JP6876328B2 - 容器およびその製造方法ならびに被験物質の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ法）による被験物質の検出に用いられる容器およびその製造方法ならびに上記容器を用いた被験物質の検出方法に関する。

ＥＬＩＳＡ法は、抗原の抗原決定基と抗体との特異的結合反応、および抗体または抗原に標識した酵素による呈色反応を組み合わせて用いる免疫学的測定法（イムノアッセイ）の一種である。ＥＬＩＳＡ法では、特異性の高い抗原抗体反応を利用し、酵素反応に基づく発色を電気信号に変換して測定するため、高感度で検出でき、定量性にも優れている。また、標識物質として放射性物質を用いる放射免疫測定（ラジオイムノアッセイ、ＲＩＡ）に比べて安全性が高く、安価で簡便である。そのため、ＥＬＩＳＡ法は、抗体、インフルエンザウイルス、血漿タンパク質、サイトカイン、ＤＮＡ、ペプチド、リガンドなどの生体関連物質；食品などに含まれる残留農薬や環境ホルモンなどの化学物質；糖尿病、癌などの診断に用いられる血糖、腫瘍マーカーなどの診断用物質など、様々な被験物質の検出や定量に汎用されている。

ＥＬＩＳＡ法では、容器としてマイクロプレートが使用されている。マイクロプレートは、平板状のプレートに複数のくぼみ（ウェル）が設けられたものであり、抗原抗体反応と洗浄を一括して行える。マイクロプレートの製造工程や被験物質の検出工程では、未反応の抗体等を洗い流す洗浄操作を手作業または専用のプレート洗浄器により行う。手作業による洗浄は作業が煩雑であるため非熟練者にとっては容易でなく、また、洗浄が不十分なマイクロプレートを使用すると未反応の抗体が残存していることにより、感度の低下や測定誤差の増加を引き起こすおそれがある。他方、プレート洗浄器は、ポンプやバルブ等の周辺機器を備えているため、高価かつ大型であり、使用できるのは検査機関や研究機関に限られてしまい利便性に欠ける。そこで、より簡便な方法で洗浄可能な容器が開発されている。例えば、特許文献１には遠心力を利用した円盤型分析チップが開示されている。この分析チップには複数の槽が設けられており、各槽に反応液や洗浄液を注入し、遠心力の大きさや方向を変えることで洗浄や反応が行われる。遠心力を利用しておりポンプやバルブ等の周辺機器が不要であるため、洗浄器を安価かつ小型化することができる。

米国特許出願公開第２０１５／２２６７３０号明細書

しかし、特許文献１に記載されている分析チップは、槽の構造が複雑であるため、遠心力の大きさや方向を変えることで抗原抗体反応と洗浄を切り換えたり、予め複数の槽に洗浄液を充填しておく必要があり、利便性に欠ける点で改善の余地があった。そこで、本発明は、酵素免疫測定法における洗浄操作を簡便に行うことができる容器を提供することを目的とする。

上記目的を達成し得た本発明の容器は、酵素免疫測定法による被験物質の検出に用いられるものであって、一方主面と他方主面を有している基材を有し、基材は、一方主面側であって重心を含む中央開口と、中央開口と連通しており基材の放射方向に延在している複数の内部流路と、を有している点に要旨を有するものである。本発明の容器によれば、中央開口に洗浄液を入れて、容器に遠心力を付与するという簡便な方法で中央開口と連通している複数の内部流路に一斉に洗浄液を移動させることで容易かつ十分に洗浄することができる。このため、操作者の習熟度によらず被験物質の検出精度を確保することができる。また、ポンプやバルブ等の周辺機器が不要な小型で安価な遠心器を洗浄器として利用することができる。

上記容器において、基材は、互いに積層されている上側基材および下側基材を有し、下側基材は、一方主面側に下側基材の重心を含む第１開口と、第１開口と連通しており、放射方向に延在している第２開口とを有し、上側基材は、第１開口と重なっている第１貫通口を有しており、中央開口が、第１開口および第１貫通口から形成されており、内部流路が、第２開口から形成されていることが好ましい。

上記容器において、下側基材は、互いに積層されている下側第１基材および下側第２基材から構成されており、第１開口および第２開口が、下側第１基材に設けられており、上側基材側から下側第２基材側に向かって貫通していることが好ましい。

上記容器において、放射方向において、第１開口の外方端が、第１貫通口の外方端よりも内方に形成されていることが好ましい。

上記容器において、基材は、中央開口よりも放射方向の外方であって、内部流路とそれぞれ連通している複数の外側開口を有していることが好ましい。

上記容器において、内部流路の周囲に液体を吸収するフィルタが設けられていることが好ましい。

上記容器において、内部流路を構成する壁面に被験物質を検出するための抗体が保持されていることが好ましい。

また、本発明は酵素免疫測定法による被験物質の検出に用いられる容器を製造する方法も提供する。本発明の容器の製造方法は、一方主面と他方主面を有する下側基材であって、一方主面側に下側基材の重心を含む第１開口と、第１開口と連通しており放射方向に延在している複数の第２開口を有する下側基材を準備する工程と、一方主面と他方主面を有する上側基材であって、上側基材の重心を含む第１貫通口と、第１貫通口の周囲に配置されている複数の第２貫通口を有する上側基材を準備する工程と、第１開口と第１貫通口を重ね、かつ第２開口と第２貫通口を重ねた状態で下側基材の一方主面と上側基材の他方主面を接合する工程と、第２貫通口から被験物質を検出する抗体を含む液体を入れる工程と、第１貫通口から洗浄液を入れる工程と、容器を回転させて、遠心力により抗体を含む液体の残液と洗浄液を排出する工程と、を有する点に要旨を有する。

上記容器の製造方法は、さらに、第２貫通口からブロッキング剤を含む液体を入れる工程と、第１貫通口から洗浄液を入れる工程と、容器を回転させて、遠心力によりブロッキング剤を含む液体の残液と洗浄液を排出する工程と、を有することが好ましい。

さらに、本発明は、上記容器を用いた酵素免疫測定法による被験物質の検出方法も提供する。本発明の検出方法は、中央開口から洗浄液を入れる工程と、容器を回転させて、遠心力により洗浄液を複数の内部流路にそれぞれ移動させる工程と、を有する点に要旨を有する。

本発明の容器によれば、中央開口に洗浄液を入れて、容器に遠心力を付与するという簡便な方法で中央開口と連通している複数の内部流路に一斉に洗浄液を移動させることで容易かつ十分に洗浄することができる。このため、操作者の習熟度によらず被験物質の検出精度を確保することができる。また、ポンプやバルブ等の周辺機器が不要な小型で安価な遠心器を洗浄器として利用することができる。

本発明の実施の形態に係る容器の斜視図を表す。 本発明の実施の形態に係る容器の正面図を表す。 図２のＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿った断面図を表す。 図１に示す容器の上側基材の平面図を表す。 図１に示す容器の下側第１基材の平面図を表す。 図１に示す容器の下側第２基材の平面図を表す。 図２に示した容器の変形例を示す正面図を表す。 図７のＶＩＩＩ−ＶＩＩＩ線に沿った断面図を表す。 図２に示した容器の他の変形例を示す正面図を表す。 図９のＸ−Ｘ線に沿った断面図を表す。 図９に示す容器の上側基材の平面図を表す。 図９に示す容器の下側第１基材の平面図を表す。 図９に示す容器のフィルタの平面図を表す。 図９に示す容器の下側第２基材の平面図を表す。 容器の製造方法を示す模式図を表す。 容器の製造方法を示す模式図を表す。 容器の製造方法を示す模式図を表す。 容器の製造方法を示す模式図を表す。

以下、下記実施の形態に基づき本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施の形態によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

１．容器
本発明の容器は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）によって被験物質を検出する際に、試料や洗浄液を入れるための容器であり、従来のマイクロプレートに代わって好ましく用いられる。本発明の容器は、被験物質または被験物質に対して特異的な相互作用（抗原抗体反応等）の検出、測定、分析のほか、これらの検出結果、測定結果、または分析結果に基づく人体への影響度等の各種評価や病気等の診断にも利用することができる。

上記被験物質としては、例えば、抗体、インフルエンザウイルス、Ｃ反応性タンパク質、血漿タンパク質、サイトカイン、ＤＮＡ、ペプチド、リガンドなどの生体関連物質；食品などに含まれる残留農薬や環境ホルモンなどの化学物質；糖尿病、癌などの診断に用いられる血糖、腫瘍マーカーなどの診断用物質などが挙げられる。

図１〜図６を用いて、本発明の容器について説明する。図１〜図３は、それぞれ本発明の実施の形態に係る容器１（１Ａ）の斜視図、正面図、図２のＩＩＩ−ＩＩＩ線に沿った断面図を示している。図４〜図６は、それぞれ図１に示す容器１Ａの上側基材２０、下側第１基材３７、下側第２基材３８の平面図を表す。

容器１は、一方主面１１と他方主面１２を有している基材１０を有し、基材１０は、一方主面１１側であって重心Ｃを含む中央開口１３と、中央開口１３と連通しており基材１０の放射方向に延在している複数の内部流路１５と、を有している。

本発明において、放射方向とは、基材１０の重心Ｃから離れる方向を指し、厚さ方向とは、基材１０の一方主面１１から他方主面１２に向かう方向を指す。

基材１０は容器１の全体形状を構成し、好ましくは平板状に形成される。基材１０を一方主面１１側から見たときの形状は、円形状、楕円形状、多角形状等、またはこれらの組み合わせにすることができるが、円形状であることが好ましい。

基材１０を構成する材料は、例えば、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ガラス、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリプロピレン（ＰＰ）を挙げることができる。基材１０が複数の基材から構成されている場合、他方主面１２側に配置される基材（例えば、後述する下側第２基材３８）の材料としては、透明度が高い、屈折率の空間分布や異方性が小さい、表面粗さが小さいといった特性を有しているＰＭＭＡを用いることが好ましい。これにより、下側第２基材３８にレーザー光を照射することによって、被験物質から得られる散乱光を検出しやすくなる。

内部流路１５に供給されている液体を視認可能とするために、基材１０は透明または半透明な材料から構成されていることが好ましい。

被験物質にレーザー光を照射して、得られる散乱光を検出することによって被験物質の濃度を測定する場合、基材１０は光透過性を有していることが好ましい。具体的には、基材１０は、波長５３２ｎｍの光を８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上透過させるものであることが好ましい。

基材１０の厚さは特に限定されないが、例えば、０．１ｍｍ以上、０．２ｍｍ以上、０．５ｍｍ以上、または１ｍｍ以上であってもよく、１０ｍｍ以下、８ｍｍ以下、または５ｍｍ以下であることも許容される。

容器１に供給される洗浄液や試料の微量化の観点からは、一方主面１１側から見た基材１０の外径は１５０ｍｍ以下、１００ｍｍ以下、または５０ｍｍ以下であることが好ましい。容器１の取り扱い性を良好にする観点からは、一方主面１１側から見た基材１０の大きさは１０ｍｍ以上、１５ｍｍ以上、または２０ｍｍ以上であることが好ましい。

基材１０の一方主面１１側には、重心Ｃを含む中央開口１３が設けられている。中央開口１３は、洗浄液の供給口として機能する。また、基材１０には、中央開口１３と連通しており基材１０の放射方向に延在している複数の内部流路１５も設けられている。本発明の容器１は、中央開口１３から洗浄液を入れて、容器１に遠心力を付与する、例えば、重心Ｃを中心として基材１０を回転させるという簡便な方法によって中央開口１３と連通している複数の内部流路１５に一斉に洗浄液を移動させることができる。このため、容器を容易かつ十分に洗浄することができ、操作者の習熟度によらず、被験物質の検出精度を確保することができる。また、ポンプやバルブ等の周辺機器が不要な小型で安価な遠心器を洗浄器として利用することができる。

基材１０に設けられる中央開口１３の数は特に限定されないが、１つのみ設けられていることが好ましい。中央開口１３から洗浄液を入れるという一つの操作で、複数の内部流路１５に洗浄液を送り込むことができるため、操作を簡便にすることができる。

基材１０の一方主面１１側から見たときの中央開口１３の形状は、円形状、楕円形状、多角形状、またはこれらの組み合わせにすることができるが、中央開口１３に洗浄液を滴下しやすくする観点からは円形状であることが好ましい。円形状の中央開口１３の中心は、基材１０の重心と重なっていてもよい。

内部流路１５は、基材１０の内部に設けられる流路であり、従来のマイクロプレートのウェルに相当する。

内部流路１５は放射方向に沿って延在している、すなわち放射状に形成されているものであればよく、直線状に形成されていてもよく、非直線状、例えば曲線状に形成されていてもよい。内部流路１５は、容器１の回転方向に沿って延在していてもよく、容器１の回転方向と反対向きに沿って延在していてもよい。また、内部流路１５は、湾曲部分や屈曲部分を有していてもよい。

１つの容器１中、内部流路１５の数は奇数でも偶数でもよく、特に限定されないが、例えば４以上、６以上、８以上、または１０以上に設定することができ、３０以下、２５以下、２０以下、または１５以下に設定することも許容される。

基材１０の厚さ方向における内部流路１５の高さは、例えば、０．１ｍｍ以上、０．２ｍｍ以上、０．３ｍｍ以上、または０．５ｍｍ以上であってもよく、３ｍｍ以下、２ｍｍ以下、または１ｍｍ以下であってもよい。

複数の内部流路１５は、同じ形状に形成されていることが好ましい。各内部流路１５に流れ込む洗浄液の量を均一にするためには、複数の内部流路１５は重心Ｃを中心として回転対称に形成されていることが好ましい。

基材１０は単一の部材から構成されていてもよく、複数の部材を組み合わせて構成されていてもよい。複数の部材を組み合わせて基材１０を構成する例について図１〜図６を用いて説明する。容器１の基材１０は、互いに積層されている上側基材２０および下側基材３０を有していてもよい。その場合、下側基材３０は、一方主面１１側に下側基材３０の重心を含む第１開口３５と、第１開口３５と連通しており、放射方向に延在している第２開口３６とを有していることが好ましい。また、上側基材２０は、第１開口３５と重なっている第１貫通口２５を有しており、中央開口１３が、第１開口３５および第１貫通口２５から形成されており、内部流路１５が、第２開口３６から形成されていることが好ましい。このように基材１０を複数の部材から構成することにより、各部材の材質や厚さを変えたり、各部材に異なる機能を付与することができる。例えば、上側基材２０の下側基材３０と対向する側の壁面には、抗体を修飾しやすい材料、例えばポリスチレン樹脂がコーティングされていることが好ましい。

上側基材２０は、内部流路１５の上側壁面（蓋）を構成し、基材１０に遠心力を付与したときに内部流路１５から意図せず液体が排出されたり、容器１を所定時間放置するときに液体が蒸発することを抑制する。上側基材２０としては、図４に示すように、中央開口１３を形成するための第１貫通口２５が１つ形成されている平板状のプレートを使用することができる。詳細は後述するが、上側基材２０には、複数の外側開口１８を形成するための第２貫通口２６が設けられていてもよい。

下側基材３０の第１開口３５が中央開口１３の下側を構成し、第２開口３６が内部流路１５の横側壁面と底壁面を構成するため、第１開口３５および第２開口３６は、厚さ方向において非貫通の溝であることが好ましい。厚さ方向において、下側基材３０の第１開口３５と第２開口３６は同じ高さを有していてもよく、異なる高さを有していてもよい。

複数の第２開口３６は、同じ形状に形成されていることが好ましい。各内部流路１５に流れ込む洗浄液の量を均一にするためには、複数の第２開口３６は、下側基材３０の重心を中心として回転対称に形成されていることが好ましい。

図１および図３では、基材１０を一方主面１１側から見て、上側基材２０と下側基材３０は同じ円形状の外形に形成されているが、例えば下側基材３０の外方端が上側基材２０の外方端よりも外方に延在していてもよい。上側基材２０と下側基材３０は、同じ材料または異なる材料から構成することができる。

上側基材２０と下側基材３０を接合する方法としては、両面テープ等の接着剤による接着、レーザー溶着や超音波溶着等の熱溶着、一の部材に設けられる凸部と他の部材に設けられる凹部の係合等が挙げられる。

さらに、下側基材３０が複数の部材から構成されていてもよい。下側基材３０は、互いに積層されている下側第１基材３７および下側第２基材３８から構成されていることが好ましい。その場合、第１開口３５および第２開口３６が、下側第１基材３７に設けられており、上側基材２０側から下側第２基材３８側に向かって貫通していることが好ましい。下側基材３０を下側第１基材３７と下側第２基材３８から構成することにより、これら基材の材質や厚さを変えたり、異なる機能を付与することができる。また、第１開口３５と第２開口３６が貫通していることにより、第１開口３５からは洗浄液を、第２開口３６からは抗原等の被験物質を含む液体（以下、「サンプル液」と称することがある）を内部流路１５に入れることができる。

図１および図３では、下側第１基材３７が基材１０の一方主面１１側、下側第２基材３８が基材１０の他方主面１２側に設けられている。下側第１基材３７としては、図５に示すように、中央開口１３を形成するための第１開口３５と、第１開口３５に連通しており、内部流路１５を形成するための第２開口３６を有している平板状のプレートを用いることができる。下側第２基材３８としては、図６に示すように、溝や貫通孔が設けられていない平板状のプレートを用いることができる。下側第１基材３７と下側第２基材３８を接合することによって、下側基材３０を形成することができる。下側第１基材３７と下側第２基材３８は、上側基材２０と下側基材３０と同様の方法で接合できる。

厚さ方向において、上側基材２０よりも下側基材３０が厚くてもよく、上側基材２０よりも下側基材３０が薄くてもよい。同様に、下側第１基材３７と下側第２基材３８の厚さの大小関係も特に制限されない。例えば、上側基材２０を厚さ０．５ｍｍのＰＭＭＡから構成されているプレートとし、下側第１基材３７と下側第２基材３８をそれぞれ厚さ０．２ｍｍのＰＭＭＡから構成されているプレートとしてもよい。

下側基材３０の第１開口３５と上側基材２０の第１貫通口２５は、同じ形状であってもよく、異なる形状であってもよい。図３に示すように、本実施形態では第１開口３５と第１貫通口２５は、同一面積の円形状に形成されている。

基材１０は、中央開口１３よりも放射方向の外方であって、内部流路１５とそれぞれ連通している複数の外側開口１８を有していることが好ましい。外側開口１８から内部流路１５にサンプル液を供給することができる。また、外側開口１８を排液の排出口として使用することもできる。

内部流路１５に供給する液体を滴下可能、あるいは内部流路１５から液体を排出可能であれば、外側開口１８の開口面積は、中央開口１３の開口面積より小さくてもよい。

外側開口１８が設けられる位置は特に限定されないが、外側開口１８を洗浄液の排出口とサンプル液の供給口の少なくともいずれか一方として使用する場合には、外側開口１８が放射方向における内部流路１５の外方端と重なっていることが好ましい。また、外側開口１８をサンプル液の供給口としてのみ使用する場合には、外側開口１８は内部流路１５の外方端よりも内方に存在していてもよい。

外側開口１８は、一の内部流路１５の放射方向における内方端と外方端の中点よりも内方に設けられていることが好ましい。これにより、外側開口１８を通じて内部流路１５に供給された液体が意図せず排出されることを防げる。

基材１０が互いに積層されている上側基材２０および下側基材３０を有している場合、外側開口１８が上側基材２０の第２貫通口２６から形成されていることが好ましい。上側基材２０に第２貫通口２６を設けるという簡便な方法で、外側開口１８を形成することができる。

内部流路１５は、中央開口１３に向かって幅が狭くなっている幅狭部１６を有していることが好ましい。内部流路１５に幅狭部１６を設けることにより、遠心力を付与しない時に、例えば抗原抗体反応をさせているときに、洗浄液が内部流路１５に意図せず移動してしまうことを防ぐ。幅狭部１６の幅は特に限定されないが、内部流路１５の最大幅の２分の１以下の幅であることが好ましく、より好ましくは３分の１以下である。

幅狭部１６は、放射方向において内部流路１５の内方端と外方端の中点よりも内方に形成されていることが好ましい。また、放射方向における幅狭部１６の長さは、内部流路１５の長さの５分の１以下であることが好ましく、１０分の１以下であることがより好ましい。これらの構成により、洗浄液の移動抑制効果が効果的に発揮される。

容器１は、内部流路１５を構成する壁面に被験物質を検出するための抗体が保持されていることが好ましい。具体的には、上記抗体が基材１０の一方主面１１側の内壁面に固相化されていることがより好ましい。さらに、上記抗体が基材１０の一方主面１１側の内壁面に保持されており、他方主面１２側の内壁面に保持されていないことが好ましい。このように抗体が保持されていれば、基材１０の他方主面１２側からレーザーを照射することで被験物質からの散乱光強度を測定しやすくなる。

さらに、内部流路１５を構成する壁面にブロッキング剤が付着していることが好ましい。ブロッキング剤は、未反応の抗体が内部流路１５の壁面に付着することを抑制する。ブロッキング剤は、基材１０の一方主面１１側の内壁面に付着していることが好ましく、内部流路１５を構成する内壁面全体に付着していることがより好ましい。ブロッキング剤としては、市販のブロッキング試薬（例えばＥＬＩＳＡ ＵＬＴＲＡＢＬＯＣＫ ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃ）を用いることができる。

次に、図１〜図６に示した容器１Ａとは異なる態様の容器１（１Ｂ）について、図７〜図８を参照しながら説明する。なお図７〜図８の説明において、上記の説明と重複する部分は説明を省略する。図７は、凸部１７が設けられている容器１Ｂの平面図であり、図８は図７に示した容器１ＢのＸＩＩＩ−ＸＩＩＩ線に沿った断面図である。

図７に示すように、基材１０の一方主面１１側であって中央開口１３内には、厚さ方向において基材１０の一方主面１１よりも低く、中央開口１３の底面よりも高く凸状に形成されている凸部１７が設けられていることが好ましい。凸部１７は、内部流路１５内のサンプル液が、毛細管現象により中央開口１３に到達して、上記内部流路１５と隣り合う別の内部流路１５内のサンプル液と混ざり合うことを抑制するために設けられる。したがって、凸部１７は、基材１０の周方向において隣り合う２つの内部流路１５の間に設けられていることが好ましい。

凸部１７を形成するためには、図７〜図８に示すように、基材１０の一方主面１１側から見て、上側基材２０の第１貫通口２５内に、下側第１基材３７の第１開口３５が配置されていることが好ましい。すなわち、放射方向において、第１開口３５の外方端が、第１貫通口２５の外方端よりも内方に形成されていることが好ましい。これにより、中央開口１３が基材１０の他方主面１２側に向かって狭まって形成される。基材１０の厚さ方向において、中央開口１３は、基材１０の一方主面１１側が広くなっているため、洗浄液を滴下しやすくなる。

凸部１７は、すべての内部流路１５の間に設けられていることが好ましい。これにより、内部流路１５に存在しているサンプル液が互いに混ざり合うことを抑制する効果が好適に発揮される。

基材１０の周方向において、隣り合う凸部１７の最小離間距離は、内部流路１５の最大幅よりも狭く形成されていることが好ましい。また、凸部１７は、基材１０の重心Ｃに向かって幅が狭くなっている部分を有していることが好ましい。このように凸部１７を形成することにより、容器１に遠心力を付与したときに、洗浄液の内部流路１５への移動が阻害されることを抑制できる。

図示していないが、基材１０の一方主面１１側から見て、下側基材３０の第１開口３５内に上側基材２０の第１貫通口２５が配置されていてもよい。これにより、中央開口１３が基材１０の一方主面１１側に向かってすぼんだ形状に形成される。基材１０の厚さ方向において、中央開口１３は、基材１０の他方主面１２側が広くなっているため、洗浄液が放射方向の外方に向かって拡散しやすくなる。

次に、図１〜図８に示した容器１Ａ、１Ｂとは更に異なる態様の容器１（１Ｃ）について、図９〜図１４を参照しながら説明する。なお図９〜図１４の説明において、上記の説明と重複する部分は説明を省略する。図９は、排液を吸収するためのフィルタ４０が基材１０内に設けられている容器１Ｃの平面図であり、図１０は図９に示した容器１ＣのＸ−Ｘ線に沿った断面図であり、図１１は、上側基材２０の平面図であり、図１２は下側第１基材３７の平面図であり、図１３はフィルタ４０の平面図であり、図１４は下側第２基材３８の平面図である

容器１（１Ｃ）は、図１１〜図１４に示す部材によって構成されている。図１０に示すように、容器１Ｃには、内部流路１５の周囲に液体を吸収するフィルタ４０が設けられていることが好ましい。このようにフィルタ４０を設けることにより、遠心力を付与したときに内部流路１５から排出される液体を吸収できる。

内部流路１５にある液体を意図せず吸収することを防ぐため、フィルタ４０は、放射方向において内部流路１５の外方端よりも外方に延在していることが好ましい。また、吸収容量を確保する観点から、フィルタ４０は内部流路１５の外方端よりも内方に延在していてもよい。

フィルタ４０は、図９〜図１０に示すように基材１０の内部に設けられていてもよい。具体的には、厚さ方向において上側基材２０と下側基材３０の間に設けられていることが好ましい。また、基材１０の厚さが増大することを防ぐため、フィルタ４０は放射方向において基材１０の外方端よりも外方に設けられていてもよい。フィルタ４０の大きさや配置位置は、内部流路１５に加えられる液量に応じて設定すればよい。例えば、フィルタ４０は、基材１０の周方向の一部にのみ設けられていてもよく、図９に示すように基材１０の周方向全体にわたって設けられていてもよい。

フィルタ４０の形状は特に限定されないが、例えば、円形状、多角形状、円環状等に形成することができる。特に、図１３に示すような円環状のフィルタ４０は、内部流路１５を取り囲むように配置できるため、内部流路１５の下側にフィルタ４０が設けられている構成と比較して、容器１の厚さが増大することを防げる。

容器１の厚さを抑える観点からは、フィルタ４０は膜状であることが好ましい。具体的には、厚さ方向において、フィルタ４０は下側第１基材３７以下の厚さを有していることが好ましい。フィルタ４０は、親水性多孔質材料から構成されていることが好ましく、例えば、ろ紙や普通紙等の紙、吸水性の合成樹脂フィルムを用いることができる。

図１４に示すように、下側第２基材３８の一方主面１１側には、補助開口１９が設けられていることが好ましい。補助開口１９は遠心力によって内部流路１５から排出される液体をフィルタ４０に吸収されるまでの間、一時的に貯留する槽として機能する。下側第２基材３８の補助開口１９は、下側第１基材３７の第２貫通口２６と連通していることが好ましい。下側第２基材３８の補助開口１９は、フィルタ４０（好ましくはフィルタ４０の外方端）よりも放射方向の内方に設けられていることが好ましい。内部流路１５の周囲に設けられる補助開口１９は、厚さ方向において下側第２基材３８を貫通していない溝であることが好ましい。補助開口１９は、中央開口１３または外側開口１８と同様の形状に形成されていてもよい。

２．容器の製造方法
次に、図１５〜図１８を参照しながら、酵素免疫測定法による被験物質の検出に用いられる容器１の製造方法について説明する。ここで製造される容器１は第１開口３５と第２開口３６を有している下側基材３０と、第１貫通口２５と第２貫通口２６を有している上側基材２０を有している。本発明の容器１の製造方法は、一方主面と他方主面を有する下側基材３０であって、一方主面側に重心を含む第１開口３５と、第１開口３５と連通しており放射方向に延在している複数の第２開口３６を有する下側基材３０を準備する工程（工程１）と、一方主面と他方主面を有する上側基材２０であって、上側基材２０の重心を含む第１貫通口２５と、第１貫通口２５の周囲に配置されている複数の第２貫通口２６を有する上側基材２０を準備する工程（工程２）と、第１開口３５と第１貫通口２５を重ね、かつ第２開口３６と第２貫通口２６を重ねた状態で下側基材３０の一方主面と上側基材２０の他方主面を接合する工程（工程３）と、第２貫通口２６から被験物質を検出する抗体を含む液体を入れる工程（工程４）と、第１貫通口２５から洗浄液を入れる工程（工程５）と、容器１を回転させて、遠心力により上記抗体を含む液体の残液と洗浄液を排出する工程（工程６）と、を有する。以下、各工程について説明する。

（工程１）
まず、中央開口１３および内部流路１５を形成するための下側基材３０を準備する。下側基材３０は、一方主面と他方主面を有しており、一方主面側に重心を含む第１開口３５と、第１開口３５と連通しており放射方向に延在している複数の第２開口３６を有する。具体的には、「１．容器」で説明した下側基材３０を用いることができる。

（工程２）
中央開口１３と外側開口１８を形成するための上側基材２０を準備する。上側基材２０は、一方主面と他方主面を有しており、上側基材２０の重心を含む第１貫通口２５と、第１貫通口２５の周囲に配置されている複数の第２貫通口２６を有する。具体的には、「１．容器」で説明した上側基材２０を用いることができる。

工程１および工程２において、内部流路１５や中央開口１３用の開口（溝）を形成する方法としては、レーザー加工、機械加工、サンドブラスト加工、射出成形などが挙げられ、中でも、平板状のプレートをレーザー加工することにより形成することが好ましい。

（工程３）
図３に示すように、第１開口３５と第１貫通口２５を重ね、かつ第２開口３６と第２貫通口２６を重ねた状態で下側基材３０の一方主面と上側基材２０の他方主面を接合する。これにより、第１開口３５および第１貫通口２５によって中央開口１３が形成され、第２開口３６および上側基材２０の他方主面によって内部流路１５が形成され、第２貫通口２６によって外側開口１８が形成される。上側基材２０と下側基材３０の接合方法は、「１．容器」で説明した方法を用いることができる。

工程３において、上側基材２０の重心と下側基材３０の重心が一致するように第１開口３５と第１貫通口２５を重ねることが好ましい。これにより、容器１に遠心力を付与したときに、複数の内部流路１５に均一に洗浄液を供給しやすくなる。

（工程４）
図１５に示すように、第２貫通口２６（外側開口１８）から被験物質を検出する抗体４５を含む液体５０を入れる。これにより内部流路１５に上記抗体４５を含む液体５０が供給されるため、図１６に示すように、内部流路１５の壁面、特に上側基材２０の下側基材３０と対向している面に、被験物質を検出する抗体４５を保持させることができる。第２貫通口２６から抗体４５を含む液体５０を入れる方法としては、ビュレットやマイクロピペットで少量ずつ滴下する方法が挙げられる。各第２貫通口２６に供給される上記液体５０の量は、例えば１μＬ以上、３μＬ以上、５μＬ以上、または７μＬ以上とすることができ、３０μＬ以下、２０μＬ以下、または１０μＬ以下とすることもできる。

内部流路１５の壁面に抗体４５を確実に保持させるため、工程４の後、上記液体５０を内部流路１５に入れた状態で恒温放置することが好ましい。放置時間は、例えば、３０分以上、６０分以上、９０分以上、または１２０分以上でもよい。

（工程５）
未反応の抗体４５、すなわち内部流路１５の壁面に保持させなかった抗体４５を洗い流すため、図１７に示すように第１貫通口２５から洗浄液を入れる。これにより、上側基材２０と下側基材３０によって形成される各内部流路１５に一斉に洗浄液を供給することができる。第１貫通口２５から洗浄液を入れる方法は、第２貫通口２６から上記液体５０を入れる方法と同様に行うことができる。第１貫通口２５に供給される洗浄液の量は、例えば、１μＬ以上、５μＬ以上、１０μＬ以上、または１５μＬ以上とすることができ、また、１００μＬ以下、８０μＬ以下、５０μＬ以下、４０μＬ以下、または３０μＬ以下とすることもできる。洗浄液としては、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いることができる。

（工程６）
図１８に示すように、容器１を回転させて、遠心力により抗体４５を含む液体５０の残液と洗浄液５１を排出する。容器１に遠心力を付与することにより、内部流路１５に存在していた液体が遠心力により放射方向の外方に移動することで内部流路１５が洗浄される。遠心器としては、市販の遠心器（例えば、日本ジェネティクス株式会社製の卓上マイクロ遠心器ミニ・セントリフュージ（型番：ＮＥ−ＮＧ００２Ｂ））を用いることができる。容器１に付与する遠心力の大きさは一定であってもよく、経時変化させてもよい。図１８では、外側開口１８を形成する第２貫通口２６から液体が排出されている例を示したが、第２貫通口２６以外の開口から排出されてもよい。

工程６において、容器１の回転方向は特に限定されない。一方向にのみ回転させてもよく、一方向に回転させた後、他の方向に回転させてもよい。また、一方向と他方向を交互に回転させてもよい。

工程５〜工程６は繰り返し行ってもよく、例えば２回以上、３回以上とすることができるが、１５回以下、１０回以下、または５回以下としてもよい。

洗浄液を入れる工程５の前に、容器１を回転させて、遠心力により抗体４５を含む液体５０の残液のみを排出する工程を行ってもよい。抗体４５を含む液体５０の残液と洗浄液５１を異なる工程で排出できるため、内部流路１５に不要な液体が残りにくい。

本発明の容器１の製造方法は、さらに、第２貫通口２６からブロッキング剤を含む液体を入れる工程（工程７）と、第１貫通口２５から洗浄液５１を入れる工程（工程８）と、容器１を回転させて、遠心力によりブロッキング剤を含む液体の残液と洗浄液５１を排出する工程（工程９）と、を有していることが好ましい。これら工程７〜工程９により、ブロッキング剤を上側基材２０の他方主面側に保持させることができるため、未反応の抗体が上側基材２０の他方主面側に付着することを抑制でき、被験物質を確度よく検出できる容器１が得られる。

工程７において、ブロッキング剤は「１．容器」で説明したものを用いることができる。工程７において、ブロッキング剤を含む液体を入れる方法は、工程４と同様の方法で行うことができる。

工程８における洗浄液の量や種類、工程９において遠心力を付与する方法は、それぞれ工程５、６と同様の方法で行うことができる。

工程８〜工程９は繰り返し行ってもよく、例えば２回以上、３回以上とすることができるが、１５回以下、１０回以下、または５回以下としてもよい。

工程７の後、工程８の前に、上記液体を内部流路１５に入れた状態で恒温放置することが好ましい。放置時間は、例えば、３０分以上、６０分以上、９０分以上、または１２０分以上でもよい。また、ブロッキング剤を含む液体の放置時間は、抗体を含む液体の放置時間よりも短くてもよく、例えば前者を２時間、後者を１時間とすることができる。

３．被験物質の検出方法
本発明は、「１．容器」に記載の中央開口１３と複数の内部流路１５を有している容器１を用いて、ＥＬＩＳＡ法により被験物質を検出する方法も提供する。ＥＬＩＳＡ法は、測定原理の違いにより直接法、間接法、競合法、サンドイッチ法に大別される。

直接法では、内部流路１５を構成する内壁面に被験物質を固相化した後、酵素で標識した抗体または被験物質中の抗体が特異結合する抗原を添加し、被験物質中の抗原または抗体と反応させる。次に、夾雑物を洗浄により除去し、標識した酵素に対する発色基質を添加して反応させ、発色した色素の吸光度や散乱光強度を測定することによって、被験物質中の抗原量または抗体量を測定する。発色した色素の散乱光強度の測定方法は、国際公開第２０１５／０６０２６９号を参照することができる。

間接法は、内部流路１５を構成する内壁面に被験物質を固相化した後、酵素で標識した抗体（一次抗体）、その後、その抗体に対する酵素標識抗体（二次抗体）を反応させる。以降は、直接法の夾雑物の洗浄以降の操作と同様にして行うことができる。

競合法では、抗体が固相化されている容器１の内部流路１５に、被験物質と酵素標識抗体を入れ、抗原抗体反応をさせる。以降は、直接法の夾雑物の洗浄以降の操作と同様にして行うことができる。

サンドイッチ法では、容器１の内部流路１５に固相化されている抗体（一次抗体）と被験物質中の抗原を反応させた後、内部流路１５を洗浄し、酵素標識抗体（二次抗体）を加えてさらに別の部位で抗原抗体反応をさせる。以降は、直接法の夾雑物の洗浄以降の操作と同様にして行うことができる。

上記検出方法は、被験物質を容器１の内部流路１５に供給するとき、中央開口１３以外の開口から被験物質を含む液体（サンプル液）を入れる工程（工程Ａ）を有していることが好ましい。例えば、容器１に外側開口１８が設けられている場合、外側開口１８から被験物質を含む液体を入れる工程を有していることが好ましい。

上記検出方法は、中央開口１３から洗浄液を入れる工程（工程Ｂ）と、容器１を回転させて、遠心力により洗浄液を複数の内部流路１５にそれぞれ移動させる工程（工程Ｃ）を有しているものである。このように中央開口１３から洗浄液を入れて、容器１に遠心力を付与するという簡便な方法で中央開口１３と連通している複数の内部流路１５に一斉に洗浄液を移動させることで容易かつ十分に容器１を洗浄することができる。このため、本発明の被験物質の検出方法によれば、操作者の習熟度によらず被験物質の検出精度を確保することができる。また、ポンプやバルブ等の周辺機器が不要な小型で安価な遠心器を洗浄器として利用することができる。

工程Ｂにおいて中央開口１３から洗浄液を入れる方法や、工程Ｃにおいて容器１に遠心力を付与する方法は、それぞれ「２．容器の製造方法」の工程５、工程６と同様の方法で行うことができる。

１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ：容器
１０：基材
１１：一方主面
１２：他方主面
１３：中央開口
１５：内部流路
１６：幅狭部
１７：凸部
１８：外側開口
１９：補助開口
２０：上側基材
２５：第１貫通口
２６：第２貫通口
３０：下側基材
３５：第１開口
３６：第２開口
３７：下側第１基材
３８：下側第２基材
４０：フィルタ
４５：抗体
５０：被験物質を検出する抗体を含む液体
５１：洗浄液

Claims (7)

1. 酵素免疫測定法による被験物質の検出に用いられる容器であって、
   一方主面と他方主面を有している基材を有し、
   前記基材は、前記一方主面側であって重心を含む中央開口と、前記中央開口と連通しており前記基材の放射方向に延在している複数の内部流路と、を有し、
   前記基材は、互いに積層されている上側基材および下側基材を有し、
   前記下側基材は、一方主面側に前記下側基材の重心を含む第１開口と、前記第１開口と連通しており、前記放射方向に延在している第２開口とを有し、
   前記上側基材は、前記第１開口と重なっている第１貫通口を有しており、
   前記中央開口が、前記第１開口および前記第１貫通口から形成されており、
   前記内部流路が、前記第２開口から形成されており、
   前記放射方向において、前記第１開口の外方端が、前記第１貫通口の外方端よりも内方に形成されていることを特徴とする容器。
2. 前記下側基材は、互いに積層されている下側第１基材および下側第２基材から構成されており、
   前記第１開口および前記第２開口が、前記下側第１基材に設けられており、前記上側基材側から前記下側第２基材側に向かって貫通している請求項１に記載の容器。
3. 前記基材は、前記中央開口よりも前記放射方向の外方であって、前記内部流路とそれぞれ連通している複数の外側開口を有している請求項１または２に記載の容器。
4. 前記内部流路の周囲に液体を吸収するフィルタが設けられている請求項１〜３のいずれか一項に記載の容器。
5. 前記内部流路を構成する壁面に被験物質を検出するための抗体が保持されている請求項１〜４のいずれか一項に記載の容器。
6. 酵素免疫測定法による被験物質の検出に用いられる容器を製造する方法であって、
   一方主面と他方主面を有する下側基材であって、前記一方主面側に前記下側基材の重心を含む第１開口と、前記第１開口と連通しており放射方向に延在している複数の第２開口を有する下側基材を準備する工程と、
   一方主面と他方主面を有する上側基材であって、前記上側基材の重心を含む第１貫通口と、前記第１貫通口の周囲に配置されている複数の第２貫通口を有する上側基材を準備する工程と、
   前記第１開口と前記第１貫通口を重ね、かつ前記第２開口と前記第２貫通口を重ねた状態で前記下側基材の一方主面と前記上側基材の他方主面を接合する工程と、
   前記第２貫通口から被験物質を検出する抗体を含む液体を入れる工程と、
   前記第１貫通口から洗浄液を入れる工程と、
   前記容器を回転させて、遠心力により前記抗体を含む液体の残液と前記洗浄液を排出する工程と、
   前記第２貫通口からブロッキング剤を含む液体を入れる工程と、
   前記第１貫通口から洗浄液を入れる工程と、
   前記容器を回転させて、遠心力により前記ブロッキング剤を含む液体の残液と前記洗浄液を排出する工程と、を有することを特徴とする方法。
7. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の容器を用いて、酵素免疫測定法により被験物質を検出する方法であって、
   前記中央開口から洗浄液を入れる工程と、
   前記容器を回転させて、遠心力により前記洗浄液を複数の前記内部流路にそれぞれ移動させる工程と、を有する検出方法。

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