CN112189018A

CN112189018A - 结合疱疹病毒抗原的嵌合抗原受体和car-t细胞

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Publication number: CN112189018A
Application number: CN201980027068.XA
Authority: CN
Inventors: 蕾娜塔·斯特皮克; 康斯坦兹·斯拉比克; 莱因哈德·蔡德勒; 沃尔夫冈·哈默施密特
Original assignee: Hanover School Of Medicine; Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Hanover School Of Medicine; Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Priority date: 2018-04-20
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2021-01-05
Also published as: US20210230245A1; WO2019201995A1; EP3781590A1; SG11202009626QA; US12054529B2

Abstract

本发明涉及一种分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其中所述CAR包含细胞外抗原结合结构域，所述结构域包含结合到由疱疹病毒编码的蛋白质或包含所述蛋白质的蛋白质复合体(疱疹病毒抗原)的抗体或抗体片段，其中所述疱疹病毒抗原存在于被所述疱疹病毒潜伏感染的人类细胞的表面上并支持病毒复制的裂解阶段。本发明还涉及编码本发明的CAR的核酸分子，表达本发明的CAR的遗传修饰的免疫细胞、优选为T细胞，以及所述细胞在治疗与人类疱疹病毒相关的医学障碍例如疱疹病毒相关癌症、慢性活动性疱疹病毒感染或原发性疱疹病毒感染中的用途。在优选实施方案中，所述疱疹病毒是Epstein‑Barr病毒(EBV)，并且所述CAR的优选疱疹病毒抗原靶点是EBV糖蛋白350/220(gp350/gp220)。

Description

结合疱疹病毒抗原的嵌合抗原受体和CAR-T细胞

技术领域

本发明涉及一种分离的嵌合抗原受体(CAR)多肽，其中所述CAR包含细胞外抗原结合结构域，所述结构域包含结合到由疱疹病毒编码的蛋白质或包含所述蛋白质的蛋白质复合体(疱疹病毒抗原)的抗体或抗体片段，其中所述疱疹病毒抗原存在于被所述疱疹病毒潜伏感染的人类细胞的表面上并支持病毒复制的裂解阶段。本发明还涉及编码本发明的CAR的核酸分子，表达本发明的CAR的遗传修饰的免疫细胞、优选为T细胞，以及所述细胞在治疗与人类疱疹病毒相关的医学障碍例如疱疹病毒相关癌症、慢性活动性疱疹病毒感染或原发性疱疹病毒感染中的用途。在优选实施方案中，所述疱疹病毒是Epstein-Barr病毒(EBV)，并且所述CAR的优选疱疹病毒抗原靶点是EBV糖蛋白350/220(gp350/gp220)。

背景技术

Epstein-Barr病毒(EBV)是一种人类疱疹病毒，与免疫受损宿主中的淋巴增殖性疾病(LPD)相关，并与多种不同类型的人类B-细胞淋巴瘤相关，例如地方性伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)以及一部分弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

EBV可以以潜伏或裂解形式感染细胞。在潜伏EBV感染期间，所述病毒作为核游离体存留并且每个细胞周期复制一次。在具有III型潜伏期的EBV感染的细胞中，9种潜伏期病毒蛋白的表达足以在体内转化原代B细胞。EBV感染的肿瘤主要由潜伏形式的EBV感染的细胞组成，因此已广泛探索了将潜伏期病毒蛋白作为抗原来激活并扩增过继性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，用作治疗PTLD或EBV淋巴瘤的细胞疗法(Papadopoulou,Gerdemann等，2014)。

当前用于产生过继性T细胞的方法的限制包括用于T细胞操作的标准操作程序的时间长和复杂性。这些方法依赖于记忆T细胞的细胞膜上高亲和性T细胞受体(TCR)的存在，其在信号传导后诱导T细胞扩增、细胞因子生产(特别是通过CD4⁺T辅助细胞)和效应子功能，以杀死EBV潜伏感染的细胞(特别是通过CD8⁺T细胞毒性细胞)。从脐带血或从EBV血清反应阴性的供体获得的T细胞缺少针对EBV的高亲和性TCR和记忆T细胞的表达，并且在体外用EBV抗原(以蛋白质或肽的形式)扩增的效率低。临床级CTL的使用仅在选定的中心中可行，并且挑战是以及时的方式为每位需要的患者生产T细胞。因此，必须使用新的方法。

CTL可以被遗传工程改造并重新定向，以利用特定CAR识别并杀死细胞(Dotti,Gottschalk等，2014)。CAR由跨膜融合蛋白构成，其在融合到间隔物和触发T细胞刺激的细胞内结构域的胞外结构域中含有可变抗原结合结构域(典型的是CD28/CD3ζ或“CD28.ζ”，4-1BB/CD3ζ或“4-1BB.ζ”)。

融合到CAR的单链可变区片段(scFv)识别表达在靶细胞表面上的细胞谱系抗原或受体。scFv以高亲和性结合到细胞表面，为有效的CAR细胞毒性功能所需。临床上最成功的CAR-T细胞通过CD19的识别靶向B细胞恶性肿瘤。

以前已公开了针对疱疹病毒蛋白的CAR(WO2015136001)，包括针对在潜伏期中表达的疱疹病毒蛋白(WO2016201124，Tang等，2014)，例如LMP-1/2。没有公开存在于被疱疹病毒潜伏感染的细胞表面上并支持病毒复制的裂解阶段的疱疹病毒抗原作为CAR的靶点。

WO2017172981公开了用于治疗癌症的各种不同的CAR构建物和修饰的细胞，所述修饰的细胞包含CAR和K13-vFLIP信号传导蛋白，并且所述CAR包含位于CAR的C-末端处的基于酪氨酸的免疫受体活化基序。没有公开靶向疱疹病毒抗原的CAR构建物的数据或治疗效果。

Von Laer等人(Handbook of Experimental Pharmacology,vol.189,2009,265-297)综述了抗病毒基因疗法，并讨论了过继性T细胞疗法在治疗EBV相关淋巴瘤和慢性活动性ENV感染中的用途。提到了受体修饰的重新靶向的T细胞的使用，例如利用针对HIV抗原的人工嵌合T细胞受体。没有提到使用嵌合抗原受体技术靶向疱疹病毒抗原。

尽管正在开发通过免疫疗法靶向疱疹病毒抗原的大量潜在可选方案，但对提供致力于解决与人类疱疹病毒相关的医学障碍的有效手段，仍存在显著的需求。

发明内容

根据现有技术，本发明所基于的技术问题是提供用于治疗和/或预防与人类疱疹病毒相关的疾病的可选或改进的方式。

该技术问题通过独立权利要求的特征得以解决。本发明的优选实施方案由从属权利要求提供。

因此，本发明涉及一种嵌合抗原受体多肽(CAR)，其包含：

i.细胞外抗原结合结构域，所述结构域包含结合到由疱疹病毒编码的蛋白质或包含所述蛋白质的蛋白质复合体(疱疹病毒抗原)的抗体或抗体片段，其中所述疱疹病毒抗原存在于被所述疱疹病毒潜伏感染的人类细胞的表面上并支持病毒复制的裂解阶段，

ii.跨膜结构域，和

iii.细胞内信号传导结构域。

因此，本发明本质上被表征为一种靶向疱疹病毒抗原亚类之一的CAR，所述疱疹病毒抗原亚类存在于被潜伏感染的细胞的表面上，使得所述抗原可用于CAR靶向，并且还参与和/或支持病毒复制的裂解阶段。这个独特的亚类代表了以前在本领域中未提出的一组新的疱疹抗原靶点，使得将免疫细胞的细胞裂解活性以靶向方式导向疱疹病毒感染的细胞的可选方法成为可能。

尽管以前已将潜伏期疱疹蛋白鉴定为免疫疗法的靶点(Papadopoulou,Gerdemann等，2014；Tang等，2014)，但以前尚未提出在潜伏期间存在于被感染细胞的细胞表面上但参与病毒复制的裂解阶段的蛋白。这个靶抗原亚类使得能够在潜伏感染期间靶向疱疹感染的细胞，但代表了似乎以足够数量存在于被潜伏感染的细胞的细胞表面上的一类新的靶抗原，从而令人吃惊地能够在用CAR T或其他相应修饰的免疫细胞靶向后表现出有效的细胞裂解活性。在本领域中没有提出与裂解复制相关的疱疹病毒蛋白也以足够的量存在于被潜伏感染的细胞的细胞表面上，以便能够实现本文中所描述的CAR修饰的免疫细胞的细胞毒性。

在一个实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述疱疹病毒抗原参与所述病毒与人类靶细胞上的受体的结合(疱疹病毒受体结合蛋白)。这种功能特征为本发明的靶抗原亚类提出了另一个优选定义。

“疱疹病毒受体结合蛋白”是参与病毒粒子与待感染细胞表面上的受体之间的直接识别和结合的蛋白。通常，疱疹病毒感染在病毒粒子与在细胞表面上具有特定类型的受体分子的细胞接触时开始。在疱疹病毒受体结合蛋白(例如包膜糖蛋白)结合到细胞膜受体后，所述病毒粒子被内化和拆解，允许病毒DNA迁移到细胞核。参与宿主细胞的这种受体结合和感染的疱疹病毒蛋白是本发明的CAR的优选靶点。

这种策略使得能够进行在潜伏期间存在于被感染细胞的表面上但也参与细胞表面受体结合的疱疹病毒蛋白亚类的靶向。在本领域中没有提出与裂解复制相关并且在感染期间也参与宿主细胞受体结合的疱疹病毒蛋白，也以足够的量存在于被潜伏感染的细胞的细胞表面上，以便能够实现本文中所描述的CAR修饰的免疫细胞的细胞毒性。

已知多种表现出上文定义的功能特点的疱疹病毒蛋白。因此，优选的靶点是表1或表2中描述的靶点。

表1：包含在被感染细胞的细胞表面和膜和/或病毒粒子中的人类疱疹病毒蛋白。未包括HSV-2和HHV-7，因为它们的命名法分别与HSV-1和HHV-6的命名法相同(从《人类疱疹病毒：生物学、疗法和免疫预防》(Human Herpesviruses:Biology,Therapy,andImmunoprophylaxis)，2007修改)。

存在于被所述疱疹病毒潜伏感染的人类细胞的表面上并支持病毒复制的裂解阶段的其他疱疹病毒抗原：

-来自于EBV gB、gH、gL或BILF1，

-来自于HCMV gB(UL55)、UL73、UL74(gO)、UL75(gH)、UL115(gL)、US27、UL100、UL132、RL10；

-此外还包括US20、UL148D、UL78、UL119、UL16、UL40、US6、UL136、US14、RL12、US28、RL11、US9、UL33、UL144、UL141(Weekes等，2014)。

最近，已经建立了能够鉴定细胞表面呈递的疱疹病毒抗原的方法(Weekes等，2014)，并且以前已经调查了这些蛋白质在潜伏和/或裂解性病毒复制周期中的作用，从而使技术人员能够鉴定本文中描述的病毒靶抗原亚类。

技术人员能够例如通过确定疱疹病毒抗原在裂解阶段中的表达，来确定所述抗原是否参与和/或支持病毒复制的裂解阶段。

在优选实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述疱疹病毒抗原是EBV抗原。在优选实施方案中，本发明聚焦于靶向EBV抗原和治疗EBV相关医学病症。在优选实施方案中，所述疱疹病毒抗原是EBV糖蛋白350/220(gp350/gp220)。

在优选实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述EBV抗原存在于EBV感染的细胞的表面上。

在优选实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述EBV抗原存在于EBV感染的癌细胞、EBV感染的B细胞或EBV感染的上皮细胞的表面上。

使用本文中描述的方法和本领域中已建立的引用方法，技术人员可以不费力地鉴定待靶向的病毒抗原(除了本文中描述的那些特定抗原之外)。

存在于EBV感染的细胞的表面上并可能存在于被潜伏感染的恶性肿瘤细胞上的抗原亚类包括：gp350/gp220，LMP1，LMP2，BILF1，BALF4(gB)，BKRF2(gL)，BXLF2(gH)，BBRF3(gM)，BLRF1(gN)。其中具体而言，gp350/gp220、BILF1、BALF4(gB)、BKRF2(gL)、BXLF2(gH)、BBRF3(gM)、BLRF1(gN)是优选的，并被认为支持病毒复制的裂解阶段。

在优选实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述EBV抗原是EBV病毒粒子包膜蛋白或EBV包膜复合体的蛋白质。

在优选实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述EBV抗原是EBV gp350/gp220。换句话说，优选地，本发明的特征在于所述包含抗体或抗体片段的细胞外抗原结合结构域结合EBV gp350/gp220。

因此，在优选实施方案中，本发明涉及gp350/gp220-CAR。

因此，其他优选的蛋白质靶点是gB、gL或gH。另外，已知其他EBV糖蛋白参与复制的裂解阶段，在EBV病毒粒子包膜蛋白和/或EBV包膜复合体的蛋白质中(表2，Hutt-Fletcher,2015)。

表2:EBV糖蛋白的概述(从Hutt-Fletcher,2015修改)

基因	蛋白质	类型	表达	功能
					BLLF1	gp350/220	单次跨膜1型	裂解晚期/结构性	附着
BALF4	gB	单次跨膜1型	裂解晚期/结构性	融合
					BXLF2	gH	单次跨膜1型	裂解晚期/结构性	调控和融合的触发
BKRF2	gL	可溶性，与gH结合	裂解晚期/结构性	调控和融合的触发
					BZLF2	gp42	单次跨膜2型/可溶性	裂解晚期/结构性	融合的触发/免疫逃避
BBRF3	gM	多次跨膜	裂解晚期/结构性	装配和释放
					BLRF2	gN	单次跨膜1型	裂解晚期/结构性	装配和释放
BMRF2	BMRF2	多次跨膜	裂解晚期/结构性	上皮细胞附着和扩散
					BDLF2	BDLF2	单次跨膜2型	裂解晚期/结构性	上皮扩散？
BDLF3	BDLF3	单次跨膜1型	裂解晚期/结构性	未知
					BILF2	BILF2	单次跨膜1型	裂解晚期/结构性	未知
BILF1	BILF1	多次跨膜	立即早期/早期	G蛋白偶联受体/免疫逃避
					BARF1	BARF1	分泌型	潜伏期和裂解早期	CSF1受体/免疫逃避

因此，本发明的CAR多肽包含细胞外抗原结合结构域，所述结构域包含结合到由疱疹病毒编码的蛋白质或包含所述蛋白质的蛋白质复合体(疱疹病毒抗原)的抗体或抗体片段，其中所述疱疹病毒抗原存在于被所述疱疹病毒潜伏感染的人类细胞的表面上并支持病毒复制的裂解阶段。除了由Weekes等(2014)鉴定的之外，表1和表2的疱疹病毒蛋白抗原也可用作CAR结合的靶。基于一种特定疱疹病毒的疱疹病毒抗原例如表1中的抗原的定义的命名法，也包括使用来自于其他已知疱疹病毒的此类相应的同源靶点。在优选实施方案中，术语“支持病毒复制的裂解阶段”对应于在病毒复制的裂解阶段期间表达(例如与潜伏阶段相比在裂解阶段期间表达提高)和/或执行病毒复制的裂解阶段必不可少的或主要与病毒复制的裂解阶段相关的功能中的一种或多种。

在优选实施方案中，所述疱疹病毒抗原是EBV抗原gp350/gp220。

因此，优选实施方案涉及针对EBV裂解抗原靶、优选为糖蛋白350(gp350)的CAR和CAR T细胞，所述糖蛋白为EBV病毒与B细胞的结合(通过结合人类细胞表面上的CD21)所需。所述gp350蛋白也以较短的形式(gp220)存在。所述gp350/gp220蛋白在EBV裂解再激活期间在被感染的细胞中丰富表达，但它在EBV潜伏期中的作用以前未被描述。因此，gp350/gp220(作为在潜伏期间在被感染细胞的表面上表达的裂解蛋白)的靶向代表了使用定向免疫疗法靶向疱疹病毒感染的全新的方法。令人吃惊的是，尽管可以发现细胞毒性CD4⁺T细胞(Adhikary,Behrends等，2006)，但在人类中很少发现针对gp350/gp220的CD8⁺T细胞CTL应答。

因此，本发明待解决的临床问题是针对疱疹病毒例如EBV和EBV相关恶性肿瘤保护患者(例如免疫受损患者)。通过将高亲和性单链抗体序列插入到CAR中以靶向细胞表面上的疱疹病毒抗原(优选为EBV抗原)，所述技术问题通过针对疱疹病毒(优选为EBV)感染的细胞的免疫细胞疗法、优选为T细胞疗法来解决。表达这些CAR的T细胞或其他免疫细胞将被感染细胞激活，并引起强力且持久的抗病毒应答。

到目前为止，使用EBV离体扩增的过继性T细胞依赖通过HLA呈递到T细胞上的TCR的病毒抗原来激活细胞应答。使用这种方法的问题是：1.EBV感染异常调节T细胞活化并与T细胞枯竭相关；2.需要HLA/TCR匹配。

与在体外扩增EBV反应性T细胞的旧方法相比，本发明的靶识别不由HLA介导。因此，靶向EBV的CAR-T细胞或其他CAR工程化免疫细胞为用于具有EBV感染、再激活、感染性单核细胞增多症、PTLD或发生EBV相关恶性肿瘤的高风险的免疫受损患者的通用“现成的(off-the-shelf)”细胞疗法开辟了前景。

在其他优选实施方案中，本发明的CAR工程化免疫细胞与结合HLA的抗原扩增的T细胞相比可以在更短的时间段内生产。在某些实施方案中，CAR工程化免疫细胞可以被编辑成缺失TCR，以避免GVHD反应。在某些实施方案中，CAR工程化免疫细胞可以被编辑成缺失HLA，以避免同种异体排斥并变成“通用CAR-T细胞”。因此，本发明的方法的优点涉及针对病毒抗原的特异性提高，不需要HLA匹配和不需要记忆T细胞，因为本发明的细胞在某些实施方案中可以使用来自于血清反应阴性的供体或来自于脐带血的幼稚T细胞来生产。

因此，本发明的另一方面涉及一种遗传修饰的免疫细胞，其包含编码和/或表达本发明的CAR的核酸分子。因此，下文提供的示例性序列可能存在于免疫细胞中，并代表了本发明的遗传修饰的免疫细胞的优选但非限制性实施方案。

在优选实施方案中，所述免疫细胞优选为T淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突状细胞。在本领域中已知这些免疫细胞对不想要的药剂、细胞或病原体做出响应表现出细胞毒性和/或其他有益活性。通过将这些细胞的活性导向特定免疫原性靶、即本文中描述的疱疹病毒抗原，感染的致病细胞可以被本文中描述的免疫细胞的相应活性消除。

在优选实施方案中，所述免疫细胞是T淋巴细胞，优选为细胞毒性T淋巴细胞或T辅助细胞。

在某些实施方案中，所述CAR工程化免疫细胞可以被工程化改造以另外共表达细胞因子(例如IL-15、IL-12、IFN-γ、IFN-α、GM-CSF、FLT3L、IL-21、IL-23)或共刺激配体(CD80、CD86、CD40L)，以改进免疫治疗效果。

在某些实施方案中，所述CAR工程化免疫细胞可以被工程化改造以另外共表达siRNA或shRNA或miRNA，以便下调T细胞受体和主要组织相容性复合体的表达，或者可以被遗传编辑成具有CRISPR/Cas，以便敲除所述T细胞受体和主要组织相容性复合体的表达，使得这些细胞可以用作同种异体细胞疗法。

在某些实施方案中，所述CAR工程化免疫细胞可以被工程化改造以另外共表达siRNA或shRNA或miRNA，以便下调T细胞表面上的检查点分子(PD1、Tim3、LAG等)的表达，或者被遗传编辑成具有CRISPR/Cas，以便敲除所述检查点分子的表达。

利用T细胞表面上的主要组织相容性复合体或检查点分子的下调的组合方法，在优化局部免疫环境以提高本发明的CAR工程化免疫细胞的细胞裂解效果方面引起附加的、可能协同的效果。

在某些实施方案中，所述CAR工程化免疫细胞可以被工程化改造以另外共表达靶向特定细胞谱系的另外的CAR。

在某些实施方案中，来自于EBV血清反应阴性的供体或脐带血的幼稚T细胞可以被高效且快速地转变成gp350/gp220-CAR-T细胞，用于本文中描述的医学治疗。关于被工程化改造以表达本发明的CAR的免疫细胞的生产的进一步指导在下文中呈现。

因此，本发明的另一方面涉及本文中描述的免疫细胞，其用于治疗或预防与疱疹病毒感染相关的医学病症。因此，本发明还涵盖了用于治疗或预防与疱疹病毒感染相关的医学病症的方法，所述方法包括向需要的对象施用本文中描述的免疫细胞(包含/表达本发明的CAR)。

因此，在某些实施方案中，用作药物或用于相应治疗方法的所述免疫细胞被优选在疱疹病毒相关癌症、慢性活动性疱疹病毒感染或原发性疱疹病毒感染的治疗中使用。

在优选实施方案中，所述待治疗的医学病症可以通过在与所述病症相关的致病细胞上存在靶来定义。例如，本发明涵盖了本文中描述的用作药物的免疫细胞，其中所述与疱疹病毒感染相关的医学病症是其中在癌细胞表面上存在疱疹病毒抗原的疱疹病毒相关癌症。

鉴定这类抗原的方法对技术人员而言是已知的，从而使技术人员能够使用这些方法鉴定用于治疗或预防的医学病症。例如，在Weekes等(2014)中所描述的方法显示了可以如何鉴定疱疹病毒抗原的细胞表面呈递。因此，可以评估任何给定癌症以便确定疱疹病毒抗原是否存在于癌细胞的细胞表面上。使用这些方法鉴定癌症类型，使技术人员能够鉴定可以使用本发明的CAR和免疫细胞治疗的病症。

存在于EBV感染的细胞表面上并可能存在于被潜伏感染的恶性肿瘤细胞上的抗原亚类包括：gp350/gp220，LMP1，LMP2，BILF1，BALF4(gB)，BKRF2(gL)，BXLF2(gH)，BBRF3(gM)，BLRF1(gN)。其中具体而言，gp350/gp220、BILF1、BALF4(gB)、BKRF2(gL)、BXLF2(gH)、BBRF3(gM)、BLRF1(gN)是优选的，并被认为支持病毒复制的裂解阶段。

在优选实施方案中，本文中描述的用作药物(或相应的治疗方法)的免疫细胞旨在用于治疗与EBV感染相关的医学病症。

在优选实施方案中，本文中描述的用作药物(或相应的治疗方法)的免疫细胞的特征在于所述医学病症是EBV相关癌症，其优选地选自淋巴增殖性障碍(LPD)例如B-细胞淋巴瘤包括伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或移植后淋巴增殖性障碍(PTLD)，或上皮癌(鼻咽、肺、乳腺)、淋巴上皮瘤、伴有淋巴样间质的癌(GCLS，例如胃癌)或神经胶质瘤。技术人员将会认识到，诸如这些癌症类型已知与EBV感染相关。因此，使用本发明的针对这些癌症类型的CAR将免疫细胞定向，代表了一种有希望的治疗选项。

在其他实施方案中，本文中描述的用作药物(或相应的治疗方法)的免疫细胞的特征在于所述与EBV感染相关的医学病症是慢性活动性EBV感染(CAEBV)或原发性EBV感染(例如单核细胞增多症)。

在其他实施方案中，本文中描述的用作药物(或相应的治疗方法)的免疫细胞旨在用于治疗在化疗、辐射、免疫抑制或移植后免疫缺陷或免疫受损的患者。

正如本文中描述的，多种抗体(或其片段)可用作所述抗原结合结构域。在优选实施方案中，使用本文中描述的特定抗体片段。在优选实施方案中，使用包含本文中描述的可变重链(VH)和可变轻链(VL)结构域的单链可变区片段。在下文中使用两个抗原结合片段，它们命名为“7A1”和“6G4”，各自代表了独特的抗原结合片段。

产生了针对gp350具有反应性的新抗体。在体外中和Raji细胞的EBV感染的两种抗体7A1和6G4的性质，以前在本领域中尚未被公开。本发明人以概念验证的方式演示了表达并入有7A1和6G4单链抗体的嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T细胞)的功能(参见下面的实施例)。作为靶，使用了被遗传修饰以表达gp350/gp220的细胞系和被EBV潜伏感染的狨猴B细胞系(B95.8)。本发明人在体外显示了gp350-CAR-T细胞对被潜伏感染的B95.8细胞系强烈反应，导致IFN-γ的生产、B95.8细胞死亡、对gp350表达阴性的细胞的选择和杀死后游离体EBV DNA数目的减少。用EBV实验室毒株M81永生化的B细胞也被产生IFNγ的gp350-CAR-T细胞识别，扩增，并显示出gp350表达的降低。

在优选实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述抗原结合结构域(7A1)包含可变重链(VH)，所述VH包含：

-重链互补决定区SEQ ID NO：1所示的H-CDR1(GLSLTSN)、SEQ ID NO：2所示的H-CDR2(WSNGG)和SEQ ID NO：3所示的H-CDR3(PRYNSGYFFDY)，或与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：3具有至少80％序列一致性的一个或多个相应的CDR序列；

和可变轻链(VL)，所述VL包含：

-轻链互补决定区SEQ ID NO：4所示的L-CDR1(KASESVSTRMH)、SEQ ID NO：5所示的L-CDR2(KTSNLAS)和SEQ ID NO：6所示的L-CDR3(QQSWNGPLT)，或与SEQ ID NO：4至SEQ IDNO：6具有至少80％序列一致性的一个或多个相应的CDR序列。

在优选实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述抗原结合结构域(6G4)包含可变重链(VH)，所述VH包含：

-重链互补决定区SEQ ID NO：7所示的H-CDR1(GFSLTSY)、SEQ ID NO：8所示的H-CDR2(WSDGD)和SEQ ID NO：9所示的H-CDR3(LQSEDTATYYCARLQVFGYPGIRDYVMDA)，或与SEQID NO：7至SEQ ID NO：9具有至少80％序列一致性的一个或多个相应的CDR序列；

和可变轻链(VL)，所述VL包含：

-轻链互补决定区SEQ ID NO：10所示的L-CDR1(KSSQSLLSSRHQKNFLA)、SEQ ID NO：11所示的L-CDR2(HASTRQS)和SEQ ID NO：12所示的L-CDR3(LQHYTSPYT)，或与SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：12具有至少80％序列一致性的序列。

在优选实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述细胞外抗原结合结构域包括：

包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的CDR序列的VH结构域，和包含SEQID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的CDR序列的VL结构域(7A1)，或

包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的CDR序列的VH结构域，和包含SEQID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的CDR序列的VL结构域(6G4)。

在一个实施方案中，所述CAR多肽包含与如下所述的SEQ ID NO：13具有至少80％序列一致性、优选地至少85％、90％、95％或100％序列一致性的VH结构域：

其中X1：L或F；X2：N或Y；X3：G或H；X4：S或H；X5：I或V；X6：L或M；X7：I或M；X8：N或D；X9：G或D；X10：D或L；X11：I或L；X12：F或I；X13：F或L；X14：K或Q；X15：N或D；X16：T或S；X17：M或T；X18：F或Y；X19：P或L；X20：R或Q；X21：无AA或V；X22：无AA或F；X23：无AA或G；X24：N或P；X25：S或G；X26：无AA或I；X27：无AA或R；X28：G或D；X29：F或V；X30：F或M；X31：Y或A；X32：V或A；X33：M或S(其中“无AA”意味着“无氨基酸”)；

和与如下所述的SEQ ID NO：14具有至少80％序列一致性、优选地至少85％、90％、95％或100％序列一致性的VL结构域：

其中X1：T或L；X2：L或M；X3：无AA或F；X4：A或S；X5：P或E；X6：R或M；X7：S或K；X8：A或S；X9：E或Q；X10：V或L；X11：S或L；X12：T或S；X13：R或S；X14：M或R；X15：无AA或Q；X16：无AA或K；X17：无AA或N；X18：无AA或F；X19：无AA或L；X20：无AA或A；X21：Q或S；X22：K或H；X23：T或A；X24：N或T；X25：L或R；X26：A或Q；X27：A或D；X28：S或I；X29：D或S；X30：P或D；X31：E或Q；X32：D或E；X33：T或L；X34：T或D；X35：F或Y；X36：Q或L；X37：S或H；X:38：W或Y；X39：N或T；X40：G或S；X41：L或Y；X42：S或A；X43：I或L(其中“无AA”意味着“无氨基酸”)。

上述SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示的序列代表了抗原结合片段VL和VH序列的统一表述方式，其将7A1和6G4两者共同的氨基酸显示为所叙述的序列中的具体氨基酸，并将可能根据7A1和6G4中的任一个而变的氨基酸显示成名为“X”，并在序列下方为每个“X"列出了相应的选项。因此，本发明的7A1和6G4抗原结合片段代表了统一的主题内容，其中的每一个能够结合EBV gp350并且能够实现本发明的CAR的有益功效。就其序列而言，共同的结构要素是显然的。

在一个实施方案中，本发明的CAR多肽包含根据下面的SEQ ID NO：15所述的VH结构域(7A1)：

(QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGLSLTSNGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWSNGGTDYNSAIKSRLSFSRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAMYFCARPRYNSGYFFDYWGQGVMVTVSS)

和根据下面的SEQ ID NO：16所述的VL结构域(7A1)：

(DTVLTQSPALAVSPGERVTISCKASESVSTRMHWYRQKPGQQPKLLIYKTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDTATYFCQQSWNGPLTFGSGTKLEIKR)，

或

根据下面的SEQ ID NO：17所述的VH结构域(6G4)：

(QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYHVHWVRQPPGKGLEWMGVMWSDGDTLYNSALKSRLSISRDTSKSQVLLQMDSLQSEDTATYYCARLQVFGYPGIRDYVMDAWGQGASVTVSS)

和根据下面的SEQ ID NO：18所述的VL结构域(6G4)：

(DLVMTQSPFSLAVSEGEMVTIKCKSSQSLLSSRHQKNFLAWYRQKPGQSPKLLIYHASTRQSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISDVQAEDLADYYCLQHYTSPYTFGAGTKLELKR)。

在本发明的其他实施方案中，使用了特定CAR构建物，其使用例如特定的前导多肽、位于所述VH和VL结构域之间的连接多肽、位于所述细胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间的间隔多肽、跨膜结构域、细胞内结构域和/或位于所述VH和VL结构域与所述间隔物之间和/或所述间隔物与所述跨膜结构域之间的连接多肽。

下面描述的实施方案代表了由本发明人开发的CAR构建物的优选但非限制性实施方案。下面描述的特定结构域的变化被考虑到了，并且被涵盖在本发明的范围之内。

在一个实施方案中，本发明的CAR多肽包含位于所述VH和VL结构域的N-末端的前导多肽，其中所述前导多肽优选为IgHL前导肽。

在一个实施方案中，所述前导多肽优选为SEQ ID NO：19所示的IgHL前导肽(MEFGLSWLFLVAILKGVQC)或与SEQ ID NO：19具有至少80％序列一致性的前导肽。

在一个实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述细胞外抗原结合结构域包含位于所述VH与VL结构域之间的连接多肽，其中所述连接物优选为G4S连接物。

在一个实施方案中，所述连接物优选为SEQ ID NO：20所示的G4S连接物(SGGGGSGGGGSGGGGS)或与SEQ ID NO：20具有至少80％序列一致性的连接物。

在一个实施方案中，本发明的CAR多肽另外包含位于所述细胞外抗原结合结构域与所述跨膜结构域之间的间隔多肽，其中所述间隔物优选为IgG1 CH3或IgG1 CH2-CH3间隔物。

在一个实施方案中，所述间隔物优选为SEQ ID NO：21所示的IgG1 CH3间隔物(ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)，或与SEQ ID NO：21具有至少80％序列一致性的间隔物。

在一个实施方案中，所述间隔物优选为SEQ ID NO：22所示的IgG1 CH2 CH3间隔物(EPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK)，或与SEQ ID NO：22具有至少80％序列一致性的间隔物。

在一个实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述跨膜结构域是CD28或CD8α跨膜结构域。

在一个实施方案中，所述跨膜结构域是优选地SEQ ID NO：23所示的CD28跨膜结构域(FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV RS)，或与SEQ ID NO：23具有至少80％序列一致性的跨膜结构域。

在一个实施方案中，所述跨膜结构域是优选地SEQ ID NO：24所示的CD8α跨膜结构域(VISTSGRPWPGLVGSFSCHWLSPFTAT TG)，或与SEQ ID NO：24具有至少80％序列一致性的跨膜结构域。

在一个实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述细胞内结构域包含CD28或4-1BB共刺激结构域。

在一个实施方案中，所述细胞内结构域包含优选地SEQ ID NO：25所示的CD28共刺激结构域(KRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS)，或与SEQ ID NO：25具有至少80％序列一致性的共刺激结构域。

在一个实施方案中，所述细胞内结构域包含优选地SEQ ID NO：26所示的4-1BB共刺激结构域(KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL)，或与SEQ ID NO：26具有至少80％序列一致性的共刺激结构域。

在一个实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述细胞内结构域包含CD3ζ链信号传导结构域。

在一个实施方案中，所述CD3ζ链信号传导结构域优选为SEQ ID NO：27所示的信号传导结构域(RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDPTTPFTCRPCPL)，或与SEQ ID NO：27具有至少80％序列一致性的信号传导结构域。

在一个实施方案中，本发明的CAR多肽的特征在于所述CAR包含位于所述VH和VL结构域与所述间隔物之间和/或所述间隔物与所述跨膜结构域之间的一个或多个连接多肽。

在一个实施方案中，所述位于所述VH和VL结构域与所述间隔物之间和/或所述间隔物与所述跨膜结构域之间的一个或多个连接多肽优选地选自SEQ ID NO：28(GDPA)或SEQID NO：29(KDPK)所示的序列。

在优选实施方案中，本发明涉及一种本文中所描述的CAR多肽，其包含下面所述的序列或由所述序列构成：

SEQ ID NO：30(7A1 CAR.CD28.z)

MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGLSLTSNGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWSNGGTDYNSAIKSRLSFSRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAMYFCARPRYNSGYFFDYWGQGVMVTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVLTQSPALAVSPGERVTISCKASESVSTRMHWYRQKPGQQPKLLIYKTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDTATYFCQQSWNGPLTFGSGTKLEIKGDPAESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR，或

SEQ ID NO：31(6G4 CAR.CD28.z)

MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYHVHWVRQPPGKGLEWMGVMWSDGDTLYNSALKSRLSISRDTSKSQVLLQMDSLQSEDTATYYCARLQVFGYPGIRDYVMDAWGQGASVTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSDLVMTQSPFSLAVSEGEMVTIKCKSSQSLLSSRHQKNFLAWYRQKPGQSPKLLIYHASTRQSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISDVQAEDLADYYCLQHYTSPYTFGAGTKLELKGDPAESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDPTTPFTCRPCPL，或

SEQ ID NO：32(7A1 CAR.41BB.z)

MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGLSLTSNGVSWIRQPPGKGLEWLGVIWSNGGTDYNSAIKSRLSFSRDTSKSQVFLKMNSLQTEDTAMYFCARPRYNSGYFFDYWGQGVMVTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSDTVLTQSPALAVSPGERVTISCKASESVSTRMHWYRQKPGQQPKLLIYKTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEADDTATYFCQQSWNGPLTFGSGTKLEIKGDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVISTSGRPWPGLVGSFSCHWLSPFTATTGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR，或

SEQ ID NO：33(6G4 CAR.41BB.z)

MEFGLSWLFLVAILKGVQCQVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYHVHWVRQPPGKGLEWMGVMWSDGDTLYNSALKSRLSISRDTSKSQVLLQMDSLQSEDTATYYCARLQVFGYPGIRDYVMDAWGQGASVTVSSSGGGGSGGGGSGGGGSDLVMTQSPFSLAVSEGEMVTIKCKSSQSLLSSRHQKNFLAWYRQKPGQSPKLLIYHASTRQSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISDVQAEDLADYYCLQHYTSPYTFGAGTKLELKGDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVISTSGRPWPGLVGSFSCHWLSPFTATTGKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCERVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY。

在其他实施方案中，本发明的CAR的特征在于所述细胞外抗原结合结构域选自全长抗体、单链抗体、Fab片段、Fab′片段、(Fab′)2片段、Fv片段和二价单链抗体或双体抗体的抗体。

在其他实施方案中，本发明的CAR的特征在于所述共刺激结构域(跨膜和细胞内信号传导结构域)包含来自于CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、DaplO、CD27、CD2、CD5、ICAM-1、LFA-1、Lck、TNFR-J、TNFR-II、Fas、CD30、CD40中的任一个或多个的信号传导结构域及其组合。

在其他实施方案中，本发明的CAR的特征在于所述跨膜结构域选自人工疏水序列和I型跨膜蛋白、T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和CD154的跨膜结构域。

在其他实施方案中，本发明的CAR的特征在于所述细胞内信号传导结构域包含人类CD3ζ链、FcyRlII、FccRI、Fc受体的胞质尾区、带有基于酪氨酸的免疫受体活化基序(ITAM)的细胞质受体、TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d中的一个或多个的信号传导结构域及其组合。

本发明的另一方面涉及一种分离的核酸分子，其优选地采取分离的载体例如分离的病毒载体的形式，所述核酸分子包含编码根据前述权利要求中的任一项所述的CAR多肽的核苷酸序列。

在优选实施方案中，本发明涉及一种分离的核酸分子，其优选地采取分离的载体例如分离的病毒载体的形式，所述核酸分子选自：

a)包含下述核苷酸序列的核酸分子：

-编码本文中所描述的CAR多肽的核苷酸序列，

-编码细胞外抗原结合结构域或其部分，包含SEQ ID NO：13-18中一个或多个的核苷酸序列，

-编码SEQ ID NO：30-33所示的CAR多肽的核苷酸序列，

-SEQ ID NO：34-37所示的一个或多个核苷酸序列；

b)与符合a)的核苷酸序列互补的核酸分子；

c)包含与根据a)或b)所述的核苷酸序列具有足够的序列一致性以至于在功能上类似/等同的核苷酸序列的核酸分子，包括优选地与根据a)或b)所述的核苷酸序列具有至少80％的序列一致性；

d)作为遗传密码的结果被简并成根据a)至c)所述的核苷酸序列的核酸分子；和/或

e)根据a)至d)所述的核苷酸序列的核酸分子，其通过缺失、添加、替换、易位、倒位和/或插入进行修饰，并且在功能上与根据a)至d)所述的核苷酸序列类似/等同。

本发明的另外且令人吃惊的方面是本文中公开的CAR的提高的稳定性。所述CAR多肽可以在适合条件下容易地长期储存而没有结合亲和性的任何损失。

本发明的优选氨基酸和核苷酸序列：

根据本发明，任何给定方面的实施方案被认为适用于其他方面和实施方案，使得本文中所公开的特定实施方案的组合被考虑在内。例如，在医学治疗方面公开的实施方案可以作为CAR的功能特点并入，反之亦然。

发明详述

所有引用的专利和非专利文献的文件通过整体引用并入本文。

疱疹病毒

存在多种已知感染人类的疱疹病毒类型，主要相关的是单纯性疱疹病毒1和2(HSV-1和HSV-2，也被称为HHV1和HHV2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV，也被称为HHV-3)、Epstein–Barr病毒(EBV或HHV-4)、人类巨细胞病毒(HCMV或HHV-5)、人类疱疹病毒6A和6B(HHV-6A和HHV-6B)、人类疱疹病毒7(HHV-7)和卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV，也被称为HHV-8)。疱疹病毒具有共同的结构，其由包装在被称为“衣壳”的二十面体蛋白笼中的编码100-200个基因的相对大的双链线性DNA基因组构成，所述衣壳本身被包裹在被称为外皮的蛋白质层中，所述外皮含有病毒蛋白质和病毒mRNA两者以及被称为包膜的质双层膜。当病毒粒子接触在细胞表面上具有特定类型的受体分子例如CD21的细胞时，就会启动感染。

在病毒包膜糖蛋白结合到细胞膜受体后，所述病毒粒子被内化并拆解，允许病毒DNA迁移到细胞核。在核内发生病毒DNA的复制和病毒基因的转录。在有症状感染期间，被感染的细胞转录裂解性病毒基因。在某些宿主细胞中，不同的是有被称为潜伏期相关转录本(LAT)的少量病毒基因积累。通过这种方式，病毒可以无限期存留在细胞(以及因此宿主)中。尽管原发性感染通常伴有临床疾病的自限期，但长期潜伏通常是无症状的。潜伏病毒的再激活与多种疾病相关。在激活后，病毒基因的转录从LAT转变到多个裂解性基因；它们导致复制增强和病毒产生。裂解激活通常导致细胞死亡。在临床上，裂解激活常伴有非特异性症状的出现，例如低烧、头痛、喉咙痛、乏力和皮疹，以及临床体征例如淋巴结肿胀或疼痛和免疫学发现。

EBV是一种被全世界几乎所有成年人群携带的人类疱疹病毒。许多原发性感染发生在儿童时期并且无症状。那些在约12岁或13岁之后发生的人更有可能伴有感染性单核细胞增多症，这是一种自限性但暂时使人衰弱的免疫病。无论感染是否伴有疾病，病毒都会持续存在。它在长寿命记忆B细胞中建立潜伏，并偶发性地再激活，使其在上皮细胞中扩增，脱落在唾液中，以通过口腔传播给新的宿主或返回到B细胞以补充B细胞贮存库。绝大多数人不会因EBV的存留而遭受不良影响，但所述病毒与许多B细胞和上皮细胞恶性肿瘤相关，包括伯基特和霍奇金淋巴瘤、移植后淋巴增殖性障碍和免疫抑制的免疫细胞性淋巴瘤、间变性鼻咽癌和一部分胃癌，并且可能是因果相关的。它还与自身免疫性疾病例如多发性硬化症相关(Hutt-Fletcher，2015)。

糖蛋白在病毒粒子的形成和宿主细胞的感染中发挥重要作用。最丰富的病毒粒子糖蛋白是gp350，其被鉴定为是负责病毒附着到B淋巴细胞的蛋白质。它是907个残基的1型膜蛋白，在病毒粒子中作为两种剪接变体存在，它们当被完全糖基化时具有大约350kDa和220kDa的质量。

所述剪接维持阅读框，并且所述蛋白质的两种形式均保留N-末端附着位点，即将病毒束缚到CR2/CD21的无聚糖表面。尚不清楚维持剪接变体是否具有任何功能意义。然而，由于CR2和gp350两者均已被建模为伸展蛋白，它们最初将病毒定位在距细胞表面一定距离处，因此与gp350和gp220的顺序结合可能与将病毒带到更接近细胞膜有关。

因此，本文中对gp350的任何指称都涉及gp350或gp220，反之亦然。本文公开的抗原结合片段结合到gp350和/或gp220。

在附着到B-细胞表面后，作为包膜病毒的EBV通过其包膜与细胞膜融合进入细胞。从内吞小泡内发生的融合需要另外四种糖蛋白gB、gH、gL和gp42作用(Hutt-Fletcher，2015)。糖蛋白B是一种作为同源三聚体表达的I型膜蛋白。在所有疱疹病毒中，目前普遍认同gB是融合的最终执行者。糖蛋白gH、gL和gp42被视为所述过程的调控物。糖蛋白gp42可以作为2型膜蛋白或作为信号序列被切掉的可溶性蛋白存在于细胞中。它通过N-末端结构域中的柔性区段与gH相互作用，并通过C-末端处的C-型凝集素结构域与II类HLA相互作用。

EBV相关疾病

本发明还涉及疱疹病毒相关疾病、优选EBV相关疾病的治疗。例如，这些医学病症涵盖疱疹病毒相关癌症或慢性活动性疱疹病毒感染或原发性疱疹病毒感染。

特别相关的是使用本文中描述的CAR和免疫细胞治疗淋巴增殖性障碍(LPD)例如B-细胞淋巴瘤，包括伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

所述B-细胞淋巴瘤是影响B细胞的淋巴瘤类型。淋巴瘤通常被称为淋巴结中的“血癌”。它们在老年人和免疫受损个体中更频繁地发生。B-细胞淋巴瘤既包括霍奇金淋巴瘤也包括大多数非霍奇金淋巴瘤。

DLBCL是B细胞的癌症。通常，DLBCL从正常B细胞产生，但它也可以代表其他类型的淋巴瘤或白血病的恶性转化。潜在的免疫缺陷是显著的风险因素，并且还发现Epstein–Barr病毒感染有助于DLBCL的发生。

伯基特淋巴瘤是一种淋巴系统、特别是生发中心中存在的B淋巴细胞的癌症。伯基特淋巴瘤可分为三种主要的临床变型：地方性、散发性和免疫缺陷相关变型。EBV感染存在于几乎所有的地方性变型中。

此外，相关的是使用本文中描述的CAR和免疫细胞治疗移植后淋巴增殖性障碍(PTLD)、上皮癌(鼻咽、肺、乳腺)、淋巴上皮瘤、伴有淋巴样间质的癌(GCLS，例如胃癌)或神经胶质瘤。

PTLD被用于指称由器官移植后的治疗性免疫抑制而造成的B-细胞增殖。这些患者可能发生感染性单核细胞增多症样病变或多克隆多形B细胞增生。因此，本发明还涉及化疗、辐射、免疫抑制或移植后免疫缺陷或免疫受损患者的治疗。

鼻咽癌或鼻咽上皮癌(NPC)是起源于鼻咽的最常见癌症，最常见于后外侧鼻咽或咽隐窝中，占病例的50％。NPC发生在儿童和成人中。Epstein-Barr病毒与鼻咽癌之间的关联在世界卫生组织(WHO)II型和III型肿瘤中是明确的。淋巴上皮瘤是一种低分化鼻咽癌类型，其特征是在肿瘤涉及的区域中淋巴细胞的明显浸润。淋巴上皮瘤在WHO分类系统中也被称为“III类鼻咽癌”。

伴有淋巴样间质的胃癌(GCLS)是胃癌的一种独特的组织学亚型，其特征是未分化癌与显著的淋巴样浸润相混合。超过80％的GCLS病例与EBV感染相关，但尚不清楚所述病毒是否影响疾病进展。

神经胶质瘤是一种始于大脑或脊髓的神经胶质细胞的肿瘤类型。神经胶质瘤约占所有脑肿瘤和中枢神经系统肿瘤的30％，占所有恶性脑肿瘤的80％。研究揭示，EBV以高频率存在于神经胶质瘤患者中，这表明使用本发明可以潜在地靶向与EBV相关的神经胶质瘤。

在本发明的其他方面，所述待治疗的与EBV感染相关的医学病症是慢性活动性EBV感染(CAEBV)或原发性EBV感染(例如单核细胞增多症)。

CAEBV是EBV感染的一种罕见且通常致命的并发症，最通常发生在亚裔或南美裔的儿童或青少年中，尽管在西班牙裔、欧裔和非裔中的病例也有报道。目前，唯一已知的CAEBV治愈方法是同种异体造血干细胞移植(HSCT)，而所有其他治疗选项(利妥昔单抗、细胞毒性化疗和免疫抑制疗法)最终似乎是无效的。

感染性单核细胞增多症、也被称为腺热，是通常由EBV引起的感染。大多数人在儿童时就被病毒感染，此时所述疾病产生很少或没有症状。在年轻人中，所述疾病通常导致发烧、喉咙痛、颈部淋巴结肿大和疲倦。

嵌合抗原受体：

根据本发明，CAR多肽包含含有结合靶抗原的抗体或抗体片段的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。CAR通常被描述为包含源自于抗体的胞外结构域(抗原结合结构域)和包含源自于T细胞信号传导蛋白的信号传导模块的胞内结构域。

在优选实施方案中，所述胞外结构域优选地包含来自于免疫球蛋白的重链和轻链的可变区，其被构造成单链可变区片段(scFv)。所述scFv优选被附连到铰链区，所述铰链区提供柔性，并通过锚定跨膜组成部分将信号传导到细胞内信号传导结构域。所述跨膜结构域优选源自于CD8α或CD28。在第一代CAR中，所述信号传导结构域由TCR复合体的ζ链构成。术语“代”是指所述细胞内信号传导结构域的结构。第二代CAR装配有源自于CD28或4-1BB的单一共刺激结构域。第三代CAR已经包括两个共刺激结构域，例如CD28、4-1BB、ICOS或OX40、CD3ζ。本发明优选涉及第二代或第三代CAR，尽管本文中描述的抗原结合片段可用于任何给定的CAR格式中。

在各种不同实施方案中，提供了遗传工程改造的受体，其将免疫效应细胞的细胞毒性重新导向B细胞。这些遗传工程改造的受体在本文中被称为CAR。CAR是将针对所需抗原(例如gp350/gp220)的基于抗体的特异性与激活T细胞受体的细胞内结构域相组合的分子，以产生表现出特定(例如抗gp350/gp220)细胞免疫活性的嵌合蛋白。当在本文中使用时，术语“嵌合”描述了由不同蛋白质的部分或来自于不同来源的DNA组成。

本文中设想的CAR包含结合到疱疹病毒抗原、优选为gp350/gp220的细胞外结构域(也被称为结合结构域或抗原结合结构域)、跨膜结构域和细胞内结构域或细胞内信号传导结构域。CAR的抗原结合结构域与靶细胞表面上的靶的接合引起所述CAR的簇集，并将激活刺激递送到含有所述CAR的细胞。CAR的主要特征是它们重新引导免疫效应细胞特异性的能力，由此引发抗原特异性效应T细胞的增殖、细胞因子的产生(例如IFN-γ)和可以以不依赖于主要组织相容性复合体(MHC)的方式介导表达所述表面抗原的靶细胞的死亡的分子的产生。

在各种不同实施方案中，CAR包括：包含(任选地人源化的)gp350/gp220特异性结合结构域的细胞外结合结构域；跨膜结构域；一个或多个细胞内信号传导结构域。在特定实施方案中，CAR包括：包含(任选地人源化的)抗gp350/gp220抗原结合片段的细胞外结合结构域；一个或多个间隔物结构域；跨膜结构域；一个或多个细胞内信号传导结构域。

“细胞外抗原结合结构域”或“细胞外结合结构域”可互换使用，并且为CAR提供了特异性结合到感兴趣的靶抗原的能力。所述结合结构域可以源自于天然、合成、半合成或重组来源。优选的是scFv结构域。

“特异性结合”应该被本领域技术人员所理解，因此技术人员清楚地了解可用于测试结合和结合特异性的各种不同实验程序。用于确定平衡结合或平衡解离常数的方法在本领域中是已知的。在许多蛋白质-蛋白质相互作用中，一些交叉反应或背景结合可能是不可避免的；这并不减损CAR与表位之间的结合的“特异性”。“特异性结合”描述了抗疱疹病毒抗原抗体或其抗原结合片段(或包含它们的CAR)与所述疱疹病毒抗原以比背景结合更高的结合亲和性结合。当考虑术语“特异性”时，术语“针对”也适用于理解抗体与表位之间的相互作用。

“抗原(Ag)”是指可以在动物中刺激抗体或T细胞应答的产生的化合物、组合物或物质。在特定实施方案中，所述靶抗原是EBV gp350和/或gp220多肽的表位。“表位”是指抗原的被结合剂结合的区域。表位可以由毗连氨基酸或通过蛋白质的三级折叠并置的非毗连氨基酸两者形成。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中并采取任一取向(例如VL-VH或VH-VL)。通常，所述scFv多肽还在所述VH与VL结构域之间包含多肽连接物，其能够使所述scFv形成抗原结合所需的结构。在优选实施方案中，本文中设想的CAR包含抗原特异性结合结构域，其是scFv，并且可能是鼠类、人类或人源化的scFv。单链抗体可以从特异性针对所需靶的杂交瘤的V区基因克隆。在特定实施方案中，所述抗原特异性结合结构域是结合EBV gp350和/或gp220多肽的人源化scFv。

适用于构建本文中设想的抗gp350/gp220 CAR的可变重链的说明性实例包括但不限于SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：17中阐述的氨基酸序列。适用于构建本文中设想的抗gp350/gp220 CAR的可变轻链的说明性实例包括但不限于SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18中阐述的氨基酸序列。

抗体和抗体片段：

所述CAR包含细胞外抗原结合结构域，所述结构域包含结合本文中描述的靶多肽的抗体或抗体片段。因此，本发明的抗体或抗体片段包括但不限于多克隆、单克隆、双特异性、人类、人源化或嵌合抗体、单链片段(scFv)、单可变区片段(ssFv)、单结构域抗体(例如来自于纳米抗体的VHH片段)、Fab片段、F(ab')₂片段、由Fab表达文库产生的片段、抗独特型抗体和表位结合片段，或任何上述抗体或片段的组合，只要它们保留了与本文中描述的CAR相似的结合性质，优选地包含本文中描述的相应CDR或VH和VL区即可。微型抗体和多价抗体例如双体抗体、三体抗体、四价抗体和五体抗体，也可用于本发明的方法。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(即IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类的免疫球蛋白分子。因此，当在本文中使用时，术语抗体还包括本发明的CAR所包含的抗体和抗体片段，其使用重组DNA方法通过完整抗体的修饰生产或从头合成。

当在本文中使用时，“抗体”通常是指由实质上被免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码的一个或多个多肽构成的蛋白质。当使用术语“抗体”时，也可以认为指称术语“抗体片段”。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其进而分别定义了免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知免疫球蛋白(抗体)的基础结构单元包含四聚体或二聚体。每个四聚体由相同的两对多肽链组成，每对具有一条“轻”(L)链(约25kD)和一条“重”(H)链(约50-70kD)。每条链的N-末端定义了约100个至110个或更多个氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变轻链”和“可变重链”分别是指轻链和重链的这些可变区。任选地，所述抗体或抗体的免疫学部分可以被化学偶联到其他蛋白质或表达成与其他蛋白质的融合蛋白。

本发明的CAR旨在结合到哺乳动物、特别是人类的蛋白靶。蛋白质名称的使用可以对应于蛋白质的小鼠或人类版本。

根据本文所述的结合结构域多肽和CAR蛋白的亲和性可以使用常规技术容易地确定，例如通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定法)或通过结合缔合或使用标记的配体的置换测定法，或使用表面等离子体共振装置例如Biacore。

包含本发明的抗体的一个或多个CDR或源自于所述抗体的一个或多个CDR的人源化抗体可以使用本领域中已知的任何方法来制备。例如，可以使用四个通用步骤将单克隆抗体人源化。这些步骤是：(1)确定起始抗体轻链和重链可变结构域的核苷酸和预测的氨基酸序列；(2)设计所述人源化抗体，即确定在人源化过程中使用哪种抗体构架区；(3)真正的人源化方法/技术；和(4)所述人源化抗体的转染和表达。参见例如美国专利号4,816,567、5,807,715、5,866,692、6,331,415、5,530,101、5,693,761、5,693,762、5,585,089、6,180,370、5,225,539、6,548,640。

术语人源化抗体意味着至少一部分构架区和任选的一部分CDR区或参与免疫球蛋白结合的其他区源自于或被调整到人类免疫球蛋白序列。小鼠单克隆抗体的人源化、嵌合或部分人源化的版本可以例如从编码H和L链的小鼠和/或人类基因组DNA序列或从编码H和L链的cDNA克隆出发，通过重组DNA技术来制备。小鼠抗体的人源化形式可以通过重组DNA技术将非人类抗体的CDR区连接到人类恒定区来产生(Queen等，1989；WO 90/07861)。或者，在本发明的方法中使用的单克隆抗体可以是人类单克隆抗体。人类抗体可以例如使用噬菌体展示方法来获得(WO 91/17271；WO 92/01047)。

当在本文中使用时，人源化抗体也是指非人类(例如鼠类、骆驼、美洲驼、鲨鱼)抗体的形式，它们是含有源自于非人类免疫球蛋白的最少序列的特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')₂或抗体的其他抗原结合子序列)。

当在本文中使用时，人类或人源化抗体或抗体片段意味着具有对应于由人类产生的抗体的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体，和/或使用本领域中已知的或本文中公开的用于制备人类抗体的任何技术来制备。人类抗体或其片段可以通过竞争性结合实验或其他方式进行选择，以具有与特定小鼠抗体相同的表位特异性。本发明的人源化抗体令人吃惊地在很大程度上享有小鼠抗体的有用功能性质。也可以提供采取来自于用免疫原性试剂免疫接种的人类的血清的形式的人类多克隆抗体。任选地，这些多克隆抗体可以使用淀粉样纤维和/或非纤维多肽或其片段作为亲和试剂，通过亲和纯化来浓缩。单克隆抗体可以按照在WO 99/60846中描述的技术从血清获得。

可变区和CDR

抗体的可变区是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。所述重链和轻链的可变区各自由通过三个也被称为超变区的互补决定区(CDR)相连的四个构架区(FR)构成。每条链中的CDR被FR保持紧邻在一起，并且与来自于另一条链的CDR一起帮助抗体的抗原结合位点的形成。

存在大量可用于确定CDR的技术，例如基于跨物种序列可变性的方法(即Kabat等，《免疫学重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)(第5版，1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.))和基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等，(1997)J.Molec.Biol.273:927-948)。可选方法包括IMGT国际ImMunoGeneTics信息系统(Marie-Paule Lefranc)。所述Kabat定义是基于序列可变性，并且是最常用的方法。所述Chothia定义是基于结构环区的位置，其中所述AbM定义是被Oxford Molecular's AbM抗体建模软件采用的上述两者之间的折中(参见www.bioinf.org.uk:Dr.Andrew C.R.Martin's Group)。当在本文中使用时，CDR可以是指通过一种或多种方法或通过这些方法的组合定义的CDR。

在某些实施方案中，本发明提供了并入到CAR中的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含与本发明的抗体的至少一个CDR、至少两个CDR、至少三个CDR或更多个CDR基本上一致的至少一个CDR、至少两个CDR、至少三个CDR或更多个CDR。其他实施方案包括具有与本发明的抗体的或源自于本发明的抗体的至少2、3、4、5或6个CDR基本上一致的至少2、3、4、5或6个CDR的抗体。在某些实施方案中，所述至少1、2、3、4、5或6个CDR与本发明的抗体的至少1、2或3个CDR具有至少约70％、75％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的一致性。应该理解，出于本发明的目的，结合特异性和/或总体活性通常保留，尽管与所述抗体相比活性程度可能改变(可能更高或更低)。

所述CAR的其他组分

在某些实施方案中，本文中设想的CAR可以在各个不同结构域之间包含为获得适合的间隔和分子构象而添加的连接物，例如包含连接VH和VL结构域并提供与所述两个子结合结构域的相互作用相容的间隔物功能的氨基酸序列的连接物，以使得到的多肽保留对与包含相同轻链和重链可变区的抗体相同的靶分子的特异性结合亲和性。本文中设想的CAR可以包含1、2、3、4或5个或更多个连接物。在特定实施方案中，连接物的长度为约1个至约25个氨基酸、约5个至约20个氨基酸或约10个至约20个氨基酸或任何中间的氨基酸长度。

连接物的说明性实例包括甘氨酸聚合物、甘氨酸-丝氨酸聚合物、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域中已知的其他柔性连接物，例如Whitlow连接物。甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物是相对非结构化的，因此可能能够充当融合蛋白例如本文中描述的CAR的结构域之间的中性系链。

在特定实施方案中，所述CAR的结合结构域后面跟有一个或多个“间隔物”或“间隔多肽”，其是指使所述抗原结合结构域远离效应细胞表面，以便能够实现适合的细胞/细胞接触、抗原结合和激活的区域。在某些实施方案中，间隔物结构域是免疫球蛋白的一部分，包括但不限于一个或多个重链恒定区例如CH2和CH3。所述间隔物结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述间隔物结构域包含IgG1或IgG4的CH2和CH3结构域。

在某些实施方案中，所述CAR的结合结构域可以跟有一个或多个“铰链结构域”，其在将所述抗原结合结构域定位到远离效应细胞表面，以便能够实现适合的细胞/细胞接触、抗原结合和激活中发挥作用。CAR可以在所述结合结构域与跨膜结构域(TM)之间包含一个或多个铰链结构域。所述铰链结构域可以源自于天然、合成、半合成或重组来源。所述铰链结构域可以包括天然存在的免疫球蛋白铰链区或改变的免疫球蛋白铰链区的氨基酸序列。适用于本文中描述的CAR的说明性铰链结构域包括源自于1型膜蛋白例如CD8α、CD4、CD28、PD1、CD 152和CD7的细胞外区域的铰链区，它们可以是来自于这些分子的野生型铰链区，或者可以被改变。在另一个实施方案中，所述铰链结构域包含PD1、CD 152或CD8α铰链区。

所述“跨膜结构域”是所述CAR的将所述细胞外结合部分与细胞内信号传导结构域融合，并将所述CAR锚定到免疫效应细胞的质膜的部分。所述TM结构域可以源自于天然、合成、半合成或重组来源。所述TM结构域可以源自于T-细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD 16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 152、CD 154和PD1。在一个实施方案中，本文中设想的CAR包含源自于CD8α或CD28的TM结构域。

在特定实施方案中，本文中设想的CAR包含细胞内信号传导结构域。“细胞内信号传导结构域”是指CAR的参与将CAR与靶多肽的有效结合的讯息传导到免疫效应细胞内部，以引发效应细胞功能的部分，所述效应细胞功能例如激活、细胞因子产生、增殖和细胞毒性活性，包括细胞毒性引起向CAR结合的靶细胞的释放，或由抗体结合到细胞外CAR结构域引发的其他细胞应答。术语“效应子功能”是指免疫效应细胞的特殊功能。T细胞的效应子功能可以是例如细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的传导效应子功能的信号并引导所述细胞执行特殊功能的部分。

本文中设想的CAR包含一个或多个共刺激信号传导结构域，以增强表达CAR受体的T细胞的功效、扩增和/或记忆形成。当在本文中使用时，术语“共刺激信号传导结构域”是指共刺激分子的细胞内信号传导结构域。共刺激分子是抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子，其在结合到抗原后提供T淋巴细胞的高效激活和功能所需的第二信号。

多肽

除非有相反指示，否则“肽”“多肽”“多肽片段”和“蛋白质”可互换使用，并且符合常规含义，即作为氨基酸的序列。多肽不限于特定长度，例如它们可以包含全长蛋白质序列或全长蛋白质的片段，并且可以包括所述多肽的翻译后修饰例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域中已知的天然存在和非天然存在的其他修饰。

在各种不同实施方案中，本文中设想的CAR多肽包含在所述蛋白质的N-末端处的信号(或前导肽)序列，其在翻译同时或翻译后指导所述蛋白质的转移。多肽可以使用各种不同的公知的重组和/或合成技术中的任一种来制备。本文中设想的多肽具体而言涵盖本文公开的CAR或具有本文中公开的CAR的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或替换的序列。

当在本文中使用时，“分离的肽”或“分离的多肽”等是指肽或多肽分子从细胞环境并从与细胞的其他组分的结合中的体外分离和/或纯化，即它不与体内物质显著结合。同样地，“分离的细胞”是指已从体内组织或器官获得并且基本上不含细胞外基质的细胞。

核酸

当在本文中使用时，术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指信使RNA(mRNA)、RNA、基因组RNA(gRNA)、正链RNA(RNA(+))、负链RNA(RNA(-))、基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)或重组DNA。多核苷酸包括单链和双链多核苷酸。优选地，本发明的多核苷酸包括与本文中描述的任何参比序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的多核苷酸或变体，通常其中所述变体维持所述参比序列的至少一种生物活性。在各种不同的说明性实施方案中，本发明部分设想了包含表达载体、病毒载体和转移质粒的多核苷酸以及包含它们的组合物和细胞。

多核苷酸可以使用本领域中已知和可用的各种不同的完善技术中的任一种来制备、操作和/或表达。为了表达所需多肽，可以将编码所述多肽的核苷酸序列插入到适合的载体中。载体的实例是质粒、自主复制序列序列和可转座元件。其他示例性载体包括但不限于质粒、噬菌粒、粘粒、人工染色体例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或源自于Pl的人工染色体(PAC)、噬菌体例如λ噬菌体或Ml 3噬菌体和动物病毒。可用作载体的动物病毒类别的实例包括但不限于反转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯性疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒病毒(例如SV40)。表达载体的实例是用于在哺乳动物细胞中表达的pClneo载体(Promega)、用于哺乳动物细胞中的慢病毒介导的基因转移和表达的pLenti4/V5-DEST^TM、pLenti6/V5-DEST^TM和pLenti6.2/V5-GW/lacZ(Invitrogen)。在特定实施方案中，可以将本文中公开的嵌合蛋白的编码序列连接到这些表达载体中，用于在哺乳动物细胞中表达所述嵌合蛋白。表达载体中存在的“控制元件”或“调控序列”是所述载体中的非翻译区——复制原点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)、内含子、多腺苷化序列、5'和3'非翻译区，它们与宿主细胞蛋白相互作用以执行转录和翻译。这些元件的强度和特异性可变。取决于所使用的载体系统和宿主，可以使用任何适合的转录和翻译元件，包括遍在启动子和可诱导启动子。

载体

在特定实施方案中，将细胞(例如免疫效应细胞，例如T细胞)用编码CAR的反转录病毒载体例如γ-反转录病毒或慢病毒载体转导。例如，将免疫效应细胞用编码CAR的载体转导，所述CAR包含抗gp350/gp220抗体或结合gp350和/或gp220多肽的抗原结合片段以及跨膜和细胞内信号传导结构域，使得这些被转导的细胞可以引发CAR介导的细胞毒性应答。

反转录病毒是用于基因递送的常用工具。在特定实施方案中，使用反转录病毒将编码CAR的多核苷酸递送到细胞。当在本文中使用时，术语“反转录病毒”是指将其基因组RNA反转录成线性双链DNA拷贝，随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中的RNA病毒。一旦所述病毒被整合到宿主基因组中之后，它被称为“前病毒”。所述前病毒充当模板用于RNA聚合酶II，并指导编码结构蛋白和产生新病毒粒子所需的酶的RNA的表达。

适合用于特定实施方案中的说明性反转录病毒包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒(M-MuLV)，莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)，哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)，鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)，长臂猿白血病病毒(GaLV)，猫白血病病毒(FLV)，泡沫病毒，Friend鼠白血病病毒，鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)以及慢病毒。

当在本文中使用时，术语“慢病毒”是指一类(或属)复杂的反转录病毒。说明性的慢病毒包括但不限于：HIV(人免疫缺陷病毒；包括1型HIV和2型HIV)；visna-maedi病毒(VMV)；山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一个实施方案中，基于HIV的载体骨架(即HIV顺式作用序列元件)是优选的。在特定实施方案中，慢病毒被用于将包含CAR的多核苷酸递送到细胞。

术语“载体”在本文中用于指称能够转移或转运另一个核酸分子的核酸分子。所述被转移的核酸通常被连接到所述载体核酸分子，例如插入到所述载体核酸分子中。载体可能包括在细胞中指导自主复制的序列，或者可能包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如DNA质粒或RNA质粒)、转座子、细菌人工染色体和病毒载体。有用的表达载体包括例如复制缺陷型反转录病毒和慢病毒。

正如对本领域技术人员而言很显然的，术语“表达载体”被广泛用于指称核酸分子(例如转移质粒)，其包括源自于病毒的核酸元件，所述元件通常促进所述核酸分子的转移或整合到细胞的基因组中，或者指称介导核酸转移的病毒粒子。病毒粒子通常包括各种不同的病毒组分，并且有时除了核酸之外还包括宿主细胞的组分。

术语表达载体可以是指能够将核酸转移到细胞中的病毒或病毒粒子，或者是指所述被转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要源自于病毒的结构和/或功能遗传元件。术语“反转录病毒载体”是指含有主要源自于反转录病毒的结构和功能遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。

因此，在优选实施方案中，本发明涉及一种用编码CAR的表达载体转染细胞的方法。例如，在某些实施方案中，所述载体包含另外的序列，例如促进所述CAR的表达的序列如启动子、增强子、poly-A信号和/或一个或多个内含子。在优选实施方案中，所述CAR编码序列两侧具有转座子序列，使得转座酶的存在允许将所述编码序列整合到被转染细胞的基因组中。

在某些实施方案中，将所述遗传转化的细胞进一步用促进CAR编码序列整合到被转染细胞的基因组中的转座酶进行转染。在某些实施方案中，所述转座酶被提供为DNA表达载体。然而，在优选实施方案中，所述转座酶被提供为可表达的RNA或蛋白质，使得在转基因细胞中不发生所述转座酶的长期表达。例如，在某些实施方案中，所述转座酶被提供为mRNA(例如包含帽子和poly-A尾的mRNA)。根据本发明的实施方案，可以使用任何转座酶系统。然而，在某些实施方案中，所述转座酶是鲑鱼型Tel样转座酶(SB)。例如，所述转座酶可以是所谓的“睡美人”转座酶，参见例如通过引用并入本文的第6,489,458号美国专利。在某些实施方案中，所述转座酶是工程化改造的具有提高的酶活性的酶。转座酶的一些具体实例包括但不限于SB 10、SB 11或SB 100X转座酶(参见例如Mates等，2009,Nat Genet.41(6):753-61或US9228180，通过引用并入本文)。例如，方法可以包括用编码SB 10、SB 11或SB 100X转座酶的mRNA对细胞进行电穿孔。

本发明的另一方面涉及一种遗传修饰的免疫细胞，其包含本文中所描述的核酸分子或载体和/或表达本文中所描述的CAR。

本发明的另一方面涉及一种包含本文中所描述的核酸分子的载体，优选为病毒载体，更优选为γ反转录病毒载体。在本发明的另一方面，本发明涉及一种转座子载体，优选为睡美人载体，其编码并优选地能够表达本发明的CAR。

在优选实施方案中，使用“睡美人”转座子系统、特别是睡美人转座酶，将旨在用于在本文中提到的疾病的治疗中施用的免疫细胞用编码并表达本文中描述的CAR的本文中描述的核酸进行遗传修饰。所述睡美人转座子系统是一种合成的DNA转座子，其被设计用于将精确限定的DNA序列引入到脊椎动物的染色体中，在本发明的情形中用于修饰免疫细胞以表达本文中描述的CAR的目的。所述睡美人转座子组合了病毒和裸露DNA的优点。病毒已在它们感染新宿主细胞并在其中复制的能力的基础上进行了进化选择。同时，细胞已进化出重要的分子防御机制来保护自己免受病毒感染。出于社会和法规原因，避免使用病毒也是重要的。因此，非病毒载体例如睡美人系统的使用避免了细胞用于对抗载体的许多但不是所有的防御。因此，睡美人系统能够对免疫细胞进行特别有效和安全的遗传修饰，用于施用到患者。

序列变体：

所述的核酸、蛋白质、抗体、抗体片段和/或CAR的维持了与本发明相似的结合性质的序列变体，例如那些由百分序列一致性定义的序列变体，也包括在本发明的范围之内。这些显示出可选序列，但基本上维持与所提供的特定序列相同的结合性质例如靶特异性的变体，被称为功能类似物或功能上类似。序列一致性是指在进行序列比对时一致的核苷酸或氨基酸的百分率。

当在本文中使用时，叙述“序列一致性”是指在比较窗口内，序列在逐个核苷酸的基础上或在逐个氨基酸的基础上一致的程度。因此，“序列一致性的百分率”可以如下计算：在比较窗口内比较两个最佳对齐的序列，确定在两个序列中出现一致的核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或一致的氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目以得到匹配位置的数目，用所述匹配位置的数目除以所述比较窗口中的位置总数(即窗口尺寸)并将结果乘以100，得到序列一致性的百分率。包括了与本文中描述的任何参比序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列一致性的核苷酸和多肽，通常其中所述多肽变体维持所述参比多肽的至少一种生物活性。

本领域普通技术人员将会认识到，作为遗传密码简并性的结果，存在许多编码本文中描述的多肽的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何本源基因的核苷酸序列具有极小的同源性或序列一致性。然而，本发明特别设想了由于密码子用法的差异而不同的多核苷酸。落于所描述的序列一致性之下序列缺失、替换和其他变化，也被涵盖在本发明中。

可能通过替换而发生的蛋白质序列修饰，也包括在本发明的范围之内。本文中所定义的替换是对蛋白质的氨基酸序列做出的修饰，其中一个或多个氨基酸被相同数量的(不同)氨基酸代替，产生含有与所述原始蛋白质不同的氨基酸序列的蛋白质。可以进行优选地不显著改变所述蛋白质的功能的替换。与添加相似，替换可以是天然的或人工的。在本领域中公知可以在不显著改变蛋白质功能的情况下做出氨基酸替换。在所述修饰涉及“保守”氨基酸替换，即将一个氨基酸用性质相似的另一个氨基酸替换时，情况尤为如此。这些“保守”氨基酸可以是天然的或合成的氨基酸，其由于尺寸、电荷、极性和构象，可以被替换而不显著影响所述蛋白质的结构和功能。通常，许多氨基酸可以被保守氨基酸替换，而对蛋白质功能没有不利影响。

通常，非极性氨基酸Gly、Ala、Val、Ile和Leu，非极性芳香族氨基酸Phe、Trp和Tyr，中性极性氨基酸Ser、Thr、Cys、Gln、Asn和Met，带正电荷的氨基酸Lys、Arg和His，带负电荷的氨基酸Asp和Glu，代表了保守氨基酸的组。这个名单不是穷举性的。例如，众所周知，Ala、Gly、Ser以及有时Cys可以彼此替换，尽管它们属于不同的组。

替换变体从抗体分子中移除了至少一个氨基酸残基，并将不同的残基插入到它的位置中。对替换突变而言最感兴趣的位点包括超变区，但也设想了FR改变。如果这些替换导致生物活性的改变，则可以引入在下表中被命名为“示例性替换”或者如下文参考氨基酸类别进一步描述的更加实质性的改变，并对产物进行筛选。

可能的氨基酸替换：

抗体生物学性质的实质性修饰，通过选择在对维持下述特点的影响方面差异显著的替换来实现：(a)替换区域中多肽骨架的结构，例如作为片层或螺旋构象，(b)分子在靶位点处的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。

保守氨基酸替换不限于天然存在的氨基酸，而是还包括合成的氨基酸。常用的合成氨基酸是作为中性非极性类似物的各种不同链长的ω-氨基酸和环己基丙氨酸，作为中性非极性类似物的瓜氨酸和甲硫氨酸亚砜，作为芳香族中性类似物的苯甘氨酸，作为带负电荷的类似物的磺基丙氨酸，以及作为带正电荷的氨基酸类似物的鸟氨酸。与天然存在的氨基酸一样，这个名单不是穷举性的，而仅仅是本领域中公知的替换的示例。

遗传修饰的细胞和免疫细胞

在特定实施方案中，本发明设想了被遗传修饰以表达本文中设想的CAR的细胞，用于治疗B细胞相关病症。当在本文中使用时，术语“遗传工程改造的”或“遗传修饰的”是指将采取DNA或RNA形式的额外的遗传材料添加到细胞中的总遗传材料中。术语“遗传修饰的细胞”“修饰细胞”和“重新定向细胞”可互换使用。当在本文中使用时，术语“基因疗法”是指将采取DNA或RNA形式的额外的遗传材料引入到细胞中的总遗传材料中，其恢复、校正或改变基因的表达，或用于表达治疗性多肽例如CAR的目的。在特定实施方案中，本文中设想的CAR被引入和表达在免疫效应细胞中，以便将它们的特异性重新导向感兴趣的靶抗原。

“免疫细胞”或“免疫效应细胞”是具有一种或多种效应子功能(例如细胞毒性细胞灭杀活性、细胞因子的分泌、ADCC和/或CDC的诱导)的免疫系统的任何细胞。

本发明的免疫效应细胞可以是自体的(“自身的”)或非自体的(“非自身的”，例如同种异体、同系或异种的)。当在本文中使用时，“自体的”是指来自于同一对象的细胞，并代表了本发明的优选实施方案。当在本文中使用时，“同种异体的”是指与被比较的细胞在遗传上不同的同一物种的细胞。当在本文中使用时，“同系的”是指与被比较的细胞在遗传上一致的不同个体的细胞。当在本文中使用时，“异种的”是指与被比较的细胞不同物种的细胞。在优选实施方案中，本发明的细胞是自体或同种异体的。

与本文中设想的CAR一起使用的说明性免疫效应细胞包括T淋巴细胞。术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域已知的，并旨在包括胸腺细胞、不成熟的T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)或活化的T淋巴细胞。细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞通常是CD3和CD56阳性、非主要组织相容性复合体(MHC)限制的自然杀伤细胞(NK)样T淋巴细胞。T细胞可以是T辅助细胞(Th；CD4⁺T细胞)，例如T辅助细胞1(Th1)或T辅助细胞2(Th2)。T细胞可以是细胞毒性T细胞(CTL；CD8⁺T细胞)、CD4⁺CD8⁺T细胞、CD4 CD8T细胞或T细胞的任何其他亚类。适用于特定实施方案的T细胞的其他说明性群体包括幼稚T细胞和记忆T细胞。

例如，在自体细胞移植后重新导回到患者时，用本文中描述的本发明的CAR修饰的细胞可以识别并杀死肿瘤细胞。CIK细胞与其他T细胞相比可能具有增强的细胞毒性活性，因此代表了本发明的免疫细胞的优选实施方案。

正如技术人员应当理解的，其他细胞也可作为免疫效应细胞与本文中描述的CAR一起使用。具体而言，免疫效应细胞还包括NK细胞、NKT细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。免疫效应细胞还包括效应细胞的祖细胞，其中这些祖细胞可以在体内或体外被诱导以分化成免疫效应细胞。

本发明提供了用于制备表达本文中设想的CAR的免疫效应细胞的方法。在一个实施方案中，所述方法包括转染或转导从个体分离的免疫效应细胞，使得所述免疫效应细胞表达本文中所描述的一种或多种CAR。在某些实施方案中，所述免疫效应细胞从个体分离并被遗传修饰，在体外没有进一步操作。然后可以将这样的细胞直接重新施用到所述个体。在其他实施方案中，首先将所述免疫效应细胞在体外激活和刺激以便增殖，然后进行遗传修饰以表达CAR。就此而言，在进行遗传修饰(即转导或转染以表达本文中设想的CAR)之前和/或之后，可以对所述免疫效应细胞进行培养。

在特定实施方案中，在本文中描述的免疫效应细胞的体外操作或遗传修饰之前，从对象获得细胞来源。在特定实施方案中，所述CAR修饰的免疫效应细胞包括T细胞。T细胞可以从大量来源获得，包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自于感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在某些实施方案中，T细胞可以使用技术人员已知的任何技术从采自对象的血液单位获得，所述技术例如沉降如FICOLL^TM分离、基于抗体偶联的珠子的方法例如MACS^TM分离(Miltenyi)。在一个实施方案中，来自于个体的循环血的细胞通过单采法获得。所述单采产物通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方案中，可以清洗所述通过单采法收集的细胞以除去血浆级分，并将所述细胞放置在适合的缓冲液或介质中用于后续加工。所述细胞可以用PBS或缺少钙、镁和大多数(如果不是所有的话)其他二价阳离子的另一种适合的溶液清洗。正如本领域普通技术人员将会认识到的，清洗步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来实现，例如通过使用半自动直流离心机，例如Cobe2991细胞处理机、Baxter CytoMate等。在清洗后，可以将所述细胞重悬浮在各种不同的生物相容的缓冲液或含有或不含缓冲剂的其他盐水溶液中。在某些实施方案中，所述单采样品的不想要的组分可以通过将所述细胞直接重悬浮在培养基中来除去。

在某些实施方案中，T细胞从外周血单核细胞(PBMC)，通过裂解红细胞并剥夺单核细胞，例如通过经PERCOLL^TM梯度离心来分离。T细胞的特定亚群可以通过正或负选择技术进一步分离。本文中使用的一种方法是通过负磁性免疫附着的细胞分拣和/或选择，或使用针对负选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物的流式细胞术。

可以使用本文中设想的方法将PBMC直接遗传修饰以表达CAR。在某些实施方案中，在分离PBMC后，进一步分离T淋巴细胞，并且在某些实施方案中，可以在遗传修饰和/或扩增之前或之后将细胞毒性和辅助性T淋巴细胞两者分拣成幼稚、记忆和效应T细胞亚群。CD8⁺细胞可以使用标准方法获得。在某些实施方案中，可以通过识别与每种类型的CD8⁺细胞相关的细胞表面抗原，将CD8⁺细胞进一步分拣成幼稚、中心记忆和效应细胞。

所述免疫效应细胞例如T细胞在分离后可以使用已知方法进行遗传修饰，或者在进行遗传修饰之前可以将所述免疫效应细胞在体外激活并扩增(或者在祖细胞的情况下分化)。在特定实施方案中，将所述免疫效应细胞例如T细胞用本文中设想的嵌合抗原受体遗传修饰(例如用包含编码CAR的核酸的病毒载体转导)，然后在体外激活并扩增。在各种不同实施方案中，可以在遗传修饰以表达CAR之前或之后将T细胞激活并扩增，这使用例如在美国专利6,352,694、6,534,055、6,905,680、6,692,964、5,858,358、6,887,466、6,905,681、7,144,575、7,067,318、7,172,869、7,232,566、7,175,843、5,883,223、6,905,874、6,797,514、6,867,041和第20060121005号美国专利申请公开中所描述的方法。

在另一个实施方案中，在对免疫效应细胞的供体群体进行遗传修饰中，可以使用例如1、2、3、4、5种或更多种不同表达载体的混合物，其中每种载体编码本文中设想的不同的嵌合抗原受体蛋白。得到的修饰的免疫效应细胞形成修饰细胞的混合群体，其中一部分修饰细胞表达超过一种不同的CAR蛋白。

在一个实施方案中，本发明提供了一种遗传修饰的表达鼠类、人类或人源化CAR蛋白的靶向疱疹病毒蛋白的免疫效应细胞的储存方法，所述方法包括将所述免疫效应细胞冷冻保存，使得所述细胞在融化后仍然存活。可以将所述表达CAR蛋白的免疫效应细胞的一部分通过本领域中已知的方法冷冻保存，以提供此类细胞的永久性来源，用于将来治疗患有B细胞相关病症的患者。在需要时，可以将所述冷冻保存的转化的免疫效应细胞融化、生长并扩增，以获得更多此类细胞。

在一个实施方案中，所述免疫细胞优选地选自T淋巴细胞或NK细胞，更优选为细胞毒性T淋巴细胞。

在优选实施方案中，包含本文中所描述的核酸分子或载体和/或表达本文中所描述的CAR的遗传修饰的免疫细胞的特征在于它是CD4⁺和/或CD8⁺T细胞，优选为CD4⁺和CD8⁺T细胞的混合物。这些T细胞群体以及优选地包含CD4⁺和CD8⁺转化细胞两者的组合物，针对各种不同的恶性B细胞例如B-NHL，优选地针对本文中描述的细胞和/或相关医学病症，显示出特别有效的细胞裂解活性。

在优选实施方案中，包含本文中所描述的核酸分子或载体和/或表达本文中所描述的CAR的遗传修饰的免疫细胞是CD4⁺和CD8⁺T细胞，优选地以1:10至10:1的比例，更优选地以5:1至1:5、2:1至1:2或1:1的比例。表达本文中描述的CAR的采取所提到的比例、优选为1:1的CD4⁺/CD8⁺比例的修饰的CAR-T细胞的施用，在本文中提到的疾病的治疗期间导致有益的特征，例如这些比例导致改进的治疗应答和降低的毒性。

组合物和剂型

本文中设想的组合物可以包含本文中设想的一种或多种多肽、多核苷酸、包含它们的载体、遗传修饰的免疫效应细胞等。组合物包括但不限于药物组合物。“药物组合物”是指配制在可药用或生理上可接受的溶液中，用于单独地或与一种或多种其他治疗方式相组合施用到细胞或动物的组合物。还应该理解，如果需要，本发明的组合物也可以与其他药剂例如细胞因子、生长因子、激素、小分子、化学治疗剂、前体药物、药物、抗体或其他各种不同的药物活性剂相组合施用。对也可以包括在所述组合物中的其他组分事实上没有限制，前提是所述另外的药剂对所述组合物递送目标疗法的能力没有不利影响。

短语“可药用”在本文中用于指称那些在健全的医学判断范围内适合与人类和动物的组织接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。

当在本文中使用时，“可药用载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于已被美国食品药品监督管理局(United States Food and Drug Administration)批准可接受用于人类或驯养动物的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、表面活性剂或乳化剂。示例性的可药用载体包括但不限于糖类例如乳糖、葡萄糖和蔗糖，淀粉例如玉米淀粉和马铃薯淀粉，纤维素及其衍生物例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯，黄耆胶，麦芽，明胶，滑石，可可脂，蜡，动物和植物脂肪，石蜡，硅酮，膨润土，硅酸，氧化锌，油类例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油，二醇类例如丙二醇，多元醇例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇，酯类例如油酸乙酯和月桂酸乙酯，琼脂，缓冲剂例如氢氧化镁和氢氧化铝，藻酸，无热原水，等渗盐水，林格氏溶液，乙醇，磷酸盐缓冲溶液，以及用于药物剂型的任何其他相容物质。

在特定实施方案中，本发明的组合物包含一定量的本文中设想的表达CAR的免疫效应细胞。当在本文中使用时，术语“量”是指遗传修饰的治疗性细胞例如T细胞的有效实现有益或所需预防或治疗结果、包括临床结果的量或有效量。

“预防有效量”是指遗传修饰的治疗性细胞有效实现所需预防结果的量。通常但不是必定的，由于预防性药剂在疾病之前或疾病的较早阶段在对象中使用，因此所述预防有效量低于治疗有效量。术语预防不必定是指特定医学障碍的完全抑制或阻止。术语预防也指某些医学障碍的症状出现或恶化的风险的降低。

遗传修饰的治疗性细胞的“治疗有效量”可以随着多种因素而变，例如疾病状态、个体的年龄、性别和体重以及干细胞和祖细胞在所述个体中引发所需应答的能力。治疗有效量也是所述病毒或转导的治疗性细胞的治疗有益效应胜过任何有毒或有害效应的量。术语“治疗有效量”包括有效“治疗”对象(例如患者)的量。当指示治疗量时，本发明的组合物的待施用的精确量，可以由医师考虑所述患者(对象)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异来确定。

一般地，包含本文中描述的免疫细胞(T细胞)的药物组合物可以以10²至10¹⁰个细胞/kg体重、优选地10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量施用，包括这些范围内的所有整数值。细胞的数目取决于所述组合物旨在用于的最终用途以及其中包括的细胞的类型。对于本文中提供的用途而言，所述细胞通常在1升以下的体积中，可以是500mL以下，甚至250mL或100mL以下。因此，所需细胞的密度通常大于10⁶个细胞/ml，并且通常大于10⁷个细胞/ml，通常为10⁸个细胞/ml或更高。可以将所述临床相关的免疫细胞数目分摊到多次输注中，其累计等于或超过10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²个细胞。在本发明的某些方面，特别是由于所有输注的细胞被重新导向特定靶抗原，因此可以施用较低的细胞数目。表达CAR的细胞组合物可以以这些范围内的剂量多次施用。对于经历治疗的患者而言，所述细胞可以是同种异体的、同系的、异种的或自体的。

通常，包含如本文中所述激活和扩增的细胞的组合物，可用于治疗和预防在免疫受损的个体中发生的疾病。具体而言，包含本文中设想的CAR修饰的T细胞的组合物被用于治疗B细胞恶性肿瘤。本发明的CAR修饰的T细胞可以单独地或与载体、稀释剂、赋形剂和/或与其他组分例如IL-2或其他细胞因子或细胞群体相组合作为组合物施用。在特定实施方案中，本文中设想的药物组合物包含与一种或多种可药用或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂相组合的一定量的遗传修饰的T细胞。

包含表达CAR的免疫效应细胞群体例如T细胞的本发明的药物组合物可以包含缓冲剂例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等，糖类例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇，蛋白质，多肽或氨基酸例如甘氨酸，抗氧化剂，螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽，佐剂(例如氢氧化铝)，以及防腐剂。本发明的组合物优选被配制成用于肠胃外施用，例如血管内(静脉内或动脉内)、腹膜内或肌肉内施用。

液体药物组合物，不论是溶液、悬液还是其他类似形式，可以包括下述一种或多种：无菌稀释剂例如注射用水，盐水溶液、优选为生理盐水，林格氏溶液，等渗氯化钠，不挥发油例如可充当溶剂或悬浮介质的合成的甘油单酯或甘油二酯，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其他溶剂；抗细菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节渗涨度的试剂例如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以装入玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。注射用药物组合物优选是无菌的。

在特定实施方案中，本文中设想的组合物包含单独的或与一种或多种治疗剂相组合的有效量的表达CAR的免疫效应细胞。因此，所述表达CAR的免疫效应细胞组合物可以单独地或与其他已知的癌症治疗例如放疗、化疗、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等相组合施用。所述组合物也可以与抗生素相组合施用。这些治疗剂可能在本领域中被接受作为用于本文中描述的特定疾病状态例如特定癌症的标准治疗。所设想的示例性治疗剂包括细胞因子、生长因子、甾类、NSAID、DMARD、抗炎药剂、化疗药剂、放疗药剂、治疗性抗体或其他活性和辅助药剂。

治疗方法

当在本文中使用时，术语“个体”和“对象”通常可互换使用，并且是指表现出可以使用本文中别处公开的基因疗法载体、基于细胞的治疗剂和方法治疗的疾病、障碍或病症的症状的任何动物。在优选实施方案中，对象包括表现出可以使用本文中公开的基于细胞的治疗剂和方法治疗的造血系统的疾病、障碍或病症例如B细胞恶性肿瘤的症状的任何动物。适合的对象包括实验室动物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和驯养动物或宠物(例如猫或狗)。非人类灵长动物和优选地人类患者，被包括在内。典型的对象包括患有B细胞恶性肿瘤、已被诊断为患有B细胞恶性肿瘤或处于患有B细胞恶性肿瘤的风险中的人类患者。

当在本文中使用时，“治疗”包括对疾病或病理状况的症状或病理的任何有益或所需效应，并且可以包括待治疗的疾病或病症的一种或多种可测量的标志物的甚至极小的减少。治疗可以任选地包括所述疾病或病症的症状的减轻或改善，或所述疾病或病症的进展的延迟。“治疗”不必定指示所述疾病或病症或其相关症状的完全根除或治愈。

当在本文中使用时，“预防”和类似词语指示阻止、抑制或降低疾病或病症发生或复发的可能性的方法。它也指延迟疾病或病症的发作或复发，或延迟疾病或病症的症状的发生或复发。当在本文中使用时，“预防”和类似词语还包括在疾病或病症发作或复发之前降低所述疾病或病症的强度、效应、症状和/或负担。

在一个实施方案中，在需要的对象中治疗疱疹病毒相关病症的方法包括施用有效量、例如治疗有效量的包含本文中设想的遗传修饰的免疫效应细胞的组合物。所述施用的量和频率由多种因素决定，例如所述患者的状况和患者疾病的类型和严重性，尽管适合的剂量可以通过临床试验确定。

本文中设想的组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄食、输注、植入或移植。在优选实施方案中，组合物被肠胃外施用。当在本文中使用时，短语“肠胃外施用”是指肠内和局部施用之外的施用方式，通常通过注射来进行，并且包括但不限于血管内、静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、肿瘤内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。在一个实施方案中，本文中设想的组合物通过直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位中施用到对象。

附图说明

本发明通过下面的附图举例说明。所述附图应当被当作为可能优选的实施方案提供进一步描述，其增强了对本发明的一个或多个非限制性实施方案的支持。

附图简述：

图1：7A1和6G4(CD28z)CAR设计以及CAR-T细胞的产生。

图2：7A1和6G4 gp350-CAR-T细胞(CD28z)识别并杀死被工程化改造以表达gp350的293T细胞系的效能。

图3：7A1-gp350-CAR-T细胞(CD28z)杀死EBV潜伏感染的B95.8细胞系的效能。

图4：含有7A1-gp350CAR-T细胞和4-1BB信号传导的设计，识别并杀死293T/gp350细胞系的效能和识别B95.8细胞系的效能。

图5：7A1-gp350CAR-T和6G4-gp350CAR-T细胞(CD28z)识别用M81-EBV-GFP永生化的自体LCL细胞系并被其激活的效能的证实。

图6：用B95.8-EBV-GFP感染并用7A1-gp350CAR-T(CD28z)治疗的人源化小鼠。

图7：用7A1-gp350CAR-T(CD28z)预先治疗并用EBV-B95.8-fLuc感染的人源化小鼠。

图8：产生的和测试的本发明的CAR构建物的概述。

图9：用分拣的CAR+CD8⁺或CAR+CD4⁺/CD8⁺7A1-gp350CAR-T(CD28z)预先治疗并用EBV-M81/fLuc2毒株感染的人源化NRG小鼠。

图10：用EBV-M81/fLuc2感染并用分拣的CD8⁺7A1-gp350CAR-T(CD28z)治疗的人源化小鼠。

附图详述：

图1：7A1和6G4(CD28z)CAR设计以及CAR-T细胞的产生。

A.在感染Raji细胞之前将7A1和6G4单克隆抗体稀释到不同剂量(ng)并与EBV-GFP病毒温育。中和活性被显示为GFP⁺感染的细胞的检测的减低。B.含有CD28z信号传导结构域并识别EBV-gp350(7A1或6G4)的CAR构建物的示意图。作为同源阴性对照，我们使用识别HCMV-gB(gB)的CAR构建物。在另外的附页(图1(续))上示出了使用Pml1、Cla1和BamHI的限制性消化，确认了含有CAR的反转录病毒构建物的结构。C.本文中用于将CAR反转录病毒基因转移到成人外周血或脐带血T细胞中的常用方法的概述。D.左图：用于检测细胞表面上的CAR的流式细胞术分析的代表性实例。CAR用针对构建物中并入的IgF4铰链的AF647或AF488偶联的山羊抗人IgG-Fc Fab-片段(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA)来检测。右图：在用成人外周血T细胞产生的CD4⁺-和CD8⁺-CAR-T细胞上gp350CAR(7A1，n＝7；6G4，n＝6)相对于gBCAR(n＝4)表达的检测。E.在用来自于5位不同供体的脐带血T细胞产生的CD4⁺-和CD8⁺-CAR-T细胞上gp350CAR(7A1)表达的检测。

A.293T野生型细胞上gp350⁺表达的流式细胞术分析(灰色)与用表达gp350的慢病毒载体转导的293T细胞的分析(黑色)的比较。表面gp350使用小鼠抗体72A1和山羊抗小鼠IgG抗体AF647来检测。B.实验方案：将293T或293T/gp350细胞接种在板上，并在一天后添加CAR-T细胞。在共培养24h和48h后，进行ELISA和FACS分析。C.细胞上清液中的IFN-γ检测，显示出7A1和6G4 gp350CAR-T细胞两者在较低(1:1)和较高(3:1)效应细胞与靶细胞比例两者下针对293T/gp350的高特异性，而阴性对照gBCAR-T细胞不识别293T/gp350靶。这些测定法使用平行运行的三份培养物进行一次。统计分析使用双向ANOVA和Bonferroni事后检验来进行。***指示p<0.001。D.为了检测死的293T/gp350靶细胞，在流式细胞术分析之前向细胞添加可固定的存活性染料(FVD)e450(eBioscience^TM)，允许在活的和死的细胞之间做出鉴别。左侧的图示出了引起高频率293T-gp350死细胞的7A1和6G4 gp350CAR-T细胞的代表性实例，而gBCAR-T细胞不促进细胞死亡。右侧的图描绘了共培养24h和48h后的定量细胞死亡，显示出在较高的效应细胞与靶细胞比率(3:1)下较高的灭杀效果。E.通过流式细胞术定量T细胞相对于靶细胞的频率，示出了在E:T 3:1下7A1和6G4 gp350 CAR-T细胞相比于gB-CAR-T细胞的偏好性扩增。F.293T/gp350靶细胞上gp350表达的分析，示出了以E:T 3:1与7A1和6G4 gp350 CAR-T细胞共培养引起抗原性损失，即gp350⁺靶的负选择。

A.潜伏感染的B95.8棉头狷猴细胞系的子群体(6％左右)上gp350⁺的表达的流式细胞术分析。表面gp350用小鼠抗体72A1和山羊抗小鼠IgG抗体AF647检测。B.实验方案：将B95.8细胞接种在板上，并在不久后以不同的E:T比例添加CAR-T细胞。在共培养36-48和86-96h后，进行ELISA和FACS分析。这些分析代表了来自于使用一个供体的4个独立实验的合并数据。C.细胞上清液中IFN-γ的检测，示出了7A1-gp350CAR-T细胞对B95.8细胞的高反应性，而gBCAR-T对照细胞在较高(1:1和10:1)的效应细胞与靶细胞比率下具有无到低的反应性，而阴性对照gBCAR-T细胞不识别B95.8靶。这些测定法对于10:1和1:1的比例而言进行12次，并且对0.1:1的比例而言进行9次。统计分析使用双向ANOVA和Bonferroni事后检验来进行。*指示p<0.05，并且***指示p<0.001。D.在共培养之前将CAR-T细胞用增殖染料CellTrace(Thermo Fisher)标记。通过流式细胞术分析显示，在86h的共培养(E:T比例为10:1)后，7A1-gp350CAR-T细胞显示出染料的缺失和三个增殖波，而gB-CAR-T细胞显示出标记染料的很少缺失。来自于四个实验的代表性结果。E.为了检测死的B95.8细胞，在流式细胞术分析之前向细胞添加可固定的存活性染料(FVD)e450(eBioscience^TM)，允许在活的和死的细胞之间做出鉴别。左侧的图示出了引起高频率293T-gp350死细胞的7A1-gp350CAR-T细胞的代表性实例，但gBCAR-T细胞不促进细胞死亡。右侧的图描绘了在较短和较长期的共培养后的定量细胞死亡，显示出在较高的效应细胞与靶细胞比率(10:1)下较高的灭杀效果。F.共培养后获得的细胞中EBV DNA的定量通过机构内部的PCR方法，通过qRT-PCR检测编码EBV BALF5的DNA序列来进行。在与7A1 CART细胞共培养86h后观察到EBV拷贝数的降低。G.B95.8细胞上gp350表达的分析在共培养36-48h和86-96h后通过流式细胞术来测量，显示出与gBCAR-T细胞相比，在与7A1-gp350CAR-T细胞共培养后gp350表达的缺失。这些测定法对于10:1和1:1的比例而言进行4次，并且对于0.1:1的比例而言进行3次。统计分析使用双向ANOVA和Bonferroni事后检验来进行。*指示p<0.05。

图4:含有7A1-gp350CAR-T细胞和4-1BB信号传导的设计，识别并杀死293T/gp350细胞系的效能和识别B95.8细胞系的效能。

A.含有4-1BB信号传导结构域并识别EBV-gp350(7A1)的CAR构建物的示意图。作为同源阴性对照，我们使用了识别HCMV-gB(gB)的CAR构建物。B.用于检测使用成人外周血T细胞生产的CD4⁺-和CD8⁺-CAR-T细胞的细胞表面上的4-1BB CAR的流式细胞术分析。CAR使用针对并入到所述构建物中的IgF4铰链的山羊抗人IgG-Fc Fab-片段来检测。C.实验方案：将293T相比于293T/gp350或B95.8细胞接种在板上并添加CAR-T细胞。在共培养48h后，进行ELISA和FACS分析。D.细胞上清液中的IFN-γ检测显示出在较高(3:1、10:1)效应细胞与靶细胞比例下7A1-gp350CAR-T-41BB细胞针对293T/gp350的特异性，而阴性对照gBCAR-T细胞对293T/gp350靶是非特异性的。D.共培养48h后的定量细胞死亡，显示出7A1-gp350CAR-T-41BB仅在中等的效应细胞与靶细胞比例(3:1)下具有特异性灭杀效果。F.细胞上清液中的IFN-γ检测显示出在较低(1:1、3:1)效应细胞与靶细胞比例下7A1-gp350CAR-T-41BB细胞针对B95.8细胞的特异性。

A.在用M81 EBV将B细胞永生化后获得的潜伏感染的LCL的子群体(26-30％左右)上gp350⁺表达的流式细胞术分子。表面gp350可以将抗体7A1或6G4作为第一抗体用于染色来检测。B.实验方案：将LCL细胞接种在板上，并在不久后以不同的E:T比例添加自体CAR-T细胞。在共培养86h后，进行ELISA和FACS分析。这些分析代表了来自于两个独立实验的合并数据。C.在共培养86h后在上清液中检测到的IFN-γ释放显示出7A1和6G4-CAR-T的T细胞活化，与此相反gBCAR-T细胞显示出零至不良的活化。这些测定法对于10:1和1:1的比例而言进行6次，并且对于3:1和0.1:1的比例而言进行3次。统计分析使用双向ANOVA和Bonferroni事后检验来进行。*指示p<0.05，并且***指示p<0.001。D.在共培养之前将CAR-T细胞用增殖染料CellTrace(Thermo Fisher)标记。通过流式细胞术进行的分析显示，在共培养86h后(E:T比例为1:1或10:1)，与6G4-gp350CAR-T和gB-CAR-T细胞相比，CD4⁺和CD8⁺7A1-gp350CAR-T细胞显示出最高水平的染料缺失。E.LCL上gp350表达的分析在共培养86h后通过流式细胞术进行测量，显示出与gB-CAR-T细胞相比，在与7A1-gp350CAR-T和6G4-gp350CAR-T共培养后gp350表达缺失。

A.实验方案：将Nod-Rag^-/-Il2 cR^-/-(NRG)小鼠辐照并用从脐带血分离的CD34⁺细胞移植。16周后，将小鼠用EBV-B95.8/GFP(10⁵GRU i.v.)i.v.感染。在感染后5周，将从同一脐带血供体产生的5×10⁶个7A1-gp350CAR-T细胞输注到2只小鼠中，并将3只小鼠维持为未处理对照。在CAR-T细胞施用后4周，将小鼠处死以用于分析。可以在一只CAR-T和一只对照动物的脾脏中检测到肿瘤。B.每周进行流式细胞术分析，用于检测外周血中的CAR⁺CD45⁺/CD3⁺和CD45⁺/CD3⁺/CD8细胞。在输注后2周CAR-T细胞的检测最高，随后降低直至4周。C.在安乐死后进行流式细胞术分析，用于检测脾脏和肿瘤中的CAR⁺CD45⁺/CD3⁺和CD45⁺/CD3⁺/CD8细胞。在脾脏和肿瘤组织中，可以检测到范围为1.5％-2.5％T细胞的CAR-T细胞(主要是CD8⁺T细胞)。D.将从脾脏和肿瘤组织分离的DNA通过RT-qPCR进行分析。只能在从对照小鼠获得的肿瘤中但不能从CAR-T治疗的小鼠获得的肿瘤中检测到高水平的EBV DNA。E.将肿瘤切片通过EBER原位杂交进行分析，证实了在从CAR-T治疗的小鼠获得的肿瘤中稀少到罕见的EBER染色以及在从对照小鼠获得的肿瘤中频繁的EBER染色。

A.实验方案：将Nod-Rag^-/-Il2 cR^-/-(NRG)小鼠辐照并用从脐带血分离的CD34⁺细胞移植。25周后，在一只小鼠中输注从同一脐带血供体产生的5×10⁶个7A1-gp350CAR-T细胞。一天后，将一只CAR-T和一只对照小鼠用EBV-B95.8/fLUC(10⁵GRU i.v.)i.v.感染。在感染后6周，将小鼠处死以用于分析。B.顺序生物发光光学成像分析显示，在EBV激惹后4周和6周时，相对于对照小鼠，在CAR-T预先治疗的小鼠中EBV-fLuc感染和扩散较低。C.在EBV感染后2周至6周，脾脏区域中生物发光信号的纵向分析。D.在终点分析时在肝脏和唾液腺区域中检测到的生物发光信号。E.外周血中CAR-T细胞的检测的纵向分析显示，在施用后1周存在3％CD45⁺/CD3⁺/CAR⁺和1.5％CD45⁺/CD3⁺/CD8⁺/CAR⁺细胞，但随时间减少。F.在终点分析时，CD4⁺CAR-T细胞可以在骨髓中检测到，并且CD8⁺CAR-T细胞可以在脾脏中检测到。

图8：产生和测试的本发明的CAR构建物的概述。

提供了由本发明人产生的各种不同构建物的概述。所有CAR构建物中的大部分在慢病毒和反转录病毒载体两者中产生并表达。对于构建物#1、3、9、11而言，CAR-T生产已经完成。对于构建物#1和3而言，在293T和B95.8共培养设置(如上所述)下的实验已经完成，并且上面提到的体内实验使用构建物#3进行。正在进行另外的实验，以证实其余构建物的所需功能效力。

图9：用分拣的CAR⁺CD8⁺或CAR⁺CD4⁺/CD8⁺7A1-gp350CAR-T(CD28z)预先治疗并用EBV-M81/fLuc2毒株感染的人源化NRG小鼠。

A.实验方案：将Nod-Rag^-/-IL2γcR^-/-(NRG)小鼠辐照并用从脐带血分离的CD34⁺细胞移植。17周后，将人源化小鼠用PBS施用并充当对照(CTR，n＝3)，或用2×10⁶个FACS分拣的CAR⁺/CD8⁺(n＝3)或CAR⁺/CD4⁺/CD8⁺7A1-gp350CAR-T细胞(n＝4)i.v.输注。流式细胞术点状图示出了在分拣之前和之后CAR⁺和CD8⁺或CD4⁺T细胞群体的示例性结果。在T细胞施用后一天，将所有小鼠用EBV-M81/fLuc2毒株感染(10⁶GRU，i.v.)。将小鼠定期放血以监测人类淋巴细胞重建的动力学，并通过光学成像分析监测EBV感染的生物分布。在EBV感染后5周将小鼠安乐死。B、C.外周血的流式细胞术分析，分别用于检测人类CD45⁺和人类CD8⁺细胞。所有小鼠用人类白细胞维持长期重建。D.上图：展示了在使用VIS SpectralCT和LiveImage并在感染后第2、3、4和5周中进行的2D生物发光分析中，在被感染的人源化小鼠的左侧视图中EBV-M81/fLuc2的萤光素酶信号。下图：在实验过程中在小鼠的整个身体中生物发光强度(通量，被表示为每秒的光子数)的定量。所述图描述了为分开的组群中的每只小鼠获得的光学成像分析的定量值以及比较三个组群的计算的合并值(对于每个分析指明了标准偏差)。数据显示，与用CD8⁺或CD4⁺/CD8⁺7A1-gp350CAR-T细胞预先治疗的小鼠相比，CTR组群中EBV感染的水平更高。E.通过qRT-PCR分析了从脾脏和骨髓样品分离的DNA。与CD8⁺(2/6)和CD4⁺/CD8⁺(4/6)CAR-T治疗的小鼠相比，在从CTR(5/6)获得的样品中更频繁地检测到EBVDNA。对于剩余的小鼠而言，PCR显示出不可检测的(n.d.)结果。F.图显示了对于每只个体小鼠而言，通过光学成像分析获得的值(全身)与用于检测脾脏和骨髓中的EBV DNA的qRT-PCR获得的值之间的相关性。在图的左下角中，在点周围画出的正方形指示用CAR-T细胞治疗的小鼠一起簇集在较低的值中，而对照小鼠的值更加分散。

A.实验方案：将Nod-Rag^-/-IL2γcR^-/-(NRG)小鼠辐照并用从脐带血分离的CD34⁺细胞移植。17周后，将小鼠用EBV-M81/fLuc2毒株(10⁶GRU，i.v.)i.v.感染。在EBV感染后3周和5周，输注从同一脐带血供体产生的FACS分拣的CAR⁺CD8⁺7A1-gp350CAR-T细胞(CD8⁺CAR，2×10⁶个细胞，i.v.，n＝7)。流式细胞术点状图示出了在分拣之前和之后CAR⁺和CD8⁺群体的示例性结果。施用PBS i.v.的EBV感染的人源化小鼠充当对照(CTR，n＝6)。将小鼠定期放血以监测人类淋巴细胞重建的动力学，并通过光学成像分析监测EBV感染的生物分布。图中的箭头描绘了CAR-T细胞施用的时间点。在EBV感染后8周将小鼠安乐死。B、C.分别用于检测外周血中的人类CD45⁺和人类CD8⁺细胞的流式细胞术分析。所有小鼠用人类白细胞维持长期重建。D.上图：在左侧视图或前视图中展示了在使用VIS SpectralCT和LiveImage并在感染后第2、3、4和5周中进行的2D生物发光分析中，EBV-M81/fLuc2感染的人源化小鼠的萤光素酶信号。下图：在实验过程中在小鼠的整个身体中生物发光强度(通量，被表示为每秒的光子数)的定量。所述图描述了为分开的组群中的每只小鼠获得的光学成像分析的定量值以及比较三个组群的计算的合并值(对于每个分析指明了标准偏差)。为第6周和8周获得的数据显示，与用CD8⁺CAR-T细胞治疗的小鼠相比，CTR组群中EBV感染的水平更高。E.通过qRT-PCR分析了从所述小鼠的脾脏、肝脏和骨髓分离的DNA。与CTR相比，对CD8⁺CAR治疗的小鼠的脾脏和骨髓可以观察到qRT-PCR信号的50％的降低。F.图显示了对于每只个体小鼠而言，通过光学成像分析获得的值(脾脏、肝脏区域或全身)与用于检测脾脏、肝脏和骨髓中的EBV DNA的qRT-PCR获得的值之间的相关性。在图的左下角中，在点周围画出的正方形指示用CAR-T细胞治疗的小鼠一起簇集在较低的值中，而对照小鼠的值更加分散。G.使用分离的器官进行了生物发光光学成像分析。与用CD8⁺CAR-T细胞治疗的小鼠(肾脏(29％)、脑(14％)和肺(29％))相比，CTR组群中的小鼠显示出更高的EBV感染发生率(肾脏(66％)、脑(33％)和肺(50％))。

实施例

本发明通过下文公开的实施例进行说明。这些实施例为本发明的潜在优选的非限制性实施方案提供技术支持和更详细的描述。

下文提出了体外临床前概念验证实验，以证实在适合的体外和体内模型中的功效。图8呈现了所产生的各种不同CAR构建物的概述。

实施例1：基于7A1和6G4的重链和轻链的氨基酸序列的功能性CAR的工程化改造。

本发明是基于在已知具有针对EBV的高的中和能力的7A1和6G4两种抗体的重链和轻链的氨基酸序列的基础上对功能性CAR进行的工程化改造。相应的DNA使用密码子优化方法商业合成。使用表达CAR并通过CD28ζ链进行信号传导的反转录病毒载体。将编码VH和VL的DNA片段亚克隆到所述反转录病毒载体骨架中，通过限制性消化来选择并通过DNA测序分析来确认克隆。图1A示出了两种抗体的中和能力。图1B提供了6G4和7A1 gp350-CAR构建物两者的反转录病毒载体图谱和相应的限制性消化物的概述。将所述质粒构建物用于293T细胞的使用磷酸钙DNA沉淀技术的转染，以产生反转录病毒载体。随后，如图1C中所示，将从外周血单核细胞(PBMC)或脐带血单核细胞(CBMC)的CD34^-级分获得的T细胞在体外用细胞因子和活化免疫珠刺激并用反转录病毒载体转导。图1D示出了使用识别IgG4铰链中的表位的抗体，通过流式细胞术分析的来自于PBMC的T细胞上的CAR表达。7A1-gp350-CAR的表达比6G4-gp350-CAR更高。图1E呈现了在脐带血来源的T细胞上达到的表达水平。

实施例2：gp350-CAR-T细胞杀死被工程化改造以表达gp350的293T细胞系的效能的证实。

图2呈现了支持7A1和6G4-gp350-CAR-T细胞杀死被工程化改造以表达gp350的293T细胞的效能的数据。为了试验gp350-CAR-T的细胞毒性效应，将CAR-T细胞与用慢病毒转导以稳定表达gp350的293T共培养(图2A)。在共培养后24h和48h进行共培养物的分析(图2B)。与对照CAR-T相比，在293T/gp350存在下6G4和甚至更显著的7A1-CAR-T分泌大量(>15ng/ml)的IFN-γ。可以观察到随时间推移的累积效应，与24h相比在48h后水平提高(图2C)。早在共培养后24h就可检测到细胞毒性效应，特别是在3:1的效应细胞与靶细胞比例下和使用7A1-CAR-T细胞时。在48h后，更低的比例也显示出与没有gp350的共培养物相比增加量的死靶细胞(图2D)。在3:1的效应细胞与靶细胞比例下，在使用gp350-CAR-T的共培养物中T细胞的相对量增加，据推测由T细胞的靶细胞杀死和增殖的协同效应引起(图2E)。此外可以观察到另一个现象。共培养后24h，我们看到在使用7A1和6G4-CAR-T细胞的培养物中对gp350阴性的293T的过低增殖，反映出强加在靶细胞上的选择压力。在与7A1-CAR-T细胞共培养48h后，这种效应甚至更加显著(图2F)。

实施例3：7A1-gp350-CAR-T细胞杀死EBV潜伏感染的B95.8棉头狷猴细胞系的效能的证实。

图3呈现了支持7A1-gp350-CAR-T细胞杀死EBV潜伏感染的细胞系的效能的数据。B95.8是一种被EBV感染并且也产生EBV病毒粒子的源自于棉头狷猴的成淋巴细胞样细胞系。对gp350的表面染色揭示出gp350的表达(图3A)。在将B95.8细胞与CAR-T细胞共培养后，在36-48小时和86-96小时后进行分析(图3B)。共培养物上清液的分析揭示出剂量依赖性的IFN-γ释放及其到较晚时间点的逐渐增加的积累(图3C)。在共培养之前用增殖染料标记所述CAR-T细胞显示出在与靶细胞共培养后gp350-CAR-T的增殖增加，而在对照CAR-T组中未能追踪到增殖(图3D)。在高的效应细胞与靶细胞比例下，在36-48小时后已经可以检测到细胞毒性效应。仅在10:1的效应细胞与靶细胞比例下，7A1-CAR-T细胞与gB-CAR-T相比显示出提高的细胞毒性效应(图3E)。分离DNA然后进行BALF4PCR以检测EBV拷贝数，揭示出与对照CAR-T组相比在gp350-CAR-T共培养物中EBV拷贝的水平降低(图3F)。然而，这种效应是由T细胞的过低增殖还是由B95.8细胞的杀死引起，仍不清楚。共培养后靶细胞上的gp350的表面染色显示出靶细胞上gp350的剂量依赖性缺失，表明gp350⁺靶细胞的杀死(图3G)。

实施例4：含有4-1BB信号传导的7A1-gp350-CAR-T识别293T/gp350和B95.8靶的证实。

图4呈现的数据支持可以在CD4⁺和CD8⁺T细胞上表达(图4B)的具有4-1BB信号传导结构域的7A1-gp350-CAR-T(图4A)在使用293T/gp350和B95.8靶的体外实验中的效能(图4C)。在3:1和10:1E:T比例下，与gBCAR-T共培养物(10-50pg/ml)中相比，在含有293T/gp350靶的gp350CAR-T细胞培养物中明显看到更高水平的IFN-γ(100-400pg/ml)(图4D)。在3:1E:T比例下观察到293T/gp350被gp350CAR-T偏好性灭杀(图4E)。B95.8细胞与gp350CAR-T细胞的共培养在所试验的所有E:T比例下导致更高的IFN-γ检测(图4F)。总而言之，这些结果显示具有4-1BB结构域的gp350CAR-T是有功能的，但与具有CD28z结构域的gp350CAR-T相比产生更弱的效应。

实施例5：7A1-gp350-CAR-T和6G4-gp350-CAR-T细胞识别用M81 EBV永生化的同一供体来源的LCL细胞系并被其激活的效能的证实。

图5呈现的数据支持具有CD28z结构域的7A1-gp350-CAR-T细胞和6G4-gp350-CAR-T细胞识别用EBV病毒株M81永生化的供体来源的成淋巴细胞样细胞系(LCL)的效能。将CD19⁺细胞用EBV-M81病毒感染，并在完全转化后检查表面gp350表达。两个抗体表位7A1和6G4均可以高水平在表面上检测到(图5A)。将CAR-T细胞与LCL共培养，并在共培养86小时后进行分析(图5B)。当与gp350-CAR-T细胞共培养时，在86h后可以检测到高水平的IFN-γ。在3:1和1:1的比例下而不是在10:1的最高比例下观察到IFN-γ的最高水平，表明了IFN-γ的使用或这种高水平的CAR-T细胞的抑制效应(图5C)。与对照CAR-T相比，可以检测到7A1-CAR-T细胞的T细胞增殖(图5D)。在86h后也可以检测到靶细胞上gp350的缺失，特别是在较高的7A1-CAR-T比例下，表明gp350⁺靶细胞被杀死，然而在使用我们的基于FACS的存活性测定法时，我们未能检测到死的靶细胞的量增加(图5E)。

实施例6：在使用用人类免疫系统重建的人源化小鼠的EBV感染模型中对7A1-gp350-CAR-T细胞进行体内测试。

图6显示了在使用人源化小鼠的EBV感染模型中7A1-gp350-CAR-T细胞的体内效能。将NRG小鼠辐照并i.v.移植hCD34⁺细胞。16周后，将小鼠用EBV-B95.8/GFP感染。在EBV感染后5周，将小鼠用5×10⁶个7A1-gp350-CAR-T细胞(与hCD34细胞匹配的同一供体)输注。每周获取外周血，并在CAR-T细胞注射后4周将小鼠处死(图6A)。CAR-T细胞在外周血中以高水平被检测到，并在注射后两周达到峰值(图6B)。在终点分析时，尸检揭示出在一只使用CAR-T细胞和一只未使用CAR-T细胞的小鼠中，在脾脏中出现肿瘤形成。其他小鼠未显示出肉眼可见的肿瘤形成。然后分析脾和肿瘤组织中CAR-T细胞的存在。在开始时接受CAR-T细胞的两只小鼠中，在脾脏中检测到CAR-T细胞。在开始时接受CAR-T细胞的小鼠的肿瘤组织中检测到大量的CAR-T细胞。此外，水平超过在健康脾组织中测量到的量，表明可以通过CAR-T细胞检测肿瘤(图6C)。此外，从脾脏和肿瘤组织分离DNA并通过RT-qPCR进行分析。在发生肿瘤的两只小鼠的脾细胞中发现病毒DNA拷贝。尽管在没有CAR-T细胞的小鼠的肿瘤中发现大量的病毒DNA拷贝，但在具有CAR-T细胞的小鼠的肿瘤中仅仅可以检测到基线PCR信号，表明EBV⁺肿瘤细胞被CAR-T细胞杀死(图6D)。肿瘤切片的组织病理学分析也揭示出在用CAR-T细胞治疗的小鼠的肿瘤中较低的EBER染色水平(图6E)。

实施例7：gp350-CAR-T在EBV人源化小鼠模型EBV/B95.8fLuc中的体内测试。

利用可以通过非侵入性光学成像来跟踪EBV-B95.8/fLUC病毒扩散和肿瘤形成的系统，对7A1-CAR-T细胞在体内控制和根除局部和系统性EBV淋巴瘤和恶性肿瘤进行了更深入的试验。预试验的结果示出在图6中。将NRG小鼠辐照并i.v.移植hCD34⁺细胞，26周后，将一只小鼠用5×10⁶个7A1-CAR-T细胞(与hCD34细胞匹配的同一供体)输注。一天后，将两只小鼠用EBV/B95.8-fLuc感染。每隔周获取外周血，并且每隔周通过IVIS成像监测感染的扩散。在CAR-T细胞注射后6周将小鼠处死(图7A)。在感染后4周，通过光学成像分析进行的生物发光检测揭示出感染扩散的巨大差异。在接受CAR-T细胞的小鼠中感染局限于脾脏，而在未接受CAR-T细胞的小鼠中可以观察到感染扩散到肝脏。然而，两周后，尽管CAR-T细胞治疗的小鼠中的信号仍然低于对照小鼠，但在CAR-T细胞治疗的小鼠中也发生了感染扩散(图7B)。这表明在具有CAR-T细胞的小鼠中感染的控制直至感染后第4周。这也被实验过程中脾脏信号的定量所强调。在CAR-T治疗的小鼠中，脾脏中的信号保持稳定直至第4周，而对照小鼠从早起开始就显示出信号的快速提高(图7C)。在终点分析时，也测量了肝脏和唾液腺区域中的生物发光信号，并揭示出与对照小鼠相比具有CAR-T细胞的小鼠中信号较低(图7D)。开始时在血液中检测到CAR-T细胞，但随后水平降低，表明迁移出血流进入组织(图7E)。这个假设得到在终点分析时在脾脏和骨髓中检测到CD4⁺和CD8⁺CAR-T细胞的支持(图7F)。

实施例8：用源自于7A1-gp350CAR-T(CD28z)细胞的分拣的CAR⁺CD8⁺或CAR⁺CD4⁺/CD8⁺预先治疗并用EBV-M81/fLuc2毒株感染的人源化NRG小鼠。

图9示出了被分拣为CAR⁺CD8⁺细胞或被分拣然后1:1重新组合为CAR⁺CD4⁺加上CD8⁺T细胞并施用到人源化小鼠中的7A1-gp350-CAR-T细胞的效应。使用的CAR构建物是根据图8所述的#3，即源自于7A1抗体的“gp350CAR7B(S.28.z)”，其包含IgHL-VH-G4S-VL scFV、IgGFc CH3间隔物和CD28–CD3ζ信号传导结构域。人源化小鼠中的EBV-M81fLuc2感染通过光学成像分析非侵入性且动态地跟踪。在干细胞移植后17周，对小鼠施用CAR-T细胞(CAR⁺CD8⁺或CAR⁺CD4⁺加上CD8⁺)或作为对照组施用PBS，并在一天后将它们用EBV感染。我们观察到非常一致的病毒分布模式，即一开始在脾脏中，然后全身性扩散。尽管对于不同组群中的小鼠而言使用内源白细胞进行的免疫重建进展正常(图9B、C)，但我们在所述小鼠的外周血或淋巴组织中未能成功地检测到CAR-T细胞。然而，在感染之前用CAR⁺CD8⁺或CAR⁺CD4⁺加上CD8⁺细胞单次施用，导致通过光学成像分析监测的EBV感染和扩散的降低(图9D)。此外，从脾脏和骨髓分离DNA并通过qRT-PCR进行分析。病毒DNA拷贝在所有对照小鼠的脾细胞中发现，但在用CAR-T细胞预先治疗的几只小鼠的脾脏中不可检测(图9E)。对于骨髓分析而言观察到类似趋势(图9E)。我们观察到通过光学成像和PCR获得的数据之间的相关性，表明用CAR-T细胞治疗的小鼠的数据簇集在远离对照小鼠的数据之处(图9E)。对于这些概念验证实验而言，数据获取是非盲的，并且在实验之前样本量未被统计学确定。统计分析使用GraphPadPrism软件(Graphpad Software Inc.,La Jolle,California,USA，版本：6和7)进行。使用T-检验来计算统计显著性。

实施例9：用EBV-M81/fLuc2毒株感染并用源自于7A1-gp350CAR-T(CD28z)细胞的分拣的CAR⁺CD8⁺治疗的人源化NRG小鼠。

在这个实验中，通过分拣选择CAR⁺CD8⁺细胞作为单一群体并在预先建立的EBV-M81/fLuc2感染后治疗性使用。使用的CAR构建物是根据图8所述的#3，即源自于7A1抗体的“gp350CAR7B(S.28.z)”，其包含IgHL-VH-G4S-VL scFV、IgG Fc CH3间隔物和CD28–CD3ζ信号传导结构域。本研究中使用的所有小鼠在使用人类CD45⁺或CD8⁺T细胞时显示出长期重建(图10B、C)。在所有小鼠中EBV感染和病毒分布开始时可以在脾脏中检测到，随后系统性扩散(特别是扩散到对应于肝脏和唾液腺的解剖学区域)(图10D)。在实验的第6和8周，即在使用CAR⁺CD8⁺细胞的第二次施用后，与对照小鼠相比，治疗的小鼠显示出更低的EBV感染和扩散。通过PCR进行的脾脏和骨髓中EBV基因组拷贝的分析显示，与对照小鼠相比CAR⁺CD8⁺治疗的小鼠的平均EBV感染载量降低(大约50％)，但对于肝脏而言差异是微不足道的(图10E)。在通过光学成像和PCR获得的数据之间观察到相关性，显示出用CAR-T细胞治疗的小鼠的值簇集在远离对照小鼠的值之处(图10F)。统计分析使用GraphPad Prism软件(GraphpadSoftware Inc.,La Jolle,California,USA，版本：6和7)进行。使用T-检验来计算统计显著性。证实了通过非侵入性全身光学成像获得的数据，通过光学成像分析的外植组织示出了与CAR-T治疗的小鼠相比，在对照小鼠中肾脏、脑和肺中EBV感染的发生率(大约加倍，图10G)。

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Arvin A,Campadelli-Fiume G,Mocarski E等主编，《人类疱疹病毒：生物学、疗法和免疫预防》(Human Herpesviruses:Biology,Therapy,and Immunoprophylaxis)，Cambridge:Cambridge University Press；2007。

Claims

1.一种嵌合抗原受体多肽(CAR)，其包含：

ii.跨膜结构域，和

iii.细胞内信号传导结构域。

2.根据前述权利要求所述的CAR多肽，其中所述疱疹病毒抗原参与病毒与人类靶细胞上的受体的结合(疱疹病毒受体结合蛋白)。

3.根据前述权利要求中的任一项所述的CAR多肽，其中所述疱疹病毒抗原是Epstein-Barr病毒抗原(EBV抗原)。

4.根据前述权利要求所述的CAR多肽，其中所述EBV抗原存在于EBV感染的细胞、优选为EBV感染的癌细胞、EBV感染的B细胞或EBV感染的上皮细胞的表面上。

5.根据前述权利要求中的任一项所述的CAR多肽，其中所述EBV抗原是EBV病毒粒子包膜蛋白或EBV包膜复合体的蛋白质(例如gB、gL、gH)。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的CAR多肽，其中所述疱疹病毒抗原是EBV糖蛋白350/220(gp350/gp220)。

7.根据前述权利要求中的任一项所述的CAR多肽：

-其中所述CAR包含位于VH和VL结构域的N-末端的前导多肽，其中所述前导多肽优选为IgHL前导肽；和/或

-其中所述细胞外抗原结合结构域包含位于所述VH与VL结构域之间的连接多肽，其中所述连接物优选为G4S连接物；和/或

-另外包含位于所述细胞外抗原结合结构域与所述跨膜结构域之间的间隔多肽，其中所述间隔物优选为IgG1 CH3或IgG1 CH2-CH3间隔物；和/或

-其中所述跨膜结构域是CD28或CD8α跨膜结构域；和/或

-其中所述细胞内结构域包含CD28或4-1BB共刺激结构域；和/或

-其中所述细胞内结构域包含CD3ζ链信号传导结构域；和/或

-其中所述CAR包含位于所述VH和VL结构域与所述间隔物之间和/或所述间隔物与所述跨膜结构域之间的一个或多个连接多肽。

8.一种分离的核酸分子，优选地采取分离的载体例如分离的病毒载体的形式，其包含编码根据前述权利要求中的任一项所述的CAR多肽的核苷酸序列。

9.一种遗传修饰的免疫细胞，其包含根据权利要求8所述的核酸分子和/或表达根据权利要求1至7中的任一项所述的CAR，其中所述免疫细胞优选地选自T淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突状细胞，其中所述T淋巴细胞优选为细胞毒性T淋巴细胞或T辅助细胞。

10.根据权利要求9所述的免疫细胞，其用于治疗或预防与疱疹病毒感染相关的医学病症，例如疱疹病毒相关癌症或慢性活动性疱疹病毒感染或原发性疱疹病毒感染。

11.根据权利要求10所述的免疫细胞，其中所述与疱疹病毒感染相关的医学病症是疱疹病毒相关癌症，其中疱疹病毒抗原存在于癌细胞表面上。

12.根据权利要求10所述的免疫细胞，其中所述疱疹病毒是EBV。

13.根据权利要求12所述的免疫细胞，其中所述医学病症是EBV相关癌症，其选自淋巴增殖性障碍(LPD)例如B-细胞淋巴瘤包括伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或移植后淋巴增殖性障碍(PTLD)，或上皮癌(鼻咽、肺、乳腺)、淋巴上皮瘤、伴有淋巴样间质的癌(GCLS，例如胃癌)或神经胶质瘤。

14.根据权利要求12所述的免疫细胞，其中所述与EBV感染相关的医学病症是慢性活动性EBV感染(CAEBV)或原发性EBV感染(例如单核细胞增多症)。

15.根据权利要求10所述的免疫细胞，其用于治疗在化疗、辐射、免疫抑制或移植后免疫缺陷或免疫受损的患者。