組み立てられる微小流路２１０に流体的に接続されている。この微小流路は、プラットホーム表面における深さが微小流路２１０とは異なる深さで好ましくは組み立てられる毛管２１１において終了する。毛管２１１は、ディスクの中心に対してリザーバーの内端よりも近位に位置する空気通気孔２１２において終了する。リザーバー２０５は、回転軸に対して遠位にあるリザーバー内の位置において微小流路２１３に流体的に接続されている。微小流路２１３もまた、微小流路２１０について記載されているように、毛管２１１において終了する。微小流路２１０および２１３の組み立てならびに毛管２１１に対するこれらの微小流路の接続は、リザーバー２０４および２０５からの流体の流れによって空気を追い出することができるが、毛管２１１の断面積は、小さすぎて、液状の流体がそれらを通って流れることができないように組み立てられる。リザーバー２０６は、毛管接合２１５において終了する微小流路２１４に流体的に接続されている。
【０１３４】
微小流路２１０および２１３は、混合用微小流路２１６に流体的に接続され、（サンプルを含有するために本明細書中では例示される）リザーバー２０４の内容物と（アルカリ細胞溶解液を含有するために本明細書中では例示される）リザーバー２０５の内容物との混合を可能にする。混合用微小流路は、混合物が微小流路の長さ方向の範囲を横切るときに種々の溶液の混合をもたらすように構成される。混合の程度は、流体の流速および混合用微小流路の長さ方向の範囲に依存し、２つの流体が接触して一緒に混合される時間の量に比例する。混合の程度はまた、混合用微小流路の横方向の広がりに依存し、そして混合される流体の拡散定数にさらに依存する。有用な範囲の粘度を有する流体を混合するために十分な長さを有する混合用微小流路を収容するために、混合用微小流路は、示されているように提供される。混合は、回転方向に対して直交するが、回転軸に対してより近位の位置から回転軸に対してより遠位の位置にまでプラットホーム表面上の半径方向に広がるプラット表面上の経路を横切るように数回曲げるために微小流路を構成することによって促進させられる。混合用微小流路２１６は約１ｍｍ〜約１００ｍｍの長さを有する。その長さは、いくつかの場合には曲げを使用することによって達成される。
【０１３５】
デバイス内の混合は拡散によって促進させられる。２つの小容量ＡおよびＢが１つの容器に加えられたとき、ＡからＢへの拡散および／またはＢからＡへの拡散は混合をもたらす。この混合に必要とされる時間の量は、混合が所望される溶液内の分子の拡散定数、および分子が拡散しなければならない距離に依存する。例えば、拡散定数Ｄを有する分子を含む０．５マイクロリットルの溶液Ａを、１辺が１ｍｍのリザーバーに加える。その拡散定数もまたＤである分子を含む溶液Ｂを加える。これらの溶液は、最初、それらを仕切る境界を有する容量を占める。流体が非常に混和しやすい場合でさえ、完全に均質な溶液を生じさせるための拡散時間はほぼ、ｔ＝２ｘ２／Ｄである。ｘ＝０．０５ｃｍ（０．５ｍｍ）およびＤ＝１０−５ｃｍ２／ｓの場合、混合時間は５００秒であり、これは、大部分の反応に関して受け入れられないほど長い時間である。この混合時間は、例えば、機械的な攪拌によって短くすることができるが、攪拌は、小さな構造体内に制限された流体において得ることは困難である。これは、流体の流れが層状であり、そして混合を促進することが知られている乱流的な渦を含有しないからである。流体Ａを１ｍｍ３の容器に入れ、次いで溶液Ｂを入れる代わりに、流体ＡおよびＢが、横方向の大きさがｄである長くて薄い毛管に並んで入れられた場合、混合に関連する時間ははるかに短くなる。例えば、ｄが１００ミクロンである場合、混合時間ｔは２０秒である。デバイスの混合用流路は、流体流ＡおよびＢを毛管微小流路内に同時に注入することによって長い毛管内への流体の導入をまねる。これらの流体は、最初に、流路を並んで下方向に流れる。プラットホームの回転によって生じる遠心力により流体が微小流路を通って押し出されると、拡散が流体間で生じる。十分に狭い直径で、十分な長さの毛管、および十分に小さい送液速度を選ぶことによって、送液時に流路内に存在するＡおよびＢの総容量のＡおよびＢの一部を混合させることができる。
【０１３６】
これらの選択は、流体が流路を横切るために必要な時間の量に等しい、混合に必要な時間を設定することによって決定され得る。拡散に必要な時間は、
【数１】
【数２】
【０１３７】
混合用微小流路は、回転軸に対して遠位にあるその端においてリザーバー２１７に流体的に接続されている。リザーバー２１７は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有し、そして回転軸に対して近位にあるリザーバーの端に空気移動毛管２２０および空気通気孔２２１を備えている。これにより、流体が混合用微小流路２１６を通って流れ、リザーバー２１７に送達されるときに、空気をリザーバーから追い出すことができる。
【０１３８】
混合用微小流路は、回転軸に対して遠位にあるその端においてリザーバー２１７に流体的に接続されている。リザーバー２１７は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有し、そして回転軸に対して近位にあるリザーバーの端に空気移動毛管２２０および空気通気孔２２１を備えている。これにより、流体が混合用微小流路２１６を通って流れ、リザーバー２１７に送達されるときに、空気をリザーバーから追い出することができる。
【０１３９】
毛管接合２１５は、微小流路２１８流体的に接続されている。図３に例示されているように、この微小流路は、リザーバー２０４および２０５からリザーバー２１７への流体の送達、そしてリザーバー２０７からリザーバー２１９への流体の送達が同時かつ調和して達成されることを最も容易に可能にするために、混合用微小流路２１６と同じ長さおよび直径を有するように構成されることが好ましい。代わりの実施形態において、混合が微小流路２１８において生じないので、混合用微小流路２１６とは異なる長さを有する微小流路２１８が提供される。別の代わりの実施形態において、流体がリザーバー２１９に直接充填される。リザーバー２１９は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが０．０５ｍｍ〜約５ｍｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有し、そして回転軸に対して近位にあるリザーバーの端に空気移動毛管２２０および空気通気孔２２１を備えている。これにより、流体が混合用微小流路２１８を通って流れ、リザーバー２１９に送達されるときに、空気をリザーバーから追い出すことができる。リザーバー２１７および２１９は、ディスクにおけるそれらの半径位置が同一であるように設計され、リザーバー内に置かれる流体の所望する比に等しい比を形成する断面積（すなわち、プラットホーム内の深さｘ横方向の大きさ）を有する。
【０１４０】
リザーバー２１７は、約０．１５ｃｍ〜約０．３０ｃｍの長さ（長さ：０．２５５２ｃｍ）を有する微小流路２２２に流体的に接続されており、毛管接合２２３において終了する。毛管接合の反対側には、約０．０１５ｃｍ〜約０．０３０ｃｍの長さ（長さ：０．０２１８ｃｍ）を有し、かつ空気移動毛管２２５において終了する微小流路２２４が存在する。空気移動毛管２２５は、毛管２２７によって拡大容量２２８に接続されている；あるいは、いくつかの実施形態では、拡大容量２２８は空気通気孔２２８によって置き換えられる。微小流路２２２および２２４の組み立てならびに毛管２２７に対するこれらの微小流路の接続は、リザーバー２１７および２１９からの流体の流れによって空気を追い出すことができるが、毛管２２７の断面積は、小さすぎて、液状の流体がそれらを通って流れることができないように組み立てられる。これらの構造体は、図４においてより詳しく例示されている。
【０１４１】
リザーバー２１９は、約０．２０ｃｍ〜約０．４０ｃｍの長さ（長さ：０．３２０５ｃｍ）を有する微小流路２２６に流体的に接続されており、空気移動毛管２２５において終了し、それとの毛管接合を形成している。微小流路２２６の深さおよび幅は、毛管２２５につながる場合、好ましくは、微小流路２２２および２２４の深さおよび幅とは異なる。
【０１４２】
微小流路２２４および２２６は、リザーバー２１７および２１９からの流体の混合を確実にするために混合用微小流路２１６と同様に設計されている混合用微小流路２２９に流体的に接続されている。混合用微小流路２２９は、約１ｍｍ〜約１００ｍｍの長さ（その長さは、いくつかの場合には曲げを使用することによって達成される）を有し、そして空気通気孔２３１をも含有するリザーバー２３０において終了する。リザーバー２３０は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが０．０５ｍｍ〜約５ｍｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有する。リザーバー２３０は微小流路２３２に流体的に接続されており、これは、半径方向の内側の方向でプラットホーム表面に配置され、かつ空気移動毛管２３３において終了する。微小流路２３２と毛管２３３との間の接合２９９は、下記においてより詳しく記載されているように、毛管停止（ｐｉｎｎｉｎｇ）（弁調節）作用を実質的に阻害するために、滑らかに広がる拡大部を伴って設計されている。この接合２９９は混合用微小流路２３４に流体的に接続されており、その半径方向の内側端は拡大容量２３５内において終了する。リザーバー２３６は、回転軸からリザーバー２３０と同じ半径距離のところに配置されている。リザーバー２３６は、幅が約０．０５ｍｍ〜約５ｍｍで、長さが約０．０５ｍｍ〜約２０ｍｍで、厚さが０．０５ｍｍ〜約５ｍｍである大きさを有し、約０．１ｎＬ〜約５００μＬの容量能を有する。好ましい実施形態において、回転軸から半径方向のより遠位にあるリザーバー２３６の部分２３７は、回転軸に対して半径方向のより近位にある部分２３８のプラットホーム表面内の深さより浅いプラットホーム表面内の深さを有する。リザーバー２３６もまた充填ポートとして役立つ空気通気孔２３９を含む。
【０１４３】
約０．１５ｃｍ〜０．３ｃｍの長さ（長さ：０．２５ｃｍ）および約０．００１ｃｍ〜約０．０２ｃｍの断面積の大きさを有する微小流路２４０は、空気移動毛管２３３を伴うリザーバー２３６に毛管接合２９８において流体的に接続されている。毛管接合２９９とは対照的に、この微小流路の結合は、「停止（ｐｉｎｎｉｎｇ）」作用をもたらすように設計されている。すなわち、接合により、流体の流れが阻害される。微小流路２４０は、逆行方向（すなわち、回転軸に向かって逆向き）にフレア状の開口部が続く制限部２９７を含有するように設計されており、毛管２３３に接続される。毛管接合の代わりの実施形態は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）および共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／９１０，７２６（１９９７年８月１２日出願）（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）においてより詳しく開示されている通りである。
【０１４４】
約１ｍｍ〜約１００ｍｍの長さを有する混合用微小流路２３４は、その長さはいくつかの場合には曲げを使用することによって達成されることが最も好ましく、熱サイクル処理用チャンバー２４１において終了する。熱サイクル処理用チャンバー２４１のプラットホーム表面内の深さは、より詳しくは下記に開示されているように、サイクル処理の熱的条件によって決定される。図３に示されているように、熱サイクル処理用チャンバー２４１の回転軸に近い方の部分が、空気通気孔２４３において終了する空気流路２４２に接続されている。このチャンバーはまた、熱サイクル処理用チャンバー２４１の直径よりも大きな直径を有する凹部である断熱用空気ポケット２４５をディスク２０１の反対側の面に含む。
【０１４５】
図５には、熱サイクル処理用チャンバーの領域における組み立てられたディスクが断面で例示されている。外向きの半径方向が矢印によって示されている。熱サイクル処理用チャンバー２４１は、示されているように、ディスク２０１の面における凹部であり、流路２３４が回転軸から半径方向の遠位の位置において進入する。シール層３０１が、熱サイクル処理用チャンバー２４１を覆うために、下記に示されているように提供される。断熱用空気ポケット２４５が、シール層３０１によって覆われてプラットホーム２０１の表面に示されている。
【０１４６】
本発明の微量システムプラットホームは、インビトロ増幅反応を行うために、最も好ましくは、ＤＮＡ単離、増幅（最も好ましくは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用する増幅）、およびディスク上での検出またはディスク以外での検出（例えば、従来のゲル電気泳動を使用する検出）を行うための増幅フラグメントの単離を含む一体化された１組の生化学的反応を行うために提供される。
【０１４７】
本発明のプラットホームのこの使用が図１〜図５に示されている；この使用は本開示および実施例から当業者によって理解されるが、プラットホームの機能は下記に明示的に記載される。
【０１４８】
本発明のプラットホームは、最も好ましくは、細菌細胞または真核生物細胞を含有する未処理の生物学的流体または予め最大に希釈された生物学的流体、あるいは細菌培養物または真核生物（最も好ましくは哺乳動物細胞）培養物のサンプル、あるいは哺乳動物細胞を含む血液などの生物学的流体を受け入れ、そして細胞からのＤＮＡ放出および増幅（最も好ましくは、ＰＣＲによる増幅）の工程によってこれらの流体を処理する。
【０１４９】
流体サンプルが流入ポート２０７を介してリザーバー２０４に加えられ、アルカリ細胞溶解液（一例において、ＮａＯＨ）が流入ポート２０８を介してリザーバー２０５に加えられ、調整用または中和用の緩衝液溶液（一例において、ＴｒｉｓＨＣｌ）が流入ポート２０９を介してリザーバー２０６に加えられる。濃度が約２００μＭである各デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、１ユニット〜１０ユニットのポリメラーゼ（最も好ましくは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼ）、ならびにサンプル中の標的ＤＮＡの量および酵素に適切な緩衝液および塩（特に、ＭｇＣｌ２）（塩化マグネシウムの量は、典型的には、この塩の濃度に対する増幅反応の感度のために経験的に決定される）のバランスの取れた混合物を含む増幅溶液が、流入ポート２３９を介してリザーバー２３７に加えられる。これは図９ａに示されている。その後、プラットホームは、本明細書中に、そしてより詳しくは共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号ならびに共同所有で同時係属中の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；および同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）（これらは参考として組み込まれる）に記載されている微量操作デバイスに載せられる。プラットホームは、ディスク上のマイクロフルーイディックス構造体の設置および大きさによって決定される様式でディスク上における流体の流れを駆動させるために回転させられる。例示的な回転プロフィルが図８に示されている。示されているように、プラットホームは、最初に、角加速度α１で、（図８において４００ｒｐｍよりもわずかに大きな）初期回転速度ω１にまで緩やかに加速される。回転は、サンプルおよびアルカリ細胞溶解液が微小流路２１０および２１３に進入し、その後、それらが、微小流路２１１を伴う毛管接合において停止させられる（本明細書中において使用されているように「止められる」）まで流れることを可能にするのに十分な時間（図８において約１０秒間）にわたって維持される。同様に、リザーバー２０６内の流体は、毛管接合２１５において止められるまで微小流路２１４内に流れる。その後、ディスクは角加速度α２で速度ω２（図８において約１８００ｒｐｍ）にまで急速に加速され、これは（図８に示されているように）所定の期間にわたって維持され得る。この速度での回転によって誘導される圧力により、微小流路２１１において止められている一方または両方の流体は、微小流路の狭いすき間を越えて、もう一方の流体と接触させられるか、またはもう一方の流体を「濡らす」；これにより、このときに接触している流体を回転速度ω３（図８において約５００ｒｐｍ）の推進力のもとで混合用微小流路２１６内に排出させることができる。
【０１５０】
図３に示されているように、微小流路２１０は、微小流路２１３よりも大きな断面積を有しており、結果として、この微小流路よりも小さな毛管圧を支える。その結果、サンプル流体は、最初に微小流路２１１にまたがるすき間を埋める。
【０１５１】
同時に、流体をリザーバー２０４および２０５から混合用リザーバー２１６内へ駆動させる速度の増大はまた、毛管接合２１５に打ち勝ち、それによって、リザーバー２０６から混合用リザーバー２１６内への流体の流れが駆動される。
【０１５２】
リザーバー２０４、２０５および２０６からの流体の流れを妨げる毛管接合を乗り越えると、回転速度は、加速度α３で速度ω３（図３において約５００ｒｐｍ）にまで減らされる；好ましい実施形態において、加速率α３は、実質的には加速率α２に等しい（しかし、この場合は減速であるので、逆の符号を有する）；これは図に示されている。このより低い速度において、混合用微小流路２１６内への流れを駆動させる全体的な圧力が低下する。混合用微小流路２１６は狭くて長いために、混合用微小流路２１６は、流れに対してかなりの水力抵抗を示す。この低速度において、リザーバー２０４と２０５における流体間の圧力差（例えば、これは、例えば、異なる容量を有するこれらのリザーバーによって引き起こされ得る）は、流体が混合用微小流路２１６内に流れるときに「釣り合う」。例えば、リザーバー２０４からの流体が、リザーバー２０５からの流体が流れるよりも早く最初に流れる場合、リザーバー２０４における半径方向の流体の広がりは、大部分の時間でリザーバー２０５における広がりよりも少なくなる；従って、微小流路２１１において及ぼされる圧力は、リザーバー２０５内の流体によって及ぼされる圧力よりも低くなり、その結果、リザーバー２０５内の流体の流速はリザーバー２０４内の流体の流速に対して増大し、半径方向における流体の広がりたは水頭の「均衡」がもたらされる。その結果、流体は、これらのリザーバーの断面積比に等しい厳密な比率で進入する。流体によって追い出される空気は、流路２２０を通って空気通気孔２２１に逃される。図９ｂには、回転速度ω３におけるある時刻での状況が例示されている。
【０１５３】
リザーバー２０６から混合用微小流路２１９を通る並行した流体の流れが、回転速度ω３において達成される。通常の場合、混合が実際には生じないので、微小流路２１８の形状は、それを通って押し出される流体が大きすぎる回転速度でチャンバー２１９を満たさない限り（すなわち、速度がω３に低下しないうちは）重要ではない。
【０１５４】
回転速度ω３における回転は、リザーバー２０４、２０５および２０６からリザーバー２１７および２１９への流体の流れを駆動させる。リザーバー２０４および２０５からの流体の混合比における変化を防止することに加えて、それよりも低い速度は、リザーバー２１７および２１９の外側端において及ぼされる圧力が、流体を保持するように設計された毛管接合を流体が通り抜けられないほど十分に低いことを意味する。
【０１５５】
十分な時間が、リザーバー２０４、２０５および２０６からリザーバー２１７および２１９への流体の流れを押し出すために過ぎた場合、回転速度は、さらに加速度α４でω４に減らされる。これは、図８には、４００ｒｐｍよりもわずかに小さいことが示されている。ディスク上における流体のこの配置が図９ｃに示されている。その後、熱が、サンプルおよびアルカリ細胞溶解緩衝液の混合物を含有するリザーバー２１７に加えられる。８５℃〜９５℃の間で行われるこの加熱工程は６０秒間〜１２０秒間にわたって加えられ、これは、細菌の細胞壁または哺乳動物細胞の原形質膜を破壊するには十分であり、それによって、ＤＮＡが溶液中に放出される。アルカリ細胞溶解液もまた、ポリメラーゼ酵素の活性を妨害し得る、血液サンプルに見出されるヘモグロブリンなどのタンパク質を変性させる作用を有する。
【０１５６】
その後、速度は、図８に示されているようにα５でω５（約８００ｒｐｍ）にまで急速に上げられ、これにより、毛管接合２２３および２２６において保持されている流体は、毛管圧を乗り越えたときに接触する。２２３の断面積が２２６の断面積よりも大きく、溶解物が最初に流れることを保証するマイクロフルーイディックス構造体が提供される。これらの流体は、接触した状態で、上記に記載されているように混合用微小流路２２９内に流れ、混合される；速度は、溶解物流体および中和液の制御された混合のために加速度α６でω６（図８において約５００ｒｐｍ）に減らされる。図９ｄには、リザーバー２３０内への流体混合物の動きが例示されている。図９ｅには、流体が押し出された後の流体の配置が例示されている。
【０１５７】
細胞溶解物および中和緩衝液の混合物がリザーバー２３０内に移されたとき、プラットホームの速度はα７で速度ω７（図８において約１２００ｒｐｍ）に上げられる。この加速は、典型的には、他の加速と比較して穏やかである（これは、図８に示されている加速度プロフィルのより小さい傾きによって示される）；これは、チャンバー２３０および２３７ならびに毛管接合２３３および２４０の設計は、図９ｆに示されているように非常に小さい「圧力水頭」を示すからである。遠心力による毛管接合における圧力は、次式によって表される：
【数３】
【０１５８】
図９ｈには、ディスクの最終的なマイクロフルーイディックス状態が例示されている。すべての流体が熱サイクル処理用チャンバー２４１に送達されている。プラットホームの速度は、緩やかな加速と同様である遅い減速プロフィルα８で回転速度ω８（図８において約５００ｒｐｍ）に下げられる。
【０１５９】
熱サイクル処理が、様々な熱サイクル処理プロトコルおよび温度プロフィルを使用して熱サイクル処理用チャンバー２４１において行われる。そのような温度プロフィルの例は下記を含む：
１．二本鎖ＤＮＡを変性させるために高い温度（例えば、約９５℃）で反応混合物を保持すること
２．１サイクルの工程を行うこと、ただし、ｎサイクルの場合、下記の工程が、ｎ−１回、同一的に繰り返される：
ａ）プライマーを一本鎖ＤＮＡにアニーリングさせるために、温度を、一時的に、あるいはアニーリング期間にわたってアニーリング温度（例えば、４５℃〜７５℃）に低下させること
ｂ）温度を、一時的に、あるいはより好ましくは、増幅プライマーの伸長を可能にするプライマー伸長期間とともに伸長温度（例えば、６０℃〜７０℃）に上げること；および
ｃ）増幅されたフラグメントの変性温度に温度を上げること。
【０１６０】
必要に応じて、最後の反応工程は、混合物をアニーリング温度に下げ、その後、熱サイクル処理用チャンバーの温度を、すべての伸長生成物について伸長反応を実質的に完了させるのに十分な時間にわたって伸長温度に上げることを含む。
【０１６１】
その後、サンプルの温度は、通常、反応を停止させるために室温以下に下げられる。
【０１６２】
次に、私が理解しているように、熱サイクル処理用チャンバーは単に、断熱層によって覆われた大きなリザーバーである。正しいか？
下記の実施例は、本発明のいくつかの好ましい実施形態をさらに例示することを目的とし、決して限定するものではない。
【０１６３】
実施例１
大腸菌に由来するゲノムＤＮＡのサンプル調製およびＰＣＲ
図１〜図４に示されているようなマイクロフルーイディックスプラットホームを使用して、大腸菌のサンプルからＤＮＡ標的を調製し、増幅した。回転プロフィルおよび熱サイクル処理を制御するために使用された装置の様々な局面は、共同所有の米国特許第６，０６３，５８９号（２０００年５月１６日発行）ならびに共同所有で同時係属している特許出願の米国特許出願第０８／７６１，０６３号（１９９６年１２月５日出願）；同第０８／７６８，９９０号（１９９６年１２月１８日出願）；同第０８／９１０，７２６号（１９９７年８月１２日出願）；同第０８／９９５，０５６号（１９９７年１２月１９日出願）；同第０９／３１５，１１４号（１９９９年５月１９日出願）；同第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願）；および同第０９／ ， 号（２０００年６月１６日出願；代理人文書番号９５，１４０８−ＸＸ）（これらのそれぞれの開示は明示的に参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されている。本実施例において使用された装置は、「好適な実施形態の詳細な説明」において上記に記載されている。
【０１６４】
マイクロフルーイディックス構造体を、Ｌｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社のＶＭＣ５０００フライス盤を操作するＬｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社の「Ｂｅｎｃｈｍａｎ」ソフトウエア（Ｌｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＨ）を使用するコンピューター／数値コード加工を使用してアクリルを加工することによって製造した。その後、ディスクを、沸騰した塩化メチレンからの蒸気をさらすことによって蒸気研磨して、加工マークを除き、そして加工された表面を滑らかにした。両面テープ（７９５３ＭＰ（１．５−０．５−１．５）など）の層をディスクの加工面に貼り付けた。テープは、貼り付ける前に型切断されたか、あるいは貼り付け後に熱サイクル処理用チャンバーの開口部から切り取られた。これは、テープの接着剤における知られているＰＣＲ阻害剤にさらされる可能性を最小限にするために行われた。その後、マイラー（ＩＣＩ）の層を両面テープに貼り、ディスクの流体構造体のシールを完全にした。多くの場合、その後、ディスクは、共同所有で同時係属中の米国特許出願第０９／５７９，４９２号（２０００年５月１２日出願、これは参考として組み込まれる）においてより詳しく開示されている方法を使用してパリレンにさらすことによって不動態化された。
【０１６５】
サンプル調製およびＰＣＲのために使用された溶液は、アルカリ細胞溶解液、中和緩衝液、および特定の標的配列を増幅するためのオリゴヌクレオチドを含有するＰＣＲ反応混合物であった。
【０１６６】
大腸菌の懸濁物をＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地で供給した。これは、標準的な実験室用分光光度計での６００ｎｍの吸光度を使用して計算されるように２．７ｘ１０９細胞／ｍｌ〜３．３ｘ１０９細胞／ｍｌの細胞濃度を有していた：所望する細胞数を達成するための培養物の希釈物を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培養液を使用して作製し、その後、脱イオン水で４０倍に希釈した。
【０１６７】
使用したアルカリ細胞溶解液は１０ｍＭのＮａＯＨであり、中和緩衝液は１６ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）であった。ＰＣＲ反応混合物は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社のＲｅａｄｙ−ｔｏ−ＧｏビーズまたはＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＴａｑ２０００のいずれかであった。Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏビーズを再懸濁して、２５μＬの最終容量にした。両方の系は、適切な塩および安定化剤とともに２００μＭの各ｄＮＴＰおよび１．５ｍＭのＭｇＣｌ２の最終濃度をもたらす。この混合物に、目的とするプライマーを、反応における各プライマーが２０ｐｍｏｌの濃度で加えた。これらのプライマーは、大腸菌ゲノムのランダムに選択された３００塩基対（ｂｐ）の非コード配列を規定するプライマー対であるＥｃｏＣｔｌ、またはｌａｃＩリプレッサータンパク質に対する４２２ｂｐコドンを規定するプライマー対であるｌａｃＩであった。
【０１６８】
ＥｃｏＣｔｌ−Ｆ配列：５’−ＡＧＴＡＣＣＧＣＡＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＧＴＡＡＴＧＣ−３’（配列番号１）；
ＥｃｏＣｔｌ−Ｒ配列：５’−ＧＴＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＴＴＣＡＧＡＧＧＡＡＴＡＡＣＣＧＣ−３’（配列番号２）；
ＬａｃＩ−Ｆ配列：５’−ＣＣＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＧＧＣＣＣ−３’（配列番号３）；
ＬａｃＩ−Ｒ配列：５’−ＡＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＣＧＧＧＣＡＡＡＣＡ−３’（配列番号４）。
【０１６９】
プライマーはすべて、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ）から得た。
【０１７０】
ＰＣＲプロトコルは、Ｒｕｄｂｅｃｋ＆Ｄｉｓｓｉｎｇ（１９９８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２５：５８８〜５９２）から改変した。ＰＣＲプロトコルは下記の工程からなる：５μＬのサンプルを５μＬのＮａＯＨと混合すること；混合物を約９５℃に１２０秒間加熱して、細胞を溶解すること；溶解物を５μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中和緩衝液と混合すること；および中和された混合物を、選択されたプライマーを含有する１０μＬのＰＣＲ反応混合物と混合すること。その後、この最終溶液を熱サイクル処理に供した。
【０１７１】
コントロールの反応を、上記のサンプル調製工程を手作業で行うことによって実験台において従来的に行った。熱サイクル処理を、ホットボンネットサーマルサイクラーを用いるＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のモデルＰＴＣ−１００において行った。この反応に対するサイクル処理パラメーターは下記の通りであった：
【表１】
【０１７２】
適切な容量を、図３に示されているチャンバー２０４、２０５、２０６および２３６に充填した後、ディスクを装置のプラテンに載せた。ディスクの中心孔が、ねじ切られたねじを覆ってプラテンの軸に置かれた。熱グリースを、ディスクと熱電気構成要素との良好な熱的接触を保証するために使用した。保持用のねじを使用して、ディスクを所定位置に保持した。
【０１７３】
使用した回転プロフィルは下記の工程からなった：
【表２】
【０１７４】
代表的なアッセイの結果を図１０に示す。この図は、従来のＰＣＲ装置と比較される、本発明のプラットホームによって得られたＤＮＡフラグメントの（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（第２版）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．に記載されているような）従来のゲル電気泳動分析を表している。これらの結果は、本発明のプラットホームにおいてＰＣＲを行うことにより、従来的に増幅されたフラグメントとの比較によって決定されるように正しいサイズを有する増幅された標的フラグメントが、従来の熱サイクル処理装置を使用して増幅されたフラグメントの収量に等しい収量で得られたことを明らかにしている。
【０１７５】
ＰＣＲ産物フラグメントの収量を、照明源（ニコン、超高圧水銀ランプ電源、モデルＨＢ−１０１０１ＡＦ）を用いるエピ蛍光顕微鏡を使用して定量的に評価した。典型的な収量は、実験台方法と比較して６０％〜１００％の収量である（２００００コピーの標的出発材料を用いて３５ｎｇ〜４０ｎｇ）。
【０１７６】
上記に記載された装置によるサイクル処理において、主として蒸発による容量損失は、典型的には、２５μＬの反応に関して、総投入容量の約２０％であり、典型的な回収量は約２０μＬである。この容量損失は増幅の経過とともに徐々に生じている。蒸発物の大部分は、サイクル処理チャンバーのすぐ上方の流路内に凝縮し、そしてサイクル処理チャンバー内に回転させて戻すために十分な液体が集まるまで集められる。
【０１７７】
ディスク上でサンプルを熱サイクル処理することによる多重化もまた、大腸菌サンプルを用いて明らかにされた。２００００個の細胞を、上記に記載されたプロトコルに従って実験台において溶解し、ＰＣＲ試薬と混合した。使用されたプライマーは、上記に記載されたＥｃｏＣｔｌプライマーおよびｌａｃＩプライマーであった。サンプルをサイクル処理チャンバー内にピペットで直接入れ、上記に概略されているパラメーターを使用してサイクル処理した。速度プロフィルもまた、プロフィルのサイクル処理部分について上記の通りであった：温度サイクル処理の継続期間中は５００ｒｐｍ。熱サイクル処理された多重サンプルに対する典型的な結果を図２７に見出すことができる。ＰＣＲ産物フラグメントの収量を、上記に記載されているように、照明源を用いるエピ蛍光顕微鏡を使用して定量的に評価した。ディスクから回収されたＰＣＲフラグメントの収量は、一般に、実験台での収量の約７０％であった。これは、単一アンプリコンサンプルの収量の範囲内である。
【０１７８】
実施例２
ウシ血液に由来するゲノムＤＮＡのサンプル調製およびＰＣＲ
実施例１に示されている実験を、全血サンプルを使用して繰り返した。これらの実験において、ヘパリン処理されたウシ血液を脱イオン水で１：４０に希釈した。ウシ血液の白血球（ＷＢＣ）の正確な数は測定されなかったが、平均値は約５ｘ１０６細胞／ｍｌであることが知られている。
【０１７９】
使用したアルカリ細胞溶解液、中和溶液およびＰＣＲ試薬は、上記に記載されている通りであった。ＰＣＲ反応混合物には、目的とするプライマー対が加えられた。プライマー対はβ−アクチンの２８９ｂｐコドンを規定する。
【０１８０】
β−アクチン−Ｆ配列：５’−ＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡ−３’（配列番号５）
β−アクチン−Ｒ配列：５’−ＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣ−３’（配列番号６）。
【０１８１】
使用した一般的なプロトコルは、上記に記載されているプロトコルと同様であった。白血球は細菌よりも頑丈ではないので、選ばれた溶解温度は９１℃であった。
【０１８２】
使用した回転プロフィルは、実施例１に記載されている通りである。
【０１８３】
熱サイクル処理パラメーターは下記の通りであった：
【表３】
【０１８４】
実施例３
大腸菌に由来するｐＴｒｃＨｉｓＡプラスミドＤＮＡのサンプル調製およびＰＣＲ
図１４に示されているプラットホームを、大腸菌のサンプルを処理して、プラスミドＤＮＡの単離および精製を行うために使用した。回転プロフィルおよび熱サイクル処理の制御のために使用された装置は、記載されている通りであった。回転プロフィルおよび熱サイクル処理を制御するために使用された装置は、パーソナルコンピューター、ＰＣとサーボ制御型駆動モーターとのインターフェース電子工学、およびＰＣとスクリーン印刷回路とのインターフェース電子工学からなった。この例の場合、中心軸は、エンコーダーを有するサーボ制御型ＤＣモーター（Ｍｉｃｒｏｍｏ、パーツ番号３５５７ＫＯ１２ＣＲ）によって駆動される。シリアルポート変換器（Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ、パーツ番号Ｚ２３２−４８５）およびモーター制御ボード盤（Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ、ＰＩＣ−ＳＥＲＶＯ）は、ＰＣとモーターとの連絡インターフェースを提供する。スリップリング（Ｌｉｔｔｏｎ、パーツ番号ＡＣ６０２３−２４）は、回転中のプラットホームと固定された電源との電気的な接続を提供した。
【０１８５】
マイクロフルーイディックスディスクは、上記に記載されているようにコンピューター／数値コード加工を使用してアクリルを加工することによって製造された。その後、ディスクを、沸騰した塩化メチレンからの蒸気をさらすことによって蒸気研磨して、加工マークを除き、そして加工された表面を滑らかにした。
【０１８６】
融点が約５４℃であるパラフィンワックスの弁を、少量の融解ワックスを犠牲弁の毛管にピペットで入れ、そしてワックスが固化する前に平らな縁でワックスを素早く平坦に押し付けることによって挿入した。過剰量を流路の端からふき取り、流路の両端における余分なワックスを、Ｅｘａｃｔｏの刃を使用して切り取った。ディスクを（下記に記載されているように）完全に組み立てた後、５Ｖをワックス弁に対応するリード線のそれぞれに加えて、ワックスを流路内で融解させ、そして再度結晶化させた。これにより、ワックスが流路の断面を連続的に覆うことができる。
【０１８７】
１枚のＷｈａｔｍａｎろ紙＃５４および１片のフリット材（Ｐｏｒｅｘから得られる：＃Ｘ−４５８８、７０μｍの細孔サイズを有する）を、チャンバー１００５の底にあるスロットの幅に切断した。ろ紙およびフリット材を、「光る」面をろ紙の方に向かせてスロットに挿入した。フリット材をディスクの中心に最も近いスロットの側面に置いた。ろ紙の向きは重要ではなかった。その後、ろ紙およびフリット材の高さを、ディスクの高さと等しくなるように切断した。
【０１８８】
１枚のガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎから得られるＧＦ−Ｆ、住所）および１片のフリット材を、上記のように、結合チャンバー１０２７内のスロット１０２９の幅に切断した。ガラス繊維フィルターをスロット内に置き、その後、フリット材を、光る面をガラス繊維フィルターの方に向かせてディスクの端に最も近い側面においてガラス繊維の背後に挿入した。その後、両方の材料の高さを、ディスクの高さと等しくなるように切断した。
【０１８９】
フッ素化されたコーティング剤（Ｃｙｔｏｎｉｘ、パーツ番号ＭＥ０００）Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｏａｔを流路Ｘ、Ｙ、Ｚに塗った。過剰なＰｅｒｆｌｕｏｒｏｃｏａｔをディスクの周囲の領域からふき取り、その後、Ｅｘａｃｔｏの刃などの鋭利物を流路に走らせ、流路が詰まっていないことを確保した。その後、フッ素化されたコーティング剤を硬化させるために、ディスクを約７０℃で１時間硬化させた。
【０１９０】
その後、１片の接着剤（３Ｍ、パーツ番号７９５３ＭＰ）をディスクの全面にわたって置き、チャンバーのすべての縁の周りを注意深くシールした。銀導電性インクおよび炭素抵抗性インクがワックス弁および結合カラムの位置に対応しているマイラーシートをディスクとともにアラインメントして、フルーイディックス構造体に向いたインクを含有する面と接着した。最後に、同じ３Ｍテープの別のシートをマイラーシート表面の裏側全体に置き、（断熱性基層を含む）加工していないアクリルディスクを、マイラー層に対する構造的一体性を得るためにテープのこの層に対して配置した。
【０１９１】
プラスミドＤＮＡを、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培養液で増殖させたトランスフェクション大腸菌の一晩培養物から得られる、ＣＲＰインサートを含有するｐＴｒｃＨｉｓベクターを有する大腸菌細菌培養物の約４０μＬの懸濁物から単離した。使用した懸濁物の容量には、約１ｘ１０８個〜約１．５ｘ１０８個の細胞が４０マイクロリットルのサンプルに含有されていた。使用した試薬溶液は、Ｑｉａｇｅｎ社のミニプレップキット（ＱＩＡｐｒｅｐ ミニプレップハンドブック、Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、Ｍａｘ−Ｖｏｌｍｅｒ−Ｓｔｒａｓｓｅ ４、４０７２４ Ｈｉｌｄｒｅｎ、ドイツ）から改変したか、あるいは原料から作製した。アルカリ細胞溶解液は、ミニプレップキットにおける溶液Ｐ２に対応する、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ； 重量対容量）を含む２００ｍＭのＮａＯＨであった。沈殿化溶液は、ミニプレップキットにおける溶液Ｎ３に対応する、１．０Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．５）および３Ｍグアニジン塩酸塩であった：この溶液は溶解混合物のｐＨを調節して、大きなゲノムＤＮＡフラグメント、ＳＤＳおよびタンパク質を沈殿させる；さらに、カオトロピック性の塩はＤＮＡの水和殻を破壊し、ＤＮＡをケイ酸物質に結合させることができる。第１および第２の洗浄液は７０％エタノール／水（ｖ／ｖ）であり、ミニプレップキットにおける溶液ＰＥに対応する；この溶液により、残留する塩がガラス繊維マトリックスから除かれた。溶出緩衝液は、０．１ＸのＴＥ（この場合、ＴＥは１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および１ｍＭのＥＤＴＡである）であり、結合したプラスミドＤＮＡをガラス繊維マトリックスから溶出させた。
【０１９２】
実験台コントロールおよび本発明のプラットホームの使用に対するプロセス工程はともに下記の通りであった：
（１）サンプル（約５０マイクロリットル）をアルカリ細胞溶解液（約５０マイクロリットル）と混合して、溶解させる
（２）得られた溶液を沈殿化溶液（約７０マイクロリットル）と混合する
（３）流体をろ過して、沈殿物および細胞破片を除く
（４）結合マトリックス（ガラス繊維フィルター）に加える
（５）エタノール／水（７０％ｖ／ｖ）の２回連続した洗浄を行う（最初の洗浄には約１００マイクロリットルを使用し、２回目の洗浄工程には約１５０マイクロリットルを使用する）
（６）プラスミドＤＮＡを、４０マイクロリットルの０．１Ｘ ＴＥ液を使用して溶出する。
【０１９３】
工程（１）〜（６）はＱｉａｇｅｎ社のミニプレッププロトコルからの改変である：発表されたプロトコルからの変更は溶液の容量割合だけである。上記に列記された容量を実験台コントロールおよびディスクの両方に使用した。実験台コントロールに対する材料および手順は、ミニプレップキットの場合と同様である；本発明のディスクは、下記の工程によって流体を負荷した後に操作された：
１）１０００ＲＰＭに加速する。アルカリ細胞溶解液をリザーバー１０１６から混合用チャンバー１００５に流す（図１７ａ〜図１７ｃに示す；矢印により記されるωは回転方向を示す（反時計回りであるように自由に選ばれる））。
【０１９４】
２）完全な停止および５００ｒｐｍ／ｓの加速を使用して５分間攪拌して、溶液およびサンプルを混合する（図１７ｄ〜図１７ｅに示す）。
【０１９５】
３）１０００ＲＰＭに加速する。
【０１９６】
４）１０２１における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加える。沈殿化溶液を１００５に移動させる（図１７ｆ）。
【０１９７】
５）上記の工程（２）のように混合する。
【０１９８】
６）１０００ＲＰＭに加速する。１０１２における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加える。溶液を１００５から結合カラム１０２７に放出させる（図１７ｇ）。沈殿混合物がガラスフィルターを通って廃棄物チャンバー１０３４に完全に移動するのに十分な時間にわたって１０００ＲＰＭで維持する。
【０１９９】
７）１０３７における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加え、第１の洗浄液を放出させる。第１の洗浄液がガラス繊維を通って廃棄物チャンバー１０３４内に完全に入るまで回転速度を１０００ＲＰＭで維持する（図１７ｇに示す）。
【０２００】
８）１０４８における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加え、第２の洗浄液を放出させる。第２の洗浄液がガラス繊維を通って廃棄物チャンバー１０３４内に完全に入るまで回転速度を１０００ＲＰＭで維持する（図１７ｈに示す）。
【０２０１】
９）１０３２における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加え、サンプル回収チャンバーを開ける。
【０２０２】
１０）５秒後、１０５８における犠牲弁に対応するリード線に電圧を加え、溶出緩衝液を放出させる。
【０２０３】
１１）洗浄されたすべての溶出緩衝液がガラス繊維フィルターを通ってサンプル回収チャンバー内に入るまで、プラットホームの回転を１０００ｒｐｍで維持する。さらなる溶出緩衝液が微小流路１０３２を通って流れていることが見えなくなった後、プラットホームの回転速度を少なくともさらに１分間維持する（図１７ｊ〜ｋに示す）。
【０２０４】
１２）ポート１０５５を使用してプラットホームから流体サンプルを取り出す。
【０２０５】
実験台コントロールおよび本発明のディスクで処理されたサンプルの両方について、回収された流体をＳｐｅｅｄｖａｃで乾燥した（Ｓａｖａｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｄｒｙｉｎｇは、分析される液体の容量を少なくする（そして濃度を増大させる）ために役立つ）；これは残留エタノールをも除く。その後、乾燥サンプルを１０マイクロリットルの脱イオン水に再懸濁した。場合により、９塩基切断酵素であるＡｌｗＮ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｅｙ、ＭＡ）などの制限酵素を使用して、サンプルを消化した。この酵素は、残留する塩に対して敏感であり、その結果、サンプルの清浄度の試験として役立つ。すべての場合において、未消化サンプルのすべてまたは一部のいずれかを、１ＸＴＢＥ緩衝液における１％アガロースゲルでの臭化エチジウムゲル電気泳動を使用して分離した。得られたバンドは、サイズラダーと比較したときにサンプル中のプラスミドＤＮＡのサイズを示している。より大きなゲノムＤＮＡは、サンプルに混入している場合にはゲルのウエル内に視認される。消化されたサンプルの場合、未切断バンドが残らないサンプルの完全な切断により、サンプルの清浄度が示される。
【０２０６】
図１８には、いくつかの異なる制限酵素を使用することによるサンプルの純度を例示するゲルが示されている。最初に、ゲル上の単独で泳動された未切断サンプルにより、プラスミドが、サンプル自体に塩をほとんど含まないいくつかの異なる配座異性体で示されている。プラスミドをＥｃｏＲＶ酵素で切断した。この酵素はプラスミドを線状化して、すべての配座異性体をラダーに対して１つのサイズで泳動させる。これにより、すべての配座異性体が切断され得ることが明らかにされる。第２の消化は、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの両方の部位を使用する二重消化であった。これらの部位はＣＲＰインサートの両端に含まれ、２つの長いフラグメントと６５３塩基のインサートフラグメントとを生じさせる。消化としての最後はＡｌｗＮ１であった。これは９塩基切断酵素であり、生成物中の塩混入に対して非常に敏感である。これらのアッセイの結果により、本発明のプラットホームを使用して得られたプラスミドＤＮＡは、品質および純度において、従来の実験台方法を使用して単離されたプラスミドＤＮＡに匹敵し得ることが明らかにされる。
【０２０７】
図１９には、ゲノムＤＮＡ混入に対するアッセイの結果が示されている。ＰＣＲが、プラスミド特異的プライマーならびに大腸菌ゲノムＤＮＡのフラグメントに特異的なプライマーを使用して行われる。陰性コントロールおよび陽性コントロールにはゲノムＤＮＡおよびゲノムプライマーを使用した。最初の増幅シリーズは、プラスミド特異的プライマーを使用して、プラスミドのテンプレートＤＮＡが減少する量で増幅された予想されるフラグメントを示す。第２の増幅シリーズは、ゲノムＤＮＡプライマーおよびプラスミドＤＮＡテンプレートを使用するゲノムＤＮＡフラグメントの増幅（またはその非存在）を示す。
【０２０８】
理解され得るように、連続した１０倍希釈物は、１：１０００希釈までのプラスミド特異的プライマーを使用して有意なＰＣＲ産物をもたらしている。１：１００００希釈においてのみ、増幅がほとんど得られなかった。逆に、ゲノムＤＮＡ特異的プライマーは、サンプル自体および１：１０希釈の場合にだけ増幅を示している。これらの観測結果は、ゲノムＤＮＡに対してプラスミドが約１０００倍過剰であることを示している。
【０２０９】
実施例４
大腸菌に由来するゲノムＤＮＡのＰＣＲ
図６、図７、図２４、図２５および図２６に示されているようなマイクロフルーイディックスプラットホームを使用して、大腸菌のサンプルからＤＮＡ標的を増幅した。
【０２１０】
図６は、マイクロフルーイディックスプラットホームの２つの主要な構成要素の分解図を示している。加工されたフルーイディックスディスク７０１が、スクリーン印刷された電気回路ディスク７１０に結合される。
【０２１１】
図７は、フルーイディックスディスク内における８個のサイクル処理用チャンバー７０３の配置を示している。熱サイクル処理用チャンバーは円形であり、７ｍｍの直径および０．５ｍｍの深さを有する。各チャンバーは反応混合物充填流路７０４および空気流路７０２を有する。両方の流路は０．５ｍｍ幅×０．５ｍｍ深さである。空気流路は、回転させて反応チャンバーに戻される前に蒸気が冷えて、その壁に沿って凝縮した場合の加熱時の液体損失を防止することを助ける。
【０２１２】
図２４は、抵抗ヒーターがどのように電気回路ディス上に配置されているかを示している。抵抗ヒーターパッチ７１３は、１辺が１０ｍｍの正方形である。ヒーターの大きさは、サイクル処理チャンバーにおける熱勾配を最小限にするために、サイクル処理チャンバーの大きさよりも大きくなるように選ばれた。電流は、陽極７１２およびアース７１１のリード線を介してヒーターに供給される。
【０２１３】
図２５は、サイクル処理チャンバー、結合層および抵抗ヒーターの断面図である。フルーイディックスディスク７０１が、０．１ｍｍ厚のマイラーシート７２６（ＩＣＩ、パーツ番号ＳＴ５０５）に両面テープ７２７（３Ｍ、パーツ番号７９５３ＭＰ）を使用して合わせられる。両面テープは、テープからの反応汚染を最小限にするために、反応チャンバーの下部の領域から除かれている。マイラー層７２６が、電気回路層７１０に両面テープ７２３を使用して合わせられる。これらの２つの層は、反応チャンバーの配置が抵抗ヒーターの配置とそろうことを保証するために半径方向にアラインメントされる。熱伝導性エラストマー７２４（Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ、パーツ番号ＣＰＵ Ｐａｄ）が、サイクル処理チャンバーにおける考えられる熱勾配を最小限にするために抵抗ヒーター７１３とマイラーシート７２６との間に挿入される。サイクル処理の温度制御のために使用される０．１ｍｍの熱電対７２５（Ｏｍｅｇａ、パーツ番号ＣＨＡＬ００５−Ｋ型）が、マイラーシート７２６と伝導性エラストマー７２４との間に挿入される。電気回路層７１０が、底部のポリカーボネート支持ディスク７２１に両面テープ７２２を使用して合わせられる。
【０２１４】
マイクロフルーイディックス構造体を、Ｌｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ社のＶＭＣ５０００フライス盤を操作する「Ｂｅｎｃｈｍａｎ」ソフトウエア（Ｌｉｇｈｔ Ｍａｃｈｉｎｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＨ）を使用してポリカーボネートディスクを加工することによって製造した。構造体は、コンピューター製図プログラムを使用して設計され、コンピューター機械コードに変換された。ディスクは、エタノールで、次いで空気で清浄化され、その後、沸騰した塩化メチレンからの蒸気をさらすことによって研磨され、表面の不完全性が除かれた。
【０２１５】
電気回路ディスクは、当業者によって知られ、そして第６，０６３，５８９号において詳細に開示されているスクリーン印刷技術を用いて製造された。炭素系抵抗インク（Ｄｕｐｏｎｔ、７１０２／７０８２混合物）を使用して、抵抗ヒーターを印刷し、そして銀系インク（Ｄｕｐｏｎｔ、５０２８）を使用して、導電性リード線を０．１ｍｍ厚のマイラーシート上に印刷した。
【０２１６】
回転プロフィルおよび熱サイクル処理を制御するために使用された装置は、パーソナルコンピューター、ＰＣとサーボ制御型駆動モーターとのインターフェース電子工学、およびＰＣとスクリーン印刷回路とのインターフェース電子工学からなった。この例の場合、中心軸は、エンコーダーを有するサーボ制御型ＤＣモーター（Ｍｉｃｒｏｍｏ、３５５７ＫＯ１２ＣＲ）によって駆動される。シリアルポート変換器（Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ、Ｚ２３２−４８５）およびモーター制御ボード盤（Ｊ．Ｒ．Ｋｅｒｒ、ＰＩＣ−ＳＥＲＶＯ）は、ＰＣとモーターとの連絡インターフェースを提供する。スリップリング（Ｌｉｔｔｏｎ、ＡＣ６０２３−２４）は、回転中のプラットホームと固定された電源との電気的な接続を提供した。熱電対によって測定される温度依存性電圧は、小型の転送器（Ｏｍｅｇａ、パーツ番号ＴＸ９１Ａ）を使用して電流に変換され、スリップリングを介して出力された。この電流は、ＰＣ内の市販のアナログ／デジタルボード盤（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｂｏａｒｄｓ、パーツ番号ＣＩＯ−ＤＡＳ１６００）によって電圧に変換されて読み取られた。抵抗ヒーターにかかる電圧はまた、スリップリングを介して加えられ、温度を所望する温度にするために変化させられた。
【０２１７】
定電力制御ループが、反応チャンバーの温度を制御するために使用された。経験的なデータは、６０℃〜１００℃の温度を維持するためには０．４Ｗ〜１．２Ｗの電力が必要であることを示していた。この例において、ＰＣのソフトウエア制御プログラムは熱電対の温度を読み取り、設定点の温度に比例した制御電圧を出力する。この電圧は、抵抗ヒーターと直列になっている定電力回路に入力された。温度が上昇すると、ヒーター抵抗が増大した。一定の電力を維持するために、回路はその出力電流を低下させた。ゼロ出力における冷却が、プラットホームの露出面からの対流によってもたらされ、そしてディスクを５００ｒｐｍの一定速度で回転させることによって助けられた。加熱速度は１．５℃／秒もの大きさであり、冷却速度は１．０℃／秒であった。
【０２１８】
ディスクは、ディスク７０５内の中心孔を介してモーターの中心軸に取り付けられた。スリップリングが、ねじを使用してディスクの上部に固定された。スリップリングは、適切な電力制御および温度測定のリード線が接続されるように電気回路層とともに並べられた。
【０２１９】
ＰＣＲ溶液は、脱イオン水、大腸菌のゲノムテンプレート（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、大腸菌ゲノムＤＮＡのβ−ガラクトシダーゼコドンの２１５塩基対部分を増幅するプライマー組ＥＢＧＡ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、およびＲｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からなった。ＥＢＧＡフォワード配列は５’−ＡＣＣＴＧＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＴ−３’（配列番号７）によって示され、ＥＢＧＡリバース配列は５’−ＣＧＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＴＴＧＣＴＴＡＴＴＣＴＣ−３’（配列番号８）によって示される。変性温度、アニーリング温度、伸長温度は、それぞれ、９５℃、６０℃および７２℃であるように選ばれた。ＰＣソフトウエアの設定値は、１００℃、６０℃および７２℃であった。設定値と得られた温度との差は、反応チャンバーの下部にある熱電対の位置およびディスクによる温度勾配に基づいて予想される。
【０２２０】
図２６には、このシステムで３０サイクルを行った後におけるゲル電気泳動結果が示されている。これらの結果は、このゲルで示されているように、市販のサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、モデル番号ＰＴＣ−１００）で行われた増幅と比較して勝っている。
【０２２１】
前記の開示は本発明のいくつかの特定の実施形態を強調していること、そしてそれらに対して均等論的な改変または代替はすべて本発明の精神および範囲に含まれることを理解しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の微量システムプラットホームの分解斜視図を示す。
【図２】図２は、図１に分解斜視図で示された微量システムプラットホームの１つの構成要素であるマイクロフルーイディックス層の平面図を示す。
【図３】図３は、図２に例示されたマイクロフルーイディックス層の断面の細部である。
【図４】図４は、図３に例示された構造体の一領域の細部を示す。
【図５】図５は、熱サイクル処理用チャンバーの近傍における図１の微量システムプラットホームの断面図である。
【図６】図６は、マイクロフルーイディックスディスクおよび印刷された回路の分解斜視図を示す。
【図７】図７は、図６に示されたマイクロフルーイディックスディスクの平面図を例示する。
【図８】図８は、実施例１および実施例２における微量システムプラットホームを通過する流体の動きを行わせるために使用される速度プロフィルの回転速度（ｒｐｍ）対時間を例示する。
【図９】図９は、図８の速度プロフィルによって駆動される流体の動きの順序を例示する。
【図１０】図１０は、大腸菌から単離されたＤＮＡに含有される標的フラグメントのＰＣＲ増幅のゲル電気泳動分析の写真である。
【図１１】図１１は、ウシ血液から単離されたＤＮＡに含有される標的フラグメントのＰＣＲ増幅のゲル電気泳動分析の写真である。
【図１２】図１２は、ＤＮＡサンプル調製ディスクの分解斜視図を示す。
【図１３】図１３は、図１２に示されたこのディスクの平面図である。
【図１４】図１４は、プラスミドＤＮＡ調製プラットホームに対するマイクロフルーイディックス構造体の平面図を示す。
【図１５】図１５は、プラスミドＤＮＡ調製プラットホームに対する加熱層の平面図を示す。
【図１６】図１６は、プラスミドＤＮＡ調製プラットホームに対する基層の平面図を示す。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｋは、プラスミドＤＮＡ調製プラットホームに対するマイクロフルーイディックス構造体を通過する流体の動きを例示する。
【図１８】図１８は、従来的に調製されたプラスミドＤＮＡ（コントロール）、または本発明のプラスミドＤＮＡ調製プラットホームを使用して調製されたプラスミドＤＮＡの制限酵素消化プロフィルのゲル電気泳動分析の写真である。写真において、外側のレーンはサイズマーカーである。
【図１９】図１９は、本発明のプラスミドＤＮＡ調製プラットホームを使用して、プラスミドＤＮＡまたは細菌ゲノムＤＮＡに特異的なプライマーを使用するインビトロ増幅反応のゲル電気泳動分析の写真である。写真において、テンプレートＤＮＡの量は、左側から右側に移動する各組の増幅反応において少なくなる；外側のレーンはサイズマーカーである。
【図２０】図２０は、本発明の電気的プラテンおよび制御エレメントの平面ダイアグラムである。
【図２１】図２１は、本発明の電気的プラテンにおける温度制御エレメントの平面ダイアグラムである。
【図２２】図２２は、プラテンおよび温度制御エレメントの印刷された回路ボード盤における電気リード線間の電気的接続の平面ダイアグラムである。
【図２３】図２３は、ペルチェ素子を含む本発明による温度制御エレメントの構造体の断面図である。
【図２４】図２４は、図６に示された電気的回路層の平面図を示す。
【図２５】図２５は、図６に示されたディスクに対する断面図を示す。
【図２６】図２６は、図６に示されたディスクを使用して大腸菌サンプルから増幅されたＤＮＡ標的のゲル電気泳動分析の写真である。
【図２７】図２７は、熱サイクル処理用チャンバーで行われた多重ＰＣＲの例を示す。
Claims (30)
- ＤＮＡサンプル調製を行うための、向心力によって駆動される微量システムプラットホームであって、
ａ）プラットホームの表面に埋め込まれた１つ以上のマイクロフルーイディックス構造体を含む表面を有する基板を含む回転可能なプラットホームであって、それぞれのマイクロフルーイディックス構造体は、
ｉ）流体的にｉｉ）に接続されているサンプル入口ポート
ｉｉ）温度制御エレメントと熱的に接触している細胞溶解チャンバーであって、細胞破片ならびに沈殿したタンパク質および核酸を保持する細孔度を有するフィルターエレメントをチャンバー内に有する細胞溶解チャンバー、
ｉｉｉ）溶解緩衝液を含有し、微小流路によって前記細胞溶解チャンバーに流体的に接続されている溶解緩衝液リザーバー；
ｉｖ）犠牲弁を含む微小流路によって前記細胞溶解チャンバーに流体的に接続されている沈殿化緩衝液リザーバー；
ｖ）犠牲弁により遮断されている微小流路によって前記細胞溶解チャンバーに流体的に接続され、かつさらに下記のｖｉ）を含むＤＮＡ結合チャンバー：
ｖｉ）ＤＮＡに対する結合親和性を有するＤＮＡ結合フィルター；
ｖｉｉ）それぞれが洗浄緩衝液を含有し、かつ犠牲弁により遮断されている微小流路によってそれぞれが前記ＤＮＡ結合チャンバーに流体的に接続されている１つ以上の洗浄緩衝液リザーバー；
ｖｉｉｉ）微小流路によって前記ＤＮＡ結合チャンバーに流体的に接続されている廃棄物リザーバー；
ｉｘ）犠牲弁により遮断されている微小流路によって前記ＤＮＡ結合チャンバーに流体的に接続されているサンプル回収チャンバー；および
ｘ）犠牲弁により遮断されている微小流路によって前記ＤＮＡ結合チャンバーに流体的に接続されている溶出緩衝液リザーバー
を含むプラットホームを含み、
前記マイクロフルーイディックス構造体を通過する流体の流れは、プラットホームの回転から生じる向心力によって駆動され、そして犠牲弁によって遮断されている微小流路を通過する流体の流れはこれらの弁の一体性に依存している、微量システムプラットホーム。 - 前記細胞溶解チャンバーは５０μＬ〜１０００μＬの容量能を有する、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記溶解緩衝液リザーバーは２５μＬ〜３００μＬの容量能を有する、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記沈殿化緩衝液リザーバーは３５μＬ〜４００μＬの容量能を有する、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記洗浄緩衝液リザーバーはそれぞれが５０μＬ〜８５０μＬの容量能を有する、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記溶出緩衝液リザーバーは２０μＬ〜２５０μＬの容量能を有する、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記廃棄物リザーバーは３５０μＬ〜１５００μＬの容量能を有する、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記ＤＮＡ結合チャンバーは５μＬ〜２０μＬの容量能を有する、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記サンプル回収チャンバーは２０μＬ〜２５０μＬの容量能を有する、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記サンプル回収チャンバーはサンプル出口ポートをさらに含む、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記細胞溶解チャンバーは１つ以上の混合用バッフルをさらに含む、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記細胞溶解チャンバーに含有される前記フィルターは、前記細胞溶解チャンバーを前記ＤＮＡ結合チャンバーに接続する微小流路の近位に位置し、流体は前記フィルターを通って前記微小流路に進入しなければならない、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記ＤＮＡ結合チャンバーに含有される前記ＤＮＡ結合フィルターは、前記ＤＮＡ結合チャンバーを前記廃棄物リザーバーおよび前記サンプル回収チャンバーに接続する微小流路の近位に位置し、流体は前記フィルターを通って前記微小流路に進入しなければならない、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記ＤＮＡ結合チャンバーを前記廃棄物リザーバーに接続する前記微小流路は、前記ＤＮＡ結合チャンバーを前記サンプル回収チャンバーに接続する微小流路と同じであり、前記ＤＮＡ結合チャンバーを前記サンプル回収チャンバーに流体的に接続する微小流路の一部を遮断する前記犠牲弁が無傷であるときにだけ、流体が、前記廃棄物リザーバーに流体的に接続している微小流路の一部を通って流れる、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 犠牲弁のそれぞれは、ワックスを融解し、かつ弁を開けるために十分な熱を生成し得る加熱エレメントと熱的に接触しているワックス弁である、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- 犠牲弁のそれぞれは、ワックス弁を含むワックスを含有し、かつ流体が微小流路を通って流れることを可能にするのに十分な断面の大きさを有する再結晶化チャンバーをさらに含む、請求項１５に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記細胞溶解チャンバーは加熱エレメントと熱的に接触している、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- １つ以上の温度制御エレメントを有する基板を含む電気的プラテンをさらに含み、前記温度制御エレメントはそれぞれが少なくとも２つの電気リード線に電気的に接続され、前記電気リード線はスリップリングを介して電源に接続され、そして前記細胞溶解チャンバーを含む前記基板は前記プラテンから隔てられ、前記温度制御エレメントは前記細胞溶解チャンバーと熱的に接触している、請求項１７に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記マイクロフルーイディックス構造体の内側表面はパリレンでコーティングされている、請求項１に記載の微量システムプラットホーム。
- インビトロ増幅反応を行うための、向心力によって駆動される微量システムプラットホームであって、
ａ）プラットホームの表面に埋め込まれた１つ以上のマイクロフルーイディックス構造体を含む表面を有する基板を含む回転可能なプラットホームであって、それぞれのマイクロフルーイディックス構造体は、
ｉ）サンプル入口ポートを含むサンプルチャンバー；
ｉｉ）細胞溶解緩衝液を含有する細胞溶解緩衝液リザーバー；
ｉｉｉ）微小流路によって第１のリザーバーに流体的に接続されている、中和緩衝液を含有する中和緩衝液リザーバー；
ｉｖ）サンプル緩衝液チャンバーおよび前記細胞溶解緩衝液リザーバーに流体的に接続されている第１の混合用微小流路であって、サンプルおよび前記細胞溶解緩衝液を混合して溶解細胞混合物にするために十分な長さを有する長さ方向の経路をプラットホームの表面において規定し、かつ下記のｖ）に流体的に接続されている第１の混合用微小流路
ｖ）第２のリザーバー、この場合、第１および第２のリザーバーは下記のｖｉ）に流体的に接続されている、
ｖｉ）前記溶解細胞混合物および前記中和緩衝液を混合してＤＮＡサンプル混合物にするのに十分な長さを有する長さ方向の経路をプラットホームの表面において規定する第２の混合用微小流路、この場合、第１の混合用微小流路は下記のｖｉｉ）に流体的に接続されている、
ｖｉｉ）第３のリザーバー；
を含み、さらに
ｖｉｉｉ）ＤＮＡ増幅試薬混合物を含む溶液を含有する第４のリザーバー、この場合、第３および第４のリザーバーは下記のｉｘ）に流体的に接続されている、
ｉｘ）前記ＤＮＡサンプル混合物および前記ＤＮＡ増幅試薬混合物を混合して、ＤＮＡ増幅反応混合物を得るのに十分な長さを有する長さ方向の経路をプラットホームの表面において規定し、かつ下記のｘ）に流体的に接続されている第３の混合用微小流路
ｘ）下記のｘｉ）と熱的に接触している熱サイクル処理用チャンバー
ｘｉ）温度制御エレメント
を含み、
プラットホームの微小流路内の流体は、微小流路を通って流体を移動させるのに十分な時間および回転速度のプラットホームの回転運動から生じる向心力によって前記微小流路を通って移動し、そしてＤＮＡの増幅が、テンプレートＤＮＡを変性させ、プライマーをアニーリングさせ、かつプライマーをポリメラーゼによって伸長させるために温度を交互に変化させることによって前記熱サイクル処理用チャンバーにおいて行われる、微量システムプラットホーム。 - 前記サンプルチャンバーは２ｎＬ〜１０００μＬの容量能を有する、請求項２０に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記細胞溶解緩衝液リザーバーは２ｎＬ〜１０００μＬの容量能を有する、請求項２０に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記中和緩衝液リザーバーは２ｎＬ〜１０００μＬの容量能を有する、請求項２０に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記第１、第２、第３および第４のリザーバーはそれぞれが２ｎＬ〜１０００μＬの容量能を有する、請求項２０に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記細胞溶解緩衝液リザーバー、前記中和緩衝液リザーバーならびに前記第３および第４のリザーバーはそれぞれがサンプル入口ポートをさらに含む、請求項２０に記載の微量システムプラットホーム。
- 混合用微小流路のそれぞれは９０ｏよりも大きな角度を有する多数の屈曲部を含む、請求項２０に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記混合用微小流路のそれぞれを通過する流体の流速は１ｎＬ／ｓ〜１００μＬ／ｓである、請求項２０に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記熱サイクル処理用チャンバーはサンプル出口ポートをさらに含む、請求項２０に記載の微量システムプラットホーム。
- １つ以上の温度制御エレメントを有する基板を含む電気的プラテンをさらに含み、前記温度制御エレメントはそれぞれが少なくとも２つの電気リード線に電気的に接続され、前記電気リード線はスリップリングを介して電源に接続され、そして前記熱サイクル処理用チャンバーを含む前記基板は前記プラテンから隔てられ、前記温度制御エレメントは前記熱サイクル処理用チャンバーと熱的に接触している、請求項２０に記載の微量システムプラットホーム。
- 前記マイクロフルーイディックス構造体の内側表面はパリレンでコーティングされている、請求項２０に記載の微量システムプラットホーム。
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