KR100947424B1 - 신경계 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 오스테오폰틴의용도 - Google Patents
신경계 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 오스테오폰틴의용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신경계 질환의 치료 및/또는 예방을 위해 오스테오폰틴의 사용 또는 오스테오폰틴 활성의 어고니스트의 사용에 관한 것이다.
Description
본 발명은 일반적으로 신경계 질환 및 장애의 분야에 관한 것이다. 이것은 신경보호, 신경 유수화 및 수삭(髓索) 생성 세포의 발생 및 재생에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 선천성 대사 장애에 기인한 탈유수화 및 신경퇴화 질병, 신경장애, 종양성 신경 병증, 스토크 및 신경계 질환에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 신경계 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 치료제의 제조에 오스테오폰틴 또는 오스테오폰틴 활성의 어고니스트의 사용에 관한 것이다.
신경 유수화는 중추신경계(CNS) 및 말초신경계(PNS) 구성분의 형성 및 기능에 필수적인 과정이다. 수초 주위의 축삭은 신경을 따라 전기적 임펄스의 적절한 전도에 필수적이다. 수삭의 손실은 다양한 질병으로 나타나는데, 이들은 CNS에 영향을 미치는 다발경화증(MS), 길라인 바르(길라인 바르e) 증상, CIDP 등이다(Amramsky 및 Ovadia, 1997; Trojaborg, 1998, Hartung 등, 1998). 전염성 병리 또는 자가면역 발작과 같은 다양한 병인론에 불구하고, 모든 탈수삭화 질병은 싱결적 기능의 상실을 일으키고 마비 및 죽음으로 이어질 수 있다. MS에서 염증성 발작을 감하고 질병의 진행을 지연하는 치료적 제제가 현존하지만, 재유수화 및 신 경기능의 회복을 이끌 수 있는 치료제를 개발할 필요가 있다(Amramsky 및 Ovadia, 1997, Pohlau 등, 1998).
외상, 저산소증 및 빈혈을 포함하는 급작스런 사고로 유발된 CNS에 대한 손상은 뉴론 및 백질 양자에 영향을 미칠 수 있다. 비록 대부분의 주의가 세포사로 이끄는 과정에 집중되지만, 축삭을 유수화하는 희돌기교세포에 손상을 주는 증가하는 증거의 제시는 또한 CNS 손상의 특정한 요소이다. 따라서, 희돌기교세포 병리는 랫트에서 스트로크 후 아주 조기 상태(3시간)에서 입증되어, 이들 세포가 신경세포 보다는 흥분적독성 건에 보다 빈약할 수 있다는 것을 제시한다(Pantoni 등, 1996). 세포사를 고려한 일 잠정적 후보는 많은 급작스런 CNS 손상을 수반하는 글루타메이트 농도의 현저한 증가이다(Lipton 등, 1994). 실제로, 신경 외에 희돌기교세포가 또한 AMPA/카이네이트 서브타입에 속하는 관능적 글루타메이트 수용체를 발현하는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 희돌기교세포는 글루타메이트 적용에 높은 취약성을 나타낸다(McDonald 등, 1998).
외상은 신경의 상처 또는 손상이다. 이것은 상처의 수준 및 그 이하로 조절되는, 근융 조절 및 감정을 포함하는 모든 신경 기능에 영향을 미치는 척수에 손상을 주는 척수 외상, 또는 닫힌 머리 외상에 의해 유발된 외상과 같은 뇌 외상일 수 있다.
뇌의 저산소증은 특정적으로 대뇌반구에 산소의 결핍이고 더욱이 전형적으로 이 용어는 전체 뇌에 산소의 결핍을 언급하는 것으로 사용된다. 저산소증의 심각성에 의존하여, 증상은 착란상태에서 복원할 수 없는 뇌 손상, 혼수 및 죽음에까지 이를 수 있다.
스트로크는 통상적으로 뇌의 허혈에 의해 유발된다. 이것은 또한 뇌혈관 질환 또는 사고로 명명된다. 이것은 뇌의 어느 부분으로 혈액 공급이 방해되어 질 때 발생하는 뇌 기능의 손실을 포함하는 뇌 장애의 군이다. 뇌는 신체 내 혈액 순환의 약 20%를 요한다. 뇌로의 일차적 혈액 공급은 목의 2 동맥(경동맥)을 통해서 되고, 이는 그런 다음 뇌안에서 뇌의 특정 영역으로 각각 공급하는 다수의 동맥으로 갈라진다. 혈액의 흐름에 단순한 방해조차도 뇌 기능의 감소를 유발할 수 있다(신경학적 결핍). 이 증상은 영향을 받은 뇌의 영역에 따라 다양하게 변하고 통상적으로 시각의 변화, 속도변화, 신체 일부의 감각이나 운동의 감소 또는 의식 수준의 변화와 같은 문제를 포함한다. 만일 혈액 흐름이 수초 보다 장시간 동안 감소된다면, 이 영역안의 뇌세포는 파괴되어(경색되어) 뇌의 그 영역에 영구적인 손상 또는 죽음조차도 유발한다.
스트로크는 약 1,000명 당 4명이 영향을 받는다. 이것은 미국을 포함하는 대부분의 개발된 국가에 있어 사망 원인의 3위를 차지한다. 스트로크의 사고율은 나에에 따라 극적으로 커지고, 35세 이후는 각각 10년마다 두 배씩 위험이 커진다. 65세 이상 인구의 약 5%는 저어도 한번의 스트로크를 경험한다. 이 질환은 여성보다 남성에서 보다 자주 일어난다.
상술한 바와 같이, 스트로크는 뇌의 영역에 혈액 순환의 손실에 기인된 뇌 기능의 손실(신경학적 결핍)을 포함한다. 특정한 신경학적 결핍은 손상의 위치, 정도 및 장애의 원인에 따라 다양할 수 있다. 스트로크는 부족한 혈액 공급 및 그 영 역에서의 조직사(경색형성)에 기인한 감소된 혈액 흐름(허혈)에 의해 기인될 수 있다. 허혈성 스트로크의 원인은 뇌에 형성된 혈액 덩어리(혈전) 및 다른 영역에서 뇌로 이동한 죽상경화성 플라그 조각의 혈액 덩어리 또는 다른 물질(색전)이다. 뇌에서의 출혈은 스트로크에 유사한 증상을 일으킬 수 있다.
스트로크의 대부분의 공통된 원인은 죽상경화증(뇌 혈전증)에 대한 이차적 스트로크이다. 죽상경화증("동맥의 경화")은 지방 증착이 동맥의 내측 면 상에 발생되어 죽상경화성 플라그(지방 증착 및 혈액 혈소판으로 구성된 덩어리)가 전개된상태이다. 동맥의 협착은 서서히 진행된다. 죽상경화성 플라그가 필수적으로 스트로크를 야기하는 것은 아니다. 다양한 뇌 동맥 간의 많은 적은 연결이 있다. 만일 혈액 흐름이 점진적으로 감소한다면, 이들 적은 연결은 사이즈가 사이즈가 증가할 것이고 방해된 영역은 "바이-패스"될 것이다(측부 순환). 만일 측부 순환이 충분하다면, 전체적으로 막힌 동맥조차도 신경학적 결핍을 일으키지않을 수 도 있다. 뇌 안에서 제이차의 안전 메카니즘은 동맥이 혈관의 75%가 폐색되어질 수 있어도 뇌의 그 영역에 여전히 적절한 혈액 흐름이 유지되도록 충분히 커다는 것이다.
혈전성 스트로크(혈전에 의해 야기된 스트로크)는 보다 어린 사람에 있어 가장 공통적이고, 때때로 근본적인 죽상경화성 심장병 또는 당뇨성 멜리터스(mellitus)이다. 이런 종류의 스트로크는 휴식을 포함하여 언제라도 일어날 수 있다. 이 사람은 의식을 있거나 잃을 수도 있다.
색전증(혈액 덩어리가 이동하는 것)에 의해 야기된 스트로크는 주로 대부분 심장장애 때문에 전개되어 뇌로 이동하는 덩어리인, 심장성 색전증에 대한 이차적 인 스트로크이다. 색전증은 또한 다른 영역 특히, 죽상경화성 플라그가 있는 곳에서 유래할 수 도 있다. 색전은 혈액류를 통해 주유할 수 있어 뇌의 적은 동맥에서 드러붙을 수 있다. 이 스트로크는 즉각적인 최대 신경적 결핍을 가지고 갑자기 발생한다. 이것은 활성 수준과 연계되지않고 언제라도 일어날 수 있다. 심장의 부정맥 공통적으로 이 장애로 보여지고 때로는 색전의 원인이다. 뇌에 대한 손상은 때로는 뇌의 혈전증에 의해 야기된 스트로크보다도 매우 심각하다. 의식이 있을 수 도 또는 없을 수 도 있다. 가능한 결과는 만일 혈관이 스트로크 파열 또는 출혈(출혈성 스트로크)에 의해 손상되면, 악화되어 진다.
말초 신경병증는 감각 손실의 증상, 근육 약화 및 영양과잉, 감소된 심건 이완, 및 혈관운동 증상의 단독 또는 어떤 조합이다.
질병은 단일 신경(단일신경병증) 또는 별개의 영역에서 둘 또는 그 이상의 신경(다중 단일신경병증), 또는 동시적으로 많은 신경(복합신경병증)에 영향을 미칠 수 있다. 축삭은 일차적으로 영향을 받을 수 있고(즉, 당뇨성 멜리터스, 석회병 또는 요독증에서 또는 독성제제로) 또는 수초 또는 슈반 세포이다(즉, 급성 또는 만성염증성 복합신경병증, 백질이영양증 또는 길라인-바르 증상에서). 소형 비유수화된 및 유수화된 섬유에 대한 손상은 일차적으로 온도와 통증 감각의 상실로 귀결되고; 큰 유수화 섬유에 대한 손상은 운동 또는 고유체위감각 결함으로 귀결된다. 몇 신경병증(예를 들어, 납 중독, 답손 사용, 진드기에 물림, 포르피린증 또는 길라인-바르 증상에 기인한 것)은 일차적으로 운동 신경에 영향을 미치고; 다른 것(즉, 암, 기면, 에이즈, 당뇨성 멜리터스 또는 만성 피리독신 독소유발의 배면근 신 경절)은 배면 근 신경절 또는 감각 섬유에 영향을 미쳐, 감각 증상을 일으킨다. 때때로는, 두개신경 또한 포함된다(즉, 길라인-바르 증상, 석회병, 당뇨성 멜리터스 및 디프테리아에서). 포함된 양식을 동정하는 것은 원인을 결정하는데 도움이 된다.
외상은 단일 신경에 대한 국부화된 손상의 가장 공통적 원인이다. 격렬한 근육의 활성 또는 조인트의 강력한 과신장은 소형 외상(즉, 작은 도구의 단단한 파지, 에어 햄머로부터 과도한 진동)이 반복되는 것 같이 소상의 신경병증을 일으킬 수 있다. 압력 또는 포획마비는 통상적으로 골돌출(즉, 사운드 슬립 또는 마른 또는 악액질성 사람에 있어 마취동안 및 때로는 알콜중독자에 있어) 또는 좁은 관(즉, 수근터널 신드롬에서)에서 표면적 신경(척골, 요골, 비골)에 영향을 미친다. 압력마비는 또한 종양, 골의 과골화증, 깁스, 목발 또는 장기간 절름발이 자세(즉, 가드닝에서)로부터 기인될 수 있다. 신경으로 출혈 및 냉기 또는 방사선에 노출은 신경병증을 유발할 수 있다. 단일신경병증은 직접적인 종양 침입으로 부터 기인될 수 있다.
다중 단일신경병증은 통상적으로 콜라겐 혈관 장애(즉, 복합동맥 결절, SLE, 스쥬그렌의 증상, RA), 유육종증, 대사성 질환(즉, 당뇨병, 아밀로이드증) 또는 전염성 질환(즉, 석회병, HIV 감염)에 대해 이차적이다. 미생물은 신경의 직접적 침입(즉, 기면)에 의해 다중 단일신경병증을 야기할 수 있다.
급작한 섬유성 질환에 기인한 복합신경병증은 독성(즉, 디프테리아에서) 또는 자가면역반응(즉, 길라인-바르 증상에서)으로부터 기인될 수 있고; 때로는 면역 반응이 따르는 복합신경병증은 아마 또한 자가면역이다.
독성 제제는 일반적으로 복합신경병증을 유발하지만, 때로는 단일신경병증을 유발한다. 이들은 에메틴, 헥사바비톨, 바비톨, 클로로부탄올, 술폰아미드, 페니토인, 니트로퓨란토인, 빈카 알카로이드, 중금속, 일산화탄소, 트리오르토크레실 포스페이트, 오르토디니트로페놀, 다양한 용매, 기타 산업성 독소 및 어떤 에이즈 약물(즉, 잘시타빈, 디단노신)을 포함한다.
영양 결핍 및 대사 장애는 복합신경병증을 나타낼 수 있다. B 비타민 결핍이 때로는 원인이다(즉, 알콜중독증, 각기, 악성 빈혈, 이소니아지드-유발 피리독신 결핍, 흡수불량증, 및 임신오조). 복합신경병증은 또한 과소티로이드증, 유육종증, 아밀로이드증, 및 요독증에서 일어난다. 당뇨성 멜리터스는 감각운동 말단 복합신경병증(대부분의 경우), 다중 단일신경병증, 및 소조의 단일신경병증(즉, 눈운동의 또는 외전의 두개골 신경)을 야기할 수 있다.
악성은 모노크로날의 감마병증(다중 미엘로마, 림프종), 아밀로이드 침입, 또는 영양 결핍 또는 방종양성 증상 같은 것을 통해 복합신경병증을 야기할 수 있다.
특정 단일신경병증; 단일 및 다중 단일신경병증은 영향을 받은 신경의 분산에서 감각 이상, 약화 및 통증에 특징이 있다. 다중 단일신경병증은 비대칭임; 신경은 모든 것은 한번에 또는 점진적으로 포함할 수 있다. 많은 신경의 포괄적 포함은 복합신경병증에 유사할 것이다.
측골 신경 마비는 때로는 엘보우에 반복된 기댐에 의해 발꿈치의 척골 홈에 신경의 외상에 의해 또는 어린시절 골절 후 비대칭적인 뼈의 성장(지연된 측골 마비)에 의해 야기된다. 측골 신경은 또한 팔꿈치터널에 압압되어 질 수 있다. 5번째 손가락 및 4번째 손가락의 내측 절반에 감각이상 및 감각결핍이 일어나고; 엄지 손가락 내전근, 5번째 손가락 내전근 및 골간의 근육이 약하게되거나 발육부진된다. 심각한 만성 척골 마비는 꾸부러진손가락 기형을 만든다. 신경 전도 연구는 손상 부위를 동정할 수 있게한다. 보존처리는 외과적 치료가 시도되기 전에 수행되어야 한다.
수근터널 증상은 횡 표면적 수근 인대와 손을 구부리는 전완 근육의 종 건 사이의 손목의 손바닥 측면에서 중간 신경의 압박으로부터 기인한다. 이것은 일측성 또는 이축성일 수 있다. 압박은 손의 방사상 손바닥 측면에서 감각이상과 손목 및 손바닥의 통증을 유발한다; 때로 통증은 전완 및 어께의 압박 부위에서 근위적으로 발생한다. 통증은 밤에 보다 심각할 수 있다. 첫째 세 손가락의 손바닥 측면에서 감각 결핍이 뒤따를 수 있다; 엄지 외전 및 어퍼지션을 조절하는 근육이 약하게되거나 발육부진될 수 있다. 이 증상은 경추 신경근증에 기인한 C-6 근 압박으로부터 구별되어진다.
비골의 신경 마비는 통상적으로 비골근의 목의 측면에 대해 신경의 압박에 의해 야기된다. 이것은 쇠약하여 침대에 누워만있는 환자와 슴관적으로 그 다리를 교차하는 마른 사람에서 가장 공통적이다. 족 신전 및 외전(풋드롭)의 나약함이 일어난다. 때로는, 감각 결핍이 하부 다리의 전외측의 측면 및 족의 배부 상에서 일어나거나 또는 일차 및 이차 중족골 사이의 웹 공간에서 일어난다. 치료는 통상적 으로 압박적인 신경병증에 대해 보존적인 것이다(즉, 다리 교차를 회피하는 것). 불완전한 신경병증이 통상적으로 만성적으로 뒤따르고 통상적으로 동시적으로 개선한다. 만일 회복이 되지않으면, 외과적 검사가 지적되어질 수 있다.
요골 신경 마비(토요일밤 마비)는, 즉 중독 또는 숙면 간에 팔이 의자의 뒤로 늘어뜨려질 때 처럼, 상박골에 대해 신경의 압박에 의해 일어난다. 증상은 손목 및 손가락 신근의 약화(리스트드롭)와 때로는, 일차 배부의 골간 근육의 배부 측면에 걸친 감각상실을 포함한다. 치료는 압박적 비골 신경병증과 유사하다.
복합신경병증은 상대적으로 대칭적이고, 때로는 감각, 운동 및 혈관운동 섬유에 영향을 동시에 미친다. 이들은 축삭 실린더 또는 수초에 영향을 미칠 수 있고, 양자 형태에서, 급성이거나(즉, 길라인-바르 증상) 또는 만성(즉, 신부전)일 수 있다.
대사장애(즉, 당뇨성 멜리터스) 또는 신부전증에 기인한 복합신경병증은 서서히 진행하고, 때로는 몇 달에서 몇년을 걸쳐 진행한다. 주로 이것은 때로는 근위보다는 기단으로 보다 심각한 하부 사지에 있어 감각비정상으로 시작된다. 주변 자통, 무감각, 화상통증, 또는 조인트 고유수용에서 결핍 및 진동적 감각이 가끔 현저하다. 통증은 때로는 밤에 악화되고 영향받은 영역을 터치하거나 또는 온도변화에 의해 심화될 수 있다. 심각한 경우에, 전형적으로 스타킹-앤드-글로브 디스트리뷰션을 갖는 감각상실의 객관적인 신호가 있다. 이킬레스 및 다른 심 건 이완이 감소되거나 완화된다. 손가락 또는 챠코트의(챠코트's) 조인트 상에 무통의 궤양은 감각 손실이 심오할 때 전개되어질 수 있다. 감각 또는 고유수용적 결핍은 비정상 적인 보행을 이끌 수 있다. 운동 침습은 기부말단 근육의 약화 및 성장부진으로 된다. 자율성 신경계는 부가적으로 또는 선택적으로 포함되어질 수 있어, 야행성 어지럼증, 배뇨 및 배변실금, 임포텐스, 또는 체위적 저혈압으로 이끌 수 있다. 피부는 정상보다 창백하며 건조하고, 때로는 어두운 탈색화를 갖는다; 땀을 과도하게 흘릴 수 있다. 영양의 변화(부드럽고 윤기나는 피부, 함요되거나 단단한 손톱, 골화증)는 심각하고, 장기화된 경우에 공통적이다.
영양의 복합신경병증은 알콜중독 및 영양결핍 중에서 공통적이다. 일차적 축삭병증은 가장 길고 큰 신경에서 축삭의 파괴 및 이차적인 탈유수화로 될 수 있다. 이 경우는 티아민의 결핍인가 또는 기타 비타민(즉, 피리독신, 판토텐산, 폴릭산)의 결핍인가가 불명확하다. 피리독신 결핍에 기인한 신경병증은 단지 TB에 대한 이소니아지드를 취한 사람에게만 발생한다; 피리독신에 의존하거나 결핍된 유아는 전신경련을 일으킬 수 있다. 기저말단 사지의 점점 약해짐 또는 대칭적인 약화는 통상 은근하게 진행하지만 신속하게 진행될 수 도 있고, 때로는 감각 상실, 감각이상 및 통증을 수반한다. 장단지 및 발에 통증, 구부러짐, 동상, 화상 및 무감각이 터치에 의해 악화될 수 있다. 복합 비타민이 병인이 모호할 때 주어질 수 있지만, 이들은 어떤 이점도 입증되지 않았다.
비정상적으로, 배타적으로 감각의 복합신경병증은 주위의 통증과 감각이상으로 시작하여 모든 형태의 감각의 상실로 진행한다. 이것은 아밀로이드증, 저티로이드증, 미엘로마 및 요독증에서 과도한 피리독신 주입(>0.5g/일) 후에, 카르시노마(특히, 기관지원성)의 별도 효과로 발생한다. 피리독신-유발 신경병증은 피리독신이 단절될 때 해결된다.
유전성 신경병증은 감각운동 신경병증 또는 감각의 신경병증으로 분류된다. 챠코트-마리-투쓰(챠코트-마리-투쓰) 질병은 가장 공통적인 유전성 감각운동 신경병증이다. 거의 흔하지 않은 감각운동 신경병증은 출생시 시작되고 큰 장애로된다. 희귀한 감각의 신경병증에서, 말단 통증과 온도감각의 상실은 진동 및 위치 감각의 상실보다 현저하다. 주요 문제는 잦은 감염 및 골수염을 갖는 통증 무감각에 기인한 발의 다변화이다.
유전성 운동 및 감각의 신경병증 타입I 및 II(챠코트-마리-투쓰 질병, 비골 근육 발육부진)는 상대적으로 흔하고, 보통 일차적으로 비골 및 말단 다리 근육에서 약함 및 성장결핍에 의해 특징되는 상염색체성의 현저한 장애이다. 환자는 또한 다른 퇴화성 질환(즉, 프리드릭의 운동실조) 또는 이들의 가족 병력을 가진다. 타입I을 갖는 환자는 풋드롭(footdrop) 및 서서히 진행하는 말단 근육 발육부진을 갖는 중간 어린이에 존재하여, "스토크 레그(stork legs)"를 형성한다. 진동, 통증 및 온도 감각은 스타킹-글로브 패턴에서 감소한다. 심 건 이완이 없어진다. 높은 발의 주 또는 햄머 발톱은 질병을 갖는 가족 구성원의 덜 감염된 유일한 신호일 수 있다. 신경 전도 속도는 느리고, 말단의 잠재가 장기화된다. 부분적 탈유수화작용 및 재유수화작용이 일어난다. 확대된 주변 신경이 박동되어질 수 있다. 이 질병은 서서히 진행하고 수명에는 영향을 미치지 않는다. 타입II 질병은 통상적으로 인생의 후반부에 발전하는 약함을 가지고 보다 서서히 전개한다. 환자는 상대적으로 정상적인 신경 전도 속도를 가지지만, 낮은 증폭을 잠정적으로 일으킨다. 부검은 웰 레리안(wallerian) 변성을 나타낸다.
희귀한 상염색체성의 퇴화적 장애인 유전적 운동 및 감각의 신경병증 타입III(영양과잉의 장기 신경장애, 데제린-소타스(Dejerine-Sottas) 질병)는 어린시절 진행성 병약화 및 감각 상실로 시작하고 심 건 이완이 없다. 초기에는 이것은 챠코트-마리-투쓰 질환에 유사하지만, 운동 병약화는 보다 빠른 비율로 진행한다. 탈유수화 및 재유수화작용이 발생하여, 신경 조직검사로 나타난 확대된 근위 신경 및 어니언 벌브(onion bulbs)를 생성한다.
운동 병약화, 족 변형, 가족 병역, 및 전기생리학적 이상의 특징적 분포는 진단을 확인한다. 유전적 분석이 이용될 수 있지만, 어떤 특징적 치료도 없다. 질환 진행에 대해 젊은 환자를 치료하기 위한 직업적인 카운셀링은 유용할 수 있다. 브레이싱(Bracing)이 풋드롭을 교정하는데 도움이되고; 족을 안정화하는 정형적 수술이 도움이 될 수 있다.
신경퇴화적 질환은 다른 것들 중에서, 알쯔하이머 질환, 피키슨 질환, 헌팅톤 질환 및 근위축성 측삭경화증(ALS)을 포함한다.
알쯔하이머 질환은 뇌 조직의 변화에 기인한 정신적 기능의 퇴화를 포함하는 장애이다. 이는 뇌 조직의 수축을 포함하지만, 혈관의 장애에 의해 유발되지않고, 일차적으로 변성의 치매이고 뇌위축을 확산한다. 알쯔하이머 질환은 또한 노인성 치매/알쯔하이머 타입(SDAT)으로 명명된다. 이것은 나이듬에 따른 지적 퇴화의 가장 공통적인 것이다. 이것의 발현은 약 10,000명 중에 9명에서 일어난다. 이 장애는 남성에게 보다 여성에게 보다 자주 더 영향을 미치고, 일차적으로 나이든 사람 에게서 일어난다.
이 원인은 알려지지않았다. 이 질환의 발생에 참여하는 신경화학적 요인은 아세틸콜린, 소마토스타틴, 기질 P, 및 노르에피네프린을 포함하는 신경충격을 전달하는 신경 세포(신경전달자)에 의해 사용된 기질의 결여를 포함한다. 환경적 요인은 알루미늄, 마그네슘, 및 기타 기질에 노출을 포함한다. 전염적 요인은 뇌 및 척추(중추신경게)에 영향을 미치는 프라이온(prion; 바이러스-유사 오르가니즘)을 포함한다. 몇가지(5 내지 10%의 경우를 나타냄) 류에 있어서, 장애의 전개에 대한 경향이 유전되어지지만, 유전성의 엄격한(멘델의 패턴) 패턴을 따르지는 않는다. 진단은 통상적으로 치매의 다른 요인을 조절함에 의해 이루어진다.
연구자들은 알쯔하이머를 갖는 다수의 구성원을 갖는 가족에서, 질환을 갖는 모든 이에게 공통하는 특정한 유전자 변형이 있다는 것을 발견하였다. 아폴리포프로테인 E4라 명명되는 기질을 생상하는 이 유전자는 질환을 야기한다고 일컬어지지 않고, 이것은 단순히 질환이 긍극적으로 일어날 수 있는 기회를 증가하는 것으로 나타난다. E4 유전자를 가지고 결코 알쯔하이머에 감염되지않은 사람이 많다.
이것의 개시는 지적 기능의 진행성 손실을 갖는 손상된 기억으로 특징되어진다. 감정 변화, 언어 능력에서의 변화, 걸음걸이 변화 및 장애의 진행에 따른 기타 변화가 있을 수 있다. 뇌 조직의 크기의 감소(위축), 뇌실(뇌 내의 공간)의 확대 및 뇌의 조직 내에서 증착이 있다.
파킨슨 질환은 워킹, 운동 및 근육 운동의 공동작업의 떨림 및 어려움에 의해 특징되는 뇌의 장애이다. 이 질환은 근육 운동을 조절하는 뇌의 일 부분에 손상 과 연관된다. 이것은 또한 마비 아지탄(agitans) 또는 흔들림 마비라고 일컬어진다.
이 질환은 대략 1,000명 중 2명이 영향을 받고, 대부분은 50세 이후에 발현된다. 이것은 남성 및 여성 양자가 영향을 받고, 가장 공통적인 노령 신경학적 장애이다. 용어 "파킨슨화"는 파킨슨 질환에서 관찰된 운동 변화의 형태의 조합을 포함하는 어떤 상태를 언급하는 것으로, 이는 이런 그룹의 증상을 야기하는 가장 공통적인 조건인 것으로 발생한다. 파킨슨화는 다른 질환 또는 외부적인 요인에 의해 야기될 수 있다(이차적인 파킨슨화).
파킨슨 질환은 근육 운동(기저의 신경절 및 추체외로의 영역)을 조절하는 뇌의 일 부분의 신경 세포의 진행성 퇴화에 의해 야기된다. 충격을 전달하기 위한 세포(전달자)에 의해 사용된 기질의 하나인 도파민은, 정상적으로 이 영역에서 생산된다. 뇌의 이 영역의 퇴화는 신체에서 이용할 수 있는 도파민의 양을 감소한다. 불충분한 도파민은 도파민과 아세틸콜린과 같은 기타 전달자 사이의 균형을 방해한다. 도파민이 없다면, 신경 세포는 신호를 적절하게 전달할 수 없고 이는 근육 기능의 상실을 가져온다. 뇌 세포가 퇴화하는 정확한 이유는 알려지지 않았다. 이 장애는 기능의 상실 정도가 다변하는 신체의 일 또는 양 측면에 영향을 줄 수 있다.
근육 조절의 손실에 부가하여, 파킨슨 질환을 갖는 몇몇 사람은 심각하게 우울증에 빠진다. 비록 정신적 능력의 조기 상실이 알려지지 않았지만, 심각한 파킨슨을 갖는 사람은 전반적인 정신적 퇴화(치매, 환각 등을 포함)를 나타낼 수 있다. 치매는 또한 장애를 치료하기 위해 사용된 몇몇 치료제의 부작용일 수 있다.
헌팅톤 질환은 유전되는 상염색체성의 현저한 신경계의 질환이다. 이것은 비공통적으로, 대략 10000명 중 1명이 영향을 받는다(Breighton and Hayden 1981). 이 질환은 인생의 5십년째 까지 통상적으로 임상적으로 명백하게되지 않고, 전형적으로는 개시에 따른 17년에 죽음으로의 냉혹한 진행과 연계된 정신의학적인 장애, 비자발적 운동 장애, 및 인식의 쇠약을 가져온다.
헌팅톤 질환에 책임이 있는 유전자는 소위 헌팅톤이다. 이것은 크로모좀 4p 상에 위치하여, 잠복기의 및 출생전의 진단의 유효한 수단을 나타낸다. 유전적 비정상성은 세로로 나란히 반복된 CAG 뉴클레오티드 시퀀스의 과잉의 수로 구성된다.
헌팅톤 질환을 갖는 사람에서 CAG 반복의 크기에서의 증가는 임상적 특성의 발현의 나이와 아주 유의성있는 상관관계를 나타낸다. 이 연계는 통상적으로 50 반복을 넘어서는 매우 유의성있는 정도를 갖는 어린나이에 발현하는 헌팅톤 질환을 갖는 사람에게 특히 현저하다. 헌팅톤 질환류에서 이 CAG 반복 길이는 어린이가 헌팅톤 유전자를 영향받은 어버지로부터 유전할 때 특히 마크되는 몇몇 불안정성을 나타낸다.
HD에서, 어떻게 이것이 광범위하게 유전자를 발현하여 선택적인 신경 사를 야기하는지 알려지지 않았다. 더욱이, 다른 공지 유전자에 대해 명백한 상동성과 구조적 모티브 또는 기능적 영역이 밝혀지지 않은 시퀀스 분석이 그의 기능에서 통찰을 명확하게 제공하는 것이 동정되었다. 특히나, 어떻게 이들이 광범위하게 유전자가 선택적인 신경 사를 발현하는가의 물음은 미지로 남아있다.
근위축성의 측삭경화증인, ALS는 뇌와 척추에서 신경 세포의 파괴 때문에 자 발적 근육의 신경성 조절의 진행성 상실을 야기하는 질병이다. 근위축성 측삭경화증은 또한, 루 게릭(루 게릭) 질환으로 명명되는, 근육의 조절 및 사용의 손실을 포함하는 장애이다. 이들 근육을 조절하는 신경은 수축되고 사라져, 신경성 자극의 결핍에 기인한 근육 조직의 손실을 낳는다. 근육의 강도 및 조합작용은 감소하여, 수의근(팔과 다리의 근육과 같이 의식적 조절 하에의 것)으로 시작한다. 어느 정도의 근육 조절의 손실이 진행을 계속하여, 더욱 더 많은 근육 군이 포함된다. 심폐를 조절하는 근육과 같이 준-수의근에 대한 신경성 자극의 상실이 있을 수 있다. 사고 또는 논리에 대한 능력에 아무런 영향을 미치지 않는다. 이 원인은 알여지지 않았다.
ALS는 대략 100,000명 중에 1명에 영향을 미친다. 이것은 몇몇의 경우에 가족에서 나타난다. 이 장애는 여성보다 남성에게서 더 영향을 미친다. 증상은 통상적으로 성년기까지, 때로는 연령 50 이후까지는 발현하지 않는다.
외상성 신경 상해는 CNS 또는 the PNS에 연관될 수 있다. 외상성 뇌 상해 (TBI), 또한 단순히 머리 상해 또는 폐쇄된 머리 상해(CHI)로 명명되고, 머리에 외부의 가격때문에 뇌에 손상을 입힌 상해를 언급한다. 대부분은 자동차 또는 자전거 사고 때 발생하지만, 또한 물에 빠짐, 심장발작, 스트로크 및 감염의 결과로 발생할 수 도 있다. 이런 타입의 외상성 뇌 상해는 통상적으로 뇌로의 산소 또는 혈액 공급의 결핍에 기인한 결과일 수 있으며 따라서, "비산소의 손상"으로 언급된다.
뇌 상해 또는 폐쇄된 머리 상해는 자동차 사고 또는 낙상때문에 머리에 대한 가격이 있을 때 일어난다. 이 경우에, 두개골이 정지상의 목적물을 때리고, 두개골 내측에 있는 뇌는 그의 축(뇌 근) 상에 회전하고 꼬여, 국부적 또는 광범위한 손상을 야기한다. 또한, 뇌를 "유동"하게 하는 유동체에 의해 싸여진 연질인 뇌는 두개골에 대해 다시 바운드되어 추가적인 손상을 가져온다.
몇 분, 몇 주 또는 몇 달 지속될 수 있는 외상에 바로 따른 무의식의 기간이 있을 수 있다. 트위스팅 및 재바운딩에 기하여, 외상적으로 뇌를 손상한 환자는 통상적으로 뇌의 여러부분에 손상 또는 상처를 받을 수 있다. 이는 뇌에 대한 확산 손상 또는 "비-유도 상처"라 명명된다. 비-유도 상처에서 발생하는 이런 종류의 뇌 손상은 일차적 또는 이차적인 것으로 분류될 수 있다.
일차적인 뇌 손상은 손상의 시기에, 주로 충격의 부위에, 특히 두개골 분획이 존재할 때 발생한다. 주요 손상은 내측뇌의 출혈과 연계될 수 있고 또는 피질성의 열상이 수반된다. 산재성의 축삭의 손상은 두개골 내에서 뇌의 회전운동에 의해 생성된 신경 돌기의 장력 강도 및 보호의 결과로 발생한다. 단지 현미경적으로 관찰될 수 있는 축삭에 대한 적은 출혈 손상 또는 산재성의 손상이 있을 수 있다.
이차적인 뇌 손상은 상해 시점 이후 전개하는 연루의 결과로 발생한다. 이들은 두개내의 출혈, 외뇌의 동맥의 외상성 손상, 두개내의 헤르니아형성, 저산소증 뇌 손상 또는 뇌막염을 포함한다.
개도 머리 상해는 머리에 대한 볼수 있는 침습으로 총상, 뇌안으로 두개골을 통과하는 목적물 또는 사고("뇌에 대한 유도 상해")로부터 기인한다. 이런 타입의 머리 상해는 뇌의 특정 영역에 손상을 주기쉽다.
소위 마일드한 뇌 상해는 의식의 손실없이 일어날 수 있고, 가능하기로는 단 지 짧게 지속되는 혼미한 느낌 또는 혼동된 상태로 일어날 수 있다. 비록 투여된 의료적 치료가 최소화될 수 있지만, 혼수상태없이 뇌 상해를 갖는 사람은 혼수 상태 손상의 생존자가 받은 것에 유사한 증상 및 손상을 경험할 것이다.
외상에 감응하여, 변화가 부가적인 손상을 방지하기 위해 모니터링을 요하는 뇌에서 발생한다. 뇌의 크기는 주로 심각한 머리 손상 후 증가한다. 이는 뇌팽창이라 불리고 뇌의 혈액 양의 증가가 있을 때 발생한다. 이 질병에서 후에 뇌 부종이라고 불리는 뇌에 물이 모여질 수 있다. 뇌 팽창 및 뇌 부종 양자는 두개내의 압력("ICP")이라 불리는 뇌 안의 과도한 압력에 기인한다.
척추 손상은 대부분의 양하지마비 및 사지마비에 대한 병원 입원으로 계산된다. 80% 이상이 로상의 사고에 기인한다. 두가지의 중요한 상해군은 임상적으로 인식된 것으로; 개도 상해 및 폐쇄 상해이다.
개도 상해는 척추 및 신경 근의 직접적인 외상을 야기한다. 관통 상해는 포괄적인 파열 및 출혈을 야기할 수 있다. 폐쇄 상해는 대부분 척주 손상으로 고려되고 통상적으로 척주의 골절/이탈과 연계되어, 통상적으로 방사선으로 진단될 수 있다. 코드에 대한 손상은 골의 손상의 정도에 의존하고 두 주요단계로 고려되어 질 수 있다; 타박상, 신경 섬유 절단 및 출혈적 괴사인 일차적인 손상 및 경막외 헤마토마(extradural heamatoma), 골절, 감염 및 부종인 이차적인 손상.
코드 손상의 후 영향은 : 손상된 신경 섬유의 상승 및 하강하는 전방으로 뻗는 퇴화, 후-외상성 척수공동증, 및 뇨도관 및 가슴 감염, 압력 통증 및 근육 소모와 같은 양하지마비의 체계적인 효과를 포함한다.
신경계의 장애는 더욱이 선천적인 대사 장애에 기인한다. 많은 신경 섬유를 싸는 미엘린 초는 발생 초기에 형성된 리포프로테인 층으로 구성된다. CNS에서 올리고덴드로글리아에 의해 형성된 미엘린은 슈반세포에 의해 근위적으로 형성된 것과 화학적 및 면역학적으로 다르지만, 양자의 타입은 축삭을 따라 신경 충격의 전달을 증진하는 같은 기능을 갖는다.
많은 대사적인 장애(즉. 페닐케톤뇨증 및 기타 아미노산뇨증; Tay-Sachs, Niemann-Pick, 및 Gaucher's 질환; Hurler's 신드롬; Krabbe's 질환 및 기타 백질이영양증)는 주로 CNS에서 전개하는 미엘린 수초에 영향을 미친다. 생화학적인 결점이 영구히 가끔 광범위하게 교정되거나 보상될 수 없다면, 신경계의 결함이 발생한다.
예를 들어, 크랩(Krabbe) 질환 또는 구상체 세포 백질이영양증은 말초 및 중추 신경계의 백질을 포함하는 장애이다. 리소좀의 효소 갈락토세레브로시다제(GALC)에 대한 유전자에서의 변이는 미엘린에서 거의 배타적으로 발견된 갈락토리피드를 변성하는 낮은 효소적 활성 및 감소된 능력을 가져온다. 환자에 있어 연속된 미엘린화작용 및/또는 재유수화작용은 충분한 GALC 발현을 제공하기 위해 기능적인 내인성의 희돌기교세포 또는 정상 희돌기교세포로 분화할 수 있는 희돌기교세포 또는 줄기 세포의 이식을 요한다(Wenger 등, 2000).
신경섬유종증 1(NF1)은 광범위한 신경계의 출현을 갖는 공통적인 상염색체성의 질환이다.
다중 시스템 위축은 알려지지않은 생태학의 간헐적이고, 성인-발현 신경퇴화 적 질환이다. 이 상태는, 만일 일차적이라면, 병인의 과정에서 희돌기교세포의 세포에 의해 역활하는 현저한 역활에 의해 신경퇴화적 질환 중에 유일할 수 있다. 피키슨 질환에 대한 중요한 차이는 MSA 환자는 L-도파(dopa) 치료에 감응하지 않는다는 것이다.
노년에 탈유수화작용은 많은 신경계 장애의 특징이다; 이것은 국소적인 손상, 빈혈, 독성제제 또는 대사적 장애에 기인한 신경 또는 미엘린에 대한 손상으로부터 유래될 수 있다. 또한 탈유수화는 정신분열증을 유발할 수 있다는 증거이다. 광범위한 미엘린 손실은 통상적으로 축삭의 퇴화 및 때로는 세포체 퇴화, 회복할 수 없는 양자가 뒤따른다. 그러나, 재유수화는 많은 경우에 일어나고, 신경 기능의 치료, 회복 및 완전한 복원은 빠르게 될 수 있다. 중앙의 탈유수화(즉, 척추, 뇌, 또는 시신경의 것)는 그의 병인이 알려지지 않은 일차적인 탈유수화 질환에서 우세하게 발견된다.
급성 산재성 뇌척수염, 감염후 뇌척수염은 혈관 주위의 CNS 수초탈락에 의해 특정되는 것으로, 이것은 자연발생적으로 일어날 수 있으나 통상적으로는 면역학적 원인을 제시하는 바이러스성의 감염 또는 바이러스성의 예방접종(또는, 매우 드물게는 박테리아성의 예방접종)에 따른다. 바이러스성의 예방접종 또는 길라인 바르의 신드롬에 따르는 급성 염증성 근위 신경병증은 동일한 가면역병인론을 갖는 탈수초 장애와 유사하지만, 이들은 단지 말초의 구조에만 영향을 미친다.
변색성의 백질이영양증은 또 다른 탈수초 질환이다. 아드레노백질이영양증 아드레노백질이영양증 및 부신수초신경병증은 부신선 기능이상에 의해 특징되는 희 귀한 X-연결 퇴행성 대사이상과 신경계의 광범위한 탈유수화이다. 부신백질이영양증은 젊은 소년에게서 발생한다; 성인에게서는 부신수초신경병증. 정신적 퇴화, 경련, 및 실명이 일어날 수 있다. 부신백질이영양증은 언제나 치명적이다. 음식조절과 면역조절의 치료가 연구중이다.
레버의(Leber's) 유전성 눈의 위축 및 관련된 미토콘드리아의 장애는 통상적으로 10대 후반 또는 20대 초반의 젊은이에 영향을 미치는 중앙 시신경의 부수적인 손실에 의해 일차적으로 특징된다. 레버의 유전성 눈의 위축은 MS에서 눈의 신경염에 유사할 수 있다. 모계에서 유전된 미토콘드리아의 DNA가 동일하게 된다.
HTLV-연계 척수장애, 인간 T-세포 림프절 바이러스에 의한 감염과 연계된 서서히 진행하는 척추 질환은 양 다리의 경련성 병약에 의해 특징된다.
더욱이, 신경계의 장애는 비정상적인 미엘린화작용을 갖는 신경병증을 포함하고, 이들의 개요는 다음과 같다.
면역: 급성, 길라인 바르, 만성, 만성 면역 탈수초화 복합신경병증(CIDP), 다소성 CIDP, 다소성 운동 신경병증 (MMN), 안티-MAG 신드롬, GALOP 신드롬, 안티-설페이티드 항체 신드롬 (혈청 M-프로테인을 가짐), 안티-GM2 항체 신드롬, POEMS 신드롬, 복합신경병증 장기종대, 내분비질환 또는 부종, M-프로테인, 피부 변화, 신경외초염, IgM 안티-GD1b 항체 신드롬 (가끔).
독소: 디프테리아, 벅톤(Buckthorn), 헥사크로로펜(Hexachlorophene), 소디움 시아네이트(소듐 Cyanate), 텔루륨(Tellurium).
약물: 현저한 탈수초: 클로로퀸(Chloroquine), FK506 (타크로리머스;Tacrolimus), 퍼헥실린(Perhexi라인), 포로카이나미드(Procain아미드)), 지멜딘(Zimeldine); 혼합 탈수초 & 축삭: 아미오다론(Amiodarone), 에오시노피리아-미앨지아(Eosinophilia-Myalgia) 신드롬, 콜드(Gold), 슈라민(Suramin), 탁솔(Taxol).
유전성: 카보하이드레이트-결핍 글리코프로테인, 백내장 & 안면 이형증, 코케인의(Cockayne's) 신드롬, 선천성 과소탈수초, 선천성 근육의 영양실조: 메로신(Merosin) 결핍, 파버의(Farber's) 질환(지방육아종증), HMSN & CMT, 우성: IA, IB, III, HNPP, EGR2, 열민감성(Thermosensitive), 열성: III (Dejerine-Sottas); 4A; 4B; 4B2; 4C; 4D (LOM); 4E; 4F; HMSN-R; CNS, X-linked: IX, 크랩(Krabbe), 마리네스코-스쥬그렌(Marinesco-Sjogren), 변색성의 백질이영양증, 니만-피크(Niemann-Pick), 펠리재우스-머르츠바커(Pelizaeus-Merzbacher) (PLP), 렙섬(Refsum), 프리온 프로테인 (PrP27-30): Glu200Lys 변이, 크레우츠펠드-야곱(Creutzfeld-Jakob) 질환, 마우스 모델: 프리온 과 발현, 사라(Salla) 질환, SOX10, 테나신(Tenascin)-XA, 말초 미엘린 초의 유네반 팩킹(Uneven packing), 엘러-단로스 표현형(Ehlers-Danlos phenotype).
대사(이례적): 당뇨 (동시에 일어나는 CIDP에 기함), 저티로이드증, 간 장애.
미토콘드리아의: MNGIE 신드롬, 근장애 & 외부 안근마비, 신경병증, 위장관내 뇌질환, NARP 신드롬, 신경병증, 아탁시아(Ataxia), 망막염, 색소.
감염: 크레우츠펠드-야곱 질환, 디프테리아, HIV: 연합 CIDP, 나병: 나종성 의; 혼합된 축색의-탈수초; 군체성 슈반 세포, 다양한 크레우츠펠드-야곱 질환.
보다 상세한 것은 다음의 인터넷 사이트에서 볼 수 있다: http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/nother/myelin.html.
다중 경화증(MS)은 퇴행성 또는 진행성 코스를 갖는 중추신경계(CNS)의 염증성의 탈수초 질환이다. MS는 단지 탈수초 질환이 아니다.
말초신경계(PNS)에서의 그의 반대부위는 만성의 염증성의 탈수초 다발성신경근염(CIDP)이다. 부가적으로, PNS에서 길라인 바르의 신드롬(GBS)이라 명명되는 염증성의 탈수초 다발성신경근염 및 CNS에서 급성 산재성 뇌척수염(ADEM)과 같은 민감성 단성상의 장애가 있다. MS 및 GBS 양자는 이형성 신드롬이다. MS에서 유전적 요인과 함께 다른 외래성 발작이 최종적으로 진단적 표준을 충족하는 질환 경로로 야기될 수 있다. 양 질환에서, 축삭의 손상이 일차적으로 탈수초 손상에 부가될 수 있고 영구적인 신경계의 결손을 야기할 수 있다.
MS는 상기 탈수초 질환의 가장 공통적인 것이다. 이것은 면역 시스템의 백혈구가 중추신경계(CNS)의 백질을 공격하는 자가면역 질환으로 특징된다. 회백질도 또한 포함될 수 있다. 비록 MS의 정확한 병인학이 밝혀지지 않았지만, 기여하는 인자는 유전적, 박테리아성의 및 바이러스성의 감염을 포함할 수 있다. 그의 분류적 명확화에 있어서(모든 경우의 85%), 이것은 실질적 또는 완전한 회복이 뒤따르는 몇 주간 지속되는 신경계의 기능이상의 에피소드에 상당한 택일적으로 재발성/이장성 상태에 의해 특징된다(Noseworthy, 1999). 완화의 주기는 시간에 걸쳐 짧아진다. 그런 다음 많은 환자는 부분적으로 또는 회복하지 않은 신경적 기능의 점진적 손실로 특징되는 최종 질환 상태로 돌입한다. 이것은 이차적인 진행성 MS로 명명된다. 아주 적은 비율(모든 MS 환자의 ~15%)이 질환의 발현이 따르는 신경계의 기능에의 점진적 및 중단되지않은 쇠약(일차적 진행성 MS)에 고통받는다. 일반적으로 치명적인 MS의 심각한 형태에 대한 명확한 치료적인 처리법이 현재로는 없다.
MS의 기본적인 징후는 뇌 및 척추의 백질 트랙에서 발견되는 반응성 신경교의 상흔 형성을 갖는 탈미엘린화된 플라그이다. 탈유수화는 기능적 환원 또는 신경 충격 전도의 방해에 연결된다. 축삭의 절단 및 사(死)는 또한 MS 환자에서 관찰된다(Bjartmar 등, 1999). 병리학적 연구는 눈의 신경, 위주위의 백질, 뇌 줄기 및 척추에 한정된 대부분의 연루를 보인다(Storch 등, 1998). 이들 CNS 결핍의 효과는 급성 증상의 복시, 무감각 및 불안정한 걸음 뿐 아니라 경련성 마비 및 실금과 같은 만성의 증상을 포함한다.
MS 병인론에 근본적인 분자성 메카니즘은 바이러스성의 및 박테리아성 감염을 포함하는 유저적 및 환경적 요인으로부터 근간을 이룬다고 나타난다. 이들 메카니즘은 혈액-뇌 경계를 가로질러 CNS 조직으로 T 림프구 및 마크로파지의 증가된 이동을 진작한다.
탈유수화는 활성화된 마크로파지 및 소신경교세포에 의한 미엘린에의 공격 뿐 아니라 파스-리간드(Fas-ligand) 신호 및 세포독성으로 고려된 구성성분- 또는 항체-로부터 나온 미엘린화 세포에 대한 손상에 기인한다. 따라서, 탈유수화는 미엘린 초에의 직접적 공격 뿐 아니라 미엘린을 생성하고 유지하는 세포의 제거 양자를 통해 일어난다..
유전적 및 환경적 요인은 혈관-뇌 경계를 통해 염증성의 세포의 증가된 유입을 이끈다. 이는 CNS 조직으로 자가반응성 T 림프구 및 마크로파지의 증가된 이주를 야기한다. T 세포에 의한 사이토킨 분비는 항원을 나타내는 세포(APCs)를 활성화한다. APCs 상 MHC 클래스 II 분자의 내용물 중 반응성 반응성 T 세포가 추정의 "MS 항체", 때로는 미엘린 초의 프로테인 구성분에 직면할 때, 이들은 활성화되어질 수 있다. 몇몇 연속하는 메카니즘은 그런 다음 희돌기교세포 및 미엘린에 손상을 주는 작용을 할 수 있다. 세포독소로 간주되는 보체 및 항체는 몇몇 환자에 있어 중요한 손상을 일으키 수 있고, 비록, CD4+ T 세포에 의한 TNF-a과 같은 전-염증성의 사이토킨류의 방출 및 파스-리간드 신호는 다른것에서 백질을 공격할 수 있다. 활성화된 마크로파지는 또한 고양된 식작용 및 팩터 분비를 통한 역활을 할 수 있다. 이는 광범위한 탈유수화 및 CNS의 축삭 중에 전도의 효율성의 연속된 상실을 야기한다. 그러나, 연속하는 치유 메카니즘은 일단 염증성의 과정이 해결되면, 재유수화를 일으킬 수 있다. MS 환자의 재미엘린화 축삭은 재미엘린화된 축삭주위의 초의 얇은 발현에 의해 병리적으로 인식된다. 부가적인 나트륨 채널은 때로 탈미엘린화 축삭의 멤브레인에 삽입되어 발견되어, 전도 효율성의 손실을 보상한다. 희돌기교세포의 전구체는 MS 손상에서 재유수화를 고양할 수 있다.
희돌기교세포는 미엘린 초의 생성 및 유지에 관련된 복수의 기능을 수행한다. 이는 복합 뉴론의 축삭에 대한 절연, 지지 및 전도 고양을 제공한다. 단일 희돌기교세포는 50의 다른 축삭까지 미엘린화될 수 있다. 미엘린화는 단지 어떤, 큰 직경의 축삭에 대해서 만 제한적이다; 미엘린화되지 않고 남아있는 성상신경교세포 의 것과 같은 수상돌기 및 기타 세포 진행. 랫트 눈 신경의 패러다임에서 축삭의 절단이 미엘린 재생 및 희돌기교세포 전구체 생성을 저해하기 때문에(reviewed in Barres and Raff, 1999), 축삭은 다수의 미엘린화 희돌기교세포에 걸쳐 조절을 발휘하는 것으로 나타난다. 희돌기교세포 증식 및 이동은 전개 간에 축삭으로부터 방출된 인자에 의해 자극될 수 있다. 이런 방식에서, 다수의 희돌기교세포 및 축삭은 CNS 내에서 조심스럽게 매치된다.
CNS의 말초신경 지지 세포인, 희돌기교세포는 축삭의 트랙을 미엘린화하고 충격 전도를 고양하는 작용을 한다. 이들은 축삭의 생존과 기능에 있어 역활을 수행한다. 이 다이어그램에서 나타난 바와 같이, 희돌기교세포는 그것이 미엘린화하는 각 축삭으로 단 하나의 과정을 신장한다.
멀티라멜라(multilamellar) 미엘린 초는 신경교의 세포 플라즈마 멤브레인의 특정화된 영역으로, 지질이 풍부하고 단백질이 낮다. 이것은 축삭을 지지하고 둘러싼 조직으로 방혈로부터의 하전을 방지함에 의해 CNS로의 전기적 신호 전도의 효능성을 개선하는 작용을 한다. 랑비에르 결절(nodes of Ranvier)은 도약성의 전도가 일어나는 축삭을 따른 초 내의 위치이다.
성인 뇌에서, 희돌기교세포는 뇌 및 척추의 아래뇌실의 영역에서 여전히 빈약하게 한정된 전구체 세포로부터 전개된다(Nait-Oumesmar 등, 1999). 이들 전구체는 증식적이고, 미엘린 전사 및 프로테인을 발현하는데, 먼저 미엘린화 몇주 전에 배아 척추의 복부 영역에 출현한다(Hajihosseini 등, 1996). 미엘린화의 과정은 생후 뇌에서 나타난다. 생후 전개 간에, 이들 전구체는 미엘린화되어지는 뉴론 트랙 으로 이동한다.
희돌기교세포는 이들의 전구체 세포로부터 한정되고 특정된 방식으로 성장한다(즉, Rogister 등, 1999에서 검토됨). 희돌기교세포 전개는 한정된 경로를 따르는데, 각 단계는 몇몇 세포-특정 마커(세포-특정 markers): 내피의 신경 세포 점착 분자(E-NCAM), 비멘틴(vimentin), A2B5, POU 전사 인자 Tst-1/Oct6/SCIP, 전-희돌기교아세포종 항체(POA), 갈락토세레브로사이드(galactocerebroside)(GalC), O1, O4, 및 미엘린-특정 프로테인 PLP, MBP, 및 MOG에 의해 구별된다. 신경 줄기 세포는 이극성 pre-GD3+ 세포를 발생하여, 이는 O2A 전구체가 된다. 이들 세포는 희돌기교세포 또는 타입 2 성상신경교세포를 일으킬 수 있다. 진보는 희돌기교세포로 실질적인 분화 전에, 전-희돌기교세포의 및 전-GalC+ 단계를 통해 지속된다. 희돌기교세포의 연계의 마지막 단계는 증식하기 위한 이들 세포의 불능에 의해 한정된다. 성숙한 희돌기교세포는 미엘린-특정 프로테인 발현에 부가하여, 세포-특정 마커 GalC 및 설페이티드(SUL)를 발현한다.
따라서, 희돌기교세포는 유사분열적으로 활성인 이동성 전구체 세포로부터 분화한다. 일단 이들 세포가 후-유사분열이 되면, 이들은 유전자 엔코딩 미엘린-특정 프로테인을 전사하여 복제한다. 축삭을 싸는 미엘린 초의 공헌은 성숙 희돌기교세포의 진행과 축삭 그 자체 사이의 직접적인 접촉에 의해서 나타난다. CNS 축삭 둘러싸기는 미엘린 초의 밀집화에 의해 완성되어, 그의 최종 형상에서 복잡한 형성의 거대분자를 포함한 액체 결정을 닮는다(Scherer, 1997). 미엘린화의 증진은, 일 성분 양의 증진 또는 감소가 전체 초 구조의 혼란을 야기할 수 있기 때문에, 미엘린 초의 개개의 구조적 프로테인 사이의 정확한 화학량론적 관계의 고려를 요구한다.
탈미엘린화 축삭의 치유를 유지하기 위한 희돌기교세포의 불능성은 MS에 특징이있는 축적적인 신경계의 기능이상에 기여한다. MS 환자에서 재유수화의 증진은 축삭의 손실을 보호할 수 있고 따라서 CNS에서 축삭의 사와 연계된 불능성으로 진보를 제한한다.
MS의 탈수초 표현형은 활성 MS 손상의 본성에 대한 광범위한 연구를 이끈다. 나(裸) 축삭 및 미엘린화 희돌기교세포의 부재는 정상 미엘린의 파손 및 MS와 연계된 재미엘린화 과정의 이탈을 나타낸다. MS 손상의 약 40%는 유산적 재미엘린화, 특히, 질환의 초기 상태에서, 의 증거를 나타내는 것으로 보여진다(Prineas 등, 1993). 이는 미엘린 치유를 증진하기 위한 발전적 전략이 영구적인 신경계의 손상을 방지할 수 있다는 실질적인 전망을 나타낸다. 성공 가능성은 재유수화 가 이미 발생한 거승로 나타난 젊은 CNS 손상에서 특히 높다. 그러나, 미엘린화 또는 재미엘린화 희돌기교세포는 아주 적은 부가적인 공격조차도 회복불가능하게 손상될 수 있는 극한적 대사 스트레스 하의 세포이다(Scolding 및 Lassmann, 1996). 이는 활성적인 MS 손상에서 자발적인 치유의 가능성을 감소하여 감염 및 기타 손상이 재미엘린화에 장애를 취한다. 미엘린 치유를 증진하기 위한 전략은 따라서 활성적인 MS 손상에서 축삭의 보호 및 재유수화에 유리한 승산을 축적한다.
성인 인간 CNS는 미엘린화 희돌기교세포로 증식할 수 있고, 성장할 수 있는 희돌기교세포 전구체 세포를 포함하는 것으로 나타났다. 부가하여, MS 손상에 인접한 내인성의 희돌기교세포 전구체들은 질환의 만성 상태 동안, 이들 전구체의 증식 및 분화에 대한 능력의 저해에 기하여 고갈되어지는 것으로 나타났다(Wolswijk, 1998). 이런 전구체 세포는 재미엘린화에 활성적으로 기여하는것으로부터 이를 방지하는 만성의 MS 손상의 환경에 일반적으로 침묵한다, 만성의 MS 손상의 상태는 따라서 희돌기교세포의 재생성을 방해하고 희돌기교세포 전구체 세포 개체군의 자극에 필요한 인자를 결핍하는 인자를 포함한다(Wolswijk, 1998). 이 개념은 MS에 대한 유효한 치료가 염증을 발현하는 것을 제한하지는 않지만 또한 재미엘린화에 유리하다는 가설을 이끌어 낸다. 재미엘린화 세포는 손상에 대해 타고난 생존하는 희돌기교세포, 이들 생존자로부터 유래된 세포, 또는 인접 전구체 세포를 포함하는 다양한 근원으로부터 유래될 수 있다. 성숙 희돌기교세포가 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)와 같은 인자에 의해 다시분화되어 증식되도록 유도될 수 있다는 것이 밝혀져, 탈수초 질환에 따른 희돌기교세포의 계대의 재생성에 대한 메카니즘을 제안한다(Grinspan 등, 1996; Grinspan 등, 1993).
MS와 같이 탈수초 장애에서 재유수화의 유익한 효과에 대한 부가적인 증거는 질환의 동물 모델에서의 처리와 같이 신경교의 성장 인자로 수행된 연구에 의해 제공된다. 희돌기교세포 증식 및 생존을 증진하는 것으로 알려진 CNS 성장 인자인, 신경교의 성장 인자 2(neuregulin/GGF-2)는 질환 발현을 지연하고, 임상적 심각성을 감소하고 MS의 EAE 쥐의 모델에서 재발 빈도가 감소하는 것이 나타났다(Marchionni 등, 1999). 뉴레굴린(Neuregulin)은 성장 희돌기교세포 생존 에 유리한 효과를 갖고 축삭에 의해 생성되는 것이 나타났다(Fernadez 등, 2000).
혈소판-유도 성장 인자(PDGF) 및 IGF-1을 포함하는 기타 성장 인자는 재유수화를 증진하고 EAE 모델에서 치료적 효과를 갖는 것으로 입증되었다(Dubois-Dalcq 및 Murray, 2000에서 검토됨). 증식 및/또는 분화를 위한 희돌기교세포 계대의 세포 유도를 통한 재미엘린화의 자극으로 달성된 성공은 MS에 대한 치료적인 전략으로 재유수화에 대한 전망이 우호적이다는 것을 나타낸다. 또한, 미엘린 합성을 저해하는 분자, 이들은 MS에서 희돌기교세포의 세포 이식과 같은 치유전략의 유효성을 낮출 수 있기 때문에, 이들 분자를 동정하는 것이 중요하다.
재유수화의 과정은 손상을 치유하고 절단 및 사로부터 축삭을 보호하기 위해 항-염증성의 경로와 함께 작용할 수 있다.
희돌기교세포는 CNS에서 축삭의 트랙을 재미엘린화하도록 유도될 수 있어, 이에 의해 질환 상태의 개선에 기여한다. 재유수화 고양은 CNS 조직으로 면역 시스템 세포의 침입과 미엘린 초에 대한 이들의 공격에 의해 만들어진 예비 파괴에 반작용을 한다.
희돌기교세포의 분화 및 복합 경화증 손상의 수회 분석은 분화된 유전자 발현의 마이크로어레이 시각화(마이크로어레이 visualization)를 사용하여 수행되어졌다(DGE, Scarlato 등, 2000; Whitney 등, 1999). 이들은 다른 어레이 기술을 유의성있게 실용화하여 다양한 세트의 유전자를 분석한다. 분화한 희돌기교세포와 복합 경화증 손상 양자에 있어 유전자 발현의 분석 미엘린-특정 유전자의 발현에 유의성있는 변화를 나타내었다. 부가하여, 다른 유전자가 분화적으로 조절되어지는 것으로 지적되고, 이들의 대부분은 세포 주기 조절, 세포질골격의 재생 및 멤브레인 교접과 같은 과정에 포함될 수 있다는 것이 알려져있다(Scarlato 등, 2000).
오스테오폰(Osteopontin)은 골 및 치아의 광물화된 세포외의 매트릭스의 현저한 구성성분인 높게 인산화된 시알로프로테인이다. OPN은 폴리아스파르트 산 시퀀스 및 하이드록시아파타이트 결합(hydroxyapatite binding)을 매개하는 Ser/Thr 인산화반응의 사이트의 존재와 세포 부착/신호화를 매개하는 크게 보전된 RGD 모티브(motif)에 의해 특징되어진다. 다양한 조직에서의 오스테오폰틴의 발현은 하나 또는 그 이상의 이들 보전된 모티브를 포함하는 기능의 다양성을 나타낸다. OPN "녹아웃" 마우스들에서 명확한 표현형의 결여가 조직에서의 오스테오폰틴에 대한 명확한 역활이 확립되지 않았지만, 최근 연구는 전개적 과정, 상처 치료, 면역학적 반응, 종양형성, 골 흡수, 및 칼슘침착을 포함하는 다양한 생물학적 사건에 있어 이들 프로테인의 다양성에 있어 몇몇 신규하고 암시적인 통찰을 제공한다. 몇몇 상호활성인 신호화 경로에 연결된 복합 수용체를 통한 세포 활성을 자극하기 위한 오스테오폰틴의 능력은 상당한 기능적 다양성에 고려될 수 있다(Sodek 등).
오스테오폰틴은 또한 신경 세포체 및 축삭 양자에서, 랫트의 척추 및 삼배 근육계에서의 일차 감각 뉴론에서 발현되어지는 것으로 알려져있다.(Ichikawa 등, 2000).
오스테오폰틴 mRNA는 하이브리드형성 그 자체에 의해 나타난것 같이 성인 뇌에서 발현된다. 발현은 후각 벌브(bulb)의 뉴론과 뇌 줄기에서 발견되고, 후자에서 이것은 운동 관련 영역, 감각계 및 망막의 형성을 포함하는 기능적으로 다양한 영 역에서 발견된다(Shin 등, 1999).
다른 연구는 렛트에서 일시적인 전뇌 빈혈에 따른 오스테오폰틴 mRNA의 이격적 및 잠정적인 발현이 조사되었다. 구의 빈혈 후에 OPN mRNA의 일시적인 유도는 해마에서 보다는 선조체에서 조기에 일어난다. 이것은 미세신경교의 세포가 보다 반응성으로 되기 전에 측면 도관에 밀접한 배중간의 선조체와 해마의 CA1 서브필드 및 지각에서 나타난다. 이것은 또한, 치상의 문(hilus)에서 그리고, CA3에서는 적은 정도로 검출된다(Lee MY, Shin SL, Choi YS, Kim EJ, Cha JH, Chun MH, Lee SB, Kim SY, Neurosci Lett 1999 Aug 20 271:2 81-4).
오스테오폰틴은 또한 Eta-1로 명명된다. WO 00/63241은 면역 반응을 조절하는 방법, 특히 Eta-1(조기 T 림프구 활성화-1)/오스테오폰틴의 조절자를 사용하여 타입1의 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다. 오스테오폰틴 조절자는 감염, 면역 장애 및 질환, MS를 포함하는 자가면역 장애, 다양한 면역결핍증, 및 암의 치료에 유용하다고 기술된다. MS를 포함하는 자가면역 장애에 유용한 것으로 여겨지는 WO 00/63241에 개시된 오스테오폰틴의 모든 조절자는 WO 00/63241의 51 내지 53페이지의 V 부분의 "Clinical Applications of the Modulatory 방법 of 본 발명은", D "Autoimmune Diseases"에서 자세하게 설명되는 바와 같이 오스테오폰틴/Eta-1의 저해자이다.
인터페론은 항-염증성, 항바이러스성 및 항증식성 활성안티을 보이는 사이토킨류의 아류이다. 생화학 및 면역학적 특성에 기초하여, 자연적으로 발생하는 인간 인터페론은 세개의 군으로 분별된: 인터페론 알파(류코사이트), 인터페론 베타(섬 유아세포) 및 인터페론 감마(면역;immune). 알파-인터페론은 현재 미국 및 다른 나라에서 모양세포성백혈병, 성병사마귀, 카포시육종(Kaposi's Sarcoma)(후천성면역결핍증(AIDS)에 걸린 환자에 공통적으로 나타나는 암), 및 만성의 비-A형, 비-B형 간염의 치료를 위해 승인되어있다.
더욱이, 인터페론(IFNs)은 글리코프로테인은 바이러스성의 감염에 반응하여 신체에 의해 생산된다. 이들은 보호된 세포에서 바이러스의 증식를 저해한다. 저분자량 프로테인인, IFNs는 이들의 작용에 있어 현저하기로는 비특정적인데, 즉 일 바이러스에 의해 유도된 IFN는 광범위한 다른 바이러스에 대해 유효하다. 그러나, 이들은 종-특정적인데, 즉 일 종에 의해 유도된 IFN는 단지 같거나 밀접하게 관련된 종의 세포에서만 항바이러스성의 활성을 자극할 것이다. IFNs는 이들의 잠재적인 항종양 및 항바이러스성의 활성에 대해 탐구되어진 제일 군의 사이토킨류이다.
세 개의 주요한 IFNs는 IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ로 언급된다. 이런 주요 종의 IFNs는 이들의 유래 세포(류코사이트, 섬유아세포 또는 T 세포)에 따라 먼저 분류된다. 그러나, 몇몇 종류는 하나의 세포에 의해 생산될 것이라는 것은 명백하다. 따라서, 류코사이트 IFN는 IFN-α, 섬유아세포 IFN은 IFN-β 및 T 세포 IFN는 IFN-γ로 불린다. 또한, 류코사이트 및 섬유아세포 IFN의 혼합물을 생산하는 것으로 보이는 "나말와(Namalwa)"세포 라인(버킷(Burkitt's) 림프종으로부터 유래)에서 생산된 림프아세포 IFN인 제사 타입의 IFN이 있다.
인터페론 단위는 바이러스의 손상에 대해 세포의 50%를 보호하기에 필요한 양으로 정의된(얼마간은 임의적임) IFN 활성도의 측정으로 보고되었다.
모든 분류의 IFN은 몇개의 명확한 타입을 포함한다. IFN-β 및 IFN-γ는 각각 단일 유전자의 산물이다. 개개 타입의 차이는 글루코스화의 다양성에 주로 기인되는 것으로 여겨진다.
IFNs-α는 약 15 종류를 포함하는 가장 다양한 군이다. 그중 15개는 활성이고 전사되는 적어도 23 구성분을 포함하는 크로모좀 9 상에 INF-α유전자의 군집이 있다.
IFNs-α 및 IFN-β는 모두 유사한 생물학적인 활성을 갖는 같은 길이(165 또는 166 아미노산)이다. IFNs-γ는 길이가 146 아미노산이고, α 및 β분류에 덜 밀접하게 닮았다. 단지 IFNs-γ만이 마크로파지를 활성화하거나 또는 킬러(killer) T 세포의 성숙을 유발한다. 효과에 있어서, 이들 새로운 타입의 치료적인 제제는 이들이 면역조절을 통해 인식에 영향을 미치는 종양의 기관에 감응하는 효과를 가지기 때문에 생물학적 반응 수식자(BRMs)라고 불릴 수 있다.
특히, 인간 섬유아세포 인터페론(IFN-b)은 항바이러스성의 활성을 가지고 또한 신생물의 세포에 대해 자연적인 킬러 세포를 자극할 수 있다. 이것은 바이러스와 이중쇄 RNA에 의해 유도된 약 20,000 Da의 폴리펩티드이다. 재조합 DNA 기술에 의해 크론된 섬유아세포 인터페론에 대한 유전자의 뉴클레오티드 시퀀스로부터, Derynk 등(Derynk R. 등, 1980)은 프로테인의 완전한 아미노산 시퀀스를 연역해냈다. 이것은 166 아미노산 길이이다.
Shepard 등(Shepard H. M. 등, 1981)은 그의 항-바이러스성의 활성이 없어진 염기 842(141위치에서 Cys →Tyr)에서의 변이와 뉴클레오티드 1119-1121의 결손을 갖는 다양한 클론을 기술한다.
Mark 등(Mark D.F. 등, 1984)은 17 위치에서 Cys →Ser으로부터 아미노산을 바뀌게하는 염기 469 (T)를 (A)로함에 의한 인위적 변위를 주장했다. 얻어진 IFN-β는 "선천성" IFN-β로 활성이고, 장시간의 보전(-70℃) 동안 안정한 것으로 보고되었다.
Rebif™(재조합 인간 인터페론-β)는 다중 경화증(MS)에 대한 인터페론 치료에서 가장 최근의 발전으로 치료에 있어 유의성있는 진보를 나타낸다. Rebif™는 척추동물 세포 라인으로부터 생산되는 인터페론(IFN)-베타 1a로 자연적으로 인간 분자를 일으키는 것에 실제 동등하다.
IFN가 그들의 효과를 발휘하는 메카니즘이 완전히 이해되지는 않는다. 그러나, 대부분의 경우에 있어, 이들은 어떤 유전자의 유도 및 전사에 영향을 미침에 의해 작용하고 따라서, 면역 시스템에 영향을 미친다. 생체외에서 연구는 IFN가 약 20가지 유전자 산물을 유도하거나 억제할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
IFN-βMS에서 세가지 주요 경로에 의해 작용할 수 있다:
■세포 기능 활성, 증식 및 억제자와 같은 T-세포 기능의 조절;
■사이토킨류의 생산 조정: 전염증성의 사이토킨류의 다운-레귤레이션 및 항염증성의 사이토킨류인 저해의 엎-레귤레이션;
■CNS 안으로 BBB를 통해 T-세포 이동 및 침투(혈액 뇌 경계).
PRISMS 연구는 재발성-이장성 다중 경화증(RR-MS)의 치료에서 주 당 3회 피하로 주어진 인터페론 베타-1a의 효능성을 확립하였다. 이 연구는 인터페론 베타- 1a가 MRI에 의해 측정된 질환과 질환 활성의 부담을 감소하고 재발의 심각성과 그횟수를 줄임에 의해 MS의 장기간 코스에 긍정적인 영향을 줄 수 있다는 것을 보여주었다("재발성-이장성 다중 경화증에서 인터페론 베타-1a의 랜덤화된, 이중-브라인드, 위약-조절된 연구", The Lancet 1998; 352 (7 November, 1998): 1498-1504.).
여기서 어떤 문헌의 인용은 이런 문헌이 적당한 종래기술이거나 또는 본 출원의 어느 청구항의 특허성에 대한 재료로 고려된다는 승인으로서 의도하는 것은 아니다. 문헌의 내용에 대한 기술이나 데이타는 출원인이 출원시에 이용할 수 있는 정보에 기한 것이고, 이런 기술의 바름에 대한 승인을 구성하는 것은 아니다.
본 발명의 목적은 신경계의 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 새로운 수단을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 프로테인 오스테오폰틴이 신경교의 세포 증식 및 분화를 증진하고 따라서, 신경의 미엘린화와 재생을 증진한다는 발견에 기초한다. 본 발명에 따르면, 더욱이 다중 경화증 및 말초신경병증의 동물모델에서 유익한 효과를 갖는다는 것이 발견되었다.
따라서, 본 발명은 외상성 신경 손상, 스트로크, CNS 또는 PNS의 탈수초 질환, 신경병증 및 신경퇴화적 질환과 같은 신경계의 질환에서 오스테오폰틴, 오스테오폰틴 활성의 어고니스트의 사용에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 오스테오폰틴은 또한, 신경계의 질환의 치료 및/또는 예 방을 위해 인터페론과 조합하여 사용될 수 있다. 신경계의 질환의 치료 및/또는 예방을 위해, 오스테오폰틴을 포함하는 발현 벡터 및 핵산 분자, 및 오스테오폰틴을 발현하는 세포의 사용 또한 본 발명의 범위 내이다. 더욱이 본 발명은 오스테오폰틴 및 인터페론을 포함하고, 임의적으로 하나 또는 그이상의 약학적으로 수용할 수 있는 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
도 1A는 3/5 w. Cup = 삼 또는 오주의 큐퍼리죤(cuprizone) 처리, 5 w. cup + 1/3/6 w. = 오주의 큐퍼리죤 처리와 회복의 일/삼 또는 육주의 철회 후의 TaqMan™분석기로 측정된 것으로, 다른 시간의 큐퍼리존 처리 후 오스테오폰틴 발현의 수준을 나타내는 히스토그램이고,
도 1B는 소뇌의 전개의 다른 단계에서 TaqMan™에 의해 측정된 것으로 대조 C1에 비하여 오스테오폰틴, MBP 및 PLP mRNA의 조절을 나타내고, C 1 내지 20 = 생후의 1 내지 20일에서의 소뇌, CA = 성인 소뇌이고,
도 2는 오스테오폰틴의 구조 및 그의 공지된 이소형 뿐 아니라 C 및 N 말단 구성을 개략적으로 나타내고,
도 3은 오스테오폰틴에 대한 시퀀를 코드하는 것을 포함하는 플라스미드 Pac을 개략적으로 나타내고,
도 4는 대조군에 비교된 6 h (1), 2 d (2), 6 d (3) 또는 10 d (4)에 대한 cAMP로 처리된 희돌기교세포 세포 라인 올리-뉴(올리-뉴)에서 오스테오폰틴 mRNA의 폴드 업레귤레이션을 도시하는 히스토그램을 나타내고, 컬럼 5 및 6은 큐퍼리죤 실 험으로부터 오스테오폰틴 mRNA 준위를 나타내고, (5): 큐퍼리죤 처리의 3 주, (6): 큐퍼리죤 처리의 5주,
도 5는 오스테오폰틴 코딩 시퀀스를 포함하는 플라스미드 pDEST 12.2를 개략적으로 도시하고,
도 6은 오스테오폰틴 코딩 시퀀스 더하기 형광 마커인 EGFP의 코딩 시퀀스를 포함하는 플라스미드 pDEST 12.2를 개략적으로 도시하고,
도 7은 HIS-태그(tag)를 갖는 오스테오폰틴 코딩 시퀀스를 포함하는 플라스미드 pDEST 12.2를 개략적으로 도시하고,
도 8은 인슐린 고갈 및 바큘로바이러스 (baculovirus)에 발현된 오스테오폰틴(Baculo-OPN) 또는 HEK 세포 발현 오스테오폰틴(HEK-OPN)으로 처리 24시간 후 올리-뉴 세포의 증식을 나타내는 것으로, 판독은 알마 블루(Alamar Blue)의 형광 및 살아있는 세포를 스테이닝 염색으로 하고,
도 9는 바큘로바이러스 발현 오스테오폰틴(BAC-OPN) 또는 HEK 세포 발현 오스테오폰틴(HEK-OPN)으로 처리 24시간 후 인슐린 고갈된 올리-뉴 세포의 증식의 복용량에 따른 반응 곡선을 나타내고,
도 10은 인슐린 고갈 및 완전한 길이의 바큘로바이러스 발현 오스테오폰틴(BacOPN) 뿐 아니라 오스테오폰틴의 N-말단 분획(N-말단 BacOPN)으로 처리한 후 올리-뉴 세포의 증식을 나타내고,
도 11은 100 nM의 바큘로바이러스 발현 재조합 오스테오폰틴으로 처리된 혼합 피질성의 배양에 있어 MBP 면역조직화학을 나타내는 것으로, A = 대조군 ; B = OPN 처리; C = B의 확대; D = OPN 처리 혼합 피질성의 세포의 다른 영역으로, 여기서는 축삭이 관찰되지않음,
도 12는 ELISA에 의해 측정된 것으로 LIF 및 바큘로바이러스 발현 오스테오폰틴 처리 후 혼합된 피질성 배양인 미엘린화에 있어 MBP 프로테인의 증가를 나타내고,
도 13은 생체외에서 인산화된 대장균(E. coli) 발현 오스테오폰틴(OPN-E-coli) 또는 바큘로바이러스 발현 오스테오폰틴(OPN Bac)의 다른 복용량(10 pM, 10 nM, 100 nM)으로 처리된 후 CG4 세포의 증식을 나타내고,
도 14는 담체(PBS), 담체 플러스 0.1% BSA, 1, 10 또는 100 mg/kg의 AS900011(오스테오폰틴) 또는 100mg/kg AS900011 및 20000 U/마우스 뮤린 인터페론 베타(mIFNb)의 조합 또는 20000U/마우스 mIFNb 단독으로 피하로 처리된 EAE 마우스의 척추에 존재하는 혈관 주위의 염증성의 침투를 도시하고,
도 15는 담체(PBS), 담체 플러스 0.1% BSA, 1, 10 또는 100 mg/kg의 AS900011(오스테오폰틴) 또는 100mg/kg AS900011 및 20000 U/마우스 뮤린 인터페론 베타(mIFNb)의 조합 또는 20000U/마우스 mIFNb 단독으로 피하로 처리된 EAE 마우스의 척추에 존재하는 탈수초 영역의 백분율을 도시하고,
도 16은 담체(PBS), 담체 플러스 0.1% BSA, 1, 10 또는 100 mg/kg의 AS900011(오스테오폰틴) 또는 100mg/kg AS900011 및 20000 U/마우스 뮤린 인터페론 베타(mIFNb)의 조합 또는 20000U/마우스 mIFNb 단독으로 피하로 처리된 EAE 마우스에서 염증성의 침투 및 탈유수화를 처리의 말단에 임상적 스코어로 도시하고,
도 17은 담체, 1, 10 또는 100 mg/kg의 오스테오폰틴 (Ost), 10 mg/kg의 긍정적인 조절화합물(4-MC) 또는 100 mg/kg의 변성된 오스테오폰틴 (Ost-D)으로 처리된 좌골 신경 압좌에 의해 유발된 신경병증의 마우스의 체중을 나타내고,
도 18은 담체, 1, 10 또는 100 mg/kg의 오스테오폰틴 (Ost), 10 mg/kg의 긍정적인 조절화합물(4-MC) 또는 100 mg/kg의 변성된 오스테오폰틴 (Ost-D)으로 처리된 신경병증 마우스에 있어 잠정적인 근육 작용 화합물의 증폭도를 나타내고,
도 19는 담체, 1, 10 또는 100 mg/kg의 오스테오폰틴 (Ost), 10 mg/kg의 긍정적인 조절화합물(4-MC) 또는 100 mg/kg의 변성된 오스테오폰틴 (Ost-D)으로 처리된 신경병증 마우스에 있어 잠정적인 근육 작용 화합물의 잠복기를 나타내고,
도 20은 담체, 1, 10 또는 100 mg/kg의 오스테오폰틴 (Ost), 10 mg/kg의 긍정적인 조절화합물(4-MC) 또는 100 mg/kg의 변성된 오스테오폰틴 (Ost-D)으로 처리된 신경병증 마우스에 있어 잠정적인 근육 작용 화합물의 지속시간을 나타내고,
도 21은 담체, 1, 10 또는 100 mg/kg의 오스테오폰틴 (Ost), 10 mg/kg의 긍정적인 조절화합물(4-MC) 또는 100 mg/kg의 변성된 오스테오폰틴 (Ost-D)으로 처리된 신경병증 마우스에 있어 퇴화된 섬유의 백분율을 나타내고,
도 22는 담체, 1, 10 또는 100 mg/kg의 오스테오폰틴 (Ost), 10 mg/kg의 긍정적인 조절화합물(4-MC) 또는 100 mg/kg의 변성된 오스테오폰틴 (Ost-D)으로 처리된 신경병증 마우스에 있어 영역 당 전체의 섬유 수를 나타낸다.
본 발명은 오스테오폰틴이 희돌기교세포 분화 및 소뇌의 전개 간에 다르게 발현된다는 발견에 기초한다. 더욱이, 희돌기교세포에서 오스테오폰틴 cDNA의 발현은 생체외에서 이들 세포의 차별된 표현형을 이끈다는 것이 발견되었다. 오스테오폰틴의 발현에 의해, 희돌기교세포는 분화된 미엘린화 세포의 표현형에 유사한 표현형을 나타낸다. 이들 생체외에서의 발견에 부가하여, 오스테오폰틴, 및 특히 오스테오폰틴과 인터페론의 조합은 다중 경화증의 확립된 모델에 있어 유익한 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. 말초 신경병증의 실험적인 모델에 있어, 오스테오폰틴은 신경 활성에 대한 공고화된 유익한 효과를 가지고, 퇴화의 백분율을 유의성있게 감소하고 미엘린화의 정도를 고양한다.
여기서 나타난 실험적 증거는 따라서 신경계의 질환, 특히 신경 및 신경교의 세포 기능에 관계된 질환을 치료하는 새로운 가능성에 대해 제공한다. 이들 발견은 WO 00/63241가 다중 경화증을 치료하기 위해 오스테오폰틴을 저해해야 한다고 기술하기 때문에 특히 놀라운 것이다.
본 발명은 따라서 신경계의 질환의 치료 및/또는 예방에 대한 치료제의 조제에 오스테오폰틴, 또는 오스테오폰틴 활성의 어고니스트의 사용에 관한 것이다.
여기서 사용된 용어 "오스테오폰틴"은 18세기 후반이래로 알려진(Oldberg 등, 1986; Kiefer 등, 1989) 아미노산 시퀀스를 갖는 완전한 길이의 인간 오스테오폰틴에 관한 것이다. 인간 오스테오폰틴의 시퀀스는 여기서 첨부된 시퀀스 리스트의 SEQ ID NO: 1으로 보고된다. 여기서 사용된 용어 "오스테오폰틴"은, 더욱이 오스테오폰틴 활성을 유지하기 위해 충분한 동정성이 있고, 얻어진 분자가 인간에 면역원성이 아니기만 하다면, 쥐, 송아지 또는 랫트의 오스테오폰틴과 같이 동물로 부터 유래된 오스테오폰틴에 관한 것이다.
여기서 사용된 용어 "오스테오폰틴"은 자연적으로 오스테오폰틴의 이성형을 일으키는 것과 같은 생물학적으로 활성인 뮤테인 및 분획에 관한 것이다. 오스테오폰틴은 전사(대안적 스플라이싱(splicing)) 및 후번역 수사(인산화, 글루코스화)의 준위에서 다른 기능적으로 뚜렷한 형태를 발현한다. OPN의 스플라이스 다양성은 OPN-a (또한 여기서는 완전한-길이 오스테오폰틴), OPN-b 및 OPN-c (첨부된 시퀀스 리스트의 SEQ ID NO: 1, 2 및 3, 또한 도 2에 나타남)로 나타난다. 이성형은 즉, Kon 등(2000)에 의해 기술되고, 즉, Saitoh 등(1995)과 Kon 등(2002)에 의해 특징된다.
트롬빈 단리는 프로테인의 N- 및 C-말단 부를 포함하는 생체내에서 두 개의 단백분해의 단리 분획을 이끈다. 오스테오폰틴, 특히 프로테인의 C-말단 부의 인산화는 오스테오폰틴 기능에 중요할 수 있다. 여기서 사용된 용어 "Osteopontin"은 따라서 또한 이들 단백분해의 분획 및 분화적으로 인산화된 오스테오폰틴 형을 포괄하는 것을 의미한다.
여기서 사용된 용어 "오스테오폰틴"은 더욱이 이소형, 뮤테인, 접합된 프로테인, 기능적 유도체, 활성적인 분획, 또는 순환적으로 변이된 유도체 또는 이들의 염을 포괄한다. 이들 이소형, 뮤테인, 접합된 프로테인, 기능적 유도체, 활성적인 분획, 또는 순환적으로 변이된 유도체는 오스테오폰틴의 생물학적 활성을 보유한다. 바람직하기로는, 이들은 야생 타입 오스테오폰틴에 비해 개선된 생물학적 활성을 가진다.
여기서 사용된 용어 "오스테오폰틴 활성의 어고니스트"는 오스테오폰틴 수용체를 통해 신호를 활성화하는 적은 분자량의 어고니스트 또는 오스테오폰틴 수용체의 작용물질적인 항체와 같은 오스테오폰틴 활성을 흉내내거나 자극하는 분자에 관한 것이다.
오스테오폰틴은 적어도 두 그룹의 수용체를 통해 그 기능을 중재한다. 먼저, 이것은 αν-인테그린(integrin)(망간의 양성적 영향하에 RGD (Arg-Gly-Asp) 세포부착 모티브를 통해 ανβ3 및 ανβ5 인테그린 수용체(Kunicki 등, 1997))과 상호작용한다. 두번째로, 이것은 CD44 변형 이소형 ν6-ν10와 상호작용한다. 오스테오폰틴의 C-말단은 CD44와의 상호작용에 포함된다고 여겨지며, 오스테오폰틴의 N-말단은 마이크로파아지의 증식, 생존 분화 및 인테그린 수용체와의 상호작용에 포함된다고 여겨진다. 오스테오폰틴의 N-말단은 또한 IL-12 및 IL-10 방출을 유도한다. 이들 수용체의 어떤 어고니스트, 자극자 또는 고양자는 여기서 사용된 용어 "OPN 활성의 어고니스트"에 포함된다.
여기서 사용된 용어 "오스테오폰틴 활성의 어고니스트"는 더욱이 세포 손상 및 아파토시스(apoptosis)로부터 희돌기교세포 연계의 세포의 보호를 증진하기 위해, 희돌기교세포 연계의 세포(후대 또는 전구체 세포)의 모집, 증식, 분화 및 성장을 증진하기 위해, 세포외 매트릭스 구성성분에 세포 부착의 증진, 미엘린 생성 세포로 희돌기교세포 연계의 세포의 형태발생과 같은 오스테오폰틴 중재 활성을 고양하는 제제에 관한 것이다.
여기서 사용된 용어 "치료" 및 "예방"은 신경계의 질환 뿐 아니라, 신경계의 질환을 수반하는 증상, 질환 또는 연루의 하나 또는 그 이상의 증상 또는 원인을 예방, 저해, 완화, 개선 또는 역위하는 것으로 이해되어진다. 신경계의 질환을 "치료"하는 때, 본 발명에 따른 기질은 질환의 발현 후에 주어지고, "예방"은 질환의 증상이 환자에게서 감지될 수 있기 전에 기질의 투여에 관한 것이다.
여기서 사용된 용어 "신경계의 질환"은 "본 발명의 배경기술"에서 상세히 설명된 것을 포함하는 모든 공지의 신경계의 질환 또는 장애, 또는 CNS 또는 PNS의 손상을 포괄한다.
신경계의 질환은 신경전달에 관련된 질환 질환, 두통, 머리의 외상, CNS 감연, 신경-안과의 및 두개의 신경 장애, 운동의 뇌엽의 기능 및 기능이상 , 무감각 및 혼수, 탈수초 질환, 섬망 및 치매, 두개경수의 연결 이상, 발작 장애, 척추 장애, 수면 장애, 말초신경계의 장애, 뇌혈관 질환, 또는 근육 장애와 같은 CNS 또는 PNS의 기능 이상에 연계된 질환을 포함한다. 이들 질환의 정의는 http://www.merck.com/pubs/mmanual/ section14/sec14.htm를 참고.
바람직하기로는, 본 발명의 신경계의 질환은 외상성 신경 상해, 스트로크, CNS 또는 PNS의 탈수초 질환 및 신경퇴화적 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다.
외상성 신경 상해는 PNS 또는 CNS에 관련될 수 있고, 이것은 상기 "본 발명의 배경기술"에서 설명된 것으로, 양하지마비를 포함하는 뇌 또는 척추 외상일 수 있다.
스트로크 저산소증 또는 뇌의 빈혈에 의해 유발될 수 있다. 이것은 또한 뇌혈관 질환 또는 사고로 명명된다. 스트로크는 뇌의 영역에 혈액 순환의 손실에 이 해 야기된 뇌 기능의 상실(신경계의 결손)을 포함할 수 있다. 혈액 순환의 손실은 뇌에 형성된 혈액 덩어리(혈전), 또는 다른 영역으로부터 뇌로 유주하는 아테롬성경화증 플라그 편 또는 기타 물질(emboli)에 기인될 수 있다. 뇌에서의 피흘림(출혈)은 스트로크에 유사한 증상을 야기할 수 있다. 스트로크의 가장 공통적인 원인은 아테롬성경화증(뇌의 혈전증)에 이차적인 스트로크이고, 따라서 본 발명은 또한 아테롬성경화증의 치료에 관련된다.
근위 신경병증은 감각 상실증, 근육 병약 및 위축, 감소된 심 건 이완, 및 혈관운동 증상에, 단독 또는 어떤 조합으로 관련될 수 있다. 신경병증은 단일 신경 (단일신경병증), 별개 영역에서 둘 또는 그 이상의 신경(다중 단일신경병증), 또는 동시적으로 많은 신경(복합신경병증)에 영향을 미칠 수 있다. 축삭이 일차적으로 영향을 받거나(즉, 당뇨 멜리투스, 라임(Lyme) 질환, 또는 뇨독증 또는 독성제제를 갖는 뇨독증에서), 또는 미엘린 초 또는 슈반 세포가 영향을 받을 수 있다(즉. 급성 또는 만성의 염증성의 복합신경병증, 백질이영양증, 또는 길라인 바르 신드롬에서). 더욱이, 본 발명에 따라 치료될 수 있는 신경병증은 즉, 납 독성, 답손(dapsone) 사용, 진드기에 물림, 포르피린증, 또는 길라인 바르 신드롬에 기인한 것일 수 있고, 이들은 일차적으로 운동 섬유에 영향을 미칠 수 있다. 암의 배근 신결절증, 나병, AIDS, 당뇨 멜리투스, 또는 만성의 피리독신 중독에 기인된 것과 같은 기타의 것은 배근 신경절 또는 감각 섬유에 일차적으로 영향을 미칠 수 있어 감각 증상을 생성한다. 두개의 신경이 또한 포함될 수 있는데, 즉, 길라인 바르 신드롬, 라임 질환, 당뇨 멜리투스 및 디프테리아에서 포함될 수 있다.
알쯔하이머 질환은 뇌 조직에서 변화로부터 유래하는 정신적 기능에서의 퇴화를 포함하는 장애이다. 이는 뇌 조직의 수축, 일차적인 변성의 치매 및 산재성의 뇌위축을 포함할 수 있다. 알쯔하이머 질환은 또한 노인성 치매/알쯔하이머 타입(SDAT)으로 불린다.
파킨슨 질환은 보행, 운동 및 조합의 흔들림 및 어려움의 장애이다. 이 질환은 근육 운동을 조절하는 뇌의 부분의 손상에 연관되고, 또한 이것은 마비 아지탄(agitans) 또는 흔들림 마비로 불린다.
헌팅톤 질환은 유전된, 상염색체성의 우성 신경계의 질환이다.
아미프트로픽(Amyptrophic) 측삭경화증인, ALS는 수의근의 신경 조절의 진행성 손실을 야기하는 장애로, 뇌 및 척추에서 신경 세포의 파손을 포함한다. 루 게릭 질환으로 불리는 근위축성 측삭경화증은 또한 근육의 사용 및 조절의 손실을 포함하는 장애이다.
다중경화증 (MS)은 재발성-이장성 또는 진행성 경로를 갖는 중추신경계(CNS)의 염증성의 탈수초 질환이다. MS는 유일한 탈수초 질환이 아니다. 말초신경계 (PNS)에 있어서 그의 대응부는 만성 염증성 탈수초 다발성신경근염(CIDP)이다. 부가하여, PNS에서 길라인 바르 신드롬(GBS)으로 불리는 염증성 탈수초 다발성신경근염, 및 CNS에서 급성 산재성 뇌척수염(ADEM)과 같은 급성 단일상 장애이다.
더욱이 신경계의 장애는 상기 본 발명의 "배경기술"에서 기술된 것 뿐 아니라 수근의 터널 신드롬과 같은 비정상 미엘린화를 갖는 신경병증을 포함한다. 외상성 신경 상해는 척주 정형의 합병증에 수반될 수 있고, 또한 이들은 본 발명에 따 른 질환 내이다.
신경계 장애는 더욱이 선천성 대사장애에 기인될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 신경계의 질환은 따라서 선천성 대사성 결손에 기인한다.
본 발명에 포괄 되는 선천성 대사장애는 즉, 페닐케톤뇨증 및 기타 아미노산뇨증, 테이-삭(Tay-Sachs), 니만-픽크(Niemann-Pick), 및 가우처(Gaucher's) 질환, 허러(Hurler's) 신드롬; 클랩(Krabbe's) 질환 및 기타 백질이영양증을 포함할 수 있다. 이들은 주로 CNS에서 미엘린 초 전개에 영향을 미칠 수 있다.
선천성 대사장애에 기인된 신경계의 질환은 또한 본 발명의 "배경기술"에서 상세히 기술되었다.
신경섬유종증, 또는 다중 시스템 위축(MSA)과 같은 덜 알려진 신경계의 질환 또한 본 발명의 범주 내이다. 더욱이, 본 발명에 따라 치료되는 장애는 상기 본 발명의 "배경기술"에서 상세히 기술되었다.
더욱 바람직한 실시형태에서, 신경계의 질환은 말초신경병증이고, 가장 바람직하기로는 당뇨성 신경병증이다. 신경병증에 연계된 화학적 치료가 또한 본 발명에 따라 바람직하다.
용어 "당뇨성 신경병증"은 어떤 형태의 당뇨성 신경병증, 또는 당뇨성 신경병증에 의해 야기된 또는 수반하는 하나 또는 그 이상의 증상 또는 장애, 또는 상기 본 발명의 "배경기술"에서 상세히 기술된 것 같은 신경에 영향을 미치는 당뇨의 합병증에 관한 것이다. 당뇨성 신경병증은 복합신경병증일 수 있다. 당뇨성 복합신경병증에서, 많은 신경이 동시적으로 영향을 받는다. 당뇨성 신경병증은 또한 단일 신경병증일 수 있다. 병소의 단일신경병증에서, 예를 들어, 질환은 동안의 또는 두개의 외전신경같은 단일 신경에 영향을 미친다. 이것은 또한 두개 이상의 신경이 별개의 영역에서 영향을 미칠때 다중 단일신경병증일 수 있다.
더욱 바람직한 실시형태, 신경계의 장애는 탈수초 질환이다. 탈수초 질환은 바람직하기로는 급성 산재성 뇌척수염(ADEM) 및 다중 경화증(MS)과 같은 CNS의 탈수초 상태 뿐 아니라 말초신경계(PNS)의 탈수초 질환을 포함한다. 후자는 만성의 염증성의 탈수초 다발성신경근염(CIDP) 및 길라인 바르 신드롬(GBS)이라 불리는 염증성의 탈수초 다발성신경근염과 같은 급성 단일상 장애와 같은 질환을 포함한다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시형태는 신경퇴화적 질환의 치료 및/또는 예방에 관한 것이다. 신경퇴화적 질환은 알쯔하이머 질환, 피키슨 질환, 헌팅톤 질환 및 ALS로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직하기로는, 오스테오폰틴은 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 펩티드, 폴리펩티드 또는 프로테인으로부터 선택된다:
(a)SEQ ID NO: 1을 포함하는 폴리펩티드;
(b)SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 168 또는 170을 포함하는 폴리펩티드;
(c)SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 16 및 170 내지 314를 포함하는 폴리펩티드;
(d)SEQ ID NO: 1의 아미노산 170 내지 314를 포함하는 폴리펩티드;
(e)SEQ ID NO: 2을 포함하는 폴리펩티드;
(f)SEQ ID NO: 3을 포함하는 폴리펩티드;
(g) (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 뮤테인 , 여기서 아미노산 시퀀스는 (a) 내지 (f)내의 적어도 하나의 시퀀스에 적어도 40 % 또는 50 % 또는 60 % 또는 70 % 또는 80 % 또는 90 % 동일함;
(h) 온화한 긴장 상태 또는 아주 긴장된 상태 하에서 (a) 내지 (f) 중 어느 것을 엔코딩하는 원래 DNA 시퀀스의 보체를 접합하는 DNA 시퀀스에 의해 엔코드된 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 뮤테인;
(i) (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 뮤테인, 여기서 아미노산 시퀀스의 어떤 변화는 (a) 내지 (f) 에서 아미노산 시퀀스에 대해 아미노산 치환체를 보전함;
(j) (a) 내지 (f) 중 어느 것의 염 또는 이성형, 융합된 프로테인, 기능적 유도체, 활성 분획 또는 순환적으로 전변이된 유도체.
활성 조각 또는 분획은 도 2에 도시된 바와 같은, N-말단 부 또는 C-말단 부와 같은 오스테오폰틴 이성형의 어느 부분 또는 영역, 또는 OPN-a, -b, 또는 -c의 어느 것을 포함할 수 있다. GRGDS 모티브는 존재될 수 있고, 또는 없을 수 있고, 또는 변이될 수 있다. 헤파린 결합 사이트는 헤파린-결합이 없는 오스테오폰틴을 부여하기 위해 변이될 수 있다. 완전한 길이의 오스테오폰틴, 또는 이들의 활성 분획은 다음 위치에서의 세린 잔기와 같이 하나 또는 그 이상의 다음의 세린 잔기에서 인산화될 수 있는다: 8, 10, 11, 33, 46, 47, 60, 62, 65, 83, 86, 89, 92, 101, 104, 107, 110, 113, 153, 155, 175, 179, 199, 203, 208, 212, 218, 223, 227, 238, 242, 247, 251, 254, 259, 264, 275, 287, 292, 294, 295. 부가적으로, 세린 인산화 사이트는 인산화반응을 닮기위해 세린으로부터 글루타메이트 잔기로 변이될 수 있다.
이 분야의 숙련가는 보다 적은 오스테오폰틴 부분조차 오스테오폰틴 기능에 요구되는 필수 아미노산을 포함하는 활성 펩티드와 같은 그 기능을 발휘하기에 충분하다고 인지될 것이다.
이 분야의 숙련가는 더욱이 오스테오폰틴의 뮤테인, 염, 이소형, 접합된 프로테인, 기능적 유도체, 오스테오폰틴의 활성 분획 또는 순환적으로 전변이된 유도체가 유사한 또는 보다 나은 오스테오폰틴의 생물학적 활성을 보유할 것이라고 인지한다. 오스테오폰틴 및 이들의 뮤테인, 이소형, 접합된 프로테인 또는 기능적 유도체, 활성 조각 또는 분획, 순환적으로 전변이된 유도체, 또는 염의 생물학적 활성은 아래 실시예 8에 기술된 것과 같이 동-배양 분석으로 측정될 수 있다. 혼합된 피질성의 배양은 희돌기교세포 뿐 아니라 기타 CNS 유래 세포(뉴론, 성상신경교세포, 소신경교세포같은 것)를 포함하고, OPN 또는 뮤테인, 이소형, 분획, 활성 분획, 기능적 유도체 또는 염과 같이 배양하에, P0, MBP 또는 MAG같이, 미엘린화에 포함된 전형적인 유전자를 유도하거나 상향 조절한다. 이들 유전자의 발현은 양적 실시간(quantitative real time) RT-PCR(TaqMan™RT-PCR) 분석기로 측정되는데, 이는 아래 실시예에서 상세히 기술된다. OPN 활성을 측정하기 위한 더욱 단순한 방법은 올리-뉴 또는 CG4 세포와 같은 적당한 희돌기교세포 세포 라인을 OPN 또는 뮤테인, 이소형, 분획, 활성 분획, 기능적 유도체 또는 염과 같이, 예를 들어 아래 실시예 7에 기술된 것과 같이, 배양하는 것을 포함하는 희돌기교세포 증식 분석이다.
바람직한 활성 분획은 완전한 길이의 오스테오폰틴의 활성보다 우수하거나 동등한 활성을 갖거나, 또는 보다 우수한 안정성 또는 낮은 독성 또는 면역원성과 같은 부가적인 이점을 가지고, 또는 이들은 많은 양으로 생산하기가 쉽고 정제하기도 쉽다. 이 분야의 숙련가는 뮤테인, 활성 분획 및 기능적 유도체가 적당한 플라스미드내에서 대응 cDNA를 크로닝하고 이를 상술한 바와 같이 공-배양 분석에서 시험함에 의해 생성될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 발명에 따른 프로테인은 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있고, 이들은 신체의 유동물과 같은 자연적인 근원으로부터 유래될 수 있고, 또는 이들은 바람직하기로는 재조합적으로 생산될 수 있다. 재조합 발현 대장균(E. coli)과 같은 원핵생물 발현 시스템에서, 또는 곤충 세포와 같은 진핵류에서, 바람직하기로는 CHO-세포 또는 HEK-세포와 같은 포유류에서 수행될 수 있다.
여기서 사용된 용어 "뮤테인"은 오스테오폰틴의 유사화합물로, 자연적인 오스테오폰틴의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기에 의해 대체되거나, 또는 결손되거나, 또는 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가 야생 타입의 오스테오폰틴과 비교하여 생성된 산물의 활성에 상당한 변화가 없이 오스테오폰틴의 자연적인 시퀀스가 부가된 것이다. 이들 뮤테인은 공지된 합성법 및/또는 사이트-다이렉티드 변이발생 기술, 또는 여기에 적당한 기타 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 오스테오폰틴의 뮤테인은 또는 이들을 코드하는 핵산은 여기에 제시된 기술 및 안내에 기하여 불필요한 실험없이 이 분야의 통상인에 의해 일상적으로 수득될 수 있는 치환체 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로 서 실질적으로 상응하는 시퀀스의 제한된 세트를 포함한다.
본 발명에 따른 뮤테인은 온화한 긴장 상태 또는 아주 긴장된 상태 하에서 본 발명에 따른 OPN을 엔코드하는 DNA 또는 RNA에 접합하는 DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 의해 코드된 프로테인을 포함한다. 용어 "긴장된 상태" 하이브리드형성 및 연속하는 수세 상태를 언급하는 것으로 이분야의 통상인에게는 전통적으로 "긴장된"으로 언급된다. Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 및 6.4 (1987, 1992), 및 Sambrook 등(Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., 및 Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)를 참고.
제한없이, 긴장된 상태의 예는 즉, 5분간 2 x SSC 및 0.5% SDS, 15분간 2 x SSC 및 0.1% SDS; 30-60분간 37℃에서 0.1 x SSC 및 0.5% SDS 및 그리고 나서, 30-60분간 68℃에서 0.1?x?SSC 및 0.5% SDS에서 연구하에 하이브리드의 계산된 Tm 아래로 12-20℃로 수세하는 상태를 포함한다. 이 기술 분야의 통상인은 긴장 상태는 또한 DNA 시퀀스, 올리고뉴클레오티드 탐침자(10-40 염기 같은 것) 또는 혼합된 올리고뉴클레오티드 탐침자의 길이에 의존한다고 이해한다. 만일 혼합된 탐침자가 사용되면, SSC 대신에 테트라메틸 암모늄 크로라이드(TMAC)를 사용하는 것이 바람직하다. Ausubel, supra 참고.
바람직한 실시형태에서, 이런 뮤테인은 첨부된 시퀀스 리스트의 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3의 시퀀스와 적어도 40% 동일성 또는 동질성을 가진다. 보다 바람직하기로는, 이것은 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 가장 바람 직하기로는, 적어도 90% 동일성 또는 동질성을 가진다.
동일성은 시퀀스를 비교함에 의해 결정된 둘 또는 그 이상의 폴리펩티드 시퀀스 또는 둘 또는 그 이상 폴리뉴클레오티드 시퀀스 사이의 관계를 반영한다. 일반적으로, 동일성은 비교되어지는 시퀀스의 길이 상에 각각 두 폴리뉴클레오티드 또는 두 폴리펩티드 시퀀스의 상당 아미노산에 대한 아미노산 또는 뉴클레오티드에 대한 정확한 뉴클레오티드를 언급한다.
정확한 대응자가 없는 시퀀스에 대해, "% 동일성"이 결정될 수 있다. 일반적으로, 비교되는 두개의 시퀀스는 시퀀스 사이에 최대의 상관관계를 갖도록 배열된다. 이는 배열의 정도를 고양하기 위해 하나 또는 양 시퀀스에 "갭"을 삽입하는 것을 포함할 수 있다. 동일성 %는 비교되는 각 시퀀스의 전체 길이에 걸쳐 결정될 것이고(소위 글로벌 배열), 이는 같거나 매우 유사한 길이 또는 보다 짧은 한정된 길이에 걸친 시퀀스에 특히 적절하고(소위 로컬 배열), 이는 같지않은 길이의 시퀀스에 가장 적절하다.
둘 또는 그 이상 시퀀스의 동일성 및 동질성을 비교하는 방법은 이 분야에 잘 알려져 있다. 그래서 일예로, 위스콘신(Wisconsin) 시퀀스 분석 팩키지, 버젼 9.1(Devereux J 등1984)에서 이용할 수 있는 프로그램, 예를 들어 프로그램 BESTFIT 및 GAP는 두 폴리뉴클레오티드 사이에 동일성 %과 두 폴리펩티드 시퀀스 사이에 동일성 % 및 동질성 %를 결정하기 위해 사용될 수 있다. BESTFIT는 Smith 및 Waterman(1981)의 "로컬 동질성" 알고리즘을 사용하여 두 시퀀스 사이의 유사성의 최상의 단일 영역을 찾는다. 시퀀스 사이의 동일성 및/또는 유사성을 결정하기 위한 다른 프로그램 또한 이 분야에 알려져 있는데, 예를 들어 프로그램의 BLAST 패밀리(Altschul S F 등, 1990, Altschul S F 등, 1997, www.ncbi.nlm.nih.gov에서 NCBI의 홈페이지를 통해 접근할 수 있음) 및 FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988)이 있다.
본 발명에 따른 뮤테인에 대한 바람직한 변경은 "보전적" 치환체로 알려진 것이다. 오스테오폰틴 폴리펩티드의 보전적 아미노산 치환체는 그룹의 멤버 사이에 치환이 분자의 생물학적 기능을 보전하는 충분하게 유사한 물리화학적 특성을 갖는 그룹 내의 유사한 아미노산을 포함한다(Grantham, 1974). 또한 상기 특정된 시퀀스에서 그들의 특성을 변경함이 없이, 특히 삽입 또는 결손이 단지 적은 아미노산, 즉 30 이하, 바람직하기로는 10 이하를 포함하고, 기능적 형상에 결정적인 아미노산을, 즉 시스테인 잔기를 제거하거나 탈거하지 않는다면, 아미노산의 삽입 및 결여가 만들어질 수 있음은 명확하다. 이런 삽입 및/ 또는 결손에 의해 생성된 프로테인 및 뮤테인은 본 발명의 범주 내이다.
바람직하기로는, 유사 아미노산 그룹은 다음 표 1에 한정된 것이다. 보다 바람직하기로는, 유사 아미노산 그룹은 다음 표 2에 한정된 것이다. 가장 바람직하기로는 유사 아미노산 그룹은 다음 표 3에 한정된 것이다.
[표 1]
유사 아미노산의 바람직한 그룹
아미노산 유사 그룹
Ser Ser, Thr, Gly, Asn
Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His
Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro Gly, Ala, Thr, Pro
Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
Ala Gly, Thr, Pro, Ala
Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
Cys Ser, Thr, Cys
His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn Gln, Asp, Ser, Asn
Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys
Asp Glu, Asn, Asp
Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
Met Phe, Ile, Val, Leu, Met
Trp Trp
[표 2]
유사 아미노산의 보다 바람직한 그룹
아미노산 유사 그룹
Ser Ser
Arg His, Lys, Arg
Leu Leu, Ile, Phe, Met
Pro Ala, Pro
Thr Thr
Ala Pro, Ala
Val Val, Met, Ile
Gly Gly
Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr Phe, Tyr
Cys Cys, Ser
His His, Gln, Arg
Gln Glu, Gln, His
Asn Asp, Asn
Lys Lys, Arg
Asp Asp, Asn
Glu Glu, Gln
Met Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp Trp
[표 3]
유사 아미노산의 가장 바람직한 그룹
아미노산 유사 그룹
Ser Ser
Arg Arg
Leu Leu, Ile, Met
Pro Pro
Thr Thr
Ala Ala
Val Val
Gly Gly
Ile Ile, Met, Leu
Phe Phe
Tyr Tyr
Cys Cys, Ser
His His
Gln Gln
Asn Asn
Lys Lys
Asp Asp
Glu Glu
Met Met, Ile, Leu
Trp Met
본 발명에서 사용하기 위한, 오스테오폰틴의 뮤테인, 폴리펩티드 또는 프로테인을 얻기 위해 사용될 수 있는 프로테인에서 아미노산 치환체의 생산의 예는 Mark 등의 US 특허 4,959,314, 4,588,585 및 4,737,462; Koths 등의 5,116,943, Namen 등의 4,965,195; Chong 등의 4,879,111; 및 Lee 등의 5,017,691; 그리고 US 특허 4,904,584(Shaw 등)에 나타난 라이신 치환 프로테인과 같은 어떤 공지된 단계를 포함할 수 있다.
용어 "접합된 프로테인" 오스테오폰틴, 또는 그들의 뮤테인 또는 분획, 다른 프로테인과 접합된 것, 즉, 신체 유동액에서 신장된 잔류 시간을 가지는 것을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 오스테오폰틴은 따라서 면역글로불린 또는 그들의 분획 같은 다른 프로테인, 폴리펩티드 등에 용융될 수 있다.
여기서 사용된 "기능적 유도체"는 오스테오폰틴의 유도체, 및 이들의 뮤테인 과 접합된 프로테인을 커버하여, 이는 이 분야의 공지된 수단에 의해 잔기 또는 N- 또는 C-말단 기 상에 측쇄로 나타나는 관능기로부터 제조될 수 있고, 이들이 약학적으로 수용할 수 있는 것인 한, 즉 이들이 오스테오폰틴의 활성에 실질저긍로 유사한 프로테인의 활성을 파괴하지 않고, 이를 포함한 조성물에 독성 특성을 부여하지 않는다면 본 발명에 포함된다.
이들 유도체는, 예를 들어 신체 유동액에 항체의 부위를 마스크할 수 있고 오스테오폰틴의 잔류를 신장하는 폴리에틸렌 글리콜 측쇄를 포함한다. 다른 유도체는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 일차 또는 이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아미드, 아실 부분(즉, 알카노일 또는 카르보시클릭 아로일 기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체 또는 아실 부분으로 형성된 유리 하이드록실기(예를 들어, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 것)의 O-아실 유도체를 포함한다.
오스테오폰틴, 뮤테인 및 접합된 프로테인의 "활성 분획"으로, 본 발명은 프로테인 분자 단독 또는 여기에 연결된 연합된 분자 또는 잔기, 즉 상기 분획이 오스테오폰틴에 실질적으로 유사한 활성을 가지기만한다면, 당 또는 인산 잔기, 또는 그 자체에 의한 프로테인 분자 또는 당 잔기의 복합체와 함께 폴리펩티드 사슬의 분획 또는 전구체를 커버한다.
여기서 용어 "염"은 카르복실기의 염 및 OPN 분자 또는 이들의 유사화합물의 아미노기의 산부가염을 언급한다. 카르복실기의 염은 이 분야의 공지된 수단에 의해 형성되어질 수 있고, 예를 들어, 트리에탄올아민, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아민, 피페리딘, 프로카인 등으로 형성된 것으로 유기 기재를 갖는 예를 들어 소듐, 칼슘, 암모늄, 철 또는 아연 염 등과 같은 무기염을 포함한다, 산 부가염은 예를 들어, 염산, 황산과 같은 미네랄산을 갖는 염, 예를 들어, 초산 또는 옥살산과 같은 유기산을 갖는 염을 포함한다. 물론, 이런 염은 본 발명에 따른 OPN의 생물학 적 활성, 즉 희돌기교세포에 대한 증식적 효과를 발휘하는 활성을 보유하여야 한다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 오스테오폰틴은 혈액 뇌 경계("BBB")의 크로싱을 증가하는 캐리어 분자, 펩티드 또는 프로테인에 접합된다. 이는 CNS가 질환에 포함되어진 이들 경우에 작용 부위로 분자를 표적하기에 적절하게하는 작용을 한다. BBB를 통한 약물 전달의 양식은 삼투적인 수단 또는 브래드키닌(bradykinin)과 같은 혈관작용성의 기질의 사용에 의해 생화학적으로 BBB의 파괴를 수반한다. BBB를 통해 가는 다른 전략은 글루코스 및 아미노산 캐리어와 같은 캐리어-중재 전달자; 인슐린 또는 트랜스페린에 대한 수용체-중재 트랜스사이토시스; 및 p-글리코프로테인과 같은 활성 발산 전단자를 포함하는 내인성의 전달계의 사용을 수반할 수 있다. BBB 뒤의 약물 전달 전략은 더욱이 대뇌내의 이식을 포함한다.
오스테오폰틴의 기능적 유도체는 안정성, 반감기, 생체이용가능성, 인체의 내성 또는 면역원성과 같은 프로테인의 특성을 개선하기 위하여 중합체에 융합될 수 있다. 이 목적을 위해, 오스테오폰틴은 즉, 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 연결될 수 있다. PEG화는 예를 들어, WO 92/13095에 기술된 것 같은 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에서, 오스테오폰틴은 PEG화된다.
본 발명의 더더욱 바람직한 실시형태에서, 접합된 프로테인은 이뮤노글로불린(Ig) 용융을 포함한다. 이 용융은 직접적으로되거나, 또는 예를 들어, 길이가 13 아미노산 잔기인 길이에서 1 내지 3 아미노산 잔기 만큼 짧게될 수 있는 짧은 링커 펩티드를 통해서 된다. 상기 링커는 시퀀스 E-F-M (Glu-Phe-Met)의 트리펩티드일 수 있고, 예를 들어, 또는 13-아미노산 링커 시퀀스는 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met로 구성되어 오스테오폰틴 시퀀스와 이뮤노글로불린시퀀스 사이에 도입된다. 얻어진 용융 프로테인은 신장된 신체 유동액 내의 잔류 시간(반감기), 또는 증가된 특정 활성, 증가된 발현 준위와 같은 개선된 특성을 갖는다. Ig 용융은 또한 접합된 프로테인의 정제를 용이하게 할 수 있다.
다른 바람직한 실시형태에서, 오스테오폰틴은 Ig 분자의 일정한 영역에 접합된다. 바람직하기로는, 이것은 예를 들어, 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 영역과 같은 헤비 체인(heavy chain) 영역에 접합된다. Ig 분자의 다른 이소형은 또한 예를 들어, 이소형 IgG2 또는 IgG4, 또는 IgM 같은 다른 Ig 클래스와 같은 본 발명에 따른 용융 프로테인의 생성에 적절하다. 용융 프로테인은 모노머 또는 멀티머, 헤테로- 또는 호모멀티머일 수 있다. 접합된 프로테인의 이뮤노글로불린 부분은 더욱이 Fc-리셉터에 보충물 바인딩 또는 보충물 캐스캐이드(cascade) 또는 바인드를 활성화하지 않는 방식으로 수사될 수 있다.
본 발명은 더욱이 신경계의 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제의 제조에 있어, 동시에, 연속으로 또는 별개로, 오스테오폰틴 및 면역억제제의 조합의 사용에 관한 것이다. 면역억제제는 스테로이드, 메토트렉사이트(methotrexate), 시클로포스파미드, 안티-류코사이트 항체(CAMPATH-1같은 것) 등 일 수 있다
본 발명은 더욱이 신경계의 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제의 제조 에 있어, 동시에, 연속으로 또는 별개로, 오스테오폰틴 및 인터페론의 조합의 사용에 관한 것이다.
본 특허 출원에서 사용된 용어 "인터페론"은 본 발명의 "배경기술"에서 언급한 IFN의 예를 들은 종류를 포함하여 문헌에 정의된 어떤 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 인터페론은 바람직하기로는 인간으로부터 유래될 수 있지만, 그러나 또한 생물학적 활성이 인간 인터페론에 유사하고 분자가 인간에 면역원성이 아니기만 하다면, 다른 종으로부터 유래할 수 있다.
특히, IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ의 종류는 상기 정의에 포함된다. IFN-β가 본 발명에 따른 바람직한 IFN 이다.
본 발명에서 사용된 용어 "인터페론-베타(IFN-β)"는 생물학적 유동물로부터 분리에 의해 얻어진 것 또는 원핵생물 또는 진핵류 호스트 세포 뿐 아니라 그의 염, 기능적 유도체, 다양한 유사화합물 및 분획으로부터 DNA 재조합 기술에 의해 얻어진 것으로서, 인간 섬유아세포 인터페론을 포함하는 것으로 의도된다.
여기서 사용된 "기능적 유도체"는 이 분야의 공지된 수단에 의해 잔기 또는 N- 또는 C-말단 기 상에 측쇄로 나타나는 관능기로부터 제조될 수 있고, 이들이 약학적으로 수용할 수 있는 것인 한, 즉 이들이 상술한 바와 같이 상응하는 수용체에 결합하고 수용체 시그날링을 시발하는 능력과 같은 프로테인의 활성을 파괴하지 않고, 이를 포함한 조성물에 독성 특성을 부여하지 않는다면 본 발명에 포함된다. 유도체는, 이런 유도체가 프로테인의 생물학적 활성을 보유하고, 약학적으로 수용할 수 있는 것이기만 하면, 카보하이드레이트 또는 포스페이트 잔기와 같은 화학적 부 분을 가질 수 있다.
예를 들어, 유도체는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 일차 또는 이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아미드, 아실 부분(즉, 알카노일 또는 카르보시클릭 아로일 기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기 또는 N-아실 유도체 또는 아실 부분으로 형성된 유리 하이드록실기(예를 들어, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 것)의 O-아실 유도체를 포함한다. 이런 유도체는 또한 예를 들어, 항체의 사이트를 마스크하고 신체 유동액에 분자의 잔류를 신장하는 폴리에틸렌 글리콜 측쇄를 포함할 수 있다.
특히 중요한 것은 오래 지속되어지는 복합제제와 유도되거나 또는 조합되어진 프로테인이다. 상술한 바와 같이 예를 들어, PEG화 버젼 또는 신체에서 장시간 지속되는 활성을 나타내도록 유전적으로 조작된 프로테인이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
용어 "유도체"는 일 아미노산을 20가지의 공통적으로 나타나는 자연적인 아미노산의 다른 것으로 변화시키지 않는 단지 이들 유도체만을 포함하는 것으로 의도된다.
여기서 용어 "염"은 상술한 바와 같이 카르복실기의 염 및 프로테인의 아미노기의 산부가염 또는 그들의 유사화합물을 언급한다. 카르복실기의 염은 이 분야의 공지된 수단에 의해 형성되어질 수 있고, 예를 들어, 트리에탄올아민, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아민, 피페리딘, 프로카인 등으로 형성된 것같은 유기 기재를 갖는 예를 들어 소듐, 칼슘, 암모늄, 철 또는 아연 염 등과 같은 무기염을 포함한 다, 산 부가염은 예를 들어, 염산, 황산과 같은 미네랄산을 갖는 염, 예를 들어, 초산 또는 옥살산과 같은 유기산을 갖는 염을 포함한다. 물론, 이런 염은 본 발명에 따른 프로테인(각각, 오스테오폰틴 및 IFN-베타)의 생물학적 활성, 즉 상응하는 수용체에 결합하고 수용체 신호화를 시발하는 능력을 보유하여야 한다.
인터페론은 또한 프로테인의 안정성을 개선하기 위해 중합체에 융합될 수 있다. 인터페론 β와 폴리올 폴리에틸렌글리콜(PEG) 간의 중합체는, 예를 들어 WO99/55377호에 기술되어 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 인터페론은 인터페론-β(IFN-β)이고, 보다 바람직하기로는 IFN-β1a이다.
오스테오폰틴은 바람직하기로는 인터페론과 동시적으로, 연속적으로 또는 별도로 사용된다..
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 오스테오폰틴은 체중에 대해 약 0.0001 내지 100 mg/kg, 또는 약 0.01 내지 10 mg/kg 또는 1 내지 5 mg/kg 또는 약 2 mg/kg의 양으로 사용된다.
본 발명은 더욱이 신경계의 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 치료제의 조제를 위해 핵산 분자의 사용에 관한 것으로, 여기서 핵산 분자는 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 폴리펩티드 엔코딩하는 핵산 시퀀스를 포함한다:
(a)SEQ ID NO: 1을 포함하는 폴리펩티드;
(b)SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 168 또는 170을 포함하는 폴리펩티드;
(c)SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 16 및 170 내지 314을 포함하는 폴리펩티드;
(d)SEQ ID NO: 1의 아미노산 170 내지 314를 포함하는 폴리펩티드;
(e)SEQ ID NO: 2을 포함하는 폴리펩티드;
(f)SEQ ID NO: 3을 포함하는 폴리펩티드;
(g) (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 뮤테인 , 여기서 아미노산 시퀀스는 (a) 내지 (f)내의 적어도 하나의 시퀀스에 적어도 40 % 또는 50 % 또는 60 % 또는 70 % 또는 80 % 또는 90 % 동일함;
(h) 온화한 긴장 상태 또는 아주 긴장된 상태 하에서 (a) 내지 (f) 중 어느 것을 엔코딩하는 원래 DNA 시퀀스의 보체를 접합하는 DNA 시퀀스에 의해 엔코드된 (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 뮤테인;
(i) (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 뮤테인, 여기서 아미노산 시퀀스의 어떤 변화는 (a) 내지 (f) 에서 아미노산 시퀀스에 대해 아미노산 치환체를 보전함;
(j) (a) 내지 (f) 중 어느 것의 염 또는 이성형, 융합된 프로테인, 기능적 유도체, 활성 분획 또는 순환적으로 전변이된 유도체.
핵산은 나체 핵산 분자로, 즉, 근육내로 주사에 의해 투여될 수 있다.
이것은 더욱이 인간신체에서, 바람직하기로는 적절한 세포 또는 조직에서 핵산 분자에 의해 엔코드된 유전자의 발현에 유용한, 바이러스성의 시퀀스와 같은 벡터 시퀀스를 포함할 수 있다.
따라서, 바람직한 실시형태로는, 핵산 분자는 더욱이 발현 벡터 시퀀스를 포 함한다. 발현 벡터 시퀀스는 이 분야에 잘 알려진 것으로, 이들은 더욱이 흥미로운 유전자의 발현에 작용하는 요소를 포함한다. 이들은 프로모터 및 인핸서 시퀀스, 선택 마커 시퀀스, 복제의 근원 등과 같은 조절 시퀀스를 포함한다. 유전자 치료적 접근은 따라서 질환의 치료 및/또는 예방에 사용된다. 유익하기로는, 오스테오폰틴의 발현은 그런 다음 그자체로 된다.
바람직한 실시형태에서, 발현 벡터는 렌티바이럴(lentiviral) 유도 벡터이다. 렌티바이럴 벡터는 특히 CNS 내에서 유전자의 전이에 매우 효과적인 것으로 보인다. 아데노바이럴 유도 벡터와 같은 다른 잘 확립된 바이러스성의 벡터가 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
표적된 벡터는 오스테오폰틴의 혈액-뇌 경계를 가로질어 통과를 고양하기 위해 사용될 수 있다. 이런 벡터는 예를 들어 트랜스페린 리셉터 또는 기타 내피의 전달 메카니즘을 표적할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 발현 벡터는 근육내 주사로 투여될 수 있다.
충분하지 않은 양의 오스테오폰틴을 발현하거나 또는 오스테오폰틴의 발현에 통상적으로 침묵하는 세포에서 오스테오폰틴의 내인성 생성을 유도 및/또는 고양하기 위해 벡터의 사용이 또한 본 발명에 따라 고려된다. 벡터는 오스테오폰틴을 발현하기에 바람직한 세포에서 기능적인 조절 시퀀스를 포함할 수 있다. 이런 조절 시퀀스는, 예를 들어 프로모터 또는 인핸서일 수 있다. 조절 시퀀스는 그런 다음 동성적 재조합에 의해 지놈의 적절한 위치에 도입될 수 있고, 따라서 유전자로 조 절 시퀀스를 작동가능하게 연결하여, 이들의 발현이 유도되거나 고양되도록 요구된다. 이 기술은 통상 "내인성 유전자 활성화"(EGA)로 언급되고, WO 91/09955에 기술되어 있다.
본 발명은 더욱이 신경계의 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 치료제의 제조에 있어 오스테오폰틴을 생산하기 위해 유전적으로 수사된 세포의 사용에 관한 것이다.
본 발명은 더욱이 신경계의 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 치료제의 제조에 있어 오스테오폰틴을 생산하기 위해 유전적으로 수사된 세포에 관한 것이다. 따라서, 세포 치료적 접근이 인체의 적절한 부위에 약물을 전달하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 더욱이 특히, 신경계의 질환의 치료 및/또는 예방에 유용한 약학적 조성물에 관한 것으로, 이들은 약학적으로 유효한 양의 오스테오폰틴과 약학적으로 유효한 양의 인터페론을 포함하고, 임의적으로 더욱이 약학적으로 유효한 양의 면역억제제를 포함한다.
"약학적으로 허용될 수 있는"의 정의는 활성성분의 생물학적 활성의 유효성에 간섭을 하지 않고 이것이 투여된 호스트에 독성을 나타내지 않는 어떤 캐리어를 포괄하는 것을 의미한다. 예를 들어, 비경구적인 투여에 대해, 활성인 프로테인이 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민 또는 링거 용액과 같은 캐리어의 주입에 대한 단위 복용형태로 제제화될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 활성 성분은 개개인에 따라 다양한 방법으 로 투여될 수 있다. 투여의 경로는 피내로, 피부를 통해(즉, 서방출형 제제), 근육내로, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 경구로, 경막외로, 국소적으로, 초내로, 직장으로, 및 비강내로의 경로를 포함한다. 다른 기타의 치료적으로 유효한 투여 경로, 예를 들어 상피의 또는 내피의 조직을 통한 흡수 또는 활성제제를 엔코딩하는 DNA 분자가 환자에 투여되어(즉, 벡터를 통해), 활성 제제가 생체내에서 분비되어 발현되는 유전적인 치료에 의한 투여가 사용될 수 있다. 부가하여, 본 발명에 따른 프로테인은 약학적으로 수용할 수 있는 표면활성제, 부형제, 캐리어, 희석제 및 담체와 같은 생물학적으로 활성인 제제와 함께 투여될 수 있다.
비경구적(즉, 정맥내로, 피하로, 근육내로) 투여를 위해, 활성 프로테인은 약학적으로 수용할 수 있는 비경구적 담체 (즉, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성을 유지하기 위한 부가제(즉, 만니톨) 또는 화학적 안정제(즉, 보존제 및 완충액)와 조합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결 분말로 제조될 수 있다. 이 제형은 통상의 방법에 따라 안정화된다.
본 발명에 따른 활성인 프로테인의 생체이용성은 또한 PCT 특허 출원 WO 92/13095에 기술된 바와 같이, 예를 들어 폴리에틸렌글리콜에 분자를 연결하는, 인체에서의 분자의 반감기를 증가하는 융합과정을 사용함에 의해 개선되어질 수 있다.
활성인 프로테인의 치료적으로 유효한 양은 프로테인의 종류, 프로테인의 친화도, 안타고니스트에 의해 나타난 잔여 세포질독성 활성, 투여의 경로, 환자의 임상적 조건(내인성의 오스테오폰틴 활성의 비독성 준위를 유지하는 바램을 포함)을 포함하는 많은 변수의 기능이다.
"치료적으로 유효한 양"는 투여되었을 때, 오스테오폰틴이 신경계의 질환에 유익한 효과를 나타내는 것이다. 단일 또는 복합 복용으로 개개인에 투여된 복용량은 오스테오폰틴 약력학 특성, 투여경로, 환자의 조건 및 특성(성별, 나이, 체중 건강, 크기), 증상의 정도, 동시 치료, 치료의 빈도 및 소망하는 효과를 포함하는 다양한 인자에 의존한다.
상기 언급된 바와 같이, 오스테오폰틴은 바람직하기로는 체중에 대해 약 0.0001 내지 10 mg/kg 또는 약 0.01 내지 5 mg/kg 또는 약 0.01 내지 5 mg/kg 또는 약 0.1 내지 3 mg/kg 또는 약 1 내지 2 mg/kg의 양으로 사용될 수 이다. 더욱 바람직한 오스테오폰틴의 양은 체중에 대해 약 0.1 내지 1000 mg/kg 또는 약 1 내지 100 mg/kg 또는 약 10 내지 50 mg/kg의 양이다.
본 발명에 따른 바람직한 투여의 경로는 피하의 경로에 의한 투여이다. 근육내 투여는 본 발명에 따르면 더욱 바람직하다.
더욱 바람직한 실시형태에서, 오스테오폰틴은 매일 또는 격일로 투여된다.
매일 복용은 통상적으로 소망하는 결과를 얻기 위해 유효한 분할된 복용량으로 또는 지속된 방출로 주어진다. 이차 또는 연속하는 투여는 개개인에게 투여된 초기 또는 전의 복용량과 같거나, 적거나 또는 많게 되는 복용량으로 수행될 수 있다. 이차 또는 연속하는 투여는 질환의 발현 전에 또는 발현 동안에 투여될 수 있다.
본 발명에 따르면, 오스테오폰틴은 예방적으로 또는 치료적으로 개개인에게, 다른 치료요법 또는 제제와 동시에 또는 연속적으로, 미리, 치료적으로 유효양으로, 특히 인터페론과 같이 투여될 수 있다(즉, 복합 약물요법). 다른 치료적 제제와 동시적으로 투여된 활성 제제가 동일하게 또는 다른 조성으로 투여될 수 있다.
본 발명은 더욱이 환자에게 그들의 요구에 따라 유효량의 오스테오폰틴, 또는 오스테오폰틴 활성의 어고니스트를, 임의적으로 약학적으로 수용할 수 있는 캐리어와 함께 투여하는 것을 포함하는 신경계의 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.
환자에게 그들의 요구에 따라 유효량의 오스테오폰틴, 또는 오스테오폰틴 활성의 어고니스트, 및 인터페론을, 임의적으로 약학적으로 수용할 수 있는 캐리어와 함께 투여하는 것을 포함하는 신경계의 질환을 치료하는 방법은 또한 본 발명 내이다.
저널 또는 미국 또는 외국 특허 출원을 공개하거나 비공개한 요약서, 발행된 미국 또는왹구 특허 또는 기타 문헌을 포함하는 여기서 인용된 모든 문헌은 전체로 여기서 참고문헌으로, 인용된 문헌에 나타난 데이타, 표, 도면, 내용을 포함하여 합체된다. 부가적으로, 여기서 인용된 문헌 내에서 인용된 문헌의 전체 내용은 또한 전체적으로 참고문헌으로 합체된다.
공지된 방법 단계, 전통적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 전통적인 방법에 대한 참고문헌이 본 발명의 측면, 상세한 설명 또는 실시형태가 관련된 기술에서 개시되고 알려지고 또는 제안되었다는 것을 승인하는 것은 아니다.
특정의 실시형태의 전기한 상세한 설명은 본 발명의 일반적인 특성을 완전히 밝혀 이 기술 분야의 통상인은 이를 적용함에 의해(영기에 인용된 참고문헌의 내용을 포함) 본 발명의 일반적인 개념을 벗어남이 없이, 불필요한 시험없이 특정 실시형태같은 다양한 적용에 쉽게 변경 및/또는 각색할 수 있다. 따라서, 각색 및 변경은 여기서 나타난 개시 및 안내에 기하여 개시된 실시형태의 동등한 범위로 된다고 해석된다. 여기서, 용어 또는 단락은 본 발명을 상세히 설면하기 위한 것으로 이를 한정하기 위한 것이 아니며, 상세한 설명의 이러한 용어 및 단락은 이 분야의 통상인의 지식과 조합하여 이 분야의 초심자에게 본 발명을 상세히 하기 위한 것이다.
이하 본 발명을 보다 자세히 설명하면, 다음의 실시예는 이를 참고로 본 발명을 보다 쉽게 이해시키기 위한 것이며 본 발명을 한정하기 위한 것은 아니다.
실시예 1: 오스테오폰틴은 탈수초 질환의 생체내 및 생체외 모델에서 분화적으로 발현됨
방법
생체외 모델 시스템
올리-뉴 세포 라인은 구성적으로 활성 티로신 키나제인 t-뉴 온코젠(t-neu onco유전자)을 엔코딩하는 복제-결함 레트로바이러스로 희돌기교세포의 전구체의 불후화를 통해 확립된다: 이 세포 라인은 배양배지에서 1 mM 디부티릴-cAMP의 존재하에 분화하는 것이 유도되는 것으로 나타난다(Jung 등, 1995). 이는 분리된 세포 타입으로 희돌기교세포 연구의 가능성을 제공한다.
A2B5 마우스 희돌기교세포 전구체로부터 유도된 것인, 마우스 희돌기교세포 세포 라인 올리-뉴의 세포의 항체적 특성 및 형태학이, 비처리된 조건에서 그리고 1-5 mM 디부티릴 cAMP로 예비-분화 처리의 6일 후에 실질적으로 다르다. 비처리된 올리-뉴 세포가 라운드 형상을 가지고 희돌기교세포 전구체 세포처럼 대부분 이극성이지만, cAMP 처리된 세포는 다양한 과정을 발생하고, 평평한 표현형을 가지고 그리고 평평하고 신장된 "초-같은(sheath-like)" 구조를 생산한다.
부가적으로, 혼합된 피질성의 배양을 사용하여 생체외 미엘린화 분석이 생체외에서 기능적인 미엘린의 가시화를 가능하게하는데 사용될 수 있다. 이 시스템은 기타 CNS 세포 타입의 존재 하에서 어떻게 희돌기교세포가 접촉하고 축삭을 미엘린화하는지에 대한 연구의 가능성을 제공한다(Lubetzki 등, 1993). 이 시스템에서, 생물학적 요소가 시험될 수 있어, 실질 미엘린 분획의 형성에 영향을 주는 것 같은, 희돌기교세포 전구체의 증식에 영향을 미치거나 또는 희돌기교세포의 분화 및 생존에 작용할 수 있다. 생체외에서 미엘린화 과정을 연구하는 요구는 뇌 세포 배양 응집(Matthieu 등, 1992), 소뇌 조각 배양(Notterpek 등, 1993), 및 동-배양 시스템(Shaw 등, 1996; Barres 등, 1993)을 포함하여 분석 타입의 범위의 발전을 이끌어왔다. 이들 모델은 다른 세포 타입과 연계하여 희돌기교세포 행동의 연구와 이들 세포가 어떻게 미엘린을 생산을 자극하는지에 대한 연구를 허용하는 이점의 있다. 탈유수화가 또한 특정 공격을 통해 이런 시스템에서 도발될 수 있고, 재유수화의 반응 과정 또한 연구될 수 있다.
생체내 모델 시스템
다중 경화증에 대한 광범위한 실험적 생체내 및 생체외 모델이 존재한다. 대부분의 생체내 모델은 실험적 알러지성 뇌척수염(EAE)인, MS의 전통적인 동물 모델 에 관련된다. 이 모델에는 많은 다양성이 있는데, 이는 마우스, 랫트 및 영장류 계를 포함하는 광범위한 척추동물의 조직에서 사용되도록 각색되었다(Petry 등, 2000에서 검토). 부가적으로, 방법학이 MS의 뇌염발생의 테일러 뮤린 바이러스(Theiler's murine virus) 모델과 같은 동물 모델에서 MS의 제시된 바이러스성의 구성분을 "흉내"내도록 제형화되었다(Dal Canto 등, 1995).
CNS 또는 PNS에서 미엘린화를 배타적으로 연구하기 위한 동물 모델이 덜 공통적으로 사용된다. "발생반복 가설"에 따른 희돌기교세포의 또는 슈반 세포 분화, 이동 및 증식을 지지하는 메카니즘에서의 몇몇 통찰을 얻기 위해 전개적인 미엘린화의 과정을 관찰하는 것이 융용하게 입증되었다(Franklin 및 Hinks, 1999). 그러나, CNS 또는 PNS가 형성되어지는 동안 발생하는 전개적인 미엘린화, 및 성인 패러다임에서 일어나는 재미엘린화에 비교하기 위해, 재미엘린화의 과정에 특징적으로 향한 모델을 형식화하는 것이 필요하다.
큐퍼리죤 모델
하나의 가장 잘알려지고 광범위하게 사용되는 재유수화 모델이 마우스에서 재유수화에 대한 큐퍼리죤 모델이다. 이는 희돌기교세포에 선택적으로 독성인 것으로 나타난 구리 킬레이트인, 유기화합물인 큐퍼리죤의 경구 투여를 포함한다(Morell 등, 1998).
탈유수화 및 재유수화는 큐퍼리죤-처리된 마우스의 사체의 칼로섬(callosum)에서 일어난다. 이들 병리적인 증상은 안티-CNPase 항체 또는 MBP 항체로 염색함에 의해 육안으로 관찰할 수 있다. 미엘린은 루솔 패스트 블루-페리오딕 에시드 쉬프(Luxol Fast Blue-periodic acid Schiff; LFB-PAS)로 염색된다. 재미엘린화 희돌기교세포 전구체는 PDGFa 리셉터 또는 NG2에 대한 항체를 사용하여 구체화될 수 있다.
무우스에 대해 3-5 주 동안 큐퍼리죤의 투여는 신체의 칼로섬의 신장된 탈유수화를 초래한다. 수초탈락과 같이 일어나는, 미엘린-특정 유전자 전사의 합성은 큐퍼리죤 투여의 3주 후 상향조절된다(Morell 등, 1998).
큐퍼리죤 욧법의 이어지는 중단은 회복에 공헌적인 환경을 만들어, 큐퍼리죤 공급을 중단 6주 후, 마우스는 신체의 콜라섬에서 신장적인 재유수화를 보인다. 따라서, 큐퍼리죤 모델은 탈유수화 및 재미엘린화의 연구 측면 내에서 생체 내에서 완전한 패러다임을 제공한다. 이의 이점은 미엘린화 과정, 뿐 아니라 결과의 재생성가능성의 보다 배타적인 연구를 가능하게 하는 CNS 조직내로의 T-세포 침입의 부재를 포함한다.(Hiremath 등, 1998).
큐퍼리죤 치료를 위해, C57BL/6 자성 마우스(8 주령, 20 +3g)가 이 연구에 사용되어, 각각 6마리 동물을 포함하는 6 그룹을 포함한다.
그룹 1: 정상의 분말화 음식물이 공급된 대조군;
그룹 2: 0.2% 큐퍼리죤 을 함유하는 분말식으로 3주간 공급(Cup3w);
그룹 3: 0.2% 큐퍼리죤 을 함유하는 분말식으로 5주간 공급(Cup5w);
그룹 4: 0.2% 큐퍼리죤 을 함유하는 분말식으로 5주간 공급하고, 정상의 분말식으로 1주간 회복 기간이 따름(1wR);
그룹 5: 0.2% 큐퍼리죤 을 함유하는 분말식으로 5주간 공급하고, 정상의 분 말식으로 3주간 회복 기간이 따름(3wR);
그룹 6: 0.2% 큐퍼리죤 을 함유하는 분말식으로 5주간 공급하고, 정상의 분말식으로 6주간 회복 기간이 따름(6wR).
뇌가 각 군의 동물로부터 각 처리의 말단에 고정된 시간에서 수집된다. 마우스는 먼저 마취되고 촤측 심실을 통해 주입된다. 뇌가 수집되고 일련의 관상 부분이 신체의 칼로섬-미의 피각(callosum-caudate putamen)(선조체) 및 해마의 준위에서 만들어졌다. 뇌 조직 분획은 면역조직화학 및 그 자체로 하이브리드형성을 위해 파라핀에 끼워진다.
조직학적인 조직 조제
1 부피의 포름알데히드(Fluka, 36% p.a.), 및 1 부피의 멸균 PBS를 8 부피의 멸균수로 희석함에 의해 포르말린에 준비된다. 연동 펌프를 갖추고 20G, 1-1/5 바늘이 장착된 실리콘 튜브에 10ml의 PBS를 충진한다. 이 튜브는 그런 다음 연속적으로 40ml의 포르말린으로, 공기거품이 발생하지 않도록 조심하면서 충진된다.
동물은 장기 및 조직의 연속하는 조직학적인 분석을 위해 심장내로 확산하기 전에 3 mg/100 ml의 농도로 멸균 PBS와 1:1로 희석된 소듐 펜토바비탈(Sanofi™)로 마취된다. 각 동물에 0.05ml(0.75 mg/kg)의 복강내의 주사를 한다. 일단 동물이 가수면되면, 이들의 스티로폼 판 상에 피부를 관통하여 사지를 핀으로 고정한다(25G 5/8 바늘). 각 동물의 복부를 에탄올로 세척하고 절개는 멸균 가위로 외부번호의 수준에서 피부로 이루어진다. 그리고 나서 복부는 더욱이 좌우측으로 잘려진다. 외부번호는 한쌍의 핀셋으로 들어지고, 횡경막이 대각상의 절개를 통해 열리고 갈비 에 수직한 대칭적인 절개가 중앙에서 박동하는 심장을 갖는 흉곽의 동공을 노출하게 한다. 심장은 핀셋으로 유지되고 우측 심방이 즉시 잘려 혈관출혈을 시킨다. 10ml의 PBS를 순환시키고, 40ml 포르말린을 각 마우스에 순환시킨다. 각 동물의 뇌 및 척추는 조심스럽게 분리되고, 50 ml Falcon™튜브내의 10 ml 포르말린 용액에 2시간 동안 둔다. 이 포르말린 용액은 그런 다음 10 ml 멸균 PBS로 바뀌고 이 물질은 +4℃에서 밤새도록 방치된다. PBS 용액이 그런 다음 다시 바뀌고 이 물질은 +4℃에서 몇 시간 동안 방치된다. 뇌 반구 및 척추는 대략 0.5 cm 슬라이스로 잘려지고, 함입 기계와 조화할 수 있는 플라스틱 바스켓에 둔다. 파라핀으로 뇌 및 척추의 포매(包埋)는 아래에 기술된 프로그램에 따라 오토매틱 티슈 텍 베큠 인필트레이션 프로세서(automatic Tissue Tek Vacuum Infiltration Processor E150/E300)(Miles Inc. Diagnostics)를 사용하여 수행된다:
50% 에탄올에서 30분
70% 에탄올에서 30분
70% 에탄올에서 30분
80% 에탄올 에서 30분
80% 에탄올 에서 90분
96% 에탄올 에서 30분
96% 에탄올 에서 90분
96% 에탄올 에서 120분
100% 크실렌 에서 30분
100% 크실렌 에서 60분
파라핀에서 4번 60분 배양(Histosec, Merck 11609); 마지막 단계는 포매를 위한 것임.
모든 용액 65℃에서 파라핀으로 40℃에서 유지된다. 조직 분획이 준비되면, 뇌 및 척추 분획이 파라핀 블록 함입을 위해 플라스틱 챔버 상에 소망하는 방향으로 놓인다. 파라핀 액체이 따루어지고 빠르게 냉각 플레이트 상에서 0℃로 냉각된다. 파라핀 블록은 분획화를 위해 마이크로톰(microtome)에서 처리된다(5-10 mm). 분획은 그런 다음 실란-처리된 글라스 스라이드(SuperFrost-Plus™ Menzel cat. no. 041300) 상에 놓여진다. 놓여진 후, 슬라이드는 먼지가 없는 환경에 보관된다.
세포 배양
올리-뉴: 마우스 희돌기교세포 세포 라인 (올리-뉴) 세포는 원심분리를 통해 모아지고 사토(Sato's) 배지(Trotter 등, 1989)에 재현탁된다. 세포는 75-mL 플라스크에서 37℃에서 그리고 5% CO2 제어된 조건에서 배양된다. 분화는 세포 배양 배지에 직접저긍로 부가된 1 mM dbcAMP로 수행된다. RNA가 트리아졸 방법(다음 참고)을 사용하여 추출된다.
RNA 분리
전체 RNA는 Tri-ZOL™추출 프로토콜을 사용한 다른 전개의 단계에서 마우스 생후 전체 뇌 및 큐퍼리죤-처리된 마우스 뇌 영역인, 올리-뉴 세포로부터 분리된다(Life Technologies AG, Basel, Switzerland). 폴리(A)+ RNA는 전체 RNA 샘 플로부터 퀴아젠 올리고텍스(Qiagen OLIGOTEX™) 컬럼(QIAGEN Inc., 28159 Stanford Avenue, Valencia, CA 91355, USA)을 사용하여 준비된다.
cDNA 마이크로분석을 사용한 DGE 분석
마이크로분석 실험이 인사이트 제노믹(인사이트 Genomics) (인사이트 Genomics Inc., 3160 Porter Drive, Palo Alto, California 94304, USA)에서 수행된다. DGE 분석은 인사이트의 마우스 GEM™1 유전자 발현 마이크로어레이를 사용하여 수행된다(http://www.인사이트.com/reagents/gem/products.shtml).
이들 분석에 사용된 인사이트 칩은 알려지거나 알려지지 않은(EST 시퀀스) 8734 유전자에 상응하는 cDNA 분자로 적하된다. 인사이트의 기술은 이들 유전자의 각 마이크로 샘플이 싱글 어레이 상에 점찍어지도록 한다. 공지된 유전자 또는 EST에 상응하는 각 cDNA 분자는 길이가 500-5000bp이다. 인사이트 명세는 샘플에서 각 mRNA에 대해 2 내지 2,000 pg의 검지할 수 있는 기능적인 영역을 준다. 각 분석 실험에 요구되는 RNA의 양은 600 ng의 폴리(A)+ RNA이다. 검지할 수 있는 분화적인 발현의 기술된 준위는 1.75 보다 큰 비율로 주어진다.
신호 정상화 및 발현 준위 결정
2 형광 강도로부터 계산된 비율은 분석된 2 세포 샘플에서 상대적인 유전자 발현 준위의 양적 측정을 제공한다. 각 유전자에 할당된 이 비율은 정상화된 발현 준위에 기하여 계산된다. 정상화 인자는 제이차 샘플의 전체 발현(P2)을 제일차 샘플의 전체 발현(P1)으로 나눔으로서 계산된다. 그런 다음 이 인자는 P2에서 각 유전 자의 발현 준위에 적용되어진다. 일단 이 정상화 단계가 적용되어지면, 유전자 비율이 다음의 규칙에 따라 계산된다:
E1은 샘플1에서 주어진 유전자의 발현 준위이고, E2은 샘플2에서 동일 유전자의 정상화된 발현 준위로; 만일 E2 > E1 이면 비율=E2/E1이거나, 그렇지않으면 비율=-E1/E2임.
샘플 하이브리드형성이 경쟁적으로 동시적으로 수행되기 때문에, 인사이트 칩 기술은 상대적인 발현 변화를 결정하는데 보다 정확하고 절대적인 발현 준위의 측정에 덜 신뢰적이다. 그럼에도 불구하고, 칩 상에 정확하게 물리적으로 비교되지않는 비교하는 쌍의 샘플 RNA 개체군에 대해 이들 발현 준위 값을 사용하는 것이 가능하다. 실리코에서(in silico) 이런 비교는 덜 신뢰적이지만, 이들은 분석되어지는 시스템에 적용될 수 있는 메카니즘 상에 대한 부가적인 정보를 제공할 수 있다.
결과
분화적인 오스테오폰틴 발현의 분석에 사용된 모델
표 4는, 상기 기술된 바와 같이 mRNA의 추출 및 칩 하이브리드형성(DGE 분석)에 사용된 모델을 나타낸다.
[표 4]
DGE 분석에 사용된 모델
| 모델 | 처리 | 대조 |
| 1. 생체외 희돌기교세포 분화 모델 | 올리-뉴 세포 + 디부티릴-cAMP (6 시간) | 올리-뉴 세포 (비처리된) |
| 올리-뉴 세포 + 디부티릴-cAMP (6 일) | 올리-뉴 세포 (비처리된) | |
| 2. 생체내 큐퍼리죤 수초탈락/재-미엘린화 모델 | 성인 전 뇌 + 큐퍼리죤 (3 주) | 비처리된 성인 전 뇌 |
| Adult frontal 뇌 + 큐퍼리죤 (5 주) | 비처리된 성인 전 뇌 | |
| 성인 전 뇌 + 큐퍼리죤 (3 주) | 성인 전 뇌 뇌 + 큐퍼리죤 (5 주) | |
| 3. 전재적인 미엘린화 | 마우스 생후 10일 (P10) 소뇌 | 마우스 생후 2일 (P2) 소뇌 |
DGE에 대한 긍정적인 대조: 미엘린-특정 유전자의 제어.
긍정적인 대조로서, 만일 미엘린-특정 유전자의 분화적 제어가 DGE를 사용하여 나타내어질 수 있다면, 이것이 먼저 시험된다.
표 5는 인사이트 마이크로어레이 상에 존재하는 미엘린-특정 유전자에 대해 관찰된 제어를 나타낸다. 각 유전자에 대한 분화적인 발현 값은 큐퍼리죤 처리의 3 주 및 5 주 양 시간 점으로부터 보고된다. 이 데이타는 칩 신뢰성을 입증하기 위한 긍정적인 대조이다. 본 실험적 조건하에서 미엘린 구조 유전자의 제어가 아주 특징적으로되기 때문에, 칩에서 측정된 이들 유전자의 관찰된 발현이 a) 기술의 정확성 및 b) 본 모델의 재생산성을 나타내기 위해 사용될 수 있다.
[표 5]
생체내에서 미엘린화 모델에 대한 마이크로어레이 분석에서 미엘린-특정 유전자의 생체내 제어.
| 유전자 명 | 어세션 번호 | Cup 3w | Cup 5w | P 2/10* |
| 미엘린 베이직 프로테인 | AA059540 | 113.6 | 11.3 | +7.9 |
| 미엘린 소포성의 프로테인/미엘린 및 림프구 프로테인 (MVP/MAL) | AA519027 | 33.5 | 11.7 | 0 |
| 시클릭 뉴클레오티드 포스포디에스테라제 1 (CNPase) | W63987 | 22.9 | 11.1 | +2.9 |
*생후의 소뇌 2/10 일
상기 표는 몇 미엘린-특정 유전자가 수초탈락, 재유수화 및 전개적인 미엘린화를 연구하기 위해 사용된 다른 생체내 모델로부터 RNA 상에 수행된 마이크로어레이 분석에서 어떻게 제어되는가를 보여준다. 이들 미엘린-특정 유전자의 발현에서 변화는 미엘린화의 과정이 마이크로어레이를 사용하여 전사적 제어의 준위에서 어떻게 연구되어질 수 있는 지를 나타낸다.
큐퍼리죤 투여 3주 후, 처리의 탈수초화 효과는 마우스 뇌의 특정 영역에서 관찰되어질 수 있다. 따라서, 3주에, 미엘린 합성 및/또는 미엘린 유지와 연계한 다양한 유전자의 다운레귤레이션을 관찰하는 것이 기대되어진다. 마이크로어레이 를 통해 관찰된 것으로 미엘린-특정 유전자의 다운레귤레이션은 실험적 시스템의 정확성 및 신뢰성의 확인으로 작용한다. 표 5에 나타난 데이타는 13.6 배 하향제어된 MBP에 대한 mRNA 준위와 2.9배 하향제어된 시클릭 뉴클레오티드-포스포디에스테라제 1 (CNPase)는 대조와 비교하여 큐퍼리죤 처리의 3주에 감소된다는 것을 보여준다. 그러나 이들 양 유전자의 RNA 준위는, 생물학적 시스템이 구조적 미엘린 프로테인의 합성을 지지함에 의해 재유수화를 이룩하기 위해 시도된다는 것을 나타내는, 각각 큐퍼리죤 처리의 5주 후에 정상적인 준위의 1.3 및 1.1 배 아래로 복원된 다.
오스테오폰틴의 분화적 제어:
칩 상에서, 오스테오폰틴이 3w (+2.2) 및 5w (+2.8) 큐퍼리죤에서 상향제어된다.
실시예 2: 실시간 정량적 리버스 트랜스크립타제 (RT)-PCR 분석 (TaqMan™)에 의한 오스테오폰틴의 분화적 유전자 발현의 확인
방법
cDNA 템플레이트 생성
TaqMan™분석을 위한 cDNA 템플레이트는 TaqMan™리버스 트랜스크립타제 시약(P/N N808-0234)을 사용하여 역전사(RT)를 통해 전체 RNA 샘플로부터 생성된다. 모든 RT 반응은: RNase-유리 H2O 안에 10 ml TaqMan RT 완충액, 22 ml 25 mM MgCl2 용액 (5.5 mM), 20 ml 데옥시NTPs 혼합물(500 mM의 각 dNTP), 5 ml 랜덤 헥사머(random hexamers)(2.5 mM), 2 ml RNase 저해제(0.4U/ml), 2.5 ml 멀티스크라이버(MultiScribe™) 역전사제(1.25 U/ml) 및 38.5 ml RNA 샘플(전체 1 mg)을 포함하는 100-㎕ 부피로 수행된다. 반응은 에펜드로프 마스터사이클러(Eppendorf MasterCycler) 상에서 25℃에서 10분(배양 단계), 48℃에서 30분(역 전사), 및 95℃에서 5분(비활성화 단계) 동안 수행된다. 모든 합성된 cDNA는 -20℃에서 20 ㎕ 부피로 보관된다.
프라이머 디자인 및 입증
모든 확인된 유전자 및 GAPDH(하우스 키핑 콘트롤)에 대한 리버스 프라이머 및 SYBR 그린 실시간(Green Real Time) PCR이 공개된 시퀀스에 따라 PE 바이오시스템으로부터 프라이머 익스프레스™ 소프트웨어를 사용하여 디자인되고 인터액티바(Interactiva)로부터 0.02 μM 농도로 된다(Interactiva: The Virtual Laboratory, Sedanstrasse 10, D-89077 Ulm). 특정성 및 임의적인 프라이머 농도는 각 프라이머 세트에 대해 시험된다. 잠정적인 지놈의 DNA 오염은 RT 효소의 부재하에 역전사 반응을 당하는 음성적 조절 cDNA 샘플 상에 PCR 반응을 수행함에 의해 모니터된다. 비-특정 증폭의 부재는 3.5% 메타포어(MetaPhor) 겔 또는 예비-주조 NuSieve™4% 겔 상에 아가로스 겔 전기영동을 통해 PCR 산물을 분석함에 의해 확인된다.
상기 표는 유전자의 분화적 발현을 확인하기 위한 TaqMan™분석을 수행하기 위해 디자인된 유전자-특정 프라이머의 시퀀스는 마이크로어레이에서 분화적으로 제어되어지는 것으로 나타나는것은 보여준다. 각 프라이머 쌍에 대응하는 유전자의 명칭 프라이머 익스프레스™ 소프트웨어로 각 프라이머를 디자인하기 위해 사용된 시퀀스의 젠뱅크(GenBank) 접근번호 또한 포함된다.
[표 6]
RT-PCR 분석을 위해 사용된 프라이머
| 유전자 명 | 접근 번호 | TaqMan™올리고 명(OLIGO NAME) | TaqMan™ 올리고 시퀀스 |
| 분비된 포스포프로테인 1 (오스테오폰틴) | AA 108928 | 오스테오폰틴-166F | AGCCTGCACCCAGATCCTATAG |
| 오스테오폰틴-235R | GCGCAAGGAGATTCTGCTTCT |
TaqMan 반응
SYBR 그린 실시간 PCR은 5㎕/RT-산물의 웰(0.5ng의 전체 RNA), 25㎕/SYBR 그린 PCR 마스터 믹스(Applied Biosystem, CA, USA)으로, AmpErase Uracil N-Glycosylase(UNG)(0.5 단위/웰) 및 20㎕의 프라이머(300 nM)로 수행된다. PCR은 50℃에서 2분(선행 TaqMan 수행으로부터 발생된 PCR 산물로 합체된 우라실을 제거함에 의해 어떤 잠정적인 이월을 제거하기 위해 AmpErase UNG 배양을 위해), 95℃에서 10분(AmpliTaq Gold 활성화를 위해) 동안 수행된다. 그런 다음 샘플은 40 주기동안 95℃에서 15초 동안, 60℃ 에서 1분 간, ABI PRISM™7700 시퀀스 디텍션 시스템상에서 실행된다. 역전사된 cDNA 샘플은 따라서 증폭되고, 이들의 CT(임계 주기) 값이 결정된다. 모든 CT 값은 하우스키핑 유전자 GAPDH로 정상화된다. 가능하다면, 샘플은 이중물 또는 삼중물로 수행되어 결과의 재생성을 평가한다. 모든 확인된 유전자 및 GAPDH에 대한 단일 특정 DNA 밴드는 전기영동적 분석 상에서 관찰된다.
주기 임계(C
T
)를 통한 유전자 제어의 계산
SYBR 그린 PCR 마스터 빅스를 사용한 실시간 검출의 원리는 이중 사슬 DNA에 SYBR 그린 염색의 결합에 의해 창출된 형광의 증가를 측정함에 의해 PCR 산물의 직 접 검출에 기초한다. 이는 PCR 성장 곡선에 기한 유전자-특정 증폭 산물에서 상대적인 증가의 정량화를 허용한다.
대조 샘플에 대한 특정 cDNA 종의 평가는 생리학적인 참고로 작용하는 캐리브레이터(calibrator) 샘플에 대한 특정 유전자에 상응하는 메신저 RNA로부터 전환된 cDNA의 정량화에 의해 수행된다. 이 캐리브레이션(측정)은 대조 또는 비처리된상태로부터 샘플에 의해 제공된다. cDNA 종의 상대적인 정량화는 역전사 반응의 전환 효능성에서 및 템플레이트 cDNA를 생성하기 위해 사용된 전체 RNA의 양 및 초기 농도에서 다양성을 고려한 내인성 조절(이 경우에는, GAPDH)에 대한 정상화를 통해 완성된다. 상대적인 정량화 값의 계산은 각 샘플에 대해 수행된 복제 반응에 대한 평균 CT 값을 취함에 의해 수행되는데, 이는 타겟 샘플과 내인성 조절 간의 평균 CT에서의 편차(ΔCT)가 계산되고, 타겟의 ΔCT로부터 타겟에 대한 칼리브레이터의 평균 CT를 차감하고(ΔΔCT) 마지막으로 유전자 발현의 상향 또는 하향 조절의 정도를 평가하기 위해 2-ΔΔCt로 타겟에 대한 상대적인 정량화 값을 표현함에 의해 수행된다.
TaqMan™반응에서 형광 신호의 정상화
SYBR 그린-dsDNA 복합체 형광 신호는 비 템플레이트 DNA를 포함한 수동적 참고 또는 음성적인 대조 반응에 대해 정상화된다. 정상화는 수동적 참고의 방출 강도에 의해 실험적 반응에서 SYBR 그린-dsDNA 복합체의 방출 강도를 나눔으로 수행 된다. 이는 반응에 대한 Rn(정상화된 레포터) 비율을 산출한다:
●Rn
+ = 템플레이트 DNA를 포함하는 모든 구성성분을 함유하는 반응의 Rn 값
●Rn
- = 반응하지 않은 샘플(비 템플레이트 DNA)의 Rn 값
●ΔRn = (Rn
+) - (Rn
-) 여기서:
Rn
+ = (SYBR 그린-dsDNA 복합체의 방출 강도)/템플레이트부 PCR
(수동적 참고의 방출 강도)
Rn
- = (SYBR 그린-dsDNA 복합체의 방출 강도)/비 템플레이트
(수동적 참고의 방출 강도)
주기 임계(C
T
) 값으로부터 폴드 제어의 계산
ΔRn은 특정 반응에 대한 주어진 세트의 PCR 조건에 의해 발생된 신호의 크기를 나타낸다. 주기 임계 변수는 실험적 cDNA 개체군에서 특정 전사의 상대적인 부재를 나타내는 유전자-특정 산물의 증폭에서의 상대적인 증가의 측정을 구성한다. 이것은 ΔRn에서 통계적으로 유의성있는 증가가 먼저 검출되는 주기점으로 고정된다. 임계는 조정가능한 인자에 의해 증폭된 초기 주기에 대한 Rn의 평균 표준 편차 로 정의된다. 주기 임계 변수는 분화적 유전자 발현의 정량화에 사용된다. 특정 값은 배경 형광 강도 이상의 증가가 검출되는 주기 또는 점에 기한 각 유전자-특정 성장 곡선에 대해 계산된다.
상대적인 정량화 값의 모든 계산은 각 샘플에 대해 수행된 복제 반응에 대한 평균 CT 값을 취함에 의해 수행되는데, 이는 타겟 샘플과 내인성 조절 간의 평균 CT에서의 편차(ΔCT)가 계산되고, 타겟의 ΔCT로부터 타겟에 대한 칼리브레이터의 평균 CT를 차감(ΔΔCT)하여 수행된다. 마지막으로, 타겟에 대한 상대적인 정량화 값은 유전자 발현의 상향 또는 하향 조절의 정도를 평가하기 위해 2-ΔΔCt로 표현된다.
결과
실시간 정량 리버스 트랜스크립타제(RT)-PCR (TaqMan)은 유전자 발현에서 변화를 확인하고 밝히는데 민감하고 믿을 수 있는 접근법을 제공한다. TaqMan 시퀀스 디텍터(ABI PRISM™7700 시퀀스 디텍션 시스템, Applied Biosystem, Foster City, CA)는 핵산 시퀀스의 고산출 정량화를 위한 시스템을 제공하기 위해 하드웨어/소프트웨어 수단을 PCR-기재 분석에 합체한다. 이는 열적 주기화, 형광 검출 및 적용-특정 소프트웨어를 조합하여 특정 PCR 산물의 양의 증가의 주기 대 주기 검출(cycle-by-cycle)을 허용한다.
마이크로어레이 분석을 통해 지적된 몇몇의 고도로 제어된 유전자의 발현은 TaqMan™플렛홈(platform)을 사용하여 입증된다. 각 경우에서, 가능하다면, 사용된 각 모델 시스템의 시간 경로가 포함되어진다. 이는 특정 유전자가 완전한 과정동안에 어떻게 행동하는가에 대해 보다 많은 정보를 모을 수 있게한다.
유전자 발현에서의 변화는 분석되는 유전자에 특정한 증폭 산물에 의해 표현된 이중 사슬 DNA에 대한 SYBR 그린 염료의 결합에 의해 창제된 형광의 측정을 통해 PCR 산물의 증가의 직접 검출을 통한 TaqMan™을 통해 정량되어질 수 있다. 대조 샘플에 대한 특정 cDNA 종의 평가는 생리학적인 참고로 작용하는 캐리브레이터(calibrator) 샘플에 대한 특정 유전자에 상응하는 메신저 RNA로부터 전환된 cDNA의 정량화에 의해 수행된다. 이 캐리브레이션은 대조 또는 비처리된상태로부터 샘플에 의해 제공된다. cDNA 종의 상대적인 정량화는 역전사 반응의 전환 효능성에서 및 템플레이트 cDNA를 생성하기 위해 사용된 전체 RNA의 양 및 초기 농도에서 다양성을 고려한 GAPDH에 대한 정상화로 계산된다.
분비된 포스포프로테인 1(오스테오폰틴) 유전자의 발현은 큐퍼리죤 모델과 연계된 수초탈락/재유수화 패러다임에 걸친 시간 경로 연구에서 분석된다.
큐퍼리죤 재유수화 모델에서 오스테오폰틴 발현을 위한 TaqMan 실험의 결과는 도 1(A)에 나타나있다. 오스테오폰틴의 mRNA 준위는 큐퍼리죤 투여의 3주 후(3 w. Cup.)에 마우스 전 뇌에서 18배 상향 조절되고, 처리의 5주 후(5 w. Cup.)에 25배 상향 조절된 것으로 발견된다.
오스테오폰틴 발현은 큐퍼리죤 처리의 5주 후 더욱이 1, 3 및 6 주의 재생 후(5 w. cup. + 1 w, 3 w. 및 6 w.)에 하향제어된다. 재유수화는 탈유수화가 여전히 진행되고 있을 때 시작되기 때문에, 이들 발견은 모델의 탈수초 및 재미엘린화 상에서 오스테오폰틴의 중요한 역활을 나타낸다.
도 1(B)는 전개성 소뇌에서 오스테오폰틴 발현 수준의 결과를 나타낸다. 오스테오폰틴 mRNA는, 소뇌에서 미엘린화의 시발의 시간 기간인 C4 내지 C8 일인, 생후 초기의 전개 동안에 일시적으로 상향조절된다.
마이크로어레이 결과는 큐퍼리죤 처리 동안 마우스 전 뇌에서 오스테오폰틴의 상향 조절을 나타낸다. 이 분석은 오스테오폰틴 발현의 프로필로 신장하여 큐퍼리죤 처리의 탈수초 및 재미엘린화 상태 양자를 포함하고, 오스테오폰틴 발현 프로필은 큐퍼리죤 처리의 탈수초 상태 동안에, 그리고 베이스라인 수준으로 복귀한 회복 기간 동안에 피크로되는 것을 나타낸다.
그 결과는 다음 표 7에 나타난다.
오스테오폰틴 발현의 TaqMan™분석의 결과는 3 및 5주 동안 큐퍼리죤을 공급한 마우스의 뇌에 상향조절을 확인한다.
[표 7]
큐퍼리죤 모델에서 오스테오폰틴 제어의 TaqMan™분석
| 조직 타입 | 실험 | 발현 준위 | 제어 |
| 전 뇌 | Cup. control | 1.00 | Control level |
| 전 뇌 | Cup. control | -1.32 | down |
| 전 뇌 | 3 w. Cup. | 17.51 | up |
| 전 뇌 | 3 w. Cup. | 23.43 | up |
| 전 뇌 | 5 w. Cup. | 20.25 | up |
| 전 뇌 | 5 w. Cup. | 23.43 | up |
| 전 뇌 | 5 w. Cup. + 1 w. R. | 1.79 | up |
| 전 뇌 | 5 w. Cup. + 1 w. R. | 3.32 | up |
| 전 뇌 | 5 w. Cup. + 3 w. R. | 2.95 | up |
| 전 뇌 | 5 w. Cup. + 3 w. R. | 4.56 | up |
| 전 뇌 | 5 w. Cup. + 5 w. R. | -1.16 | down |
| 전 뇌 | 5 w. Cup. + 5 w. R. | 1.04 | Control level |
| 전 뇌 | 5 w. Cup. + 5 w. R. | 1.07 | Control level |
실시예 3: 노던 블롯(Northern Blot)에 의한 분화적 오스테오폰틴 발현의 확인
방법
블롯 조제
특정 유전자에 대해, 발현의 조직 특정성은 마우스 멀티-티슈 노던 블롯(Clontech Labs, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto CA)을 사용하여 분석된다. 이들은 성인 마우스의 다른 조직으로부터 레인 당 2㎍의 폴리(A)+ RNA를 함유한다. 별개 블롯이 생체외 및 생체내 양 상황에서 분화적 유전자 발현의 분석을 위해 준비된다. 3 주, 5 주에 큐퍼리죤 처리된 마우스 및 회복 과정(6주 까지) 동안의 1, 3 및 6-주 시간 점에서 마우스의 뇌로부터 분리된 RNA가 일 세트의 블롯 상에 사용된다. 생후의 다른 날 단계로부터 전체 뇌 RNA가 제이 세트 상에 사용된다. 마지막으로, RNA의 시간 경로 시리즈가 디부티릴-cAMP로 다른 길이의 시간 동안 처리되고 배양으로 성장된 올리-뉴 세포로부터 제조된다. 이 RNA는 제삼 세트의 블롯을 제조하기 위해 사용된다. 새로운 블롯은 최대의 검출 효능성을 공고히하고, 하이브리드형성 후 고르지않은 스트립핑에 기한 결과의 다양성을 최소화하기 위해 각 유전자-특정 탐침자로 사용된다. 모든 블롯은 두번 접종되는데, 먼저 의도하는 유전자에 대한 탐침자로하고 그런 다음 스트립핑 후, RNA 로딩에 있어 변화를 제어하기 위해 마우스 글리세르알데하이드-3-포스페이트(mGAPDH)에 대한 탐침자로 한다.
RNA(10㎍/웰)은 포름알데히드 및 5X MOPS(멸균 H2O를 갖는 5L에 209.27g 3- (N-모르폴리노)-프로판술폰산, 20.5 g 소듐 이세테이트, 50 mL 0.5 M EDTA pH 8.0을 12 M NaOH로 pH. 7.0로함)를 함유하는 1.2% 변성 아가로스 겔 상에 적하된다. 각 RNA 샘플은 2㎕ 에티디움 브로마이드(0.01mg/ml), 2㎕ 5X 3-(N-모르폴리노)-프로판술폰산(MOPS), 3.5㎕ 37% 포름알데히드 및 10㎕ 포름아미드와 혼합된다. 샘플은 그런 다음 65℃에서 10분 동안 가열되고 얼음 상에서 급히 냉각된다. 2㎕ RNA 적하 완충액(50% 글리세롤, 1mM EDTA, 0.4% 브로모페놀 블루 및 0.4% 크실렌 시안놀 염료)이 겔 상에 적하되기 전에 각 샘플에 즉시 부가된다.
각 겔 주입은 ~3 시간 동안 1X MOPS 러닝 버퍼(1L = 330 mL 37% 포름알데히드, 400 mL 5X MOPS, 270 mL DEPC-처리된 H2O)에서 5 V cm-1 (겔 길이)에서 된다. 양성적으로 하전된 나이론 멤브레인(Hybond™-N, Amersham Life Sciences, Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England HP7 9NA)으로 밤샘 RNA 이전이 SSC 용액을 사용하여 기술된 바와 같은 수행이 뒤따른다(Terry Brown, Unit 4.9, Current Protocols, 1993 [ed. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G. Seidman, J.A. Smith, and K. Struhl]). RNA 이전 효능성은 UV 광선하에 평평화된 겔과 멤브레인을 검사함에 의해 체크된다. RNA는 멤브레인에 스트레이트링커(Stratalinker)(Stratagene, USA)를 통해 가교된다. 블롯은 하이브리드형성 전에 실온에서 왓트만(Whatman) 3MM 필터 페이퍼의 시트 사이에서 보관된다.
탐침자 제조
방사성활성인 32P-표지 탐침자가 목적 유전자에 대응하는 cDNA 클론(길이가 ~500 > 800 bp)의 겔-정제 제한 분획을 사용하여 준비된다. DNA 분획은 하이프라임(HighPrime™) 라벨링 시스템(Roche Diagnostics AG, Industriestraβe 7, 6343 Rotkreuz, Switzerland)을 사용하여 32P-dCTP로 특정 활성 > 109 cpm ml
-1로 랜덤하게 표지된다. 비합체된 32P-dCTP는 세파덱스(Sephadex™) G-25 미디움(0.15% Kathon™CG/ICP Biocide™을 함유한 증류수에서의 DNA 등급)를 함유한 파머시아(Pharmacia) NAP™5 컬럼을 통해 탐침자 혼합물의 중력에 기한 용출을 통해 제거된다.
하이브리드형성 및 신호 검출
탐침자 하이브리드형성은 제조자의 설명에 따라 ExpressHyb™(Clontech Labs, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto CA)을 사용하여 수행된다. 블롯은 자동 방사촬영 카셋트에서 -80℃에서 Hyperfilm™MP(Amersham Pharmacia Biotech, England)에 하이브리드형성에 따라 노출된다. 노출에 따른 탐침자 스트립핑은 블롯을 10분 동안 멸균 H2O/0.5% SDS 용액 내에서 90-100℃에서 배양하고 나서 블롯을 10분 동안 냉각시킴에 의해 수행된다. 스트립된 멤브레인은 플라스틱에 밀봉되고 -20℃에서 재탐침이 요구될 때 까지 보관된다.
결과
노던 블롯 분석은 이미 대 규모의 분화적 유전자 발현 연구에서 이차적 확인 기술로 사용되어왔다(Chang 등, 2000). 이의 민감성 및 정확성은 주어진 원하는 유전자에 대한 발현의 조직 특정성 뿐 아니라 실험적 및 대조 조건 사이의 분화적 제어의 정도의 분석을 허용한다. 이는 이것이 마이크로어레이 분석을 통해 얻어진 DGE 결과를 확인하는 신뢰성있는 방법으로 만든다. 또한, 노던 블롯은 원하는 유전자에 상당하는 가능한 대안적인 스플라이스(splice) 이소형과 전사 크기에 대한 정보를 제공한다.
종래 노던 블롯은 큐퍼리죤-처리되고 조절된 마우스의 뇌로부터 분리된 RNA를 사용하여 제조된다. 이들은 인사이트 제노믹으로부터 송달된 클론으로부터 방사활성적으로 표지된 DNA 분획으로 탐침된다. 유전자 발현의 TaqMan™분석을 통해 관찰된 결과를 재생산하기 위한 노던 블롯은 큐퍼리죤으로 처리된 마우스의 뇌로부터 분리된 RNA의 블롯에 접종된 마우스 오스테오폰틴에 대한 방사활성적으로 표지된 탐침자를 사용하여 입증된다. 이런 방식으로, 큐퍼리죤 모델에서 오스테오폰틴의 발현의 TaqMan™분석에 비교하는 것이 가능하다.
도 3은 인사이트 제노믹으로부터 주문된 pT7T3D-Pac 벡터 안으로 삽입된 마우스 오스테오폰틴에 대한 열린 판독 프레임을 나타낸다. 회백질 영역은 코딩 시퀀스이고 화살표는 오스테오폰틴에 대한 완전한 cDNA를 나타낸다. 삽입된 클론은 EcoRI 및 NotI 제한 사이트의 측면으로 지난다. 이 유전자의 조직 발현을 분석하기 위해 노던 블롯팅에 사용하기 위한 탐침자를 만들기 위해, 893-bp 분획이 HincII 및 StyI 제한 효소를 사용하여 클론으로부터 잘린다. 이 분획은 탐침자로서 사용을 위해 겔 정제되고 라벨된다.
마우스 오스테오폰틴의 발현은, 회복 및 비처리된 조절을 포함하여 큐퍼리죤 모델에서 각 단계로부터 마우스의 뇌로부터 RNA로 제조된 종래 블롯을 사용한 노던 블롯 분석을 통해 확증된다. 블롯은 먼저, 노출에 따른 스트립된, 마우스 오스테오폰틴 cDNA의 방사활성적으로 표지된 분획으로 탐침되고, 그리고 나서 마우스 GAPDH의 방사활성적으로 표지된 분획으로 탐침된다. 이것은 블롯 상의 각 레인에서 RNA의 전체 양의 다양성에 기하여 관찰된 발현 준위에서의 차이를 고려한 양성적 대조로서 사용된다.
큐퍼리죤-처리된 마우스의 뇌에서 오스테오폰틴의 발현은 서서히 높아져 5주에 가장높은, 큐퍼리죤 공급의 3 및 5주에 피크에 달한다. 회복상태 동안, 오스테오폰틴 mRNA의 준위는 큐퍼리죤 공급의 중단 후 1주에 발현이 인식할 만큼 감소하는, 상대적으로 빠르게 감소한다. 오스테오폰틴 mRNA의 준위는 6주 회복 후에 대략 정상적인 준위로 복원한다. 이는 큐퍼리죤 모델에서 오스테오폰틴 발현의 TaqMan™분석에서 얻어진 결과에 양적으로 비교할 수 있다(도 1A 참고).
실시예 4:올리-뉴 세포에서 오스테오폰틴의 조절
cAMP로 처리된 희돌기교세포(올리-뉴)에서 오스테오폰틴 발현은 TaqMan 분석으로 측정된다. 결과는 도 4에 나타난다. 컬럼 1 내지 4는 희돌기교세포에서 얻어진 결과를 나타낸다. 대조로 비교된 바와 같이(값 = 1), cAMP로 처리 6시간(col. 1)은 오스테오폰틴 mRNA의 상향조절을 이끈다. cAMP 처리의 2d 후(col. 2), 12배 상향조절이 측정된다. 6 내지 10d 동안의 장시간 처리(col. 3,4)는 오스테오폰틴 mRNA의 낮은 준위를 이끈다. 큐퍼리죤 모델에서 오스테오폰틴 mRNA의 조절에 비교(col. 5, 6)는 전 뇌에서 규퍼리죤의 3 및 5주 후 오스테오폰틴의 상향조절이 cAMP 처리의 2 d 후 희돌기교세포에서 상향조절에 비교할 만하다는 것을 보여준다.
실시예 5?: 희돌기교세포에서 오스테오폰틴의 발현
방법
올리-뉴 세포는 칼슘 포스페니트 침전 방법에 따라 일시적으로 형질전환된다. 간단히는, 지수적 성장 상태로부터 올리-뉴 세포가 형질전환이 수행되기 전일에 6-웰 플레이트 안으로 시드된다(10e5/ml). 100㎕의 250mM CaCl2의 용액이 5㎍의 플라스미드 DNA와 혼합된다. Na2HPO4 및 NaH2PO4의 300mM 저장 용액으로부터 pH 7.05에서 포스페이트로 현탁된 동등한 부피(100㎕)의 2x HEPES 용액(140mM NaCl, 50 mM HEPES pH 7.05)이 Ca/DNA 용액에 부가된다. 정확하기로는 1분 후, 이 혼합물은 온화하게 배양 플레이트에 부가되고, 37℃에서 CO2 인큐베이터 내에서 4시간 동안 배양된다. 이 시간 후, 배지는 신선한 배지로 교환되고 그리고 나서 세포는 수확 및 웨스턴 블롯팅에 의한 분석 전에 24-72시간동안 배양된다.
결과
pDEST12.2 벡터(pDEST12.2- 오스테오폰틴-EGFP, pDEST12.2-오스테오폰틴-His6, pDEST12.2-오스테오폰틴, 도 4 내지 7 참고, 및 대조 플라스미드로 pCIE- EGFP)에서, 다른 마우스 오스테오폰틴 구성이 올리-뉴 세포에 형질도입된다. 프로테인이 생성되고 특정 상업적 항체(R&D 시스템, AF808)에 의해 검지된 세포에 의해 분비된다. EGFP 표지된 구조는 형질도입 초기 및 형질도입 후 24시간의 모니터링을 하게하고, 세포 형태학상 특정 변화(희돌기교세포 과정에서 증가)는 pCIEGFP 대조(도시생략)와 비교로 검지될 수 있어, 이는 오스테오폰틴이 마우스 희돌기교세포 세포 라인 올리-뉴를 보다 성숙한 형태학적 표현형으로 유도한다는 것을 나타낸다. 오스테오폰틴 형질도입된 올리-뉴 세포에 의해 표현된 형상은 미엘린화 희돌기교세포의 형상과 매우 유사하다.
이들 결과는 희돌기교세포에서 오스테오폰틴의 발현이 이들 세포를 미엘린화로 유도하는데 유익하고, 따라서 희돌기교세포 기능이상에 연관된 질환에서 오스테오폰틴의 유익한 효과를 나타낸다는 것을 입증한다.
실시예 6: 큐퍼리죤 모델에서 뇌의 특정 영역에 오스테오폰틴 프로테인의 발현
오스테오폰틴 면역조직화학은 큐퍼리죤 모델에서 탈- 및 재유수화의 다양한 시점에서 수행된다. 수초탈락의 사이트에 현저한 소신경교세포 보강과 연계된 시점인, 큐퍼리죤 처리의 5주에 강한 신호가 탈미엘린화 신체 칼섬 및 선조체 번들에서 발견된다. 활성화된 소신경교세포 세포를 시각으로 볼 수 있게 하기 위해, 연속하는 부분에 CD68 염색이 수행되고, 유사한 발현 패턴이 오스테오폰틴의 소신경교세포 발현을 제시한다.
흥미롭게, 오스테오폰틴은 또한 전(前) 심실에 있는 세포에 발견된다. 이 영역은 뉴론, 성상신경교세포 및 희돌기교세포의 생성을 위한 복합잠재성의 줄기 세포를 갖는 성인 아래뇌실 영역으로 기술된다. NG2, PSA-NCAM, PDGFa 리셉터로 이중 염색은 희돌기교세포의 전구체 세포 발현 오스테오폰틴을 결정하기 위해 수행되어진다.
실시예 7: 희돌기교세포 증식에 대한 오스테오폰틴 프로테인의 효과
t-뉴(neu) 온코젠(oncogene)("올리-뉴" 세포 라인)으로 불사된 뮤린 일차 희돌기교세포(희돌기교세포의) 세포 라인이 이 실험에서 사용된다. 올리-뉴 세포 라인의 확립 및 특성 뿐 아니라 배양 조건은 Jung 등(1995)에 기술된다.
이 연구의 목적은 올리-뉴 증식 분석에서 희돌기교세포 증식에 대한 OPN 효과의 측정이다. 세포는 아래서 합류하게 놓여진다. 이들은 대조 또는 재조합 프로테인으로 처리되기 전에 인슐린 유리 배지에서 24시간 동안 절식된다. 세포 수는 형광 판독을 주는 알머 블루(Alamar blue)로 정량된다. 잠재성에 대한 계산은 IGF1 (control) 표준 곡선에 대한 비교에 기초된다. 증식 저해의 계산은 dbcAMP 표준 곡선에 대한 비교에 기초된다.
재료
장비 및 소프트웨어
Wallac Victor 2 multilabel counter
(excitation at 530-560 nm, emission at 590 nm)
Graph Pad Prism software
시약
올리-뉴 세포 라인 (Eur J Neuro 7:125-1265 (1995))
알머 블루(BioSourceIntl. Inc., Camarillo, CA93012)
사토 배지(Sato medium) 조성은 다음과 같은:
| 산물 | 공급처 | 저장용량 | 500ml 당 ㎕ |
| DMEM | Seromed F0435 | 500 ml | |
| 트랜스페린 | Sigma T-2252 | 100 mg/ml (1 mg in 10ml PBS) | 50 |
| 소듐 세레나이트 | Sigma S-9133 | 1 mg/2.56 ml PBS | 50 |
| 인슐린 | Sigma I-1882 | 10 mg/ml (100 mg/10ml PBS) | 500 |
| 퓨트레신(Putrescine) | Sigma P-7505 | 80.5 mg/ml (PBS) | 500 |
| 프로게스테론 | Sigma P-0130 | 0.62 mg/ml (EtOH) | 50 |
| TIT (Triiodothyronine) | Sigma T-5516 | 1.7mg/ml (1/3 HCl 1N+2/3 EtOH | 100 |
| L-티록신(Thyroxine) | Sigma T-0397 | 2.88 mg/ml + 1 drop NaOH 1N | 100 |
| L-글루타민 | Gibco 25030-024 | 200 mM | 5000 |
| 겐타마이신(Gentamycin) | Gibco15750-037 | 50 mg/ml | 250 |
| 소듐 비카보네이트 (Bicarbonate) | Gibco 25080-052 | 7.50% | 13000 |
| 말 혈청 | 5000 | ||
Becton Dickinson사로부터 폴리 D 라이신 (356461); R3-IGF1(Sigma사로부터 I1146); DbcAMP(Sigma사로부터 D-0627)으로 코팅된 생체도막 평평 바닥 플레이트(BioCoat flat bottom 플레이트)
방법
생체외에서 바이오어세이를 위한 세포의 배양
올리-뉴 세포는 BioCoatTM 폴리-라이신 예비-도포된 96 웰 플레이트 상에 플레이트된 폴리-L-라이신 기질 세포 상에 성장하는 부착 세포이다. 이 세포는 2-3x/ 주로 분열한다. 분열을 위해, 이들은 먼저 PBS로 수세되고 나서 PBS 플러스 1 mMEDTA로 단리된다. 세포는 가습된 10% CO2 배양조에서 성장된다.
사용된 동결 배지는 20% FCS 및 10% DMSO를 갖는 사토 배지이다. 이 실험에서, 16계대 보다 높지않은 올리-뉴 세포가 사용된다. 세포는 인슐린을 뺀 사토 배지에서 24시간 절식 후 96 웰 플레이트에서 웰 당 4000 세포의 최종 농도로 사용된다.
알머 블루 염색
CO2 배양기에서 48시간 후, 10㎕의 알머 블루 용량이 웰에 부가되고 부가적인 2.5시간 동안 배양된다. 형광은 530-560nm 여기 및 590nm 방출 파장에서 검출된다. 플레이트는 형광 단위에 대해 1 밀리온(million)까지 그리고 4시간 까지 판독될 수 있다.
실험 설계
대조로서, 100ng/ml R3-IGF-1(양성적 대조), 또는 1 mM dbcAMP(음성적 대조), 또는 100nM의 가열 OPN 또는 인슐린을 갖지않는 배지가 사용된다. 실험적인 샘플은 1 nM, 10 pM, 0.1 pM, 0.01 pM 또는 100 nM의 재조합 오스테오폰틴이다. 대조 및 실험적 샘플은 인슐린을 뺀 사토 배지에서 50㎕의 최종 부피를 갖는 희망하는 농도로 희석되어 웰에 부가된다. 올리-뉴 세포는 인슐린 유리 배지에서 24시간 동안 성장되고 그리고 나서 48시간 동안 대조 또는 실험적 샘플로 처리된다. 인슐린을 뺀 배지에서 24시간 동안 신선하게 절식된 단리된 올리-뉴 세포가 PBS 플러스 1 mM EDTA를 갖는 성장 플라스크로부터 얻어진다. 세포는 ml 당 300,000 세포로 준비되고 웰 당 50㎕를 부가한다. 그리고 나서, 세포는 48시간 동안 37℃에서 습윤 CO2 배양기에서 배양된다. 10㎕ 알라머 블루(alamar blue)가 부가되고 세포는 2.5시간 동안 배양기로 환원된다. 그리고 나서, 각 웰로 부터 70㎕가 블랙 96 웰 플레이트로 이전되고 즉시 형광도가 측정된다.
분화되지 않은 올리-뉴 세포의 증식은 24시간 후에 곤충 세포 (BacOPN), 또는 포유류의 발현 시스템(HEK-OPN)을 사용하여 생산된 다른 양의 오스테오폰틴에 감응하여 측정된다. 성장 율은 형광도/색도계 성장 인디케이터인, 알머 블루로 세포의 대사성 활성을 측정함에 의해 정량된다. 이 제제는 세포 성장으로 기인한 성장 배지의 화학적 환원에 반응하여 형광 및 그의 색상 변화 양자를 나타내는 산화-환원 인디케이터를 함유한다. 사용된 제제 및 분석은 Ahmed 등 (1994) 및 US 특허 5,501,959에 기술되어 있다.
결과
결과는 도 8 내지 10에 도시된다.
복용 반응은 바큘로바이러스 발현 및 HEK 세포 발현인, 재조합 오스테오폰틴으로 관찰된다. 가열에 의한 프로테인의 퇴화는 기대되는 바와 같이, 생물학적 활성을 파괴한다. 바큘로바이러스 발현 오스테오폰틴 (BacOPN) 및 HEK 세포 발현 OPN (HEK OPN)의 부가는 HekOPN에 3.7nM 및 0.05 nM의 BacOPn에 대해 IC50(도 9)을 갖 는 세포 증식의 용량 의존적인 증가(도 8)로 나타난다. 부가하여, 이소형 a의 아미노산 1 내지 168에 상당하는 N-말단 OPN 구조(도 2 참고, N-말단 OPN-a)는 곤충 세포에서 발현된다. 정제된 프로테인은 완전한 길이의 프로테인에 비교하여 증식 분석에 시험된다. 완전한 프로테인은 활성(10nM, 100 nM)이다. 도 10 참고.
실시예 8: 혼합된 피질성의 배양에서 미엘린화 마커의 발현에 대한 오스테오폰틴의 효과
커버슬립(coverslips) 상에서 성장한 혼합된 피질성의 배양은 Bac OPN(100nM)로 DIV(생체외에서의 날) 5-17로부터 12일 동안 처리된다. 생체외에서 17일에, 배양은 고정되어 안티-MBP 항체로 염색된다. 결과는 BacOPN 커버슬립이 대조에 비해 높게 분지된 MBP 양성적 희돌기교세포가진다는 것을 보여준다(도 11). 부가하여, 대조 배양(도 11 A)에 반해 미엘린화 희돌기교세포는 관찰되지 않고, OPN 처리된 배양(도 B, C 및 D)은 희돌기교세포가 풍부하여, 축삭을 둘러 싸 미엘린 분획과 인터노드(internodes)를 형성한다(도 11 B 내지 D). 분획 덩어리를 헤아림은 비록 대조에 분획이 관찰될 수 없지만, 세개의 다른 OPN 처리된 샘플이 16, 22, 및 18 분획 덩어리에 나타난다는 것을 밝힌다. 이들 결과는 오스테오폰틴을 갖는 피질성의 혼합된 세포의 처리가 미엘린화 희돌기교세포에 특징적인 희돌기교세포의 분화된 표현형을 이끈다는 것을 나타낸다.
실시예 9: MBP ELISA에 의해 측정된 혼합된 피질성의 배양에서 MBP의 발현에 대한 오스테오폰틴의 효과
MBP ELISA가 MBP 프로테인 증가와 이에 따른 LIF 처리된 혼합된 피질성의 배양 및 OPN에서 미엘린화를 관찰하기 위해 사용된다.
일차 배양
물질원은 성교-후 16일에 임신한 NMR1 자성 마우스로부터 분리된, 배아로부터의 배아성 마우스 뇌 조직이다. 배아는 Lubetzki 등의 프로토콜에 따라 분리되고, 피질은 트립신 소화에 의해 탈거되고 탈거된 세포(뉴론, 성상신경교세포, 희돌기교세포, 소신경교세포 및 신경 전구체를 포함)는 폴리-L-라이신 예비-도포된 96-웰 배양 플레이트(50-㎕의 초기 부피로)상에 각 웰에 대해 웰 당 1*105 세포로 심어진다.
재조합 프로테인 처리
처리는 재조합 프로테인(양성적 대조, AMRAD Laboratories으로부터 구입한 재조합 마우스 백혈병 저해성 인자(LIF), 1 ㎍/ml, 100 ng/ml, 및 10ng/ml의 농도에서; 100 nM, 10 nM, 및 10 pM의 농도에서 마우스 바큘로바이러스-생산 완전한 길이의 오스테오폰틴)을 사용하여 수행된다. 모든 프로테인은 생체외에서 세포에 부가에 앞서, 저장물질로부터 적절한 농도로 배양배지에 희석된다. 배양은 5 일 동안 생체외에서 성장되고 나서 17 일 동안 연속적으로 처리되게된다. 배지는 매 3일 마 다 교환된다.
샘플 수득을 위한 마이크로웰 플레이트 프로토콜
세포는 용해되고 샘플은 생체외에서 17일 후(DIV17)수득된다. 세포 용융은 트리플 디터전트 버퍼를 사용하여 수행된다.
트리플 디터전트 버퍼
최종농도
50 ml Tris pH 8.0 1 M 50 mM
8.77 g NaCl 150 mM
2 ml NaN3 (10%) 0.02%
5 ml SDS 20% 0.1%
10 ml NP40 1%
5g 소듐 데옥시콜레이트e 0.5%
단일 프로테아제 저해제 타블렛(Roche no. 1836170)가 사용에 앞서 10ml의 트리플 디터전트 버퍼 용액에 부가된다.
배지는 96-웰 예비-도포된 플레이트에 심어진 혼합된 피질성의 배양 샘플로부터 제거된다. 세포는 50㎕의 1X PBS로 이회 온화하게 수세되고 나서 50㎕의 트리플 디터전트 버퍼가 각 웰에 부가된다. 접합된 샘플을 함유하는 모든 마이크로웰 플레이트는 그런 다음 분석에 앞서 -20℃에서 보관된다.
BCA 프로테인 분석
피어스(Pierce) BCA 프로테인 분석은 전체 프로테인의 정량 및 색도계 검출을 위한 비신코닌산(bicinchoninic acid; BCA)에 기재된 디터전트와 조화할 수 있는 제형이다. 이 방법은 알카리 배지에서 프로테인에 의한 Cu+2 에서 Cu+1로의 잘 알려진 환원과 비신코닌산을 함유하는 유일한 시약을 사용한 아주 민감하고 선택적인 구리 양이온(Cu+1)의 색도계적인 검출을 조합한다.
이 분석의 자주색 반응 산물은 일 구리 이온으로 두 분자의 BCA의 킬레이트반응에 의해 형성된다. 이 물 가용성 복합체는 20㎍/ml 내지 2000㎍/ml의 광범위한 작업 범위에 걸쳐 증가하는 프로테인의 농도와 평행하는 562nm에서 강력한 흡수를 보인다. BCA 방법은 진정한 말단점(end-point) 방법이 아니라- 최종 색상은 전개를 계속함- 배양에 따라, 색상 전개의 비율은 충분하게 느려 다수의 샘플이 단일 실행에서 수행되어지게 한다. 프로테인의 거대분자 구조, 다수의 펩티드 결합 및 네개의 아미노산(시스테인, 시스테인, 트립토판 및 트립신)의 존재는 BCA로 색상 형성에 의한다고 보고되었다.
전체 프로테인 함량의 결정을 위한 마이크로 웰 플레이트 프로토콜
25㎕의 각 표준(BSA 농도: 2000 ㎍/ml, 1500 ㎍/ml, 1000 ㎍/ml, 750 ㎍/ml, 500 ㎍/ml, 250 ㎍/ml, 125 ㎍/ml, 25 ㎍/ml) 및 샘플이 적절한 웰 플레이트에 부가된다. 25㎕의 희석제(트리플 디터전트 버퍼)가 블랭크 웰에 대해 사용된다(20-2000 ㎍/ml의 작업 범위).
200㎕의 작업 시약(50부의 BCA 시약 A와 1부의 BCA 시약 B의 혼합물)이 각 웰에 부가된다. 플레이트 웰이 30초 동안 흔들려지고 37℃에서 30분 동안 배양된다. 배양 후 흡광도 값은 570nm에서 측정된다.
MBP 샌드위치 ELISA
96-웰 평평-바닥 멸균 마이크로플레이트(Costar)가 +4℃에서 1X PBS에서 1:5000로 희석된 안티-MBP 항체(Chemicon, MAB5274)로 밤세워 배양된다. 50㎕의 희석 항체 용액이 각 웰에 부가된다.
다음 날에, 항체 용액은 플레이트 내의 모든 웰로부터 제거되고 블록킹 단계(blocking step)가 각 웰에 대해 1X PBS에서 50㎕의 1% BSA 용액을 사용하여 수행된다. 블록킹은 1시간 동안 대류온도에서 수행된다. 플레이트는 PBS/Tween를 사용한 블록킹 단계에 따라 자동적으로 3회 수세된다.
배양은 마이크로웰 플레이트에 1% BSA/PBS 내에 샘플 또는 MBP 펩티드 표준의 일련의 희석제의 부가 후 수행된다. MBP 펩티드 100 ng/ml 저장 용액은 2 대 2로 희석된다. 여기서 사용된 희석은 BCA 프로테인 분석의 결과를 사용하여 전체 프로테인 함량의 계산 후에 결정된다. 이들은 다음과 같다:
100 ㎕; 50 ㎕; 25 ㎕; 12.5 ㎕; 6.2 ㎕; 3.1 ㎕.
MBP 표준 및 프로테인 샘플로 배양 후, 플레이트는 1% BSA/PBS에서 다시 3회 세척된다.
제 이 배양은 1% BA/PBS에서 희석된 폴리크로날 안티-MBP 항체(Zymed 10-0038, 1:300)을 사용하여 수행된다. 플레이트는 2시간 동안 대류온도에서 배양된다. 이 배양 후, 플레이트는 상기와 같이 다시 3회 세척된다.
1%BSA/PBS에서 희석 후 모든 웰에 50-㎕ 부피에 부가된, 염소(goat) 안티-래빗 바이오틴(벡터 BA-1000, 1:10,000)으로 배양이 1시간 동안 대류온도에서 수행된다. 플레이트는 상기와 같이 배양에 따라 다시 세척된다.
최종 배양은 각 웰에 부가되는 1X PBS에 희석된 50㎕의 스트렙타비딘-융합 호스 래디쉬 퍼옥시다제(streptavidin-conjugated horse radish peroxidase (strep-HRP) (Amersham RPN 1051, 1:8000))로 수행된다. 플레이트는 1시간 동안 대류온도에서 배양된다.
수세 단계 후, 반응은 오르도페닐렌디디아민 디하이드로크로라이드(OPD) (Sigma, 20-ml 부피의 물에 1 타블렛을 부가함에 의해 제조된 용액)를 사용하여 밝혀진다. 이 반응은 3 M HCl 또는 30% H2SO4의 부가를 통해 블록된다. 광학 밀도는 멀티-스캔 프루오로플레이트 리더(Labsystem Multiskan EX)을 사용하여 492nm에서 측정된다.
결과
도 12에 나타난 바와 같이, MBP 프로테인 준위는 bacOPN (10 nM) 처리된 배양에서 DIV 17에서 대조 배양에 비하여 3배 증가된다. 이 관찰은 희돌기교세포 전구체 증식 및 미엘린화에 대한 바큘로바이러스 발현 OPN의 양성적인 효과를 나타내는 이전의 결과를 지지한다.
실시예 10: CG4 증식에 대한 오스테오폰틴의 효과
CG4 세포 라인은 랫트 불사 희돌기교세포 세포 라인으로, 이는 자발적으로 일차 A2B5 희돌기교세포 전구체로부터 수득된다. CG4 세포는 희돌기교세포 분화 또는 생존을 연구하기 위해 일반적으로 사용된 세포 라인이다. CG4 세포 라인은 다음같은 이점을 갖는다:
●희돌기교세포 후대같은 높은 증식 비율(O2A-like) (GD3, A2B5-양성적 세포);
●ATCC로부터 얻어진 B104 랫트 신경모세포증 세포 라인(Louis J.C. 등 1992)으로부터 수득된 제어된 배지 (유효한 배양-인자 농도로)에서 낮은 유지 비용.
●한정 배지(무 FBS)가 단기간 동안의 증식을 위한 B104 조건의 배지 대신에 사용될 수 있음(FGF2+PDGF로 보충);
●희돌기교세포로 분화(O4,GalC-positive)는 한정 배지로 시발될 수 있음;
●성상신경교세포로 분화(GFAP-positive)는 FBS의 존재하에 시발될 수 있음;
계대 수 35의 CG4 세포가 증식에서 두 OPN 프로테인(E-coli 또는 곤충 세포에서 발현)의 효과를 시험하기 위해 사용된다. 오스테오폰틴을 생산한 R&D 시스템 E-coli(Cat.441-OP)가 이 분석에 사용되고, 이것은 그런 다음 생체외에서 다음과 같이 60ml 부피에서 프로테인 키나제 2(GST 접합된 것)로 인산화된다:
키나제 버퍼 6x: 샘플 버퍼 2x pH6
Hepes 50mM Tris-Cl 0.125
MgCl2 10mM 글리세롤 20%
DTT 1 mM DTT 0.2M
소듐 바나데이트(Vanadate) 0.2mM 브로모페놀 블루 0.02%
베타 글리세롤포스페이트 25mM
ATP 혼합 (60μM)
600mM에서 30 ㎕ ATP
5 ㎕의 32pATP
265 ㎕ H2O2
반응을 시작하기 위해 ATP 혼합이 부가되고 배양은 30℃에서 1시간 동안 수행된다. 30℃에서 배양(교반으로) 90분 후, 100㎕ 글루타티온 세파로스 비즈(Pharmacia)가 프로테인 키나제를 제거하기 위해 PBS에서 예비적으로 수세된 반응 혼합물에 부가된다. 그런 다음, 혼합물은 온화하게 교반하면서 실온에서 1시간 동안 배양된다. 현탁액은 500g에서 5분 동안 원심분리되어 비즈가 가라앉는다. 그리고 나서, 상등액은 PBS에 대해 4℃ 이상에서 밤세워 투석된다. 프로테인은 BCA(Pierce)에 의해 정량된다.
키나제 반응:
0.05 ㎍/ml에서 10㎕ 카제인 키나제
0.5 ㎍/ml에서 10 ㎕ E-coli OPN
20 ㎕ 50 mM Tris-HCL ph 8
10 ㎕ 키나제 버퍼 6x
10 ㎕ ATP 혼합물
증식 분석
Bac OPN 및 생체외에서 인산화된 OPN 프로테인은 10pM, 10nM 및 100nM 농도에서 CG4 세포의 증식에 대해 시험된다. 판독으로서는 BrdU(Amersham)가 Avellana 등 1996에 기술된 바와 같이 사용된다. 세포는 70% N1 한정 배지(4.5g'l 글루코스, 2 mM 글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 1 mM 소듐 피루베이트를 함유하고 5 ㎍/ml 트랜스페린, 100 mM 퓨트레신, 30 nM 소듐 셀레나이트 및 10 ng/ml 바이오틴으로 보충된 DMEM) 및 30% B104 조건 배지(바이오틴 무 N1)에 서 배양된다(Louis J. C. 등 1992). 분석은 3x104 세포/웰로 심어진 폴리-오르니틴(100 mg/ml) 처리된 24 웰 플레이트에서 수행된다. 10 nM BrdU가 같은 시간에 부가되고 18시간 동안 배양된다. 고정화 후, 면역세포화학이 안티-BrdU 항체로 수행되어 세포 분화를 검지한다. 세포는 또한 획스트(Hoechst) 44432 스테이닝(Sigma)으로 염색되어 전체 세포 수를 헤아린다. Leica QWin 이미지 분석 시스템을 사용하여 이미지가 얻어지고 분석된다.
결과
결과는 도 13에 나타난다.
바큘로바이러스 발현 오스테오폰틴은 CG4 세포의 증가된 증식을 이끈다. 비록 100 nM의 OPN이 보다 잘 증식으로 이끌 수 있지만, 가장 공시된 효과는 10 nM OPN의 농도에서 관찰될 수 있다. 생체외에서 인산화된, E.- coli 발현 OPN은 CG4 세포의 적은 증식을 이끈다.
OPN 처리 대 비-처리된 CG4 세포의 형태학의 분석은, 비록 대조에서 비 분화가 관찰될 수 있지만, OPN 처리된 CG4 세포는 대부분의 세포가 과정을 진행으로 분화되어진다는 밝힌다. 비록 분화는 바큘로바이러스 발현 OPN을 사용하여 보다 공시되지만, E. coli 발현된, 생체외 인산화된 OPN은 보다 잘 CG4 세포 분화를 이끈다(도시 생략).
실시예 11: 마우스에서 MOG-유발 실험적 자가면역 뇌척수염 (EAE)에 대한 오스테오폰틴의 효과
연구과정
오스테오폰틴(OPN; AS900011)은 점착, 이동, 분화, 생존 및 다양한 세포 타입의 사이토킨 분비를 포함하는 다형질발현성의 기능을 갖는 사이토킨이다. OPN은 재유수화 및 희돌기교세포 기능을 조정할 수 있는 유전자 검출의 목적으로 하는 분화적인 유전자 발현 (DGE) 어프로치에서 동정된다(실시예 1참고). 희돌기교세포 전구체를 재조합 바큘로바이러스 발현 OPN(AS900011)으로 처리는 복용량 의존 형식으로 증식을 증가한다(IC50: 3.7 pM, 실시예 7 참고). 부가하여, AS900011는 CG4 세포 라인 및 일차 신경구(neurospheres)의 분화에 효과를 보인다(실시예 8 참고). OPN은 큐퍼리죤으로 처리된 마우스의 미엘린화된 신체 칼로섬 뇌 영역에서 발현되는데, 여기서 발현이 미세신경교 세포에서 가장 강하다(실시예 1 참고). 부가하여, OPN 발현은 심실 아래 영역(SVZ)에서 관찰되어, 재유수화에 참여하는 희돌기교세포 전구체를 생성하는 것을 제시한다(실시예 4 참고). 다양한 면역-조절 특성을 갖는 사이토킨인 OPN은 또한 신경 및 신경교의 기능으로서 역활을 할 수 있다.
이 연구의 목적은 마우스에서 MOG-유발 EAE의 모델에서 OPN의 치료적 효능을 시험하기 위한 것이다.
시험 방법
이 연구에 사용된 EAE의 유발 방법은 Sahrbacher 등 (1998)에 의해 공고된 프로토콜로부터 각색된다. 이 실험에 사용된 몽물의 보호는 1992년 1월 27일에 이탈리아의 D.L. No. 116로 시행된 Directive 86/609/EEC에 따른다. 동물의 수용 및 보호를 위한 물리적인 기구 및 장비는 EEC Council Directive 86/609의 규정에 따른다. 연구소는 Competent Veterinary Health Authorities에 의해 완전히 권한을 받는다. 동물 관리에 관한 이 프로토콜의 모든 부분은 공식적인 전문가에 의해 승인되었다. 이 프로토콜은 이탈리아 보건장관에 의해 권한을 받는다(Decree No. 51/99-B).
시험 시스템
종, 스트레인, 서브스트레인 및 성:
IFFA CREDO (Saint Germain sur l'Arbresle, France) 콜로니로부터 C57 BL/6JICO 자성 마우스가 Charles River Italia(Calco, Lecco, Italy)사에 의해 공급된다.
시험 시스템의 선정을 위한 조정:
C57 BL/6JICO 마우스가 실험 모델로 선택된다; 이 선택된 스트레인은 EAE에 감염하기 쉬움이 기록되어있다.
공급원:
Charles River Italia S.p.A.
Via Indipendenza, 11
23885 - Calco (Lecco)
요구 사항:
적어도 연구 5일 전에 시작된다. 이 기간 동안에 동물은 매일 연구에 대한 이들의 적합성을 확인하기 위해 관찰된다.
연령 및 체중(무작위로):
약 8-주 령; 18-22 g.
수용:
10 마리/에어컨이 장착된 실내의 우리.
온도: 22℃ ±2
상대습도: 55% ±10
환기 : HEPA 99.99% 상에 여과된 약15-20/시간.
조명: 12시간 주기(7 a.m. - 7 p.m.)
우리: 각각 스테인레스 스틸 커버-급식 선반을 갖춘 Makrolon™우리 42.5x26.6x15h. 그릴이 우리 바닥에 삽입된다. 그릴을 통해 우리 바닥으로 떨어진 노폐물은 주기적으로 치워진다.
동물 동정:
귀의 태그에 의함. 우리 카드는 실험 번호, 복용 그룹 및 화합물 투여의 일 을 표시한다.
다이어트:
Charles River Italia의 급식 라이센시인 Mucedola S.r.l., Settimo Milanese에 의해 생산된 GLP 4RF25 정상급 펠렛화 음식(top certificate pelleted diet). 아픈 동물의 영양 공급을 용이하게 하기 위해, 7일 부터 적은 펠렛이 매일 우리 바닥에 놓여진다. 생산업자는 EPA-TSCA(44FR:44053- 44093, 1979년 7월 26일)에 의해 제안된 한계 내인 수준이라는 영양소 및 오염원에 대한 분석의 증명서를 제공한다. RBM은 박테리아 오염에 대해 매년 적어도 두번 재분석된 동물 음식을 갖는다. 다이어트는 동물에 이용할 수 있는 "ad libitum"이다.
물:
도시의 주요 급수 시스템으로부터 이용. 물은 여과되어 자동적인 밸브 시스템에 의해 동물에게 "ad libitum"을 공급한다. 플라스틱 병이 자동적 급수 시스템에 부가하여 사용된다. 부기적으로 물을 마시는 것은 미생물학적 카운트, 중금속, 기타 오염원(즉, 용매, 살균제) 및 다른 화학적 및 물리적 특징을 위해 분석된다. 물 흡수 양의 허용된 한계는 EEC Directive 80/778에 기술된 것으로 한다.
연구의 대상물에 간섭될 수 있는 오염원은 이 음식 또는 공급된 물에 존재하는 것으로 기대되지는 않는다.
시험 기질:
뮤린, 6 his-태그된 오스테오폰틴 (AS900011) 및 mIFNβ
면역화 과정:
마우스는 좌측 측복부에 0.5mg의 미코박테리움 튜브큐로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 포함하는 컴플릿 프룬트 어쥬번트(Complete Freund's Adjuvant) (CFA, Difco, Detroit, U.S.A.)에서 200㎍ MOG35-55 펩티드(Neosystem, Strasbourg, France)로 구성된 0.2 ml의 에멀젼을 s.c. 주사함에 의해 면역된다(일=0). 직 후, 이들은 400 ml의 버퍼(0.5 M NaCl, 0.017% Triton X-100, 0.015 M Tris, pH=7.5)에 용해된 500ng 페르투시스 톡신(pertussis toxin)(List Biological Lab., Campbell, CA, U.S.A.)을 i.p. 주사로 맞는다. 2일에, 동물은 500ng 페르투시스 톡신을 이차 i.p. 주사로 맞는다. 7일에, 마우스는 좌측 측복부에 CFA 내 200mg의 MOG35-55 펩티드를 s.c. 주사로 이차 복용량을 받아들인다. 대략적으로 8-10일로부터 시작하여, 이 절차는 점진적으로 꼬리로부터 유발되어 전사지로 오라가는 진행성 마비를 일으킨다.
연구 디자인:
연구는 각 15 동물의 7 그룹을 포함한다. 모든 그룹은 면역화 프로토콜에 따라 CFA 내 MOG35-55 펩티드 및 페르투시스 톡신으로 면역되고 다음과 같이 처리된다:
그룹 1: OPN 담체 만으로(PBS + 0.1% BSA) s.c. 경로에 의해 투여된 양성적 대조군 .
그룹 2: mIFNβ담체 만으로(PBS) s.c. 경로에 의해 투여된 양성적 대조군 .
그룹 3: 1 mg/kg s.c. 의 오스테오폰틴(AS900011)으로 투여
그룹 4: 10 mg/kg s.c 의 오스테오폰틴 (AS900011)으로 투여
그룹 5: 100 mg/kg s.c. 의 오스테오폰틴 (AS900011)으로 투여
그룹 6: 100 mg/kg s.c. 의 오스테오폰틴 (AS900011) 플러스 20,000 U/마우스 s.c. 의 mIFNβ으로 투여
그룹 7 : 20,000 U/마우스 s.c. 의 mIFNβ으로 투여
그룹 당 동물의 수는 관찰된 약리적 효과의 정확한 평가를 위한 최소의 수이다.
담체:
PBS 플러스 0.1%BSA가 오스테오폰틴을 적절한 농도로 희석하기 위해 사용된다. PBS는 mIFNβ을 적절한 농도로 희석하기 위해 사용된다.
투여 경로:
1, 10 및 100 ㎍/kg의 복용량에서 오스테오폰틴(AS900011)은 10 ml/kg의 부피로 s.c. 투여된다. 20,000 U/마우스의 복용량에서 mIFNβ 200 ㎕/마우스의 부피로 s.c. 투여된다. 그룹 1은 PBS 플러스 0.1 %BSA를 10 ml/kg의 부피로 s.c. 복용되고 그룹 2는 200 ㎕/ PBS/마우스로 s.c. 복용된다.
처리 기간:
이 연구 군의 처리는 각 동물에 대해 임상적 스코어 ≥1의 발현으로 시작하고 그리고 나서 35일 동안 계속된다.
투여의 형태:
화합물 및 mIFNβ는 적절한 담체에 용액으로 투여된다. 각 제형은 스폰서의 지시에 따라 제조된다.
임상적 관찰:
면역화 후 7일 부터 시작하여 동물은 개개적으로 다음과 같은 임상적 값의 수단으로 마비의 존재에 대해 시험된다:
0 = 질환의 신호 없음
0.5 = 부분적인 꼬리 마비
1 = 꼬리 마비
1.5 = 꼬리 마비 + 부분적인 비평형적 후사지 마비
2 = 꼬리 마비 + 후사지 병약 또는 부분적인 후사지 마비
2.5 = 꼬리 마비 + 부분적인 후사지 마비 (lowered pelvi)
3 = 꼬리 마비 + 완전한 후사지 마비
3.5 = 꼬리 마비 + 완전한 후사지 마비 + 실금
4 = 꼬리 마비 + 후사지 마비 + 전사지의 병약 또는 부분적인 마비
5 = 치사
동물의 관찰은 조용한 실내에서 수행된다. 임상적 신호는 각 처리 군에서 매일 처리를 모르는 전문가에 의한 브라인드(blind) 형식으로 모니터된다.
동물의 체중이 매일 관찰된다.
고통 상태 또는 치사 상태인 것으로 고려된 동물은 전문가 스템 또는 권한을 받은 사람에 의해 검사되고, 필요하다면, 고통을 줄이기 위해 인간적으로 희생시킨다.
혈액 샘플링:
마지막 처리 24시간 후, 혈액 샘플이 각 동물로부터 모아진다(펜토바비탈 마취 하에). 혈청이 루틴한 절차에 의해 분리되고 혈청 샘플은 -20℃에서 보관된다. 동결된 혈청은 그런 다음 화합물 혈청 농도의 상대적인 결정을 위해 SPRI로 이동된다.
병역적 시험:
처리의 말단에, 펜토바비탈 마취하의 동물에 좌측 심실을 통해 4% 포름알데하이드를 확산 고정한다. 그런 다음, 이들의 척추를 조심스럽게 탈거하여 포르말린에 담근다. 척추 슬라이스는 파라핀 블록에 끼워진다. 염증에 대해 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)과 수초탈락을 위해 Kluver-PAS(Luxol fast blue plus Periodic Acid Schiff staining)로 염색 및 분획화가 실행된다.
데이타 평가:
임상적 검사 결과는 각 군내에서 평균(±SEM) 값으로 표현된다. 시험 기질의 효과는 담체-처리된 양성적인 대조군의 것과 비교된다. 각 그룹 사이에 임상적 스코어 값의 차이는, 유의성의 경우에 각 평가 시에 쌍의 형식으로 윌콕슨 테스트(Wilcoxon test)에 따른, 크루스칼-왈리스 테스트(Kruskal-Wallis test)에 의해 분석된다. 체중 데이타는, 유의성의 경우에 투키(Tukey) 테스트에 따른 원-웨이 아노바(one-way ANOVA)에 의해 평가된다. S- 플러스™소프트웨어가 사용된다.
결과:
이 연구의 결과는 14 내지 16에 나타난다.
혈관 주위의 염증성의 침입의 조직학적인 분석은 OPN 처리된 동물에서, 특히 1 ㎍/kg의 가장 낮게 복용된 양에서 혈관 주위의 침입의 보다 낮은 양을 향한 경향이 있음을 보여준다. 다중 경화증의 치료에 활성적인 것으로 알려진 화합물인, OPN 및 IFNβ의 조합은 각각 OPN 또는 IFN 단독의 투여보다 효과적이다(도 14).
다음으로, 탈미엘린화된 영역의 백분율이 측정된다(도 15). 다시, OPN로 처리된 동물에서, 덜 탈미엘린화된 영역에 대한 경향이 관찰될 수 있다. IFN 및 OPN의 조합은 IFN 단독으로 관찰된 탈유수화의 정도보다 아주 낮은 수초탈락의 아주 유의성있는 감소로 이끈다(도 15).
도 16은 처리의 마지막에, 이 연구에서 측정된 염증성의 침입 탈유수화가 관찰된 이상적 스코어를 요약한다. 비록 OPN 처리된 마우스에서 관찰된 임상적 스코어가 대조군보다 유의적으로 낮지 않지만, OPN 및 IFN의 조합은, 인터페론-베타인 양성적 대조군보다 낮은 임상적 스코어에 대한 공고한 효과를 이끈다. 이 관찰은 염증성의 침입 및 수초탈락의 정도의 평가에 동의하는 것이다. 양 변수는 OPN 및 IFNβ의 투여 후 유의적으로 감소된다(도 16).
요약하면, 다음의 결과가 이 연구에서 관찰된다:
1, 10 및 100 mg/kg s.c.의 복용량에서 단독 시험된 오스테오폰틴 (AS900011)은 혈관 주위의 침입 및 탈유수화를 통계적으로 유의성을 가지고 감소하지 않는다. mIFN베타(20,000 U/마우스 s.c.)로 처리는 혈관 주위의 침입(55%) 및 탈유수화(53%)에서의 감소를 유도한다. 동일 복용량에서 mIFN베타가 100 mg/kg s.c.의 복용량에서 AS900011와 조합되면, 염증성의 침입(71%) 및 탈유수화(81%)의 유의성있고 현저한 감소가 관찰된다.
임상적 스코어와 상호연관된 조직학적인 데이타는, 조직학적인 분석을 위해 동물이 희생되고 척추가 수거된 35일(처리의 마지막)에 관찰한다. 1, 10 및 100 mg/kg s.c.의 복용량에서 단독 시험된 오스테오폰틴(AS900011)은 질환의 심각성을 유의성을 가지고 감소하지 않는다. 동일 복용량에서 mIFN베타가 100 mg/kg s.c.의 복용량에서 AS900011와 조합되면, 임상적 신호의 통계적으로 유의성있는 감소가 관찰된다.
이들 데이타는 조합된 오스테오폰틴 및 mIFN베타 처리가 마우스 EAE 모델에서 임상적 및 병리학적 효과 양자를 감소하는데 유효하고, 따라서 다중 경화증의 유효한 치료일 수 있다.
실시예 12: 마우스에서 좌골 신경 압좌에 의해 유발된 신경병증에 대한 오스테오폰틴의 보호적 효과
약어
CMAP : 잠재적 근육작용 화합물(compound muscle action potential)
EMG : 근전도계(electromyography)
IGF-1 : 인슐린-형 성장 인자
SC : 피하로
s.e.m. : 평균의 표준 편차(standard error)
vs : 대(versus)
도입
신경병증은 통상적으로 영향을 받은 PNS 뉴론의 타입(즉, 감각 대 자율) 및 또한 실제로 뉴론의 서브타입(소형 대 대형)에 선택적이다. 근위 신경의 액소토미(Axotomy)는 신경친화성 인자의 신경보호적인 효과를 관찰하기 위한 가장 공통적으로 사용되는 동물 모델이다. 외상성 신경 손상, 신경총 손상 및 근(根) 손상은 사고의 심각한 합병증이다. 부가하여, 미엘린 손상을 일으킬 수 있는 근위 신경에 대한 압박은 수근의 터널 증상(tunnel syndrom)같은 질환에서 자주 관찰되거나 척주 정형의 합병증과 연관된다. 액소토미는 세포 사, 감소된 축삭의 전도속도 및 손상된 뉴론에서 변경된 신경전달자(neurotransmitter) 수준과 같은 현상을 발생한다. 압좌 손상은 신경병증 상태에 관해 흥미있는 부가적인 과정인 재생성이 허용된다(McMahon S. 및 Priestley J.V. 1995).
세포의 신경생리학에서 기초적인 의문은 상해 또는 질환 후 신경 재생성의 조절이다. 기능적인 신경 재생성은 축삭의 퍼트림(sprouting) 및 신장 뿐 아니라 새로운 미엘린 합성을 요한다. 재유수화는 정상 신경 전도 및 새로운 신경퇴화적 면역학적 공격으로부터 축삭의 보호가 요구된다. 신경퇴화적 장애에서의 연구의 일차적인 목표는 신경 사를 방지하고, 신경 표현형을 유지하고 신경 및 미엘린 손상을 치유하는 조정을 극단적으로 발전시키는 것이다. 많은 연구는 옥소톰화된 척추의 운동 뉴론의 완전한 재생을 하는 분자성 및 세포성 메카니즘을 밝히는데 공헌을 하였다(Fawcett 등, 1990; Funakoshi 등, 1993). 신경친화성 인자 및 상응하는 리셉터의 손상-유발 발현은 신경 재생성의 능력에 중요한 역활을 할 수 있다. 이전의 연구는 신경 재생성에 인슐린-형 성장 인자(IGF-1), ACTH(Lewis 등, 1993; Strand 등, 1980), 테스토스테론(Jones, 1993), SR57746A(Fournier 등, 1993) 및 4-메틸카테콜(Kaechi K 등 1993, 1995; Hanaoka Y 등 1992)같은 다양한 펩티드 및 비펩티드 화합물로 유의성있는 개선을 나타냈다.
본 연구는 다른 복용량으로 오스테오폰틴 처리된 마우스에서 신경의 재생성을 평가하기 위해 수행된다. 이 모델에서 신경 및 축삭의(감각 및 운동 뉴론) 생존 및 재생성, 미엘린화 또는 마크로파지 염증에 대한 OPN의 긍정적인 효과는 운동 기능의 회복을 이끈다. 재생성은 감각운동 기능의 회복 및 형태학적 연구에 따라 측정될 수 있다. 따라서 본 연구에서 전기물리학적 기록과 조직형태학적 분석이 병행하여 수행된다.
재료 및 방법
동물
84 마리의 8 주령 자성 C57bl/6 RJ 마우스(Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, France)가 사용된다. 이들은 7 그룹으로 나뉜다(n = 12) : (a) 담체 위약 조작 그룹 ; (b) 담체 신경 압좌 조작 그룹 ; (c) 신경 압좌/오스테오폰틴(1 ㎍/kg) ; (d) 신경 압좌/오스테오폰틴(10 ㎍/kg) ; (e) 신경 압좌/오스테오폰틴(100 ㎍/kg) ; (f) 신경 압좌/4-메틸카테콜(10 ㎍/kg) ; (g) 신경 압좌/변성 오스테오폰 틴(100 ㎍/kg).
이들은 그룹별로 수용되고(우리단 5 동물) 조절된 온도(21-22℃)의 인큐베이터에서 유지되고, 음식 및 물이 이용할 수 있는 ad libitum으로 공급되며 명-암 주기(12h/12h)가 교효로 된다. 모든 실험은 연구소의 가이드라인에 따라 수행되었다.
좌골 신경의 손상
동물은 60 mg/kg 케타민 크롤하이드레이트(Imalgene 500™ Rhone Meieux, Lyon, France)의 IP 주사로 마취된다. 우측 좌골 신경은 넓적다리 중간 수준에서 외과적으로 노출되어 좌골 신경의 삼분기에 5mm 기단에서 압좌된다. 신경은 지혈제 집게(폭 1.5 mm; Koenig; Strasbourg; France)으로 30초 간, 각 압좌 사이에 90도 회전으로 이회 압좌된다.
실험 및 약리적 처리 계획
근전도계(EMG) 시험은 수술일 전에 한번(베이스라인) 그리고 조작에 따른 3 주 동안 매주 수행된다.
신경 압좌 수술일은 일 (D) 0으로 된다. 압좌에 따른 4일 동안 시험은 수행되지 않는다.
체중 및 생존율은 매일 기록된다.
신경 상해일 부터 연구 끝까지, 4-메틸카테콜의 매일 주사가 IP로 수행되는 반면 오스테오폰틴 및 변성된 오스테오폰틴이 SC 경로로 매일 투여된다.
네번째 주에, 각 그룹 당 4 동물이 희생되어 좌골 신경이 형태학적 분석을 수행하기 위해 탈거된다.
전기물리학적 기록
전기물리학적 기록은 뉴로매틱(Neuromatic) 2000M 근전도계(EMG) (Dantec, Les Ulis, France)를 사용하여 수행된다. 마우스는 100 mg/kg 케타민 크롤하이드레이트(Imalgene 500™ Rhone Meieux, Lyon, France)의 복막내 주사로 마취된다. 정상적인 체온은 가열 램프로 30℃로 유지되고 접촉 온도계(Quick, Bioblock Scientific, Illkirch, France)를 꼬리에 두어 조절된다.
잠정적 근육 작용 화합물(CMAP)은 최대 강도(12.8 mA)로 좌골 신경의 단일 0.2ms 자극 후 비복근 근육에서 측정된다. 진폭(mV), 잠복기(ms) 및 잠정적 작용의 기간(탈분극 및 재분극 기간에 요구된 시간)이 측정된다. 진폭은 활성인 운동 단위의 수를 나타내어, 기저 잠복기는 간접적으로 운동 신경 전도와 신경근육의 전달 속도를 반영한다.
형태학적 분석
형태학적 분석은 신경 압좌 후 3주에 수행된다. 각 그룹 당 네마리의 임의적으로 선택된 동물이 이 분석에 사용된다. 이들은 100 mg/kg Imalgene 500™의 IP 주사로 마취된다. 좌골 신경의 5mm 분획이 조직학적 분석을 위해 절개된다. 이 조직은 인산염 완충액 용액(pH = 7.4)에서 4 % 수성 용액 글루타르알데하이드(Sigma, L'lsle d'Abeau-Chesnes, France)으로 밤세워 고정되고, 사용될 때 까지 30% 슈크로스 용액에 +4℃에서 유지된다. 신경은 인산염 완충액에서 2% 오스뮴 테트록사이드(Sigma, L'lsle d'Abeau-Chesnes, France)에서 2시간 동안 고정되고, 일련의 알콜 용액에서 탈수되고, Epon에 끼원진다. 끼워진 조직은 그런 다음 중합화 반응을 위해 3일 동안 +70℃에 놓여진다. 1.5㎛의 횡 단면이 마이크로톰으로 만들어져 1%의 톨루이딘 블루(Sigma, L'lsle d'Abeau-Chesnes, France)로 2분 동안 염색되고 탈수되어 유키트(Eukitt)에 장착된다. 샘플 당 20 분획이 광학 현미경(Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 관찰되고, 형태학적인 분석은 준자동화된 디지탈 이미지 분석 소프트웨어(Biocom, France)로 신경 샘플 당 6개의 랜덤화된 슬라이스 상에서 수행된다. 슬라이스 당 두 영역이 연구된다. 다음의 변수가 계산된다: 퇴화 섬유의 백분율(영역 당) 및 전체 섬유 수.
데이타 분석
데이타의 G글로벌 분석이 하나의 인자 또는 분산(anova) 및 원 웨이 어노바의 반복된 측정 분석 및 비-변수적 시험(mann whitney test)을 사용하여 수행된다. 듀넷(dunnett's) 테스트가, 적당하다면 더 사용된다. 유의성의 수준은 p < 0.05로 설정된다. 결과는 평균 ±평균의 표준편차(s.e.m.)로 표현된다.
결과
모든 동물은 신경 압좌 절차 후 생존한다. 마우스(신경 압좌/담체 n°2)는, EMG 평가 동안 마취의 결과로, 7 및 2일에 죽고(담체 위양 조작된 것 n°3 및 N°6) 14일에 죽는다.
동물 체중
도 17에 도시된 바와 같이, 유의성있는 그룹간차이가 연구를 통해 체중의 진행으로 나타난다[F (6, 132) = 1.93 및 p < 0.001 ; 반복된 측정 ANOVA].
모든 다른 그룹은 연구를 통해 체중의 증가를 보인다.
전기물리학적 측정
잠정적 근육 작용 화합물의 진폭(도 18):
연구를 통해 CMAP의 진폭에서 유의성있는 그룹간의 차이가 있다 [F (6, 18) = 49.185 및 p < 0.001; 반복된 측정 ANOVA] (도 19).
신경 손상 후, 신경 압좌를 수용한 모든 동물은 위약으로 조작된 그룹에 비하여 CMAP 진폭의 유의성있는 감소를 나타냈다(p < 0.001 ; Dunnett's test).
더욱이, D 7 및 D 14에는, 100 ㎍/kg의 오스테오폰틴 또는 10 ㎍/kg의 4-메틸카테콜로 처리된 마우스의 CMAP 진폭은 신경 압좌/담체의 것에 비하여 유의성있게 높았다(p < 0.05 ; Dunnett's test).
신경 압좌/담체 그룹과 신경 압좌/D-오스테오폰틴 100 ㎍/kg 사이의 유의성 있는 차이는 나타나지 않았다.
잠재적 근육 작용 화합물의 잠복기(도 19):
도 20에 도시된 바와 같이, CMAP 잠복기에서 유의성있는 그룹간의 차이가 있다 [F (6, 18) = 2.521 및 p < 0.001 ; 반복된 측정 ANOVA]. D 21에, 신경 압좌 그룹은 위약으로 조작된 그룹에 비하여 증가된 CMAP 잠복기를 나타낸다(p < 0.001 ; Dunnett's test). 더욱이, 10 및 100 ㎍/kg로 오스테오폰틴 처리 유의성있는 효과를 보여, 실제로 이들 그룹의 잠복기는 신경 압좌/담체의 것에 유의적으로 유사하였다(p = 0.017 ; Dunnett's test).
신경 압좌/담체와 신경 압좌/D-오스테오폰틴 100 ㎍/kg 그룹 사이의 유의성있는 차이는 없었다.
잠재적 근육 작용 화합물의 기간(도 20):
연구를 통해 CMAP 기간에서 유의성있는 그룹간의 차이가 있다 [F (6, 18) = 25.15 및 p < 0.001 ; 반복된 측정 ANOVA] (도 20).
D 7 이래로, CMAP 기간의 유의성있는 증가가 신경 압좌 그룹에서 관찰 된다(위약 조작 그룹 vs 신경 압좌 그룹 : p < 0.001; Dunnett's test). 더욱이, D 7에 신경 압좌/오스테오폰틴 100 ㎍/kg은 신경 압좌/담체 그룹의 것보다 유의적으로 짧은 기간을 보였다(p < 0.001; Dunnett's test).
D 14 및 D 21에, 세 그룹은 신경 압좌/담체 그룹에 비해 유의성있는 감소된 기간을 나타낸다: (a) 신경 압좌/오스테오폰틴 10 ㎍/kg ; (b) 신경 압좌/오스테오폰틴 100 ㎍/kg ; (c) 신경 압좌/4-메틸카테콜 10 ㎍/kg.
더욱이, 신경 압좌/담체와 신경 압좌/D-오스테오폰틴 100 ㎍/kg 그룹 사이의 유의성있는 차이는 없었다.
형상학적 분석
퇴화 섬유의 백분율(도 21):
통계적 분석은 영역 당 퇴화된 섬유의 백분율에 있어 유의성있는 그룹 간의 차이를 밝힌다(p < 0.001; 원 웨이 ANOVA)(도 22). 모든 신경 압좌 그룹은 유의성있는 퇴화된 섬유의 증가된 백분율을 보인다(p < 0.001, Dunnett's test). 더욱이, 신경 압좌/처리된 마우스는 신경 압좌/담체 그룹의 것보다 유의성있게 낮은 백분율을 나타낸다(p < 0.001; Dunnett's test). 더욱이, D-오스테오폰틴(100 ㎍/kg) 처리된 그룹은 오스테오폰틴-처리된 그룹의 것보다 퇴화된 섬유의 높은 백분율을 나타낸다(p < 0.001; Dunnett's test).
전체 섬유의 수(도 22):
분획은 광학 현미경을 사용하여 관찰되고 형태학적 분석은 비지오랩(Visiolab) 2000 소프트웨어(Biocom, Paris, France)로 수행된다. 동물 당 5분획, 분획 당 2영역이 분석된다. 단지 기능적인 미엘린화 섬유 만이 컴퓨터에 기록된다(미엘린 초 퇴화를 의미하는 모든 퇴화된 섬유는 기록되지 않음).
결론
신경 압좌 모델은 근위 신경병증의 매우 극적인 모델이다. 신경 압좌 직 후, 대부분의 큰 직경 섬유는 기계적인 손상에 기인하여 손실되어, CMAP 진폭의 강한 감소를 가져온다. CMAP 잠복기는 즉시 영향을 미치지는 않지만 퇴화가 조정된 면역인, 이차적인 소직경 섬유의 부가적인 퇴화에 기인하여 21 날에 증가를 보인다(마크로파지, 과립세포). CMAP 기간은 7 일에 증가하여, 14 일에 피크를 이루고 21 일에 7일 시점에 비교할 수 있는 수준으로 복원된다. 이는 21 일에, 압좌 손상이 신경병증 상태와의 관계에서 흥미있는 부가적인 진행인 퇴화를 허용한다는 사실에 기인된다. 이 축삭의 퍼짐/퇴화는 또한 삼 주 시점에 대조군에서 입증된다.
오스테오폰틴은 마우스에서 신경 압좌 모델에서 보호적 효과를 보였다. 감각운동 기능은 복용량 의존적 형태로 상해 후 7, 14 및 21 일에 유의적으로 회복되고, 압좌 후 21 일에 수행된 형상학적 연구는 퇴화 섬유의 백분율에서 유의성있는 감소와 전체 섬유수의 증가를 보인다. OPN은 이 연구에서 사용된 조절 분자, 4-메틸카테콜 만큼 유효하고, 열 실활되고, 퇴화된 OPN 프로테인은 기능적 또는 조직학적인 변수에 대해 유의성있는 효과를 전혀 나타내지 않는다. 기능적 및 조직학적인 회복에 대한 이 긍정적인 효과는 다음에 대한 OPN 효과에 기인되는 것일 수 있다:
- 이차인 퇴화 조절 면역으로부터 섬유의 직접적인 보호;
- 가속화된 재유수화 및 축삭의 보호;
- 가속화된 퇴화/ 손상된 축삭의 퍼짐;
- 마크로파지에 의해 청소된 증가된 미엘린 파편.
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<160> 5
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 314
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala
1 5 10 15
Ile Pro Val Lys Gln Ala Asp Ser Gly Ser Ser Glu Glu Lys Gln Leu
20 25 30
Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro
35 40 45
Ser Gln Lys Gln Asn Leu Leu Ala Pro Gln Asn Ala Val Ser Ser Glu
50 55 60
Glu Thr Asn Asp Phe Lys Gln Glu Thr Leu Pro Ser Lys Ser Asn Glu
65 70 75 80
Ser His Asp His Met Asp Asp Met Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp His
85 90 95
Val Asp Ser Gln Asp Ser Ile Asp Ser Asn Asp Ser Asp Asp Val Asp
100 105 110
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115 120 125
Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr Glu
130 135 140
Val Phe Thr Pro Val Val Pro Thr Val Asp Thr Tyr Asp Gly Arg Gly
145 150 155 160
Asp Ser Val Val Tyr Gly Leu Arg Ser Lys Ser Lys Lys Phe Arg Arg
165 170 175
Pro Asp Ile Gln Tyr Pro Asp Ala Thr Asp Glu Asp Ile Thr Ser His
180 185 190
Met Glu Ser Glu Glu Leu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Ile Pro Val Ala
195 200 205
Gln Asp Leu Asn Ala Pro Ser Asp Trp Asp Ser Arg Gly Lys Asp Ser
210 215 220
Tyr Glu Thr Ser Gln Leu Asp Asp Gln Ser Ala Glu Thr His Ser His
225 230 235 240
Lys Gln Ser Arg Leu Tyr Lys Arg Lys Ala Asn Asp Glu Ser Asn Glu
245 250 255
His Ser Asp Val Ile Asp Ser Gln Glu Leu Ser Lys Val Ser Arg Glu
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Glu Leu Asp Ser Ala Ser Ser Glu Val Asn
305 310
<210> 2
<211> 299
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Arg Ile Ala Val Ile Cys Phe Cys Leu Leu Gly Ile Thr Cys Ala
1 5 10 15
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Tyr Asn Lys Tyr Pro Asp Ala Val Ala Thr Trp Leu Asn Pro Asp Pro
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65 70 75 80
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100 105 110
Glu Ser Asp Glu Leu Val Thr Asp Phe Pro Thr Asp Leu Pro Ala Thr
115 120 125
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165 170 175
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<211> 286
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> homo sapiens
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agcctgcacc cagatcctat ag 22
<210> 5
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<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 5
gcgcaaggag attctgcttc t 21
Claims (22)
- 외상성 신경 손상, 스트로크, 중추신경계(CNS) 또는 말초신경계(PNS)의 탈수초 질환, 신경 퇴화적 질환 및 말초 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경계 질환의 치료, 예방, 또는 치료 및 예방을 위한, 오스테오폰틴 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 신경계 질환이 페닐케톤뇨증 및 기타 아미노산뇨증; 테이-삭스(Tay-Sachs), 니만픽 질환(Niemann-Pick), 및 고오셔 질환(Gaucher's 질환); 후를러(Hurler's) 신드롬; 크라베 (Krabbe's) 질환 및 백질이영양증으로 이루어진 군으로부터 선택된 선천성 대사질환에 의해 야기된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 말초 신경병증이 감각 손실, 근육 약화 및 영양과잉, 감소된 심건 이완, 및 혈관운동 증상으로 이루어진 군으로부터 선택된 단독 또는 조합인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 4항에 있어서, 상기 신경계 질환은 당뇨성 신경병증인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 탈수초 질환이 다중경화증(MS)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 신경퇴화적 질환이 알쯔하이머 질환, 파킨슨 질환, 헌팅톤 질환 및 근위축성 측삭경화증(ALS)인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1항 또는 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오스테오폰틴은:(a)SEQ ID NO: 1을 포함하는 폴리펩티드;(b)SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 168 또는 170을 포함하는 폴리펩티드;(c)SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 16 및 170 내지 314를 포함하는 폴리펩티드;(d)SEQ ID NO: 1의 아미노산 170 내지 314를 포함하는 폴리펩티드;(e)SEQ ID NO: 2을 포함하는 폴리펩티드; 및(f)SEQ ID NO: 3을 포함하는 폴리펩티드으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 오스테오폰틴이 혈액 뇌 간극의 관통을 증진하는 펩티드 또는 프로테인인 캐리어 분자에 접합된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 8항에 있어서, 상기 오스테오폰틴이 폴리에틸렌글리콜(PEG)화된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 프로테인인 캐리어 분자에 접합된 것이 이뮤노그로불린(Ig) 용융을 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1항 또는 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 인터페론을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 12항에 있어서, 상기 인터페론은 인터페론-β인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제 1항 또는 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오스테오폰틴이 체중의 0.001 내지 100mg/kg의 양으로 사용되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 제1항 또는 제3항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 상기 오스테오폰틴이, 오스테오폰틴을 생산하도록 유전적으로 변이된 세포로부터 생성된 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 외상성 신경 손상, 스트로크, CNS 또는 PNS의 탈수초 질환, 신경 퇴화적 질환 및 말초 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경계 질환의 치료, 예방, 또는 치료 및 예방을 위한, 핵산 및 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하며, 상기 핵산이 다음 군으로부터 선택된 아미노산 시퀀스를 포함하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 약제학적 조성물:(k)SEQ ID NO: 1을 포함하는 폴리펩티드;(l)SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 168 또는 170을 포함하는 폴리펩티드;(m)SEQ ID NO: 1의 아미노산 1 내지 16 및 170 내지 314을 포함하는 폴리펩티드;(n)SEQ ID NO: 1의 아미노산 170 내지 314를 포함하는 폴리펩티드;(o)SEQ ID NO: 2을 포함하는 폴리펩티드; 및(p)SEQ ID NO: 3을 포함하는 폴리펩티드.
- 제 16항에 있어서, 상기 핵산 분자가 발현 벡터 시퀀스를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 삭제
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 유전자 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 삭제
- 약제학적으로 허용가능한 캐리어와 함께, 유효량의 오스테오폰틴을 치료가 필요한 인간을 제외한 동물 환자에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,외상성 신경 손상, 스트로크, CNS 또는 PNS의 탈수초 질환, 신경 퇴화적 질환 및 말초 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경계 질환의 치료방법.
- 약제학적으로 허용가능한 캐리어와 함께, 유효량의 오스테오폰틴 및 인터페론을 치료가 필요한 인간을 제외한 동물 환자에 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,외상성 신경 손상, 스트로크, CNS 또는 PNS의 탈수초 질환, 신경 퇴화적 질환 및 말초 신경병증으로 이루어진 군으로부터 선택된 신경계 질환의 치료방법.
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