JPH0327349A - 蛋白質、ペプチド及びアミノ酸の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「利用分離」 本発明は、蛋白質、ペブチド及びア藁ノ酸の分離方法に
関する． 「従来技術及びその問題点」 リン酸カルシウム系化合物は、その優れた生体親和性に
より生体材料として利用される他、蛋白質などに対する
吸着能に着目して液体クロマトグラフィー用充填剤とし
てもしばしば使用されている． 特開昭６２−９１４１０号公報には、ゲル状ハイドロキ
シアパタイトを造粒し、得られた造粒体を４００〜７０
０℃の温度で焼戒することによって特定の単位格子定数
を有する大方晶系のクロマトグラフィー分離用粒子を製
造する方法が開示されている．しかしながら、この方法
では、焼戒温度が７００゜Ｃ以下であるため、粒子強度
が充分でなく、高速液体クロマトグラフィー用充填剤と
して使用するには更に改善が望まれる。そこで、焼成温
度を上げると、強度は高くなるが、粒子は緻密質となり
、試料負荷量が減少してしまう．また、従来のアパタイ
ト系充填剤については、蛋白賞の分離は可能であったが
、ペブチドやアξノ酸の分離はできなかったため、分離
能の向上が望まれている． 「発明の目的」 本発明は、蛋白質、ペプチド及びアミノ酸を液体クロマ
トグラフィーによって短時間に高い分離精度で分離しう
る方法を提供することを目的とする． 「発明の構威」 本発明による蛋白質、ペブチド及びアミノ酸の分離方法
は、Ｃａ／Ｐ比１．５〜１．８０のリン酸カルシウム系
化合物から戒る平均粒径１〜４０μｍの球状の多孔質リ
ン酸カルシウム系化合物粒子を固定相として用い、移動
相としてリン酸塩緩衝液を用いて液体クロマトグラフィ
ーに付すことを特徴とする． 本発明方法においては、固定相として上記のような多孔
質リン酸カルシウム系化合物粒子を用いる．リン酸カル
シウム系化合物としては、Ｃａ／Ｐ比１．　５〜１．８
０の任意のリン酸カルシウムを使用することができ、例
えばリン酸三カルシウム、ハイドロキシアパタイト、フ
ッ素アパタイトなどが該当する． さらに、多孔質粒子は、平均粒径１〜４０μｍ、好まし
くは１〜２０μｍの球状粒子であることを必要とする．
このように微細な球状粒子であることにより高性能の液
体クロマトグラフィー用充填剤として機能し、上記の範
囲を外れると、強度、分ＩＩＩｉｌ度などが改善されな
い． 固定相として用いる多孔質粒子は、上記の条件を満たす
ものであれば、すべて使用しうるが、平均孔径が１００
〜４０００人、特に５００〜２０００人の連続気孔を有
し、全細孔容積の９０％が、平均孔径の０．　５〜２倍
の範囲の孔径を有する細孔で占められており、粒子１ｇ
当たりの細孔容積が０．０５ｄ以上である粒子であるの
が好ましい．平均孔径が１００人未満であると、多孔体
とし１の機能が不充分となり、吸着能が低下する。

また、平均孔径が４０００人を超えると、強度が低下す
る傾向がある．また、このように孔径分布の狭いものは
、粒子の微細構造が著しく均一になり、強度の向上とと
もに、クロマトグラフィーにおける分離精度が著しく向
上している．さらに、上記のような細孔が、粒子１ｇ当
たりの細孔容積が０．　０　５　ｄ以上となるように存
在することが好ましい．細孔容積が０．０５ｄ未満であ
ると、吸着能が不充分となる傾向がある。

上記のような多孔質リン酸カルシウム系化合物粒子は、
高純度のカルシウム化合物と高純度のリン酸化合物とを
水中で反応させて、Ｃａ／Ｐ比が１．　５〜１．８０の
リン酸カルシウム系化合物の０．　１〜１０重量％水性
懸濁液を製造し、該水性懸濁液の粘度がｌ　Ｏｃｐ＝　
１　０　０ｃｐに達するまで攪拌を続け、その後、噴霧
乾燥により粒径１〜４０μｍの粒子に造粒し、７００〜
１２００℃の温度で焼戒することによって製造すること
ができる．さらに詳述すれば、本発明に用いる多孔質粒
子を製造するには、上記のように高純度の原料を用いて
まず、Ｃａ／Ｐ比が１．５〜１．８０のリン酸カルシウ
ム系化合物の０．１〜１０重量％水性懸濁液を製造する
．この濃度が０．ｌ重量％未満であると、著しく生産性
が低下し、１０重量％を超えると、反応液の粘度が上昇
し、反応が不均一になるおそれがある．得られた水性懸
濁液を攪拌し続けると、始めは粘度の上昇が起こるが、
再び粘度が低下する．粘度が低下して１０〜１００ｃＰ
に達したら、攪拌を止めて、噴霧乾燥する。粘度がｌ０
０ｃＰ以下まで低下しないと、熟威が不充分であり、上
記のような特性を有する粒子が得られないが、１０ｃＰ
より低下させる必要はない。このような範囲の粘度に達
するには、通常、２４時間前後攪拌を続けることが必要
である。

噴霧乾燥は、様々な方法で行うことができ、ノズルから
噴霧する方式でも、アトマイザーを用いる方式でもよい
．噴霧乾燥によって粒径１〜１０μｍの球状粒子に造粒
する。粒径の調節は、噴霧乾燥の際の様々な条件を適切
に設定することにより行うことができる。

こうして造粒した球状粒子をさらに７００゜Ｃ〜１２０
０℃の温度で焼或することによって上記のような特性を
有する多孔質粒子が得られる。焼威温度は、その都度の
リン酸カルシウム化合物の種類などによって上記の範囲
内で適宜選択することができる。しかしながら、焼威温
度が７００゜Ｃ未満であると、強度が不充分であり、１
２００℃を超えると、緻密質どなってしまう。

上記のようにして得られた多孔質粒子は１５０ｋｇ／ｒ
ｒｆ以上の高い強度を有し、液体クロマトグラフィーに
おいて高い分離能を示し、保水性が高く、インキュベー
ションを必要とせず、直ちに分離操作を行うことができ
る． 本発明の方法においては、上記のような多孔質粒子を固
定相としてカラムなどの分離器に充填し、移動相として
リン酸塩緩衝液を用いて液体クロマトグラフィーに付す
． 移動相として用いるリン酸塩緩衝液は、液体クロマトグ
ラフィーに常用されているものであってよく、例えばリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）などを用いること
ができる。

本発明によるクロマトグラフィーは、グラジエント法で
も、アイソクラティック法でも行うことができる．アイ
ソクラティック法を適用する場合には、分子！１万以上
の物質の分離には、１０ｍＭ以上のリン酸塩緩衝液を単
一移動相として用い、分子量１万以下の物質の分離には
、１０ｎＭ以下のリン酸塩緩衝液を単一移動相として用
いるのが好ましい． 「発明の実施例」 次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない． 参考例（充填剤の製造） 水酸化カルシウム懸濁液（ＪＩＳ特級の炭酸カルシウム
を１０００゜Ｃで焼成し、純水で水和して得たもの）及
びリン酸水溶液（ＪＩＳ特級試薬）をＣａ／Ｐ比が１．
６７になるように配合し、湿式法によりハイドロキシア
パタイトを製造し、ハイｒロキシアパタイトの８重量％
水性懸濁液を得た。

この懸濁液を更に、粘度が２０ｃＰに達するまで攪拌し
、その後、攪拌を停止し、噴霧乾燥する．さらに下記の
第１表に示す温度で焼威し、粒径２μｍ、１０μｍ、２
０μｍ及び４０μｍの多孔質球状粒子（以下、それぞれ
ＨＰ−０２、ＨＰ−１０、｝ＩＰ−２０及びＨＰ−４　
０と記す）を得た．各粒子の比表面積、平均孔径及び細
孔容積を測定し、結果を第１表に示す。

なお、比表面積はＢＥＴ法により測定し、平均孔径は水
銀多孔度計により測定したものである．（以下余白） 第ｌ表 さらに、得られた粒子のＸ線回折図（ＣｕＫα、４０Ｋ
Ｖ、１００ｍＡ）を第１図に、赤外線吸収スペクトルを
第２図に示す。第１図及び第２図において、ＡはＨＰ−
１０、ＢはＨＰ−０２、Ｃは上記の噴霧乾燥後の粒子（
未焼成粒子）を示す。

第１図及び第２図から、得られた粒子がノ＼イドロキシ
アパタイトであることが証明された。

さらに、上記参考例で製造したノ＼イドロキシアパタイ
ト粒子の孔径と水銀細孔容積計で測定した細孔容積との
関係を第３図に示す。第３図から、得られたハイドロキ
シアパタイト粒子が、全細孔容積の９０％が平均孔径の
０．５倍〜２倍の範囲の孔径を有する細孔で占められて
いることが証明された。

実施例ｌ 上記の参考例で製造したハイドロキシアパタイト粒子を
内径７．５１ＩＩＩ１、高さ１００ａｍのカラムに充填
し、ウシ血清アルブミン、リゾチーム及びチトクローム
Ｃを含む試料のクロマトグラフィー分離を行った．溶離
液としてリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．　８　＞を
用いてｌＭ１／分の流速で３０分間で１＋＊Ｍから４０
０ｍＭまでリニアグラジエント法で分離を行った． ＨＰ−０　２を用いて得られたクロマトグラムを第４図
、ＨＰ−１０を用いて得られたクロマトグラムを第５図
、ＨＰ−２０を用いて得られたクロマトグラムを第６図
、ＨＰ−４０を用いて得られたクロマトグラムを第７図
に示す．なお、第４図〜第７図において、ａはウシ血清
アルブミンのピーク、ｂはリゾチームのピーク、Ｃはチ
トクロームＣのピークを示す． 第４図及び〜第５図に示した本発明の実施例であるクロ
マトダラムでは、粒径の大きい固定相を用いた第６図及
び第７図のクロマトグラムに比べてピークが著しくシャ
ープであり、分離性能が高いことが判る。

実施例２ 参考例で製造したハイドロキシアパタイト粒子を充填し
た内径７．　５　ｒｔｍ、高さ１００ｎｎのカラムを用
い、リゾチームを含む試料を１ｍＭから４００＋＋＋Ｍ
までリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）で３０分リ
ニアグラジエント法でクロマトグラフィー分離し、粒径
と理論段数との関係を調べた。結果を第８図に示す． さらに、同じカラムを用いて、シチジンを含む試料を４
００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を移動
相としてアイソクラティック法でクロマトグラフィー分
離し、粒径と理論段数との関係を調べた．結果を第８図
に示す． 第８図から、粒径が小さい程、グラジエント法でもアイ
ソクラティック法でも、理論段数が高くなり、分離性能
が極めて高くなることが判る。

実１Ｎ例３ ＨＰ−０２を充填した内径７．５Ｍ、高さ１００閣のカ
ラム、ＨＰ−１０を充填した内径７．５ｍｓ，高さ１０
０閣のカラム、ＨＰ−１０を充填した内径１０．７閣、
高さ１００ｍのカラム、ＨＰ−２　０を充填した内径２
１．５ｍ、高さ１００ｍｍのカラムの４種類のカラム（
それぞれ、カラムＡ、カラムＢ、カラムＣ及びカラムＤ
として示す）を用い、溶離液としてリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ６．８）を用いて１ｒＩＩ１／分の流速で３
０分間で１ｍＭから４００ｍＭまでリニアグラジエント
法でリゾチーム及びチトクロームＣの混合物の分離を行
った。試料の量と分離度を測定し、結果を第９図に示す
。

これらの結果からいずれも高い試料負荷量が可能である
ことが証明された。

実施例４ 参考例で製造した粒子ＨＰ−０２を充填した内径７．５
ｍｍ，高さ１００ａｍのカラムを用い、移動相溶離液と
してリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて、
ｌｄ／分の流速で３０分間で１ｎ＋Ｍから４００ｍＭま
でリニアグラジエント法で通液し、様々な蛋白質を分離
し、保持時間をそれぞれ下記の第２表に示す．なお、第
２表には、分離された物質の分子量及び等電点も示す。

同様にして、ペプチドを分離し、第３表に分子量、等電
点及び保持時間を示す。

（以下余白） 実施例５ 参考例で製造した粒子ＨＰ−０　２を充填した内径７．
５ｍｍ，高さｌｏＯａｎのカラムを用い、移動相溶Ｍ液
としてリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて
、ｌｄ／分の流速で３０分間、０．　０　Ｏ　１ｍＭか
ら０．４ｍＭまでリニアグラジエント法により、蛋白質
とべブチドの混合物を分離した。圧力は、３７ｋｇ／ｃ
ｉｉであった．得られたクロマトグラムを第ｌＯ図に示
す．第１０図において、１は（Ｄ一＾１ａ”，　　Ｄ　
−ＬｅｕＳ）　一エンケファリンのピーク、２はアンギ
オテンシンＨのピーク、３はアンギオテンシン■のビー
ク、４はオバルブミンのピーク、５はウシ血清アルブミ
ンのピーク、６はミオグロビンのピーク、７はリゾチー
ムのピーク、８はαーキモトリプシノーゲンーＡのピー
ク、９はチトクロームＣのピークを示す。

実施例６ 参考例で製造した粒子ＨＰ−０２を充填した内径７．５
閣、高さ１００ｍのカラムを用い、溶離液として１＋Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐｌｌ６．８）を用いて、ｌ
Ｉｄ／分の流速でアイソクラティック法で様々なアよノ
酸を分離した。各アξノ酸の等電点と保持時間を下記の
第４表に示す． 第４表 １１ｅ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｐｈｅ Ｇｌｕ ｎｙｐ Ｔｙｒ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ ｃｔｙ Ａｓｐ Ｈｉｓ ６．０２ ６．３０ ５．９６ ５．４８ ３．２２ ５．８３ ５．６６ ５．７４ ６．００ ６．１６ ５．４１ ５．６８ ５．９７ ２．７７ ７．５９ ２．７１ ２．７３ ２．７３ ２．７３ ２．７９ ２．８６ ２．８７ ２．８９ ３．０１ ３．３５ ３．６７ ３．７８ ３．９０ ４．０８ ４．７８ Ａｒｇ　　　　　　　　１　０．　７　６　　　　　　
　　７．　９　０Ｃｙｓ−Ｃｙｓ　　　　　　　　４．
　６　０　　　　　　　　８．　４　０Ｌ　ｓ　　　　
　　　　　　９．　７　４　　　　　　　　８．　９　
０実施例７ 参考例で製造した粒子ＨＰ−０　２を充填した内径７．
５Ｍ、高さ１００ｍのカラムを用い、溶離液として１ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用いて、１
−／分の流速でアイソクラティック法でアミノ酸の混合
物を分離した。検出は、１９５１ｍのＵＶを用いて行っ
た．得られたクロマトグラムを第１１図に示す。第１１
図において、ｄはイソロイシンのピーク、ｅはアラニン
のピーク、ｆはスレオニンのピーク、ｇはアスパラギン
酸のピーク、ｈはアルギニンのピークを示す。

第１１図から明らかなとおり、分子量が低くて従来液体
クロマトグラフィーでは分離できなかったアミノ酸を鮮
明に分離することができた。このような低分子量物質の
分離は、従来はイオン交換樹脂を用いるクロマトグラフ
ィーで行われ、通常３０分程度の時間がかかっていた。

しかし、本発明によれば、極めて短時間に分離すること
ができる。

実施例８ 参考例で製造した粒子ＨＰ−０　２を充填した内径７．
　５　ｍ、高さ１００ｍのカラムを用い、溶離液として
４００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）を用
いて、ｌａｄ！／分の流速でアイソクラティック法でウ
シ血清アルブミン、リゾチーム及びチトクロームＣの混
合物を分離し、得られたクロマトグラムを第１２Ａ図に
示す。別に、同じカラムを用いて、溶離液としてリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）を用い、１−／分の流
速で１ｍＭから４００驕門まで３０分間、リニアグラジ
エント法で上記と同じ試料を分離し、得られたクロマト
グラムを第１２Ｂ図に示す。なお、第１２Ａ図及び第１
２Ｂ図において、ａはウシ血清アルプミンのピーク、ｂ
はリゾチームのピーク、ＣはチトクロームＣのピークを
示す。

さらに、上記のクロマトグラムからグラジエント法によ
る保持時間とアイソクラティック法による保持時間との
相関図を作威し、第１３図に示す．この相関図から明ら
かなとおり、２つの方法はほぼ直線的な相関を示し、ア
イソクラテインク法は極めて短時間に分離を行うことが
できるので、アイソクラティック法は、分析条件などを
検討するのに極めて好適である。

「発明の効果」 本発明の分離方法によれば、分離能の著しく高い固定相
を用いているので、蛋白質を分離できるばかりでなく、
従来の液体クロマトグラフィーでは分離が困難であった
ような低分子量のペプチド及びアミノ酸を高い分離精度
で分離することができる。また、高い試料負荷量が可能
である．キモ本発明の分離方法は、アイソクラティック
法で行うこともでき、極めて短時間で分離することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例で製造した粒子のＸ線回折図、第２図は
赤外線吸収スペクトル、第３図は孔径と細孔容積との関
係図、第４図はＨＰ−０２を用いて得られたクロマトグ
ラム、第５図はＨＰ−１０を用いて得られたクロマトグ
ラム、第６図はＨＰ一２０を用いて得られたクロマトグ
ラム、第７図はＨＰ−４　０を用いて得られたクロマト
グラム、第８図は実施例２で測定した平均粒径と理論段
数との関係図、第９図は実施例３で測定した試料負荷量
と分離度との関係図、第ｌＯ図は実施例５で得られたク
ロマトグラム、第１１図は実施例７で得られたクロマト
ダラム、第１２Ａ図は実施例８で得られたアイソクラテ
ィック法によるクロマトグラム、第１２Ｂ図は実施例８
で得られたリニアグラジエント法によるクロマトグラム
、第１３図は実施例８で得られたグラジエント法による
保持時間とアイソクラティック法による保持時間との相
関図である。 符号の説明 Ａ・・・ＨＰ−１０、Ｂ・・・ＨＰ−０２、Ｃ・・・未
焼或粒子、ａ・・・ウシ血清アルブξンのピーク、ｂ・
・・リゾチームのピーク、Ｃ・・・チトクロームＣのピ
ーク、■・・・　（Ｄ　　Ａｌａ”，Ｄ−Ｌｅｕｓ）一
エンケファリンのピーク、２・・・アンギオテンシン■
のピーク、３・・・アンギオテンシン■のピーク、４・
・・オバルブξンのピーク、５・・・ウシ血清アルプξ
ンのピーク、６・・・ミオグロビンのピーク、７．・・
・リゾチームのピーク、８・・・α−キモトリプシノー
ゲンーＡのピーク、９・・・チトクロームＣのピーク、
ｄ・・・イソロイシンのピーク、ｅ・・・アラニンのピ
ーク、ｆ・・・スレオニンのピーク、ｇ・・・アスパラ
ギン酸のピーク、ｈ・・・アルギニンのピークを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｃａ／Ｐ比１．５〜１．８０のリン酸カルシウム系
   化合物から成る平均粒径１〜４０μｍの球状の多孔質リ
   ン酸カルシウム系化合物粒子を固定相として用い、移動
   相としてリン酸塩緩衝液を用いて液体クロマトグラフィ
   ーに付すことを特徴とする蛋白質、ペプチド及びアミノ
   酸の分離方法。 ２、液体クロマトグラフィーをグラジエント法又はアイ
   ソクラティック法で行う請求項１記載の分離方法。 ３、分子量１万以上の物質の分離には、１０ｍＭ以上の
   リン酸塩緩衝液を単一移動相として用い、分子量１万以
   下の物質の分離には、１０ｍＭ以下のリン酸塩緩衝液を
   単一移動相として用いて、アイソクラティック法で液体
   クロマトグラフィーを行う請求項１記載の分離方法。