JP3291548B2 - 組換えヤドリギレクチン（ｒＭＬ） - Google Patents
組換えヤドリギレクチン（ｒＭＬ）Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、成熟後にヤドリギレクチンダイマーの生物
学的活性を有するプレプロタンパク質をコードする核酸
分子、これらの核酸分子を含有するベクター、該ベクタ
ーで形質転換された宿主、およびこれらの核酸分子によ
ってコードされるポリペプチドおよび／またはポリペプ
チドダイマーに関する。本発明のポリペプチドおよび／
またはポリペプチドダイマーは、治療上広範に適用可能
である。従って、本発明はさらに、本発明のポリペプチ
ドおよび／またはポリペプチドダイマーを含有するイム
ノトキシンならびに薬学組成物に関する。さらに、本発
明は、本発明の核酸分子、本発明のポリペプチドおよび
／またはポリペプチドダイマー、および／または本発明
の核酸分子と特異的にハイブリダイズするプライマーを
含有する診断組成物に関する。最後に、本発明は、本発
明のポリペプチドおよび／または本発明のポリペプチド
ダイマーを含有する植物保護剤に関する。
学的活性を有するプレプロタンパク質をコードする核酸
分子、これらの核酸分子を含有するベクター、該ベクタ
ーで形質転換された宿主、およびこれらの核酸分子によ
ってコードされるポリペプチドおよび／またはポリペプ
チドダイマーに関する。本発明のポリペプチドおよび／
またはポリペプチドダイマーは、治療上広範に適用可能
である。従って、本発明はさらに、本発明のポリペプチ
ドおよび／またはポリペプチドダイマーを含有するイム
ノトキシンならびに薬学組成物に関する。さらに、本発
明は、本発明の核酸分子、本発明のポリペプチドおよび
／またはポリペプチドダイマー、および／または本発明
の核酸分子と特異的にハイブリダイズするプライマーを
含有する診断組成物に関する。最後に、本発明は、本発
明のポリペプチドおよび／または本発明のポリペプチド
ダイマーを含有する植物保護剤に関する。
ヤドリギ抽出物は数世紀にわたって治療に用いられて
いる。今世紀始めから、ヤドリギ調製物はガンの治療に
用いられ、様々な成功例がある（Bocci,1993;Gabius
ら、1993;GabiusおよびGabius,1994;GangulyおよびDas,
1994）。Hajtoら（1989,1990）は、治療効果が、特にい
わゆるヤドリギレクチン（ビスキュミン（viscumin）、
Viscum albumアグルチニン、VAA）によって媒介される
ということを示すことができた。今日、細胞傷害効果の
他に、従来技術では特に、（非特異性）免疫刺激につい
て論じられており、この正の効果を腫瘍患者の随伴治療
およびアフターケアに利用される。生活の質の向上は、
このような患者において内因性エンドルフィンの分泌に
よりおそらく媒介される（HeinyおよびBeuth,1994）。
インビトロ（Hajtoら、1990;Mnnelら、1991;Beuth
ら、1993）およびインビボ（Hajto,1986;Hajtoら、198
9;Beuthら、1991;Beuthら、1992）での多数の研究なら
びに臨床試験（Beuthら、1992）において、炎症性サイ
トカイン（TNF−α、IL−１、IL−６）の増加した放出
ならびに免疫系の細胞成分（TH細胞、NK細胞）の活性化
が報告されている。
いる。今世紀始めから、ヤドリギ調製物はガンの治療に
用いられ、様々な成功例がある（Bocci,1993;Gabius
ら、1993;GabiusおよびGabius,1994;GangulyおよびDas,
1994）。Hajtoら（1989,1990）は、治療効果が、特にい
わゆるヤドリギレクチン（ビスキュミン（viscumin）、
Viscum albumアグルチニン、VAA）によって媒介される
ということを示すことができた。今日、細胞傷害効果の
他に、従来技術では特に、（非特異性）免疫刺激につい
て論じられており、この正の効果を腫瘍患者の随伴治療
およびアフターケアに利用される。生活の質の向上は、
このような患者において内因性エンドルフィンの分泌に
よりおそらく媒介される（HeinyおよびBeuth,1994）。
インビトロ（Hajtoら、1990;Mnnelら、1991;Beuth
ら、1993）およびインビボ（Hajto,1986;Hajtoら、198
9;Beuthら、1991;Beuthら、1992）での多数の研究なら
びに臨床試験（Beuthら、1992）において、炎症性サイ
トカイン（TNF−α、IL−１、IL−６）の増加した放出
ならびに免疫系の細胞成分（TH細胞、NK細胞）の活性化
が報告されている。
今日、60kDaのヤドリギレクチンタンパク質は、抽出
物から生化学的に得られるヤドリギ抽出物の活性成分で
あると考えられている（Franzら、1977;Gabiusら、199
2）。MLタンパク質は、２個の共有Ｓ−Ｓ結合したサブ
ユニットからなり、そのＡ鎖はリボソームの酵素的不活
性化を担い（Endoら、1988）、そして、そのＢ鎖は炭水
化物結合を担う。今日、生物学的活性は、主にＢ鎖のレ
クチン活性による（Hajtoら、1990）。
物から生化学的に得られるヤドリギ抽出物の活性成分で
あると考えられている（Franzら、1977;Gabiusら、199
2）。MLタンパク質は、２個の共有Ｓ−Ｓ結合したサブ
ユニットからなり、そのＡ鎖はリボソームの酵素的不活
性化を担い（Endoら、1988）、そして、そのＢ鎖は炭水
化物結合を担う。今日、生物学的活性は、主にＢ鎖のレ
クチン活性による（Hajtoら、1990）。
しかしながら、ヤドリギレクチン（ML）の構造／機能
関係についてはほとんど知られていない。観察される作
用様式および／または治療効果に対してどちらの単鎖な
らびにその異なる生化学的活性および酵素活性が寄与す
るかは未だに明らかでない。構造／機能関係の分析は、
調製物に他のヤドリギ植物成分が混入するため、困難に
なっている（SteinおよびBerg,1994）。抽出調製物の活
性は調製物の異なる組成に依存し得、次にはこの組成は
宿主樹木（リンゴ、マツ、ポプラなど）の種類に依存し
得ることが論じられる（Ｈlsenら、1986）。ビスコト
キシン（viscotoxin）（Garcia−Olmedoら、1983;Mende
zら、1990）およびその他のビスキュミン（viscumin）
（例えば、ML−２、ML−３など）は、同様の効果を有す
ると言われる（Eiflerら、1994）。生化学的に（アフィ
ニティークロマトグラフィーにより）高度に精製された
ML調製物ですらも実質的には不均一である（図８参
照）。この不均一さは、生化学的に評価可能な鎖の活
性、インビトロおよびインビボにおいて引き起こされる
効果およびタンパク質構造それ自体に関する。構造変異
体は、MLのＡおよびＢ鎖のグリコシル化ならびに配列変
異について論じられる。Gabiusら（1992）およびDietri
chら（1992）は、ML−１のA1鎖およびA2鎖の配列変異性
を示す。
関係についてはほとんど知られていない。観察される作
用様式および／または治療効果に対してどちらの単鎖な
らびにその異なる生化学的活性および酵素活性が寄与す
るかは未だに明らかでない。構造／機能関係の分析は、
調製物に他のヤドリギ植物成分が混入するため、困難に
なっている（SteinおよびBerg,1994）。抽出調製物の活
性は調製物の異なる組成に依存し得、次にはこの組成は
宿主樹木（リンゴ、マツ、ポプラなど）の種類に依存し
得ることが論じられる（Ｈlsenら、1986）。ビスコト
キシン（viscotoxin）（Garcia−Olmedoら、1983;Mende
zら、1990）およびその他のビスキュミン（viscumin）
（例えば、ML−２、ML−３など）は、同様の効果を有す
ると言われる（Eiflerら、1994）。生化学的に（アフィ
ニティークロマトグラフィーにより）高度に精製された
ML調製物ですらも実質的には不均一である（図８参
照）。この不均一さは、生化学的に評価可能な鎖の活
性、インビトロおよびインビボにおいて引き起こされる
効果およびタンパク質構造それ自体に関する。構造変異
体は、MLのＡおよびＢ鎖のグリコシル化ならびに配列変
異について論じられる。Gabiusら（1992）およびDietri
chら（1992）は、ML−１のA1鎖およびA2鎖の配列変異性
を示す。
ヤドリギレクチンの治療効果についてより詳細な分析
を行うには、ヤドリギレクチンが純粋な形態の構造的に
均一な物質として利用可能であることが望ましい。さら
に、科学者らにとっては、ヤドリギレクチン／その成分
を薬学組成物の活性成分として大規模に用い得るよう
に、これを純粋な形態で大量に調製できることが重要で
ある。これらの目的は、当該分野で公知のプロセスでは
達成し得なかった。当該分野の現在の状況に従う植物原
料からの単離では、常に不均一な物質の混合物しか得ら
れない。
を行うには、ヤドリギレクチンが純粋な形態の構造的に
均一な物質として利用可能であることが望ましい。さら
に、科学者らにとっては、ヤドリギレクチン／その成分
を薬学組成物の活性成分として大規模に用い得るよう
に、これを純粋な形態で大量に調製できることが重要で
ある。これらの目的は、当該分野で公知のプロセスでは
達成し得なかった。当該分野の現在の状況に従う植物原
料からの単離では、常に不均一な物質の混合物しか得ら
れない。
へのML−１の翻訳後プロセシングの効果である。そのた
め、ヤドリギレクチン調製物は、単離方法または発酵期
間に依存して異なる含有量のML−１、ML−２およびML−
３を有する（Ｊggyら、1995）。さらに、上述した任
意のイソ型はさらに、等電点電気泳動によってML−１に
ついて図８に例示されるようにたいてい微小不均一（mi
croheterogeneous）である。
め、ヤドリギレクチン調製物は、単離方法または発酵期
間に依存して異なる含有量のML−１、ML−２およびML−
３を有する（Ｊggyら、1995）。さらに、上述した任
意のイソ型はさらに、等電点電気泳動によってML−１に
ついて図８に例示されるようにたいてい微小不均一（mi
croheterogeneous）である。
したがって、本発明の根底にある課題は、ヤドリギレ
クチンを純粋な形態で、そして大規模でのその利用が可
能になる量で提供することにある。この課題は、請求の
範囲において特徴付けられる実施態様によって解決され
る。
クチンを純粋な形態で、そして大規模でのその利用が可
能になる量で提供することにある。この課題は、請求の
範囲において特徴付けられる実施態様によって解決され
る。
したがって、本発明は、（ａ）成熟後にヤドリギレク
チンダイマーの生物学的機能を有し、そして図4cに示さ
れるヌクレオチド配列を有するプレプロタンパク質をコ
ードする核酸分子；（ｂ）（ａ）のプレプロタンパク質
のフラグメントであってヤドリギレクチンダイマーの生
物学的に活性な成分をコードする核酸分子；（ｃ）遺伝
暗号の縮重により（ａ）または（ｂ）の核酸分子と異な
る核酸分子；あるいは（ｄ）ストリンジェントな条件下
で（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の核酸分子とハイブリ
ダイズし、そして（ａ）または（ｂ）に示される生物学
的機能および／または活性を有するポリペプチドをコー
ドする核酸分子に関する。
チンダイマーの生物学的機能を有し、そして図4cに示さ
れるヌクレオチド配列を有するプレプロタンパク質をコ
ードする核酸分子；（ｂ）（ａ）のプレプロタンパク質
のフラグメントであってヤドリギレクチンダイマーの生
物学的に活性な成分をコードする核酸分子；（ｃ）遺伝
暗号の縮重により（ａ）または（ｂ）の核酸分子と異な
る核酸分子；あるいは（ｄ）ストリンジェントな条件下
で（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の核酸分子とハイブリ
ダイズし、そして（ａ）または（ｂ）に示される生物学
的機能および／または活性を有するポリペプチドをコー
ドする核酸分子に関する。
ヤドリギレクチンの遺伝子配列を初めて提供すること
によって、インビトロにて再会合し得、そしてそれゆえ
タンパク質化学、酵素活性、および構造に関して均質な
rMLホロタンパク質を生成する個々の高純度組換え鎖（r
MLA、rMLB）が、該配列から開始することにより得られ
得る。再会合した組換えタンパク質は、特にその一次構
造および翻訳後修飾（グリコシル化、リン酸化）におい
ては変異しないだけでなく微小不均一でもないため、ホ
ロタンパク質としても、部分鎖としてもサブフラグメン
トの形状でも治療上特に有用である。
によって、インビトロにて再会合し得、そしてそれゆえ
タンパク質化学、酵素活性、および構造に関して均質な
rMLホロタンパク質を生成する個々の高純度組換え鎖（r
MLA、rMLB）が、該配列から開始することにより得られ
得る。再会合した組換えタンパク質は、特にその一次構
造および翻訳後修飾（グリコシル化、リン酸化）におい
ては変異しないだけでなく微小不均一でもないため、ホ
ロタンパク質としても、部分鎖としてもサブフラグメン
トの形状でも治療上特に有用である。
本発明によれば、ヤドリギレクチンプレプロタンパク
質の「フラグメント」は、天然に存在するフラグメント
のみならず、ヤドリギレクチンダイマーの生物学的に活
性な成分であるいかなるフラグメントでもあることが理
解される。当業者らは、ヤドリギレクチンダイマーのこ
のような生物学的に活性な成分はまた、明瞭であるとい
う理由で、言うまでもなくダイマーの単鎖の成分でもあ
ると理解することが示される。したがって、図4cに示さ
れる配列の一部を形成する単鎖またはそのフラグメント
も本発明に包含される。
質の「フラグメント」は、天然に存在するフラグメント
のみならず、ヤドリギレクチンダイマーの生物学的に活
性な成分であるいかなるフラグメントでもあることが理
解される。当業者らは、ヤドリギレクチンダイマーのこ
のような生物学的に活性な成分はまた、明瞭であるとい
う理由で、言うまでもなくダイマーの単鎖の成分でもあ
ると理解することが示される。したがって、図4cに示さ
れる配列の一部を形成する単鎖またはそのフラグメント
も本発明に包含される。
本発明において、「ヤドリギレクチンの成分」に関し
て用いられる「天然に」という用語は、このように特徴
付けされたフラグメントが、ヤドリギレクチンダイマー
鎖または該鎖において天然に存在する鎖のサブフラグメ
ントのいずれかであることを指すものと理解される。こ
れらのフラグメントは、好ましくは生物学的に活性であ
る。
て用いられる「天然に」という用語は、このように特徴
付けされたフラグメントが、ヤドリギレクチンダイマー
鎖または該鎖において天然に存在する鎖のサブフラグメ
ントのいずれかであることを指すものと理解される。こ
れらのフラグメントは、好ましくは生物学的に活性であ
る。
本発明において、「生物学的に活性」という用語は、
これらのフラグメントが、本願において記載されるよう
な鎖またはダイマーの生物学的機能、あるいは単鎖また
はダイマーの任意のその他の生物学的機能を少なくとも
１つ有することを指すものと理解される。さらに、「生
物学的に活性」という用語は、薬理学的な活性および／
または免疫学的活性にも関連していることを意味する。
これらのフラグメントが、本願において記載されるよう
な鎖またはダイマーの生物学的機能、あるいは単鎖また
はダイマーの任意のその他の生物学的機能を少なくとも
１つ有することを指すものと理解される。さらに、「生
物学的に活性」という用語は、薬理学的な活性および／
または免疫学的活性にも関連していることを意味する。
さらに組換えMLタンパク質を初めて使用することで、
実験によって個々のドメインおよびサブドメインの貢献
度を調査し得る。組換えMLタンパク質および組換えサブ
ユニット／部分鎖は、抽出調製物および標準抽出物の代
わりに使用し得るように対応して規定された単一物質調
製物の主成分である。
実験によって個々のドメインおよびサブドメインの貢献
度を調査し得る。組換えMLタンパク質および組換えサブ
ユニット／部分鎖は、抽出調製物および標準抽出物の代
わりに使用し得るように対応して規定された単一物質調
製物の主成分である。
従来のクローニング方法が失敗した後に、驚くべきこ
とに新たなクローニング方法に基づいてヤドリギレクチ
ンをコードする遺伝子のクローニングがもたらされ得
た。
とに新たなクローニング方法に基づいてヤドリギレクチ
ンをコードする遺伝子のクローニングがもたらされ得
た。
ヤドリギレクチンML−１については多数のタンパク質
化学データが知られている。その分子量およびサブユニ
ット構造、特に短いＮ−末端ペプチドが知られている。
これらのアミノ酸配列は、Dietrichら（1992）およびGa
biusら（1992）（DE4221836号も参照のこと）によって
個々に記載されている。アミノ酸組成およびこれらのペ
プチドから開始するＡおよび／またはＢ鎖のＮ−末端ペ
プチドの高縮重度のために、ゲノム遺伝子ライブラリー
をスクリーニングする場合にML遺伝子フラグメントを同
定し得るほど十分に縮重度が低い合成オリゴヌクレオチ
ドを調製することは事実上不可能である。Viscum album
ポリ−（Ａ＋）RNAに基づいて調製されたcDNA遺伝子ラ
イブラリーについても同様のことが言える。
化学データが知られている。その分子量およびサブユニ
ット構造、特に短いＮ−末端ペプチドが知られている。
これらのアミノ酸配列は、Dietrichら（1992）およびGa
biusら（1992）（DE4221836号も参照のこと）によって
個々に記載されている。アミノ酸組成およびこれらのペ
プチドから開始するＡおよび／またはＢ鎖のＮ−末端ペ
プチドの高縮重度のために、ゲノム遺伝子ライブラリー
をスクリーニングする場合にML遺伝子フラグメントを同
定し得るほど十分に縮重度が低い合成オリゴヌクレオチ
ドを調製することは事実上不可能である。Viscum album
ポリ−（Ａ＋）RNAに基づいて調製されたcDNA遺伝子ラ
イブラリーについても同様のことが言える。
ポリメラーゼ連鎖反応によって、既知のストレッチの
間に位置しているDNAストレッチを増幅することができ
る（Erlichら、1988）。MLAのＮ−末端から開始する
「センス」オリゴヌクレオチドおよびMLBのＮ−末端か
ら開始する「アンチセンス」オリゴヌクレオチドを使用
すると、ML遺伝子にイントロンが含まれていなければ、
介在遺伝領域が増幅されると考えられる（図1a）。しか
しながら、実際にはＢ鎖のＮ−末端配列を分析してみる
と、オリゴヌクレオチドの考えられる組み合わせの縮重
度はこの方法を実現させるには高すぎるということが分
かる。その原因は特に、オリゴヌクレオチド構成にとっ
ては好ましくなく、そして公知のアミノ酸配列領域から
開始されるML遺伝子配列の増幅を実行不可能にするＢ鎖
のＮ−末端の配列にあり得る（図1b）。
間に位置しているDNAストレッチを増幅することができ
る（Erlichら、1988）。MLAのＮ−末端から開始する
「センス」オリゴヌクレオチドおよびMLBのＮ−末端か
ら開始する「アンチセンス」オリゴヌクレオチドを使用
すると、ML遺伝子にイントロンが含まれていなければ、
介在遺伝領域が増幅されると考えられる（図1a）。しか
しながら、実際にはＢ鎖のＮ−末端配列を分析してみる
と、オリゴヌクレオチドの考えられる組み合わせの縮重
度はこの方法を実現させるには高すぎるということが分
かる。その原因は特に、オリゴヌクレオチド構成にとっ
ては好ましくなく、そして公知のアミノ酸配列領域から
開始されるML遺伝子配列の増幅を実行不可能にするＢ鎖
のＮ−末端の配列にあり得る（図1b）。
改変されたPCRストラテジーを使用してML遺伝子をク
ローニングしようとする場合、科学者らは、特にヤドリ
ギレクチンとＩ型およびII型のリボソーム不活性化タン
パク質（RIP）との類似点に基づくタンパク質データを
さらに追加し、増幅オリゴヌクレオチドを構成するよう
試みた（Stirpeら、1992）。（ａ）Ｉ型RIPタンパク質
およびリシンのＡ鎖ならびに（ｂ）アブリンおよびリシ
ンのＢ鎖の複数アラインメントに基づいて保存領域を全
部で８つの配列ストレッチにおいて同定した。これらの
配列領域から開始して、関連種のコドン選択表について
も考慮し、全部で21個のオリゴヌクレオチドを構築して
200回を超える増幅試験において様々な組み合わせで使
用した。しかしながら、アニーリング温度、Mg2+含有量
ならびにサイクルパラメータに関してPCR条件を広範に
変化させたにもかかわらず、いずれの場合においても特
異的な増幅産物を得ることはできなかった。
ローニングしようとする場合、科学者らは、特にヤドリ
ギレクチンとＩ型およびII型のリボソーム不活性化タン
パク質（RIP）との類似点に基づくタンパク質データを
さらに追加し、増幅オリゴヌクレオチドを構成するよう
試みた（Stirpeら、1992）。（ａ）Ｉ型RIPタンパク質
およびリシンのＡ鎖ならびに（ｂ）アブリンおよびリシ
ンのＢ鎖の複数アラインメントに基づいて保存領域を全
部で８つの配列ストレッチにおいて同定した。これらの
配列領域から開始して、関連種のコドン選択表について
も考慮し、全部で21個のオリゴヌクレオチドを構築して
200回を超える増幅試験において様々な組み合わせで使
用した。しかしながら、アニーリング温度、Mg2+含有量
ならびにサイクルパラメータに関してPCR条件を広範に
変化させたにもかかわらず、いずれの場合においても特
異的な増幅産物を得ることはできなかった。
上述したように熟考したところ、ゲノムライブラリー
およびcDNAライブラリーをスクリーニングしてもPCR技
術を使用しても、特異的なMLのDNA配列に達することは
できなかった。
およびcDNAライブラリーをスクリーニングしてもPCR技
術を使用しても、特異的なMLのDNA配列に達することは
できなかった。
したがって、増幅オリゴヌクレオチドの構築において
リシンおよびアブリンの構造の構造的特性をさらに含む
ための新たな方法を見いだすための試みが行われてい
る。
リシンおよびアブリンの構造の構造的特性をさらに含む
ための新たな方法を見いだすための試みが行われてい
る。
リボソーム不活性化タンパク質（RIP）（ここでは特
にII型のRIPリシン）の酵素メカニズムはMLの酵素メカ
ニズムと類似している（Endoら、1988a＋1988b）ため、
これらのタンパク質もまた機能的一次構造および三次構
造のレベルで構造的に類似しているということを除外す
ることはできなかった。リシンの結晶構造（Katzinら、
1991;RutenberおよびRobertus,1991;Westonら、1994）
から開始して、リシンＡ鎖の鎖の可変性を分析したとこ
ろ、保存配列領域内に位置しているArg180の移動度の低
さが指摘された。さらに、基質の相互作用を十分に検討
しながら、鎖の「バックボーン」の立体配置が原因で起
こり得る活性中心のこの領域での可能性のあるアミノ酸
置換についても分析した。このように熟考の結果は、リ
シンＡ鎖およびさらにＩ型RIPの広範囲の配列アライン
メントについての評価と相関していた。
にII型のRIPリシン）の酵素メカニズムはMLの酵素メカ
ニズムと類似している（Endoら、1988a＋1988b）ため、
これらのタンパク質もまた機能的一次構造および三次構
造のレベルで構造的に類似しているということを除外す
ることはできなかった。リシンの結晶構造（Katzinら、
1991;RutenberおよびRobertus,1991;Westonら、1994）
から開始して、リシンＡ鎖の鎖の可変性を分析したとこ
ろ、保存配列領域内に位置しているArg180の移動度の低
さが指摘された。さらに、基質の相互作用を十分に検討
しながら、鎖の「バックボーン」の立体配置が原因で起
こり得る活性中心のこの領域での可能性のあるアミノ酸
置換についても分析した。このように熟考の結果は、リ
シンＡ鎖およびさらにＩ型RIPの広範囲の配列アライン
メントについての評価と相関していた。
このように、構造データを含むことによる配列比較の
結果を補足したところ、特定の位置における特定のアミ
ノ酸残基の発生率についての確率データが得られた。こ
れらのデータを使用して、この領域には多数の理論MLア
ミノ酸配列が存在するのではないかと仮定し、後者に基
づいて、驚くほど縮重度の低い（図1c）対応のオリゴヌ
クレオチド（RMLA2）を構築することができた。
結果を補足したところ、特定の位置における特定のアミ
ノ酸残基の発生率についての確率データが得られた。こ
れらのデータを使用して、この領域には多数の理論MLア
ミノ酸配列が存在するのではないかと仮定し、後者に基
づいて、驚くほど縮重度の低い（図1c）対応のオリゴヌ
クレオチド（RMLA2）を構築することができた。
RMLA1（MLA鎖のＮ−末端アミノ酸配列由来の縮重オリ
ゴヌクレオチド；例えば図1b）と、上述した熟考内容に
基づいて構築された「活性部位」オリゴヌクレオチドRM
LA2とを組み合わせることにより、上述した他のアプロ
ーチが全て失敗に終わった後に、複合ゲノムML−DNAか
ら開始される所定のPCRパラメータでフラグメントを得
ることができた。
ゴヌクレオチド；例えば図1b）と、上述した熟考内容に
基づいて構築された「活性部位」オリゴヌクレオチドRM
LA2とを組み合わせることにより、上述した他のアプロ
ーチが全て失敗に終わった後に、複合ゲノムML−DNAか
ら開始される所定のPCRパラメータでフラグメントを得
ることができた。
次に、フラグメントａ（図３）をクローニングして配
列決定することによって得られるMLAの部分遺伝子配列
由来の特異的な非縮重オリゴヌクレオチドプライマー
と、RIP Iおよびリシン／アブリン配列アラインメント
由来の縮重オリゴヌクレオチドとによって、さらにPCR
増幅を行って遺伝子の配列情報を完成させた。縮重Ｂ鎖
オリゴヌクレオチドを構築するために、高度に保存され
た領域が認められるリシンおよびアブリンのＢ鎖の配列
アラインメントを使用した。
列決定することによって得られるMLAの部分遺伝子配列
由来の特異的な非縮重オリゴヌクレオチドプライマー
と、RIP Iおよびリシン／アブリン配列アラインメント
由来の縮重オリゴヌクレオチドとによって、さらにPCR
増幅を行って遺伝子の配列情報を完成させた。縮重Ｂ鎖
オリゴヌクレオチドを構築するために、高度に保存され
た領域が認められるリシンおよびアブリンのＢ鎖の配列
アラインメントを使用した。
ホロタンパク質の5'末端および3'末端と、Ｂ鎖の部分
フラグメントと、5'非翻訳領域および3'非翻訳領域とを
決定するために、単離したヤドリギRNAから開始される
逆転写によってアナログcDNAを合成し、RACE技術（Froh
manら、1988）を使用してそれぞれの遺伝子セクション
を得た。多数のオーバーラップ遺伝子フラグメントを利
用できるようになると（図３）、それぞれ複合ゲノムヤ
ドリギDNAから開始される完全なＡ鎖およびＢ鎖遺伝子
セクションを、特異的PCRによって得た。rMLAおよびrML
Bの遺伝子配列はいずれも末端修飾されていた。これを
図4aおよび図4bに示す。5'非翻訳領域および3'非翻訳領
域ならびにエンドペプチドおよびシグナルペプチドをコ
ードする遺伝子セクションを有する完全なML遺伝子配列
を図4cに示す。
フラグメントと、5'非翻訳領域および3'非翻訳領域とを
決定するために、単離したヤドリギRNAから開始される
逆転写によってアナログcDNAを合成し、RACE技術（Froh
manら、1988）を使用してそれぞれの遺伝子セクション
を得た。多数のオーバーラップ遺伝子フラグメントを利
用できるようになると（図３）、それぞれ複合ゲノムヤ
ドリギDNAから開始される完全なＡ鎖およびＢ鎖遺伝子
セクションを、特異的PCRによって得た。rMLAおよびrML
Bの遺伝子配列はいずれも末端修飾されていた。これを
図4aおよび図4bに示す。5'非翻訳領域および3'非翻訳領
域ならびにエンドペプチドおよびシグナルペプチドをコ
ードする遺伝子セクションを有する完全なML遺伝子配列
を図4cに示す。
本発明の核酸分子の好ましい実施態様において、フラ
グメントは、図4aに示されるヌクレオチド配列によって
コードされるヤドリギレクチンのＡ鎖（MLA）である。
グメントは、図4aに示されるヌクレオチド配列によって
コードされるヤドリギレクチンのＡ鎖（MLA）である。
本発明の核酸分子のさらに好ましい実施態様におい
て、フラグメントは、図4bに示されるヌクレオチド配列
によってコードされるヤドリギレクチンのＢ鎖（MLB）
である。
て、フラグメントは、図4bに示されるヌクレオチド配列
によってコードされるヤドリギレクチンのＢ鎖（MLB）
である。
本発明のさらに好ましい実施態様は、DNA分子である
核酸分子に関する。
核酸分子に関する。
本発明において、「DNA分子」という用語は、ゲノム
分子およびcDNA分子の両方または（半）合成DNA分子と
関係しているものと解される。本発明の教示内容のつい
ての知識において、これらの様々なDNA分子を調製する
ためのプロセスは当業者に周知である。
分子およびcDNA分子の両方または（半）合成DNA分子と
関係しているものと解される。本発明の教示内容のつい
ての知識において、これらの様々なDNA分子を調製する
ためのプロセスは当業者に周知である。
本発明のさらに好ましい実施態様において、核酸分子
はRNA分子である。
はRNA分子である。
本発明はさらに、本発明の上述した核酸分子のいずれ
かに対するアンチセンス鎖である核酸分子に関する。こ
のようなアンチセンス鎖は、転写阻害に実験的に使用さ
れ得、したがって植物におけ発現および調節の研究に実
験的に使用され得る。
かに対するアンチセンス鎖である核酸分子に関する。こ
のようなアンチセンス鎖は、転写阻害に実験的に使用さ
れ得、したがって植物におけ発現および調節の研究に実
験的に使用され得る。
本発明はまた、本発明による少なくとも１つの核酸分
子を含有するベクターに関する。
子を含有するベクターに関する。
本発明のベクターは、例えば、ヤドリギレクチンプレ
プロタンパク質全体をコードする本発明の１つの核酸分
子を含有し得る。上記ベクターが発現ベクターであると
仮定すると、プレプロタンパク質は適切な形質転換宿主
においてプロセスされ得、そしてインビボまたはインビ
トロにてモノマー単位を結合し、ヤドリギレクチンダイ
マーを得ることができる。他の実施態様において、本発
明のベクターは、本発明の核酸の増殖にのみ使用される
ベクターである。
プロタンパク質全体をコードする本発明の１つの核酸分
子を含有し得る。上記ベクターが発現ベクターであると
仮定すると、プレプロタンパク質は適切な形質転換宿主
においてプロセスされ得、そしてインビボまたはインビ
トロにてモノマー単位を結合し、ヤドリギレクチンダイ
マーを得ることができる。他の実施態様において、本発
明のベクターは、本発明の核酸の増殖にのみ使用される
ベクターである。
好ましい実施態様において、本発明のベクターは、ヤ
ドリギレクチンのＡ鎖またはそのフラグメントをコード
する核酸分子およびＢ鎖またはそのフラグメントをコー
ドする核酸分子の両方を含有する。好ましくは、これら
のモノマーのフラグメントは生物学的に活性である。
ドリギレクチンのＡ鎖またはそのフラグメントをコード
する核酸分子およびＢ鎖またはそのフラグメントをコー
ドする核酸分子の両方を含有する。好ましくは、これら
のモノマーのフラグメントは生物学的に活性である。
さらに好ましい実施態様において、本発明のベクター
は発現ベクターである。様々な宿主生物に適した発現ベ
クターをどのようにして得るかについては、当業者には
明らかである。
は発現ベクターである。様々な宿主生物に適した発現ベ
クターをどのようにして得るかについては、当業者には
明らかである。
本発明によれば、ヤドリギレクチンＡ鎖をコードする
配列を、複合ゲノムヤドリギDNAから開始される特異的P
CRによって、異種発現用に生成した。使用するプライマ
ーオリゴヌクレオチドの非相補的領域を介して翻訳制御
エレメントならびに制限エンドヌクレアーゼの認識配列
を加え、それによって、ゲノム形態で存在するプレプロ
ヤドリギレクチン遺伝子に基づいてヤドリギレクチンＡ
鎖をクローニングして別々に発現させることができた。
配列を、複合ゲノムヤドリギDNAから開始される特異的P
CRによって、異種発現用に生成した。使用するプライマ
ーオリゴヌクレオチドの非相補的領域を介して翻訳制御
エレメントならびに制限エンドヌクレアーゼの認識配列
を加え、それによって、ゲノム形態で存在するプレプロ
ヤドリギレクチン遺伝子に基づいてヤドリギレクチンＡ
鎖をクローニングして別々に発現させることができた。
２つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション
およびクローニングすることにより、および翻訳開始コ
ドンを加えることにより、アミノ酸配列残基チロシン１
−チロシン17に対応するrMLAをコードする配列の5'領域
（Dietrichら、1992;Gabiusら、1992）を合成遺伝子フ
ラグメントとして調製した。このように、Escherichia
coliにおいて強く発現する遺伝子について説明されてい
る（Gribskovら、1984）ようにコドンの選択に関して遺
伝子配列を最適化した。合成rMLA遺伝子フラグメントの
3'末端ならびにPCRによって得られるrMLA遺伝子フラグ
メントの5'末端において、TACからTATへのチロシン17コ
ドンの特異的な交換によってSsp I制限部位を導入し
た。この制限部位によって、ベクターpML14−17（図
５）を得ながら２つのrMLA遺伝子フラグメントを融合さ
せることができた。DNA配列決定（図4a）によってrMLA
をコードする配列を確認した。Escherichia coliにおい
てrMLAを発現させるために、ベクターpML14−17から遺
伝子配列を単離し、これを発現ベクターpT7−７に挿入
することによってT7−RNAポリメラーゼプロモーターー
および転写ターミネーターーの制御下においた（Studie
rおよびMoffart,1986）。得られた発現ベクターpT7−ML
A（図５）を使用して、E.coli発現菌株BL21を形質転換
した。遺伝子発現の誘導は、相対分子量が25kDaを有す
る非グリコシル化組換えヤドリギレクチンＡ鎖に対応す
るタンパク質バンドの発生によって特徴付けられる。こ
の組換え発現産物についてのアッセイおよび同定を、特
異的抗MLA抗体を使用してウェスタンブロット分析によ
って実施した（図７）。
およびクローニングすることにより、および翻訳開始コ
ドンを加えることにより、アミノ酸配列残基チロシン１
−チロシン17に対応するrMLAをコードする配列の5'領域
（Dietrichら、1992;Gabiusら、1992）を合成遺伝子フ
ラグメントとして調製した。このように、Escherichia
coliにおいて強く発現する遺伝子について説明されてい
る（Gribskovら、1984）ようにコドンの選択に関して遺
伝子配列を最適化した。合成rMLA遺伝子フラグメントの
3'末端ならびにPCRによって得られるrMLA遺伝子フラグ
メントの5'末端において、TACからTATへのチロシン17コ
ドンの特異的な交換によってSsp I制限部位を導入し
た。この制限部位によって、ベクターpML14−17（図
５）を得ながら２つのrMLA遺伝子フラグメントを融合さ
せることができた。DNA配列決定（図4a）によってrMLA
をコードする配列を確認した。Escherichia coliにおい
てrMLAを発現させるために、ベクターpML14−17から遺
伝子配列を単離し、これを発現ベクターpT7−７に挿入
することによってT7−RNAポリメラーゼプロモーターー
および転写ターミネーターーの制御下においた（Studie
rおよびMoffart,1986）。得られた発現ベクターpT7−ML
A（図５）を使用して、E.coli発現菌株BL21を形質転換
した。遺伝子発現の誘導は、相対分子量が25kDaを有す
る非グリコシル化組換えヤドリギレクチンＡ鎖に対応す
るタンパク質バンドの発生によって特徴付けられる。こ
の組換え発現産物についてのアッセイおよび同定を、特
異的抗MLA抗体を使用してウェスタンブロット分析によ
って実施した（図７）。
ヤドリギＢ鎖の異種発現用に、複合ゲノムViscum alb
um DNAから特異的PCRによって安全なMLBコード配列を増
幅した。使用するプライマーオリゴヌクレオチドの非相
補的領域を介して、制限エンドヌクレアーゼの翻訳制御
エレメントおよび認識配列を導入した（図６）。得られ
た0.8kbpのPCR産物を、発現ベクターpT7−７に挿入する
ことによってTAクローニングベクターpCR IIでクローニ
ングした後、翻訳制御エレメントの制御下におき、そし
て得られた発現ベクターpT7−MLBで発現菌株E.coli BL2
1を形質転換した。
um DNAから特異的PCRによって安全なMLBコード配列を増
幅した。使用するプライマーオリゴヌクレオチドの非相
補的領域を介して、制限エンドヌクレアーゼの翻訳制御
エレメントおよび認識配列を導入した（図６）。得られ
た0.8kbpのPCR産物を、発現ベクターpT7−７に挿入する
ことによってTAクローニングベクターpCR IIでクローニ
ングした後、翻訳制御エレメントの制御下におき、そし
て得られた発現ベクターpT7−MLBで発現菌株E.coli BL2
1を形質転換した。
DNA配列決定（図4b）によってrMLBコード配列の完全
性を確認した。特異的抗MLB抗体（TB33、Tonevitsky
ら、1995）を使用して、ウェスタンブロットアッセイに
て発現を検出した。ここで、遺伝子発現を誘導した２時
間後に非グリコシル化組換えヤドリギレクチンＢ鎖に対
応する相対分子量31kDAの免疫反応性タンパク質が生じ
た（図7b）。E.coli細胞を完全に細胞破砕した後の細胞
画分の分析では、合成rMLB鎖が上清における可溶性画分
とE.coli細胞破砕時の沈降物における不溶性封入体画分
とに分かれることを示した。誘導の４時間後に、可溶性
および不溶性画分はそれぞれ全収量の50％を占めていた
（図7b）。
性を確認した。特異的抗MLB抗体（TB33、Tonevitsky
ら、1995）を使用して、ウェスタンブロットアッセイに
て発現を検出した。ここで、遺伝子発現を誘導した２時
間後に非グリコシル化組換えヤドリギレクチンＢ鎖に対
応する相対分子量31kDAの免疫反応性タンパク質が生じ
た（図7b）。E.coli細胞を完全に細胞破砕した後の細胞
画分の分析では、合成rMLB鎖が上清における可溶性画分
とE.coli細胞破砕時の沈降物における不溶性封入体画分
とに分かれることを示した。誘導の４時間後に、可溶性
および不溶性画分はそれぞれ全収量の50％を占めていた
（図7b）。
本発明はさらに、本発明の少なくとも１つのベクター
で形質転換された宿主に関する。
で形質転換された宿主に関する。
当業者が追求する目的に応じて、本発明の宿主は、一
つのモノマーのみまたは両方のモノマーの組み合わせの
いずれかを、好ましくは会合ダイマーとして調製するた
めにのみ使用することができる。本発明の宿主は、真性
生物細胞または原核生物細胞、トランスジェニック植物
またはトランスジェニック動物であり得る。
つのモノマーのみまたは両方のモノマーの組み合わせの
いずれかを、好ましくは会合ダイマーとして調製するた
めにのみ使用することができる。本発明の宿主は、真性
生物細胞または原核生物細胞、トランスジェニック植物
またはトランスジェニック動物であり得る。
好ましくは、本発明の宿主は、哺乳類細胞、植物細
胞、細菌、カビ細胞、酵母細胞、昆虫細胞またはトラン
スジェニック植物である。
胞、細菌、カビ細胞、酵母細胞、昆虫細胞またはトラン
スジェニック植物である。
特に好ましい実施態様において、本発明の宿主は、細
菌E.coli、Aspergillus細胞またはSpodoptera細胞であ
り、好ましくはSpodoptera frugiperdaである。
菌E.coli、Aspergillus細胞またはSpodoptera細胞であ
り、好ましくはSpodoptera frugiperdaである。
本発明はさらに、本発明の核酸分子または本発明のベ
クターによってコードされるポリペプチドおよび／また
は本発明の宿主によって産生されるポリペプチドに関す
る。
クターによってコードされるポリペプチドおよび／また
は本発明の宿主によって産生されるポリペプチドに関す
る。
本発明のポリペプチドは、好ましくはヤドリギレクチ
ンのＡ鎖またはＢ鎖の生物学的活性を有する。しかし、
他の実施態様においては、本発明のポリペプチドは、生
物学的活性の一部のみ呈し得るかあるいは全く生物学的
活性を呈することができない。本発明において、「生物
学的活性の一部」は、低減された活性および／または生
物学的活性の範囲からの多数の活性のいずれかに関する
ものと解される。本発明のポリペプチドは、上述した特
性を呈するＡ鎖またはＢ鎖のフラグメントであり得る。
ンのＡ鎖またはＢ鎖の生物学的活性を有する。しかし、
他の実施態様においては、本発明のポリペプチドは、生
物学的活性の一部のみ呈し得るかあるいは全く生物学的
活性を呈することができない。本発明において、「生物
学的活性の一部」は、低減された活性および／または生
物学的活性の範囲からの多数の活性のいずれかに関する
ものと解される。本発明のポリペプチドは、上述した特
性を呈するＡ鎖またはＢ鎖のフラグメントであり得る。
rMLA、rMLBおよびrMLホロタンパク質の特性についての
試験 （Ｉ） 相対分子量および構造 還元条件下でのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
と、これに続く銀またはクーマシーブリリアントブルー
でのタンパク質染色とによって、あるいはウェスタンブ
ロット分析における免疫染色によって、相対分子量を測
定した。
試験 （Ｉ） 相対分子量および構造 還元条件下でのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動
と、これに続く銀またはクーマシーブリリアントブルー
でのタンパク質染色とによって、あるいはウェスタンブ
ロット分析における免疫染色によって、相対分子量を測
定した。
驚くべきことに、組換え非グリコシル化ヤドリギレク
チンＡ鎖は250kDaの相対分子量を有しており、従って天
然に存在するヤドリギレクチンＡ鎖のA1の31kDAおよびA
2の29kDAとは有意に異なっているということが分かっ
た。従来技術においてはＡ鎖はグリコシル化されないと
仮定されていたため、相対分子量にこのような差異が見
られたのは極めて驚くべきことである。組換えヤドリギ
Ｂ鎖は31kDaの相対分子量を有しており、従って36kDaの
グリコシル化された天然に存在するヤドリギレクチンＢ
鎖よりも実質的に軽い（図７）。
チンＡ鎖は250kDaの相対分子量を有しており、従って天
然に存在するヤドリギレクチンＡ鎖のA1の31kDAおよびA
2の29kDAとは有意に異なっているということが分かっ
た。従来技術においてはＡ鎖はグリコシル化されないと
仮定されていたため、相対分子量にこのような差異が見
られたのは極めて驚くべきことである。組換えヤドリギ
Ｂ鎖は31kDaの相対分子量を有しており、従って36kDaの
グリコシル化された天然に存在するヤドリギレクチンＢ
鎖よりも実質的に軽い（図７）。
グリコシル化および／または配列変異による天然に存
在するMLタンパク質の不同質性は、SDSゲルにおいて広
いバンドとして明らかになり、試験を行ったいかなる例
の組換え種においても生じない。
在するMLタンパク質の不同質性は、SDSゲルにおいて広
いバンドとして明らかになり、試験を行ったいかなる例
の組換え種においても生じない。
再会合したrMLA/rMLBホロタンパク質（rML）の相対分
子量は、これよりも重い65〜67kDaのnMLと比較すれば、
合計で56kDaになる。
子量は、これよりも重い65〜67kDaのnMLと比較すれば、
合計で56kDaになる。
（II） 等電同質性 rMLAは、等電点5.2;5.4;5.7および6.2を有する４種に
分類される高度に精製された天然に存在するヤドリギレ
クチンＡ鎖と比較すると、等電点6.8を有する等電的に
均一なタンパク質であることが分かる（図８）。
分類される高度に精製された天然に存在するヤドリギレ
クチンＡ鎖と比較すると、等電点6.8を有する等電的に
均一なタンパク質であることが分かる（図８）。
rMLBは、等電点7.1および7.3を有する２種に分類され
る天然に存在するヤドリギレクチンＢ鎖と比較すると、
等電点5.1を有する等電的に均一なタンパク質であるこ
とが分かる（図８）。
る天然に存在するヤドリギレクチンＢ鎖と比較すると、
等電点5.1を有する等電的に均一なタンパク質であるこ
とが分かる（図８）。
このため、天然に存在するMLホロタンパク質について
は可能性のある分子変異体および組み合わせ（図８下）
が多数存在するが、組換えヤドリギレクチンタンパク質
についてはIEFクロマトフォーカシングにおける移動度
が均一である。このことは、天然に存在するタンパク質
種の微小不均一に対するrMLの同質性を示す。
は可能性のある分子変異体および組み合わせ（図８下）
が多数存在するが、組換えヤドリギレクチンタンパク質
についてはIEFクロマトフォーカシングにおける移動度
が均一である。このことは、天然に存在するタンパク質
種の微小不均一に対するrMLの同質性を示す。
（III） rMLAの酵素活性 組み合わせた転写／翻訳アッセイにイムノアフィニテ
ィー精製rMLA調製物を使用すると、rMLA（可溶性発現産
生画分から単離）およびrMLA（不溶性「封入体」画分か
ら単離）についての翻訳阻害活性を検出することができ
た。
ィー精製rMLA調製物を使用すると、rMLA（可溶性発現産
生画分から単離）およびrMLA（不溶性「封入体」画分か
ら単離）についての翻訳阻害活性を検出することができ
た。
rMLAは、翻訳阻害の用量依存性および使用した網状赤
血球溶解物における非阻害可能な残基翻訳活性に関し
て、天然に存在するヤドリギレクチンＡ鎖に対して異な
る阻害特性を示した（図９を参照のこと）。MLホロタン
パク質の毒性作用の基礎を形成する酵素特性は、組換え
種において有意に減少する。
血球溶解物における非阻害可能な残基翻訳活性に関し
て、天然に存在するヤドリギレクチンＡ鎖に対して異な
る阻害特性を示した（図９を参照のこと）。MLホロタン
パク質の毒性作用の基礎を形成する酵素特性は、組換え
種において有意に減少する。
（IV） rMLBの炭水化物結合活性 一次発現産物からの再生および再酸化によって生成さ
れたrMLB鎖は、インビトロで再会合したrMLA/rMLB、rML
A/MLBおよびMLA/rMLBホロタンパク質と同様に、炭水化
物マトリクスのアシアロフェチュインまたはフェチュイ
ンに結合することによる酵素結合レクチンアッセイ（EL
LA）によって検出され得る炭水化物結合活性を有する。
ELLA系において、ガラクトース、β−ラクトース、Ｎ−
アセチルガラクトサミン（GalNAc）およびシアル酸（si
alic acid）（Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎ−acetyl
neuraminic acid,NANA）の競合条件下で、組換えrMLB鎖
の炭水化物特異性が測定および定量され得る。驚くべき
ことに、競合ELLAテストはnMLBおよびrMLBに対して異な
る炭水化物特異性を示す。結合親和性は、ガラクトース
（IC50 nMLB;4.5mM;IC50 rMLB:相互作用が低すぎるため
測定できない）、β−ラクトース（IC50 nMLB:4.9mM;IC
50 rMLB:＞70mM）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（IC50
nMLB:20.7mM;IC50 rMLB:109mM）による固定化アシアロ
フェチュインリガンド、またはシアル酸（IC50 nMLB:4
9.8mM;IC50 rMLB:47.1mM）による固定化フェチュインリ
ガンドのタンパク質の半値幅置換の系特異的IC50値によ
って特徴付けられる。
れたrMLB鎖は、インビトロで再会合したrMLA/rMLB、rML
A/MLBおよびMLA/rMLBホロタンパク質と同様に、炭水化
物マトリクスのアシアロフェチュインまたはフェチュイ
ンに結合することによる酵素結合レクチンアッセイ（EL
LA）によって検出され得る炭水化物結合活性を有する。
ELLA系において、ガラクトース、β−ラクトース、Ｎ−
アセチルガラクトサミン（GalNAc）およびシアル酸（si
alic acid）（Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎ−acetyl
neuraminic acid,NANA）の競合条件下で、組換えrMLB鎖
の炭水化物特異性が測定および定量され得る。驚くべき
ことに、競合ELLAテストはnMLBおよびrMLBに対して異な
る炭水化物特異性を示す。結合親和性は、ガラクトース
（IC50 nMLB;4.5mM;IC50 rMLB:相互作用が低すぎるため
測定できない）、β−ラクトース（IC50 nMLB:4.9mM;IC
50 rMLB:＞70mM）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（IC50
nMLB:20.7mM;IC50 rMLB:109mM）による固定化アシアロ
フェチュインリガンド、またはシアル酸（IC50 nMLB:4
9.8mM;IC50 rMLB:47.1mM）による固定化フェチュインリ
ガンドのタンパク質の半値幅置換の系特異的IC50値によ
って特徴付けられる。
ガラクトース特異的レクチンとして説明されているnM
LB鎖は予想通りガラクトースおよびβ−ラクトースによ
って置換され得るが、E.coliにおいて組換えにより得ら
れるrMLB鎖はガラクトースと検出可能な相互作用を少し
も示さず、β−ラクトースとわずかな相互作用を示すの
みである。組換えrMLBは、順にＮ−アセチルガラクトサ
ミンおよびシアル酸に対して明らかな親和性を有してお
り、驚くべきことに、植物nMLBに関してＮ−アセチルガ
ラクトサミン／シアル酸特異的レクチンに対する炭水化
物特異性の実質的なシフトを示す。rMLBおよびホロタン
パク質を含有しているrMLBの生物学的活性に関して、こ
れによってリガンド、レセプターまたは標的細胞が、あ
る範囲で存在する可能性が生じる。この範囲は、植物ヤ
ドリギレクチンタンパク質での範囲を超えるかまたはこ
れとは異なっている。
LB鎖は予想通りガラクトースおよびβ−ラクトースによ
って置換され得るが、E.coliにおいて組換えにより得ら
れるrMLB鎖はガラクトースと検出可能な相互作用を少し
も示さず、β−ラクトースとわずかな相互作用を示すの
みである。組換えrMLBは、順にＮ−アセチルガラクトサ
ミンおよびシアル酸に対して明らかな親和性を有してお
り、驚くべきことに、植物nMLBに関してＮ−アセチルガ
ラクトサミン／シアル酸特異的レクチンに対する炭水化
物特異性の実質的なシフトを示す。rMLBおよびホロタン
パク質を含有しているrMLBの生物学的活性に関して、こ
れによってリガンド、レセプターまたは標的細胞が、あ
る範囲で存在する可能性が生じる。この範囲は、植物ヤ
ドリギレクチンタンパク質での範囲を超えるかまたはこ
れとは異なっている。
好ましい実施態様において、本発明のポリペプチドは
少なくとも１つの化学的または酵素的な修飾を有する。
少なくとも１つの化学的または酵素的な修飾を有する。
この修飾は、ポリペプチドの生物学的活性を、もしあ
るのであれば、変化、低下または上昇させ得る。このよ
うな修飾は、例えばポリペプチドの翻訳および単離後に
行うことができる。このような修飾はまた、本発明のポ
リペプチドの化学的または半合成的な調製中に導入する
ことができる。これらの修飾は、当業者がそれ自体公知
の方法によって導入し、ヤドリギレクチンの薬理学的活
性を変化させ、好ましくはこれを改善することができ
る。
るのであれば、変化、低下または上昇させ得る。このよ
うな修飾は、例えばポリペプチドの翻訳および単離後に
行うことができる。このような修飾はまた、本発明のポ
リペプチドの化学的または半合成的な調製中に導入する
ことができる。これらの修飾は、当業者がそれ自体公知
の方法によって導入し、ヤドリギレクチンの薬理学的活
性を変化させ、好ましくはこれを改善することができ
る。
他の好ましい実施態様において、本発明のポリペプチ
ドは融合タンパク質である。この融合タンパク質は、好
ましくは先に定義した生物学的活性を有する。
ドは融合タンパク質である。この融合タンパク質は、好
ましくは先に定義した生物学的活性を有する。
本発明のポリペプチドのこの実施態様はまた、好まし
くは、ヤドリギレクチンポリペプチドの薬理学的特性を
細胞レベルでの標的用に変化させ、好ましくはこれを改
善するよう設計される。
くは、ヤドリギレクチンポリペプチドの薬理学的特性を
細胞レベルでの標的用に変化させ、好ましくはこれを改
善するよう設計される。
本発明はさらに、２つのモノマーが本発明の核酸分子
によってコードされている、ヤドリギレクチンの生物学
的活性を有するポリペプチドダイマーに関する。
によってコードされている、ヤドリギレクチンの生物学
的活性を有するポリペプチドダイマーに関する。
「ヤドリギレクチンの生物学的活性」という用語は、
ヤドリギレクチンの全体の生物学的活性スペクトル（sp
ecter）のあらゆる生物学的活性を含むものと解され
る。このような機能は、例えば、ヤドリギレクチンの薬
理学的作用である。
ヤドリギレクチンの全体の生物学的活性スペクトル（sp
ecter）のあらゆる生物学的活性を含むものと解され
る。このような機能は、例えば、ヤドリギレクチンの薬
理学的作用である。
植物ヤドリギ１は、アポトーシスメカニズムによって
ヒトおよびマウス起源の多数の腫瘍細胞株において細胞
溶解を誘導した（Janssen.1993）。ヤドリギレクチン１
またはＢ鎖単独は、健常ヒト血液ドナーの末梢単核細胞
からのサイトカインの放出を誘導した（Hajto,1990）。
ヤドリギレクチン１は、ガン患者の好中球顆粒球からの
スーパーオキシドアニオンの分泌を誘導した（Timoshen
ko,1993）。ヤドリギレクチン１は、健常ヒト血液ドナ
ーの末梢リンパ球におけるインターロイキン２レセプタ
ー（CD25）のＡ鎖および／またはHLA DQ抗原の発現を誘
導した（Beuth,1992）。ヤドリギレクチン１をマウスに
適用した後、胸腺細胞数、胸腺における細胞傷害性Ｔリ
ンパ球（Lyt−２＋）およびヘルパーＴ細胞（L3T4＋）
数、および末梢マクロファージ数、特に活性化マーカー
MAC−３を有する末梢マクロファージ数の増加が観察さ
れ得た（Beuth,1994）。実験動物の胸腺におけるL3T4＋
/Lyt2＋の関連が増加した。マウスの末梢血において、
ヤドリギレクチン１での処理後に、白血球、リンパ球、
一般におよび特に細胞表面にてインターロイキン２受容
体を活性化マーカーとして発現するリンパ球の単球、お
よび活性化マーカーMAC3を発現する単球の密度が増加し
た（Beuth,1994）。ガン患者の血液では、ヤドリギレク
チン１によって、Ｔリンパ球（CD4＋、CD8＋）、ナチュ
ラルキラー細胞およびＢリンパ球の密度が増加した（Be
uth,1992）。
ヒトおよびマウス起源の多数の腫瘍細胞株において細胞
溶解を誘導した（Janssen.1993）。ヤドリギレクチン１
またはＢ鎖単独は、健常ヒト血液ドナーの末梢単核細胞
からのサイトカインの放出を誘導した（Hajto,1990）。
ヤドリギレクチン１は、ガン患者の好中球顆粒球からの
スーパーオキシドアニオンの分泌を誘導した（Timoshen
ko,1993）。ヤドリギレクチン１は、健常ヒト血液ドナ
ーの末梢リンパ球におけるインターロイキン２レセプタ
ー（CD25）のＡ鎖および／またはHLA DQ抗原の発現を誘
導した（Beuth,1992）。ヤドリギレクチン１をマウスに
適用した後、胸腺細胞数、胸腺における細胞傷害性Ｔリ
ンパ球（Lyt−２＋）およびヘルパーＴ細胞（L3T4＋）
数、および末梢マクロファージ数、特に活性化マーカー
MAC−３を有する末梢マクロファージ数の増加が観察さ
れ得た（Beuth,1994）。実験動物の胸腺におけるL3T4＋
/Lyt2＋の関連が増加した。マウスの末梢血において、
ヤドリギレクチン１での処理後に、白血球、リンパ球、
一般におよび特に細胞表面にてインターロイキン２受容
体を活性化マーカーとして発現するリンパ球の単球、お
よび活性化マーカーMAC3を発現する単球の密度が増加し
た（Beuth,1994）。ガン患者の血液では、ヤドリギレク
チン１によって、Ｔリンパ球（CD4＋、CD8＋）、ナチュ
ラルキラー細胞およびＢリンパ球の密度が増加した（Be
uth,1992）。
さらに、ヤドリギレクチン１の適用後、乳癌患者の血
液血漿中にて内因性オピエートメディエータであるβ−
エンドルフィンの増加が検出され得た（Heiny,1994）。
さらに、ヤドリギレクチン１は、Ｋ−562腫瘍細胞に対
する末梢のナチュラルキラー細胞の細胞傷害性効果を増
強し、ならびに末梢血における大顆粒リンパ球（LGL）
の密度を高めることが確認された（Hajto,1989）。マウ
スの肉腫細胞におけるヤドリギレクチン１の抗転移活性
も検出され得た（Beuth,1991）。
液血漿中にて内因性オピエートメディエータであるβ−
エンドルフィンの増加が検出され得た（Heiny,1994）。
さらに、ヤドリギレクチン１は、Ｋ−562腫瘍細胞に対
する末梢のナチュラルキラー細胞の細胞傷害性効果を増
強し、ならびに末梢血における大顆粒リンパ球（LGL）
の密度を高めることが確認された（Hajto,1989）。マウ
スの肉腫細胞におけるヤドリギレクチン１の抗転移活性
も検出され得た（Beuth,1991）。
他の実施態様において、本発明のポリペプチドダイマ
ーは天然に存在するヤドリギレクチンダイマーと同じ範
囲の生物学的活性を有する。
ーは天然に存在するヤドリギレクチンダイマーと同じ範
囲の生物学的活性を有する。
（Ｖ） 組換えヤドリギレクチンの生物学的活性 同時折り畳み（co−folding）工程での可溶性折り畳
み鎖または変性rMLAおよびrMLB鎖から開始して、インビ
トロにて別々の工程で組換えにより合成した単鎖を使用
して、rMLホロタンパク質を生成した。ここで、rMLB
は、好ましくは、グルタチオン酸化還元系の存在下、特
にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの存在下でモル
過剰のrMLAと再会合された。Ｎ−アセチルガラクトサミ
ンアガロースまたはラクトシルアガロースを用いたアフ
ィニティクロマトグラフィーによる再会合反応から、ヘ
テロダイマーに対応するrMLホロタンパク質を単離およ
び精製し、これによりこのタンパク質を遊離rMLAおよび
rMLAダイマーから分離した。類似の方法で、rMLA/rMLB
（rML）およびrMLA/nMLBヘテロダイマーホロタンパク質
を調製した。
み鎖または変性rMLAおよびrMLB鎖から開始して、インビ
トロにて別々の工程で組換えにより合成した単鎖を使用
して、rMLホロタンパク質を生成した。ここで、rMLB
は、好ましくは、グルタチオン酸化還元系の存在下、特
にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの存在下でモル
過剰のrMLAと再会合された。Ｎ−アセチルガラクトサミ
ンアガロースまたはラクトシルアガロースを用いたアフ
ィニティクロマトグラフィーによる再会合反応から、ヘ
テロダイマーに対応するrMLホロタンパク質を単離およ
び精製し、これによりこのタンパク質を遊離rMLAおよび
rMLAダイマーから分離した。類似の方法で、rMLA/rMLB
（rML）およびrMLA/nMLBヘテロダイマーホロタンパク質
を調製した。
細胞傷害性活性 再会合したホロタンパク質の生物学的活性の一例とし
ての細胞傷害性作用をヒト単球白血病細胞株（MOLT4）
で試験した。Ｂ鎖（表面結合）およびＡ鎖（酵素リボソ
ーム不活性化）の両方とも観察された細胞傷害性作用に
寄与している。インビトロで再会合したrMLA/rMLBホロ
タンパク質ならびにインビトロで再会合したrMLA/nMLB
ホロタンパク質を、天然に存在するnMLホロタンパク質
の２つのバッチと比較した。組換えrMLA/rMLBおよびrML
A/nMLBホロタンパク質は、IC値が約10〜30pg/mlの比較
的高い細胞傷害特性を示す（図11）。これは、組換え鎖
を使用してインビトロで再会合されたrMLホロタンパク
質の機能的完全性および生物学的活性を示す。驚くべき
ことに単離されたrMLB鎖のみでは細胞傷害活性を有さな
いため、細胞傷害活性を作用させるためにはＢ鎖が酵素
的に活性なＡ鎖と作動可能に連結される必要がある。し
たがって、上述の植物ヤドリギレクチンＢ鎖調製物の細
胞傷害活性は、おそらくnMLホロタンパク質の残留含量
に起因し得る。このように、単鎖の組換え生成によっ
て、ヤドリギレクチンの炭水化物結合および酵素活性に
ついて別々に説明してこれを利用することが初めて可能
になる。
ての細胞傷害性作用をヒト単球白血病細胞株（MOLT4）
で試験した。Ｂ鎖（表面結合）およびＡ鎖（酵素リボソ
ーム不活性化）の両方とも観察された細胞傷害性作用に
寄与している。インビトロで再会合したrMLA/rMLBホロ
タンパク質ならびにインビトロで再会合したrMLA/nMLB
ホロタンパク質を、天然に存在するnMLホロタンパク質
の２つのバッチと比較した。組換えrMLA/rMLBおよびrML
A/nMLBホロタンパク質は、IC値が約10〜30pg/mlの比較
的高い細胞傷害特性を示す（図11）。これは、組換え鎖
を使用してインビトロで再会合されたrMLホロタンパク
質の機能的完全性および生物学的活性を示す。驚くべき
ことに単離されたrMLB鎖のみでは細胞傷害活性を有さな
いため、細胞傷害活性を作用させるためにはＢ鎖が酵素
的に活性なＡ鎖と作動可能に連結される必要がある。し
たがって、上述の植物ヤドリギレクチンＢ鎖調製物の細
胞傷害活性は、おそらくnMLホロタンパク質の残留含量
に起因し得る。このように、単鎖の組換え生成によっ
て、ヤドリギレクチンの炭水化物結合および酵素活性に
ついて別々に説明してこれを利用することが初めて可能
になる。
アポトーシスの誘導 ヤドリギレクチンの生物学的活性の一例としてのアポ
トーシス誘導能を、単球細胞株U937を使用して、組換え
rMLホロタンパク質について示した。70pg/mlで細胞を処
理した24時間後、rMLホロタンパク質によるアポトーシ
スの誘導を検出することができた（図12）。MOLT−４細
胞および末梢単核細胞（PBMC）についてのヤドリギレク
チンでの試験は、低用量範囲でのアポトーシスプロスセ
の誘導がヤドリギレクチンの細胞傷害活性の基礎である
ことを示した。サイトカイン誘導は低細胞傷害性の濃度
範囲内で起こる（図13、図14）ため、アポトーシス誘導
活性との相関がありそうではあるが、高用量範囲におい
てならびにインキュベーション時間を長くすると、アポ
トーシスは壊死作用により重畳される。アポトーシスの
結果として生じる細胞傷害性は、感受性MOLT−４細胞を
組換えＢ鎖で処理した場合には検出できなかったため、
低用量範囲におけるアポトーシス誘導の生物学的活性
は、ホロタンパク質の作用にのみ起因し得る。
トーシス誘導能を、単球細胞株U937を使用して、組換え
rMLホロタンパク質について示した。70pg/mlで細胞を処
理した24時間後、rMLホロタンパク質によるアポトーシ
スの誘導を検出することができた（図12）。MOLT−４細
胞および末梢単核細胞（PBMC）についてのヤドリギレク
チンでの試験は、低用量範囲でのアポトーシスプロスセ
の誘導がヤドリギレクチンの細胞傷害活性の基礎である
ことを示した。サイトカイン誘導は低細胞傷害性の濃度
範囲内で起こる（図13、図14）ため、アポトーシス誘導
活性との相関がありそうではあるが、高用量範囲におい
てならびにインキュベーション時間を長くすると、アポ
トーシスは壊死作用により重畳される。アポトーシスの
結果として生じる細胞傷害性は、感受性MOLT−４細胞を
組換えＢ鎖で処理した場合には検出できなかったため、
低用量範囲におけるアポトーシス誘導の生物学的活性
は、ホロタンパク質の作用にのみ起因し得る。
免疫刺激活性 組換えヤドリギレクチンホロタンパク質の生物学的活
性の例としての免疫刺激作用を、健康な血液ドナー（PB
MCモデル）のヒト単核細胞からの腫瘍壊死因子α（TNF
−α）およびインターフェロンγ（IFN−γ）放出の誘
導と、ヒト一次角化細胞および皮膚線維芽細胞（皮膚2Z
K1200モデル）の共同培養物におけるインターロイキン
１α（IL−１α）およびインターロイキン６（IL−６）
放出の誘導とについて実験的に試験した。PBMCモデルに
おいて組換えrMLホロタンパク質３〜48ng/mlでTNF−α
およびIFN−γの用量依存放出が起こり、皮膚２モデル
では組換えrMLホロタンパク質0.25〜8ng/mlでIL−１α
およびIL−６の用量依存放出が起こった。
性の例としての免疫刺激作用を、健康な血液ドナー（PB
MCモデル）のヒト単核細胞からの腫瘍壊死因子α（TNF
−α）およびインターフェロンγ（IFN−γ）放出の誘
導と、ヒト一次角化細胞および皮膚線維芽細胞（皮膚2Z
K1200モデル）の共同培養物におけるインターロイキン
１α（IL−１α）およびインターロイキン６（IL−６）
放出の誘導とについて実験的に試験した。PBMCモデルに
おいて組換えrMLホロタンパク質３〜48ng/mlでTNF−α
およびIFN−γの用量依存放出が起こり、皮膚２モデル
では組換えrMLホロタンパク質0.25〜8ng/mlでIL−１α
およびIL−６の用量依存放出が起こった。
上述したサイトカインはいずれも関係のあるヒト免疫
系の刺激メディエータであり、特に細胞性免疫応答の活
性化の際に中心となる機能を有する。
系の刺激メディエータであり、特に細胞性免疫応答の活
性化の際に中心となる機能を有する。
免疫刺激活性は主にＢ鎖のレクチン活性が原因で起こ
るとしている現在までの従来技術の状況（Hajtoら、199
0）とは対照的に、上述したサイトカイン放出はいずれ
も組換えrMLB鎖のみを用いて誘導することはできなかっ
た。免疫刺激活性は、低用量範囲にて作動可能に結合さ
れたrMLホロタンパク質によってのみ達成され低用量範
囲にて作動可能に結合されたrMLホロタンパク質によっ
てのみ達成された。この驚くべき所見から、植物rMLB鎖
の免疫刺激調製物は依然としてnMLホロタンパク質の痕
跡を含んでおり、そしてnMLB鎖に起因する免疫刺激作用
は、nMLの残留量に起因しているに違いないと考えられ
る。したがって、今まで述べられているnMLBを調製する
ための方法では、ホロタンパク質を定量的に分離するこ
とはできず、個々のヤドリギレクチン鎖の組換えを実現
することで、均一なヤドリギレクチンＢ鎖調製物を試験
して提供することが初めて可能になる。これによって、
Ａ鎖およびＢ鎖の生物学的活性を別々に説明してこれを
利用し、そして単鎖の生物学的活性と作動可能に結合し
たホロタンパク質の生物学的活性とを区別することが初
めて可能になる。
るとしている現在までの従来技術の状況（Hajtoら、199
0）とは対照的に、上述したサイトカイン放出はいずれ
も組換えrMLB鎖のみを用いて誘導することはできなかっ
た。免疫刺激活性は、低用量範囲にて作動可能に結合さ
れたrMLホロタンパク質によってのみ達成され低用量範
囲にて作動可能に結合されたrMLホロタンパク質によっ
てのみ達成された。この驚くべき所見から、植物rMLB鎖
の免疫刺激調製物は依然としてnMLホロタンパク質の痕
跡を含んでおり、そしてnMLB鎖に起因する免疫刺激作用
は、nMLの残留量に起因しているに違いないと考えられ
る。したがって、今まで述べられているnMLBを調製する
ための方法では、ホロタンパク質を定量的に分離するこ
とはできず、個々のヤドリギレクチン鎖の組換えを実現
することで、均一なヤドリギレクチンＢ鎖調製物を試験
して提供することが初めて可能になる。これによって、
Ａ鎖およびＢ鎖の生物学的活性を別々に説明してこれを
利用し、そして単鎖の生物学的活性と作動可能に結合し
たホロタンパク質の生物学的活性とを区別することが初
めて可能になる。
（VI） 組換えヤドリギレクチンＢ鎖（rMLB）の生物学
的活性 免疫担当細胞の活性化マーカーとして、細胞表面タン
パク質CD69の誘導を試験した。CD69は、Ｔ細胞、Ｂ細胞
および特にナチュラルキラー細胞（NK細胞）の活性化後
に最初の細胞表面抗原の１つとして現れる。細胞表面タ
ンパク質は休止リンパ球では発現しないため、CD69は上
述した免疫担当細胞集団の活性化マーカーの機能を有す
る。さらに、誘導可能なCD69表面タンパク質は、NK細胞
およびTcRγ／δＴ細胞の細胞溶解活性に対して助ける
機能を持っていることが明らかにされている（Moretta
ら、1991）。
的活性 免疫担当細胞の活性化マーカーとして、細胞表面タン
パク質CD69の誘導を試験した。CD69は、Ｔ細胞、Ｂ細胞
および特にナチュラルキラー細胞（NK細胞）の活性化後
に最初の細胞表面抗原の１つとして現れる。細胞表面タ
ンパク質は休止リンパ球では発現しないため、CD69は上
述した免疫担当細胞集団の活性化マーカーの機能を有す
る。さらに、誘導可能なCD69表面タンパク質は、NK細胞
およびTcRγ／δＴ細胞の細胞溶解活性に対して助ける
機能を持っていることが明らかにされている（Moretta
ら、1991）。
細胞表面でのCD69の発生およびCD69陽性細胞のシェア
の両方に関して、抗CD69mAbを使用するフローサイトメ
トリー（FACS）を利用して濃度範囲１〜100ng/mlで単核
細胞の活性化を検出した。用量依存性曲線は釣り鐘型
で、rMLB鎖の２つのリガンド結合部位を介して細胞レセ
プターが相互に結合する必要性を示している。rMLBが10
0ng/mlの最高濃度においても本試験で検討されたPBMCに
対する細胞傷害作用を証明することはできなかった。
の両方に関して、抗CD69mAbを使用するフローサイトメ
トリー（FACS）を利用して濃度範囲１〜100ng/mlで単核
細胞の活性化を検出した。用量依存性曲線は釣り鐘型
で、rMLB鎖の２つのリガンド結合部位を介して細胞レセ
プターが相互に結合する必要性を示している。rMLBが10
0ng/mlの最高濃度においても本試験で検討されたPBMCに
対する細胞傷害作用を証明することはできなかった。
好ましい実施態様において、本発明によるポリペプチ
ドダイマーは、モノマーのうちの少なくとも１つとして
化学的または酵素的に修飾された本発明によるポリペプ
チドまたは本発明による融合タンパク質を呈する。
ドダイマーは、モノマーのうちの少なくとも１つとして
化学的または酵素的に修飾された本発明によるポリペプ
チドまたは本発明による融合タンパク質を呈する。
修飾を利用して効力を最適化することができるが、特
定の品質（例えば、Ｂ鎖副作用をなくすことによって、
考えられる治療用途を拡げることもできる。特性が変化
したポリペプチドもまた作用メカニズムを明瞭にするた
めのツールとして役に立つことができる。特定の治療に
は、ポリペプチドの抗原性および免疫原性を弱めること
および／またはその薬物動態学的特性を最適化すること
が必要とされる。これは、個々のアミノ酸を特異的に交
換することによって可能になる。
定の品質（例えば、Ｂ鎖副作用をなくすことによって、
考えられる治療用途を拡げることもできる。特性が変化
したポリペプチドもまた作用メカニズムを明瞭にするた
めのツールとして役に立つことができる。特定の治療に
は、ポリペプチドの抗原性および免疫原性を弱めること
および／またはその薬物動態学的特性を最適化すること
が必要とされる。これは、個々のアミノ酸を特異的に交
換することによって可能になる。
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドおよび／
またはポリペプチドダイマーと特異的に結合する抗体ま
たはそのフラグメントまたは誘導体に関する。したがっ
て、これらの抗体またはそのフラグメントまたは誘導体
は、天然に存在するヤドリギレクチンまたはその単鎖を
認識しない。好ましくは、本発明による抗体は天然に存
在するヤドリギレクチンのグリコシル化によってマスク
されるエピトープと結合する。この抗体は、モノクロー
ナル抗体、ポリクローナル抗体または（半）合成抗体で
あり得る。フラグメントは、例えば、Fab'、Ｆ（ab）２
またはFvフラグメントであり得る。抗体の誘導体も従来
技術において公知である。
またはポリペプチドダイマーと特異的に結合する抗体ま
たはそのフラグメントまたは誘導体に関する。したがっ
て、これらの抗体またはそのフラグメントまたは誘導体
は、天然に存在するヤドリギレクチンまたはその単鎖を
認識しない。好ましくは、本発明による抗体は天然に存
在するヤドリギレクチンのグリコシル化によってマスク
されるエピトープと結合する。この抗体は、モノクロー
ナル抗体、ポリクローナル抗体または（半）合成抗体で
あり得る。フラグメントは、例えば、Fab'、Ｆ（ab）２
またはFvフラグメントであり得る。抗体の誘導体も従来
技術において公知である。
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドまたはポ
リペプチドダイマーを調製するための方法に関する。こ
の方法では、本発明による宿主を適切な条件下で培養
し、このようにして得られるポリペプチドまたはポリペ
プチドダイマーを単離する。
リペプチドダイマーを調製するための方法に関する。こ
の方法では、本発明による宿主を適切な条件下で培養
し、このようにして得られるポリペプチドまたはポリペ
プチドダイマーを単離する。
当業者であれば、宿主を培養して単離するための適切
な条件を熟知している。例えば、本発明によるポリペプ
チドまたはポリペプチドダイマーを適切な発現系を介し
て宿主から輸出することができ、そして培地において収
集することができる。一方、ポリペプチドまたはポリペ
プチドダイマーを細胞中に残存させ、そこから単離する
こともできる。以下、本発明による方法の別の好ましい
実施態様について説明する。
な条件を熟知している。例えば、本発明によるポリペプ
チドまたはポリペプチドダイマーを適切な発現系を介し
て宿主から輸出することができ、そして培地において収
集することができる。一方、ポリペプチドまたはポリペ
プチドダイマーを細胞中に残存させ、そこから単離する
こともできる。以下、本発明による方法の別の好ましい
実施態様について説明する。
rMLAを単離するために、適切な発現ベクターで形質転
換させたE.coli細胞を破壊し、そして遠心分離によって
可溶性と不溶性細胞画分とを分離した。細胞画分を分析
したところ、発現条件および発現期間に応じて、組換え
ヤドリギレクチンＡ鎖は５〜50％が可溶形態で蓄積さ
れ、50〜95％が不溶性タンパク質凝集体（「封入体」）
の形態で蓄積されることが分かった。
換させたE.coli細胞を破壊し、そして遠心分離によって
可溶性と不溶性細胞画分とを分離した。細胞画分を分析
したところ、発現条件および発現期間に応じて、組換え
ヤドリギレクチンＡ鎖は５〜50％が可溶形態で蓄積さ
れ、50〜95％が不溶性タンパク質凝集体（「封入体」）
の形態で蓄積されることが分かった。
可溶性および不溶性のタンパク質の存在は、rMLAタン
パク質の再折り畳みまたは復元が可能であるならば、rM
LAを単離する方法は少なくとも２つあることを示す。変
性条件下で沈降物を洗浄してE.coliタンパク質を除去し
た後、凝集して「封入体」になるrMLAを溶解し（Babbit
tら、1990）、そして折り畳み緩衝液（50mM Tris−HC
l、2mM DTT、1mM EDTA、pH8.0）にて90倍に希釈するこ
とによって再折り畳みした。
パク質の再折り畳みまたは復元が可能であるならば、rM
LAを単離する方法は少なくとも２つあることを示す。変
性条件下で沈降物を洗浄してE.coliタンパク質を除去し
た後、凝集して「封入体」になるrMLAを溶解し（Babbit
tら、1990）、そして折り畳み緩衝液（50mM Tris−HC
l、2mM DTT、1mM EDTA、pH8.0）にて90倍に希釈するこ
とによって再折り畳みした。
このような処理によって、図９に示されるように、複
元された本来不溶性の変性rMLA種とちょうど同様の完全
な酵素活性を有する可溶性折り畳みタンパク質種が得ら
れた。抗MLA特異抗体TA5を使用してイムノアフィニティ
クロマトグラフィーによって可溶性rMLAと同様に復元ML
Aを単離することができる（Tonevitskyら、1995）。
元された本来不溶性の変性rMLA種とちょうど同様の完全
な酵素活性を有する可溶性折り畳みタンパク質種が得ら
れた。抗MLA特異抗体TA5を使用してイムノアフィニティ
クロマトグラフィーによって可溶性rMLAと同様に復元ML
Aを単離することができる（Tonevitskyら、1995）。
可溶形態ならびに不溶性「封入体」の形態のrMLBが存
在することから、組換えヤドリギレクチンＢ鎖を単離す
るための方法は２つあることが分かる。
在することから、組換えヤドリギレクチンＢ鎖を単離す
るための方法は２つあることが分かる。
E.coli細胞質の強還元環境から可溶性rMLB鎖を単離す
るために、還元および酸化させたグルタチオンからなる
レドックス系の存在下でこれをインキュベートして鎖間
ジスルフィド橋を構築し、リガンドβ−ラクトースの存
在下でインキュベートして活性折り畳み生成物を安定さ
せる。折り畳み反応活性から、単一工程プロセスにおい
て、ラクトシルアガロースまたはＮ−アセチルガラクト
サミンアガロースを使用するアフィニティクロマトグラ
フィーによって、炭水化物結合rMLB鎖を選択的に単離お
よび／または精製した。
るために、還元および酸化させたグルタチオンからなる
レドックス系の存在下でこれをインキュベートして鎖間
ジスルフィド橋を構築し、リガンドβ−ラクトースの存
在下でインキュベートして活性折り畳み生成物を安定さ
せる。折り畳み反応活性から、単一工程プロセスにおい
て、ラクトシルアガロースまたはＮ−アセチルガラクト
サミンアガロースを使用するアフィニティクロマトグラ
フィーによって、炭水化物結合rMLB鎖を選択的に単離お
よび／または精製した。
「封入体」として存在する不溶性発現生成物画分から
rMLBを単離するために、E.coli細胞の完全細胞破壊の沈
降物を洗浄してE.coliタンパク質を除去し（Babbitt
ら、1990）、そして変性および還元条件下で溶解した。
還元および酸化させたグルタチオンからなるレドックス
系の存在下ならびにリガンドβ−ラクトースの存在下
で、希釈によって復元を行った。Ｎ−アセチルガラクト
サミンアガロースまたはラクトシルアガロースを使用す
るアフィニティクロマトグラフィーによって、復元反応
物から活性炭水化物結合rMLB鎖を選択的に単離して精製
した。
rMLBを単離するために、E.coli細胞の完全細胞破壊の沈
降物を洗浄してE.coliタンパク質を除去し（Babbitt
ら、1990）、そして変性および還元条件下で溶解した。
還元および酸化させたグルタチオンからなるレドックス
系の存在下ならびにリガンドβ−ラクトースの存在下
で、希釈によって復元を行った。Ｎ−アセチルガラクト
サミンアガロースまたはラクトシルアガロースを使用す
るアフィニティクロマトグラフィーによって、復元反応
物から活性炭水化物結合rMLB鎖を選択的に単離して精製
した。
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドまたは本
発明によるポリペプチドダイマーおよび／または後述す
る本発明によるイムノトキシンを、任意に薬学的に許容
可能な担体と混合して含有する薬学組成物に関する。
発明によるポリペプチドダイマーおよび／または後述す
る本発明によるイムノトキシンを、任意に薬学的に許容
可能な担体と混合して含有する薬学組成物に関する。
本発明によるポリペプチド、その会合物または修飾物
は、天然に存在するヤドリギレクチンで知られている薬
理学的特性と同様にガンまたは感染症の治療における様
々な用途に役立つ。
は、天然に存在するヤドリギレクチンで知られている薬
理学的特性と同様にガンまたは感染症の治療における様
々な用途に役立つ。
体が本来持っている免疫防御作用を直接的および／ま
たは間接的に刺激し、腫瘍および考えられる転移とより
効果的に闘うことができるようにすることで、免疫刺激
作用を腫瘍治療に利用することができる。感染症、特に
ウイルスによる感染症についても同じことが言える。
たは間接的に刺激し、腫瘍および考えられる転移とより
効果的に闘うことができるようにすることで、免疫刺激
作用を腫瘍治療に利用することができる。感染症、特に
ウイルスによる感染症についても同じことが言える。
本発明によるポリペプチドを、インターフェロン、サ
イトカインまたはコロニー刺激因子などの他の免疫刺激
剤と組み合わせて投与し、相乗効果を達成したり、ある
いは組み合わせ調製物の必要用量を減らして副作用を少
なくすることもできる。
イトカインまたはコロニー刺激因子などの他の免疫刺激
剤と組み合わせて投与し、相乗効果を達成したり、ある
いは組み合わせ調製物の必要用量を減らして副作用を少
なくすることもできる。
静細胞因子または放射線療法と組み合わせることで、
従来の治療方法によって引き起こされる免疫系の機能低
下が軽減されるため、白血球減少症／骨髄抑制の副作用
を緩和または軽減することができる。
従来の治療方法によって引き起こされる免疫系の機能低
下が軽減されるため、白血球減少症／骨髄抑制の副作用
を緩和または軽減することができる。
グリコシダーゼ活性を有するポリペプチドの直接的な
細胞傷害作用は、腫瘍細胞のアポトーシスの原因となる
ものであり、治療の目的で使用することもできる。本発
明によるポリペプチドが適切な抗体と結合されれば、こ
の原理をイムノトキシンの投与により具体的に使用する
ことができる。このため、本発明はさらに、本発明によ
るポリペプチドまたはポリペプチドダイマーを少なくと
も１つ含むイムノトキシンにも関する。例えば、活性Ａ
鎖またはホロタンパク質は、タンパク質化学の方法によ
って抗体またはそのフラグメントと結合することができ
る。このような結合方法は当業者間で公知であり、対応
の抱合体は多くの用途に有用である（Vitetta,1993）。
あるいは、例えば抗体およびこれに加えて本発明による
ポリペプチドの細胞傷害フラグメントから得られる抗原
結合ドメインを含有する、対応して構成された融合タン
パク質構成物を発現させることができる。
細胞傷害作用は、腫瘍細胞のアポトーシスの原因となる
ものであり、治療の目的で使用することもできる。本発
明によるポリペプチドが適切な抗体と結合されれば、こ
の原理をイムノトキシンの投与により具体的に使用する
ことができる。このため、本発明はさらに、本発明によ
るポリペプチドまたはポリペプチドダイマーを少なくと
も１つ含むイムノトキシンにも関する。例えば、活性Ａ
鎖またはホロタンパク質は、タンパク質化学の方法によ
って抗体またはそのフラグメントと結合することができ
る。このような結合方法は当業者間で公知であり、対応
の抱合体は多くの用途に有用である（Vitetta,1993）。
あるいは、例えば抗体およびこれに加えて本発明による
ポリペプチドの細胞傷害フラグメントから得られる抗原
結合ドメインを含有する、対応して構成された融合タン
パク質構成物を発現させることができる。
さらに、腫瘍細胞が他の細胞に結合するのを阻害でき
れば、転移病巣が形成されるのを防止することができ
る。本発明によるポリペプチドを使用して、競合レクチ
ン結合を利用することでこのような結合を防止すること
ができる。
れば、転移病巣が形成されるのを防止することができ
る。本発明によるポリペプチドを使用して、競合レクチ
ン結合を利用することでこのような結合を防止すること
ができる。
本発明はさらに、本発明による核酸分子またはその相
補鎖と特異的にハイブリダイズするプライマーおよび／
またはプライマー対にも関する。
補鎖と特異的にハイブリダイズするプライマーおよび／
またはプライマー対にも関する。
本発明はさらに、少なくとも ａ） 本発明による核酸分子と、 ｂ） 本発明による核酸分子またはその相補鎖と特異的
にハイブリダイズするプライマーおよび／またはプライ
マー対および／または ｃ） 本発明によるポリペプチドおよび／または本発明
によるポリペプチドダイマーと、を含有する診断組成物
にも関する。
にハイブリダイズするプライマーおよび／またはプライ
マー対および／または ｃ） 本発明によるポリペプチドおよび／または本発明
によるポリペプチドダイマーと、を含有する診断組成物
にも関する。
例えば薬学的に興味深いレクチンをコードし得る新た
なレクチン遺伝子を見いだすなどの目的で、プライマー
および／またはプライマー対を含有する本発明による診
断組成物を使用してレクチン遺伝子の存在に関して生物
をスクリーニングすることができる。本発明による診断
組成物に含まれる本発明による核酸分子を使用し、例え
ばサザンブロットまたはノーザンブロット法によって、
このようなレクチン遺伝子の存在について生物をスクリ
ーニングすることができる。ハイブリダイゼーションの
ストリンジェント性を変化させることによって、関連の
レクチン遺伝子をスクリーニングすることができる。ポ
リペプチド（ダイマー）を使用して、例えばそれ自体公
知の方法によって様々な生物中のぞれぞれの（ヤドリ
ギ）レクチンを検出することができる抗体または抗血清
を生成することができる。
なレクチン遺伝子を見いだすなどの目的で、プライマー
および／またはプライマー対を含有する本発明による診
断組成物を使用してレクチン遺伝子の存在に関して生物
をスクリーニングすることができる。本発明による診断
組成物に含まれる本発明による核酸分子を使用し、例え
ばサザンブロットまたはノーザンブロット法によって、
このようなレクチン遺伝子の存在について生物をスクリ
ーニングすることができる。ハイブリダイゼーションの
ストリンジェント性を変化させることによって、関連の
レクチン遺伝子をスクリーニングすることができる。ポ
リペプチド（ダイマー）を使用して、例えばそれ自体公
知の方法によって様々な生物中のぞれぞれの（ヤドリ
ギ）レクチンを検出することができる抗体または抗血清
を生成することができる。
最後に、本発明は、本発明によるポリペプチドおよび
／または本発明によるポリペプチドダイマーを含有する
植物保護因子に関する。植物のヤドリギレクチンについ
て論じられている機能に基づいて、本発明によるポリペ
プチド、その会合物または修飾物を植物保護因子として
使用することができる。抗ウイルス保護としてのヤドリ
ギレクチンの機能は、食べられることに対する植物の保
護対策としての有毒な特性ならびに膜の透過性および構
成に影響する特性がゆえに論じられている。
／または本発明によるポリペプチドダイマーを含有する
植物保護因子に関する。植物のヤドリギレクチンについ
て論じられている機能に基づいて、本発明によるポリペ
プチド、その会合物または修飾物を植物保護因子として
使用することができる。抗ウイルス保護としてのヤドリ
ギレクチンの機能は、食べられることに対する植物の保
護対策としての有毒な特性ならびに膜の透過性および構
成に影響する特性がゆえに論じられている。
図面において、 図１ 一次増幅オリゴヌクレオチドの構築 図２ 一次Viscum album ML増幅生成物 図３ ML遺伝子を得るためのクローニング方法 図４ rMLAおよびrMLB用の発現ベクターの挿入断片お
よび完全なML遺伝子配列 図５ rMLAについての構築スキーム発現ベクター 図６ rMLBについての構築スキーム発現ベクター 図７ rMLA、rMLBの発現および免疫検出 図８ rMLAおよびrMLB対天然MLのIEFクロマトフォー
カシング 図９ rMLA（RIP）の酵素活性 図10 rMLBの炭水化物結合特性 図11 rMLのMOLT4細胞傷害性 図12 rMLによるアポトーシスの誘導 図13 PBMCモデルにおける組換えヤドリギレクチンの
免疫刺激作用 図14 皮膚２モデルにおける組換えヤドリギレクチン
の免疫刺激作用 図15 PBMCにおける細胞表面マーカーCD69の誘導 実施例は本発明を例示するためのものである。
よび完全なML遺伝子配列 図５ rMLAについての構築スキーム発現ベクター 図６ rMLBについての構築スキーム発現ベクター 図７ rMLA、rMLBの発現および免疫検出 図８ rMLAおよびrMLB対天然MLのIEFクロマトフォー
カシング 図９ rMLA（RIP）の酵素活性 図10 rMLBの炭水化物結合特性 図11 rMLのMOLT4細胞傷害性 図12 rMLによるアポトーシスの誘導 図13 PBMCモデルにおける組換えヤドリギレクチンの
免疫刺激作用 図14 皮膚２モデルにおける組換えヤドリギレクチン
の免疫刺激作用 図15 PBMCにおける細胞表面マーカーCD69の誘導 実施例は本発明を例示するためのものである。
実施例１ 一次増幅オリゴヌクレオチドの構築 ヤドリギレクチン（ML）は、様々な系統由来の植物で
広く一般的なタンパク質ファミリーを表すリボソーム不
活性化タンパク質のクラスに属している（Stirpeら、19
92）。MLは、そのサブユニットの活性がゆえにII型リボ
ソーム不活性化タンパク質のグループに属していた（En
doら、1988a）。
広く一般的なタンパク質ファミリーを表すリボソーム不
活性化タンパク質のクラスに属している（Stirpeら、19
92）。MLは、そのサブユニットの活性がゆえにII型リボ
ソーム不活性化タンパク質のグループに属していた（En
doら、1988a）。
しかしながら、Viscum album cDNAライブラリーおよ
びゲノムライブラリーをスクリーニングする自明なアプ
ローチは、ML遺伝子配列を見つけるには全く不適切であ
る。様々なDNAプローブを使用したにもかかわらず、Vis
cum albumポリＡ＋RNAからの遺伝子ライブラリーでML特
異性クローンを同定することはできなかった。ML遺伝子
配列はイントロンを含有していないという仮定に基づい
て、PCR方法を実施した。Ｎ−末端アミノ酸配列はMLA鎖
およびMLB鎖の両方に知られている（Dietrichら、1992;
Gabiusら、1992）ため、周知のペプチドから誘導された
縮重増幅オリゴヌクレオチド（図1a）を使用してMLAコ
ード領域を増幅することは可能であるように思われた。
低縮重度の有用なオリゴヌクレオチドはMLA鎖のＮ−末
端（RMLA1、図1b）から誘導できるため、対応の十分に
特異なオリゴヌクレオチドをMLB鎖のＮ−末端（RMLB1、
RMLB2、RMLB3、図1b）から構築することは不可能であ
る。
びゲノムライブラリーをスクリーニングする自明なアプ
ローチは、ML遺伝子配列を見つけるには全く不適切であ
る。様々なDNAプローブを使用したにもかかわらず、Vis
cum albumポリＡ＋RNAからの遺伝子ライブラリーでML特
異性クローンを同定することはできなかった。ML遺伝子
配列はイントロンを含有していないという仮定に基づい
て、PCR方法を実施した。Ｎ−末端アミノ酸配列はMLA鎖
およびMLB鎖の両方に知られている（Dietrichら、1992;
Gabiusら、1992）ため、周知のペプチドから誘導された
縮重増幅オリゴヌクレオチド（図1a）を使用してMLAコ
ード領域を増幅することは可能であるように思われた。
低縮重度の有用なオリゴヌクレオチドはMLA鎖のＮ−末
端（RMLA1、図1b）から誘導できるため、対応の十分に
特異なオリゴヌクレオチドをMLB鎖のＮ−末端（RMLB1、
RMLB2、RMLB3、図1b）から構築することは不可能であ
る。
したがって、関連のタンパク質のタンパク質データを
含ませることで、それまで知られていなかったML配列領
域から増幅オリゴヌクレオチドを誘導することを可能に
する食の戦略を展開せざるを得なかった。Ｉ型およびII
型のリボソーム不活性化タンパク質のアミノ酸配列分析
を行ったところ、配列相同性の高い多数の保存領域が認
められた。図1cは、リシンの活性中心についてのＩ型RI
PとII型RIPとの共通度の高さを示す。配列モチーフMISE
AARF内で、E177およびR180に関して、これらは酵素メカ
ニズムに何らかの役割を果たしていると論じられた（Ki
mら、1992;Lordら、1994）。少なくともこれら２つの残
基はML配列中に存在しているという結論に達した。コド
ン利用の縮重度が低いものに特に注意を払って個々の残
基の存在に関してさらに構造面から熟考したところ、増
幅オリゴヌクレオチドRMLA22の構築が得られた。このオ
リゴヌクレオチドの配列を図1cに示す。
含ませることで、それまで知られていなかったML配列領
域から増幅オリゴヌクレオチドを誘導することを可能に
する食の戦略を展開せざるを得なかった。Ｉ型およびII
型のリボソーム不活性化タンパク質のアミノ酸配列分析
を行ったところ、配列相同性の高い多数の保存領域が認
められた。図1cは、リシンの活性中心についてのＩ型RI
PとII型RIPとの共通度の高さを示す。配列モチーフMISE
AARF内で、E177およびR180に関して、これらは酵素メカ
ニズムに何らかの役割を果たしていると論じられた（Ki
mら、1992;Lordら、1994）。少なくともこれら２つの残
基はML配列中に存在しているという結論に達した。コド
ン利用の縮重度が低いものに特に注意を払って個々の残
基の存在に関してさらに構造面から熟考したところ、増
幅オリゴヌクレオチドRMLA22の構築が得られた。このオ
リゴヌクレオチドの配列を図1cに示す。
実施例２ ML遺伝子特異DNAフラグメントの調製 Baurら（1993）の方法に準じて、新鮮なViscum album
葉（宿主樹木Populus wilsonii）から高分子ゲノムDNA
を単離した。PCRによってML遺伝子特異DNAフラグメント
を調製するために、各増幅反応に100ngのゲノムDNAを使
用した。PCR緩衝液（10mM Tris−HCl、1.5mM MgCl2、50
mM KCl、0.25mM dNTP、pH8.3）、プライマーRMLA1を78p
molおよびRMLA2を50pmol（反応２）または100pmol（反
応１）を含有する全容量50μｌで増幅を実施した。Biom
etraサーモサイクラーにて、Boehringer MannheimのTaq
DNAポリメラーゼ（1.5U/反応）を使用してPCRを実施し
た。PCRパラメーターは、90℃での変性１分、50℃での
アニーリング１分、72℃での延長１分を全部で30サイク
ルとした。５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動および
臭化エチジウム（ethidium bromide）を用いた染色によ
って増幅生成物を分析した（図２）。反応２において得
られた大きさ約500bpの特異増幅生成物をゲル溶出によ
って単離し、TAベクターでのクローニングに供した。
葉（宿主樹木Populus wilsonii）から高分子ゲノムDNA
を単離した。PCRによってML遺伝子特異DNAフラグメント
を調製するために、各増幅反応に100ngのゲノムDNAを使
用した。PCR緩衝液（10mM Tris−HCl、1.5mM MgCl2、50
mM KCl、0.25mM dNTP、pH8.3）、プライマーRMLA1を78p
molおよびRMLA2を50pmol（反応２）または100pmol（反
応１）を含有する全容量50μｌで増幅を実施した。Biom
etraサーモサイクラーにて、Boehringer MannheimのTaq
DNAポリメラーゼ（1.5U/反応）を使用してPCRを実施し
た。PCRパラメーターは、90℃での変性１分、50℃での
アニーリング１分、72℃での延長１分を全部で30サイク
ルとした。５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動および
臭化エチジウム（ethidium bromide）を用いた染色によ
って増幅生成物を分析した（図２）。反応２において得
られた大きさ約500bpの特異増幅生成物をゲル溶出によ
って単離し、TAベクターでのクローニングに供した。
実施例３ クローニング方法 一次PCRに使用される増幅オリゴヌクレオチドの誘導
を実施例１（図1a）に示し、以下、「ａ」と呼ぶViscum
album ML遺伝子の一次遺伝子フラグメントの調製を実
施例２（図２）に示す。クローン化した遺伝子フラグメ
ント「ａ」配列から開始して、ML遺伝子はイントロンを
持たないという反応から、フラグメント「ｂ」、
「ｃ」、「ｄ」および「ｅ」の増幅を可能にする配列特
異5'オリゴヌクレオチドを誘導することが可能であっ
た。「ｃ」の3'オリゴヌクレオチドも「ａ」のDNA配列
から誘導されたが、Ｉ型（「ｂ」）およびII型
（「ｄ」、「ｅ」、「ｇ」）RIPタンパク質の均一領域
を分析することによって、遺伝子フラグメント「ｂ」、
「ｄ」、「ｅ」および「ｇ」の増幅用の縮重3'プライマ
ーを構成しなければならなかった。タンパク質ファミリ
ー内での配列比較を再度使用して、コドン使用の縮重度
が低い残基に特に注意を払って個々の残基の存在を推定
した。特に、既知のリシンおよびアブリンcDNAおよび誘
導タンパク質配列を使用して、約50のML特異オリゴヌク
レオチドの組み合わせを構成した。図３は、特異増幅生
成物としてクローン化可能かつさらに分析可能な遺伝子
フラグメントのみを示す。その他のオリゴヌクレオチド
の組み合わせから開始すると、ML特異増幅生成物を生成
することはできなかった。遺伝子フラグメント「ｆ」
（MLA鎖をコードする）および「ｇ」（MLB鎖をコードす
る）の調製については、それぞれ実施例５および６にお
いて詳細に説明する。
を実施例１（図1a）に示し、以下、「ａ」と呼ぶViscum
album ML遺伝子の一次遺伝子フラグメントの調製を実
施例２（図２）に示す。クローン化した遺伝子フラグメ
ント「ａ」配列から開始して、ML遺伝子はイントロンを
持たないという反応から、フラグメント「ｂ」、
「ｃ」、「ｄ」および「ｅ」の増幅を可能にする配列特
異5'オリゴヌクレオチドを誘導することが可能であっ
た。「ｃ」の3'オリゴヌクレオチドも「ａ」のDNA配列
から誘導されたが、Ｉ型（「ｂ」）およびII型
（「ｄ」、「ｅ」、「ｇ」）RIPタンパク質の均一領域
を分析することによって、遺伝子フラグメント「ｂ」、
「ｄ」、「ｅ」および「ｇ」の増幅用の縮重3'プライマ
ーを構成しなければならなかった。タンパク質ファミリ
ー内での配列比較を再度使用して、コドン使用の縮重度
が低い残基に特に注意を払って個々の残基の存在を推定
した。特に、既知のリシンおよびアブリンcDNAおよび誘
導タンパク質配列を使用して、約50のML特異オリゴヌク
レオチドの組み合わせを構成した。図３は、特異増幅生
成物としてクローン化可能かつさらに分析可能な遺伝子
フラグメントのみを示す。その他のオリゴヌクレオチド
の組み合わせから開始すると、ML特異増幅生成物を生成
することはできなかった。遺伝子フラグメント「ｆ」
（MLA鎖をコードする）および「ｇ」（MLB鎖をコードす
る）の調製については、それぞれ実施例５および６にお
いて詳細に説明する。
ML遺伝子の翻訳配列領域および非翻訳配列領域の5'領
域および3'領域を分析するために、5'および3'RACEの条
件（Frohmanら、1988）を確立した。これは、フラグメ
ント「ｈ」、「ｉ」および「ｊ」の生成を引き起こすも
のである。したがって、RACE−PCRによるフラグメント
「ｊ」の増幅は、完全なMLB遺伝子フラグメントの調製
に代わるものである。逆転写によってヤドリギ葉から単
離されたViscum album全RNAから調製されたcDNA（宿主
樹木Populus wilsonii）を使用してRACE反応を実施し
た。
域および3'領域を分析するために、5'および3'RACEの条
件（Frohmanら、1988）を確立した。これは、フラグメ
ント「ｈ」、「ｉ」および「ｊ」の生成を引き起こすも
のである。したがって、RACE−PCRによるフラグメント
「ｊ」の増幅は、完全なMLB遺伝子フラグメントの調製
に代わるものである。逆転写によってヤドリギ葉から単
離されたViscum album全RNAから調製されたcDNA（宿主
樹木Populus wilsonii）を使用してRACE反応を実施し
た。
実施例４ DNA配列および翻訳生成物rMLAおよびrMLB 様々なML特異オリゴヌクレオチドを使用して、「プラ
イマー歩行」方法（２つの鎖の完全に重複している配列
の検出）を利用する標準的な手順によって発現ベクター
pT7−MLAおよびpT7−MLBの挿入断片の配列を決定した
（図4a、ｂ）。下線を付した配列領域は、pT7発現ベク
ターへのクローニング用の制限部位を示す。実施例５お
よび６において説明するような発現ベクターの構成スキ
ームに基づいて、２つの遺伝子フラグメントを修飾し
た。図4cは、上記のフラグメントから誘導された完全な
ML遺伝子配列を示す。この配列は、5'非翻訳領域および
3'非翻訳領域ならびにエンドペプチドおよびシグナルペ
プチドコード領域を有する。
イマー歩行」方法（２つの鎖の完全に重複している配列
の検出）を利用する標準的な手順によって発現ベクター
pT7−MLAおよびpT7−MLBの挿入断片の配列を決定した
（図4a、ｂ）。下線を付した配列領域は、pT7発現ベク
ターへのクローニング用の制限部位を示す。実施例５お
よび６において説明するような発現ベクターの構成スキ
ームに基づいて、２つの遺伝子フラグメントを修飾し
た。図4cは、上記のフラグメントから誘導された完全な
ML遺伝子配列を示す。この配列は、5'非翻訳領域および
3'非翻訳領域ならびにエンドペプチドおよびシグナルペ
プチドコード領域を有する。
実施例５ 発現ベクターpT7−MLAの構成 異種発現用に、複合ゲノムヤドリギDNAから開始して
特異的PCRによってヤドリギレクチンＡ鎖をコードする
配列を調製し、末端修飾した。使用するプライマーオリ
ゴヌクレオチドの非相補的領域を介して翻訳調節要素な
らびに制限エンドヌクレアーゼの認識配列を加え、これ
によってゲノムプレプロヤドリギレクチンに基づくヤド
リギレクチンＡ鎖のクローニングおよび別個の発現を可
能にした。
特異的PCRによってヤドリギレクチンＡ鎖をコードする
配列を調製し、末端修飾した。使用するプライマーオリ
ゴヌクレオチドの非相補的領域を介して翻訳調節要素な
らびに制限エンドヌクレアーゼの認識配列を加え、これ
によってゲノムプレプロヤドリギレクチンに基づくヤド
リギレクチンＡ鎖のクローニングおよび別個の発現を可
能にした。
図5bは、PCRによるMLAコード遺伝子フラグメントの調
製を示す。MLAコード遺伝子配列を増幅するために、PCR
緩衝液（10mM Tris−HCl、50mM KCl、それぞれ0.25mMの
dNTP、pH8.3）中のゲノムViscum album DNAを200ngと、
1.5mM（反応１）または2.5mM（反応２）塩化マグネシウ
ムと、プライマーオリゴヌクレオチドRML16およびRML17
をそれぞれ40pmolとを全容量50μｌで使用した。94℃で
変性を１分、52℃でアニーリングを１分、72℃で延長を
1.5分の温度プロファイルを全部で30サイクルとして、T
aqポリメラーゼ（1.5U/反応、Boehringer Mannheim）を
使用してPCRを実施した。１％アガロースゲル電気泳動
および臭化エチジウムを用いた染色によって増幅生成物
を分析し（図5b）、ゲル溶出によってTAベクターでのク
ローニングに供した。
製を示す。MLAコード遺伝子配列を増幅するために、PCR
緩衝液（10mM Tris−HCl、50mM KCl、それぞれ0.25mMの
dNTP、pH8.3）中のゲノムViscum album DNAを200ngと、
1.5mM（反応１）または2.5mM（反応２）塩化マグネシウ
ムと、プライマーオリゴヌクレオチドRML16およびRML17
をそれぞれ40pmolとを全容量50μｌで使用した。94℃で
変性を１分、52℃でアニーリングを１分、72℃で延長を
1.5分の温度プロファイルを全部で30サイクルとして、T
aqポリメラーゼ（1.5U/反応、Boehringer Mannheim）を
使用してPCRを実施した。１％アガロースゲル電気泳動
および臭化エチジウムを用いた染色によって増幅生成物
を分析し（図5b）、ゲル溶出によってTAベクターでのク
ローニングに供した。
２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
およびクローニングならびに翻訳開始コドンの追加によ
って、アミノ酸配列残基チロシン１−チロシン17と対応
するrMLAをコードする配列の5'領域（Dietrichら、199
2;Gabiusら、1992）を合成遺伝子フラグメントとして調
製した。このように、Escherichia coliにおいて強く発
現する遺伝子について説明されているようにコドンの選
択に関して遺伝子配列を最適化した（Gribskovら、198
4）。PCRによって得られる合成rMLA遺伝子フラグメント
の3'末端ならびにrMLA遺伝子フラグメントの5'末端にお
いて、TACからTATへのチロシン17コドンの特異的な交換
によってSsp I制限部位を導入した。この制限部位によ
って、ベクターpML14−17を得ながら２つのrMLA遺伝子
フラグメントを融合させることができた（図５）。
およびクローニングならびに翻訳開始コドンの追加によ
って、アミノ酸配列残基チロシン１−チロシン17と対応
するrMLAをコードする配列の5'領域（Dietrichら、199
2;Gabiusら、1992）を合成遺伝子フラグメントとして調
製した。このように、Escherichia coliにおいて強く発
現する遺伝子について説明されているようにコドンの選
択に関して遺伝子配列を最適化した（Gribskovら、198
4）。PCRによって得られる合成rMLA遺伝子フラグメント
の3'末端ならびにrMLA遺伝子フラグメントの5'末端にお
いて、TACからTATへのチロシン17コドンの特異的な交換
によってSsp I制限部位を導入した。この制限部位によ
って、ベクターpML14−17を得ながら２つのrMLA遺伝子
フラグメントを融合させることができた（図５）。
DNA配列決定（図4a）によってrMLAをコードする完全
生成配列を確認した。Escherichia coliにおいてrMLAを
発現させるために、遺伝子配列をベクターpML14−17か
ら単離し、発現ベクターPT7−７に挿入することによっ
てこれをT7−RNAポリメラーゼプロモーターおよび転写
ターミネーターの制御下においた。得られた発現ベクタ
ーpT7−MLA（図５）を使用して、E.coli発現菌株BL21を
形質転換した。
生成配列を確認した。Escherichia coliにおいてrMLAを
発現させるために、遺伝子配列をベクターpML14−17か
ら単離し、発現ベクターPT7−７に挿入することによっ
てこれをT7−RNAポリメラーゼプロモーターおよび転写
ターミネーターの制御下においた。得られた発現ベクタ
ーpT7−MLA（図５）を使用して、E.coli発現菌株BL21を
形質転換した。
実施例６ 発現ベクターpT7−MLBの構築 ヤドリギレクチンＢ鎖の異種発現のために、使用する
プライマーオリゴヌクレオチドの非相補的領域を介して
翻訳調節要素ならびに制限エンドヌクレアーゼの認識配
列を導入して、特異的PCRによって複合ゲノムViscum al
bum DNAからMLBをコードする完全配列を増幅した。
プライマーオリゴヌクレオチドの非相補的領域を介して
翻訳調節要素ならびに制限エンドヌクレアーゼの認識配
列を導入して、特異的PCRによって複合ゲノムViscum al
bum DNAからMLBをコードする完全配列を増幅した。
図6bは、rMLBを完全にコードする全遺伝子フラグメン
トのPCRによる調製を示す。PCR緩衝液（10mM Tris−HC
l、50mM KCl、1.5mM MgCl2、それぞれ0.25mMのdNTP、pH
8.3）およびゲノムViscum album DNAを200ng、プライマ
ーオリゴヌクレオチドRML25を50pmolおよびプライマー
オリゴヌクレオチドRML26を30pmol（反応１）および10p
mol（反応２）の全容量50μｌでPCR反応物においてrMLB
コードDNAフラグメントの増幅を実施した。94℃で変性
を１分、52℃でアニーリングを１分、72℃で延長を1.5
分を全部で30サイクルとして、Taqポリメラーゼ（1.5U/
反応、Boehringer Mannheim）を使用してPCRを実施し
た。１％アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム
を用いた染色によってPCR生成物を分析した。結果は0.8
kbpのPCR生成物であり、これをゲル溶出によって単離し
てTAベクターでのクローニングに供した。このrMLBコー
ド遺伝子フラグメントを、発現ベクターPT7−７に挿入
することによって翻訳調節要素の制御下におき、得られ
た発現ベクターpT7−MLBで発現菌株E.coli BL21を形質
転換した。rMLBをコードするPCR生成完全配列の完全性
をDNA配列決定によって確認した（図4b）。
トのPCRによる調製を示す。PCR緩衝液（10mM Tris−HC
l、50mM KCl、1.5mM MgCl2、それぞれ0.25mMのdNTP、pH
8.3）およびゲノムViscum album DNAを200ng、プライマ
ーオリゴヌクレオチドRML25を50pmolおよびプライマー
オリゴヌクレオチドRML26を30pmol（反応１）および10p
mol（反応２）の全容量50μｌでPCR反応物においてrMLB
コードDNAフラグメントの増幅を実施した。94℃で変性
を１分、52℃でアニーリングを１分、72℃で延長を1.5
分を全部で30サイクルとして、Taqポリメラーゼ（1.5U/
反応、Boehringer Mannheim）を使用してPCRを実施し
た。１％アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム
を用いた染色によってPCR生成物を分析した。結果は0.8
kbpのPCR生成物であり、これをゲル溶出によって単離し
てTAベクターでのクローニングに供した。このrMLBコー
ド遺伝子フラグメントを、発現ベクターPT7−７に挿入
することによって翻訳調節要素の制御下におき、得られ
た発現ベクターpT7−MLBで発現菌株E.coli BL21を形質
転換した。rMLBをコードするPCR生成完全配列の完全性
をDNA配列決定によって確認した（図4b）。
実施例７ rMLAおよびrMLBの発現、免疫学的分析、再生およびイン
ビトロでの再会合 （Ｉ） E.coliでのrMLAの発現 組換えヤドリギレクチンＡ鎖を発現させるために、定
常成長させたE.coli BL21/pT7−MLAのLBAmp前培養物5ml
と共にLBAmp培地1000mlを２リットルの溝付組織培養フ
ラスコに接種し、振盪しながら37℃で培養した。578nm
の比濁分析によって成長を観察した。細胞密度が約OD
5780.9〜1.0に達したら0.5mM IPTGを加えて遺伝子発現
を誘導した。収穫するために、5,000rpmの遠心分離によ
って20分間４℃でGS−３ローター（Sorvall）にて誘導
後に細胞を２時間沈降させ、培養液をデカントした。１
リットルの培養容積から開始して、３〜4g（含水重量）
の細胞塊を単離した。
ビトロでの再会合 （Ｉ） E.coliでのrMLAの発現 組換えヤドリギレクチンＡ鎖を発現させるために、定
常成長させたE.coli BL21/pT7−MLAのLBAmp前培養物5ml
と共にLBAmp培地1000mlを２リットルの溝付組織培養フ
ラスコに接種し、振盪しながら37℃で培養した。578nm
の比濁分析によって成長を観察した。細胞密度が約OD
5780.9〜1.0に達したら0.5mM IPTGを加えて遺伝子発現
を誘導した。収穫するために、5,000rpmの遠心分離によ
って20分間４℃でGS−３ローター（Sorvall）にて誘導
後に細胞を２時間沈降させ、培養液をデカントした。１
リットルの培養容積から開始して、３〜4g（含水重量）
の細胞塊を単離した。
French−Press（SML Instruments）を使用して細胞破
壊を行った。細胞沈降物を破壊緩衝液Ｂ（50mM Tris−H
Cl、100mM NaCl、1mM EDTA、5mM DTT、1mM PMSF、pH8.
0）20mlに再懸濁させ、そして二工程French−Pressによ
って1,500psiで破壊した。続いて、10,000rpmで30分
間、４℃でSS−34ローター（Sorvall）にて遠心分離を
行って不溶性細胞画分および考えられる「封入体」を沈
降させ、そしてこれを上清に残った可溶性E.coliタンパ
ク質または可溶性発現生成物から分離した。
壊を行った。細胞沈降物を破壊緩衝液Ｂ（50mM Tris−H
Cl、100mM NaCl、1mM EDTA、5mM DTT、1mM PMSF、pH8.
0）20mlに再懸濁させ、そして二工程French−Pressによ
って1,500psiで破壊した。続いて、10,000rpmで30分
間、４℃でSS−34ローター（Sorvall）にて遠心分離を
行って不溶性細胞画分および考えられる「封入体」を沈
降させ、そしてこれを上清に残った可溶性E.coliタンパ
ク質または可溶性発現生成物から分離した。
発現を分析するために、12.5％SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動およびクーマシーブリリアントブルーで
の染色ならびにMLA特異抗血清TA5を使用するウェスタン
ブロットによって等容量の細胞破壊画分を試験した（図
7a）。モノクローナル抗体TA5（Tonevitskyら、1995）
を著者から入手した。本発明において使用する他の抗体
と同様に、これらの抗体もそれぞれの免疫原（TA5の場
合には、ML−１またはMLA）を使用する標準的な技術に
よって調製され得る。発現を検出するために、E.coli破
壊物の等容量の可溶性画分（レーン２、４、６、８）な
らびに不溶性「封入体」画分（レーン１、３、５、７）
をrMLA含有量について試験した。発現経過を示すため
に、遺伝子発現の誘導前（レーン１および２）、２時間
後（レーン３および４）、４時間後（レーン５および
６）および６時間後（レーン７および８）を使用した。
発現は、rMLAに対応する免疫反応性の25kDaの発現生成
物の発生によって誘導１時間後にすでに特徴付けされて
おり、その最大発現は誘導２時間後に達成されている。
誘導２時間後の可溶性および不溶性の細胞破壊画分にわ
たるrMLAの分布はそれぞれ約50％であり、発現期間が長
くなると不溶性「封入体」の形成量が増加する。
ドゲル電気泳動およびクーマシーブリリアントブルーで
の染色ならびにMLA特異抗血清TA5を使用するウェスタン
ブロットによって等容量の細胞破壊画分を試験した（図
7a）。モノクローナル抗体TA5（Tonevitskyら、1995）
を著者から入手した。本発明において使用する他の抗体
と同様に、これらの抗体もそれぞれの免疫原（TA5の場
合には、ML−１またはMLA）を使用する標準的な技術に
よって調製され得る。発現を検出するために、E.coli破
壊物の等容量の可溶性画分（レーン２、４、６、８）な
らびに不溶性「封入体」画分（レーン１、３、５、７）
をrMLA含有量について試験した。発現経過を示すため
に、遺伝子発現の誘導前（レーン１および２）、２時間
後（レーン３および４）、４時間後（レーン５および
６）および６時間後（レーン７および８）を使用した。
発現は、rMLAに対応する免疫反応性の25kDaの発現生成
物の発生によって誘導１時間後にすでに特徴付けされて
おり、その最大発現は誘導２時間後に達成されている。
誘導２時間後の可溶性および不溶性の細胞破壊画分にわ
たるrMLAの分布はそれぞれ約50％であり、発現期間が長
くなると不溶性「封入体」の形成量が増加する。
（II） 不溶性「封入体」からのrMLAの単離 Babittら（1990）に従って、E.coli完全細胞破壊物の
沈降物を、それぞれSTET緩衝液（50mM Tris−HCl、８％
（w/v）スクロース、50mM EDTA、1.5％（v/v）Triton X
−100、pH7.4）20mlで２回洗浄し、E.coliタンパク質を
除去した。「封入体」を含有する残りの沈降物を、室温
にて16時間、一定攪拌下でインキュベートすることによ
って変性緩衝液（6M塩化グアニジニウム（guanidiniumc
hloride）、100mM DTT、50mM Tris−HCl、pH8.0）20ml
に溶解した。
沈降物を、それぞれSTET緩衝液（50mM Tris−HCl、８％
（w/v）スクロース、50mM EDTA、1.5％（v/v）Triton X
−100、pH7.4）20mlで２回洗浄し、E.coliタンパク質を
除去した。「封入体」を含有する残りの沈降物を、室温
にて16時間、一定攪拌下でインキュベートすることによ
って変性緩衝液（6M塩化グアニジニウム（guanidiniumc
hloride）、100mM DTT、50mM Tris−HCl、pH8.0）20ml
に溶解した。
rMLAを再生するために、変性緩衝液中に存在するタン
パク質溶液を、90倍容量の折り畳み緩衝液（50mM Tris
−HCl、2mM DTT、1mM EDTA、pH8.0）にゆっくりと滴下
して加え、そして攪拌しながら室温にて16時間インキュ
ベートした。GS−３ローター（Sorvall）において6,000
rpmで30分間、４℃で遠心分離することによって、沈殿
したタンパク質を分離した。rMLA含有上清を、保存のた
めに20％（v/v）グリセロールに調整し、４℃で保存し
た。
パク質溶液を、90倍容量の折り畳み緩衝液（50mM Tris
−HCl、2mM DTT、1mM EDTA、pH8.0）にゆっくりと滴下
して加え、そして攪拌しながら室温にて16時間インキュ
ベートした。GS−３ローター（Sorvall）において6,000
rpmで30分間、４℃で遠心分離することによって、沈殿
したタンパク質を分離した。rMLA含有上清を、保存のた
めに20％（v/v）グリセロールに調整し、４℃で保存し
た。
（III） イムノアフィニティークロマトグラフィーに
よるrMLAの精製 イムノアフィニティークロマトグラフィーによるrMLA
（可溶性発現生成物画分または再折り畳みタンパク質）
の一工程精製のために、HarlowおよびSpur（1988）の方
法に従って、ヤドリギレクチンＡ鎖に対して方向付けら
れたモノクローナル抗体抗nMLA−IgG（TA5,Tonevitsky
ら、1995）260μｇを、プロテインＡセファロースCL4B
（Sigma,Deisenhofen）上に共有結合的に固定した。イ
ムノアフィニティーマトリックスをrMLA試料とともにイ
ンキュベートし、このマトリックスを10カラム床容量
（column bed volume）の洗浄緩衝液１（1M NaCl、10mM
リン酸緩衝液、pH7.0）および10カラム床容量の洗浄緩
衝液２（10mMリン酸緩衝液、pH7.0）で洗浄して非特異
的に結合したタンパク質を除去した後、特異的に結合し
たrMLAを、溶出緩衝液（0.1Mグリシン、pH2.5）で溶出
した。溶出を行ってpH8.0の1Mリン酸緩衝液を含む容器
中でpHを再調整した。
よるrMLAの精製 イムノアフィニティークロマトグラフィーによるrMLA
（可溶性発現生成物画分または再折り畳みタンパク質）
の一工程精製のために、HarlowおよびSpur（1988）の方
法に従って、ヤドリギレクチンＡ鎖に対して方向付けら
れたモノクローナル抗体抗nMLA−IgG（TA5,Tonevitsky
ら、1995）260μｇを、プロテインＡセファロースCL4B
（Sigma,Deisenhofen）上に共有結合的に固定した。イ
ムノアフィニティーマトリックスをrMLA試料とともにイ
ンキュベートし、このマトリックスを10カラム床容量
（column bed volume）の洗浄緩衝液１（1M NaCl、10mM
リン酸緩衝液、pH7.0）および10カラム床容量の洗浄緩
衝液２（10mMリン酸緩衝液、pH7.0）で洗浄して非特異
的に結合したタンパク質を除去した後、特異的に結合し
たrMLAを、溶出緩衝液（0.1Mグリシン、pH2.5）で溶出
した。溶出を行ってpH8.0の1Mリン酸緩衝液を含む容器
中でpHを再調整した。
（IV） E.coliでのrMLBの発現 組換えヤドリギレクチンＢ鎖を発現させるために、定
常増殖させたE.coli BL21/pT7−MLBのLBAmp前培養物5ml
と共にLBAmp培地1000mlを2Lの溝付組織培養フラスコに
接種し、そして振盪下で37℃にて培養した。578nmの比
濁分析によって増殖を観察した。細胞密度OD578が約0.9
〜1.0に達したときに、0.5mM IPTGを加えて遺伝子発現
を誘導した。回収するために、誘導４時間後、GS−３ロ
ーター（Sorvall）における5,000rpmで20分間４℃にて
の遠心分離によって細胞を沈降させ、そして培養培地を
デカントした。
常増殖させたE.coli BL21/pT7−MLBのLBAmp前培養物5ml
と共にLBAmp培地1000mlを2Lの溝付組織培養フラスコに
接種し、そして振盪下で37℃にて培養した。578nmの比
濁分析によって増殖を観察した。細胞密度OD578が約0.9
〜1.0に達したときに、0.5mM IPTGを加えて遺伝子発現
を誘導した。回収するために、誘導４時間後、GS−３ロ
ーター（Sorvall）における5,000rpmで20分間４℃にて
の遠心分離によって細胞を沈降させ、そして培養培地を
デカントした。
French−PressTM（SLM Instruments）を使用して細胞
を破壊した。細胞沈降物を、破壊緩衝液Ｂ（20mMリン酸
緩衝液、50mM NaCl、1mM EDTA、1mM PMSF、pH7.2）20ml
に再懸濁し、そして２回のFrench−Press工程によって
1,500psiで破壊した。続いて、SS−34ローター（Sorval
l）において10,000rpmで30分間、４℃で遠心分離を行う
ことによって不溶性細胞画分および考えられる「封入
体」を沈降させ、そしてこれを上清に残る可溶性E.coli
タンパク質または可溶性発現生成物から分離した。
を破壊した。細胞沈降物を、破壊緩衝液Ｂ（20mMリン酸
緩衝液、50mM NaCl、1mM EDTA、1mM PMSF、pH7.2）20ml
に再懸濁し、そして２回のFrench−Press工程によって
1,500psiで破壊した。続いて、SS−34ローター（Sorval
l）において10,000rpmで30分間、４℃で遠心分離を行う
ことによって不溶性細胞画分および考えられる「封入
体」を沈降させ、そしてこれを上清に残る可溶性E.coli
タンパク質または可溶性発現生成物から分離した。
発現を分析するために、12.5％SDSポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動、およびクーマシーブリリアントブルー
での染色、ならびにMLD特異的抗血清TB33を使用するウ
ェスタンブロットによって、等容量の細胞破壊画分を試
験した（図7b）。モノクローナル抗体TB33（Tonevitsky
ら、1995）を著者から入手した。この抗体は標準的な技
術によって調製された。対応する抗体は、ML−１または
MLBを免疫原として使用する標準的な技術によって、当
業者により調製され得る。発現を分析するために、E.co
liの等容量の可溶性画分（レーン２、４、６、８）およ
び不溶性「封入体」画分（レーン１、３、５、７）をrM
LB含有量について試験した。発現経過を示すために、遺
伝子発現の誘導前（レーン１および２）、２時間後（レ
ーン３および４）、４時間後（レーン５および６）およ
び６時間後（レーン７および８）の試料を使用した。発
現は、rMLBに対応する免疫反応性の31kDa発現生成物の
出現によって誘導１時間後にすでに特徴付けられてお
り、その最大発現は誘導４時間後に達成される。誘導４
時間後の可溶性および不溶性の細胞破壊画分にわたるrM
LBの分布はそれぞれ約50％であり、より長い発現期間は
不溶性「封入体」の形態での発現rMLBの蓄積が生じる。
ドゲル電気泳動、およびクーマシーブリリアントブルー
での染色、ならびにMLD特異的抗血清TB33を使用するウ
ェスタンブロットによって、等容量の細胞破壊画分を試
験した（図7b）。モノクローナル抗体TB33（Tonevitsky
ら、1995）を著者から入手した。この抗体は標準的な技
術によって調製された。対応する抗体は、ML−１または
MLBを免疫原として使用する標準的な技術によって、当
業者により調製され得る。発現を分析するために、E.co
liの等容量の可溶性画分（レーン２、４、６、８）およ
び不溶性「封入体」画分（レーン１、３、５、７）をrM
LB含有量について試験した。発現経過を示すために、遺
伝子発現の誘導前（レーン１および２）、２時間後（レ
ーン３および４）、４時間後（レーン５および６）およ
び６時間後（レーン７および８）の試料を使用した。発
現は、rMLBに対応する免疫反応性の31kDa発現生成物の
出現によって誘導１時間後にすでに特徴付けられてお
り、その最大発現は誘導４時間後に達成される。誘導４
時間後の可溶性および不溶性の細胞破壊画分にわたるrM
LBの分布はそれぞれ約50％であり、より長い発現期間は
不溶性「封入体」の形態での発現rMLBの蓄積が生じる。
（Ｖ） 不溶性「封入体」からのrMLBの単離 Babittら（1990）に従って、E.coli完全細胞破壊物の
沈降物を、それぞれSTET緩衝液（50mM Tris−HCl、８％
（w/v）スクロース、50mM EDTA、1.5％（v/v）Triton X
−100、pH7.4）20mlで２回洗浄し、E.coliタンパク質を
除去した。「封入体」を含有する残りの沈降物を、室温
にて16時間、振盪させながらインキュベートすることに
よって変性緩衝液（6M塩化グアニジニウム、100mM DT
T、50mM Tris−HCl、pH8.0）20mlに溶解した。
沈降物を、それぞれSTET緩衝液（50mM Tris−HCl、８％
（w/v）スクロース、50mM EDTA、1.5％（v/v）Triton X
−100、pH7.4）20mlで２回洗浄し、E.coliタンパク質を
除去した。「封入体」を含有する残りの沈降物を、室温
にて16時間、振盪させながらインキュベートすることに
よって変性緩衝液（6M塩化グアニジニウム、100mM DT
T、50mM Tris−HCl、pH8.0）20mlに溶解した。
rMLABを再生するために、変性緩衝液中に存在するタ
ンパク質溶液を、90倍容量の折り畳み緩衝液（20mMリン
酸緩衝液、50mM KCl、1mM EDTA、10mMグルコース、10％
（v/v）グリセロール、10mM β−ラクトース、pH5.5）
にゆっくりと滴下して加え、攪拌しながら室温にて16時
間インキュベートした。GS−３ローター（Sorvall）に
おいて6,000rpmで30分間、４℃で遠心分離することによ
って、沈殿したタンパク質を可溶性折り畳みrMLG画分か
ら分離した。
ンパク質溶液を、90倍容量の折り畳み緩衝液（20mMリン
酸緩衝液、50mM KCl、1mM EDTA、10mMグルコース、10％
（v/v）グリセロール、10mM β−ラクトース、pH5.5）
にゆっくりと滴下して加え、攪拌しながら室温にて16時
間インキュベートした。GS−３ローター（Sorvall）に
おいて6,000rpmで30分間、４℃で遠心分離することによ
って、沈殿したタンパク質を可溶性折り畳みrMLG画分か
ら分離した。
（VI） Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンアガロース
でのアフィニティークロマトグラフィーによるrMLBの単
離 活性な炭水化物結合rMLBを単離するために、Ｎ−アセ
チル−ガラクトサミンアガロースアフィニティーマトリ
ックス（PIERCE,USA）を、10カラム床容量のクロマトグ
ラフィー緩衝液（50mMリン酸緩衝液、300mM NaCl、1mM
EDTA、10％（v/v）グリセロール、0.05％（v/v）Tween
−20、pH7.0）で平衡化した。rMLB含有試料溶液中で
少なくとも２時間４℃でアフィニティーマトリックスを
バッチインキュベートすることによって、試料の適用を
実施した。クロマトグラフィー緩衝液でアフィニティー
マトリックスを洗浄して非特的に結合したタンパク質を
除去した後、pH4.0のクロマトグラフィー緩衝液中で0.3
M N−アセチル−ガラクトサミンとの競合的置換によっ
て結合rMLBを溶出させた。
でのアフィニティークロマトグラフィーによるrMLBの単
離 活性な炭水化物結合rMLBを単離するために、Ｎ−アセ
チル−ガラクトサミンアガロースアフィニティーマトリ
ックス（PIERCE,USA）を、10カラム床容量のクロマトグ
ラフィー緩衝液（50mMリン酸緩衝液、300mM NaCl、1mM
EDTA、10％（v/v）グリセロール、0.05％（v/v）Tween
−20、pH7.0）で平衡化した。rMLB含有試料溶液中で
少なくとも２時間４℃でアフィニティーマトリックスを
バッチインキュベートすることによって、試料の適用を
実施した。クロマトグラフィー緩衝液でアフィニティー
マトリックスを洗浄して非特的に結合したタンパク質を
除去した後、pH4.0のクロマトグラフィー緩衝液中で0.3
M N−アセチル−ガラクトサミンとの競合的置換によっ
て結合rMLBを溶出させた。
（VII） ホロタンパク質を調製するためのインビトロ
でのヤドリギレクチン鎖の再会合 組換えヤドリギレクチンホロタンパク質（rML）は、
単離した折り畳みヤドリギレクチンＡおよびヤドリギレ
クチンＢ鎖から開始するか、あるいは変性ヤドリギレク
チン鎖（共折り畳みによって再生された）から開始して
調製し得る。
でのヤドリギレクチン鎖の再会合 組換えヤドリギレクチンホロタンパク質（rML）は、
単離した折り畳みヤドリギレクチンＡおよびヤドリギレ
クチンＢ鎖から開始するか、あるいは変性ヤドリギレク
チン鎖（共折り畳みによって再生された）から開始して
調製し得る。
単離した折り畳み単鎖を再会合するために、単離した
ヤドリギレクチンＢ鎖（nMLBまたはrMLB）を、20mMリン
酸緩衝液、50mM NaCl、1mM EDTA;pH7.2中で４℃で16〜4
8時間、モル過剰のrMLAとともにインキュベートした。
鎖間ジスルフィド架橋を形成させるために、6mMグルタ
チオン（還元型対酸化型の比5:1）または10mMグルタチ
オン（還元型対酸化型の比2:1）＋１μＭタンパク質ジ
スルフィドイソメラーゼ（Boehringer Mannheim）のレ
ドックス系の存在下で反応物をインキュベートした。
ヤドリギレクチンＢ鎖（nMLBまたはrMLB）を、20mMリン
酸緩衝液、50mM NaCl、1mM EDTA;pH7.2中で４℃で16〜4
8時間、モル過剰のrMLAとともにインキュベートした。
鎖間ジスルフィド架橋を形成させるために、6mMグルタ
チオン（還元型対酸化型の比5:1）または10mMグルタチ
オン（還元型対酸化型の比2:1）＋１μＭタンパク質ジ
スルフィドイソメラーゼ（Boehringer Mannheim）のレ
ドックス系の存在下で反応物をインキュベートした。
共折り畳みにより変性単鎖から開始する再会合のため
に、rMLA鎖を、6M塩化グアニジニウム、2mM DTT、50mM
Tris−HCl、pH8.0に濃度2mg/mlまで溶解した。システイ
ン残基を完全に還元するために、rMLB鎖を、6M塩化グア
ニジニウム、100mM DTT、50mM Tris−HCl、pH8.0に溶解
し、室温で20分間のインキュベーションの後、PD−10
（Pharmacia,Sweden）でのゲル浸透によって6M塩化グア
ニジニウム、50mM Tris−HCl、pH8.0で再び緩衝化し、
そして濃度200μg/mlに調整した。カップリング緩衝液
（50mMリン酸ナトリウム緩衝液、50mM KCl、1mM EDTA、
10％（v/v）グリセロール、100mMグルコース、20mMラク
トース、pH8.0）中でグアニジウム溶液を1:30までゆっ
くりと希釈し、そして４℃で16時間インキュベートする
ことにより、rMBLをモル過剰のrMLAと共折り畳みするこ
とによって再会合を実施した。鎖間ジスルフィド架橋を
形成させるために、2mMグルタチオン（還元型対酸化型
の比1:1）のレドックス系の存在下で反応物をインキュ
ベートした。
に、rMLA鎖を、6M塩化グアニジニウム、2mM DTT、50mM
Tris−HCl、pH8.0に濃度2mg/mlまで溶解した。システイ
ン残基を完全に還元するために、rMLB鎖を、6M塩化グア
ニジニウム、100mM DTT、50mM Tris−HCl、pH8.0に溶解
し、室温で20分間のインキュベーションの後、PD−10
（Pharmacia,Sweden）でのゲル浸透によって6M塩化グア
ニジニウム、50mM Tris−HCl、pH8.0で再び緩衝化し、
そして濃度200μg/mlに調整した。カップリング緩衝液
（50mMリン酸ナトリウム緩衝液、50mM KCl、1mM EDTA、
10％（v/v）グリセロール、100mMグルコース、20mMラク
トース、pH8.0）中でグアニジウム溶液を1:30までゆっ
くりと希釈し、そして４℃で16時間インキュベートする
ことにより、rMBLをモル過剰のrMLAと共折り畳みするこ
とによって再会合を実施した。鎖間ジスルフィド架橋を
形成させるために、2mMグルタチオン（還元型対酸化型
の比1:1）のレドックス系の存在下で反応物をインキュ
ベートした。
カップリング反応物を、保存緩衝液（50mMリン酸ナト
リウム緩衝液、300mM NaCl、1mM EDTA、10％（v/v）グ
リセロール、0.05％（v/v）Tween −20、pH8.0）に対
して透析した。非還元条件下でのSDS−PAGEおよびこれ
に続くヤドリギレクチンＡ鎖またはヤドリギレクチンＢ
鎖に対する特異的モノクローナル抗体（TA5またはTB3
3）を使用するウェスタンブロット分析によって、形成
されたヘテロダイマーのアッセイおよび同定を実施し
た。（VI）において説明したように、Ｎ−アセチル−ガ
ラクトサミンセファロースまたはラクトシルアガロース
でのアフィニティークロマトグラフィーによって、形成
されたホロタンパク質の単離、または遊離rMLAまたはrM
LA凝集体の分離を実施した。
リウム緩衝液、300mM NaCl、1mM EDTA、10％（v/v）グ
リセロール、0.05％（v/v）Tween −20、pH8.0）に対
して透析した。非還元条件下でのSDS−PAGEおよびこれ
に続くヤドリギレクチンＡ鎖またはヤドリギレクチンＢ
鎖に対する特異的モノクローナル抗体（TA5またはTB3
3）を使用するウェスタンブロット分析によって、形成
されたヘテロダイマーのアッセイおよび同定を実施し
た。（VI）において説明したように、Ｎ−アセチル−ガ
ラクトサミンセファロースまたはラクトシルアガロース
でのアフィニティークロマトグラフィーによって、形成
されたホロタンパク質の単離、または遊離rMLAまたはrM
LA凝集体の分離を実施した。
実施例８ rMLAおよびrMLBの等電同質性 rMLA、天然に存在するMLA、rMLB、天然に存在するMLB
またはMLホロタンパク質１〜２μｇを、IEFタンパク質
標準（BioRad,USA）と一緒に、Servalyt PreNets IEFゲ
ル（pH3〜10、125×125mm、150μｍ、Serva Heidelber
g）上の一点に置いた（focus）。分析のために、これら
のタンパク質を、ニトロセルロースメンブラン（0.2μ
ｍ、Schleicher ＆ Scull,Dassel）上での半乾燥エレ
クトロブロッティングによって固定した。rMLAおよびnM
LAについてはモノクローナルMLA特異抗体（TA5、Tonevi
tskyら、1995）を使用し、あるいはrMLB、nMLBおよびML
ホロタンパク質についてはモノクローナルMLB特異抗体
（TB33、Tonevitskyら、1995）を使用して、免疫染色を
実施した。アルカリホスファターゼと結合した抗マウス
IgG−IgG（Sigma,Deisenhofen）を使用し、基質であるN
BTおよびBCIPを反応させて免疫複合体を染色した（図
８）。
またはMLホロタンパク質１〜２μｇを、IEFタンパク質
標準（BioRad,USA）と一緒に、Servalyt PreNets IEFゲ
ル（pH3〜10、125×125mm、150μｍ、Serva Heidelber
g）上の一点に置いた（focus）。分析のために、これら
のタンパク質を、ニトロセルロースメンブラン（0.2μ
ｍ、Schleicher ＆ Scull,Dassel）上での半乾燥エレ
クトロブロッティングによって固定した。rMLAおよびnM
LAについてはモノクローナルMLA特異抗体（TA5、Tonevi
tskyら、1995）を使用し、あるいはrMLB、nMLBおよびML
ホロタンパク質についてはモノクローナルMLB特異抗体
（TB33、Tonevitskyら、1995）を使用して、免疫染色を
実施した。アルカリホスファターゼと結合した抗マウス
IgG−IgG（Sigma,Deisenhofen）を使用し、基質であるN
BTおよびBCIPを反応させて免疫複合体を染色した（図
８）。
高純度の植物性ヤドリギレクチンＡ鎖および高純度の
ヤドリギレクチンＢ鎖は、nMLAの等電点が5.2:5.4:5.5:
6.2で、nMLBの等電点が7.1:7.3である等電的に非同質な
タンパク質である一方、等電点6.8を有する組換えrMLA
鎖および等電点5.1を有する組換えrMLB鎖は、均質なタ
ンパク質である（図８）。このため、天然に存在するML
ホロタンパク質については多数の異質な分子変異体が存
在する（図８下）一方、組換えヤドリギレクチンタンパ
ク質の均一な移動度から、rMLの同質性および植物性ヤ
ドリギレクチンの微小異質性が明らかになる。
ヤドリギレクチンＢ鎖は、nMLAの等電点が5.2:5.4:5.5:
6.2で、nMLBの等電点が7.1:7.3である等電的に非同質な
タンパク質である一方、等電点6.8を有する組換えrMLA
鎖および等電点5.1を有する組換えrMLB鎖は、均質なタ
ンパク質である（図８）。このため、天然に存在するML
ホロタンパク質については多数の異質な分子変異体が存
在する（図８下）一方、組換えヤドリギレクチンタンパ
ク質の均一な移動度から、rMLの同質性および植物性ヤ
ドリギレクチンの微小異質性が明らかになる。
実施例９ rMLAの酵素的なリボソーム不活化活性の検出 イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精
製されたrMLA（再折り畳み）およびrMLA（可溶）のタン
パク質濃度ならびに天然に存在するMLA鎖（nMLA）のタ
ンパク質濃度を、BSA標準を使用してBradford（1976）
に従って測定した。
製されたrMLA（再折り畳み）およびrMLA（可溶）のタン
パク質濃度ならびに天然に存在するMLA鎖（nMLA）のタ
ンパク質濃度を、BSA標準を使用してBradford（1976）
に従って測定した。
MLAの酵素的rRNA−Ｎ−グリコシダーゼ活性の検出お
よび定量のために、「TNT結合網状赤血球系」（Promeg
a,USA）を使用して非放射活性試験系を確立した。反応
ごとに、等量（20μｌ）のTNT系を、30℃にて15分間プ
レインキュベートした。翻訳阻害の定量化のために、対
応の緩衝液20μｌをコントロール反応物に添加し、そし
てグラジエントMLA希釈物２μｌ（濃度範囲350〜0pM）
を試験反応物に添加した。各反応から、８分間の間隔で
２つの試料を採取し、そして液体窒素中で凍結して反応
を停止させた。翻訳活性の尺度として、生物発光試験に
おいて、シンチレーションカウンターによって相対ルシ
フェラーゼ値（cpmの平方根）を測定した。各反応につ
いて、異なる時点に採取された試料の測定されたcpmの
平方根の差を相対翻訳活性の尺度として決定した。RIP
を含まないコントロール反応物の活性を、０％不活化率
（IAR）に設定した。
よび定量のために、「TNT結合網状赤血球系」（Promeg
a,USA）を使用して非放射活性試験系を確立した。反応
ごとに、等量（20μｌ）のTNT系を、30℃にて15分間プ
レインキュベートした。翻訳阻害の定量化のために、対
応の緩衝液20μｌをコントロール反応物に添加し、そし
てグラジエントMLA希釈物２μｌ（濃度範囲350〜0pM）
を試験反応物に添加した。各反応から、８分間の間隔で
２つの試料を採取し、そして液体窒素中で凍結して反応
を停止させた。翻訳活性の尺度として、生物発光試験に
おいて、シンチレーションカウンターによって相対ルシ
フェラーゼ値（cpmの平方根）を測定した。各反応につ
いて、異なる時点に採取された試料の測定されたcpmの
平方根の差を相対翻訳活性の尺度として決定した。RIP
を含まないコントロール反応物の活性を、０％不活化率
（IAR）に設定した。
使用したrMLA濃度に対して相対翻訳不活化率を適用し
て、非線形回帰によってコントロール反応物と比較した
場合に翻訳活性の50％阻害を生じるタンパク質濃度を決
定した。このIC50値は、系に依存する値であり、これ
は、rMLA（可溶）、rMLA（再折り畳み）およびnMLAの酵
素活性の検出および定量を可能にする（図９）。
て、非線形回帰によってコントロール反応物と比較した
場合に翻訳活性の50％阻害を生じるタンパク質濃度を決
定した。このIC50値は、系に依存する値であり、これ
は、rMLA（可溶）、rMLA（再折り畳み）およびnMLAの酵
素活性の検出および定量を可能にする（図９）。
図９は、組換えMLA鎖の酵素的リボソーム不活化活性
の検出を示す。可溶性発現生成物内容を単離すること
（可溶rMLA）、および「封入体」から単離されたタンパ
ク質を再び折り畳むこと（再折り畳みrMLA）によって、
酵素的に活性な発現生成物を入手し得る。rMLA（可溶）
およびrMLA（再折り畳み）は、IC50値が10.7±1.3pMま
たは15.6±6.6pMである対応の活性を示す。従って、こ
れらは、天然に存在するMLA鎖（IC501.1±0.7pM）より
も低い毒性活性を示す。
の検出を示す。可溶性発現生成物内容を単離すること
（可溶rMLA）、および「封入体」から単離されたタンパ
ク質を再び折り畳むこと（再折り畳みrMLA）によって、
酵素的に活性な発現生成物を入手し得る。rMLA（可溶）
およびrMLA（再折り畳み）は、IC50値が10.7±1.3pMま
たは15.6±6.6pMである対応の活性を示す。従って、こ
れらは、天然に存在するMLA鎖（IC501.1±0.7pM）より
も低い毒性活性を示す。
実施例10 ヤドリギレクチンＢ鎖の炭水化物結合活性 組換えヤドリギレクチンＢ鎖の炭水化物結合活性の検
出ならびに組換えレクチンＢ鎖と植物性ヤドリギレクチ
ンＢ鎖との炭水化物結合活性および特異性の比較を、競
合炭水化物の存在下で、酵素結合レクチンアッセイ（EL
LA）によって実施する。圧倒的なガラクトースおよびＮ
−アセチル−ガラクトサミン残基に固定化したアシアロ
フェチュインマトリックスを使用することならびに圧倒
的なシアル酸残基に固定したフェチュインマトリックス
を使用することによって、nMLBおよびrMLB鎖の結合を確
立した。
出ならびに組換えレクチンＢ鎖と植物性ヤドリギレクチ
ンＢ鎖との炭水化物結合活性および特異性の比較を、競
合炭水化物の存在下で、酵素結合レクチンアッセイ（EL
LA）によって実施する。圧倒的なガラクトースおよびＮ
−アセチル−ガラクトサミン残基に固定化したアシアロ
フェチュインマトリックスを使用することならびに圧倒
的なシアル酸残基に固定したフェチュインマトリックス
を使用することによって、nMLBおよびrMLB鎖の結合を確
立した。
炭水化物マトリックスを固定化するために、PBS 11ml
中のアシアロフェチュイン（Sigma,Deisenhofen）1.1mg
の溶液またはフェチュイン（Sigma,Deisenhofen）1.1mg
の溶液100μｌを、MaxiSorp C96マイクロタイタープレ
ート（Nunc,Wiesbaden）のウェルに移し、そして室温に
て16時間インキュベートした。マイクロタイタープレー
トを150μl/ウェルのPBS−Ｔ（10mMリン酸ナトリウム緩
衝液、130mM NaCl、0.1％（v/v）Tween −20、pH7.2）
で３回洗浄した後、このマイクロタイタープレートを、
200μl/ウェルのPBS−Ｔ−１％ BSA（10mMリン酸ナトリ
ウム緩衝液、130mM NaCl、0.1％（v/v）Tween −20、
１％（w/v）BSA、pH7.2）とともに36℃で１時間インキ
ュベートして非特異的結合部位をブロックし、続いて上
述したように洗浄した。試験を行うために、濃度100〜5
00ng/ml、好ましくは400ng/mlでＢ鎖含有調製物100μｌ
を使用した。試料をPBS−0.05％ BSA（10mMリン酸ナト
リウム緩衝液、130mM NaCl、0.05％（w/v）BSA、pH7.
2）に希釈することによって試験濃度を調整した。試験
濃度およびコントロールごとに、２〜３のレプリカを調
製した。PBS−0.05％ BSAまたはそれぞれの調製緩衝液
を用いてコントロール測定を実施した。結合特異性を測
定するために、遊離競合糖の存在下で試料をインキュベ
ートした。アシアロフェチュインまたはフェチュインマ
トリックスへの結合からのrMLB、nMLBまたはMLホロタン
パク質の置換のために、好ましくは濃度範囲が０〜280m
Mのガラクトース、濃度範囲０〜280mMのＮ−アセチル−
ガラクトサミン、濃度範囲０〜140mMのラクトースまた
は濃度範囲０〜140mMのシアル酸を使用した。
中のアシアロフェチュイン（Sigma,Deisenhofen）1.1mg
の溶液またはフェチュイン（Sigma,Deisenhofen）1.1mg
の溶液100μｌを、MaxiSorp C96マイクロタイタープレ
ート（Nunc,Wiesbaden）のウェルに移し、そして室温に
て16時間インキュベートした。マイクロタイタープレー
トを150μl/ウェルのPBS−Ｔ（10mMリン酸ナトリウム緩
衝液、130mM NaCl、0.1％（v/v）Tween −20、pH7.2）
で３回洗浄した後、このマイクロタイタープレートを、
200μl/ウェルのPBS−Ｔ−１％ BSA（10mMリン酸ナトリ
ウム緩衝液、130mM NaCl、0.1％（v/v）Tween −20、
１％（w/v）BSA、pH7.2）とともに36℃で１時間インキ
ュベートして非特異的結合部位をブロックし、続いて上
述したように洗浄した。試験を行うために、濃度100〜5
00ng/ml、好ましくは400ng/mlでＢ鎖含有調製物100μｌ
を使用した。試料をPBS−0.05％ BSA（10mMリン酸ナト
リウム緩衝液、130mM NaCl、0.05％（w/v）BSA、pH7.
2）に希釈することによって試験濃度を調整した。試験
濃度およびコントロールごとに、２〜３のレプリカを調
製した。PBS−0.05％ BSAまたはそれぞれの調製緩衝液
を用いてコントロール測定を実施した。結合特異性を測
定するために、遊離競合糖の存在下で試料をインキュベ
ートした。アシアロフェチュインまたはフェチュインマ
トリックスへの結合からのrMLB、nMLBまたはMLホロタン
パク質の置換のために、好ましくは濃度範囲が０〜280m
Mのガラクトース、濃度範囲０〜280mMのＮ−アセチル−
ガラクトサミン、濃度範囲０〜140mMのラクトースまた
は濃度範囲０〜140mMのシアル酸を使用した。
ロード後、プレートを36℃で２時間インキュベート
し、続いて上述したように洗浄した。ロードしたウェル
に、100μl/ウェルのヤギ抗ヤドリギレクチン血清（PBS
−Ｔ−0.1％ BSA−Tx（10mMリン酸ナトリウム緩衝液、1
30mM NaCl、0.1％（v/v）Tween −20、0.1％（w/v）BS
A、１％（v/v）Triton X100、pH7.2）における血清プ
ールの1:19800希釈物）を添加し、36℃で２時間インキ
ュベートし、次いで上述のように洗浄した。免疫複合体
をアッセイするために、ロードしたウェルごとに、PBS
−１％ BSA（10mMリン酸ナトリウム緩衝液、130mM NaC
l、１％（w/v）BSA、pH7.2）中の1:3500希釈物に西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（Sigma,Deisenhofen）と結合し
た100μｌの抗ヤギIgG−IgGを添加し、そして36℃で１
時間インキュベートした。次に、これらのウェルを150
μl/ウェルのPBS−Ｔで６回洗浄した。発色のために、1
00μl/ウェルの基質溶液（25mlの65mMクエン酸（pH5.
0）＋10μｌの30％過酸化水素中にｏ−フェニレンジア
ミン錠（Sigma,Deisenhofen）１個）を添加し、暗所に
て室温で20分間インキュベートした。100μl/ウェルの1
M硫酸を添加することによって反応を停止させた。参照
波長690nmの450nmでの吸光光度法により、そして測定デ
ータの４パラメータフィットで表されるIC50値の算出に
よって評価を行った。
し、続いて上述したように洗浄した。ロードしたウェル
に、100μl/ウェルのヤギ抗ヤドリギレクチン血清（PBS
−Ｔ−0.1％ BSA−Tx（10mMリン酸ナトリウム緩衝液、1
30mM NaCl、0.1％（v/v）Tween −20、0.1％（w/v）BS
A、１％（v/v）Triton X100、pH7.2）における血清プ
ールの1:19800希釈物）を添加し、36℃で２時間インキ
ュベートし、次いで上述のように洗浄した。免疫複合体
をアッセイするために、ロードしたウェルごとに、PBS
−１％ BSA（10mMリン酸ナトリウム緩衝液、130mM NaC
l、１％（w/v）BSA、pH7.2）中の1:3500希釈物に西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（Sigma,Deisenhofen）と結合し
た100μｌの抗ヤギIgG−IgGを添加し、そして36℃で１
時間インキュベートした。次に、これらのウェルを150
μl/ウェルのPBS−Ｔで６回洗浄した。発色のために、1
00μl/ウェルの基質溶液（25mlの65mMクエン酸（pH5.
0）＋10μｌの30％過酸化水素中にｏ−フェニレンジア
ミン錠（Sigma,Deisenhofen）１個）を添加し、暗所に
て室温で20分間インキュベートした。100μl/ウェルの1
M硫酸を添加することによって反応を停止させた。参照
波長690nmの450nmでの吸光光度法により、そして測定デ
ータの４パラメータフィットで表されるIC50値の算出に
よって評価を行った。
図10は、ELL系において観察された、Ｄガラクトース
（図10a）、β−ラクトース（図10b）またはＮ−アセチ
ルガラクトサミン（図10c）の量を増加させることによ
る固定アシアロフェチュインリガンドからのrMLBおよび
nMLBの置換の値、ならびにシアル酸（図10d）の量を増
加させることによる固定フェチュインリガンドからの置
換の値を示す。最大置換の半値に関するIC50値によって
nMLBおよびrMLBの結合特性を表す。
（図10a）、β−ラクトース（図10b）またはＮ−アセチ
ルガラクトサミン（図10c）の量を増加させることによ
る固定アシアロフェチュインリガンドからのrMLBおよび
nMLBの置換の値、ならびにシアル酸（図10d）の量を増
加させることによる固定フェチュインリガンドからの置
換の値を示す。最大置換の半値に関するIC50値によって
nMLBおよびrMLBの結合特性を表す。
植物性nMLB鎖の炭水化物結合は、主にガラクトース
（IC50＝4.5mM）およびβ−ラクトース（IC50＝4.9mM）
によって競合されるが、驚くべきことに組換えrMLB鎖
は、明らかに変化していた炭水化物特異性を有する。nM
LBとは対照的に、rMLBの炭水化物結合活性は、ガラクト
ースによって競合され得ず（IC50出不能）、β−ラクト
ースによっては限られた程度にしか競合され得ない（IC
50＞70mM）。ガラクトースおよびβ−ラクトースに対す
る劇的に低下した親和性を除けば、組換えrMLB鎖はＮ−
アセチルガラクトサミンに対する顕著な特異性を有する
（IC50＝109mM）。nMLBについて表されたシアル酸リガ
ンドに対する他の結合活性もまた、組換えMLB鎖につい
て検出され得る（図10d）。植物性nMLB鎖（IC50＝49.8m
M）および組換えrMLB鎖（IC50＝47.1mM）について、同
じ結合親和性が検出された。
（IC50＝4.5mM）およびβ−ラクトース（IC50＝4.9mM）
によって競合されるが、驚くべきことに組換えrMLB鎖
は、明らかに変化していた炭水化物特異性を有する。nM
LBとは対照的に、rMLBの炭水化物結合活性は、ガラクト
ースによって競合され得ず（IC50出不能）、β−ラクト
ースによっては限られた程度にしか競合され得ない（IC
50＞70mM）。ガラクトースおよびβ−ラクトースに対す
る劇的に低下した親和性を除けば、組換えrMLB鎖はＮ−
アセチルガラクトサミンに対する顕著な特異性を有する
（IC50＝109mM）。nMLBについて表されたシアル酸リガ
ンドに対する他の結合活性もまた、組換えMLB鎖につい
て検出され得る（図10d）。植物性nMLB鎖（IC50＝49.8m
M）および組換えrMLB鎖（IC50＝47.1mM）について、同
じ結合親和性が検出された。
植物性の主にガラクトース／β−ラクトース特異的nM
LB鎖に対して、組換え調製したrMLB鎖は、Ｎ−アセチル
ガラクトサミン／シアル酸結合の方向にシフトした明ら
かに異なる炭水化物特異性を有する。
LB鎖に対して、組換え調製したrMLB鎖は、Ｎ−アセチル
ガラクトサミン／シアル酸結合の方向にシフトした明ら
かに異なる炭水化物特異性を有する。
実施例11 ヒトリンパ性白血病細胞に対するインビトロで再会合し
たrMLホロタンパク質の細胞傷害性の検出 ヒト単核（リンパ性）白血病細胞MOLT−４株（Europe
an Collection of Animal Cell Cultures No.8501141
3）に対する細胞傷害性を定量分析することによって、
ヤドリギレクチンホロタンパク質の完全性を検出した。
たrMLホロタンパク質の細胞傷害性の検出 ヒト単核（リンパ性）白血病細胞MOLT−４株（Europe
an Collection of Animal Cell Cultures No.8501141
3）に対する細胞傷害性を定量分析することによって、
ヤドリギレクチンホロタンパク質の完全性を検出した。
MOLT−４細胞を無血清MDC−１培地（PAN SYSTEMS,Aid
enbach）において培養し、そして試験のために生存可能
性＞98％で細胞密度1.5×105MOLT−４細胞/mlに調整し
た。細胞傷害性を測定するために、96ウェルマイクロタ
イタープレートのウェルごとに、18000細胞／ウェルに
対応するMOLT−４細胞懸濁液90μｌを加え、そして試料
溶液10μｌと混合した。
enbach）において培養し、そして試験のために生存可能
性＞98％で細胞密度1.5×105MOLT−４細胞/mlに調整し
た。細胞傷害性を測定するために、96ウェルマイクロタ
イタープレートのウェルごとに、18000細胞／ウェルに
対応するMOLT−４細胞懸濁液90μｌを加え、そして試料
溶液10μｌと混合した。
試験を行うために、ヤドリギレクチンホロタンパク質
調製物（ラクトシルセファロース（Franzら、1977）を
使用する標準的な技術によってヤドリギ葉またはヤドリ
ギ茶から単離されたバッチNo.220793（Madaus）およびB
RAIN 12/94）、ならびに濃度範囲１〜100pg/mlのインビ
トロで再会合したrMLホロタンパク質を、希釈系列をMDC
−１細胞培養培地において調製して、対応させて使用
（1.6fM〜1.66pM）した。各試料濃度およびコントロー
ルごとに、６つのレプリカを調製した。
調製物（ラクトシルセファロース（Franzら、1977）を
使用する標準的な技術によってヤドリギ葉またはヤドリ
ギ茶から単離されたバッチNo.220793（Madaus）およびB
RAIN 12/94）、ならびに濃度範囲１〜100pg/mlのインビ
トロで再会合したrMLホロタンパク質を、希釈系列をMDC
−１細胞培養培地において調製して、対応させて使用
（1.6fM〜1.66pM）した。各試料濃度およびコントロー
ルごとに、６つのレプリカを調製した。
細胞をインキュベーター中で37℃で５％ CO2にて72時
間インキュベートした。対応のCell Proliferation Rea
gent WST−１（Boehringer Mannheim）を使用するWST−
１法（Scudieroら、1988）に従って、可溶性ホルマザン
染料を使用して細胞の生存可能性を測定することによっ
て細胞傷害効果の定量化を行った。
間インキュベートした。対応のCell Proliferation Rea
gent WST−１（Boehringer Mannheim）を使用するWST−
１法（Scudieroら、1988）に従って、可溶性ホルマザン
染料を使用して細胞の生存可能性を測定することによっ
て細胞傷害効果の定量化を行った。
組換えホロタンパク質およびキメラホロタンパク質rM
LB/nMLBは、天然に存在するタンパク質に対して同じ生
物学的活性を示し、MOLT−４細胞傷害性に関するIC50値
は約10〜30pg/mlである。しかし、試験した濃度範囲
（最大1ng/mlのrMLB）では、rMLBは細胞傷害活性を示さ
ない。
LB/nMLBは、天然に存在するタンパク質に対して同じ生
物学的活性を示し、MOLT−４細胞傷害性に関するIC50値
は約10〜30pg/mlである。しかし、試験した濃度範囲
（最大1ng/mlのrMLB）では、rMLBは細胞傷害活性を示さ
ない。
実施例12 組換えヤドリギレクチン（rML）によってヒト単球細胞U
937株について示されるアポトーシスの誘導 核を蛍光染料DAPI（Hotzら、1992）で染色することに
よって、組換えヤドリギレクチン（rMLA/rMLB）による
アポトーシスプロセスの誘導を検出する。核の形態の代
表的なアポトーシス性変化は、顕微鏡下で観察され得、
そして１試料あたり500〜100個の細胞を計数することに
よって定量化し得る。血清タンパク質の存在は利用可能
なレクチンの量を劇的に減少させる（10％FCSで約40分
の１、Ribereau−Gayonら、1995）ので、アッセイの感
度のためには無血清培地を使用することが必須である。
24時間の誘導時間は、MOLTアッセイとの直接相関を部分
的にのみ可能にする。なぜなら、細胞傷害効果は、生存
可能性アッセイにおいて72時間後にやっと明らかに肉眼
で認められるが、アポトーシスはより早く検出され得る
効果であるからである。インキュベーション時間が長す
ぎる場合、アポトーシスは二次壊死によって消滅する。
937株について示されるアポトーシスの誘導 核を蛍光染料DAPI（Hotzら、1992）で染色することに
よって、組換えヤドリギレクチン（rMLA/rMLB）による
アポトーシスプロセスの誘導を検出する。核の形態の代
表的なアポトーシス性変化は、顕微鏡下で観察され得、
そして１試料あたり500〜100個の細胞を計数することに
よって定量化し得る。血清タンパク質の存在は利用可能
なレクチンの量を劇的に減少させる（10％FCSで約40分
の１、Ribereau−Gayonら、1995）ので、アッセイの感
度のためには無血清培地を使用することが必須である。
24時間の誘導時間は、MOLTアッセイとの直接相関を部分
的にのみ可能にする。なぜなら、細胞傷害効果は、生存
可能性アッセイにおいて72時間後にやっと明らかに肉眼
で認められるが、アポトーシスはより早く検出され得る
効果であるからである。インキュベーション時間が長す
ぎる場合、アポトーシスは二次壊死によって消滅する。
図12は、組換えMLホロタンパク質での処理後のアポト
ーシスU937細胞の率の顕著な増加を示す。70pg/mlで、
無血清培地における２つの異なる培養物中の24時間後の
アポトーシス細胞の数は３倍に増加する。このため、天
然に存在するタンパク質のような組換えヤドリギレクチ
ン（Janssenら、1993）はアポトーシス性の細胞死を誘
導し得る。
ーシスU937細胞の率の顕著な増加を示す。70pg/mlで、
無血清培地における２つの異なる培養物中の24時間後の
アポトーシス細胞の数は３倍に増加する。このため、天
然に存在するタンパク質のような組換えヤドリギレクチ
ン（Janssenら、1993）はアポトーシス性の細胞死を誘
導し得る。
実施例13 PBMCモデルにおける組換えヤドリギレクチンの免疫刺激
効果 サイトカインであるTNF−α（単球、マクロファー
ジ）およびIFN−γ（Ｔヘルパー細胞）は、ヒトの免疫
学的システムの複雑なネットワーク内の中心メディエー
タである。
効果 サイトカインであるTNF−α（単球、マクロファー
ジ）およびIFN−γ（Ｔヘルパー細胞）は、ヒトの免疫
学的システムの複雑なネットワーク内の中心メディエー
タである。
健康な血液ドナー由来のヒト単核細胞（PBMC、単球お
よびリンパ球を含む）を、FICOLL−PAQUER 密度勾配遠
心分離により生産者（Pharmacia,Sweden）の指示に従っ
て単離した。
よびリンパ球を含む）を、FICOLL−PAQUER 密度勾配遠
心分離により生産者（Pharmacia,Sweden）の指示に従っ
て単離した。
TNF−αの放出を誘導するために、細胞（４×106単核
細胞/ml）を、10％（v/v）ウシ胎仔血清と、ペニシリン
100U/mlと、ストレプトマイシン100μg/mlとを含有する
RPMI 1640培地で、気体を供給したインキュベーター内
のＵ字型マイクロタイター細胞培養プレート中で、37
℃、５％ CO2および相対湿度＞95％にて、最初は組換え
ヤドリギレクチンタンパク質のみとともに18時間、続い
て同時刺激因子としてSalmonella abortus equi由来の
リポ多糖１μg/mlとともにさらに24時間インキュベート
した。次に、無細胞上清において任意のELISA（Genzyme
Diagnostics,Rsselsheim）によってTNF−αの濃度を
定量した。
細胞/ml）を、10％（v/v）ウシ胎仔血清と、ペニシリン
100U/mlと、ストレプトマイシン100μg/mlとを含有する
RPMI 1640培地で、気体を供給したインキュベーター内
のＵ字型マイクロタイター細胞培養プレート中で、37
℃、５％ CO2および相対湿度＞95％にて、最初は組換え
ヤドリギレクチンタンパク質のみとともに18時間、続い
て同時刺激因子としてSalmonella abortus equi由来の
リポ多糖１μg/mlとともにさらに24時間インキュベート
した。次に、無細胞上清において任意のELISA（Genzyme
Diagnostics,Rsselsheim）によってTNF−αの濃度を
定量した。
IFN−γの放出を誘導するために、細胞を、上述の培
地において、組換えヤドリギレクチンタンパク質のみと
ともに１時間、次いで上述のような同時刺激因子として
のフィトヘムアグルチニンL 0.5μg/mlとともにさらに6
5時間インキュベートした。次に、IFN−γのそれぞれの
濃度を、ELISA（ENDOGEN INC.,Cambridge,USA）によっ
て無細胞上清において定量した。
地において、組換えヤドリギレクチンタンパク質のみと
ともに１時間、次いで上述のような同時刺激因子として
のフィトヘムアグルチニンL 0.5μg/mlとともにさらに6
5時間インキュベートした。次に、IFN−γのそれぞれの
濃度を、ELISA（ENDOGEN INC.,Cambridge,USA）によっ
て無細胞上清において定量した。
実施例14 皮膚2ZK1200モデルにおける組換えヤドリギレクチンの
免疫刺激効果 バイオアッセイとして確立された皮膚２モデルは、三
次元の線維芽細胞含有皮膚および角質化していないケラ
チノサイト由来の構造表皮からなる（これらの細胞自身
が天然に分泌するマトリックス中（Jollerら、1996）。
皮膚組織片（11×11mm2、ヒトから調製、一次細胞、Adv
anced Tissue Sciences Inc.（ATS）,La Jolla,USA）は
アガロース中のナイロングリッドで提供され、これを受
領時にすみやかにspecial medium A（ATS,La Jolla,US
A）に移した。
免疫刺激効果 バイオアッセイとして確立された皮膚２モデルは、三
次元の線維芽細胞含有皮膚および角質化していないケラ
チノサイト由来の構造表皮からなる（これらの細胞自身
が天然に分泌するマトリックス中（Jollerら、1996）。
皮膚組織片（11×11mm2、ヒトから調製、一次細胞、Adv
anced Tissue Sciences Inc.（ATS）,La Jolla,USA）は
アガロース中のナイロングリッドで提供され、これを受
領時にすみやかにspecial medium A（ATS,La Jolla,US
A）に移した。
IL−１αおよびIl−６はいずれもヒトの免疫学的シス
テムの関連刺激サイトカインである。
テムの関連刺激サイトカインである。
IL−１αまたはIL−６の放出を誘導するために、皮膚
２組織片を、試験物質とともにspecial medium B（ATS,
La Jolla,USA）2ml中にて37℃、空気中５％のCO2、相対
湿度＞95％で、12カップの細胞培養プレート（Corning
Glass Works,Corning,USA）において24時間インキュベ
ートした。次に、IL−１α（Quantikine human IL−１
α Assay、R ＆ D Systems Inc.,Minneapolis,USA）の
濃度およびIL−６（ｈ−interleukin 6 ELISA、Boehrin
ger Mannheim GmbH）の濃度を、無細胞上清においてELI
SAによって定量した。
２組織片を、試験物質とともにspecial medium B（ATS,
La Jolla,USA）2ml中にて37℃、空気中５％のCO2、相対
湿度＞95％で、12カップの細胞培養プレート（Corning
Glass Works,Corning,USA）において24時間インキュベ
ートした。次に、IL−１α（Quantikine human IL−１
α Assay、R ＆ D Systems Inc.,Minneapolis,USA）の
濃度およびIL−６（ｈ−interleukin 6 ELISA、Boehrin
ger Mannheim GmbH）の濃度を、無細胞上清においてELI
SAによって定量した。
0.25〜8ng rML/mlで誘導したIL−１αの用量依存的放
出および0.25〜8ng rML/mlで誘導したIL−６の用量依存
的放出によって皮膚２モデルを特徴付けた（図14）。驚
くべきことに、組換えrMLB鎖だけでは上述したサイトカ
イン放出はいずれも達成し得なかった。この知見は、免
疫刺激活性が主にＢ鎖のレクチン活性に起因するという
従来技術の知識（Hajtoら、1990）とは絶対的に矛盾す
る。
出および0.25〜8ng rML/mlで誘導したIL−６の用量依存
的放出によって皮膚２モデルを特徴付けた（図14）。驚
くべきことに、組換えrMLB鎖だけでは上述したサイトカ
イン放出はいずれも達成し得なかった。この知見は、免
疫刺激活性が主にＢ鎖のレクチン活性に起因するという
従来技術の知識（Hajtoら、1990）とは絶対的に矛盾す
る。
実施例15 組換えヤドリギレクチンＢ鎖（rMLB）による免疫担当細
胞の活性化 細胞表面タンパク質CD69の誘導を使用して免疫担当細
胞の活性化を試験した。CD69は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および
特にナチュラルキラー細胞（NK細胞）の活性化後に最初
の細胞表面抗原の１つとして現れる。これらの細胞は、
その新生物細胞を認識しそして溶解する能力のために、
腫瘍に対する天然の防御において中心的な役割を果た
す。細胞表面タンパク質は休止リンパ球では発現しない
ので、CD69は上述の免疫担当細胞集団の活性化マーカー
である。さらに、誘導可能なCD69表面タンパク質につい
ては、NK細胞およびTcRγ／δＴ細胞の細胞溶解活性に
対する伝達機能を検出することができた（Morettaら、1
991）。
胞の活性化 細胞表面タンパク質CD69の誘導を使用して免疫担当細
胞の活性化を試験した。CD69は、Ｔ細胞、Ｂ細胞および
特にナチュラルキラー細胞（NK細胞）の活性化後に最初
の細胞表面抗原の１つとして現れる。これらの細胞は、
その新生物細胞を認識しそして溶解する能力のために、
腫瘍に対する天然の防御において中心的な役割を果た
す。細胞表面タンパク質は休止リンパ球では発現しない
ので、CD69は上述の免疫担当細胞集団の活性化マーカー
である。さらに、誘導可能なCD69表面タンパク質につい
ては、NK細胞およびTcRγ／δＴ細胞の細胞溶解活性に
対する伝達機能を検出することができた（Morettaら、1
991）。
フローサイトメトリー（FACS）によってヒト単核細胞
上の表面マーカーを検出するために、実施例13と同様の
Hypaque（Sigma）での密度勾配によってPBMCを単離し
た。細胞を、５％FCSを含むRPMI 160培地に溶解し、マ
イクロタイタープレートの１カップあたり約250000細胞
を播種した後、この溶液を、１、10、30および100ngの
試験物質rMLBとともに４時間インキュベートした。氷浴
中で蛍光標識抗C100ngの試験物質rMLBとともに４時間イ
ンキュベートした。氷浴中で蛍光標識抗CD69 MAbとの20
分間のインキュベーション後、５％ FCSを含むHank溶液
で洗浄した。沈降した標識細胞をSheath Fluid 200μｌ
に添加し、FACScan（Becton Dickinson）で測定した。
細胞１個あたりのCD69細胞表面マーカーの数および全細
胞集合団においてCD69陽性細胞が占める率に対応して蛍
光の中央値を適用する。
上の表面マーカーを検出するために、実施例13と同様の
Hypaque（Sigma）での密度勾配によってPBMCを単離し
た。細胞を、５％FCSを含むRPMI 160培地に溶解し、マ
イクロタイタープレートの１カップあたり約250000細胞
を播種した後、この溶液を、１、10、30および100ngの
試験物質rMLBとともに４時間インキュベートした。氷浴
中で蛍光標識抗C100ngの試験物質rMLBとともに４時間イ
ンキュベートした。氷浴中で蛍光標識抗CD69 MAbとの20
分間のインキュベーション後、５％ FCSを含むHank溶液
で洗浄した。沈降した標識細胞をSheath Fluid 200μｌ
に添加し、FACScan（Becton Dickinson）で測定した。
細胞１個あたりのCD69細胞表面マーカーの数および全細
胞集合団においてCD69陽性細胞が占める率に対応して蛍
光の中央値を適用する。
濃度範囲１〜100ng/mlで、細胞表面でのCD69の出現率
およびCD69陽性細胞が占める率の両方に関して、単核細
胞の活性化を検出し得た。釣り鐘状の用量依存曲線が観
察できた。rMLBの最高濃度100ng/mlでさえも、本実施例
において試験したPBMCに対する細胞傷害効果は検出でき
なかった。
およびCD69陽性細胞が占める率の両方に関して、単核細
胞の活性化を検出し得た。釣り鐘状の用量依存曲線が観
察できた。rMLBの最高濃度100ng/mlでさえも、本実施例
において試験したPBMCに対する細胞傷害効果は検出でき
なかった。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/42 37/04 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ０７Ｋ 14/42 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 バウアー， アクセル ドイツ国 メアーブッシュ 40668， オッスム 13アー， ハウス グリップ スワルド (72)発明者 ジンケ， ホルガー ドイツ国 ビッケンバッハ 64404， ハルテナウエル シュトラーセ 49 (56)参考文献 Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ ａｃ．，Ｖｏｌ．13，Ｎｏ．７，Ｐ. 1037−1041（1991) Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒ ｓ，Ｖｏｌ．46，Ｐ．５−８（1995) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 A61K 35/78 A61K 38/00 A61K 39/395 A61P 31/12 A61P 35/00 A61P 37/04 C07K 14/42 C12N 1/21 C12P 21/02 C12Q 1/68 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (24)
- 【請求項１】核酸分子であって、 （ａ） 成熟後にヤドリギレクチンダイマーの生物学的
機能を示し、かつ以下の図： 【化１】 に示される核酸配列を有するプレプロタンパク質をコー
ドする； （ｂ） （ａ）に記載のプレプロタンパク質のフラグメ
ントであって、ヤドリギレクチンダイマーの生物学的に
活性な部分であるフラグメントをコードする； （ｃ） （ａ）または（ｂ）に記載の核酸分子とは遺伝
子コードの縮重に起因して異なる；または （ｄ） ストリンジェントな条件下で（ａ）、（ｂ）、
または（ｃ）に記載の核酸分子とハイブリダイズし、か
つ（ａ）または（ｂ）に示される生物学的機能または活
性を有するポリペプチドをコードする、核酸分子。 - 【請求項２】前記フラグメントが、以下の図： 【化２】 に示されるヌクレオチド配列によってコードされるヤド
リギレクチンのＡ鎖である、請求項１に記載の核酸分
子。 - 【請求項３】前記フラグメントが、以下の図： 【化３】 に示されるヌクレオチド配列によってコードされるヤド
リギレクチンのＢ鎖である、請求項１に記載の核酸分
子。 - 【請求項４】DNA分子である、請求項１〜３のいずれか
に記載の核酸分子。 - 【請求項５】RNA分子である、請求項１〜３のいずれか
に記載の核酸分子。 - 【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子
に対してアンチセンス鎖である、核酸分子。 - 【請求項７】請求項１〜６のいずれかに記載の核酸分子
を少なくとも１つ含有する、ベクター。 - 【請求項８】請求項２または４に記載の核酸分子および
請求項３または４に記載の核酸分子の両方を含有する、
請求項７に記載のベクター。 - 【請求項９】前記ベクターが発現ベクターである、請求
項７または８に記載のベクター。 - 【請求項１０】請求項７〜９のいずれかに記載のベクタ
ーの少なくとも１つで形質転換されている、細菌細胞宿
主。 - 【請求項１１】前記細菌がE.coliである、請求項10に記
載の宿主。 - 【請求項１２】請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分
子または請求項７〜９のいずれか１つに記載のベクター
によってコードされ、かつ請求項10〜11のいずれかに記
載の宿主によって産生される、ポリペプチド。 - 【請求項１３】少なくとも１つの化学的または酵素的な
修飾を示す、請求項12に記載のポリペプチド。 - 【請求項１４】前記ポリペプチドが、融合タンパク質で
ある、請求項12または13に記載のポリペプチド。 - 【請求項１５】ヤドリギレクチンの生物学的機能を有す
るポリペプチドダイマーであって、第１のモノマーが請
求項２に記載の核酸分子によってコードされ、そして第
２のモノマーが請求項３に記載の核酸分子によってコー
ドされる、ポリペプチドダイマー。 - 【請求項１６】前記モノマーの少なくとも１つが、請求
項13または14に記載のポリペプチドである、請求項15に
記載のポリペプチドダイマー。 - 【請求項１７】請求項10〜11のいずれかに記載の宿主を
適当な条件下で培養し、そのようにして得られるポリペ
プチドまたはポリペプチドダイマーが単離される、請求
項12〜14のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項
15もしくは16に記載のポリペプチドダイマーを生成する
ための方法。 - 【請求項１８】請求項12〜14のいずれかに記載のポリペ
プチドまたは請求項15もしくは16に記載のポリペプチド
ダイマーを少なくとも１つ含む、イムノトキシン。 - 【請求項１９】請求項12〜14のいずれかに記載のポリペ
プチドおよび／または請求項15または16に記載のポリペ
プチドダイマーおよび／または請求項18に記載のイムノ
トキシンを、必要に応じて、薬学的に受容可能な担体と
の混合物中に含む、医薬組成物。 - 【請求項２０】請求項１〜５のいずれか１つに記載の核
酸分子またはその相補的鎖に特異的にハイブリダイズす
るプライマーまたはプライマー対。 - 【請求項２１】診断組成物であって、少なくとも （ａ） 請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子； （ｂ） 請求項20に記載のプライマーおよび／またはプ
ライマー対；および／または （ｃ） 請求項12〜14のいずれかに記載のポリペプチド
および／または請求項15または16に記載のポリペプチド
ダイマー を含有する、診断組成物。 - 【請求項２２】請求項12〜14のいずれかに記載のポリペ
プチドおよび／または請求項15または16に記載のポリペ
プチドダイマーを含有する、植物保護因子。 - 【請求項２３】前記核酸分子がDNAである、請求項15に
記載のポリペプチドダイマー。 - 【請求項２４】前記核酸分子がRNAである、請求項15に
記載のポリペプチドダイマー。
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