JP3440104B2 - ヒト型キメラ抗体の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト型キメラ抗体の製
造法に関する。ヒト型キメラ抗体は、マウスモノクロー
ナル抗体に比べて患者体内で抗マウスイミュノグロブリ
ン抗体ができないため、副作用が減少し、血中半減期も
伸び、ヒト癌治療等においてマウスモノクローナル抗体
より優れた治療効果が得られると期待される。

【０００２】

【従来の技術】一般にマウス抗体をヒトに投与すると、
異物として認識されることによりヒト体内に抗マウスイ
ミュノグロブリン抗体ができてしまい、投与されたマウ
ス抗体と反応し、副作用を引き起こしたり〔ジャーナル
・オブ・クリニカル・オンコロジー(J.Clin.Oncol.)
２,881(1984)、ブラッド(Blood) 65,1349-1363(1985)、
ジャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インステ
ィテュート(J.Natl.CancerInst.) 80,932(1988)、プロ
シーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.) 82,1242
(1985) 〕、抗体が早くクリヤランスされ〔ジャーナル
・オブ・ニュクレアー・メディシン(J.Nucl.Med.) 26,1
011(1985) 、ブラッド(Blood) 65,1349-1363(1985)、ジ
ャーナル・オブ・ナショナル・キャンサー・インスティ
テュート(J.Natl.Cancer Inst.) 80,937(1988)〕、その
効果を減じてしまうことが知られている〔ジャーナル・
オブ・イミュノロジー(J.Immunol.)135, 1530(1985) 、
キャンサー・リサーチ(Cancer Res.) 46, 6489(198
6)〕。マウスモノクローナル抗体をヒト型キメラ抗体に
すると、ヒト抗マウスイミュノグロブリン抗体はほとん
ど惹起されず、ヒトにおける血中半減期が６倍伸びるこ
とが報告されている〔プロシーディング・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.) 86, 4220(1989)〕。また、マウス抗体
のFc領域はヒト抗体Fc領域に比べヒト補体やヒトエフェ
クター細胞を十分に活性化しない可能性がある。例え
ば、ガングリオシドGD₂ に対するマウスモノクローナル
抗体は、ヒト抗体Fc領域を持つキメラ抗体に変換すると
ヒトエフェクター細胞を介した抗腫瘍効果が上昇するこ
とが報告されている〔ジャーナル・オブ・イミュノロジ
ー(J.Immunol.)144, 1382-1386(1990)〕。

【０００３】ガングリオシドは動物の細胞膜を構成して
いる糖脂質の１種で、親水性側鎖である糖鎖と、疎水性
側鎖であるスフィンゴシンおよび脂肪酸とから構成され
る分子である。ガングリオシドの発現は、細胞種、臓器
種、動物種等によって異なることが知られている。さら
に細胞が癌化する過程においては、発現しているガング
リオシドが量的および質的変化を起こすことが明らかに
なった〔キャンサー・リサーチ（Cancer Res.)45, 2405
(1985)〕。例えば、悪性度が高いといわれている神経外
胚葉系腫瘍である神経芽細胞腫、肺小細胞癌およびメラ
ノーマでは、正常細胞にはほとんど認められないガング
リオシドGD₂,GD₃,GM₂ 等が発現していることが報告され
ている〔ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデ
ィシン(J.Exp.Med.)155, 1133(1982) 、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)257,
12752(1982) 、キャンサー・リサーチ(Cancer Res.) 4
7,225(1987) 、同47,1098(1987) 、同45,2642(1985) 、
プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)80,53
92(1983) 〕。

【０００４】ガングリオシドGD₃ は神経外胚葉系腫瘍の
中でも特にメラノーマにおいてその発現が多く認めら
れ、これまでにマウスIgM クラスおよびIgG クラスに属
する抗GD₃ モノクローナル抗体が知られている〔インタ
ーナショナル・ジャーナル・オブ・キャンサー(Int.J.C
ancer)29, 269(1982) 、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カル・ケミストリー(J.Biol.Chem.)257,12752(1982) 、
キャンサー・リサーチ(Cancer Res.) 47, 225(1987) 、
アクタ・ニューロパソロジカ(Acta Neuropathol.) 79,
317(1989) 、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.) 77,6114(1980) 、ジャーナル・オブ・エクスペ
リメンタル・メディシン(J.Exp.Med.)155, 1133(1982)
、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)
81,5767(1984) 〕。

【０００５】特願平2-334659に開示されているKM-641(F
ERM BP-3116)は、マウスIgG3クラスに属する抗GD₃ モノ
クローナル抗体であり、ガングリオシドGD₃ ばかりでな
くガングリオシド3',8'-LD1 とも反応し、広い抗腫瘍ス
ペクトラムを有する。また、KM-641は、J.Exp.Med.155,
1133(1982) 記載の抗GD₃ モノクローナル抗体R24 より
も強い結合活性を有しており、強力な抗腫瘍活性を示
す。

【０００６】ガングリオシドGD₃ に対するマウスモノク
ローナル抗体R24 は、メラノーマの治療に用いられたこ
とがあるが、患者の体内に抗マウスイミュノグロブリン
抗体ができ、投与されたマウスモノクローナル抗体R24
の効果を減じてしまうことが報告されている〔ヨーロピ
アン・ジャーナル・オブ・キャンサー・アンド・クリニ
カル・オンコロジー(Eur.J.Cancer Clin.Oncol.)24, su
ppl2,s65(1988)〕。

【０００７】従って、抗GD₃ モノクローナル抗体につい
ても、キメラ抗体ができれば、患者体内で抗マウスイミ
ュノグロブリン抗体ができず、副作用が減少し、血中半
減期も伸び、さらには抗腫瘍エフェクター効果も増大
し、ヒト癌治療において、マウスモノクローナル抗体よ
り優れた治療効果が得られると期待される。ヒト型キメ
ラ抗体の製造法に関しては、マウスモノクローナル抗体
の重鎖（以下Ｈ鎖と略記する）および軽鎖（以下Ｌ鎖と
略記する）の定常領域部分をヒト型に変換したヒト型キ
メラ抗体を、組換えＤＮＡ技術を用いて、動物細胞にお
いて産生させる方法が知られている。すなわち、マウス
Ｈ鎖可変領域（以下Ｖ_H と略記する）およびＬ鎖可変領
域（以下Ｖ_L と略記する）をコードする遺伝子として、
染色体DNA を用いてヒト型キメラ抗体を産生する方法
〔モリソン（Morrison）ら，プロシーディング・オブ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.）81,6851(1984) 、ニューバーガー
(Neuberger) ら，ネイチャー(Nature)314,268(1985) 、
西村ら，キャンサー・リサーチ(Cancer Res.) 47,999(1
987)、ドライ(Dorai) ら，ジャーナル・オブ・イミュノ
ロジー(J.Immunol.)139,4232(1987)、亀山ら，フェデレ
ーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサ
イアティーズ(FEBS Letters) 244,301 (1989) 〕およ
び、cDNAを用いてヒト型キメラ抗体を産生する方法が知
られている〔ギリース(Gillies) ら、ジャーナル・イミ
ュノロジカル・メソッズ(J.Immunol.Methods) 125,191
(1989) 、リュー(Liu) ら，特表平2-501886〕。ハイブ
リドーマ細胞からのマウスＶ_H およびＶ_L をコードする
染色体DNA のクローニングと塩基配列の決定は、マウス
Ｖ_H およびＶ_L をコードするcDNAのクローニングと塩基
配列の決定に比べ時間と労力がかかる。従って、染色体
DNA を用いるヒト型キメラ抗体の製造法よりも、cDNAを
用いるヒト型キメラ抗体の製造法が望ましい。

【０００８】ギリース(Gillies) らはマウスＶ_H をコー
ドするcDNAとヒトＣ_H をコードする染色体DNA を結合さ
せたヒト型キメラＨ鎖遺伝子およびマウスＶ_L をコード
するcDNAとヒトＣ_L をコードする染色体DNA を結合させ
たヒト型キメラＬ鎖遺伝子を、動物細胞用の発現ベクタ
ーに挿入し、ヒト型キメラ抗体を動物細胞において発現
させた〔ジャーナル・イミュノロジカル・メソッズ(J.I
mmunol.Methods) 125,191(1989) 〕。しかしながら、い
くつかの抗体のキメラ化を試みたところ、リーダー配列
を変換しないとＬ鎖が発現しないキメラ抗体があるとい
う問題点があった。さらに、ヒトＣ_H およびＣ_L をコー
ドする染色体DNA の代わりにヒトＣ_H およびＣ_L をコー
ドするcDNAを用いたヒト型キメラ抗体の製造法の方がよ
り簡便である。

【０００９】リュー(Liu) らは特表平2-501886におい
て、マウスＶ_H をコードするcDNAとヒトＣ_H をコードす
るcDNAを結合させたキメラＨ鎖cDNAおよびマウスＶ_L を
コードするcDNAとヒトＣ_L をコードするcDNAを結合させ
たＬ鎖cDNAを、動物細胞用の発現ベクターに挿入し、動
物細胞においてヒト型キメラ抗体を発現させることを示
している。しかしながら、この方法では、マウスＶ_H あ
るいはＶ_L をコードするcDNAとヒトＣ_H あるいはＣ_L を
コードするcDNAをマウス可変領域内のＪ領域部にて結合
させているため、Ｖ_H をコードするcDNAのＪ_H 部および
Ｖ_L をコードするcDNAのＪ_L 部のおのおのを突然変異誘
発により変更することを必要とする。また、マウスJk5
を用いたキメラＬ鎖については、ヒト型キメラ化により
フレームワーク４部のアミノ酸の１つがロイシンからイ
ソロイシンに変化してしまう。抗体の抗原との結合は、
相補性決定領域（以下CDR と省略）のアミノ酸配列がと
くに重要であるが、フレームワーク部分のアミノ酸配列
の重要性も示されている。これに関して、リーヒマン(R
iechmann) らはラット抗体のCDR 部分をヒト抗体のフレ
ームワーク部分に移植したCDR 移植抗体を作製した結
果、フレームワーク部の変換により抗体の結合活性は低
下し、フレームワーク部のアミノ酸を一部変換すること
で抗体活性の上昇が見られたと報告している〔ネイチャ
ー(Nature) 332,323(1988) 〕。従って、Liu らの開示
したマウスJk5 を用いた製造法によるヒト型キメラ抗体
は、抗体の結合活性が低下する可能性がある。従って、
全てのマウス型抗体のヒト型キメラ化に際し、マウス抗
体可変領域部のアミノ酸が全く変化しない簡便なヒト型
キメラ抗体の産生法が望まれている。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
型キメラ抗体の製造において、マウス抗体可変領域のア
ミノ酸配列を全く変化させずに、簡便にヒト型キメラ抗
体を得ることができるヒト型キメラ抗体の製造法を提供
することにある。さらには、当該方法を用いるガングリ
オシドGD₃ に対するヒト型キメラ抗体およびその製造法
を提供することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は以下に関する。 （１） ヒト抗体重鎖定常領域Cγ1をコードするcDNA
を動物細胞用発現ベクターに挿入することによりカセッ
トベクターを構築し、該カセットベクターにヒト以外の
動物の抗体の重鎖可変領域をコードするcDNAを挿入する
ためのクローニングサイトを設け、ヒト以外の動物の
抗体の重鎖可変領域をコードするcDNAを制限酵素を用い
て切り出し、配列番号７の３１〜４３番目の塩基配列
で表されたヒト抗体重鎖定常領域の５’末端側の塩基配
列と、ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域の３’末端
側の塩基配列とからなり、制限酵素部位を両端に有する
合成DNAと、上記で得られたヒト以外の動物の抗体の
重鎖可変領域をコードするcDNAとを該カセットベクター
に挿入することにより、該合成DNAを介してヒト抗体重
鎖定常領域Cγ1をコードするcDNAとヒト以外の動物の抗
体重鎖可変領域をコードするcDNAとが結合されたヒト型
キメラ抗体重鎖発現ベクターを構築し、ヒト抗体軽鎖
定常領域CκをコードするcDNAを動物細胞用発現ベクタ
ーに挿入することによりカセットベクターを構築し、該
カセットベクターにヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領
域をコードするcDNAを挿入するためのクローニングサイ
トを設け、ヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域をコ
ードするcDNAを制限酵素を用いて切り出し、配列番号
８の４５〜６１番目の塩基配列で表されたヒト抗体軽鎖
定常領域の５’末端側の塩基配列と、ヒト以外の動物の
抗体の軽鎖可変領域の３’末端側の塩基配列とからな
り、制限酵素部位を両端に有する合成DNAと、上記で
得られたヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域をコード
するcDNAとを該カセットベクターに挿入することによ
り、該合成DNAを介してヒト抗体軽鎖定常領域Cγ1をコ
ードするcDNAとヒト以外の動物の抗体軽鎖可変領域をコ
ードするcDNAとが結合されたヒト型キメラ抗体軽鎖発現
ベクターを構築し、上記で得られたヒト型キメラ抗
体重鎖発現ベクターおよび上記で得られたヒト型キメ
ラ抗体軽鎖発現ベクターを動物培養細胞に導入し、上
記で得られた動物培養細胞を培地中に培養し、培養物
中にヒト型キメラ抗体を生成蓄積させ、該培養物からヒ
ト型キメラ抗体を採取することを特徴とするヒト型キメ
ラ抗体の製造法。 （２） ヒト以外の動物がマウスである、上記（１）記
載の製造法。 （３） ヒト以外の動物の抗体が、ガングリオシドに対
する抗体である、上記（１）記載の製造法。 （４） ヒト以外の動物の抗体が、ガングリオシドGD₃
に対する抗体である、上記（１）記載の製造法。 （５） ヒト以外の動物の抗体が、FERM BP-3116が生産
するモノクローナル抗体KM-641である、上記（１）記載
の製造法。 （６） ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域をコード
するcDNAが、配列番号４記載のアミノ酸配列の１〜１２
０番目のアミノ酸配列をコードするDNAであり、軽鎖可
変領域をコードするDNAが、配列番号５記載のアミノ酸
配列の１〜１０８番目のアミノ酸配列をコードするcDNA
である上記（１）記載の製造法。 （７） ヒト型キメラ抗体が、ガングリオシドGD₃に反
応する抗体である、上記（１）記載の製造法。 （８） ヒト型キメラ抗体が、FERM BP-3512が生産する
ヒト型キメラ抗体KM-871である、上記（１）記載の製造
法。 （９） 配列番号７または８記載の塩基配列からなるDN
A。 （１０） 上記（１）記載の製造法により得られるヒト
型キメラ抗体。 （１１） 配列番号４記載の１〜１２０番目のアミノ酸
配列を含む重鎖可変領域および配列番号５記載の１〜１
０８番目のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むガン
グリオシドGD3に反応するヒト型キメラ抗体。 （１２） FERM BP-3116が生産するモノクローナル抗体
KM-641の可変領域のアミノ酸配列とヒト抗体定常領域と
を含むガングリオシドGD3に反応するヒト型キメラ抗
体。 （１３） FERM BP-3512が生産する、ガングリオシドGD
3に反応するヒト型キメラ抗体KM-871。 （１４） 上記（１１）〜（１３）のいずれか１項に記
載のヒト型キメラ抗体の可変領域をコードするDNA。 （１５） 配列番号４の４４〜４０３番目の塩基配列を
有するDNA。 （１６） 上記（１５）記載のDNAを含有する組換えベ
クター。 （１７） 配列番号５の８５〜４０８番目の塩基配列を
有するDNA。 （１８） 上記（１７）記載のDNAを含有する組換えベ
クター。 （１９） 上記（１６）および（１８）記載の組換えベ
クターにより得られた形質転換細胞。 （２０） 形質転換細胞がFERM BP-3512である、上記
（１９）記載の細胞。

【００１２】

【００１３】以下に本発明を詳細に説明する。 １．カセットベクターの構築 本発明で用いるカセットベクターは動物細胞用発現ベク
ターにヒト抗体定常領域をコードするcDNAを挿入するこ
とにより構築する。動物細胞用発現ベクターとしては、
ヒト抗体定常領域をコードするcDNAを組込み発現できる
ものであればいかなるものでも用いることができる。例
えば、pAGE107 〔サイトテクノロジー(Cytotechnology)
3,133(1990) 〕等があげられる。動物細胞用発現ベクタ
ーに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、SV40
の初期プロモーターとエンハンサー〔ジャーナル・オブ
・バイオケミストリー(J.Biochem.)101,1307(1987)〕、
モロニーマウス白血病ウイルスのLTR プロモーターとエ
ンハンサー〔バイオケミカル・アンド・バイオフィジカ
ル・コミュニケーションズ(Biochem.Biophys.Res.Comu
n. 149,960(1987) 〕、免疫グロブリンＨ鎖のプロモー
ター〔セル(Cell)41,479(1985)〕とエンハンサー〔セル
(Cell)33,717(1983)〕等があげられる。免疫グロブリン
Ｈ鎖のプロモーターとエンハンサーは、抗体産生ハイブ
リドーマ細胞、例えば、特開昭60-258128 に開示されて
いる抗ヒト血清アルブミン抗体産生ラットハイブリドー
マKM50細胞等を用いて作製することができる。以下に、
KM50細胞を用いる免疫グロブリンＨ鎖のプロモーターと
エンハンサーの作製法について説明する。

【００１４】培養したKM50細胞、KM50の融合相手のP3X6
3Ag8U.1 （以下P3U1と略記する）細胞(ATCC CRL1597)、
およびラットの腎臓細胞より、モレキュラー・クローニ
ング〔(Molecular Cloning) 第２版、Cold Spring Harb
or Laboratory Press 刊、1989年，p9.14 〕に記載され
た方法に従ってそれぞれの染色体DNA を抽出する。次
に、フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バイオケ
ミカル・ソサイアティーズ(FEBS letter) 244,301(198
9) に記載の方法に従い、KM50細胞より抽出された染色
体DNA より、DNA 再配列が起こったKM50細胞中の活性型
免疫グロブリンＨ鎖可変領域遺伝子、免疫グロブリンの
プロモーターおよびエンハンサーを含むDNA断片を取得
する。このDNA 断片より免疫グロブリンのプロモーター
部分およびエンハンサー部分を切り出し、上記動物細胞
用発現ベクターに挿入する。免疫グロブリンＨ鎖のプロ
モーターとエンハンサーを有する動物細胞用発現ベクタ
ーの具体例としては、例えば、プラスミドpIg1SE1d4 等
があげられる。

【００１５】次に、カセットベクターのヒト定常領域の
上流に、ヒト以外の動物の抗体の可変領域をコードする
cDNAを挿入するためのクローニングサイトを設ける。こ
のクローニングサイトにヒト以外の動物の抗体の可変領
域をコードするcDNAを、ヒト抗体の定常領域の5'末端側
の塩基配列とヒト以外の動物の可変領域の3'末端側の塩
基配列とからなり、制限酵素部位を両端に有する合成Ｄ
ＮＡを用いて挿入することにより、該合成ＤＮＡを介し
てヒト抗体定常領域をコードするcDNAとヒト以外の動物
の抗体の可変領域をコードするcDNAとが結合挿入された
ヒト型キメラ抗体発現用ベクターを製造することができ
る。ここで用いる合成ＤＮＡは、ヒト抗体の定常領域の
5'末端側の塩基配列とヒト以外の動物の可変領域の3'末
端側の塩基配列に基づいて、ＤＮＡ合成機を用いて製造
する。クローニングサイトが設けられたカセットベクタ
ーの具体例としては、例えば、ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発
現ベクターを構築するために用いるカセットベクターpC
hiIgHB2 、ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築す
るために用いるカセットベクターpChiIgLA2 等があげら
れる。

【００１６】ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築
するために用いるカセットベクターは、例えば、ヒトＣ
_H をコードするcDNAを、５’末端付近のApa Ｉ部位より
３’末端まで切り出し、プラスミドpIg1SE1d4 等の動物
細胞用発現ベクターに挿入することにより構築する。こ
のカセットベクターに、ヒト以外の動物のＶ_H をコード
するcDNAを挿入するためのクローニングサイトを設け、
このクローニングサイトに、ヒト抗体Ｃ_H の5'末端から
Apa Ｉ部位までの塩基配列とヒト以外の動物の抗体のＶ
_H の3'末端側の塩基配列とからなり、制限酵素部位を両
端に有する合成ＤＮＡを用いて、適当な制限酵素により
切り出したヒト以外の動物の抗体のＶ_HをコードするcDN
Aを挿入することで、発現したときにＶ_H のアミノ酸配
列に変化を生じないようなヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベ
クターを容易に取得できる。

【００１７】ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築
するために用いるカセットベクターは、例えば、ヒトＣ
_L をコードするcDNAを、５’末端付近に突然変異誘発に
よりEcoRV 部位を導入し、EcoRV 部位より３’末端まで
切り出し、プラスミドpIg1SE1d4 等のプラスミドに挿入
することにより構築する。このカセットベクターに、ヒ
ト以外の動物の抗体のＶ_L をコードするcDNAを挿入する
ためのクローニングサイトを設け、このクローニングサ
イトに、ヒト抗体Ｃ_L の5'末端からEcoRＶ部位までの塩
基配列とヒト以外の動物の抗体のＶ_L の3'末端側の塩基
配列とからなり、制限酵素部位を両端に有する合成ＤＮ
Ａを用いて、適当な制限酵素により切り出したヒト以外
の動物の抗体のＶ_L をコードするcDNAを挿入すること
で、発現したときにＶ_L のアミノ酸配列に変化を生じな
いようなヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターを容易に取
得できる。

【００１８】上記ヒトＣ_H およびヒトＣ_L をコードする
cDNAは、セル(Cell)22,197(1982)等に開示されており、
プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）79,7025
(1985) 、同82,7025(1985)等に記載された方法に従っ
て、ヒト抗体産生ミエローマ細胞、ヒト型モノクローナ
ル抗体産生ハイブリドーマ細胞、ヒト型キメラ抗体産生
細胞〔SP2-PC Chimera：フェデレーション・オブ・ヨー
ロピアン・バイオケミカル・ソサイアティーズ(FEBS le
tter) 244,301(1989) 〕等より取得できる。すなわち、
上記細胞からモレキュラー・クローニング(Molecular C
loning) 第２版、1989年、p8.1に記載された方法に従い
mRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAを、モレ
キュラー・クローニング(Molecular Cloning) 第２版、
1989年、p8.1、1.53に記載された方法に従い、ベクター
としてファージあるいはプラスミドを用いてライブラリ
ーを作成する。次に、モレキュラー・クローニング(Mol
ecular Cloning) 第２版、1989年、p8.1、1.53に記載さ
れた方法に従い、該ライブラリーより、ヒト抗体の定常
領域部分あるいは可変領域部分をプローブとして用い、
ヒトＣ_H をコードするcDNAを有する組換えファージある
いは組換えプラスミド、およびヒトＣ_L をコードするcD
NAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドを
得る。ヒトＣ _H をコードするcDNAおよびヒトＣ_L をコー
ドするcDNAの塩基配列は、モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning) 第２版、1989年、p13.1 に記載さ
れた方法で決定する。ヒトＣ_L をコードするcDNAへの適
当な制限酵素部位の導入、例えば、５’末端付近へのEc
oRＶ部位の導入は、モレキュラー・クローニング(Molec
ular Cloning) 第２版、1989年、p15.1 に記載された方
法で行う。

【００１９】２．ヒト型キメラ抗体の産生 ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗GD₃ モノクロ
ーナル抗体のＶ_H およびＶ_L をコードするcDNAは、以下
のようにして取得する。

【００２０】マウス抗GD₃ モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマ細胞、例えば、マウス抗GD₃ モノクロ
ーナル抗体KM-641(FERM BP-3116)等よりmRNAを抽出し、
cDNAを合成する。合成したcDNAを、ベクターとしてファ
ージあるいはプラスミドを用いてライブラリーを作成す
る。該ライブラリーより、ヒト以外の動物の抗体、例え
ば、マウス抗体の定常領域部分あるいは可変領域部分を
プローブとして用い、Ｖ_H をコードするcDNAを有する組
換えファージあるいは組換えプラスミド、およびＶ_L を
コードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換え
プラスミドを得る。上記と同様にＶ_H をコードするcDNA
およびＶ_L をコードするcDNAの塩基配列を決定する。

【００２１】Ｖ_H をコードするcDNAを５’末端から３’
末端付近にある適当な制限酵素部位（以下、Ａ部位と称
する）まで切り出し、これをヒト抗体のＣ_H の5'末端側
の塩基配列とヒト以外の動物のＶ_H の3'末端からＡ部位
までの塩基配列とからなり、制限酵素部位を両端に有す
る合成ＤＮＡを用いて、上記カセットベクターのクロー
ニングサイトに挿入し、該合成ＤＮＡを介してヒト抗体
Ｃ_H をコードするcDNAとヒト以外の動物の抗体のＶ_H を
コードするcDNAとを結合させることによりヒト型キメラ
抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築する。同様に、Ｖ_L をコー
ドするcDNAを５’末端から３’末端付近にある適当な制
限酵素部位（以下、Ｂ部位と称する）まで切り出し、こ
れをヒト抗体のＣ_L の5'末端側の塩基配列とヒト以外の
動物のＶ _L の3'末端からＢ部位までの塩基配列とからな
り、制限酵素部位を両端に有する合成ＤＮＡを用いて、
上記カセットベクターのクローニングサイトに挿入し、
該合成ＤＮＡを介してヒト抗体Ｃ_L をコードするcDNAと
ヒト以外の動物の抗体のＶ _L をコードするcDNAとを結合
させることによりヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターを
構築する。

【００２２】ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターとヒト
型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターとを宿主細胞に導入する
ことにより、ヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株を
得ることができる。ヒト型キメラ抗体発現ベクターを導
入する宿主細胞としては、ヒト型キメラ抗体を発現させ
ることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用
いることができる。例えば、マウスSP2/0-Ag14細胞（AT
CC CRL1581、以下SP2/0 細胞と略記する）、マウスP3X6
3-Ag8.653(ATCC CRL1580) 、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝
子（以下dhfrと略記する）が欠損したＣＨＯ細胞〔ウル
ラウブ(Urlaub)ら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 77,421
6,(1980)〕等があげられる。

【００２３】ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターおよび
ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの宿主細胞への導入
は、例えば、特開平2-257891に開示されているエレクト
ロポーレイション法により行うことができる。ヒト型キ
メラ抗体を生産する形質転換株は、特開平2-257891に開
示されている方法に従い、G418および牛胎児血清を含む
RPMI1640培地により選択する。ヒト型キメラ抗体を生産
する形質転換株の具体例としては、ガングリオシドGD₃
に反応するヒト型キメラ抗体を生産する形質転換株であ
るKM-871があげられる。KM-871は平成３年８月１３日付
で、工業技術院微生物工業技術研究所にFERM BP-3512と
して寄託されている。

【００２４】形質転換株を培養するための培地は、目的
とする抗体を生成、蓄積できるものであればいずれでも
用いることができる。例えば、G418およびウシ胎児血清
を含むRPMI1640があげられる。培養は該培地200 μl 〜
100 mlを用い、１×１０⁵ 〜１×１０⁷ 細胞／mlの形質
転換株を37℃、５％ＣＯ₂ インキュベーター中で１〜７
日間培養することにより行う。ヒト型キメラ抗体は培養
物中に生成、蓄積する。培養物中のヒト型キメラ抗体の
活性は酵素免疫抗体法（ELISA 法: 抗体実験マニュア
ル、E.Harlowら編、Cold Spring Harbor Laboratory
刊、1988年）により測定する。形質転換株は、特開平2-
257891に開示されている方法に従い、dhfr増幅系を利用
してヒト型キメラ抗体の生産量を上昇させることができ
る。

【００２５】ヒト型キメラ抗体は、上記培養物の上清よ
りプロテインＡカラムを用いて精製することができる
（抗体実験マニュアル、E.Harlowら編、Cold Spring Ha
rbor Laboratory 刊、1988年）。このようにして得られ
るヒト型キメラ抗体の具体例としては、ガングリオシド
GD₃ に反応するヒト型キメラ抗体、例えば、ヒト型キメ
ラ抗体KM-871等があげられる。

【００２６】ヒト型キメラ抗体の反応性はELISA 法等で
測定する。精製したヒト型キメラ抗体のＨ鎖、Ｌ鎖ある
いは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（SDS-PAGE）やウエスタンブロッティング法
（抗体実験マニュアル、E.Harlowら編、Cold Spring Ha
rbor Laboratory 刊、1988年）等で測定する。ガングリ
オシドGD₃ に反応するヒト型キメラ抗体の培養癌細胞株
に対する結合活性は、蛍光抗体法、ELISA 法等により測
定する。ヒト型キメラ抗体の培養癌細胞株に対する補体
依存性殺細胞活性（CDC 活性）、抗体依存性細胞障害活
性（ADCC活性）は、免疫学実験入門（松橋ら、学会出版
センター刊、1981年）記載の方法により測定する。

【００２７】以下に、本発明の実施例および参考例を示
す。

【００２８】

【実施例】

【００２９】実施例１ カセットベクターの構築 １．KM50細胞由来免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよ
びエンハンサー遺伝子の取得 （１）KM50細胞、P3U1細胞およびラット腎臓からの染色
体DNA の調製 公知の方法〔マニアティス(Maniatis)ら編集、モレキュ
ラー・クローニング(Molecular Cloning) 、1989年、p
9.16 〕に従い、以下のようにして染色体DNA を調製し
た。

【００３０】KM50細胞1.2 ×10⁸ 個、P3U1細胞(ATCC CR
L1597)2 ×10⁸ 個、ラット腎臓（-80 ℃で凍結後、木槌
で充分たたいて砕いたもの）1.6gのそれぞれを2ml の10
mMトリス−塩酸，150 mM塩化ナトリウムおよび10mMエチ
レンジアミン４酢酸２ナトリウム（以下EDTAと略記す
る）からなる緩衝液(pH7.5) に懸濁し、この溶液にプロ
テイネースＫ（シグマ社製）0.8mg とラウリル硫酸ナト
リウム（以下SDS と略記する）10mgを加えて37℃で一晩
インキュベートした。次に等量のフェノールで１回、ク
ロロホルムで２回、エーテルで１回抽出し、10mMトリス
−塩酸および1mMEDTAからなる緩衝液(pH7.5) に一晩透
析を行った。透析チューブよりDNA 溶液を回収し、これ
にリボヌクレアーゼＡ（シグマ社製）を終濃度20μg/ml
となるように加えた。この溶液を６時間、37℃にてイン
キュベートし、RNA を充分分解させた後に、15mgのSDS
と1mg のプロテイネースＫを加え、37℃で一晩インキュ
ベートした。次に等量のフェノールで２回、クロロホル
ムで２回、エーテルで２回抽出し、10mMトリス−塩酸お
よび1mM EDTAからなる緩衝液(pH7.5) に一晩透析を行っ
た。透析チューブよりDNA 溶液を回収して、染色体DNA
サンプルとした。DNAの濃度を260nm における吸光度で
測定した結果、KM50細胞1.2 ×10⁸ 個より1.6mg 、P3U1
細胞２×10⁸ 個より1.5mg 、ラット腎臓1.6gより1.9mg
の染色体DNA がそれぞれ得られた。

【００３１】（２）サザンブロッティングによる、KM50
細胞中における活性型免疫グロブリンＨ鎖遺伝子の同定 （１）で得られたKM50細胞、P3U1細胞、ラット腎臓の染
色体DNA の各３μg ずつを10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，
6mM 塩化マグネシウムおよび100mM 塩化ナトリウムから
なる緩衝液25μl に溶解し、15単位のXba Ｉ（宝酒造社
製、以下、制限酵素は宝酒造社製を使用した）を加え、
37℃で２時間インキュベートし、Xba Ｉ部位で切断し
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動にかけた後、サ
ザンらの方法〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー(J.Mol.Biol.),98,503(1975)〕に従い、ニトロ
セルロースフィルターにDNA をトランスファーし、常法
〔亀山ら、フェデレーション・オブ・ヨーロピアン・バ
イオケミカル・ソサイアティーズ(FEBS letter) 244,30
1-306(1989) 〕に従って、同文献記載のマウスJHプロー
ブでハイブリダイゼーションを行った。KM50細胞のDNA
においてのみ約9.3kbの位置にバンドが認められた。従
って、この位置に存在する免疫グロブリンXbaＩ断片DNA
が、KM50細胞中における活性型免疫グロブリンＨ鎖遺
伝子をコードしていると考えられる。

【００３２】（３）KM50細胞の染色体DNA ライブラリー
の作製 （１）で得られたKM50細胞の染色体DNA 60μg を10mMト
リス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび100m
M 塩化ナトリウムからなる緩衝液250 μl に溶解し、15
0 単位のXba Ｉを加え、37℃で２時間インキュベート
し、Xba Ｉ部位で切断した。該反応液をアガロースゲル
電気泳動にて分画後、9.3kb の部分をDEAEペーパー法
〔マニアティス(Maniatis)ら編集、モレキュラー・クロ
ーニング(Molecular Cloning) 、1989年、p6.24 〕等を
用いて、KM50細胞の9.3kb DNA サンプルとして約２μg
を回収した。一方ベクターとして用いるラムダーZAP
（ストラタジーン社製）は３μg を10mMトリス−塩酸(p
H7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび100mM 塩化ナトリ
ウムからなる緩衝液200 μl に溶解し、50単位のXba Ｉ
を加え、37℃で２時間インキュベートし、Xba Ｉ部位で
切断した。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出
し、エタノールで沈澱させ、DNA を約３μg 回収した。
このDNA を100mM トリス−塩酸(pH7.5) 溶液100 μl に
溶解し、アリカリフォスファターゼ（宝酒造社製）１単
位を加えて、ベクターDNA の制限酵素切断末端の脱リン
酸化反応を行った。該反応物をフェノール−クロロホル
ムで抽出し、エタノールで沈澱させ、DNA を２μg 回収
した。このDNA を10mMトリス−塩酸(pH7.5) および1mM
EDTA溶液10μl に溶解しベクターDNA サンプルとした。
次にベクターDNA サンプルを0.２μg と、KM50細胞の9.
3kb DNA サンプル0.2 μg とを、66mMトリス−塩酸(pH
7.5) ，6.6mM 塩化マグネシウム，10mMジチオスレイト
ール（以下DTT と略記する）および0.1mM アデノシン３
リン酸（以下ATP と略記する）からなる緩衝液（以下T4
リガーゼ緩衝液と略記する）５μl に溶解し、T4DNA リ
ガーゼ（宝酒造社製）175 単位を加えて、３日間、４℃
にてインキュベートした。この混合液のうち２μl を常
法〔マニアティス(Maniatis)ら編集、モレキュラー・ク
ローニング(Molecular Cloning) 、1989年、p2.95 〕に
従い、ストラタジーン社製ギガパックゴールドを使用し
てラムダファージにパッケージングし、これを大腸菌BB
4 に感染させて、20万個のファージクローンを取得し
た。次にこのうち10万個のファージを常法〔マニアティ
ス(Maniatis)ら編集、モレキュラー・クローニング(Mol
ecular Cloning) 、1989年、p2.112〕に従って、ニトロ
セルロースフィルター上に固定した。

【００３３】（４）KM50細胞中において活性型となって
いる（抗ヒト血清アルブミン）免疫グロブリンＨ鎖可変
領域遺伝子を含む組換えDNA の選択 （３）で作製した10万個のファージライブラリーより、
亀山らの方法〔フェデレーション・オブ・ヨーロピアン
・バイオケミカル・ソサイアティーズ(FEBS letter)44,
301-306(1989) 〕に従って³²Ｐで標識したマウスJHプロ
ーブに、65℃において強く会合するクローンを２個取得
した。常法〔マニアティス(Maniatis)ら編集、 モレキュ
ラー・クローニング(Molecular Cloning) 、1989年、p
2.118-2.169〕に従って、ファージDNA を回収したとこ
ろ、9.3kb のKM50細胞の染色体DNAのXba Ｉ断片が組み
込まれていた。

【００３４】（５）KM50細胞中において活性型となって
いる（抗ヒト血清アルブミン）免疫グロブリンＨ鎖可変
領域遺伝子の塩基配列 （４）で得られた２個のクローンについて、種々の制限
酵素で消化し、制限酵素切断地図を作ったところ、全く
同一のDNA 断片(9.3kb) が挿入されていることが明らか
となった（図１）。そこで次にこのDNA 断片9.3kb のう
ち、ラット免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター領域およ
び可変領域をコードしていると考えられる部分につい
て、サンガー法〔サンガー(Sanger)ら、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.) 74,5463(1977) 、Amersh
am社 M13 cloning and sequencing handbook〕に従って
塩基配列を決定した。配列番号１の中で、ATGCAAAT等の
オクタマー配列やTTGAAAA 等のTATA box 配列を含む部
分は、免疫グロブリンのプロモーター領域と考えられる
部分である。

【００３５】２．KM50細胞中において活性型となってい
る（抗ヒト血清アルブミン）免疫グロブリンＨ鎖可変領
域遺伝子のプロモーターとエンハンサーを用いた異種タ
ンパク発現ベクターの構築 （１）pKMB11の構築 １の（５）で得られた9.3kb の免疫グロブリンＨ鎖可変
領域遺伝子断片１μgを、10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6
mM 塩化マグネシウムおよび100mM 塩化ナトリウムから
なる緩衝液30μl に溶解し、10単位のBgl IIとHindIII
を加え、37℃で２時間インキュベートし、Bgl IIとHind
III 部位で切断した。該反応液をアガロースゲル電気泳
動後、0.8kb の免疫グロブリンプロモーターを含むDNA
断片を0.01μg 回収した。次にプラスミドpBR322-BglII
〔桑名(Kuwana)ら、フェデレーション・オブ・ヨーロピ
アン・バイオケミカル・ソサイアティーズ(FEBS lette
r)219,360(1987) 〕の１μg を、10mMトリス−塩酸(pH
7.5) ，6mM 塩化マグネシウム，100mM 塩化ナトリウム
からなる緩衝液30μl に溶解し、10単位のBgl IIと10単
位のHindIII を加え、37℃で２時間インキュベートし、
Bgl II部位とHindIII部位で切断した。該反応液をアガ
ロースゲル電気泳動後、約4.2kb のDNA 断片を回収し
た。このようにして得たpBR322 Bgl II 由来の約4.2kb
のDNA 断片(0.1μg)と、免疫グロブリンプロモーターを
含むDNA 断片0.01μg を、T4リガーゼ緩衝液20μl に溶
解し、T4DNA リガーゼ（宝酒造社製）175 単位を加え
て、１日間、４℃にてインキュべートした。該反応液を
用いて大腸菌HB101 株〔ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー(J.Mol.Biol.) 41,459(1969)〕をスコ
ット(Scott) らの方法〔重定勝：細胞工学 2,616(198
3) 〕に従って形質転換し、アンピシリン耐性（以下ApR
と略記する）のコロニーを得、このコロニーよりプラ
スミドDNA を回収し、図２に示したpKMB11を得た。

【００３６】（２）pKMD6 の構築 免疫グロブリンプロモーター下流に適当な制限酵素部位
を設けるため、（１）において構築したpKMB11のNco Ｉ
部位からヌクレアーゼBAL31 を用いて消化を行った。プ
ラスミドpKMB11の10μg を10mMトリス−塩酸(pH7.5),6m
M 塩化マグネシウムおよび50mM塩化カリウムからなる緩
衝液100 μl に溶解し、30単位のNco Ｉを加え、37℃で
２時間インキュベートし、Nco Ｉ部位で切断した。該反
応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール
で沈澱後、DNA 断片を全量100 μl のBAL31 緩衝液〔20
mMトリス−塩酸(pH8.0) ，600mM 塩化ナトリウム，12mM
塩化カルシウム，12mM塩化マグネシウムおよび1mM EDTA
からなる緩衝液〕に溶解し、0.25単位のBAL31 〔ベセス
ダリサーチラボラトリーズ(BRL) 社製〕を加え、37℃で
５秒間反応を行った。反応をフェノールで抽出すること
により止め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱
させた後、DNA を１μg 回収した。このDNA0.1μg と合
成DNA リンカーSal Ｉ 0.01 μg とをT4リガーゼ緩衝液
20μl に溶解し、T4DNA リガーゼ175 単位を加えて、１
日間、４℃にてインキュべートした。該反応液を用いて
大腸菌HB101 株をスコットらの方法によって形質転換
し、ApRコロニーを得、このコロニーよりプラスミドDNA
を回収し、図３に示したpKMD6を得た。このプラスミド
のうち、BAL31 にて消化を行った部分について、サンガ
ー法に従って塩基配列を決定したところ免疫グロブリン
の開始コドンATG の上流に向かって３番目の塩基（配列
番号１で303 番目の塩基）まで除かれていた。

【００３７】（３）pEPKMA1,pEPKMB1,pAGE501 の構築 免疫グロブリンの本来のプロモーターとエンハンサー
は、その位置が離れている。従って異種タンパクを発現
させるためのベクターとして、そのプロモーターとエン
ハンサーを接続したベクターを作っておくことが必要と
なる。そのために以下の操作を行った。

【００３８】１の（５）で得られた9.3kb の免疫グロブ
リンＨ鎖可変領域遺伝子断片１μgを10mMトリス−塩酸
(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび100mM 塩化ナト
リウムからなる緩衝液30μl に溶解し、10単位のEcoRＶ
と10単位のXba Ｉを加え、37℃で２時間インキュベート
し、EcoRＶ部位とXba Ｉ部位で切断した。該反応液をア
ガロースゲル電気泳動後、約1kb の免疫グロブリンエン
ハンサー領域を含むDNA 断片を0.1 μg 回収した。一方
（２）で得たプラスミドpKMD6 の１μg を10mMトリス−
塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび100mM 塩化
ナトリウムからなる緩衝液100 μl に溶解し、10単位の
Bgl IIを加え、37℃で２時間インキュベートし、Bgl II
部位で切断した。フェノールおよびクロロホルムで抽出
し、エタノールで沈澱させた後、DNA 断片を全量40μl
のDNA ポリメラーゼＩ緩衝液〔50mMトリス−塩酸(pH7.
5) ，10mM塩化マグネシウム，0.1mM dATP（デオキシア
デノシン３リン酸），0.1mM dCTP（デオキシシチジン３
リン酸），0.1mM dGTP（デオキシグアノシン３リン酸）
および0.1mM dTTP（デオキシチミジン３リン酸）からな
る緩衝液〕に溶解し、６単位の大腸菌DNA ポリメラーゼ
Ｉクレノー(Klenow)断片を加え、16℃で90分間反応さ
せ、Bgl II消化によって生じた５’突出末端を平滑末端
に変えた。反応をフェノールで抽出することにより止
め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた
後、DNA 断片を10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マ
グネシウムおよび50mM塩化ナトリウムからなる緩衝液30
μl に溶解し、10単位のHindIII を加え、37℃で２時間
インキュベートし、HindIII 部位で切断した。該反応液
をアガロースゲル電気泳動後、約0.8kb の免疫グロブリ
ンプロモーター領域を含むDNA 断片を0.1 μg 回収し
た。次にプラスミドpUC18 〔メッシング(Messing) 、メ
ソッド・イン・エンザイモロジー(Methods in Enzymolo
gy)101,20(1983)〕の0.2 μg を10mMトリス−塩酸(pH7.
5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび100mM 塩化ナトリウ
ムからなる緩衝液30μl に溶解し、10単位のHindIIIと1
0単位のXba Ｉを加え、37℃で２時間インキュベート
し、HindIII 部位とXbaＩ部位で切断した。該反応液を
アガロースゲル電気泳動後、約2.7kb のDNA 断片を0.1
μg 回収した。このようにして得たpKMD6 由来の0.8kb
のDNA 断片(0.1μg)と、免疫グロブリンエンハンサー領
域を含むDNA 断片0.02μg と、pUC18 の0.1 μg とを、
T4リガーゼ緩衝液20μl に溶解し、T4DNA リガーゼ175
単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。
該反応液を用いて大腸菌HB101 株を形質転換し、ApR コ
ロニーを得、このコロニーよりプラスミドDNA を回収
し、図４に示したpEPKMA1 を得た。

【００３９】次に、プラスミドpEPKMA1 の１μg を10mM
トリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび10
0mM 塩化ナトリウムからなる緩衝液100 μl に溶解し、
10単位のXba Ｉを加え、37℃で２時間インキュベート
し、Xba Ｉ部位で切断した。フェノール−クロロホルム
で抽出し、エタノールで沈澱させた後、DNA 断片を全量
40μl のDNA ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、６単位の
大腸菌DNA ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、16℃で
90分間反応させ、Xba Ｉ消化によって生じた５’突出末
端を平滑末端に変えた。反応をフェノールで抽出するこ
とにより止め、クロロホルムで抽出し、エタノールで沈
澱させた後、DNA 断片を回収した。このDNA 断片と合成
DNA リンカーXho Ｉ（宝酒造社製）の0.01μg を、T4リ
ガーゼ緩衝液20μl に溶解し、T4DNA リガーゼ175 単位
を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。該反
応液を用いて大腸菌HB101 株を形質転換し、ApR コロニ
ーを得、このコロニーよりプラスミドDNA を回収し、図
５に示したpEPKMB1 を得た。

【００４０】次に、動物細胞用異種遺伝子発現ベクター
pAGE107 〔宮地(Miyaji)ら、サイトテクノロジー(Cytot
echnology) 3,133-140(1990) 〕のSV40初期遺伝子のプ
ロモーターおよびエンハンサー領域（Ｐ_SEと略記する）
を、pEPKMB1 の持つKM50由来免疫グロブリンＨ鎖プロモ
ーターおよびエンハンサー（Ｐ_IHと略記する）に以下に
示す方法により変換した。プラスミドpAGE107 の１μg
を10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウムお
よび150mM 塩化ナトリウムからなる緩衝液30μl に溶解
し、10単位のSalＩと10単位のXho Ｉを加え、37℃で２
時間インキュベートし、Sal Ｉ部位とXhoＩ部位で切断
した。該反応液をアガロースゲル電気泳動後、約5.95kb
のG418耐性遺伝子等を含むDNA 断片を0.5 μg 回収し
た。次に、プラスミドpEPKMB1 の１μg を、10mMトリス
−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび150mM 塩
化ナトリウムからなる緩衝液30μl に溶解し、10単位の
Sal Ｉと10単位のXho Ｉを加え、37℃で２時間インキュ
ベートし、Sal Ｉ部位とXho Ｉ部位で切断した。該反応
液をアガローズゲル電気泳動後、約1.7kb の免疫グロブ
リンプロモーターおよびエンハンサー領域を含むDNA 断
片を0.1 μg 回収した。このようにして得たpAGE107 由
来の5.95kbのDNA 断片(0.1μg)と、免疫グロブリンプロ
モーターおよびエンハンサー領域を含むDNA 断片0.02μ
g を、T4リガーゼ緩衝液20μl に溶解し、T4DNA リガー
ゼ175 単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべート
した。該反応液を用いて大腸菌HB101 株を形質転換し、
ApR コロニーを得、このコロニーよりプラスミドDNA を
回収し、図６に示したpAGE501 を得た。

【００４１】（４）pAGE109 の構築 pAGE106 に２つあるEcoRＩ切断部位の１つが除去された
プラスミドpAGE109 を以下のように構築した。

【００４２】特開平3-22979 に記載の動物細胞用異種遺
伝子発現ベクターpAGE106 の２μgを100 μl の10mMト
リス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび50mM
塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に10単位のEc
oRＩとSac Ｉをそれぞれ加え、37℃で４時間反応させ
た。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画し、Ec
oRＩとSac Ｉで切断したSV40初期遺伝子プロモーターお
よびG418耐性遺伝子を含むpAGE106 のDNA 断片(4.3kb)
を約1.5 μg 回収した。次にこのDNA 断片を全量40μl
のDNA ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌
DNA ポリメラーゼＩラージ断片を加え、16℃で２時間反
応させ、Sac Ｉ消化によって生じた３’突出末端と、Ec
oRＩ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変え
た。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出後、エ
タノールで沈澱させ、20μl のT4リガーゼ緩衝液に溶解
し、この混合溶液に更に350 単位のT4DNA リガーゼを加
え、４℃で４時間反応を行った。このようにして得た組
換えプラスミドDNA を用いて大腸菌HB101 株を形質転換
し、図７に示したプラスミドpAGE109 を得た。

【００４３】（５）pAGE502 の構築 pAGE107 のSV40のプロモーターとエンハンサーを免疫グ
ロブリンＨ鎖のプロモーターとエンハンサーに変換する
ために、プラスミドpAGE502 を以下のように構築した。

【００４４】特開平3-22979 記載のpAGE107 の２μg を
100 μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネ
シウムおよび50mM塩化ナトリウムからなる緩衝液に加
え、更に10単位のHindIII を加えて37℃で４時間反応さ
せた。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、
エタノールで沈澱させた後、全量40μl のDNA ポリメラ
ーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌DNA ポリメラー
ゼＩクレノー断片を加え、16℃で２時間反応させ、Hind
III 消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変え
た。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させ、30μl の10mM トリス−塩酸(pH
7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび100mM塩化ナトリウ
ムからなる緩衝液に加え、更に10単位のXho Ｉを加えて
37℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電
気泳動にて分画し、Xho ＩとHindIII で切断したG418耐
性遺伝子とApR 遺伝子を含むpAGE107 のDNA 断片（約5.
95kb) を約1.5 μg 回収した。

【００４５】次に（３）で得られたpAGE501 の２μg を
100 μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネ
シウムおよび175mM 塩化ナトリウムからなる緩衝液に加
え、更に10単位のSal Ｉを加えて37℃で４時間反応させ
た。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させた後、全量40μl のDNA ポリメラー
ゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌DNA ポリメラーゼ
Ｉクレノー断片を加え、16℃で２時間反応させ、Sal Ｉ
消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。
該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノ
ールで沈澱させた後、30μl の10mMトリス−塩酸(pH7.
5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび100mM塩化ナトリウム
からなる緩衝液に加え、更に10単位のXho Ｉを加えて37
℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気
泳動にて分画し、Xho ＩとSal Ｉで切断したKM50細胞の
免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエンハンサー遺
伝子を含むpAGE501 のDNA 断片(1.8kb) を約0.2 μg 回
収した。

【００４６】次に上記で得られたpAGE107 のHindIII-Xh
o Ｉ断片（約5.95kb)0.1μg と、pAGE501 のSal Ｉ-Xho
Ｉ断片（約1.8kb)0.1 μg を全量20μl のT4リガーゼ緩
衝液に溶解し、この溶液に更にT4DNA リガーゼ350 単位
を加えて、１日間、４℃にてインキュべートした。この
ようにして得られた組換えプラスミドDNA を用いて大腸
菌HB101 株を形質転換し、図８に示したプラスミドpAGE
502 を得た。

【００４７】（６）pAGE503 の構築 pAGE502 に２つあるEcoRＩ切断部位の１つが除去された
プラスミドpAGE503 を以下のように構築した。

【００４８】（４）で得られたpAGE109 の２μg を30μ
l の10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウム
および50mM塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に
10単位のHindIII と10単位のCla Ｉを加えて37℃で４時
間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて
分画し、Cla ＩとHindIII で切断したベーターグロビン
とSV40初期遺伝子のポリＡシグナル遺伝子を含むpAGE10
9 のDNA 断片（約1kb)を約0.2 μg 回収した。

【００４９】次に（５）で得られたpAGE502 の２μg を
30μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5)，6mM 塩化マグネシ
ウムおよび50mM塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、
更に10単位のHindIII と10単位のCla Ｉを加えて37℃で
４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動
にて分画し、HindIII とCla Ｉで切断したKM50細胞の免
疫グロブリンＨ鎖プロモーター、エンハンサー遺伝子、
ApR 遺伝子およびG418耐性遺伝子を含むpAGE502 のDNA
断片（約6.1kb)をDEAEペーパー法にて約１μg回収し
た。次に上記で得られたpAGE109 のHindIII-Cla Ｉ断片
（約1kb)0.1 μgと、pAGE502 のHindIII-Cla Ｉ断片(
約6.1kb)0.1 μg を全量20μl のT4リガーゼ緩衝液に溶
解し、この溶液に更にT4DNA リガーゼ350 単位を加え
て、１日間、４℃にてインキュべートした。このように
して得られた組換えプラスミドDNA を用いて大腸菌HB10
1 株を形質転換し、図９に示したプラスミドpAGE503 を
得た。

【００５０】（７）pSE1d1の構築 pAGE107 にジハイドロフォレートレダクターゼ（dhfr）
遺伝子が導入されたプラスミドpSE1d1を以下のように構
築した。

【００５１】特開平3-22979 記載のpAGE107 の２μg を
100 μl の100mM トリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグ
ネシウムおよび50mM塩化ナトリウムからなる緩衝液に加
え、更に10単位のEcoRＩを加えて37℃で４時間反応させ
た。該反応液をフェノ−ル−クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させた後、全量40μl のDNA ポリメラー
ゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌DNA ポリメラーゼ
Ｉクレノー断片を加え、16℃で２時間反応させ、EcoRＩ
消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。
該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノ
ールで沈澱させた後、30μl の10mM トリス−塩酸(pH
7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび50mM塩化ナトリウ
ムからなる緩衝液に加え、更に10単位のHindIII を加え
て37℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル
電気泳動にて分画し、EcoRＩとHindIII で切断したG418
耐性遺伝子とApR 遺伝子を含むpAGE107 のDNA 断片（約
5.6kb)を約1.5 μg 回収した。

【００５２】次にpSV2-dhfr 〔スブラマニ(Subramani)
ら，モレキュラー・セルラー・バイオロジー(Mol.Cell.
Biology)1,854(1981) 〕の２μg を100 μl の10mMトリ
ス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび100mM
塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に10単位のBg
l IIを加えて37℃で４時間反応させた。該反応液をフェ
ノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱を行
い、次に全量40μl のDNA ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解
し、５単位の大腸菌DNA ポリメラーゼＩクレノー断片を
加え、16℃で２時間反応させ、Bgl II消化によって生じ
た５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノ
ール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた
後、30μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグ
ネシウムおよび100mM 塩化ナトリウムからなる緩衝液に
加え、更に10単位のHindIII を加えて37℃で４時間反応
させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画
し、Bgl IIとHindIII で切断したdhfr遺伝子を含むpSV2
-dhfrDNA断片(0.76kb)を約0.2 μg 回収した。

【００５３】次に上記で得られたpAGE107 のHindIII-Ec
oRＩ断片（約5.6kb)0.1 μg と、pSV2-dhfr のBgl II-H
ind III 断片（約0.76kb)0.1μg とを全量20μl のT4リ
ガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更にT4DNA リガーゼ
350 単位を加えて、１日間、４℃にてインキュべートし
た。このようにして得られた組換えプラスミドDNA を用
いて大腸菌HB101 株を形質転換し、図10に示したプラス
ミドpSE1d1を得た。

【００５４】（８）pSE1d2の構築 pSE1d1のHindIII 切断部位が除去されたプラスミドpSE1
d2を以下のように構築した。

【００５５】（７）で得られたpSE1d1の２μg を100 μ
l の10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウム
および50mM塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に
10単位のHindIII を加えて37℃で４時間反応させた。該
反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノー
ルで沈澱させた後、全量40μl のDNA ポリメラーゼＩ緩
衝液に溶解し、５単位の大腸菌DNA ポリメラーゼＩクレ
ノー断片を加え、16℃で２時間反応させ、HindIII 消化
によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反
応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール
で沈澱させた後、20μl のT4リガーゼ緩衝液に溶解し、
この溶液に更にT4DNA リガーゼ350 単位を加えて、１日
間、４℃にてインキュべートした。このようにして得ら
れた組換えプラスミドDNA を用いて大腸菌HB101 株を形
質転換し、図11に示したプラスミドpSE1d2を得た。

【００５６】（９）pIg1SE1d2 の構築 pAGE503 にdhfr遺伝子が導入されたプラスミドpIg1SE1d
2 を以下のように構築した。

【００５７】（６）で得られたpAGE503 の２μg を100
μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウ
ムおよび50mM塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更
に10単位のCla Ｉを加えて37℃４時間反応させた。該反
応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノール
で沈澱させた後、全量40μl のDNA ポリメラーゼＩ緩衝
液に溶解し、５単位の大腸菌DNA ポリメラーゼＩクレノ
ー断片を加え、16℃で２時間反応させ、Cla Ｉ消化によ
って生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物
をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈
澱させた後、30μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6mM
塩化マグネシウムおよび50mM塩化ナトリウムからなる緩
衝液に加え、更に10単位のMlu Ｉを加えて37℃で４時間
反応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分
画し、Cla ＩとMlu Ｉで切断したKM50免疫グロブリンＨ
鎖プロモーターおよびエンハンサーを含むpAGE503 のDN
A断片（約5.4kb)を約１μg 回収した。

【００５８】次に（８）で得られたpSE1d2の２μg を10
0 μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5)，6mM 塩化マグネシ
ウムおよび100mM 塩化ナトリウムからなる緩衝液に加
え、更に10単位のXho Ｉを加えて37℃で４時間反応させ
た。該反応液をフェノール−クロロホルムで抽出し、エ
タノールで沈澱させた後、全量40μl のDNA ポリメラー
ゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌DNA ポリメラーゼ
Ｉクレノー断片を加え、16℃で２時間反応させ、Xho Ｉ
消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。
該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノ
ールで沈澱させた後、30μl の10mMトリス−塩酸(pH7.
5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび100mM 塩化ナトリウ
ムからなる緩衝液に加え、更に10単位のMlu Ｉを加えて
37℃で４時間反応させた。該反応液をアガロースゲル電
気泳動にて分画し、Xho ＩとMlu Ｉで切断したdhfr遺伝
子を含むpSE1d2のDNA 断片（約3.8kb)を約１μg 回収し
た。

【００５９】次に上記で得られたpAGE503 のCla Ｉ-Mlu
Ｉ断片（約5.4kb)1 μg と、pSE1d2のXho Ｉ-MluＩIII
断片（約3.8kb)１μg を全量20μl のT4リガーゼ緩衝液
に溶解し、この溶液に更にT4DNA リガーゼ350 単位を加
えて、１日間、４℃にてインキュべートした。このよう
にして得られた組換えプラスミドDNA を用いて大腸菌HB
101 株を形質転換し、図12に示したプラスミドpIg1SE1d
2 を得た。

【００６０】（１０）pIg1SE1d3 の構築 pIg1SE1d2 のApa Ｉ切断部位が除去されたプラスミドpI
g1SE1d3 を以下のように構築した。

【００６１】（９）で得られたpIg1SE1d2 の２μg を10
0 μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5)および6mM 塩化マグ
ネシウムからなる緩衝液に加え、更に10単位のApa Ｉを
加えて37℃で４時間反応させた。該反応液をフェノール
−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、
全量40μl のDNA ポリメラーゼＩ緩衝液に溶解し、５単
位の大腸菌DNA ポリメラーゼＩクレノー断片を加え、16
℃で２時間反応させ、Apa Ｉ消化によって生じた３’突
出末端を平滑末端に変えた。該反応物をフェノール−ク
ロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた後、20μ
l のT4リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に350 単
位のT4リガーゼを加え４℃で24時間反応を行った。この
ようにして得られた組換えプラスミドDNA を用いて大腸
菌HB101株を形質転換し、図13に示したプラスミドpIg1S
E1d3 を得た。

【００６２】（１１）pIg1SE1d4 の構築 pIg1SE1d3 のHindIII 切断部位とEcoRＩ切断部位の間に
クローニングサイトを設けるために、配列番号２で示し
た合成ＤＮＡを挿入したプラスミドであるpIg1SE1d4 を
以下のように構築した。

【００６３】（１０）で得られたpIg1SE1d3 の２μg を
30μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5)，6mM 塩化マグネシ
ウムおよび50mM塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、
更に10単位のHindIII とEcoRＩを加えて37℃で４時間反
応させた。該反応液をアガロースゲル電気泳動にて分画
し、HindIII とEcoRＩで切断したKM50細胞の免疫グロブ
リンＨ鎖プロモーター、エンハンサー、ApR 遺伝子、G4
18耐性遺伝子およびdhfr遺伝子を含むpIg1SE1d3 のDNA
断片（約9.2kb)を約１μg 回収した。

【００６４】次に上記で得られたpIg1SE1d3 のHindIII-
EcoRＩ断片（約9.2kb)0.1 μg と、合成DNA （配列番号
２）の10ngを全量20μl のT4リガーゼ緩衝液に溶解し、
この溶液に更にT4DNA リガーゼ350 単位を加えて、１日
間、４℃にてインキュべートした。このようにして得ら
れた組換えプラスミドDNA を用いて大腸菌HB101 株を形
質転換し、図14に示したプラスミドpIg1SE1d4 を得た。

【００６５】３．モロニーマウス白血病ウイルスのロン
グ・ターミナル・リピート(long terminal repeat )
（以下、MoLTR と略記する）の調製 MoLTR はプロモーターおよびエンハンサー活性を有する
ことが知られている〔桑名ら，バイオケミカル・アンド
・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ
(Biochem.Biophys.Res.Comun.)149,960(1987) 〕。そこ
で、MoLTR をカセットベクターのプロモーターおよびエ
ンハンサーとして用いるために、MoLTRを有するプラス
ミドpPMOL3を以下に示す方法により調製した。

【００６６】特開平1-63394 記載のpPMOL1の３μg を30
μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，7mM塩化マグネシウ
ムおよび6mM 2-メルカプトエタノールからなる緩衝液に
加え、更に10単位のCla Ｉを加えて37℃で４時間反応さ
せた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、
エタノールで沈澱させた後、全量40μl のDNA ポリメラ
ーゼＩ緩衝液に溶解し、５単位の大腸菌DNA ポリメラー
ゼＩクレノー断片を加え、16℃で２時間反応させ、Cla
Ｉ消化によって生じた５’突出末端を平滑末端に変え
た。反応をフェノールで抽出することにより止め、クロ
ロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、DNA 断片を
２μg 回収した。このDNA 断片と合成DNAリンカーXho
Ｉ（宝酒造社製）の0.01μg を、T4リガーゼ緩衝液20μ
l に溶解し、T4DNA リガーゼ175 単位を加えて、１日
間、４℃にてインキュベートした。該反応物を用いて大
腸菌HB101 株を形質転換し、図15に示したプラスミドpP
MOL2を得た。次に、pPMOL2の3 μg を30μl の10mMトリ
ス−塩酸(pH7.5) ，7mM 塩化マグネシウム，10mM塩化ナ
トリウムおよび6mM 2 −メルカプトエタノールからなる
緩衝液に加え、更に10単位のSma Ｉを加えて37℃４時間
反応させた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽
出し、エタノールで沈澱させ、DNA 断片を２μg回収し
た。このDNA 断片と合成DNA リンカーEcoRＩ（宝酒造社
製) の0.01μg を、T4リガーゼ緩衝液20μl に溶解し、
T4DNA リガーゼ175 単位を加えて、１日間、４℃にてイ
ンキュベートした。該反応物を用いて大腸菌HB101 株を
形質転換し、図16に示したプラスミドpPMOL3を得た。

【００６７】４．ヒト免疫グロブリンIgG1のＨ鎖定常領
域（Ｃγ１）cDNAおよびＬ鎖定常領域（Ｃκ）cDNAのク
ローニング （１）キメラ抗体産生細胞SP2-PC Chimera-1からのmRNA
の取得 インビトロジェン社製のmRNA抽出キットであるFast Tra
ck（商品番号K1593-02）を用いて、抗フォスフォリルコ
リン活性を有するキメラ抗体産生細胞でフェデレーショ
ン・オブ・ヨーロピアン・バイオケミカル・ソサイアテ
ィーズ(FEBS letter) 244,301-306(1989) に記載されて
いるキメラ抗体産生細胞SP2-PC Chimera-1の１×10⁸ 細
胞より、mRNAを6.2 μg 取得した。

【００６８】（２）SP2-PC Chimera-1 cDNA ライブラリ
ーの作製とヒト免疫グロブリンＨ鎖定常領域（Ｃγ１）
cDNAおよびＬ鎖定常領域（Ｃκ）cDNAのクローニング （１）で得られたmRNAの２μg から、ファルマシア社製
のcDNA Synthesis Kit（商品番号27-9260-01) を用い
て、EcoRＩアダプターを付与した後、カイネーションを
行った。得られたcDNA溶液をフェノール−クロロホルム
で抽出し、エタノールで沈澱させ、４μg のcDNAを回収
した。このcDNAを20μl の滅菌水に溶解後、アガロース
ゲル電気泳動にて分画し、約1.8kb と約1.0kb のDNA 断
片をそれぞれ約0.3 μg 回収した。

【００６９】次に、ベクターpUC18 の5 μg を100mM ト
リス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび100m
M 塩化ナトリウムからなる緩衝液100 μl に加え、更に
50単位のEcoRＩを加え、37℃で４時間反応させ、pUC18
のDNA 中のEcoRＩ部位で切断した。該反応物をフェノー
ル−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、Ec
oRＩで切断したpUC18 のDNA 断片を約３μg 回収した。

【００７０】次に上記で得られたpUC18 のEcoRＩ断片
（約2.7kb)0.1 μg と、SP2-PC Chimera-1細胞より調製
した1.8kb および1.0kb のcDNA断片各0.1 μg を全量20
μl のT4リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に350
単位のT4DNA リガーゼを加え、４℃で24時間反応させ
た。このようにして得られた組換え体プラスミドDNA を
用いて大腸菌LE392 株を形質転換した。得られた約3000
個のコロニーをニトロセルロースフィルター上に固定し
た。亀山らによって単離されたヒト免疫グロブリン定常
領域の染色体遺伝子（IgG1のＨ鎖の定常領域であるＣγ
1 と、 Ｌ鎖の定常領域であるＣκ）〔亀山ら、FEBS let
ter 244,301(1989) 〕を³²Ｐで標識したプローブに65℃
で強く会合した菌株のうちＣγ1 と会合するもの１個(p
PCVHhCGI1)、Ｃκと会合するもの1 個(pPCVLhCK1) をそ
れぞれ得た。

【００７１】（３）ヒトIgκ鎖定常領域へのEcoRＶ部位
の導入 プロメガ社製のキット（カタログ番号Q6210 ）を用いた
部位特異的変異導入法によりヒトIgκ鎖定常領域５’末
端近傍領域にEcoRＶ部位を導入した。プラスミドpPCVLh
CK1 の２μg を30μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6m
M 塩化マグネシウムおよび50mM塩化ナトリウムからなる
緩衝液に加え、更に10単位のEcoRＩと10単位のKpn Ｉを
加えて37℃で４時間反応させた。該反応物をアガロース
ゲル電気泳動にて分画し、Kpn ＩとEcoRＩで切断したヒ
ト免疫グロブリンＬ鎖定常領域遺伝子を含むpPCVLhCK1
のDNA 断片（約0.8kb)を約0.2 μg 回収した。

【００７２】次にpSELECT1（プロメガ社製のキット：カ
タログ番号Q6210 ）の２μg を30μl の10mMトリス−塩
酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよび50mM塩化ナト
リウムからなる緩衝液に加え、更に10単位のEcoRＩとKp
n Ｉを加えて37℃で４時間反応させた。該反応物をアガ
ロースゲル電気泳動にて分画し、EcoRＩとKpn Ｉとで切
断したpSELECT1のDNA 断片（約5.7kb)を約１μg 回収し
た。

【００７３】次に上記で得られたpPCVLhCK1 のEcoRＩ-K
pnＩ断片（約0.8kb)0.1 μg と、pSELECT1のEcoRＩ-Kpn
Ｉ断片（約5.7kb)0.1 μg を全量20μl のT4リガーゼ緩
衝液に溶解し、この溶液に更に350 単位のT4DNA リガー
ゼを加えて４℃で24時間反応を行った。このようにして
得られた組換え体プラスミドDNA を用いて大腸菌JM109
株を形質転換し、図17に示したプラスミドpchCKA7 を得
た。

【００７４】次にpchCKA7 を用いて、配列番号３の合成
DNA を変異導入プライマーとして使用して、ヒト免疫グ
ロブリンＬ鎖定常領域のＮ末端から12ベース目より14ベ
ース目までのACC 配列をGAT に変換することにより、そ
の部位にEcoRＶ部位を導入したプラスミドpchCKB1 を構
築した（図18）。次に、pchCKB1 のEcoRＶ部位をHindII
I 切断部位に変換するために、以下の操作を行った。

【００７５】プラスミドpchCKB1 の２μg を10μl の10
0mM トリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよ
び100mM 塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に10
単位のEcoRＩを加えて37℃で４時間反応させた。該反応
物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで
沈澱させた後、全量40μl のDNA ポリメラ−ゼＩ緩衝液
に溶解し、５単位の大腸菌DNA ポリメラーゼＩクレノー
断片を加え、37℃で30分間反応させ、EcoRＩ消化によっ
て生じた５’突出末端を平滑末端に変えた。該反応物を
該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノ
ールで沈澱させた後、更に0.1 μg のHindIII リンカー
（宝酒造社製）を加えて20μl のT4リガーゼ緩衝液に溶
解し、この溶液に更に350 単位のT4リガーゼを加えて４
℃で24時間反応を行った。このようにして得られた組換
え体プラスミドDNA を用いて大腸菌HB101 株を形質転換
し、図19に示したプラスミドpchCKC1 を得た。

【００７６】５．カセットベクターの構築 （１）ヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発現ベクターを構築するた
めに用いるカセットベクターの構築 ２の（１１）で得たpIg1SEId4 の２μg を30μl の10mM
トリス−塩酸(pH7.5)，6mM 塩化マグネシウムおよび100
mM 塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に10単位
のEcoRＶとApa Ｉを加えて37℃で４時間反応させた。該
反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、EcoRＶと
Apa Ｉで切断した9.2kb のpIg1SEId4 のDNA 断片（約9.
2kb)を約1.5 μg 回収した。

【００７７】次に４の（２）で得たpPCVHhCGI1の２μg
を30μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5) および6mM 塩化マ
グネシウムからなる緩衝液に加え、更に10単位のApa Ｉ
と10単位のSma Ｉを加えて37℃で１時間反応させた。該
反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画し、Apa Ｉと
Sma Ｉで切断したヒト免疫グロブリンＨ鎖定常領域遺伝
子を含むpPCVHhCGＩ1 のDNA 断片（約1kb)を約0.2 μg
回収した。

【００７８】次に上記で得られたpIg1SEId4 のEcoRＶ-A
paＩ断片（約9.2kb)0.1 μg と、pPCVHhCGＩ1 のApa Ｉ
- Sma Ｉ断片（約1kb)0.1 μg を全量20μl のT4リガー
ゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に350 単位のT4DNA リ
ガーゼを加えて４℃で24時間反応させた。このようにし
て得られた組換え体プラスミドDNA を用いて大腸菌HB10
1 株を形質転換し、図20に示すヒト型キメラ抗体Ｈ鎖発
現ベクターを構築するために用いるカセットベクターで
あるプラスミドpChiIgHB2 を得た。

【００７９】（２）ヒト型キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクター
を構築するために用いるカセットベクターの構築 ２の（１１）で得られたpIg1SEId4 の２μg を30μl の
10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグネシウムおよ
び100mM 塩化ナトリウムからなる緩衝液に加え、更に10
単位のEcoRＶと10単位のHindIII を加えて37℃で４時間
反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分
画し、EcoRＶとHindIII で切断したpIg1SEId4 のDNA 断
片（約9.2kb)を約1.5 μg 回収した。

【００８０】次に４の（３）で得られたpchCKC1 の２μ
g を30μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，6mM 塩化マグ
ネシウムおよび100mM 塩化ナトリウムからなる緩衝液に
加え、更に10単位のEcoRＶと10単位のHindIII を加えて
37℃で１時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電
気泳動にて分画し、EcoRＶとHindIII で切断したヒト免
疫グロブリンＬ鎖定常領域遺伝子を含むpPCVLhCK1 のDN
A 断片（約0.6kb)を約0.2 μg 回収した。

【００８１】次に上記で得られたpIg1SEId4 のEcoRＶ-H
ind III 断片（約9.2kb)0.1 μg と、pchCKC1 のEcoRＶ
-Hind III 断片（約0.6kb)0.1 μg を全量20μl のT4リ
ガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に350 単位のT4DN
A リガーゼを加えて４℃で24時間反応を行った。このよ
うにして得られた組換え体プラスミドDNA を用いて大腸
菌HB101 株を形質転換し、図21に示したヒト型キメラ抗
体Ｌ鎖発現ベクターを構築するために用いるカセットベ
クターであるプラスミドpChiIgLA1 を得た。

【００８２】実施例２ 抗GD₃ キメラ抗体 １．マウス抗GD₃ モノクローナル抗体KM-641産生ハイブ
リドーマ細胞からのmRNAの取得 インビトロジェン社製のmRNA抽出キットであるFast Tra
ck（商品番号K1593-02）を用いて、参考例１で得られる
マウス抗GD₃ モノクローナル抗体KM-641産生ハイブリド
ーマ細胞の１×10⁸ 細胞より、mRNAを34μg 取得した。

【００８３】２．KM-641のＨ鎖およびＬ鎖cDNAライブラ
リーの作製 １で取得したmRNAの３μg から、ストラタジーン社製の
cDNA合成キットであるZAP-cDNA Synthesis Kit（商品番
号sc200400) を用い、５’末端にEcoRＩアダプター、
３’末端にXho Ｉアダプターを有するcDNAをそれぞれ合
成した。このcDNA約６μg を10μl の滅菌水に溶解後、
アガロースゲル電気泳動にて分画し、Ｈ鎖に対応する約
1.8kb のcDNA断片とＬ鎖に対応する約1.0kb のcDNA断片
をそれぞれ約0.1 μg 回収した。次に、約1.8kb のcDNA
断片0.1 μg および約1.0kb のcDNA断片0.1 μg と、ベ
クターとして用いるUni-ZAP XR （ストラタジーン社
製、Lambda ZAPIIベクターをEcoRＩとXho Ｉで切断後、
Calf Intestine Alkaline Phosphatase で処理したも
の）1 μg をT4リガーゼ緩衝液11.5μl に溶解し、T4DN
Aリガーゼ175 単位を加えて、12℃にて１晩インキュベ
ートし、さらに室温にて２時間インキュベートした。こ
の反応液のうち４μl を常法〔マニアティス(Maniatis)
ら編集、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloni
ng) 、1989年、p2.95 〕に従い、ギガパックゴールド
（ストラタジーン社製）を使用し、ラムダファージにパ
ッケージングし、これを常法〔Maniatisら編集、モレキ
ュラー・クローニング(Molecular Cloning) 、1989年、
p2.95-107 〕に従って、大腸菌株PLK-Fに感染させて、
Ｈ鎖のcDNAライブラリーおよびＬ鎖のcDNAライブラリー
としてそれぞれ約１万個のファージクローンを取得し
た。次に常法〔マニアティス(Maniatis)ら編集、モレキ
ュラー・クローニング(Molecular Cloning) 、1989年、
p2.112〕に従い、ファージをニトロセルロースフィルタ
ー上に固定した。

【００８４】３．モノクローナル抗体KM-641のＨ鎖およ
びＬ鎖cDNAのクローニング ２で作製したＨ鎖のcDNAライブラリーおよびＬ鎖のcDNA
ライブリーより、常法〔マニアティス(Maniatis)ら編
集、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)
、1989年、p2.108〕に従い、マウス免疫グロブリン定
常領域の染色体遺伝子であるマウスＣγ1 遺伝子を含む
約6.8kb のEcoRＩ断片〔Roederら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A. 78,474(1981)〕およびマウスＣκ遺伝子を含
む約3kb のHindIII-BamHＩ断片（Sakanoら、Nature 28
0,288(1979) を³²Ｐで標識したプローブを用いて、プロ
ーブに65℃で強く会合したファージクローンをそれぞれ
１個ずつ取得した。次に、ストラタジーン社製のcDNA合
成キットであるZAP-cDNA Synthesis Kit（商品番号sc20
0400) を用いて、ファージクローンをプラスミドpBlues
cript に変換し、KM-641のＨ鎖のcDNAを含む組換えプラ
スミドpKM641HA3 およびKM-641Ｌ鎖cDNAを含む組換えプ
ラスミドpKM641LA2 をそれぞれ取得した。pKM641HA3 お
よびpKM641LA2 をEcoRＩとXho Ｉを用いて切断したとこ
ろ、それぞれ約1.6kb および約0.9kb のcDNA断片が挿入
されていた（図22）。

【００８５】４．KM-641のＨ鎖cDNA(pKM641HA3) および
KM-641のＬ鎖cDNA(pKM641LA2) の免疫グロブリン可変領
域の塩基配列 ３で得られたpKM641HA3 およびpKM641LA2 の免疫グロブ
リン可変領域の塩基配列をSequenase Version 2.0 DNA
Sequencing Kit(United States Biochemical Corporati
on社製）を用いてダイデオキシ法〔マニアティス(Mania
tis)ら編集、モレキュラー・クローニング(Molecular C
loning) 、1989年、p13.42〕により決定した。その結果
得られたＨ鎖可変領域の塩基配列をを配列番号４に、Ｌ
鎖可変領域の塩基配列を配列番号５にそれぞれ示した。
pKM641LA2 は、５’端付近に開始コドンATG と推定され
るメチオニンが存在し、リーダー配列を含む完全長のcD
NAであった。pKM641HA3 は、５’端付近に開始コドンと
推定されるメチオニンが存在せず、リーダー配列が一部
欠損していた。

【００８６】５．KM-641キメラＨ鎖発現ベクターの構築 プラスミドpKM641HA3 の可変領域遺伝子の５’末端付近
のAlu Ｉ部位および可変領域遺伝子の３’末端付近のSt
y Ｉ部位で切断して得られるＨ鎖可変領域遺伝子を配列
番号６および７に示す合成DNA を用いて実施例１で得ら
れたヒト型キメラ抗体Ｈ鎖の構築のために用いるカセッ
トベクターと連結させることにより、ヒト型キメラ抗体
Ｈ鎖発現ベクターを構築した（図23）。

【００８７】まず、pKM641HA3 の免疫グロブリンＨ鎖可
変領域の3'末端から3'末端付近にあるSty Ｉ切断部位ま
での塩基配列と、pAGE28の免疫グロブリンＨ鎖定常領域
の5'末端から5'末端付近にあるApa Ｉ切断部位までの塩
基配列とからなり、Sty Ｉ切断部位とApa Ｉ切断部位を
両端に有する配列番号７に示したＤＮＡ（図23参照）を
ＤＮＡ合成機で合成した。次に、この合成ＤＮＡを以下
に示す方法で、プラスミドpKM641HA3 に導入した。

【００８８】pKM641HA3 の３μg を30μl の50mMトリス
−塩酸(pH7.5) ，10mM塩化マグネシウム，50mM塩化ナト
リウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に10単
位のEcoRＩと10単位のSty Ｉを加えて37℃で４時間反応
させた。該反応物をアガロースゲル電気泳動にて分画
し、0.41kbのDNA 断片を約0.3 μg 回収した。次に、pA
GE28〔水上ら、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー
(J.Biochem) 101,1307-1310(1987) 〕の３μg を30μl
の10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，7mM 塩化マグネシウムお
よび6mM 2-メルカプトエタノールからなる緩衝液に加
え、更に10単位のEcoRＩと10単位のApa Ｉを加えて37℃
で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電気泳
動にて分画し、2.45kbのDNA 断片を約２μg 回収した。
次に、上記で得られたpKM641HA3 のEcoRＩ-StyＩ断片
（約0.41kb)0.1μg およびpAGE28のEcoRＩ-ApaＩ断片
（約2.45kb)0.1μg および配列番号７に示す合成DNA の
0.3 μg を全量20μl のT4リガーゼ緩衝液に溶解し、こ
の溶液に更に350 単位のT4リガーゼを加え４℃で24時間
反応させた。このようにして得られた組換え体プラスミ
ドDNA を用いて大腸菌HB101 株を形質転換し、図24に示
したプラスミドpKM641HE1 を得た。

【００８９】pKM641HE1 はリーダー配列が欠損している
ため、それを補填するために配列番号６に示した合成Ｄ
ＮＡを用いて以下の操作を行った。pKM641HE1 の３μg
を30μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5) ，7mM 塩化マグネ
シウムおよび6mM 2-メルカプトエタノールからなる緩衝
液に加え、更に10単位のEcoRＩと10単位のApa Ｉを加え
て37℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル
電気泳動にて分画し、約0.42kbのDNA 断片を約0.4 μg
回収した。pKM641HE1 のEcoRＩ-ApaＩ断片（約0.42kb)
0.4μg を30μl の10mMトリス−塩酸(pH7.5)，7mM 塩化
マグネシウム，50mM塩化ナトリウムおよび6mM 2-メルカ
プトエタノールからなる緩衝液に加え、更に10単位のAl
u Ｉを加えて37℃で４時間反応させた。該反応物をフェ
ノール−クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱さ
せ、約0.4kb のDNA 断片を約0.3 μg 回収した。

【００９０】次に、上記で得られたpKM641HE1 のAlu Ｉ
-ApaＩ断片（約0.4kb)0.1 μg およびpAGE28のEcoRＩ-A
paＩ断片（約2.45kb)0.1μg および配列番号６に示す合
成DNA の0.3 μg を全量20μl のT4リガーゼ緩衝液に溶
解し、この溶液に更に350 単位のT4リガーゼを加え４℃
で24時間反応させた。このようにして得られた組換え体
プラスミドDNA を用いて大腸菌HB101 株を形質転換し、
図25に示したプラスミドpKM641HF1 を得た。

【００９１】次に、pKM641HF1 の免疫グロブリンＨ鎖可
変領域をカセットベクターpChiIgHB2 に導入するために
以下の操作を行った。pKM641HF1 の３μg を30μl の10
mMトリス−塩酸(pH7.5) ，7mM 塩化マグネシウムおよび
6mM 2-メルカプトエタノールからなる緩衝液に加え、更
に10単位のEcoRＩと10単位のApa Ｉを加えて37℃で４時
間反応させた。該反応物をアガロ−スゲル電気泳動にて
分画し、0.44kbのDNA 断片を約0.5 μg 回収した。次
に、pChiIgHB2 の３μg を30μl の10mM トリス−塩酸
(pH7.5) ，7mM 塩化マグネシウムおよび6mM 2-メルカプ
トエタノールからなる緩衝液に加え、更に10単位のEcoR
Ｉと10単位のApa Ｉを加えて37℃で４時間反応させた。
該反応物をフェノール−クロロホルムで抽出し、エタノ
ールで沈澱させ、約3 μg のDNA を回収した。次に、上
記で得られたpKM641HF1 のEcoRＩ-ApaＩ断片（約0.44k
b)0.1μg およびpChiIgHB2 のEcoRＩ-ApaＩ断片（約10.
1kb)0.1μg を全量20μl のT4リガーゼ緩衝液に溶解
し、この溶液に更に350 単位のT4リガーゼを加え４℃で
24時間反応させた。このようにして得られた組換え体プ
ラスミドDNA を用いて大腸菌HB101 株を形質転換し、図
26に示したプラスミドpChi641HA1を得た。

【００９２】次に、以下に示す方法で、pChi641HA1のKM
50由来免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエンハン
サー領域をMoLTR に変換した。pChi641HA1の３μg を30
μl の50mMトリス−塩酸(pH7.5) ，10mM塩化マグネシウ
ム，50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTT からなる緩衝液
に加え、更に10単位のEcoRＩと10単位のXho Ｉを加えて
37℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電
気泳動にて分画し、約8.8kb のDNA 断片を約0.2 μg 回
収した。実施例１の２で得られたpPMOL3の3 μg を30μ
l の50mMトリス−塩酸(pH7.5) ，10mM塩化マグネシウ
ム，50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTT からなる緩衝液
に加え、更に10単位のEcoRＩと10単位のXho Ｉを加えて
37℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲル電
気泳動にて分画し、MoLTR を含む0.63kbのDNA 断片を約
0.3μg 回収した。次に、pChi641HA1のEcoRＩ- Xho Ｉ
断片0.1 μg およびpPMOL3のEcoRＩ- Xho Ｉ断片0.1 μ
g をT4リガーゼ緩衝液20μl に溶解し、T4DNA リガーゼ
175 単位を加えて、１日間、４℃にてインキュベートし
た。該反応物を用いて大腸菌HB101 株を形質転換し、図
27に示したKM-641キメラＨ鎖発現ベクターであるプラス
ミドpChi641HAM1 を得た。

【００９３】６．KM-641キメラＬ鎖発現ベクターの構築 プラスミドpKM641LA2 の可変領域遺伝子の５’末端のEc
oRＩ部位および可変領域遺伝子の３’末端付近のHindII
I 部位で切断して得られるＬ鎖可変領域遺伝子を配列番
号８に示した合成DNA を用いてキメラＬ鎖用カセットベ
クターと連結させることによりＬ鎖用発現ベクターを構
築した（図28）。

【００９４】まず、pKM641LA2 の免疫グロブリンのＬ鎖
可変領域の3'末端から3'末端付近にあるHindIII 切断部
位までの塩基配列と、pChiIgLA1 の5'末端から5'末端付
近にあるEcoRＶ切断部位までの塩基配列とからなり、Hi
ndIII切断部位とEcoRＶ切断部位を両端に有する配列番
号８で示したＤＮＡ（図29参照）をＤＮＡ合成機を用い
て合成した。次に、この合成ＤＮＡを以下に示す方法で
pKM641LA2 に導入した。

【００９５】pKM641LA2 の３μg を30μl の10mMトリス
−塩酸(pH7.5) ，7mM 塩化マグネシウム，50mM塩化ナト
リウムおよび6mM 2-メルカプトエタノールからなる緩衝
液に加え、更に10単位のEcoRＩと10単位のHindIII を加
えて37℃で４時間反応させた。該反応物をアガロースゲ
ル電気泳動にて分画し、0.35kbのDNA 断片を約0.3 μg
回収した。次に、pChiIgLA1 の3 μg を30μl の50mMト
リス−塩酸(pH7.5) ，10mM塩化マグネシウム，50mM塩化
ナトリウムおよび1mM DTT からなる緩衝液に加え、更に
10単位のEcoRＩと10単位のEcoRＶを加えて37℃で４時間
反応させた。該反応物をフェノール−クロロホルムで抽
出し、エタノールで沈澱させた後、約３μg のDNA を回
収し、10mMトリス−塩酸（pH7.5）および１mM EDTAから
なるTE溶液10μl に溶解した。次に、上記で得られたpK
M641LA2 のEcoRＩ-Hind III 断片（約0.35kb)0.1μg お
よびpChiIgLA1 のEcoRＩ-EcoR Ｖ断片（約9.7kb)0.1 μ
gおよび配列番号８に示す合成DNA の0.3 μg を全量20
μl のT4リガーゼ緩衝液に溶解し、この溶液に更に350
単位のT4リガーゼを加え４℃で24時間反応させた。この
ようにして得られた組換え体プラスミドDNA を用いて大
腸菌HB101 株を形質転換し、図29に示したプラスミドpC
hi641LG11 を得た。

【００９６】次に、以下に示す方法で、pChi641LG11 の
KM50由来の免疫グロブリンＨ鎖プロモーターおよびエン
ハンサー領域をMoLTR に変換した。pChi641LG11 の３μ
g を30μl の50mMトリス−塩酸(pH7.5) ，10mM塩化マグ
ネシウム，50mM塩化ナトリウムおよび1mM DTT からなる
緩衝液に加え、更に10単位のEcoRＩと10単位のXho Ｉを
加えて37℃で４時間反応させた。該反応物をアガロース
ゲル電気泳動にて分画し、約8.3kb のDNA 断片を約0.2
μg 回収した。次に、pChi641LG11 のEcoRＩ−Xho Ｉ断
片0.1 μg およびpPMOL3のEcoRＩ−Xho Ｉ断片0.1 μg
をT4リガーゼ緩衝液20μl に溶解し、T4DNA リガーゼ17
5 単位を加えて、１日間、４℃にてインキュベートし
た。該反応物を用いて大腸菌HB101 株を形質転換し、図
30に示したKM-641キメラＬ鎖発現ベクターであるプラス
ミドpChi641LGM11を得た。

【００９７】７．抗GD₃ キメラ抗体のSP2/0 細胞におけ
る発現 SP2/0 細胞へのプラスミドの導入は、Miyajiらの方法に
従い、エレクトロポーレーション法〔サイトテクノロジ
ー(Cytotechnology)，3,133-140(1990) 〕にて行った。

【００９８】２×10⁶ 細胞あたりpChi641LG11 およびpC
hi641HA1を各２μg 同時に、または、pChi641LGM11およ
びpChi641HAM1 を各２μg 同時に導入後、40mlのRPMI16
40-FCS(10) 〔FCS を10％、7.5 ％ NaHCO₃ を1/40量、2
00mM L−グルタミン溶液(GIBCO社製) を３％、ペニシリ
ン・ストレプトマイシン溶液(GIBCO社製、5000units/ml
ペニシリンおよび5000μg/mlストレプトマイシン含有)
を0.5 ％含むRPMI1640培地（日水製薬社製）〕に懸濁
し、96穴マイクロタイタープレートに200 μl ずつ分注
した。CO₂ インキュベーターで37℃、 24時間培養した
後、G418（ギブコ社製）を0.5mg/mlになるように添加し
て１〜２週間培養した。形質転換株のコロニーが出現
し、コンフルエントになったウェルより培養液を回収
し、抗GD₃ キメラ抗体活性を以下に示すELISA 法にて測
定した。

【００９９】酵素免疫測定法(ELISA法) 2ng のGD₃ （ヤトロン社製）またはその他のガングリオ
シドを5ng のフォスファチジルコリン（シグマ社製）と
2.5ng のコレステロール（シグマ社製）とを含む２μl
のエタノール溶液に溶解した。この溶液20μl またはこ
の溶液の希釈液20μl を96ウェルマイクロタイタープレ
ート（グライナー社製）の各ウェルにそれぞれ分注し、
風乾後、１％BSA を含むPBS でブロッキングを行った。
ここに形質転換株の培養上清または精製したマウスモノ
クローナル抗体または精製したキメラ抗体を50〜100 μ
l 加え、一晩、４℃で反応させた。反応後、各ウェルを
PBS で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識プロテインＡ（フ
ナコシ社製）を50-100μl加え、１〜２時間室温で反応
させた。PBS で洗浄後、ABTS基質液〔2,2'アジノビス
（3-エチルベンゾチアゾリン-6- スルホン酸）二アンモ
ニウムの550mg を0.1Mクエン酸緩衝液(pH4.2) に溶解
し、使用直前に過酸化水素１μl/mlを加えた溶液〕を50
〜100 μl を加えて発色させ、OD₄₁₅ を測定した。

【０１００】得られたクローンの中で、ELISA 法で最も
高い活性を示したクローンの培養液中の抗GD₃ キメラ抗
体量は約0.1 μg/mlであった。上記抗GD₃ キメラ抗体活
性を示したクローンについて、G418を0.5mg/ml、メソト
レキセート（以下MTX と略記する）を50nM含むRPMI1640
-FCS(10)培地に１〜２×10⁵ 細胞/ml になるように懸濁
し、24ウェルプレートに2ml 分注した。CO₂ インキュベ
ーターで37℃、２〜３週間培養して、50nM MTX耐性クロ
ーンを誘導した。コンフルエントになった時点で培養液
中の抗GD₃ キメラ抗体活性をELISA 法にて測定した。得
られたクローンの中で、ELISA 法で最も高い活性を示し
た50nM MTX耐性クローンの抗GD₃ キメラ抗体量は約0.3
μg/mlであった。

【０１０１】上記50nM MTX耐性クローンについて、G418
を0.5mg/mlおよびMTX を200nM 含むRPMI1640-FCS(10)培
地に１〜２×10⁵ 細胞/ml になるように懸濁し、24ウェ
ルプレートに2ml 分注した。CO₂ インキュベーターで37
℃、２〜３週間培養して、200nM MTX 耐性クローンを誘
導した。コンフルエントになった時点で、培養液中の抗
GD₃ キメラ抗体活性をELISA 法にて測定した。得られた
クローンの中で、ELISA 法で最も高い活性を示した200n
M MTX 耐性クローンの抗GD₃ キメラ抗体量は約２μg/ml
であった。この200nM MTX 耐性クローンを形質転換株KM
-871と命名した。

【０１０２】上記形質転換株KM-871が抗GD₃ キメラ抗体
タンパク質を発現することをSDS-ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動(SDS-PAGE)により以下のようにして確認し
た。形質転換株KM-871を、G418を0.5mg/mlおよびMTX を
200nM 含むGIT 培地（日本製薬社製）に１〜２×10⁵ 細
胞/ml になるように懸濁し、175cm²フラスコ（グライナ
ー社製）に100ml 分注した。CO₂ インキュベーターで37
℃、３〜５日間培養し、コンフルエントになった時点で
培養液を回収した。該培養液約900ml を50％硫安で塩析
後、アフィゲルプロテインＡ MAPS−IIキット（バイオ
ラッド社製）を用いて、精製された抗GD₃ キメラ抗体KM
-871を約100 μg 取得した。精製されたGD₃ キメラ抗体
KM-871の約５μg を、公知の方法〔レムリー(Laemmli)
、ネイチャー(Nature) 227,680(1970) 〕に従って電
気泳動し、抗GD₃ キメラ抗体KM-871の分子量を調べた。
その結果を図31に示した。図31に示したように、還元条
件下ではキメラＨ鎖の分子量は約50キロダルトン、キメ
ラＬ鎖の分子量は約25キロダルトンであり、正しい分子
量のＨ鎖およびＬ鎖の発現が確認された。また、非還元
条件下ではキメラ抗体の分子量は約150 キロダルトンで
あり、２本のＨ鎖および２本のＬ鎖よりなる正しい大き
さの抗体の発現が確認された。

【０１０３】８．抗GD₃ キメラ抗体KM-871の反応特異性 ガングリオシドGM₁ ，Ｎ−アセチルGM₂ （ベーリンガー
・マンハイム社製），N-グリコリルGM₂ ，N-アセチルGM
₃ ，N-グリコリルGM₃ ，GD_1a，GD_1b（ヤトロン社製），
GD₂ ，GD₃ （ヤトロン社製），GT_1b（フナコシ社製）お
よびGQ_1b（ヤトロン社製）に対する抗GD₃ キメラ抗体の
反応性をELISA 法で測定した。GM₁ とGD _1aはウシ脳よ
り、N-グリコリルGM₂ とN-グリコリルGM₃ はマウス肝臓
より、N-アセチルGM₃ はイヌ赤血球より、GD₂ は培養細
胞株IMR32(ATCC CCL127)によりそれぞれ公知の方法〔ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J.Bio
l.Chem.) 263,10915(1988)〕に準じて精製した。その結
果を第１表に示す。

【０１０４】

【表１】

【０１０５】第１表に示したように、抗GD₃ キメラ抗体
KM-871およびマウス抗GD₃ 抗体KM-641はGD₃ のみに反応
し、他のガングリオシドには反応せず、キメラ化により
反応特異性は変化しなかった。

【０１０６】９．蛍光抗体法による抗ＧＤ₃ キメラ抗体
ＫＭ−８７１の腫瘍細胞との反応性 ＧＤ₃ を発現しているヒト悪性黒色腫培養細胞株ＳＫ−
ＭＥＬ−２８（ＡＴＣＣ ＨＴＢ７２）およびＧ３６１
（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４２４）のそれぞれ１×10⁶ 個を
マイクロチューブ（トレフ社製）にとりＰＢＳで遠心分
離（1200rpm 、５分）して細胞を洗浄後、ＫＭ−８７１
を５０μl （１０μg ／ml）加えて攪拌し、４℃、３０
分間反応させた。反応後、ＰＢＳで３回遠心分離（1200
rpm 、５分）して洗浄した後、フルオレッセインイソチ
アシアネートで蛍光標識したプロテインＡ（ベーリンガ
ーマンハイム山之内社製、２０倍希釈）２０μl を加え
て攪拌後、４℃、３０分間反応させた。反応後、ＰＢＳ
で３回遠心分離（1200rpm、５分）して洗浄した後、さ
らにＰＢＳに懸濁し、フローサイトメーターＦＣＳ−１
( 日本分光社製) で解析を行った。

【０１０７】対照としてＫＭ−８７１無添加で以下上記
と同様の操作により解析を行った。その結果を図３２に
示す。ＫＭ−８７１の蛍光強度は、対照のそれと比較す
るとピークの位置が右側（蛍光強度強）に移動してお
り、ＫＭ−８７１はヒト悪性黒色腫培養細胞株ＳＫ−Ｍ
ＥＬ−２８およびＧ３６１細胞表面のＧＤ₃ に直接反応
していることが示された。

【０１０８】１０．抗ＧＤ₃ キメラ抗体ＫＭ−８７１の
in vitro 抗腫瘍効果：補体依存的細胞障害活性(Compl
ement Dependent Cytotoxicity : CDC) (a) 標的細胞の調製 １０％ＦＣＳ添加RPMI-1640 培地に浮遊させた標的細胞
ＳＫ−ＭＥＬ−２８およびＧ３６１をそれぞれ１×10⁷
個／mlに調整し、Ｎａ₂ ⁵¹ ＣｒＯ₄ を１００μＣｉ／１
×10⁷ 個になるように加え、３７℃で１時間反応後、培
地で３回洗浄した。次いで４℃、３０分間培地中に放置
し、自然解離させ、遠心分離（1200rpm、５分) 後、培
地を加えて４×10⁶ 個／mlに調整した。

【０１０９】(b) 補体の吸収 ３人の健常人の血清を混合し、ヒト抗体源として用い
た。

【０１１０】(c) ＣＤＣ活性の測定 ９６穴Ｕ字底プレートに抗ＧＤ₃ キメラ抗体ＫＭ−８７
１および抗ＧＤ₃ マウス抗体ＫＭ−６４１を各最終濃度
0.０５μg ／ml〜５０μg ／mlの範囲でそれぞれ加え、
各々に標的細胞２×10⁵ 個／穴を添加した。室温で１時
間反応させ、遠心分離（1200rpm 、５分) 後、上清を除
去し、(b) で得られたヒト血清（最終濃度１５％Ｖ／
Ｖ）１５０μl を添加し、３７℃、１時間反応させた。
遠心分離（1200rpm 、５分) 後、上清の⁵¹Ｃｒ量をγ−
カウンターにて測定した。自然解離 ⁵¹Ｃｒ量は、標的細
胞に抗体、補体溶液の代わりに培地のみを添加し、上記
と同様に上清の⁵¹Ｃｒ量を測定することにより求めた。
全解離⁵¹Ｃｒ量は、補体溶液の代わりに５規定水酸化ナ
トリウムを添加し、上記と同様に行い、上清の⁵¹Ｃｒ量
を測定することにより求めた。ＣＤＣ活性は、下式によ
り求めた。

【０１１１】

【数１】

【０１１２】その結果を図３３に示す。ＳＫ−ＭＥＬ−
２８およびＧ３６１に対してキメラ抗体ＫＭ−８７１は
マウス抗体ＫＭ−６４１に比べ強いＣＤＣ活性を示し
た。この結果は、キメラ抗体ＫＭ−８７１の方がマウス
抗体ＫＭ−６４１よりも腫瘍の治療等において有用であ
ることを示している。

【０１１３】１１．抗ＧＤ₃ キメラ抗体ＫＭ−８７１の
in vitro 抗腫瘍効果：抗体依存的細胞媒介障害活性
（Antibody Dependent Cell mediated Cytotoxicity: A
DCC) (a) 標的細胞の調製 10の(a) と同様にして標的細胞Ｇ３６１を調製した。

【０１１４】(b) エフェクター細胞の調製 ヒト静脈血５０mlを採血し、ヘパリンナトリウム（武田
薬品、1000単位／ml)0.５mlを加え穏やかに混ぜる。こ
れをPolymorphprep(Nycomed Pharma AS 社製)を用いて
遠心分離(1500 〜1800ｇ、１５分）してリンパ球層およ
び多型核白血球層を分離し、RPMI-1640 培地で３回遠心
分離 (1500〜1800ｇ、１５分）して洗浄後、１０％ＦＣ
Ｓ添加RPMI-1640 培地に懸濁 (５×10⁶ 細胞／ml) し、
リンパ球および多型核白血球をそれぞれエフェクター細
胞とした。

【０１１５】(c) ＡＤＣＣ活性の測定 ９６穴Ｕ字底プレートに抗ＧＤ₃ キメラ抗体ＫＭ−８７
１および抗ＧＤ₃ マウス抗体ＫＭ−６４１を５０μl
（各最終濃度１０μg ／ml）加え、各々に標的細胞２×
10⁵ 個／穴（１００μl ）およびエフェクター細胞５×
10⁵ 個／穴（５０μl ）を添加した（エフェクター細胞
と標的細胞の比は50:1および100:1 ) 。３７℃、４時間
反応させた後、遠心分離（1200rpm 、５分）し、上清の
⁵¹Ｃｒ量をγ−カウンターにて測定した。自然解離⁵¹Ｃ
ｒ量は、標的細胞に抗体、エフェクター細胞の代わりに
培地のみを添加し、上記と同様に上清の⁵¹Ｃｒ量を測定
することにより求めた。全解離⁵¹Ｃｒ量は、抗体、エフ
ェクター細胞の代わりに５規定水酸化ナトリウムを添加
し、上記と同様に行い、上清の⁵¹Ｃｒ量を測定すること
により求めた。ＡＤＣＣ活性は下式により求めた。

【０１１６】

【数２】

【０１１７】対照として、抗体の代わりに培地を添加
し、上記と同様に行い、対照の⁵¹Ｃｒ量を測定しＡＤＣ
Ｃ活性を求めた。その結果を図３４に示す。

【０１１８】エフェクター細胞としてリンパ球および多
型核白血球のいずれを用いても、Ｇ３６１に対するＡＤ
ＣＣ活性は、キメラ抗体ＫＭ−８７１の方がマウス抗体
ＫＭ−６４１に比べて強かった。この結果は、キメラ抗
体ＫＭ−８７１の方がマウス抗体ＫＭ−６４１よりも腫
瘍の治療等において有用であることを示している。

【０１１９】１２．抗ＧＤ₃ キメラ抗体ＫＭ−８７１の
in vitro 抗腫瘍効果：移植腫瘍に対する治療効果 ヒト悪性黒色腫培養細胞株Ｇ３６１の１×１０⁷ 個を１
群５〜７匹のBalb/c nu/nuマウス腹部皮内に移植した。
移植後、ＫＭ−８７１の100 μg を腫瘍移植翌日から４
回静脈内に投与した。また、対照群として、抗ＧＤ₃ マ
ウス抗体ＫＭ−６４１および抗シアリルLe^a モノクロー
ナル抗体ＡＭＣ−４６２(ECACC86050801) の100 μg を
それぞれ腫瘍移植当日より５回静脈内に投与した。移植
腫瘍に対する治療効果を、下記式により算出した腫瘍体
積により表した。

【０１２０】

【数３】

【０１２１】その結果を図３５に示した。図３５に示し
たように、ＡＭＣ−４６２を投与した対照群において
は、著しい腫瘍の増殖が認められたが、ＫＭ−８７１お
よびＫＭ−６４１投与群は有意に腫瘍の増殖が抑制さ
れ、さらに、ＫＭ−８７１投与群においては、腫瘍移植
後６５日後において腫瘍の生着が完全に阻害され、強い
腫瘍に対する治療効果が認められた。

【０１２２】参考例１ （１）抗原の調製 非還元末端にＮｅｕＡｃα２→８ＮｅｕＡｃα２→３Ｇ
ａｌ糖鎖の結合したガングリオシドGD₃ （ヤトロン社
製）５μg 、ジパルミトイルフォスファチジルコリン
（シグマ社製）0.５μmol 、コレステロール（ナカライ
テスク社製）0.５μmol 、ジパルミトイルフォスファチ
ジリック酸（シグマ社製）0.０５μmol およびリピッド
Ａ（フナコシ薬品社製）2.５μg をクロロホルム／メタ
ノール （２／１）溶液３０mlに溶解し、４５℃に加温
して溶媒除去し、均一な脂質薄膜を形成させた。さらに
真空ポンプで１時間吸引して完全に溶媒を除き、0.５ml
のＰＢＳを加え４５℃で攪拌し抗原溶液を得た。

【０１２３】（２）抗体産生細胞の調製 （１）で調製した抗原溶液0.５mlをマウスの尾静脈に１
週に１回、計７回投与し免疫した。さらにガングリオシ
ドGD₃ 陽性細胞 SK-MEL-28(ATCC HTB 72) (1×10⁷ 個）
を１週に１回計３回腹腔内投与し免疫した。最終投与後
の３日目にマウスよりそれぞれ脾細胞を調製して、細胞
融合に供した。

【０１２４】（３）マウス骨髄腫細胞の調製 ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を
正常培地で培養し、細胞融合時に２×10⁷ 以上の細胞を
得、細胞融合に親株として供した。

【０１２５】（４）ハイブリドーマの作製 （２）と（３）で得られた脾細胞と骨髄腫細胞とを１
０：１の割合で用いて前述した方法で融合させ、ＨＡＴ
培地で３７℃、１４日間ＣＯ₂ ５％下で培養した。融合
細胞を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに培養した後、ガ
ングリオシドGD₃に対する抗体価を測定して、活性なウ
ェルを選び、さらに正常培地に変え、２回クローニング
を繰り返して、酵素免疫測定法または、免疫組織学的判
定法（ABC法) により、ガングリオシドGD₃ に特異的に
反応するハイブリドーマを選択した。すなわち、ガング
リオシドGM₃ ｛犬の赤血球よりノーレス (Nores) 等の
方法〔ジャーナル・イミュノロジー(J.Immunol.)139 ,
3171(1987)〕に従って精製したもの｝およびガングリオ
シドGD₃ （ヤトロン社製）それぞれ２ngを５ngのフォス
ファチジルコリン（シグマ社製）と2.５ngのコレステロ
ール（シグマ社製）とを含む２mlのエタノール溶液に溶
解した。このうち２０μl を９６穴マイクロタイタープ
レート（フローラボラトリーズ社製) の各ウェルにそれ
ぞれ分注し、風乾後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液でブロッ
キングを行った。ハイブリドーマの培養上清をガングリ
オシドGD₃ を吸着させたプレートとガングリオシドGM₃
を吸着させたプレートに各５０μl ずつ分注し、１８時
間、４℃で反応させた。

【０１２６】以下公知の方法〔キャンサー・リサーチ
（CancerRes.) 46 ,4438(1986)〕に従い反応を行い、ガ
ングリオシドGM₃ に反応せず、ガングリオシドGD₃ に特
異的に反応するマウスモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ株を選択した。該マウスモノクローナル抗
体をマウスモノクローナル抗体KM-641とし、該抗体を生
産するハイブリドーマをハイブリドーマKM-641とした。
ハイブリドーマKM-641は平成２年９月２７日付で工業技
術院微生物工業技術研究所にFERM BP-3116として寄託し
てある。

【発明の効果】本発明により、マウス抗体可変領域のア
ミノ酸配列が全く変化しないヒト型キメラ抗体の簡便な
製造方法およびガングリオシドGD₃ に対するヒト型キメ
ラ抗体が提供される。

【０１２７】

【配列表】

【０１２８】配列番号：1 配列の長さ： 818 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： Genomic DNA 起源 ハイブリドーマ： KM50 配列の特徴 特徴を表す記号： TATA signal 存在位置： 261..267 AAAGTCAGAC AACTTTGTAG AGTAGGTTCT ATCAATCCTA CTGCAATCCA 50 ACATCACTGA GGACAAATGT TTATACTGAG GAACCTGGTC TTGTGTGATA 100 CGTACTTTCT GTGGGAAGCA GATACGCACT CTCATGTGGC TCCTGAATTT 150 CCCATCACAG AATGATACAT CTTGAGTCCT AAAATTTAAG TACACCATCA 200 GTGTCAGCAC CTGGTGAGGA AATGCAAATC TCTCCTGGAT CCACCCAACC 250 TTGGGTTGAA AAGCCAAAGC TGGGCCTGGG TACTCACTGG TGTGCAGCC 299 ATG GAC AGG CTT ACT TCC TCA TTC CTA CTG CTG ATG GTC 338 Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Met Val -15 -10 CCT GCA T GTGAGTACCA AAGCTTCCTA AGTGATGAAC 375 Pro Ala -5 TGTTCTATCC TCACCTGTTC AAACCTGACC TCCTCCCCTT TGATTTCTCC 425 ACAG AT GTC CTG TCT CAG GTT ACT CTG AAA GAA TCT GGC 464 Tyr Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly 1 5 CCT GGG ATA TTG CAG CCC TCC CAG ACC CTC AGT CTG ACT 503 Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr 10 15 20 TGC TCT TTC TCT GGG TTT TCA CTG AGC ACT TAT GGT ATG 542 Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Met 25 30 TGT GTG GGC TGG ATT CGT CAG TCT TCA GGG AAG GGT CTG 581 Cys Val Gly Trp Ile Arg Gln Ser Ser Gly Lys Gly Leu 35 40 45 GAG TGG CTG GCA AAC GTT TGG TGG AGT GAT GCT AAG TAC 620 Glu Trp Leu Ala Asn Val Trp Trp Ser Asp Ala Lys Tyr 50 55 60 TAC AAT CCA TCT CTG AAA AAC CGG CTC ACA ATC TCC AAG 659 Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys 65 70 GAC ACC TCC AAC AAC CAA GCA TTC CTC AAG ATC ACC AAT 698 Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala Phe Leu Lys Ile Thr Asn 75 80 85 ATG GAC ACT GCA GAT ACT GCC ATA TAC TAC TGT GCT GGG 737 Met Asp Thr Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Gly 90 95 AGA GGG GCT ACG GAG GGT ATA GTG AGC TTT GAT TAC TGG 776 Arg Gly Ala Thr Glu Gly Ile Val Ser Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 GGC CAC GGA GTC ATG GTC ACA GTC TCC TCA GGTAAG 812 Gly His Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 105 110

【０１２９】配列番号： ２ 配列の長さ： 46 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： 他の核酸 合成DNA 配列 AGCTGAATTC GGGCCCGATA TCAAGCTTGT CGACTCTAGA GGTACC 46

【０１３０】配列番号： ３ 配列の長さ： 29 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： 他の核酸 合成DNA 配列 GATGAAGACA GATATCGCAG CCACAGTTC 29

【０１３１】配列番号： ４ 配列の長さ： 403 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA 起源 ハイブリドーマ： KM-641 配列の特徴 特徴を表す記号： sig peptide 存在位置：14..43 特徴を決定した方法： S 配列 AATTCGGCAC GAG CTT GTC CTT GTT TTC AAA GGT GTT CAG TGT GAA GTG 49 Leu Val Leu Val Phe Lys Gly Val Gln Cys Glu Val -10 -5 1 ACG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTT GTG AAA CCT GGA GGG TCC CTG Thr Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Phe Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu 97 5 10 15 AAA GTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC GCT TTC AGT CAT TAT GCC ATG 145 Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser His Tyr Ala Met 20 25 30 TCT TGG GTT CGC CAG ACT CCG GCG AAG AGG CTG GAA TGG GTC GCA TAT 193 Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Ala Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr 35 40 45 50 ATT AGT AGT GGT GGT AGT GGC ACC TAC TAT TCA GAC AGT GTA AAG GGC 241 Ile Ser Ser Gly Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly 55 60 65 CGA TTC ACC ATT TCC AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAA 289 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 70 75 80 ATG CGC AGT CTG AGG TCT GAG GAC TCG GCC ATG TAT TTC TGT ACA AGA 337 Met Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Thr Arg 85 90 95 GTT AAA CTG GGA ACC TAC TAC TTT GAC TCC TGG GGC CAA GGC ACC ACT 385 Val Lys Leu Gly Thr Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 CTC ACT GTC TCC TCA GCT 403 Leu Thr Val Ser Ser Ala 115 120

【０１３２】配列番号： ５ 配列の長さ： 408 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA 起源 ハイブリドーマ： KM-641 配列の特徴 特徴を表す記号： sig peptide 存在位置：25..84 特徴を決定した方法： S 配列 AATTCGGCAC GAGTCAGCCT GGAC ATG ATG TCC TCT GCT CAG TTC CTT GGT 51 Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly -20 -15 CTC CTG TTG CTC TGT TTT CAA GGT ACC AGA TGT GAT ATC CAG ATG ACA 99 Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr -10 -5 1 5 CAG ACT GCA TCC TCC CTG CCT GCC TCT CTG GGA GAC AGA GTC ACC ATC 147 Gln Thr Ala Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile 10 15 20 AGT TGC AGT GCA AGT CAG GAC ATT AGT AAT TAT TTA AAC TGG TAT CAA 195 Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln 25 30 35 CAG AAA CCA GAT GGA ACT GTT AAA CTC CTG ATC TTT TAC TCA TCA AAT 243 Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Phe Tyr Ser Ser Asn 40 45 50 TTA CAC TCG GGA GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGC GGT GGG TCC GGG ACA 291 Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr 55 60 65 GAT TAT TCT CTC ACC ATC AGC AAC CTG GAG CCT GAA GAT ATT GCC ACT 339 Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr 70 75 80 85 TAC TTT TGT CAT CAG TAT AGT AAG CTT CCG TGG ACG TTC GGT GGA GGC 387 Tyr Phe Cys His Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly 90 95 100 ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG 408 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 105

【０１３３】配列番号： ６ 配列の長さ： 35 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： 他の核酸 合成DNA 配列 AATTCACC ATG GAG TTT GGG CTC AGC TGG CTT TTT 35 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe

【０１３４】配列番号： ７ 配列の長さ： 43 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： 他の核酸 合成DNA 配列 CAA GGT ACC ACG TTA ACT GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC C 43 Gln Gln Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

【０１３５】配列番号： ８ 配列の長さ： 61 配列の型： 核酸 鎖の数： 二本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の種類： 他の核酸 合成DNA 配列 AG CTT CCA TGG ACG TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGA ACT 50 Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr GTG GCT GCA CC Val Ala Ala 61

Ｖ

【図面の簡単な説明】

【図１】は9.3kb のKM50細胞の染色体DNA のXba Ｉ断片
の制限酵素切断地図を示した図である。

【図２】は プラスミドpKMB11の造成工程を示した図で
ある。

【図３】はプラスミドpKMD6 の造成工程を示した図であ
る。

【図４】はプラスミドpEPKMA1 の造成工程を示した図で
ある。

【図５】はプラスミドpEPKMB1 の造成工程を示した図で
ある。

【図６】はプラスミドpAGE501 の造成工程を示した図で
ある。

【図７】はプラスミドpAGE109 の造成工程を示した図で
ある。

【図８】はプラスミドpAGE502 の造成工程を示した図で
ある。

【図９】はプラスミドpAGE503 の造成工程を示した図で
ある。

【図１０】はプラスミドpSEd1 の造成工程を示した図で
ある。

【図１１】はプラスミドpSE1D2の造成工程を示した図で
ある。

【図１２】はプラスミドpIG1SE1d2 の造成工程を示した
図である。

【図１３】はプラスミドpIG1SE1d3 の造成工程を示した
図である。

【図１４】はプラスミドpIG1SE1d4 の造成工程を示した
図である。

【図１５】はプラスミドpPMOL2の造成工程を示した図で
ある。

【図１６】はプラスミドpPMOL3の造成工程を示した図で
ある。

【図１７】はプラスミドpchCKA7 の造成工程を示した図
である。

【図１８】はプラスミドpchCKB1 の造成工程を示した図
である。

【図１９】はプラスミドpckCKC1 の造成工程を示した図
である。

【図２０】はプラスミドpChiIgHB2 の造成工程を示した
図である。

【図２１】はプラスミドpChiIgLA1 の造成工程を示した
図である。

【図２２】はプラスミドpKM641HA3およびpKM641LA2 を
示した図である。

【図２３】はプラスミドpChi641HA1を示した図である。

【図２４】はプラスミドpKM641HE1 の造成工程を示した
図である。

【図２５】はプラスミドpKM641HF1 の造成工程を示した
図である。

【図２６】はプラスミドpChi641HA1の造成工程を示した
図である。

【図２７】はプラスミドpChi641HAM1 の造成工程を示し
た図である。

【図２８】はプラスミドpChi641LG11 を示した図であ
る。

【図２９】はプラスミドpChi641LG11 の造成工程を示し
た図である。

【図３０】はプラスミドpChi641LGM11の造成工程を示し
た図である。

【図３１】は精製した抗GD₃ キメラ抗体KM-871（約５μ
g/レーン) のSDS-PAGE（4-15％グラジエントゲル使用）
のパターンを示した図である。左より、分子量マーカ
ー、ヒトIgG スタンダード、マウス抗GD₃ 抗体KM-641、
抗GD₃ キメラ抗体KM-871の泳動パターンをそれぞれ示し
た。Ａは還元条件で電気泳動を行った図であり、Ｂは非
還元条件下で電気泳動を行った図である。

【図３２】は蛍光抗体法によるガングリオシドＧＤ₃ 陽
性細胞Ｇ３６１およびＳＫ−ＭＥＬ−２８に対するＫＭ
−８７１の反応性を示した図である。縦軸は細胞数を、
横軸は蛍光強度をそれぞれ示す。点線は抗体無添加での
反応性を、実線はＫＭ−８７１添加での反応性をそれぞ
れ示す。

【図３３】はガングリオシドＧＤ₃ 陽性細胞Ｇ３６１お
よびＳＫ−ＭＥＬ−２８に対するＫＭ−８７１のＣＤＣ
活性を示した図である。縦軸はＣＤＣ活性を、横軸は添
加した抗体濃度をそれぞれ示す。黒のカラムは、ＫＭ−
８７１のＣＤＣ活性を、斜線のカラムはＫＭ−６４１の
ＣＤＣ活性をそれぞれ示す。

【図３４】はガングリオシドＧＤ₃ 陽性細胞Ｇ３６１に
対するＡＤＣＣ活性を示した図である。横軸はＡＤＣＣ
活性を、縦軸はエフェクター細胞およびエフェクター細
胞と標的細胞の数の比をそれぞれ示す。黒のカラムはＫ
Ｍ−８７１のＡＤＣＣ活性を、斜線のカラムはＫＭ−６
４１のＡＤＣＣ活性を、灰色のカラムは抗体無添加のＡ
ＤＣＣ活性をそれぞれ示す。

【図３５】は移植腫瘍に対する抗腫瘍効果を示した図で
ある。縦軸は腫瘍体積、横軸は腫瘍移植後の日数をそれ
ぞれ示す。黒丸はＡＭＣ−４６２投与群、白四角はＫＭ
−６４１投与群、白三角はＫＭ−８７１投与群をそれぞ
れ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 35/78 ＡＤＵ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭61−47500（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−36796（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−85930（ＪＰ，Ａ) Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ, 1991年 １月，Ｖｏｌ．51，Ｎｏ．１, ｐ．144−149 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 21/08 C07K 16/00 - 19/00 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ ＰｕｂＭｅｄ

Claims (20)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）ヒト抗体重鎖定常領域Cγ1をコー
   ドするcDNAを動物細胞用発現ベクターに挿入することに
   よりカセットベクターを構築し、該カセットベクターに
   ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域をコードするcDNA
   を挿入するためのクローニングサイトを設け、 （２）ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域をコードす
   るcDNAを制限酵素を用いて切り出し、 （３）配列番号７の３１〜４３番目の塩基配列で表され
   たヒト抗体重鎖定常領域の５’末端側の塩基配列と、ヒ
   ト以外の動物の抗体の重鎖可変領域の３’末端側の塩基
   配列とからなり、制限酵素部位を両端に有する合成DNA
   と、上記（２）で得られたヒト以外の動物の抗体の重鎖
   可変領域をコードするcDNAとを該カセットベクターに挿
   入することにより、該合成DNAを介してヒト抗体重鎖定
   常領域Cγ1をコードするcDNAとヒト以外の動物の抗体重
   鎖可変領域をコードするcDNAとが結合されたヒト型キメ
   ラ抗体重鎖発現ベクターを構築し、 （４）ヒト抗体軽鎖定常領域CκをコードするcDNAを動
   物細胞用発現ベクターに挿入することによりカセットベ
   クターを構築し、該カセットベクターにヒト以外の動物
   の抗体の軽鎖可変領域をコードするcDNAを挿入するため
   のクローニングサイトを設け、 （５）ヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域をコードす
   るcDNAを制限酵素を用いて切り出し、 （６）配列番号８の４５〜６１番目の塩基配列で表され
   たヒト抗体軽鎖定常領域の５’末端側の塩基配列と、ヒ
   ト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域の３’末端側の塩基
   配列とからなり、制限酵素部位を両端に有する合成DNA
   と、上記（５）で得られたヒト以外の動物の抗体の軽鎖
   可変領域をコードするcDNAとを該カセットベクターに挿
   入することにより、該合成DNAを介してヒト抗体軽鎖定
   常領域CκをコードするcDNAとヒト以外の動物の抗体軽
   鎖可変領域をコードするcDNAとが結合されたヒト型キメ
   ラ抗体軽鎖発現ベクターを構築し、 （７）上記（３）で得られたヒト型キメラ抗体重鎖発現
   ベクターおよび上記（６）で得られたヒト型キメラ抗体
   軽鎖発現ベクターを動物培養細胞に導入し、 （８）上記（７）で得られた動物培養細胞を培地中に培
   養し、培養物中にヒト型キメラ抗体を生成蓄積させ、該
   培養物からヒト型キメラ抗体を採取することを特徴とす
   るヒト型キメラ抗体の製造法。
2. 【請求項２】 ヒト以外の動物がマウスである、請求項
   １記載の製造法。
3. 【請求項３】 ヒト以外の動物の抗体が、ガングリオシ
   ドに対する抗体である、請求項１記載の製造法。
4. 【請求項４】 ヒト以外の動物の抗体が、ガングリオシ
   ドGD₃に対する抗体である、請求項１記載の製造法。
5. 【請求項５】 ヒト以外の動物の抗体が、FERM BP-3116
   が生産するモノクローナル抗体KM-641である、請求項１
   記載の製造法。
6. 【請求項６】 ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域を
   コードするcDNAが、配列番号４記載のアミノ酸配列の１
   〜１２０番目のアミノ酸配列をコードするDNAであり、
   軽鎖可変領域をコードするDNAが、配列番号５記載のア
   ミノ酸配列の１〜１０８番目のアミノ酸配列をコードす
   るcDNAである請求項１記載の製造法。
7. 【請求項７】 ヒト型キメラ抗体が、ガングリオシドGD
   ₃に反応する抗体である、請求項１記載の製造法。
8. 【請求項８】 ヒト型キメラ抗体が、FERM BP-3512が生
   産するヒト型キメラ抗体KM-871である、請求項１記載の
   製造法。
9. 【請求項９】 配列番号７または８記載の塩基配列から
   なるDNA。
10. 【請求項１０】 請求項１記載の製造法により得られる
    ヒト型キメラ抗体。
11. 【請求項１１】 配列番号４記載の１〜１２０番目のア
    ミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号５記載の
    １〜１０８番目のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含
    むガングリオシドGD3に反応するヒト型キメラ抗体。
12. 【請求項１２】 FERM BP-3116が生産するモノクローナ
    ル抗体KM-641の可変領域のアミノ酸配列とヒト抗体定常
    領域とを含むガングリオシドGD3に反応するヒト型キメ
    ラ抗体。
13. 【請求項１３】 FERM BP-3512が生産する、ガングリオ
    シドGD3に反応するヒト型キメラ抗体KM-871。
14. 【請求項１４】 請求項１１〜１３のいずれか１項に記
    載のヒト型キメラ抗体の可変領域をコードするDNA。
15. 【請求項１５】 配列番号４の４４〜４０３番目の塩基
    配列を有するDNA。
16. 【請求項１６】 請求項１５記載のDNAを含有する組換
    えベクター。
17. 【請求項１７】 配列番号５の８５〜４０８番目の塩基
    配列を有するDNA。
18. 【請求項１８】 請求項１７記載のDNAを含有する組換
    えベクター。
19. 【請求項１９】 請求項１６および１８記載の組換えベ
    クターにより得られた形質転換細胞。
20. 【請求項２０】 形質転換細胞がFERM BP-3512である、
    請求項１９記載の細胞。