JP3352757B2

JP3352757B2 - 液体クロマトグラフィー用充填剤

Info

Publication number: JP3352757B2
Application number: JP12645093A
Authority: JP
Inventors: 千也井上; 幹夫小林
Original assignee: Kanto Chemical Co Inc
Current assignee: Kanto Chemical Co Inc
Priority date: 1993-04-19
Filing date: 1993-04-19
Publication date: 2002-12-03
Anticipated expiration: 2017-12-03
Also published as: JPH06300746A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は液体クロマトグラフィー
用充填剤に関する。

【０００２】

【背景技術】ヒドロキシアパタイト（以下、ＨＡＰと記
す）を充填剤に用いた液体クロマトグラフィーは、タン
パク質や核酸などの生体高分子を温和な条件で分離精製
できるという、優れた特長を有するため、ＨＡＰは、工
業的に大量に分取するクロマトグラフィー用充填剤とし
て極めて望ましいものである。このような優れたクロマ
ト特性に加えて、分取コストを低くするためにクロマト
グラフィー用充填剤用のＨＡＰは、生体高分子に対する
負荷能力が高く、かつ、機械的強度が大きく耐久性に優
れたものである必要がある。一般に、ＨＡＰを使用する
クロマトグラフィーにおいては、充填剤としてのＨＡＰ
を多孔質にすることにより、タンパク質や核酸などに対
する負荷能力を大きくできることが知られている。充填
剤としての多孔質のＨＡＰの製法に関する従来技術とし
ては、例えば、湿式合成したＨＡＰのスラリーのみを用
いて、噴霧乾燥法などにより１００〜２５０℃の温度で
乾燥・造粒し、加熱焼成して多孔質化すると同時に機械
的強度を付与する方法が知られている。しかし、この方
法では焼成温度を高くするにつれてＨＡＰの焼結による
体積収縮と緻密化が進み、特に、８００℃より高温にな
ると細孔の消滅による多孔性の低下が著しくなる。この
ため、焼成は８００℃以下の温度で行わざるを得ない
が、そのような温度は機械的強度を大きくするという目
的からは不十分な焼成温度である。緻密化による多孔性
の低下を防ぐため、ＨＡＰのスラリーに過酸化水素水な
どの発泡剤やスチロール樹脂などの熱分解性粒子を混合
して加熱焼成するなどの工程を組入れ、予め大きな気孔
を化学的または物理的に導入する方法も知られている
が、この方法は、比較的単純な形状の気孔に限られ、ま
た、全てが開気孔として作用する訳ではなく、その気孔
が閉気孔となって粒子内部に閉じこめられて意味のない
ものとなると共に機械的強度を弱くしてしまうことにも
なる。更に、緻密化による多孔性の低下を抑制する別法
として、９００〜１４００℃の高温下での固体反応によ
って調製したヒドロキシアパタイトを粉砕して微粒子と
し、これを再造粒し、焼成する方法があるが、この方法
は、ヒドロキシアパタイト粒子が既に高温で調製されて
いるため焼結反応に対する活性が低く、造粒粒子を９０
０〜１４００℃で焼成しても粒子同士の結合は弱い。従
って、機械的強度を大きくするためにはこの温度範囲よ
りも更に高い温度での焼成が必要であるが、そのような
高温下における焼成によっては再び多孔性が低下した
り、ＨＡＰの分解が生じてしまうので、機械的強度を十
分大きくするために、より高温で加熱することは事実上
困難であった。

【０００３】

【発明の目的】本発明の目的は、上述の如き現状に鑑
み、耐久性に優れ、タンパク質や核酸などの生体高分子
試料の分離・分取に好適な多孔質のＨＡＰから成る液体
クロマトグラフィー用充填剤を提供することにある。更
にまた、本発明の目的は、上記液体クロマトグラフィー
用充填剤の製法を提供することである。

【０００４】

【発明の開示】本発明により、下記の新規な液体クロマ
トグラフィー用充填剤が提供される。本発明に係わる新
規な液体クロマトグラフィー用充填剤は、８００℃未満
の温度域で合成されたヒドロキシアパタイト粒子（以
下、ＨＡＰ粒子Ａと称する）と８００℃以上の温度域で
合成されたヒドロキシアパタイト粒子（以下、ＨＡＰ粒
子Ｂと称する）とを含むスラリーを乾燥・造粒し、該造
粒物を８００℃以上の温度で焼成を行うことにより生成
させた、多孔質のＨＡＰから成ることを特徴とするもの
である。

【０００５】本発明者らは、鋭意、研究の結果、ＨＡＰ
粒子Ａは低温で調製されているので焼結反応に対する活
性が高く、ＨＡＰ粒子Ａを単独で８００℃程度の高温域
まで加熱した場合ＨＡＰ粒子Ａの凝集体が多数の隙間
（開気孔）を残しながら、米粒状のＨＡＰの粒子が連な
るように成長し、焼結していき、全体としては体積の収
縮を伴いながら多孔性を発現していることが認められる
こと、そして、この多孔性発現に寄与するＨＡＰ粒子Ａ
に対し、ＨＡＰ粒子Ｂを混合することにより高温で焼成
しても細孔容積の減少する度合いを抑制できること、そ
の結果細孔容積を大きく保持できることを見い出した。
本発明はかかる知見に基づきなされたものである。

【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明
は、８００℃未満の温度域で合成されたヒドロキシアパ
タイト粒子（ＨＡＰ粒子Ａ）と８００℃以上の温度域で
合成されたヒドロキシアパタイト粒子（ＨＡＰ粒子Ｂ）
とを含み、ＨＡＰ粒子Ｂの混合割合が、ＨＡＰ粒子Ａと
ＨＡＰ粒子Ｂとの全重量に対し、３〜６０重量％である
スラリーから造粒物を調製し、その造粒物を８００℃以
上の温度で焼成することにより生成させた、多孔質ヒド
ロキシアパタイトから成る液体クロマトグラフィー用充
墳剤を提供するものであるが、本発明に係わるＨＡＰ粒
子Ａとは、８００℃未満の温度で調製されたＨＡＰの非
晶質または結晶質の粒子であって、８００℃以上の焼成
温度で加熱されるに際し、結晶成長と焼結反応に対する
活性が高いため、それらの反応に伴って大きな体積収縮
が生じる粒子を意味している。この様なＨＡＰの粒子で
あれば、どのような製法によるものでもよく、特に特定
されることはない。例を挙げればティゼリウス法〔Ａ．
Ｔｉｓｅｌｉｕｓ，ｅｔａｌ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，６５，１３２−１５５（１９
５６）〕をはじめ水溶液からイオンの直接的反応によっ
て、ＨＡＰ微粒子の沈殿を生ぜしめる、いわゆる湿式合
成法と称せられる様々な公知の方法によって製造するこ
とができる。ＨＡＰ粒子ＡとＨＡＰ粒子Ｂとの混合によ
り調製されるスラリー中において、ＨＡＰ粒子ＡでＨＡ
Ｐ粒子Ｂを均一に覆い、更には、ＨＡＰ粒子Ｂが多孔質
である場合にはその細孔にもＨＡＰ粒子Ａを浸入させ、
焼成時にＨＡＰ粒子Ａ同士が焼結すると同時に、細孔の
内と外でＨＡＰ粒子ＡがＨＡＰ粒子Ｂを包みこむように
強固に結合する効果を得るために、本発明に係わるＨＡ
Ｐ粒子Ａの大きさは出来るだけ細かいほうがよい。後述
のＨＡＰ粒子Ｂの調製に於いて生成する細孔の大きさは
製法によって様々であり、小さいほうでは１ミクロン以
下の細孔も容易に生じるが、実験により本発明の効果を
得るためには、ＨＡＰ粒子Ａはこれらの小さな細孔にも
浸入できるほうが望ましいことが分った。従って、ＨＡ
Ｐ粒子Ａの大きさは、少なくともＨＡＰ粒子Ｂに存在す
る細孔の大きさより小さい方が望ましく、多くの場合、
１ミクロン以下であれば十分である。

【０００７】前記のＨＡＰ粒子Ｂは、８００℃以上の温
度で十分に加熱され、結晶成長と焼結反応に伴う体積収
縮などが十分に進行したＨＡＰの結晶粒子であって、本
発明における焼成温度条件下での加熱の際には新たに大
きな体積収縮は生じない、熱的に安定な、ＨＡＰの単結
晶または多結晶の粒子を意味している。また、形状的に
は、球状、板状、柱状、不定形状など、どのような形状
のものでもよく、特に特定されない。また、このＨＡＰ
粒子Ｂは多孔質であっても、緻密質であってもよい。一
例を挙げれば、ＨＡＰ粒子Ａより大きな径の開気孔（細
孔）が存在する多孔質のＨＡＰ粒子Ｂを用いると、ＨＡ
Ｐ粒子ＡがＨＡＰ粒子Ｂの表面を覆うだけでなく、ＨＡ
Ｐ粒子Ｂの開気孔の中まで浸入したＨＡＰ粒子Ａが、乾
燥・造粒後の焼成によってＨＡＰ粒子Ｂの細孔の内外で
結晶化し、焼結反応に伴いＨＡＰ粒子Ｂを取込むように
強固な結合が生じるので、機械的強度の大きな充填剤が
得られる。また、柱状のＨＡＰ粒子Ｂを用いると、ＨＡ
Ｐ粒子Ａとの混合によって、ＨＡＰ粒子Ｂ同士の絡みあ
った隙間を満たしているＨＡＰ粒子Ａが、乾燥・造粒後
の加熱により、結晶化と焼結反応による体積収縮が生じ
てＨＡＰ粒子Ｂに絡みつくように強固に結合するので、
機械的強度の大きな充填剤が得られる。

【０００８】上記のＨＡＰ粒子Ｂの大きさは、格別には
特定されないが、ＨＡＰ粒子Ａが体積収縮を起こした場
合にあってもＨＡＰ粒子Ｂの大きさがＨＡＰ粒子Ａより
も十分に大きいと造粒粒子全体としての多孔性の低下を
抑制することができる。通常、容易に調製できるＨＡＰ
粒子Ａの大きさは、小さいもので０．１ミクロン程度で
あるので、ＨＡＰ粒子Ｂの大きさは少なくとも１ミクロ
ン以上であることが望ましい。

【０００９】本発明における前述のＨＡＰのスラリーと
は、ＨＡＰ粒子ＡとＨＡＰ粒子Ｂとが水や有機溶媒など
の溶液中に分散した懸濁液を意味している。そのための
スラリー調製法としては、格別に特定されない。調製法
の例を挙げれば、ＨＡＰ粒子Ａのみの懸濁液とＨＡＰ粒
子Ｂのみの懸濁液を調製した後で両者を混合してもよ
く、ＨＡＰ粒子ＡとＨＡＰ粒子Ｂを混合したものを水や
有機溶媒に分散させてもよく、また、ティゼリウス法な
どの湿式合成法においてＨＡＰ粒子Ａの沈殿物が生じて
いる溶液に、ＨＡＰ粒子Ｂを混合してもよく、いずれの
方法も本発明における前記のＨＡＰのスラリーの調製法
として使用することができる。

【００１０】ＨＡＰ粒子ＡとＨＡＰ粒子Ｂとから成るＨ
ＡＰのスラリーの濃度は格別に特定されず、用いる乾燥
・造粒方法、焼成による粒子の収縮の度合いや多孔性、
細孔容積などを考慮し、本発明の目的を達成するのに好
適な濃度に調整される。

【００１１】上記のＨＡＰ粒子ＡとＨＡＰ粒子Ｂの混合
割合は、本発明の目的を達成するためにはＨＡＰ粒子Ｂ
の割合を３〜６０重量％の範囲とすることが望ましく、
１５〜３０重量％が好適である。３重量％以下の場合に
は、８００℃以上の高温での焼成により、ＨＡＰ粒子Ａ
の焼結に伴う大きな体積収縮が生じ、緻密化が進行する
ため、ＨＡＰ粒子Ｂの共存による充填剤の多孔質性の低
下を抑制する効果がほとんどなく、また、６０重量％以
上の場合には、多孔性の低下は抑制できるが、ＨＡＰ粒
子ＡでＨＡＰ粒子Ｂを覆うことによる造粒粒子全体の結
合強化の効果が小さくなり、高温で焼成しても機械的強
度の増大はそれ以上には著しくならず、いずれも本発明
の目的を十分に達成することができなくなる。

【００１２】上記のＨＡＰ粒子ＡとＨＡＰ粒子Ｂとを含
むスラリーの乾燥・造粒の方法としては、格別に特定さ
れない。その方法としては、下記の如き公知の方法を例
示することができる。（１）耐熱性の容器に入れて、加熱して乾燥・固化さ
せ、次いで、所望の粒子径の粒子となるように粉砕す
る。（２）噴霧乾燥法により、乾燥と造粒を同時に行う。
この方法によると、クロマトグラフィー用充填剤の形状
として極めて好ましい球状粒子を得ることができる。ま
た、噴霧乾燥法における乾燥温度を、例えば７００℃ま
で高くすると、乾燥のみならず、一部焼結反応をも生じ
させることが可能であり、こうした方法も本発明の方法
における乾燥造粒方法として好適に用いることができ
る。

【００１３】多孔質のＨＡＰの細孔容積は、ＨＡＰのス
ラリーの調製方法と条件、加熱焼成条件などによって異
なってくる。一例を挙げれば、硝酸カルシウムとリン酸
の反応により生成させたＨＡＰ粒子Ａを含むスラリーを
乾燥し、粉砕して、１０００℃まで加熱すると、焼結が
進み多孔性が著しく低下して、細孔容積は０．１８ｃｃ
／ｇとなり、タンパク質などの生体関連試料の負荷能力
は、８００℃で作製した多孔質のＨＡＰと比較して約１
／５まで減少した。従って、機械的強度を増加させるた
めには焼成温度を高くするのが望ましいが、一方、タン
パク質などの負荷能力を著しく低下させないためには、
多孔質のＨＡＰの細孔容積は、少なくとも０．２ｃｃ／
ｇ以上、好ましくは０．３５ｃｃ／ｇ以上あることが望
ましい。

【００１４】本発明によれば、予め高温で焼成して焼結
と体積収縮を十分に行わせたＨＡＰ粒子Ｂと焼結反応に
対する活性の高いＨＡＰ粒子Ａとを含むスラリーを用い
るので、ＨＡＰ粒子Ｂを包み込んだＨＡＰ粒子Ａ同士の
結晶化と焼結反応が体積収縮の無いＨＡＰ粒子Ｂの回り
で生じると同時に、ＨＡＰ粒子Ａは収縮するにつれてＨ
ＡＰ粒子Ｂを強固に包みこむようにしながら、ＨＡＰ粒
子Ｂに同化するように焼結されていく。このようにＨＡ
Ｐ粒子Ａのみの一様な収縮を阻止することにより、粒子
全体の多孔性の低下を抑制する効果と機械的強度を増大
させる効果が生じる。また、開気孔を有する多孔質のＨ
ＡＰ粒子Ｂや柱状のＨＡＰ粒子Ｂを用いて、ＨＡＰ粒子
ＡとＨＡＰ粒子Ｂとの混合割合やスラリーの濃度を選択
することにより、ＨＡＰ粒子Ｂの開気孔やＨＡＰ粒子Ｂ
同士の隙間を満たしたスラリー中のＨＡＰ粒子Ａが加熱
によって大きく体積収縮し、その結果再び開気孔を生じ
るようにすることもでき、当然ながら、これらの方法は
ＨＡＰ焼成体の多孔性の低下を抑制することに役立つ。

【００１５】以下に、本発明の実施例と比較例とを掲
げ、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は下記
の実施例に限定されるものではない。

【００１６】

【実施例】

実施例１水酸化カルシウムとリン酸の反応により、０．１〜０．
７ミクロンの大きさのＨＡＰ粒子Ａが分散している懸濁
液を調製した。一方、該ＨＡＰ粒子Ａが分散した懸濁液
を１５０℃で乾燥して粉末とした後、１０００℃で４時
間焼成して粉砕し、２〜１５ミクロンの粒子から成るＨ
ＡＰ粒子Ｂを調製した。次に、上記のＨＡＰ粒子Ａの分
散した懸濁液とＨＡＰ粒子Ｂとを用いて、ＨＡＰ粒子Ｂ
がそれぞれ、５、１０、２５、および、４０重量％の割
合で含まれている４種類のＨＡＰのスラリーを調製し、
各々のスラリーを１５０℃で乾燥した。この４種類の乾
燥スラリーを８００℃、および、１０００℃で各４時間
焼成した。こうして得られた８種類の焼成体を各々粉砕
しておよそ０．５ミリメートルの大きさの、多孔質のＨ
ＡＰを得た。この８種類の多孔質のＨＡＰの細孔容積
を、水銀圧入法により測定した。その結果を表１に示
す。表１中の数値は、（ｃｃ／ｇ）である。

【００１７】表１に示された結果から、焼成温度が８０
０℃では、ＨＡＰ粒子Ｂの混合割合の増加につれて多孔
質のＨＡＰの細孔容積は小さくなるが、焼成温度を高く
したときの細孔容積の減少の度合いはＨＡＰ粒子Ｂの混
合割合いが大きい程低くなり、その結果、１０００℃で
の焼成では、ＨＡＰ粒子Ｂの混合割合が大きいもの程、
残存する細孔容積も大きいことが分る。結局、多孔質の
ＨＡＰの機械的強度を大きくする目的で焼成温度を高め
る場合、ＨＡＰ粒子ＡにＨＡＰ粒子Ｂを混合して用いる
ことにより細孔の減少の度合いを低く抑えられるので、
８００℃以上の温度で焼成を行った場合においても、細
孔容積の大きい多孔質のＨＡＰが得られることが分る。

【００１８】

【表１】

【００１９】比較例１ＨＡＰ粒子Ａのみを分散させた懸濁液（実施例１参照）
を１５０℃で乾燥して粉末とした後、８００、および、
１０００℃の各焼成温度で４時間加熱した。得られた２
種類の焼成体を各々粉砕して、およそ０．５ミリメート
ルの大きさの、多孔質のＨＡＰの焼結粒子２種を得た。
この２種類のＨＡＰ焼結粒子の各細孔容積の測定結果
は、表１に示されている。ＨＡＰ粒子Ａのみを用いて作
製した多孔質のＨＡＰの細孔容積は、焼成温度が高くな
るに従い、急激に減少する。機械的強度を高めるために
１０００℃で焼成すると、その細孔容積は、ＨＡＰ粒子
Ｂを１０〜４０重量％混合して１０００℃で焼成した場
合のいずれの試料の細孔容積と対比しても小さい。

【００２０】実施例２水酸化カルシウムとリン酸の反応により生成したＨＡＰ
粒子Ａを分散させた懸濁液に、ＨＡＰ粒子Ｂ（実施例１
参照）を２０重量％加えて混合撹拌し、３００℃で噴霧
乾燥して平均粒径１００ミクロンの球状粒子を得た。こ
の粒子を、８５０℃で焼成して、細孔容積が０．３８ｃ
ｃ／ｇの、球状で多孔質のＨＡＰを得た。

【００２１】この多孔質のＨＡＰを直径１０ｍｍ、長さ
１０ｃｍのガラス管に加圧充墳し、リン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６．８）を用いて、０．０１Ｍから０．３Ｍ
まで６０分のリニアグラジエントの測定モードにより、
２ｍｌ／ｍｉｎの流速条件下で牛血清アルブミン、リゾ
チウム、およびチトクロムＣの混合試料の分離テストを
行い、良好な分離結果を得た。また、測定時のカラム背
圧は０ｋｇ／ｃｍ^２であり、５００回以上の繰返し測定
が可能であった。更に、生体関連試料の負荷能力を評価
するためにリゾチウムを用いて調べた結果は１５ｍｇ／
ｇであった。これらの結果から、本発明によるＨＡＰ充
填剤は耐久性が高く、生体高分子試料の分離・分取に好
適な液体クロマト特性を有することが分る。

【００２２】比較例２水酸化カルシウムとリン酸の反応により生成したＨＡＰ
粒子Ａを分取させた懸濁液を、３００℃で噴霧乾燥し、
平均粒径が１００ミクロンの球状粒子を得た。次いで、
この粒子を８５０℃で焼成して多孔質のＨＡＰを得た。
この多孔質のＨＡＰを、実施例２で用いたガラス管と同
じサイズのガラス管に充填し、実施例２と同じ条件で液
体クロマトグラフィー用充填剤としての特性を評価し
た。混合試料の分離テストでは実施例２と同様の分離結
果が得られたが、測定時の通液に対する抵抗が大きくな
り、カラム背圧は２０ｋｇ／ｃｍ^２と高くなつた。ま
た、リゾチウムの負荷能力は１１ｍｇ／ｇであった。

【００２３】実施例３アルギン酸塩法〔岩崎弘通、金子泰成、材料、３７、６
０−６４（１９８８）〕に基づき紡糸したゲル状繊維
を、９００℃で１時間熱処理した後、粉砕し、１％塩化
アンモニウム溶液で処理して副生成物のＣａＯを除去し
て、直径が３０〜４０μｍ、長さがおよそ１００〜３０
０μｍの柱状のＨＡＰから成るＨＡＰ粒子Ｂを作製し
た。次いで、水酸化カルシウムとリン酸を反応させてＨ
ＡＰ粒子Ａの懸濁液を調製し、これに上述の柱状ＨＡＰ
粒子Ｂを３０重量％加えて混合撹拌し、１５０℃で乾燥
した後、９００℃で焼成した。得られた焼成物を粉砕し
てフルイ分けすることにより、０．５〜１ミリの大きさ
の粒子を充填剤用に選別した。選別されたＨＡＰは、細
孔容積が０．３６ｃｃ／ｇの多孔質のＨＡＰであった。

【００２４】この多孔質のＨＡＰを直径１０ｍｍ、長さ
１０ｃｍのガラス管に充填し、リン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ６．８）を用いて、牛血清アルブミン、リゾチウ
ム、およびチトクロムＣの混合試料を、０．０７Ｍ、
０．１４Ｍ、及び０．２５Ｍの濃度によるステップワイ
ズ法で分離し、良好な結果を得た。また、生体関連試料
の負荷能力の評価としてリゾチウムを用いて測定した結
果は、１４ｍｇ／ｇであった。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】８００℃未満の温度域で合成されたヒド
ロキシアパタイト粒子（ａ）と８００℃以上の温度域で
合成されたヒドロキシアパタイト粒子（ｂ）とを含み、
その粒子（ｂ）の混合割合が粒子（ａ）と粒子（ｂ）と
の全重量あたり３〜６０重量％であるスラリーから調製
された造粒物を８００℃以上の温度で焼成することによ
り生成させた、多孔質ヒドロキシアパタイトから成る液
体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項２】前記の８００℃未満の温度域で合成され
たヒドロキシアパタイト粒子（ａ）が１ミクロン以下の
粒子である、請求項１に記載の液体クロマトグラフィー
用充填剤。
【請求項３】前記の８００℃以上の温度域で合成され
たヒドロキシアパタイト粒子（ｂ）が１ミクロン以上の
粒子である、請求項１または２に記載の液体クロマトグ
ラフィー用充填剤。
【請求項４】前記の８００℃以上の温度域で合成され
たヒドロキシアパタイト粒子（ｂ）が多孔質である、請
求項１〜３のいずれかに記載の液体クロマトグラフィー
用充填剤。
【請求項５】８００℃未満の温度域で合成されたヒド
ロキシアパタイト粒子（ａ）と８００℃以上の温度域で
合成されたヒドロキシアパタイト粒子（ｂ）とを含んで
いるスラリーからの造粒物の調製を噴霧乾燥法により行
う、請求項１〜４のいずれかに記載の液体クロマトグラ
フィー用充填剤。
【請求項６】前記の多孔質ヒドロキシアパタイトの細
孔容積が０．２ｃｃ／ｇ以上である、請求項１〜５のい
ずれかに記載の液体クロマトグラフィー用充填剤。
【請求項７】前記の多孔質ヒドロキシアパタイトが球
状体である、請求項１〜６のいずれかに記載の液体クロ
マトグラフィー用充填剤。