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JP3310307B2 - ブドウからのスチルベンシンターゼ遺伝子 - Google Patents

ブドウからのスチルベンシンターゼ遺伝子

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JP3310307B2
JP3310307B2 JP18567491A JP18567491A JP3310307B2 JP 3310307 B2 JP3310307 B2 JP 3310307B2 JP 18567491 A JP18567491 A JP 18567491A JP 18567491 A JP18567491 A JP 18567491A JP 3310307 B2 JP3310307 B2 JP 3310307B2
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dna
coli
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plant
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Bayer AG
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  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ブドウ(grapevines)か
ら単離されたスチルベンシンターゼの遺伝子、及びベク
ター、宿主生物及び植物の形質転換のためのその使用、
及び有害生物(pests）に対する増加した耐性を有する植
物の製造に関する。
【０００２】スチルベンという用語は、植物中に存在し
そして共通の基本的構造としてスチルベン骨格（トラン
ス−１，２−ジフェニルエチレン）を含む一群の化学物
質を表す。この基本的骨格は、更なる基を加えることに
より補足することができる。２つの重要なスチルベン
は、３，５−ジヒドロキシ−スチルベン（ピノシルビ
ン）及び３,３′，５−トリヒドロキシ−スチルベン
（レスベラトロール）である。
【０００３】スチルベンは、或る種の樹木（被子植物、
裸子植物）中に見いだされたが、草本性植物にも［フト
モモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）、ブドウ科（Ｖｉｔａｃ
ｅａｅ）及びマメ科（Ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｅ）の種
に］見いだされた。スチルベンは、有害生物、特に、カ
ビ・菌類（ｆｕｎｇｉ）、バクテリア、ウイルス及び昆
虫に対して毒性であり、これらの有害生物を撲滅するの
に適している。これらの物質を合成する能力は、植物の
重要な防衛機構とみなすことができる。都合の悪いこと
に、スチルベンを形成することができるか又は有害生物
に対して充分に耐性とするような量でスチルベンを製造
することができるのは、少数の有用な植物だけである。
【０００４】増加した有害生物耐性を有する植物を製造
するためのスチルベン合成遺伝子の使用は、既にＥＰ−
Ａ−０,３０９,８６２号に開示されている。この公報
は、ナンキンマメ植物(peanut plants)［アラキス・ヒ
ポゲア(Arachis hypogea)］からのスチルベンシンター
ゼ遺伝子を特に記載している。
【０００５】ブドウからのスチルベンシンターゼのため
の新規な遺伝子（“スチルベンシンターゼ遺伝子”）が
単離された。これらの遺伝子は、スチルベンを生産しな
い植物のゲノムに組み込むことができるか、又はこれら
の植物の有害生物に対する耐性を組込みにより不十分な
程度にしか増加させることができない植物のゲノムに組
み込むことができる。
【０００６】驚くべきことに、ブドウ(vine)からの新規
なスチルベンシンターゼ遺伝子は、先行技術から既に知
られているナンキンマメからのスチルベンシンターゼ遺
伝子よりも相当好ましい有害生物耐性を植物に与える。
【０００７】スチルベンシンターゼ遺伝子は、それらが
ＲＮＡに転写されそして（適当な環境中で）タンパク質
に翻訳されることにより、スチルベンシンターゼの性質
を有する酵素の形成（適当な環境中でのスチルベンの酵
素的合成）を引き起こす核酸（ＤＮＡ）を意味し、これ
らの核酸は、自然の環境から単離されるか、又はベクタ
ーに組み込まれているか、又は“外来”(foreign)ＤＮ
Ａ又は“追加の”(additional)ＤＮＡとして原核生物又
は真核生物中に含まれている、と理解される。
【０００８】スチルベンシンターゼ遺伝子は、それらの
開始点及び／又は終点に、その遺伝子の機能を抑制しな
いか又は実質的に抑制しない他のＤＮＡ配列を含むスチ
ルベンシンターゼ遺伝子を意味するとも理解され、“遺
伝子単位”とも呼ばれるこれらのＤＮＡ配列は、例えば
制限酵素を使用して切り出すことにより（例えば遺伝子
１の場合にはＥｃｏＲＩによる切断によりそして遺伝子
２の場合には部分的切断により）形成される。何故なら
ば慣用の制限酵素の切断部位は正確には該遺伝子の開始
点及び終点に存在しないからである。それらの端部に
は、スチルベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単位は、そ
れらの操作に適したＤＮＡ配列（例えば“リンカー”）
も有することができる。
【０００９】スチルベンシンターゼ遺伝子（又は遺伝子
単位）は、植物ゲノム（非スチルベンシンターゼコード
化配列及び／又は非調節配列（イントロンの如き）を含
む“ゲノム”形態）に含まれている形態で、又は逆転写
酵素／ポリメラーゼによりｍＲＮＡから得られ得る（も
はやイントロンを含まない）ｃＤＮＡ（“コピー”ＤＮ
Ａ）に相当する形態で存在することができる。スチルベ
ンシンターゼ遺伝子は、部分的に又は完全に合成された
形態にあることもできる。合成遺伝子とは、天然遺伝子
の一部の新規な融合により造り出される遺伝子であると
も理解される。
【００１０】本発明に従うスチルベンシンターゼ遺伝子
（又は遺伝子単位）では、ＤＮＡ切断片は、本質的に同
じ方向に作用する他のＤＮＡ切断片、又はＤＮＡsによ
り置換することができる。
【００１１】本発明に関連して、“外来”ＤＮＡは、或
る種の原核生物又は真核生物ゲノムに天然には存在しな
いが、ヒトによる操作の結果としてこのゲノムに導入さ
れるこのようなＤＮＡを意味するものと理解される。
“追加の”ＤＮＡ（特に遺伝子又は遺伝子単位又はその
一部）とは、特定の原核生物又は真核生物のゲノムに実
際に天然に存在するが、ヒトによる操作の結果として追
加の量でこのゲノムに導入されるこのようなＤＮＡであ
ろう。“外来”ＤＮＡ又は“追加の”ＤＮＡの１個又は
それより多くの試片を問題となる場合の要求及び性質に
依存して導入することができる。本発明に従うスチルベ
ンシンターゼ遺伝子（又は遺伝子単位）の参加の下に植
物又は植物細胞中で形成されるスチルベンシンターゼ
は、スチルベン骨格を示す、有害生物に対するこれらの
植物防御物質（フィトアレキシン）の形成を引き起こす
酵素を示す。
【００１２】本発明の場合に、レスベラトロールはスチ
ルベンとして特に好ましく、即ち、レスベラトロールシ
ンターゼはスチルベンシンターゼとして特に好ましい。
【００１３】既に述べたように、本発明に従うスチルベ
ンシンターゼ遺伝子は、ブドウ(vine)、好ましくは、
［ヨーロッパブドウ（ビイチス・ビニフェラ）（Vitis
vinifera)及びビチス・リパリア(Vitis riparia)］、特
に、ビイチス・ビニフェラ シーブイ・オプチマ(Vitis
vinifera cv. Optima)から単離することができるスチ
ルベンシンターゼ遺伝子である。
【００１４】本発明に従うスチルベンシンターゼ遺伝子
として特に好ましいものは、プラスミドｐＶＳｔ１、ｐ
ＶＳｔ２及びｐＶＳｔ１２ｔ３（下記で更に詳細に述べ
る）中に存在する（遺伝子単位として）スチルベンシン
ターゼ遺伝子、及び本質的に同じ方向に作用するＤＮＡ
配列である。
【００１５】ブドウに存在するスチルベンシンターゼ遺
伝子（少なくとも５種の遺伝子が仮定される）は、広範
なＤＮＡ配列相同性を示す。プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ
３に含まれたスチルベンシンターゼ遺伝子は、植物ゲノ
ム中で互いに近くに位置している（遺伝子カップリン
グ）。すべてのスチルベンシンターゼ遺伝子は、レスベ
ラトロールシンターゼをコードする。該遺伝子は、形成
されたレスベラトロールシンターゼの量により本質的に
お互いに異なる。本テキストに詳細に述べられていない
スチルベンシンターゼ遺伝子は、配列相同性の故に、分
子生物学の公知の方法を使用して慣用の方法で、決定
し、単離しそして解明することができ、これは、相同性
の故に、プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３、ｐＶＳｔ１及び
ｐＶＳｔ２上に位置した遺伝子ＤＮＡ配列の助けにより
特に有利に可能である。
【００１６】本発明に従う特に好ましいスチルベンシン
ターゼ遺伝子又は遺伝子単位は、プラスミドｐＶＳｔ１
２ｔ３に含まれたそれら又は本質的に同じ方向に作用す
るＤＮＡ配列である。
【００１７】以下に述べる“遺伝子１”と名付けられた
本発明に従う遺伝子は、プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３上
のサイズが約４．９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片上に、以下に
述べる“遺伝子単位１”と名付けられた遺伝子単位の形
態で位置している。遺伝子単位１は、また、プラスミド
ｐＶＳｔ１上にも存在しそして説明した制限酵素を使用
して、このプラスミドから単離することもできる。
【００１８】以下に述べる“遺伝子２”と名付けられた
本発明に従う更なる遺伝子は、ＥｃｏＲＩによる部分的
消化により得られる、プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３上の
サイズが約３．４ｋｂの断片上に、以下に述べる“遺伝
子単位２”と名付けられた遺伝子単位の形態で位置して
いる。Ａｓｐ７１８は遺伝子内で切断する。
【００１９】本発明に従う更なる機能的スチルベンシン
ターゼ遺伝子は、プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３の３６０
０ｂｐのＥｃｏＲＩ部位において遺伝子単位２をプラス
ミドｐＶＳｔ１２ｔ３の２００ｂｐのＥｃｏＲＩ部位と
融合することにより得られる。遺伝子単位２の断片は、
ここではプラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３上に部分的に含ま
れている更なる遺伝子（遺伝子３）の部分的配列により
補足される。この２つの遺伝子のサブ断片又は遺伝子単
位２及び３は、プラスミドｐＶＳｔ２上にも含まれる。
得られる融合遺伝子は合成遺伝子の例である。
【００２０】本発明に従う好ましい遺伝子及び遺伝子単
位は、遺伝子単位１及び２及び融合遺伝子及び対応する
遺伝子単位である。遺伝子及び遺伝子単位１及び２は特
に好ましい。
【００２１】大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｉｅｒ１ ｐＶ
Ｓｔ１は、プラスミドｐＶＳｔ１を含む。大腸菌株Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｆｉｅｒ１ ２ ｐＶＳｔ２はプラスミドｐ
ＶＳｔ２を含む。大腸菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｉｅｒ１
ｐＶＳｔ１２ｔ３は、プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３を含
む。これらの株は、特許手続きの目的で微生物の寄託の
国際認識に基づくブタペスト条約の規定に合致して、西
ドイツ、Ｄ−３３００ブラウンシュバイヒ、マッシェロ
ーデルベーグ１ｂの、微生物のドイツコレクション(Deu
ysche Sammlung von Mikroorganismen）（ＤＳＭ）に寄
託された（寄託日：Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｉｅｒ１ ｐＶＳ
ｔ１及びＥ．ｃｏｌｉ Ｆｉｅｒ１ ｐＶＳｔ２：１９
９０年６月１８日及びＥ．ｃｏｌｉ Ｆｉｅｒ１ ｐＶ
Ｓｔ１２ｔ３：１９９１年２月１１日）。
【００２２】株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｉｅｒ１ ｐＶＳｔ１
は、寄託番号ＤＳＭ６００２を与えられ、株Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｆｉｅｒ１ ｐＶＳｔ２は、寄託番号ＤＳＭ６００
３を与えられ、そして株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｉｅｒ１ ｐ
ＶＳｔ１２ｔ３は、寄託番号ＤＳＭ６３４６を与えられ
た。
【００２３】これらの株及びそれらの突然変異体は同様
に本発明の一部である。これらの宿主中に寄託されるプ
ラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３、ｐＶＳｔ１及びｐＶＳｔ２
の必要な量は、上記株を増殖させ、続いてプラスミドを
単離することにより慣用の方法で容易に得ることができ
る。
【００２４】本発明に従うスチルベンシンターゼ遺伝子
と同様に機能的に完全な遺伝子は、調節部分（特にプロ
モーター）及びタンパク質スチルベンシンターゼをコー
ド化している構造遺伝子から成る。
【００２５】両方の遺伝子部分は、互いに独立に使用す
ることができる。例えば、植物ゲノムに導入した後発現
させることを意図する異なるＤＮＡ配列（スチルベンシ
ンターゼ遺伝子から逸脱する）を調節部分の下流に配列
することが可能である。植物又は植物細胞中で活性であ
りうる単離されたプロモーターは少数のものしか知られ
ていないので、同様に本発明の一部をなすスチルベンシ
ンターゼ遺伝子のプロモーターは、形質転換された植物
又は植物細胞の製造において価値ある手段を示す。
【００２６】同様に、スチルベンシンターゼ構造遺伝子
の上流に“外来”調節部分を配列することが可能であ
る。これは、特定の植物において、或る種の調節遺伝子
（例えば自己由来の植物遺伝子）のみが充分な程度に活
性となりうる場合に有利である。故に、スチルベンシン
ターゼ構造遺伝子は、独立して使用することができる価
値ある単位を表し、そして既に説明したように、同様に
本発明の一部である。本発明に従うスチルベン構造遺伝
子は、慣用の方法により調節部分と構造遺伝子に分離す
ることができる。種々の天然に存在するスチルベンシン
ターゼ遺伝子の一部を組み合わせて新規な機能的“合
成”遺伝子（例えば遺伝子２と３の上記の組み合わせ）
を得ることも可能である。本発明に従う完全な天然のス
チルベンシンタ（又は遺伝子単位）を使用することが好
ましい。
【００２７】慣用の方法を用いて、スチルベンシンター
ゼ遺伝子（又は遺伝子単位）又はその一部を、１コピー
又はそれより多くのコピーで、好ましくは１コピーで、
原核生物（好ましくはバクテリウム）ＤＮＡ又は真核生
物（好ましくは植物）ＤＮＡ中に“外来”ＤＮＡ又は
“追加の”ＤＮＡとして導入することが可能である。例
えば、遺伝子１及び２（又はそれらの遺伝子単位）を、
それらがプラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３上に配列される方
法で一緒に導入することができる。このようにして“修
飾”されそして例えば植物又は植物細胞を形質転換する
ために使用することができ、そして形質転換後植物又は
植物細胞中に含まれる組換えＤＮＡは、本発明の構成要
素である。
【００２８】スチルベンシンターゼ遺伝子（又は遺伝子
単位）及び／又はその一部及び組換えＤＮＡは、ベクタ
ー（特にプラスミド、コスミド又はファージ中）中に、
形質転換された微生物中に、（好ましくはバクテリア、
特に大腸菌のようなグラム陰性菌中に）及び形質転換さ
れた植物細胞及び植物中に又はそれらのＤＮＡ中に、
“外来”ＤＮＡ又は“追加の”ＤＮＡとして含まれ得
る。このようなベクター、形質転換された微生物（これ
らのベクターを含むこともできる）及び形質転換された
植物細胞及び植物及びそれらのＤＮＡは、本発明の構成
要素を表す。
【００２９】既に述べたように、本発明に従うスチルベ
ンシンターゼ遺伝子（又は遺伝子単位）の２又はそれよ
り多くのコピーが、天然の植物ゲノムに（ゲノムの同一
又は異なる部位で）導入され、その際異なる遺伝子を互
いに組み合わせることが可能である。既にスチルベン合
成の能力のある植物の場合には、本発明に従う１個又は
それより多くのスチルベンシンターゼ遺伝子の導入は、
相当に改良された耐性挙動をもたらすことができる。適
当ならば、本発明に従う構造遺伝子を使用しそしてそれ
ぞれの植物から単離された調節ＤＮＡ要素の上流導入が
可能である。
【００３０】本発明に従う形質転換された植物細胞及び
植物の増加した耐性は、農業及び林業にとって重要であ
る。例えば製薬学的に利用可能な物質を得るために植物
細胞を培養する場合に、有害微生物、特にかび・菌類(f
ungi)による攻撃に対する耐性の増加した入手可能な植
物細胞を得ることも有利である。
【００３１】故に、本発明は、有害生物に対する増加し
た耐性を有する形質転換された植物細胞（原形質体を包
含する）及び植物（植物の一部及び種子を包含する）を
製造する方法であって、（ａ）ブドウからの１種又は１
種より多くのスチルベンシンターゼ遺伝子（又は遺伝子
単位）及び／又はブドウからのスチルベンシンターゼ遺
伝子（又は遺伝子単位）の一部及び／又は本発明に従う
組換えＤＮＡを、植物細胞（原形質体を包含する）のゲ
ノムに導入し、そして、適当ならば、（ｂ）形質転換さ
れた植物細胞（原形質体を包含する）から完全な形質転
換された植物を再生し、そして適当ならば増殖させ、そ
して、適当ならば、（ｃ）親世代又はそれから導かれた
更なる世代の得られる形質転換された植物から、植物の
所望の一部（種子を包含する）を得る、ことを特徴とす
る方法にも関する。
【００３２】工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、公知の
方法に従って慣用の方法で行うことができる。
【００３３】ブドウからの１種又は１種より多くのスチ
ルベンシンターゼ遺伝子（又は遺伝子単位）及び／又は
ブドウからのスチルベンシンターゼ遺伝子（又は遺伝子
単位）の一部を“外来”ＤＮＡ又は“追加の”ＤＮＡと
して含む形質転換された植物細胞（原形質体を包含す
る）及び植物（植物の一部及び種子を包含する）及び上
記の方法に従って得られる形質転換された植物細胞及び
植物は、同様に本発明の一部である。
【００３４】（ａ）植物細胞（原形質体を包含する）及
び植物（植物の一部及び種子を包含する）を形質転換す
るための、ブドウからのスチルベンシンターゼ遺伝子
（又は遺伝子単位）及び／又はそれらの一部及び／又は
本発明に従う組換えＤＮＡ及び／又は本発明に従う組換
えベクター及び／又は本発明に従う形質転換された微生
物の使用、及び、（ｂ）増殖物質を製造するため及び新
規な植物及びその増殖物質を製造するための、本発明に
従って形質転換された植物細胞（原形質体を包含する）
及び植物（植物の一部及び種子を包含する）の使用、及
び、一般に、（ｃ）有害生物を撲滅するための、ブドウ
からの本発明に従うスチルベンシンターゼ遺伝子（又は
遺伝子単位）及び／又はそれらの一部及び／又は本発明
に従う組換えＤＮＡの使用、も又本発明の一部である。
【００３５】スチルベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単
位又はそれらの一部を植物又は植物細胞の遺伝物質に
“外来”ＤＮＡ又は“追加のＤＮＡとして導入するため
の多数の種々の方法が利用可能である。遺伝子移入は、
一般に慣用の公知の方法に従って行うことができ、その
際当業者が困難なく好適な方法を決定することが可能で
ある。
【００３６】外来ＤＮＡを双子葉及びた単子葉植物のゲ
ノムに移入するために利用可能な多くの種において使用
することができる特に好ましいベクターは、アグロバク
テリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacie
ns）のＴｉプラスミドである。スチルベンシンターゼを
コードする遺伝子物質は、Ｔｉプラスミド（例えばザン
ブリスキー(Zamberyski)等、１９８３）のＴ−ＤＮＡに
導入され、そして植物を感染させること、植物の一部又
は植物組織、例えば、葉盤(leaf discs)、柄（stalk
s)、胚軸(hypocotyls)、子葉(cotyledons)、分裂組織(m
eristems）及びこれら由来の組織、例えば、二次胚(sec
ondary embryos）及びカルス（calli)を感染させること
により、又は原形質体をアグロバクテリウム・ツメファ
シエンスと共に同時培養することにより移入される。
【００３７】別法は、ポリカチオン又はカルシウム塩及
びポリエチレングリコールの存在下における、植物原形
質体に所望の遺伝子を含む精製したＤＮＡのインキュベ
ーションである（例えば、ハイン等、１９８５； クレ
ンス等、１９８２； パスツコウスキー等、１９８
４）。
【００３８】ＤＮＡ取り込み(DNA uptake）は、更に電
界により高めることもできる（エレクトロポレーショ
ン）（例えばフロム等、１９８６）。
【００３９】上記ＤＮＡは、上記ＤＮＡを有する物理的
に加速された粒子を花粉に照射することにより、植物花
粉を使用して公知の方法で導入することができる（ＥＰ
−Ａ０,２７０,３５６Ｂ号参照）。
【００４０】植物は、適当な培地の助けにより公知の方
法で再生される（例えばネイジー及びマリガ１９７
６）。
【００４１】本発明に従う方法の好ましい態様では（Ｅ
Ｐ−Ａ１１６，７１８号に記載の方法に従って）、プラ
スミドｐＶＳｔ１２ｔ３又はｐＶＳｔ１からの遺伝子又
は遺伝子単位を、適当な媒介大腸菌ベクター(intermedi
ary E.coli vector)、例えばｐＣＶ００１又はｐＣＶ０
０２（ＥＰ−Ａ１１６，７１８号；コンクツ等、１９８
６）参照）又は好ましくは、例えばｎｐｔＩＩ（ヘレラ
−エストレラ等、１９８３）又はｈｐｔ（ファン・デン
・エルツェン等、１９８６）のようなレポーター遺伝子
を更に含むその誘導体中にクローニングする。
【００４２】上記構造のプラスミドは、慣用の方法を使
用して（例えばファン・ハウテ等、１９８３）例えばｐ
ＧＶ３８５０又はその誘導体（ザンブリスキー等、１９
８３）を含むアグロバクテリウム・ツムファシエンスに
移入される。この方法で遺伝子１及び遺伝子２を一緒に
移入することもできる。別法として、スチルベンシンタ
ーゼ遺伝子単位をバイナリーベクター(binary vector)
中にクローニングし（例えばコンクツ及びシェル１９８
６）そしてそれを上述の如き適当なアグロバクテリウム
菌株に移入する（コンクツ及びシェル１９８６）ことが
可能である。植物に移入することができる形態でスチル
ベンシンターゼ遺伝子又は遺伝子単位を含む得られるア
グロバクテリウム菌株を、次いで植物形質転換に使用す
る。
【００４３】更なる好ましい態様では、プラスミドｐＶ
Ｓｔ１２ｔ３又は単離されたプラスミドｐＶＳｔ１又は
単離された遺伝子又は遺伝子単位を、適当ならば、植物
細胞のためののレポーター遺伝子、例えば、カナマイシ
ン耐性（例えばヘレラ−エストレラ等、１９８３）又は
ヒグロマイシン耐性（ファン・デン・エルツェン、１９
８６）のレポーター遺伝子を含む他のプラスミド、好ま
しくはｐＬＧＶｎｅｏ２１０３（ハイン等１９８５）、
ｐＬＧＶ２３ｎｅｏ（ヘレラ-エストレラ１９８３、ｐＭ
ＯＮ１２９(フレイリー・アール・テー等、プロシーディン
グス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイ
エンス・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.National Acad.
Sci.USA)８０、４８０３（１９８３））、ｐＡＫ１００
３、ｐＡＫ２００４（ベルテン・ジェー等、ヨーロピア
ン・モレキュラー・バイオロジー・オルガニゼーション
・ジャーナル(EMBO Journ)、３巻、２７２３（１９８
４））又はｐＧＳＳＴｎｅｏ３（ｐＧＳＳＴ３）（ＥＰ
−Ａ−１８９，７０７号）と一緒に、直接遺伝子移入
（例えばハイン等、１９８５）を使用して慣用の方法で
植物原形質体に移入する。これに関して、プラスミド又
は遺伝子又は遺伝子単位は、環状で存在することができ
るが、線状で存在するのが好ましい。レポーター遺伝子
を有するプラスミドを使用する場合には、カナマイシン
耐性原形質体をスチルベンシンターゼ発現についてチェ
ックする。他の場合には（レポーター遺伝子がない場
合）、得られるカルスをスチルベンシンターゼ遺伝子の
発現について試験する（慣用の方法によるスクリーニン
グ）。
【００４４】形質転換された（トランスジェニック）植
物又は植物細胞は、公知の方法により、例えば、再生性
植物原形質体又は細胞培養物とアグロバクテリウム・ツ
メファシエンスの同時培養（例えばモートン等、１９７
９；ハイン等１９８５）又は直接ＤＮＡトランスフェク
ションによる葉盤形質転換（例えばホルシュ等、１９８
５）により生産される。得られる形質転換された植物
は、例えば、カナマイシンサルフェートによる及びカナ
マイシンのホスホリル化の生体外アッセイ（レイス等、
１９８４；シュライエル等、１９８５）によるレポータ
ー遺伝子発現による選択、又はノパリン(nopalin）シン
ターゼ発現（アエルツ等、１９８３の方法に従って）又
はノザーンブロット分析及びウエスタンブロット分析を
使用するスチルベンシンターゼ発現により検出される。
スチルベンシンターゼ及びスチルベンは、特異的抗体の
助けにより公知の方法で形質転換された植物において検
出することもできる。スチルベンシンターゼは、酵素活
性を試験することによっても検出することができる（ロ
ルフス等、プラント・セル・レポーツ(Plant Cell Repo
rts)１、８３−８５、１９８１）。
【００４５】形質転換された植物の培養及び完全な植物
を得るための再生は各場合に適した培地を使用して一般
に慣用の方法により行われる。
【００４６】そのすべてが本発明に従うスチルベンシン
ターゼ遺伝子（又は遺伝子単位）を含みそして本発明の
構成要素である形質転換された植物細胞及び形質転換さ
れた植物は、有害生物、特に植物病原性カビ・菌類(phy
topathogenic fungi)に対する相当増加した耐性を示
す。
【００４７】本発明に関連して、“植物”という用語
は、完全な植物及び植物の一部、例えば、葉、種子、塊
茎(tubers)、挿木(cuttings)等を示す。“植物細胞”
は、原形質体、細胞系(cell lines)、植物カルス等を包
含する。“増殖物質”は、形質転換された植物及び植物
細胞を増殖させるために使用することができる植物及び
植物細胞を示し、従って同様に本発明の一部である。
【００４８】本発明に関連して、“本質的に同じ方向で
作用するＤＮＡ配列”とは、本発明が、スチルベンシン
ターゼがもはや形成されないか又は調節遺伝子部分がも
はや有効ではないようにはスチルベンシンターゼ遺伝子
及びその一部の機能が制限されない修飾も含むというこ
とを意味する。問題の修飾は、ＤＮＡ切断片、個々のコ
ドン及び／又は個々のヌクレオチドの置換、付加及び／
又は除去により達成することができる。
【００４９】本発明に従って使用することができる微生
物に関連して、“突然変異体”とは、本発明を実施する
ために必須の特徴を依然として示す、特に問題のプラス
ミドを含む修飾された微生物を示す。
【００５０】本発明に従ってスチルベンシンターゼ遺伝
子（又は遺伝子単位）を導入すること（形質転換）によ
り上記有害生物に対する耐性又は増加した耐性を付与す
ることができる植物には、実質的にすべての植物が包含
される。耐性の付与が特に要求されるものとしては、作
物、例えば、森林植物、例えば、モミ(firs）、トウヒ
（spruces)、ダグラスファー(Douglas firs)、マツ、カ
ラマツ(larch)、ブナノキ(beeches)及びオーク(oaks)及
び食物及び原料を提供する植物、例えば、穀物(cereal
s)（特に、コムギ、ライムギ、オオムギ、エンバク(oat
s)、キビ(millet)、コメ及びトウモロコシ）、ジャガイ
モ、マメ科植物(Leguminosae)例えば豆類(pulses)、特
に、ムラサキウマゴヤシ（alfalfa)、大豆、野菜（特
に、キャベツの種及びトマト類）、果物（特にリンゴ、
セイヨウナシ、サクランボ、ブドウ、柑橘類、パイナッ
プル及びバナナ）、ギネアアブラヤシ(oil palms)、茶
の木(rea shrubs)、ココアの木(cocoa shrubs)及びコー
ヒーの木(cofee shrubs)、タバコ、サイザルアサ及び綿
及びインドジャボク(Rauwolfia)及びジギタリスのよう
な薬用植物である。特に好ましいものとして挙げること
ができる作物は、ジャガイモ、トマト、ブドウ及びマメ
科の植物(legumes）である。本発明に従うスチルベンシ
ンターゼ遺伝子を“外来”ＤＮＡとして（即ち、ブドウ
以外の植物において）植物のゲノムに導入することが可
能である。
【００５１】本発明に従ってスチルベンシンターゼ遺伝
子により有害生物に対する耐性又は増加した耐性を得る
ことができるその有害生物としては、昆虫、ダニ、及び
線虫のような動物害虫及び植物病原性カビ・菌類、バク
テリア及びウイルスのような有害微生物(microbial pes
ts)を挙げることができる。有害微生物、特に、植物病
原性カビ・菌類が特に強調される。
【００５２】特に有害な昆虫には、次の目：直翅目(Ort
hoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera）、
総翅目（Thysanoptera)、異翅目(Heteroptera）、同翅
目(Homoptera)、鱗翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleopt
era）、膜翅目(Hymenoptera）及び双翅目(Diptera）が
包含される。
【００５３】有害なダニには、特に、ホコリダニ(Tarso
nemus）の種、ハダニ(Panonychus)の種、及びナミハダ
ニ(Tetranychus)の種を包含する。
【００５４】有害な線虫類には、特に、ネグサレセンチ
ュウ(Pratylenchus)の種、シストセンチュウ(Heteroder
a)の種及びネコブセンチュウ(Meloidogyne)の種が包含
される。
【００５５】有害微生物には、特に、植物病原性カビ・
菌類：ネコブカビ類(Plasmodiophoromycetes)、卵菌類
(Oomycetes)、ツボカビ類(Chytridiomycetes）、接合菌
類(Zygomycetes）、子嚢菌類（Ascomycetes）、担子菌
類（Basidiomycetes）、不完全菌類(Deuteromycetes)が
包含される。 植物病原性バクテリアには、特に、シュードモナス科(Pse
udomonadaceae)、リゾビウム科(Rizobiaceae)、腸内細
菌科(Enterobacteriaceae)、コリネバクテリウム科(Cor
ynebacteriaceae)及びストレプトミセス科(Streptomyce
taceae)を包含する。
【００５６】ウイルス疾患には、特に、モザイクウイル
ス(mosaic viruses)、矮化ウイルス(stunting viruses)
及び黄変化ウイルス(yellowing viruses）が包含され
る。
【００５７】下記の包括的名称の部類に入るウイルス疾
患、カビ・菌類疾患及びバクテリア疾患のいくらかの原
因生物を例として挙げることができるが、限定として挙
げるものではない：オオムギ黄萎ウイルス(barley yell
ow dwarf virus)(ＢＹＤＶ）、ジャガイモＹウイルス(p
otato virus Y)、キュウリモザイクウイルス(cucumber
mosaic virus)（ＣＭＶ）、カボチャモザイクウイルス
(watermelon mosaic virus)（ＷＭＶ）、トリステイザ
ウイルス(tristeza virus)、タバコモザイクウイルス(to
baccomosaic virus)（ＴＭＶ）、タバコネクロシスウイ
ルス(tobacco necrosis virus)（ＴＮＶ）、ビート壊疽
性葉脈黄化ウイルス(beet necrotic yellow vein viru
s)（ＢＮＹＶＶ）及びビートのそう根病ウイルス(rhizo
mania virus)。
【００５８】カントモナス属Xanthomonas)の種，例え
ば、カントモナス・カムペストリス ・ピーブイ・オリザエ
(Xanthomonas campestris pv. oryzae)(イネの白葉枯病
菌)、シュードモナス属の種、例えば、シュードモナス・
シリンガエ・ピーブイ・ラクリマンス(Pseudomonas syrin
gae pv.lachrymans)(スイカの萎ちょう病菌)、エルウィ
ニア属の種、例えば、エルウィニア・アミロボラ(Erwin
ia amylovora)（リンゴ・ナシの火傷病菌）、フハイカ
ビ属(Pythium)の種、例えば、ピシウム・ウルチムム(Py
thium ultimum)、エキビョウキン属(Phytophthora)の
種、例えば、フィトホソラ・インフェスタンス(Phytoph
thora infestans)（トマトの疫病菌）、シュードペルノ
スポーラ(Pseudopernospora)属の種、例えば、シュード
ペルノスポーラ・ヒュミリ(Pseudopernospora humuli)
（ホップのべと病菌）又はシュードペルノスポーラ・キ
ュベンス(Pseudopernospora cubense)（ウリのべと病
菌）、タンジクツユカビ属(Plasmopara）の種、例え
ば、プラスモパラ・ビチコラ(Plasmopara viticola)
（ブドウのべと病菌）、ツユカビ属(Peronospora)の
種、例えば、ペルノスポーラ・ピシ(Peronosporapisi)
(エンドウのべと病菌）又はペルノスポーラ・ブラシカ
エ(Peronospora brassicae）（キャベツ・ハクサイのべ
と病菌）、エリシフェ属(Erysiphe)の種、例えば、エリ
シフェ・グラミニス(Erysiphe graminis）（ムギ類のう
どん粉病菌）、スフアエロテカ属(Sphaerotheca)の種、
例えば、スフアエロテカ・フリギネア(Sphaerotheca fu
liginea）（アズキのうどん粉病菌）、ポドスファエラ
属(Podosphaera)の種、例えば、ポドスファエラ・ロイ
コトリカ（Sphaerotheca leucotricha）（リンゴのうど
ん粉病菌）、ベンチュリア属:Venturia）の種、例え
ば、ベンチュリア・インアエカリス（Venturia inaequa
lis)（リンゴの黒星病菌）、ピレノフォーラ属(Pyrenop
hora)の種、例えば、ピレノフォーラ・テレス（Pyrenop
hora teres)（オオムギの網斑病菌）又はピレノフォー
ラ・グラミネア（P.graminea)（オオムギ斑葉病菌）
（分生子形態：ドレクスレラ(Drechslera)、同物異語(sy
n):ヘルミンソスポリウム(Helminthosporium)、コクリ
オボラス属(Cochliobolus)の種、例えば、コクリオボラ
ス・サチブス（Cochliobolud sativus）（オオムギ、コ
ムギの斑点病菌）（分生子形態：ドレクスレラ、同物異
語：ヘルミンソスポリウム（Helminthosporium）、ウロ
ミセス属(Uromyces)の種、例えば、ウロミセス・アペン
ディキュラツス(Uromyces appendiculatus)(インゲンマ
メのさび病菌)、 プクシニア属(Puccinia)の種、例えば、プクシニア・レ
コンディタ(Puccinia recondita)（コムギの赤さび病
菌）、ナマグサクロボキン属(Tilletia)の種、例えば、
ティレティア・カリエス（Tiletia caries)（コムギの
網なまぐさ黒穂病菌）、クロボキン属(Ustilago)の種、
例えば、ウスチラゴ・ヌダ(Ustilago nuda)（オオムギ
の裸黒穂病菌）、ペリキュラリア属(Pellicularia)の
種、例えば、ペリキュラリア・ササキイ（Pellicularia
sasakii)、ピリキュラリア属(Pyricularia）の種、例
えば、ピリキュラリア・オリザエ(Pyricularia oryzae)
（イネのいもち病菌）、フザリウム属(Fusarium）の
種、例えば、フザリウム・クルモルム(Fusarium culmor
um)（赤かびトキシン産生菌）、ボトリチス属（Botryti
s）の種、例えば、ボトリチス・シネレア(Botrytis cin
erea)（灰色かび病菌）、セプトリア属(Septoria）の
種、例えば、セプトリア・ノドルム(Septoria nodorum)
（コムギのふ枯病菌）、レプトスファエリア属（Leptos
phaeria）の種、例えば、レプトスファエリア・ノドル
ム(Leptosphaeria nodorum)（コムギのふ枯病菌）、ケ
ルコスポーラ属(Cercospora）の種、例えば、ケルコス
ポーラ・カネッセンス(Cercospora canescens)（アズキ
の褐斑病菌）、アルテルナリア属(Alternaria)の種、例
えば、アルテルナリア・ブラシカエ(Alternaria brassi
cae）（アブラナ科の野菜黒斑病菌）、及び、シュード
ケルコスポレラ属(Pseudocarcosporella）の種、例え
ば、シュードケルコスポレラ・ヘルコトリポイデス(Pse
udocarcosporella herpotrichoides)。更にヘルミンソス
ポリウム・カルボヌム(Helminthosporium carbonum）を
挙げることができる。
【００５９】本発明を下記の実施例により更に詳細に説
明する。１．ブドウからのスチルベンシンターゼ遺伝子の単離 ブドウ（ビチス・ビニフェラ・シーブイ・オプチマ（Vi
tis vinifera,cv. Optima)の植物及び細胞培養物は、レ
スベラトロールシンターゼ（タンパク質サイズ４５，０
００Ｄ；特異的抗血清との反応）の形成を引き起こすス
チルベンシンターゼ遺伝子を含む。
【００６０】スチルベンシンターゼ遺伝子の単離には、
例えば、下記のハンドブック：マニアチス・テイ、フリ
ッツ・イー・エフ、サムブルック・ジェー：分子クロー
ニング：実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Labo
ratory Manual); コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー、第２版 １９８９に詳細に記載されているよ
うに、分子生物学で知られたプロセス及び方法を使用し
た。
【００６１】最初に、ブドウの“遺伝子ライブラリー”
を確立し、濃縮された細胞核からのゲノムＤＮＡ（ベッ
ドブルック・ジエー、プラント・モレキュラー・バイオ
ロジー・ニュースレター(Plant Molecular Biology New
sletter)２、２４、１９８１)を、約１２，０００ヌクレオ
チド対の平均長のＤＮＡ断片が形成されるように、制限
酵素ＮｄｅＩＩにより切断する。これらの断片を、λフ
ァージＥＭＢＬ４（フリスシャオフ等、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー(J.Mol.Biol)、１７
０、８２７−８４２、（１９８３）のＢａｍＨＩ部位に
クローニングし、このファージを大腸菌(E.coli)中で増
殖させる。全体のファージ集団は、個々の断片にクロー
ニングされたブドウ細胞の全体のゲノムＤＮＡを含んで
おり、従ってスチルベンシンターゼ遺伝子(多重遺伝子
族)も含む。 スチルベンシンターゼ遺伝子、それらのｍＲＮＡ及びス
チルベンシンターゼのｃＤＮＡは、同一核酸配列を含
む。その理由は、それらは互いに誘導することができる
（遺伝子→ｍＲＮＡ→ｃＤＮＡ）からである。これは、
スチルベンシンターゼ遺伝子は、スチルベンシンターゼ
ｃＤＮＡとの特異的ハイブリダイゼーション（シュレダ
ー等、１９８８；メルキオール及びキンドル１９９０；
ＥＰ−Ａ−３０９８６２）により、又はＥＰ−Ａ−３０
９８６２に示されたＤＮＡ配列から導くことができる特
異的オリゴヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーシ
ョンにより同定することができる。上記遺伝子を有する
ファージを、ハイブリダイゼーションにより同定し、次
いで単離しそして増殖させる。このファージにおいてク
ローニングされるブドウからのゲノムＤＮＡを、種々の
制限酵素を使用する分析により更にマッピングし、ｃＤ
ＮＡ配列又は合成オリゴヌクレオチドを使用する更なる
ハイブリダイゼーション実験により、スチルベンシンタ
ーゼ遺伝子の位置を決定する。最後に、ＥｃｏＲＩによ
る消化又はＥｃｏＲＩによる部分的消化によりファージ
から遺伝子単位を切り出し、適当に切断されたプラスミ
ドベクターＰＵＣ１８（製造業者：西ドイツ、エッゲン
シュタインのギブコ−ＢＲＬ社（Gibco-BRL GmbH)にお
いてクローニングし、そして組換えプラスミドとして増
殖させる。
【００６２】本発明に従う更なるスチルベンシンターゼ
遺伝子を単離するために、プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ
３、ｐＶＳｔ１及びｐＶＳｔ２上に位置付けられた遺伝
子に含まれているＤＮＡ配列を、配列相同性のゆえに、
プローブとして使用することができる。例えば、下記の
配列のオリゴヌクレオチドを、使用することもできる。
これらの図はコード化領域の開始点に位置付けられてい
るＡＴＧ配列のＡに対するヌクレオチドの位置を示す。
【００６３】
【表１】
【００６４】これらの配列又は大部分が相同性の配列
は、本発明に従うスチルベンシンターゼ遺伝子中に含ま
れており、その結果該スチルベンシンターゼ遺伝子はこ
れらの配列の含有率又はこれらの配列に対して大部分が
相同性である配列の含有率により特徴付けられることも
できる。
【００６５】２．プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３、ｐＶＳ
ｔ１及びｐＶＳｔ２の説明（第１図乃至第３図参照） Ａ）プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３、ｐＶＳｔ１及びｐＶ
Ｓｔ２は２つの成分から成る： １．遺伝子単位又は遺伝子部分 （ａ）プラスミドｐＶＳｔ１：遺伝子１の構造遺伝子及
び調節遺伝子部分［ブドウ、シーブイ・オプチマ(grape
vine,cv．Optima)からの］を含む遺伝子単位１は、制限
酵素ＥｃｏＲＩによる切断(cleavage)により（約）４９
００ｂｐのＤＮＡ断片としてプラスミドｐＶＳｔ１から
切り出すことができる核酸上に位置付けられている。
【００６６】（ｂ）プラスミドｐＶＳｔ２ 遺伝子２及び遺伝子３の配列は、サイズが３．４ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片上に位置付けられている。この断片の環
化は、遺伝子２及び３の遺伝子部分から成る機能的合成
スチルベンシンターゼ遺伝子を与える。
【００６７】（ｃ）プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３ プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３は、ベクターｐＵＣ１８に
おいてλファージＤＮＡによりフランキングされた（fl
anked）、約１２６００ｂｐのビチス・ビニフェラのゲ
ノム断片を含む。完全な遺伝子単位１及び２はサイズが
約１２６００ｂｐであるこの断片上に位置付けられてい
る。しかしながら、遺伝子３のすべてがこの断片にある
のではない。遺伝子単位１は、長さが４９００ｂｐの断
片としてＥｃｏＲＩ消化により単離することができる。
【００６８】遺伝子単位２は、３４００ｂｐ断片上の部
分的ＥｃｏＲＩ消化により単離することができる。
【００６９】２．ベクタープラスミド 遺伝子単位又は遺伝子部分は、ベクターｐＵＣ１８にク
ローニングされる。このベクターのサイズは、２６８６
ヌクレオチド対である。それは、アンピシリン耐性遺伝
子を有する。即ち、このプラスミドを有する大腸菌細胞
は、抗生物質アンピシリンを含む普通培地中で増殖す
る。Ｏｒｉ：大腸菌中のプラスミドを増殖させるために
必要な配列の用語。
【００７０】プラスミドｐＶＳｔ１及びｐＶＳｔ２は、
アンピシリン耐性の遺伝子を有する。それらは、ｐＶＳ
ｔ１又はｐＶＳｔ２を含む大腸菌細胞（それぞれ、Ｅ．
ｃｏｌｉ Ｆｉｅｒ １及びＥ．ｃｏｌｉ Ｆｉｅｒ１
２）中で慣用の方法で増殖させることができる。同じ
ことがＥ．ｃｏｌｉ Ｆｉｅｒ株 ｐＶＳｔ１２ｔ３に
もあてはまる。
【００７１】ｐＶＳｔ１、ｐＶＳｔ２及びｐＶＳｔ１２
ｔ３を含む大腸菌細胞（例えばＪＡ２２１、ナカムラ・
ケイ、イノウエ・エム、ヨーロピアン・モレキュラー・
バイオロジー・オルガニゼーション・ジャーナル(EMBO
J)、１、７７１−７７５、１９８２）のための好ましい
普通培地（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｎｕｒｄｕｇ ２０１０）： バクトペプトン(Bacto peptone)＊ １０ｇ 酵母抽出物 ５ｇ ＮａＣｌ ５ｇ 寒天 ２０ｇ Ｈ2Ｏ １ｌ ｐＨ ７．５ ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを上記普通培地に加え
る。
【００７２】発酵：３７℃、好気性条件。
【００７３】（＊バクト（Ｂａｃｔ）は米国、デトロイ
トのディフコ・ラボラトリーズ社の商標名である）。３．タバコの形質転換 ａ）タバコ(shoot)新芽培養及びタバコ原形質体の単離 タバコ（Nicotiana tabacum(Petit Havanna SR1)をホル
モン不含有ＬＳ培地（リンスマイアー及びスクッグ１９
６３）での無菌新芽培養物として増殖させる。約６−８
週間毎に新芽切片を新しいＬＳ培地に移す。新芽培養物
は１２時間の光（１０００−３０００ルックス）で２４
−２６℃で成長キャビネット中に保つ。
【００７４】葉の原形質体の単離のために、約２グラム
の葉（長さが約３−５ｃｍ）を、新しい安全かみそりの
刃を用いて小片（０．５ｃｍ×１ｃｍ）に切断する。こ
の葉材料を、Ｋ３培地（ネイジー及びマリガ１９７
６）、スクロース０．４モル、ｐＨ５．６、ツェルラー
ゼ(Zellulase)Ｒ１０（セルバ）２％、マセロジム(Mace
rozym)Ｒ１０（セルバ）０．５％から成る酵素溶液２０
ｍｌ中で、室温で１４−１６時間インキュベーションす
る。この後、０．３０ｍｍ及び０．１ｍｍ鋼製ふるいで
のろ過により細胞砕片(cell debris）から原形質体を分
離する。ろ液を、１００ｘｇで１０分間遠心分離する。
この遠心分離の間、無傷の原形質体は、バンドの形態で
酵素溶液の頂部に浮上しそして集まる。細胞砕片及び酵
素溶液から成るペレットを、ガラス毛細管を使用する吸
引により除去する。予め清浄にした原形質体を、新たな
Ｋ３培地（浸透圧剤として０．４Ｍのスクロース）を用
いて１０ｍｌに構成しそして再浮上させる。洗浄培地を
吸引により除去しそして原形質体を、培養のため又はア
グロバクテリアによるその後の感染（同時培養）のため
に１−２×１０5／ｍｌに希釈する。原形質体濃度は血
球計数器(haemocytometer）により決定する。
【００７５】ｂ）アグロバクテリウム・ツムファシエン
スとの同時培養による再生性タバコ原形質体の形質転換 下記においては、マートン等、１９７９の僅かに修正さ
れた方法を使用する。上記の如くして原形質体を単離し
そしてＫ３培地（スクロース０．４モル、０．１ｍｇ／
ｌＮＡＡ、カイネチン０．２ｍｇ）中で１−２×１０5
／ｍｌの密度で暗所で２日間及び弱い光（５００ルック
ス）下に１乃至２日間２６℃でインキュベーションす
る。最初の原形質体分割が起こるやいなや、最小Ａ（Ａ
ｍ）培地中のアグロバクテリア懸濁液（密度約１０9ア
グロバクテリア／ｍｌ）３０μｌを、再生性原形質体３
ｍｌに加える。同時培養を暗所で２０℃で３−４日間行
う。次いでタバコ細胞を１２ｍｌの遠心分離管にデカン
テーションし、海水（６００ｍＯｓｍ／ｋｇ）で１０ｍ
ｌに希釈し、そして６０×ｇで１０分間ペレットにす
る。この洗浄プロセスを１回又は２回反復してアグロバ
クテリアの大部分を除去する。細胞懸濁液を、１ｍｇ／
ｌＮＡＡ（ナフチル−１−酢酸）、０．２ｍｇ／ｌのカ
イネチン及び５００ｍｇ／ｌのセファロスポリンセフォ
タキシム抗生物質を含むＫ３培地（スクロース０．３モ
ル）中で５×１０4／ｍｌの密度で培養する。細胞懸濁
液を、新しいＫ３培地を用いて１週間毎に希釈し、そし
て培地の浸透圧値を、週当たり０．０５モルスクロース
（約６０ｍＯｓｍ／ｋｇ）徐々に減少させる。カナマイ
シン（１００ｍｇ／ｋｇカナマイシンサルフェート（シ
グマ）、６６０ｍｇ／ｇ活性ｋｍ）による選択を、アガ
ロース“ビーズ型培養”（シリト等、１９８３）での同
時培養の２−３週間後に開始する。カナマイシン耐性コ
ロニーは、選択の開始から２−３週間後発育の遅れたコ
ロニーのバックグラウンドから区別することができる。
【００７６】ｃ）ＤＮＡによるタバコ原形質体の直接形
質転換・硝酸カルシウム／ＰＥＧ形質転換 ペトリ皿において、Ｋ３培地１８０μｌ中の約１０6の
原形質体を、０．５μｇ／μｌプラスミドｐＶＳｔ１２
ｔ３又は例えば０．５μｇ／μｌｐＬＧＶｎｅｏ２１０
３（ハイン等、１９８５）と混合された０．５μｇ／μ
ｌプラスミドｐＶＳｔ１を含む２０μｌ水性ＤＮＡ溶液
と注意深く混合する。次いで２００μｌの融合溶液（硝
酸カルシウム０．１モル、マンニトール０．４５Ｍ、ポ
リエチレングリル（ＰＥＧ６０００）２５％、ｐＨ９）
を注意深く加える。１５分の後、洗浄溶液（硝酸カルシ
ウム０．２７５Ｍ、ｐＨ６）５ｍｌを加えそして更に５
分後の、原形質体を遠心分離管に移し６０×ｇでペレッ
ト化する。このペレットを少量のＫ３培地に取り込み、
下記の節に記載の如くして培養する。別法として、原形
質体をハイン等、１９８３により記載の如くして形質転
換することができる。
【００７７】形質転換は、０．５μｇ／μｌｐＬＧＶｎ
ｅｏ２１０３の添加なしで行うこともできる。この場合
にはレポーター遺伝子は使用されないので、得られるカ
ルスを、ドットブロットハイブリダイゼーションを用い
てスチルベンシンターゼ遺伝子単位の存在について試験
することができる。使用することができるハイブリダイ
ゼーションプローブは、ｐＶＳｔ１又はｐＶＳｔ２から
の内部ＥｃｏＲＩ断片である。抗体アッセイ又は、カビ
・菌類に対する増加した耐性の検出の如き他の検出方法
も、もちろん使用することができる。
【００７８】ｄ）ＤＮＡと一緒にインキュベーションさ
れた原形質体の培養及びカナマイシン耐性カルスの選択 下記の培養のため及びカナマイシン耐性コロニーの選択
のために、修正された“ビーズ型培養”法（シリト等、
１９８３）を使用する。原形質体をＤＮＡで処理して
（Ｃ参照）１週間後、細胞懸濁液３ｍｌを、５ｃｍのペ
トリ皿でＫ３培地［スクロース０．３Ｍ＋ホルモン；
（シープラーク（Seaplaque））ＬＭＴアガロース［低
融点アガロース、マリン・コロイズ(Marine Colloid
s)］１．２％］３ｍｌと混合する。この目的で、乾燥ア
ガロースをオートクレーブ処理し、Ｋ３培地を加え、混
合物をマイクロ波オーブン中で短時間煮沸する。アガロ
ースが固化した後、アガロースディスク（“ビーズ”）
を埋め込まれたタバコ微小カルス(embedded tobacco mi
crocalli)と一緒に、さらに培養及び選択するために１
０ｃｍのペトリ皿に移し、Ｋ３培地（スクロース０．３
Ｍ、１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／ｌカイネチン）
１０ｍｌ及び１００ｍｇ／ｌカナマイシンサルフェート
（シグマ）のバッチを加える。この液体培地を１週間毎
に取り換える。このプロセス中、培地の浸透圧値を徐々
に降下させる。
【００７９】交換培地（Ｋ３＋ｋｍ）を１週間ごとに
０．０５モルスクロース（約６０ｍＯｓｍ）減少させ
る。
【００８０】 ＤＮＡ形質転換後のカナマイシン耐性タバココロニーの選択ダイアグラム 0.4 M 0.3 M 0.25 M 0.20 M 0.15 M 0.10 M 液体培地中のスクロースUES K 1 2 3 4 5 6 DNA 取り込み後の週 (K3 培地，NAA 1 mg，kinetin 0.2 mg) Ｕ＝ＤＮＡ取り込み Ｅ＝アガロース中に埋め込み Ｓ＝カナマイシン（１０ｍｇ／ｌのカナマイシンサルフ
ェート）による選択 Ｋ＝カナマイシン耐性コロニーはバックグラウンドから
明白に区別することができる。
【００８１】ｅ）カナマイシン耐性植物の再生 カナマイシン耐性コロニーが約０．５ｃｍの直径に到達
すると直ちに、それらの半分を再生培地（ＬＳ培地、ス
クロース２％、０．５ｍｇ／ｌベンジルアミノプリン
Ｂａｐ）上に置き、培養物を１２時間の光（３０００−
５０００ルックス）で２４℃で増殖キャビネット内に維
持する。他の半分を１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ、０．２ｍｇ／
ｌカイネチン、０．１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ及び１００ｍｇ
／カナマイシンサルフェートを含むＬＳ培地でカルス培
養物として増殖させる。再生された新芽が約１ｃｍのサ
イズを有すると、切り取りそして根付かせるために成長
調節因子なしに１／２ＬＳ培地（スクロース１％、寒天
０．８％）上に置く。新芽を１０ｍｇ／ｌカナマイシン
スサルフェートを含む１／２ＬＳ培地上に根付かせ、そ
して後に土壌に移植する。
【００８２】ｆ）アグロバクテリウム・ツムファシエン
スによる葉盤の形質転換 葉盤の形質転換（ホルシュ等１９８５）のために、無菌
新芽培養物の長さ約２−３ｃｍの葉を１ｃｍの直径のデ
ィスクに打ち抜き、このディスクを、適当なアグロバク
テリア［Ａｍ培地中約（１０9／ｍｌ）（ｂ参照）、下
記参照］の懸濁液と約５分間インキュベーションする。
感染した葉の部分を約２４℃で３−４日間ホルモンなし
のＭＳ培地（下記参照）上に保つ。この期間、アグロバ
クテリウムは、増殖と共に葉の部分を覆う。次いでこの
葉の部分をＭＳ培地（０．５ｍｌＢＡＰ、０．１ｍｇ／
ｍｌ ＮＡＡ）中で洗浄し、５００μｇ／ｍｌセフォタ
キシム及び１００μｇ／ｍｌカナマイシンサルフェート
（シグマ）を含む同じ培地（寒天０．８％）上に置く。
培地は、２週間後に更新されるべきである。形質転換さ
れた新芽は、更に２−３週間後には目に見えるようにな
る。新芽の再生もまた、選択圧力なしに平行に行われる
べきである。次いで再生された新芽は、例えばノパリン
シンターゼ又はスチルベンシンターゼ活性似ついて生物
学的試験を用いて形質転換について試験されなければな
らない。形質転換された新芽の１−１０％がこのように
して得られる。
【００８３】形質転換を検出するための生物学的方法 植物組織中のノパリンの検出 ノパリンは、オッテン及びシルペルールト（１９７８）
により述べられた如く、下記の如くして検出される。エ
ッペンドルフ(Eppendorf)容器中で、植物材料（カルス
又は葉の部分）５０ｍｇを、アルギニン０．１Ｍを含む
ＬＳ培地中で室温で一夜インキュベーションする。次い
で植物材料を、吸収性紙を当て、ガラス棒を用いて新た
なエッペンドルフ遠心分離容器中で均質化し、ホモジネ
ートをエッペンドルフ遠心分離器で２分間遠心分離す
る。上澄液２μｌを、電気泳動に適した紙（２０×４０
ｃｍ）（ホワットマン３ＭＭ紙）のシートに、小さなス
ポットの形態で施し、次いで乾燥する。紙のシートを、
移動相（ギ酸５％、酢酸１５％、Ｈ2Ｏ８０％、ｐＨ
１．８）で飽和させ、４００ボルトで４５分間電気泳動
を行う。ノパリンはカソードに移行する。次いで紙のシ
ートを熱風の流れの中で乾燥し、フェナンスレンキノン
色素（等容量のエタノール中の０．０２％濃度のフェナ
ンスレンキノン及び６０％濃度エタノール中の１０％濃
度ＮａＯＨ）を通して移動の方向に引っぱる。乾燥した
紙のシートを長波紫外線下に見そして写真を取る。この
試薬はアルギニン及びアルギニン誘導体を蛍光黄色に着
色する。
【００８４】ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
（ＮＰＴ ＩＩ）酵素アッセイ 植物組織中のＮＰＴ ＩＩ活性は、ライス等（１９８
４）及びシュレイアー等（１９８５）により述べられた
如く、下記の如くしてカナマイシンのその場でのホスホ
リル化により検出される。植物組織５０ｍｇを、氷上で
ガラス粉末の添加により、抽出緩衝液（グリセリン１０
％、２−メルカプトエタノール５％、ＳＤＳ０．１％、
ブロムフェノールブルー０．０２５％、６２．５ｍｌの
トリスｐＨ６．８）５０μｌ中でホモジナイズし、ホモ
ジネートをエッペンドルフ遠心分離器中で４℃で１０分
間遠心分離する。上澄液５０μｌを、本来の(native)ポ
リアクリルアミドゲル（１４５×１１０×１．２ｍｍ；
分離ゲル：アクリルアミド１０％、ビスアクリルアミド
０．３３％、トリスｐＨ８．８、０．３７５Ｍ、採集ゲ
ル：アクリルアミド５％、ビスアクリルフミド０．１６
５％、トリスｐＨ６．８、０．１２５Ｍ）に加え、この
ゲルを４℃及び６０Ｖで一夜電気泳動に付す。ブロムフ
ェノールブルーマーカーがゲルから外に出るやいなや、
ゲルを蒸留水で１０分間２回及び反応緩衝液（６７ミリ
モルトリスマレエート、ｐＨ７．１、ＭｇＣｌ2４２ミ
リモル、塩化アンモニウム４００ミリモル）で３０分間
１回洗浄する。ゲルを等しいサイズのガラス板上に置
き、基質カナマイシンサルフェート（２０μｇ／ｍｌ）
及び２０−２００μＣｉ32ＰＡＴＰ（アマーシャム）を
含む反応緩衝液中の１％濃度アガロース４０ｍｌで覆
う。サンドイッチゲルを室温で３０分間インキュベーシ
ョンし、次いでホスホセルロース紙Ｐ８１（ホワットマ
ン）のシートをアガロース上に置く。４層のろ紙３ＭＭ
（ホワットマン）及びいくらかのペーパータオルをこの
頂部に置く。その場でホスホリル化された放射性カナマ
イシンホスフェートのＰ８１紙への移動は３−４時間後
に止まる。Ｐ８１紙を、プロテイナーゼＫ及び１％濃度
ドデシル硫酸ナトリウムの溶液中６０℃で３０分間イン
キュベーションし、次いで、２５０ｍｌの１０ミリモル
リン酸緩衝液ｐＨ７．５中で８０℃で３−４回洗浄し、
乾燥しそして−７０℃で１−１２時間オートラジオグラ
フにかける（ＸＡＲ５フィルム、コダック）。
【００８５】４．ソラナム・ツバースム(Solanum tubers
um)(ジャガイモ)の形質転換 ＥＰ−Ａ−０，２４２，２４６号、１４−１５頁に記載
の方法に正確に従って形質転換を行った。その際アグロ
バクテリアは、スチルベン合成遺伝子又はスチルベンシ
ンターゼ遺伝子を有するＴｉプラスミドを含んでいた。
【００８６】上記実施例におけるすべての百分率は、特
記しない限り重量％である。
【００８７】上記実施例に従って得られた植物細胞及び
植物（タバコ）において、スチルベンシンターゼ遺伝子
の存在は、サザーンブロット分析により確かめられた。
スチルベンシンターゼ遺伝子の発現は、ノザーンブロッ
ト分析により検出され、スチルベンシンターゼ及びスチ
ルベンは、特異的抗体により検出される。形質転換され
た植物及び形質転換されなかった植物（比較のための）
は、ボトリティス・シネラ(Botrytis cinera)の胞子懸
濁液を噴霧され、１週間後、植物をカビ・菌類疾患につ
いて評価した。形質転換された植物は、カビ・菌類疾患
に対する増加した耐性（形質転換されていない比較植物
と比べて）を示した。
【００８８】以下においては、植物又は植物細胞の形質
転換に使用された培地のいくつかを記載する。
【００８９】 タバコの無菌新芽培養物のための培地 多量元素ＭＳ塩の濃度の１／２ 微量元素ＭＳ塩の濃度の１／２ ＦｅＥＤＴＡ ムラシゲ(Murashige)及びスクーグ（Skoog)(ＭＳ） ｍｙｏ−イノシトール １００ ｍｇ／ｌ スクロース ３０ ｇ／ｌ 寒天 ８ ｇ／ｌ ビタミン類 パントテン酸カルシウム １ ｍｇ／ｌ ビオチン １０ ｍｇ／ｌ ニコチン酸 １ ｍｇ／ｌ ピリドキシン １ ｍｇ／ｌ サイアミン １ ｍｇ／ｌ オートクレーブ処理前のｐＨ５．７Ｋ３培地 ニコチアナ・タバクム・プチ・ハバナ・ＳＲ１(Nicotia
na tabacum petit Havana SR1)、ニコチアナ・タバクム
・ウィスコンシン３８(Nicotiana tabacum Wisconsin 3
8)及びニコチアナ・プルマギニフォリア(Nicotiana plu
maginifolia)原形質体を培養するためのもの（ナジー及
びマリガ、１９７６）。
【００９０】
【表２】
【００９１】リンスマイアー(Linsmaier）及びスクーグ
（Skoog）培地（リンスマイアー及びスクーグ、１９６
５） 再生性原形質体を培養するため及びタバコ腫瘍及びカル
スの組織培養のためのもの。リンスマイアー及びスクー
グ（ＬＳ）培地は、ムラシゲ及びスクーグ培地に下記の
修正を施したものである。
【００９２】−計量して加えたサイアミンの濃度は、
０．１ｍｇ／ｌの代わりに０．４ｍｇ／ｌとより高くす
る。
【００９３】−グリシン、ピリドキシン及びニコチン酸
はなし。
【００９４】
【表３】
【００９５】植物又は植物細胞の形質転換に関して下記
の文献を引用することができる。アエルツ・エム（Ａｅ
ｒｔａ Ｍ）、ヤコブス・エム（Ｊａｃｏｂｓ Ｍ）、
ヘルナルステーンス・ジェイ・ピー（Ｈｅｒｎａｌｓｔ
ｅｅｎｓ ＪＰ）、ファン・モンタギュ・エム（Ｖａｎ
Ｍｏｎｔａｇｕ Ｍ）、シェル・ジェー（Ｓｃｈｅｌ
ｌ Ｊ）（１９８３）、アラビドプシス・サリアナ根頭
癌腫病の誘発及び試験管内培養（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａ
ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｃｒｏｗｎ
ｇａｌｌｔｕｍｏｕｒｓ）、プラント・サイエンス・
レターズ（Ｐｌａｎｔ ＳｃｉＬｅｔｔ）、１７：４３
−５０。
【００９６】フレーリー・アール・ティ(Fraley R.
T.,)、ロジャース・エス・ジー(RogersS.G.,)、ホルシ
ュ・アール・ビー(Horsch R.B.,)、サンダース・ピー・
アール(Sanders P.R.,)、フリック・ジェイ・エス(Flic
k J.S.,)、アダムス・エス・ピー(Adams S.P.,)、ビッ
トナー・エム・エル(Bittner M.L.,)、ブランド・エル
・エー(Brand L.A.,)、フィンク・シー・エル(Fink C.
L.,)、フライ・ジェイ・エス(Fry J.S.,)、ファルピ・
ジー・アール(Fallupi G.R.,)、ゴールドバーグ・エス
・ビー(Goldberg S.B.,)、ホフマン・エヌ・エル(Hoffm
an N.L.,)、ウー・エス・シー(Woo S.C.,)、植物細胞に
おけるバクテリア遺伝子の発現(Expression ofbacteria
l genes in plant cells)、プロシーディングス・オブ
・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オ
ブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)、８
０：４８０３−４８０７。
【００９７】フロム・エム・イー(Fromm ME)、テイラー
・エル・ピー(Tailor LP)、ウォルボット・ブイ(Walbot
V）（１９８６）、エレクトロポレーションによる遺伝
子移入後のトウモロコシの安定な形質転換(Stable tran
sformation of maize after gene transfer by electro
poration)、ネイチャー(Nature)３１９：７９１−７９
３。
【００９８】ハイン・アール(Hain,R)、ステイベル・ピ
ー(Stabel,P）、クゼルニロフスキー、エー・ピー(Czer
nilofsky，Ａ．Ｐ．)、ステインビス・エイチ・エイチ
(Steinbiss,H.H.）、ヘレラ−エストレラ・エル(Herrer
a-Estrella,L.,)、シェル・ジェイ(Schell，J)（１９８
５）、植物原形質体による選択可能なキメラ遺伝子の取
り込み、組込み、発現及び遺伝的伝達(Uptake,integrat
ion,expression and genetic transmission of a selec
table chimeric gene by plant protoplasts)、モレキ
ュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molec
Gen Genet.)、１９９：１６１−１６８。
【００９９】ハイン・アール(Hain R.)、ビーセラー・
ビー（Bieseler B.）、キンドル・エイチ(Kindl H.)、
シュレーダー・ジー(Schroeder G.）、ステッカー・アー
ル（Stoecker R.)（１９９０）、ニコチアナ・タバクム
におけるスチルベンシンターゼ遺伝子の発現は、フィト
アレキシンレスベラトロールの合成をもたらす(Express
in of a stilbene synthase gene in Nicotiana tabacu
m results in synthesisof the phytoalexin resveratr
ol）、プラント・モレキュラー・バイオロジー(Plant M
ol,Biol)、１５：３２５−３３６。
【０１００】ヘルナルステーンス・ジェイ・ピー(Herna
lsteens JP)、シア−トング・エル(Thia−Tong L.)、シ
ェル・ジェイ(Schell J.)、ファン・モンタギュ・エム(V
an Montagu M)（１９８４）、単子葉アスパラガス・オ
フィシナリスからのアグロバクテリウム形質転換された
細胞培養物(An Agrobacterium−transformed Cell cult
ure from the monocot Asparagus officinalis)、ヨー
ロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オルガニゼー
ション・ジャーナル(EMBO J)、３：３０３９−３０４
１。
【０１０１】ヘレラ−エストレラ・エル(Herrera-Estre
lla L．）、デ・ブロック・エム(DeBlock M.)、メセン
ス・イー(Messens E.)、ヘルナルステーンス・ジェイ・
ピー(Hernalsteens JP.)、ファン・モンタギュ・エム(Va
n Montagu M.)、シェル・ジェイ（Schell J.)（１９８
３）、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オ
ルガニゼーション・ジャーナル(EMBO J)、２：９８７−
９９５。
【０１０２】ホルシュ・アール・ビー(Horsch RB)、フ
ライ・ジエイ・イー(Fry JE)、ホフマン・エヌ・エル(H
offman NL)、アイヒホルツ・デイ(Eichholtz D)、ロジ
ャース・エス・ジー(Rogers SG)、フレーリー・アール
・テイ(Fraley RT)（１９８５）、植物中に遺伝子を移
入するための簡単で一般的な方法(A simple and genera
l method for transferring genes into plants)、サイ
エンス（Science）、２７７：１２２９−１２３１。
【０１０３】クレンス・エフ・エイチ(Krens FH)、モレ
ンジーク・エル(Molendijk L)、ブレムス・ジー・ジェ
イ(Wullems GJ)、シルペルールト・アール・エイ(Schil
peroort RA)（１９８２）、ＴｉプラスミドＤＮＡによ
る植物原形質体の試験管内形質転換(in vitro transfor
mation of plant protoplasts with Ti-plasmid DNA)、
ネイチャー、２９６：７２−７４。
【０１０４】コンクツ・シー(Koncz C）、シェル・ジェ
イ(Schell J）（１９８６）、ＴL−ＤＮＡ遺伝子５のプ
ロモーターは、新規な型のアグロバクテリウムライナリ
ーベクターにより担われたキメラ遺伝子の組織特異的発
現を制御する(The promotorof TL-DNA gene 5 controls
the tissue-specific expression of chimaeric genes
carried by a noval type of Agrobacterium linary v
ector）、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネ
テイックス）（１９８６）２０４：３３８−３９６。
【０１０５】リンスマイアー・デイ・エム(Linsmaier D
M)、スクーグ・エフ(Skoog F）（１９６５）、タバコ組
織培養の有機増殖因子要求(Organic growth factor req
uirements of tobacco tissue cultures）フィジオル・
プラント:Physiol plant)、１８：１００−１２７。
【０１０６】マートン・エル(Marton l）、ブレムス・
ジー・ジェイ(Wullems GJ)、モレンジーク・エル(Molem
dijk L）、シルペルールト・ピー・アール(Schilperoor
t PR)（１９７９）、アグロバクテリウム・ツメファシ
エンスによるニコチアナ・タバクムからの培養された細
胞の試験管内形質転換(In vitro transformation ofcul
tured cells from Nicotiana tabacum by Agrobacteriu
m tumfaciens)、ネイチャー、２７７：１２２９−１３
１。
【０１０７】メルキオール・エフ（Melchior F）、キン
ドル・エイチ（Kindl H）（１９９０）、カルコンシン
ターゼｃＤＮＡとは僅かに異なるブドウスチルベンシン
ターゼｃＤＮＡは、大腸菌において触媒的に活性な酵素
に発現される(Grapevine stilbene syntase cDNA only
slightly differing from chalcone synthase cDNA is
expressed in Escherichia coli into a catalytically
active enzyme )、ＦＥＢＳ ２６８：１７−２０。
【０１０８】ネイジー・ジェイ・アイ(Nagy JI)、マリ
ガ・ピー(Maliga P）、ニコチアナ・シルベストリスの
葉肉原形質体からのカルス誘発及び植物再生(Callus in
duction and plant regeneration from mesophyll prot
oplasts of Nicotiana sylvestris)、ザイツシュリフト
・フュール・プランツェンフィジオリジー(Z Pflanzenp
hysiol)、７８：４５３−４５５。
【０１０９】オッテン・ラブム(Otten LABM)、シルペル
ールト・アール・アイ(Schilperoort RA）（１９７
８）、リソピン及びノパリンデヒドロゲナーゼ活性の検
出のための迅速なマイクロスケールの方法(A rapid mic
roscale method for the detection of Lysopin and No
palin dehydrogenase activities）、ビオキミカ・エ・
ビオフイジカ・アクタ(Biochim biophys acta)、５２
７：４９７−５００。
【０１１０】パスツコウスキー・ジェイ(Paszkowski
J）、シリト・アール・デイ(Schillito RD）、サウル・
エム(Saul M）、マンダク・ブイ(Mandak V)、ホーン・
テイ(Hohn T)、ホーン・ビー(Hohn B)、ポトリクス・ア
イ(Potrykus I)（１９８４）、植物への直接の遺伝子移
入(Direct gene transfer to plants）、ヨーロピアン
・モレキュラー・バイオロジー・オルガニゼーション・
ジャーナル(EMBO J)、３：２７１７−２７２２。
【０１１１】ロルフ・シー・エイチ(Rolf C.H)、フリッ
ツェマイアー・ケイ・エイチ(Fritzemeier K.H)及びキ
ンドル・エイチ(Kindle H)（１９８１）、スチルベンシ
ンターゼの誘発に感受性のアラキス・ヒポガエアの培養
された細胞（レスベラトロール形成性）(Cultured cell
s of Arachis hypogaea susceptible to induction of
stilbene synthase)（resveratrol forming）、プラン
ト・セル・レポーツ(Plant Cell.Rep)、１：８３−８
５。
【０１１２】シュレーダー・ジー(Schroeder,G）、ブラ
ウン・ジェイ・ダブリュ・エス(Brown J.W.S.)及びシュ
レーダー・ジェイ(Schroeder,J)（１９８８）、レスベ
ラトロールシンターゼの分子分析：ｃＤＮＡ、ゲノムク
ローン及びカルコンシンターゼとの関係(Molecular ana
lysis of resveratrol synthase:cDNA,genomic clones
and relationship with chalconsynthase)、ヨーロピア
ン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Eur.J.Bio
chem)、１７２、１６１−１６９。
【０１１３】シリト・アール・デイ(Schillito RD)、パ
スツコウスキー・ジェイ(Paszkowski J)、ポトリクス・
アイ(Potrykus I)（１９８３）、アガロース平板培養及
びビーズ型培養技術は、多数の植物種における原形質体
由来のコロニーの成長を可能としそして刺激する(Agaro
se plating and Bead type culture technique enable
and stimulate development of protoplast-derived co
lonies in an number of plant species)。プラント・
セル・レポーツ(Pl Cell Rep)、2:244-247。ファン・デン
・エルツェン・ピージェイエム(Van den Elzen PJM)、
タウンセンド・ジェイ(Townsend J)、リー・ケイ・ワイ
(Lee KY)、ベドブルック、ジエイ・アール(Bedbrook J
R)（１９８５）、植物細胞における選択可能なマーカー
としてのキメラ耐性遺伝子(A chimaeric resistance ge
n as a selectable marker in plant cells)、プラント
・モレキュラー・バイオロジー(Plant Mol Biol)、５、
２９９−３０２。
【０１１４】ベルテン・ジェイ(Velten J)、ベルテン・
エル(Velten L)、ハイン・アール(Hain R)、シェル・ジ
ェイ(Schell J)（１９８４）、アグロバクテリウム・
ツムファシエンスのＴｉプラスミドからの２つの植物プ
ロモーター断片の単離(Isolation of a dual plant pro
motor fragment from the Ti Plasmid of Agrobacteriu
m tumfaciens)、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオ
ロジー・オルガニゼーション・ジャーナル(EMBO J)、１
２：２７２３−２７３０。
【０１１５】ファン・ハウテ・イー(Van Haute E)、ヨ
ース・エイチ(Joos H)、マエス・エム(Maes M)、ワレン
・ジー(Warren g)、ファン・モンタギュ・エム(Van Mon
taguM)、シェル・ジェイ(Schell J)（１９８３）、ｐＢ
Ｒ３２２における制限断片クローンの遺伝子間移入及び
交換組換え：／アグロバクテリウム・ツムファシエンス
のＴｉプラスミドの逆向き遺伝学のための新しい方策(I
ntergenic transferand excharge recombination of re
striction fragments clones in pBR 322:anovel strat
egy for the reversed genetics of Ti plasmid of /Ag
robacterium tumfacienes)、ヨーロピアン・モレキュラ
ー・バイオロジー・オルガニゼーション・ジャーナル(E
MBO J)、２：４１１−４１８。
【０１１６】ザンブリスキー・ビー(Zambryski P)、ヨ
ース・エイチ(Joos H)、ジェネテロ・シー(Genetello
C)、ファン・モンタギュ・エム(Van Montagu M)、シェ
ル・ジェイ(Schell J)（１９８３）、植物細胞の普通の
再生能力を変えないで植物細胞中にＤＮＡを導入するた
めのＴｉプラスミドベクター(Ti-plasmid vector for t
he introduction of DNA into plant cells without al
tering their normal regeneration caoacity)、ヨーロ
ピアン・モレキュラー・バイオロジー・オルガニゼーシ
ョン・ジャーナル(EMBO J)１２：２１４３−２１５０。
【０１１７】ライス・ビー(Reiss B)、スプレンゲル・
ウイル・エイチ(Sprengel,Will H)及びシャラー・エイ
チ(Schaller H)（１９８４）、未加工細胞トラクトにお
けるネオマイシンホスホトランスフェラーゼの定性的及
び定量的アッセイのための新規な鋭敏な方法(A new sen
sitive method for qalitative and quantitative asse
y of neomycin phosphotransferase in crude cell tra
cts)、ジェネ(GENE)、１０８１：２１１−２１７。
【０１１８】シュライアー・ピー・エイチ(Schreier P.
H.)、セフター・イー・エー（Seftor E.A.)、シェル・
ジェイ(Schell J)及びボナート・エイチ・ジェイ(Bohne
rt H.J)（１９８５）、外来タンパク質の光制御合成及
び植物葉緑体への輸送を指向するための核コード化配列
の使用(The use of nuclear-encoded sequences to dir
ect the light-regulated synthesis and transport of
a foreign protein into plant chloroplasts)、ヨー
ロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オルガニゼー
ション・ジャーナル(EMBO J)、４巻、１号：２５−３
２。
【０１１９】下記の公開された特許出願を更に挙げるこ
とができる。
【０１２０】ＥＰ−Ａ−１１６，７１８
ＥＰ−Ａ−１２６，５４６ ＥＰ−Ａ−１５９，４１８ ＥＰ−Ａ−１
６４，５９７ ＥＰ−Ａ−１２０，５１５ ＥＰ−Ａ−１
７５，９６６ ＥＰ−Ａ−１２０，５１６ ＷＯ ８４／
０２９１３ ＥＰ−Ａ−１７２，１１２ ＷＯ ８４／
０２９１９ ＥＰ−Ａ−１４０，５５６ ＷＯ ８４／
０２９２０ ＥＰ−Ａ−１７４，１６６ ＷＯ ８３／
０１１７６ ＥＰ−Ａ−１２２，７９１ 図１乃至図４の説明 図１は、プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３を表す。スチルベ
ンシンターゼ遺伝子１及び２は、λ−ファージＤＮＡに
よりｐＶＳｔ１２ｔ３においてフランキングされ(flank
ed)、ｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位にクローニングされ
た、長さが約１２,６００ｂｐのビチス（Vitis)断片上
に位置している。遺伝子３の末端配列のみは、ｐＶＳｔ
１２ｔ３上に位置している。各場合に１は、遺伝子１、
遺伝子２及び遺伝子３の、コード化領域の開始点を示
し、２はコード化領域の終点を示す。更に、矢印は、遺
伝子が断片上でいかに方位付けられているかを示す。肉
太で描かれれた区域はフランキングファージＤＮＡを表
す。
【０１２１】図２は、プラスミドｐＶＳｔ１を表す。遺
伝子１は、サイズが約４.９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片上に
位置している。それは、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによ
る二重消化により単離することもできる。ＨｉｎｄＩＩ
Ｉは、上記遺伝子以内で切断する。矢印は、遺伝子がプ
ラスミド上でいかに方位付けられているかを示す。
【０１２２】図３は、ｐＶＳｔ２を表す。このプラスミ
ドは、遺伝子３の終点区域と遺伝子２の近位区域を含む
サイズが３．４ｋｂのｐＶＳｔ１２ｔ３のＥｃｏＲＩ断
片を含む。この断片の環化により機能的スチルベンシン
ターゼ遺伝子が得られる。この遺伝子は、遺伝子２及び
３の合成遺伝子である。
【０１２３】図４は、遺伝子１及び２のコード化区域
（エクソン／肉太で描かれた）及び非コード化区域（イ
ントロン）を表す。翻訳開始コドン（ＡＴＧ）の位置は
遺伝子１の場合には約１１,０００（図１参照）にあ
り、そして遺伝子２の場合には位置２,５５０にある。
遺伝子１は、約１,５３０ｂｐの長さを有しそして位置
９４４６に端部を有する。遺伝子２は、長さが約１,３
００ｂｐでありそして位置３８６１に端部を有する。２
つの遺伝子の異なる長さは、異なる長さのイントロンの
結果である。
【０１２４】図１乃至図４において、記号は、下記の意
味を示す。
【０１２５】Ｅ ：ＥｃｏＲＩ Ｂ ：ＢａｍＨＩ Ｈ ：ＨｉｎｄＩＩＩ ＰＬ ：プラスミドｐＵＣ１８からのポリリンカー Ａ ：Ａｓｐ７１８ ＡＴＧ ：翻訳開始コドン Ｓ ：ＳｍａＩ 本発明に従って形質転換された植物の増加した耐性は、
下記の実施例により説明される。
【０１２６】
【実施例】実施例Ａ 植物病に対する増加した耐性を試験するために、植物を
病原体で接種し、感染の程度をパラメーターとして使用
した。使用した試験病原体は、ボトリチス・シネレア・
ペルス(Botrytis cinerea Pers)であった。
【０１２７】上記タバコ植物を組織培養により予備培養
し、次いでポット（ｄ＝１１ｃｍ）中の標準土壌［バル
スター（Balster)により製造された］中で温室で鉢植
し、試験を開始するまで温室中で２３℃及び７０−８０
％相対湿度で栽培した。それらに必要に応じて水及び肥
料を補給した。接種のために、植物（温室に移して３−
４週間後）の葉にしたたるまで病原体の胞子懸濁液を噴
霧した。次いで植物を１００％相対湿度及び１０−２０
℃でインキュベーシヨンした。４−８日後、植物の健康
状態を、感染した葉の区域に基づいて、百分率として決
定した。
【０１２８】表からわかるように、本発明に従うスチル
ベンシンターゼ遺伝子を導入された形質転換された植物
は、ボトリチス・シネレアによる感染の程度が形質転換
されていない野生型ＳＲ１よりは少なく、従って、形質
転換されていない対照植物と比較してカビ・菌類に対す
る増加した耐性を示した。
【０１２９】
【表４】 表 ボトリチス・シネレアによるタバコ植物の感染に対するレスベラトロール遺伝 子の効果 下記番号の葉の感染した葉面積％ １ ２ ３ ４ ５ ６ ｘ 減少率＊ 野生型 15.0 16.0 16.5 11.5 8.6 2.8 11.7 (対照) 形質転換され たタバコ 1 6.4 8.6 8.8 2.9 1.7 0.9 4.9 58％ 形質転換され たタバコ 2 10.8 8.1 3.7 3.6 3.0 0.8 5.0 57％ ＊アボットの式を用いて計算した減少率 ｘ＝平均
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３を示す図である。
【図２】プラスミドｐＶＳｔ１を示す図である。
【図３】プラスミドｐＶＳｔ２を示す図である。
【図４】遺伝子１及び遺伝子２のコード化区域及び非コ
ード化区域を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｎ 1/21 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） 5/00 Ｃ (73)特許権者 591063187 Ｄ−51368 Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇ ｅｒｍａｎｙ (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ. 259（11），ｐ．6806−6811（1984) Ｐｌａｎｔａ，Ｖｏｌ．151，ｐ．48 −52（1981) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 A01H 1/00 A01H 4/00 A01H 5/00 C12N 1/21 C12N 5/10 C12N 9/00 C12N 1/21 ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ Ｓ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ｉ）レスベラトロールシンターゼをコ
    ードし、サイズが約４９００塩基対であり、且つ大腸菌
    （Ｅscherichia coli）菌株Ｅ.coli ＦierｐＶＳｔ１２
    ｔ３（ＤＳＭ６３４６）中に含まれている下記の制限酵
    素地図によって示されるプラスミドｐＶＳｔ１２ｔ３か
    らＥcoＲＩで切り出すことにより得ることができる、ブ
    ドウのゲノムＤＮＡの制限酵素切断断片； （ｉｉ） レスベラトロールシンターゼをコードし、大
    きさが約３４００塩基対であり、且つ大腸菌菌株Ｅ.col
    i Ｆier ｐＶＳｔ１２ｔ３（ＤＳＭ６３４６）中に含ま
    れている下記の制限酵素地図によって示されるプラスミ
    ドｐＶＳｔ１２ｔ３からＥcoＲＩで部分的に切り出すこ
    とにより得ることができる、ブドウのゲノムＤＮＡの制
    限酵素切断断片；及び （ｉｉｉ） 上記（ｉ）又は（ｉｉ）に記載の制限酵素
    切断断片がコードしているレスベラトロールシンターゼ
    をコードするｃＤＮＡよりなる群から選ばれるＤＮＡ。 【図１】
  2. 【請求項２】 請求項１に記載のＤＮＡを含有するベク
    ター。
  3. 【請求項３】 大腸菌菌株Ｅ.coli Ｆier １ ｐＶＳｔ
    １（ＤＳＭ６００２）中に含まれているプラスミドｐＶ
    Ｓｔ１、大腸菌菌株Ｅ.coli Ｆier ２ ｐＶＳｔ２（Ｄ
    ＳＭ６００３）中に含まれているプラスミドｐＶＳｔ２
    又は大腸菌菌株Ｅ.coli Ｆier ｐＶＳｔ１２ｔ３（ＤＳ
    Ｍ６３４６）中に含まれているプラスミドｐＶＳｔ１２
    ｔ３である請求項２に記載のベクター。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のＤＮＡで形質転換され
    た微生物。
  5. 【請求項５】 大腸菌菌株Ｅ.coli Ｆier １ ｐＶＳｔ
    １（ＤＳＭ６００２）、大腸菌菌株Ｅ.coli Ｆier ２
    ｐＶＳｔ２（ＤＳＭ６００３）又は大腸菌菌株Ｅ.coli
    Ｆier ｐＶＳｔ１２ｔ３（ＤＳＭ６３４６）である請求
    項４に記載の微生物。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載のＤＮＡを含有する形質
    転換された植物細胞。
  7. 【請求項７】 請求項１に記載のＤＮＡを含有する形質
    転換された双子葉植物又はその一部。
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