MXPA02003176A - Neuropeptidos estabilizados por polimero. - Google Patents

Abstract

Se provee un conjugado sustancialmente hidrofilo que tiene un peptido que es capaz de pasar la barrera hematoencefalica covalentemente unido a un polimero no peptidico soluble en agua tal como polietilenglicol; el conjugado exhibe solubilidad mejorada y estabilidad in vivo y es capaz de pasar la barrera hematoencefalica de un animal.

Description

NEUROPEPTIDOS ESTABILIZADOS POR POLÍMERO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un conjugado entre un péptido y un polietilenglicol o un polímero substancialmente substituible y un método de uso del mismo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Durante la última década ha habido un progreso significativo en el descubrimiento y desarrollo de neurofarmacéuticos potenciales (moléculas pequeñas, péptidos, proteínas, y antisentido) para tratar dolor y trastornos cerebrales tales como enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson. Sin embargo, la administración sistémica de muchos neurofarmacéuticos recientemente descubiertos se ha impedido por la ausencia de un sistema efectivo para administrarlos. La inyección intravenosa usualmente no es efectiva debido al transporte no adecuado a través de la barrera entre el cerebro y el suministro sanguíneo (la "barrera hematoencefálica" o "BBB"). La barrera hematoencefálica es una barrera física continua que separa el sistema nervioso central, es decir, el tejido cerebral, a partir de la circulación general de un animal. La barrera está comprendida de células endoteliales microvasculares que se unen juntas mediante uniones estrechas complejas intracelulares. Esta barrera permite el intercambio selectivo de moléculas entre el cerebro y la sangre, y previene que muchos fármacos hidrófilos y péptidos entren dentro del cerebro: Muchos de los novedosos compuestos farmacéuticos neuroactivos potentes no atraviesan la BBB debido a que estos tienen un peso molecular superior a 500 daltones y son hidrófilos. Los compuestos que no son lipófilos y que tienen un peso molecular mayor que 500 daltones generalmente no atraviesan la BBB. Varias estrategias para administrar fármacos no lipófilos, de alto peso molecular al cerebro se han desarrollado incluyendo infusión intracerebroventricular, transplante de células genéticamente diseñadas que secretan el compuesto neuroactivo, e implante de una matriz polimérica que contiene el compuesto farmacéutico. Véase Pardridge, W. M., J. Controlled Reí., (1996) 39:281-286. Sin embargo, todos estos implican procedimientos quirúrgicos invasivos que pueden acarrear una variedad de complicaciones. Cuatro mecanismos de transporte no quirúrgicos se han identificado para atravesar la BBB, incluyendo: (i) difusión transmembranal, (ii) transporte mediado por receptor, (iii) endocitosis mediada por absorbente, y (iv) transporte mediado por vehículo. Véase Brownless et al., J. Neurochemistry, (1993) 60(3): 793-803. La permeabilidad vascular puede incrementarse al abrir las uniones estrechas con soluciones salinas hiperosmóticas y análogos de bradiquinina. Un problema inherente en este método es que los compuestos no deseables en la circulación general entran al cerebro a través de lar aberturas artificialmente agrandadas en la barrera hematoencefálica. Se ha descubierto que las células capilares endoteliales en la barrera hematoencefálica tienen un alto nivel de receptores a transferrina, 5 insulina, factor de crecimiento semejante a insulina I y II, lipoproteína de baja densidad y factor natriurético atrial. Véase Frieden, P. M., J. Controlled Reí., (1996) 46:117-128. La patente de E.U.A. No. 5,833,988 a Frieden describe un método para administrar un neurofarmacéutico o agente diagnóstico a través de la barrera hematoencefálica empleando un anticuerpo en contra del 10 receptor de transferrina. Un factor de crecimiento nervioso o un factor neurotrófico se conjuga a un anticuerpo específico al receptor de transferrina. El conjugado resultante se administra a un animal y es capaz de cruzar la barrera hematoencefálica dentro del cerebro del animal. La patente de E.U.A. No. 4,902,505 a Pardridge et al. describe el 15 uso de péptidos quiméricos para administración de neuropéptido a través de la barrera hematoencefálica. Un péptido específico de receptor se utiliza para llevar un péptido hidrófilo neuroactivo a través de la BBB. Las proteínas vehículo descritas, las cuales son capaces de atravesar la BBB mediante transcitosis mediada por receptor, incluyen histonas, insulina, transferrina, 20 factor de crecimiento semejante a insulina I (IGF-I), factor de crecimiento semejante a insulina II (IGF-II), albúmina básica, y prolactina. La patente de E.U.A. No. 5,442,043 a Fukuta et al. describe el uso de un fragmento de insulina como un vehículo en un péptido quimérico para transportar un neuropéptido a través de la barrera hematoencefálica. Los métodos no invasivos para administrar agentes neurofarmacéuticos a través de la BBB típicamente son menos efectivos que 5 los métodos invasivos que de hecho ponen al agente dentro del cerebro. Dosis altas de péptidos quiméricos se requieren para lograr el efecto terapéutico deseado debido a que éstos son propensos a degradación. La concentración de los péptidos quiméricos en la circulación sanguínea puede reducirse rápidamente mediante proteólisis. Un sistema de administración 10 acuoso generalmente no es efectivo para administrar fármacos hidrófobos. Otro método para administrar compuestos hidrófilos dentro del cerebro mediante transcitosis mediada por receptor se describe en Pardridge et al. en Pharm. Res. (1988) 15(4): 576-582. Un anticuerpo monoclonal al receptor de transferrina (OX26 Mab) modificado con estreptavidina se utiliza 15 para transportar la proteína catiónica, factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) a través de la BBB. BDNF se modifica ¡nicialmente con PEG2000- biotina para formar BDNF-Peg2000-biotina, el cual se une entonces al anticuerpo modificado con estreptavidina OX26 Mab. El conjugado resultante se mostró que es capaz de atravesar la BBB hacia adentro del cerebro. 20 El mejorar la duración de los efectos antinociceptivos en animales puede resultar en analgésicos menos frecuentemente administrados, los cuales pueden mejorar el consentimiento del paciente y reducir los potenciales efectos laterales. Maeda et al. en Chem. Pharm. Bull. (1993) 41 (11 ):2053-2054, Biol. Pharm. Bull. (1994) 17(6):823-825, y Chem. Pharm. Bull. (1994) 4289): 1859-1863 demuestran que al unir amina de polietilenglicol 4000 a la leucina C-terminal de la Leu-encefalina (distante a partir del residuo de tirosina necesario para la antinocicepción), éstos pueden incrementar la 5 potencia y duración de la Leu-encefalina cuando se administran directamente al cerebro mediante inyección intracerebroventricular. Hay una necesidad en la técnica para administrar agentes neuroactivos a partir de la circulación sistémica a través de la barrera hematoencefálica y dentro del cerebro que reduzcan o eliminen algunas de los 10 inconvenientes y desventajas asociados con la técnica precedente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención provee un método para administra un péptido 15 dentro del cerebro de un humano o de otro animal a través de la barrera hematoencefálica. El péptido a ser administrado se une a un polímero no peptídico soluble en agua, para formar un conjugado. El conjugado se administra entonces a un animal en la circulación sanguínea de manera que le conjugado pasa a través de la barrera hematoencefálica y dentro del cerebro. 20 El polímero no peptídico soluble en agua puede seleccionarse a partir del grupo que consiste de polietilenglicol y copolímeros de polietilenglicol y propilenglicol activados para conjugación mediante la unión covalente al péptido.

En una modalidad de esta invención, un conjugado sustancialmente hidrófilo se provee que tiene un péptido analgésico con capacidad de transporte, es decir, un péptido analgésico capaz de pasar la barrera hematoencefálica, covalentemente unido a un polímero no peptídico, soluble en agua tal como polietilenglicol. El conjugado es capaz de pasar la barrera hematoencefálica de una animal. Los péptidos con capacidad de transporte adecuados para uso en esta modalidad de la invención pueden incluir dinorfinas, encefalinas, endorfinas, endomorfinas, y bifalin. Típicamente, éstos neuropéptidos pequeños son susceptibles a la degradación dentro del cuerpo en la circulación sanguínea y en el cerebro. En contraste, cuando se conjugan a polietilenglicol o a un polímero similar no peptídico, no inmunogénico, soluble en agua que tiene propiedades similares, estos péptidos exhiben estabilidad significativamente incrementada. En otra modalidad de esta invención, se provee una composición que comprende un conjugado de esta invención como se describió anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición puede administrarse directamente dentro de la circulación general de una animal mediante cualesquiera medios adecuados, por ejemplo, administraciones por inyección parenteral, inyección a vena intracerebral, y administraciones ¡ntranasales, pulmonares, oculares, y bucales. De conformidad con incluso otra modalidad de esta invención, se provee un método para administrar un péptido analgésico a través de la barrera hematoencefálica dentro del cerebro de un animal. El método comprende proveer un conjugado de esta invención como se describió anteriormente, y administrar el conjugado dentro del torrente sanguíneo del animal hospedero. 5 Se ha considerado previamente que los polímeros hidrófilos grandes tales como polietilenglicol, cuando se unen a un péptido que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, podrían interferir con el transporte del péptido a través de la barrera hematoencefálica. En particular, se cree que la conjugación directa de polímeros hidrófilos grandes a un péptido no 10 solamente podría incrementar la hidrofilicidad sino que también mejora la interacción entre el péptido y su receptor o a otras estructuras en la BBB mediante interferencia estérica a partir de las hebras grandes del polímero. Se ha descubierto actualmente que, aunque el conjugado es substancialmente hidrófilo y contiene un polímero no peptídico soluble en 15 agua, el conjugado no es capaz de pasar la barrera hematoencefálica de un animal. En comparación con su estado nativo, el péptido conjugado a un polímero no peptídico soluble en agua puede exhibir inmunogenicidad reducida, mejora la solubilidad en el agua, e incrementa la estabilidad. En particular, los péptidos conjugados a polietilenglicol de conformidad con esta 20 invención tienen un tiempo de circulación más largo, susceptibilidad reducida a la degradación metabólica y eliminación, y una vez administrados dentro del cerebro a través de la barrera hematoencefálica, exhiben una vida media extendida en el cerebro. Por lo tanto, esta invención permite la administración efectiva de péptidos analgésicos dentro de cerebros de humano y de otros animales y puede mejorar significativamente la eficiencia de los péptidos a ser administrados. 5 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se utiliza en la presente, "pasar la barrera hematoencefálica" o "atravesar la barrera hematoencefálica" significa que una vez administrado dentro de la circulación sanguínea de un animal a una dosis 10 ordinaria fisiológicamente aceptable, un conjugado o un péptido es capaz de pasar la barrera hematoencefálica del animal hasta tal grado que una cantidad suficiente del conjugado o péptido se administra dentro del cerebro del animal para ejercer un efecto terapéutico, antinociceptivo o profiláctico sobre el cerebro, o para afectar el funcionamiento biológico del cerebro hasta un grado 15 detectable. "Pasar la barrera hematoencefálica" o "atravesar la barrera hematoencefálica" también puede utilizarse en la presente para significar que el conjugado o péptido es capaz de ser tomado por el cerebro de un animal hasta un grado que es detectable por un método adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, perfusión de cerebro in situ como se describe en 20 Williams et al., J. Neurochem., 66 (3), pp 1289-1299, 1996, el cual se incorpora en la presente como referencia. El conjugado de esta invención normalmente es substancialmente hidrófilo. Por el término "substancialmente hidrófilo", se pretende que se entienda que el conjugado de esta invención no contiene una porción sustancialmente lipófila tal como ácidos grasos o glucolípidos. Los ácidos grasos y glucolípidos se utilizan en la técnica para incrementar la lipofilicidad de una molécula con el objeto de incrementar la capacidad de la molécula para pasar las membranas celulares. El término "analgésico" como se utiliza en la presente significa cualesquiera sustancias químicas que son deseables para administrarse dentro del cerebro del humano o de otros animales para propósitos de aliviar, mitigar, o prevenir el dolor en humanos o en otros animales, o mejorar de otra manera el bienestar físico o mental de humanos o animales. Los péptidos analgésicos pueden introducirse dentro del cerebro de un animal para ejercer un efecto terapéutico, antinociceptivo, o profiláctico sobre las funciones biológicas del cerebro animal, y pueden ser utilizados para tratar o prevenir el dolor. Los agentes típicamente no considerados "analgésicos" pueden unirse al conjugado péptido/polímero de la invención. Por ejemplo, los agentes de diagnóstico o de imagen pueden unirse al conjugado. La fluoresceína, proteínas, u otros tipos de agentes específicamente dirigidos a un tipo particular de célula o proteína, tales como anticuerpos monoclonales, todos pueden utilizarse en el conjugado de esta invención para propósitos de diagnóstico o de imagen. Como se describe a continuación, cuando un agente es incapaz de pasar la barrera hematoencefálica, es decir, no tiene capacidad de transporte a través de la BBB, entonces típicamente un péptido que es capaz de pasar la barrera hematoencefálica, es decir, tiene capacidad de transporte a través de BBB, se utilizará en un conjugado de esta invención como un vehículo. En una modalidad de esta invención, el péptido es un péptido analgésico con capacidad de transporte. Como se utiliza en la presente, el término "con capacidad de transporte" significa que el péptido es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica de un animal como se definió anteriormente. Por lo tanto, se provee un conjugado que comprende un péptido con capacidad de transporte unido a un polímero soluble en agua, no peptídico, no inmunogénico, que incluye polietilenglicol. El término "péptido" significa cualquier secuencia de a-aminoácidos polimerizados que consiste de 2 a aproximadamente 40 aminoácidos que tienen un enlace peptídico (-CO-NH-) entre cada aminoácido que puede ¡mpactar la condición y función biológica del cerebro de un animal. Un péptido analgésico normalmente es un péptido endógeno que ocurre naturalmente en un animal, o fragmentos o análogos del mismo. Sin embargo, los péptidos no endógenos que pueden impactar las condiciones y funciones biológica del cerebro de un animal también se incluyen. Muchos péptidos se conocen generalmente en la técnica que se cree que son capaces de pasar la barrera hematoencefálica. Los ejemplos de péptidos con capacidad de transporte que se cree que son capaces de pasar la barrera hematoencefálica después del tratamiento con PEG de conformidad con la invención incluyen, pero no se limitan a, bifalin y péptidos opioides tales como dinorfinas, encefalinas, endorfinas, endomorfinas, etc. Muchos derivados y análogos de estos péptidos con capacidad de transporte también pueden utilizarse en la práctica de la invención. 5 Los péptidos opioides se cree que son especialmente adecuados para la práctica de la invención. Los péptidos opioides exhiben una variedad de actividades farmacológicas, incluyendo entre ellas el alivio del dolor y la analgesia. La encefalina es un pentapéptido que tiene una secuencia de 10 aminoácidos de H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH (metionin encefalina) o H-Tyr-Gly- Gly-Phe-Leu-OH (leucin encefalina). Muchos análogos de encefalina han sido identificados y sintetizados los cuales son específicos a distintos tipos de receptores de opiato. Véase, por ejemplo, Hruby y Gehrig, (1989) Medical Research Reviews, 9(3):343-401. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 15 4,518,711 describe varios análogos de encefalina incluyendo DPDPE, [D- Pen2,D-Pen5]encefalina, el cual es un análogo cíclico de encefalina elaborado mediante la sustitución del segundo y quinto residuo de aminoácido de los pentapéptidos naturales ya sea con cisteína o con D- o L-penicilamina (beta, beta-dimetilcisteína) y la unión de dos posiciones mediante un enlace 20 disulfuro. Se ha mostrado que DPDPE es capaz de pasar la barrera hematoencefálica hacia el cerebro. Véase, por ejemplo, Williams et al. (1996) Journal of Neurochemistry, 66(3): 1289-1299. La patente de E.U.A. No. 5,326,751 describe DPADPE preparado mediante la sustitución del resido de Mnát?á amwmñ - - - .-*-.* - glicina en la tercera posición de DPDPE con un residuo de alanina. Ambas patentes se incorporan en la presente como referencias. Otros análogos de encefalina incluyen bifalin (H-Tyr-D-Ala-Gly- Phe-NH-)2, el cual es un análogo sintético de encefalina que es un tetrámero 5 dimerizado producido mediante el acoplamiento de dos unidades que tienen la fórmula H-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-OH en el C-terminal con hidrazina. La forma dimérica de la encefalina mejora la afinidad, y es específica al receptor delta- opioide. Los análogos diméricos de encefalina se describen en Rodbard et al. patente de E.U.A. No. 4,468,383, el contenido del cual se incorpora en la 10 presente como referencia. Las dinorfinas son otra clase de péptidos opioides. La dinorfina naturalmente aislada tiene 17 aminoácidos. Muchos fragmentos de dinorfina y análogos se han propuesto en la técnica, incluyendo, por ejemplo, dinorfina (1-10), dinorfina (1-13), dinorfina (1-13) amida, [D-Pro10] Dinorfina (1-11 ) 15 (DPDYN), análogos de dinorfina amida, etc. Véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,684,624, 4,62,941 , y 5,017,689, los cuales se incorporan en la presente como referencia. Aunque dichos péptidos analgésicos son capaces de transportarse a través de la barrera hematoencefálica, muchos de ellos tienen una vida media muy corta debido a su susceptibilidad a la 20 biodegradación dentro del cuerpo. Incluso aunque el polietilenglicol normalmente tiene un peso molecular grande y es hidrófilo, la conjugación a los péptidos con capacidad de transporte en la ausencia de una porción lipófila no interfiere con la capacidad de transportación de los péptidos. Los péptidos conjugados permanecen capaces de cruzar la barrera hematoencefálica. Típicamente, después de la administración dentro de la circulación general de un animal, el conjugado de la invención, que comprende un péptido con capacidad de 5 transporte unido a un polietilenglicol o a un polímero equivalente, se toma por ele cerebro a porcentajes mucho mayores en comparación con una forma no conjugada del péptido. Los péptidos en los conjugados de esta invención tienen una estabilidad incrementada y exhiben una vida media extendida dentro del cuerpo. 10 En otra modalidad de esta invención, se provee un conjugado que comprende un primer péptido, el cual es un péptido con capacidad de transporte, y un segundo agente neuroactivo unidos entre sí mediante polietilenglicol o un polímero equivalente. Este segundo agente neuroactivo puede o no ser capaz de cruzar la barrera hematoencefálica por si mismo. El 15 péptido con capacidad de transporte se utiliza como un vehículo para transportar un agente neuroactivo que no tiene capacidad de transporte a través de la barrera hematoencefálica hacia el cerebro de una animal. El polímero de unión sirve no solamente como un adaptador sino que también incrementa la solubilidad y estabilidad del conjugado y reduce la 20 inmunogenicidad tanto del neuropéptido como de otros agentes neuroactivos a ser administrados. De conformidad con la invención, el péptido con capacidad de transporte y, opcionalmente, otro agente neuroactivo como se describió anteriormente, están covalentemente unidos a un polímero no peptídico soluble en agua para formar un conjugado de esta invención. Los polímeros no peptídicos solubles en agua adecuados para uso en varios aspectos de esta invención incluyen polietilenglicol, y otros polialquilenglicoles, y 5 copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. Como se utiliza en la presente, el término polietilenglicol ("PEG") es inclusivo y significa cualquiera de una serie de polímeros que tienen la fórmula general: HO-CH2CH2?-(CH2CH2?)n-CH2CH2-OH 10 en donde n tiene un intervalo de aproximadamente 10 a 2,000.

PEG también se refiere a la unidad estructural: -CH2CH2?-(CH2CH2O)n-CH2CH2 en donde n es de aproximadamente 10 a aproximadamente 2000. Por lo tanto, por PEG se entiende PEG modificados incluyendo metoxi- 15 PEG; PEG que tienen al menos una porción terminal diferente a un grupo hidroxilo el cual es reactivo con otra porción; PEG ramificados; PEG colgantes; PEG ahorquillado; y similares. El polietilenglicol útil en la práctica de esta invención normalmente tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 200 a 20 100,000 daltones. Los pesos moleculares de aproximadamente 200 a 10,000 son un poco más comúnmente utilizados. Los pesos moleculares de aproximadamente 300 a 8,000, y en particular, de aproximadamente 500 a aproximadamente 5,000 daltones, son un poco más típicos.

PEG es útil en aplicaciones biológicas debido a que este tiene propiedades que son altamente deseables y generalmente se aprueba para aplicaciones biotécnicas. PEG generalmente es claro, incoloro, inodoro, soluble en agua, estable al calor, inerte a muchos agentes químicos, no se 5 hidroliza o deteriora, y generalmente no es tóxico. El poli(etilenglicol) se considera biocompatible, lo que es decir que el PEG es capaz de coexistencia con tejidos vivos u organismos sin ocasionarles daño. Más específicamente, PEG, en sí mismo, es considerado normalmente no inmunogénico, lo que es decir que el PEG no tiende a producir una respuesta inmune en el cuerpo. Los 10 grupos de activación terminal deseables por medio de los cuales el PEG puede se unido a varios péptidos no deben alterar apreciablemente el carácter no inmunogénico del PEG, así como a evitar efectos inmunogénicos. Los conjugados deseables de PEG no tienden a producir una respuesta inmune substancial o a ocasionar formación de coágulos u otros efectos no 15 deseables. PEG es un polímero en espiral altamente hidratado al azar que puede proteger proteína o péptidos a partir de la digestión enzimática, moléculas del sistema inmune y células, y puede incrementar el volumen hidrodinámico para disminuir su eliminación del sistema reticuloendotelial 20 (RES). PEG es un polímero útil que tiene las propiedades de solubilidad en agua así como solubilidad en muchos solventes orgánicos. Las propiedades de solubilidad únicas de PEG permiten la conjugación (polietilenglicosilados) a ciertos compuestos con baja solubilidad acuosa, con el conjugado resultante siendo soluble en agua. Sin embargo, la polietilenglicosilación, la cual es conjugar una molécula de PEG a otra molécula, no está sin dificultades. Los efectos de un derivado de PEG particular no son necesariamente predecibles. El resultado depende de la interacción específica entre un compuesto particular y el polímero PEG funcional no peptídico. El polímero utilizado en esta invención normalmente puede ser lineal o ramificado. Las estructura básicas poliméricas ramificadas generalmente se conocen en la técnica. Típicamente, un polímero ramificado tiene una porción núcleo central y una pluralidad de cadenas poliméricas lineales unidas al núcleo central. PEG comúnmente se utiliza en formas ramificadas que pueden prepararse mediante la adición de óxido de etileno a varios polioles, tales como glicerol, pentaeritritol y sorbitol. Por ejemplo, el PEG ramificado de cuatro brazos preparado a partir de pentaeritritol se muestra a continuación: C(CH2-OH)4 + n C2H4O ^C[CH2O-(CH2CH2?)n-CH2CH2-OH] 4 La porción central también puede derivarse a partir de varios aminoácidos. Un ejemplo es lisina. El polietilenglicol ramificado puede representarse en forma general como R(-PEG-OH)n en donde R representa la porción núcleo, tal como glicerol o pentaeritritol, y n representa el número de brazos. Los PEG adecuadamente ramificados pueden prepararse de conformidad con la patente de E.U.A. No. 5,932,462, los contenidos de la cual se incorporan en la presente como referencia. Estos PEG ramificados pueden utilizarse entonces de conformidad con las enseñanzas en la presente. Los PEG ahorquillados y polímero relacionados deben ser útiles en la práctica de la presente invención. El término "ahorquillado" se utiliza 5 para describir aquellos PEG que están ramificados en la parte adyacente a al menos un extremo del mismo. El polímero tiene una porción ramificada en un extremo de la cadena polimérica y dos grupos reactivos libres, uno en cada extremo de la porción ramificada, mediante unión covalente a otra molécula. Cada porción reactiva puede tener un grupo de enlace, incluyendo, por 10 ejemplo, una cadena alquilo, que une un grupo reactivo a la porción ramificada. Por lo tanto, el extremo ramificado permite que el polímero reaccione con dos moléculas para formar conjugados. Los PEG ahorquillados y polímero ahorquillados relacionados se describen en la solicitud de patente en trámite, que comúnmente se posee por los E.U.A. número de serie 15 09/265,989, la cual se presentó el 11 de marzo de 1999 y se titula Poly(ethylene glycol) Derivatives with Proximal Reactive Groups. Esta solicitud de patente copendiente se incorpora como referencia en la presente en su totalidad. Los PEG ahorquillados pueden ser ya sea lineales o ramificados en la estructura básica unida al extremo terminal. 20 Los polímeros no peptídicos, solubles en agua, substancialmente no inmunogénicos diferentes a PEG también deben ser adecuados para la práctica de la invención, aunque no necesariamente con resultados equivalentes. Estos otros polímeros pueden ser ya sea de forma lineal o de forma ramificada, e incluyen, pero no se limitan a, otros poli(óxidos de alquileno), incluyendo copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, y similares. Los polímeros ejemplares se listan en la patente de E.U.A. No. 5,990,237, los contenidos de la cual se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Los polímeros pueden ser homopolímeros o polímeros al azar, o copolímeros en bloque y terpolímeros basados en los monómeros de los polímeros anteriormente mencionados, ya sean de cadena recta o de cadena ramificada. Los ejemplos específicos de polímeros adicionales adecuados incluyen, pero no se limitan a, poli(acriloilmorfolina) ("PacM") y poli(vinilpirrolidona) ("PVP"), y poli(oxazolina). PVP y poli(oxazolina) son polímeros bien conocidos en la técnica y su preparación debe ser fácilmente aparente a los técnicos expertos. PAcM y su síntesis y uso se describen en la patente de E.U.A. No. 5,629,384 y 5,631 ,322, el contenido de las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Para acoplar PEG a un péptido, por ejemplo, un péptido con capacidad de transporte, para formar un conjugado de esta invención, frecuentemente es necesario "activar" el PEG para preparar un derivado del PEG que tenga un grupo reactivo en el extremo para la reacción con ciertas porciones del péptido. Muchos derivados activados de PEG se han descrito en la técnica y todos pueden utilizarse en esta invención, aunque no necesariamente con resultados equivalentes. Un ejemplo de dicho derivado activado es el "éster activo" de succinimidil succinato: I? í ,i » 4?xU? -M -i .i. F.S& . Z. .

CH3O-PEG-O2C-CH2CH2-C?2-NS donde NS = El éster activo de succinimidilo es un compuesto útil debido a que éste reacciona rápidamente con grupos amino en proteínas y otras moléculas para formar una unión amida (-CO-NH-). Por ejemplo, la patente de 10 E.U.A. No. 4,179,337 a Davis et al. describe el acoplamiento de este derivado a las proteínas (representadas como PRO-NH2): mPEG-02CCH2CH2C02NS + PRO-NH2 rpPEG-O2-CH2CH2-CONH-PRO Otras moléculas PEG activadas conocidas en la técnica incluyen PEG que tienen una porción de cloruro cianúrico reactivo, succinimidil 15 carbonatos de PEG, fenilcarbonatos de PEG, imidazolil formato derivados de PEG, PEG- azida de carboximetilo, PEG-imidoésteres, PEG-vinil sulfona, etilsulfona activa derivada de PEG, tresilatos de PEG, PEG-fenilglioxal, PEG activados con un grupo aldehido, PEG-maleimidas, PEG con una porción amino terminal, y otros. Estos derivados de polietilenglicol y métodos para 20 conjugar dichos derivados a un agente generalmente se conocen en la técnica y se describen en Zalipsky et al., Use of Functionalized Poly(Ethylene Glycol)s for Modification of Polipeptides, En Use of Polyethilene Glycol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Ed., Plenum Press, New York (1992), y en Zalipsky, Advanced Drug Reviews (1995) 16:157-182, todos los cuales se incorporan en la presente como referencias. Típicamente, la conjugación de un polímero no inmunogénico soluble en agua a un péptido de conformidad con esta invención resulta en la formación de un enlace entre el polímero y el péptido. El término "enlace" se utiliza en la presente para referirse a grupos o enlaces normalmente formados como un resultado de una reacción química. Los enlaces covalentes formadas en la práctica de esta invención puedes ser hidrolíticamente estables. Los enlaces pueden ser substancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a un pH útil, bajo condiciones fisiológicas de manera que el agente neurodegenerativo puede liberarse a partir del PEG en el cuero de un animal, preferiblemente después de que éste se ha administrado dentro del cerebro del animal. El método en el que los fármacos a ser administrados son liberados mediante la degradación de más agentes complejos bajo condiciones fisiológicas es un componente poderoso de la administración del fármaco, véase, por ejemplo, R. B. Greenwald, Exp. Opin. Ther. Patents, 76(6):601-609 (1997). Por ejemplo, los conjugados de la invención pueden formarse mediante la unión de PEG a péptidos con capacidad de transporte y/o agentes neuroactivos utilizando enlaces que son degradables bajo condiciones fisiológicas. La vida media de un conjugado PEG-agente neuroactivo in vivo depende del tipo de grupo reactivo de la molécula PEG que enlaza el PEG al agente neuroactivo. Típicamente, los enlaces de éster, zizi -x . . —z lzízA ..—?n-.* . -aat ifc£-jfefc,.í formados mediante la reacción de ácido PEG carboxílicos o ácido PEG carboxílicos activados con grupos alcohol sobre agentes neuroactivos, se hidrolizan bajo condiciones fisiológicas para liberar el agente neuroactivo. Véase, por ejemplo, S. Zalipsky, Advanced Drug Delivery Reviews, 16:157- 5 182 (1995). Por ejemplo, en la publicación PCT No. WO 96/23794, se describe que el paclitaxel puede enlazarse a PEG utilizando enlaces esteres y el paclitaxel enlazado puede liberarse en el suero mediante hidrólisis. La actividad anti-malaria de la dihidroartemisina unida a PEG a través de un enlace éster hidrolizable también puede demostrarse. Véase, Bentley et al., 10 Polymer Preprints, 38(1 ):584 (1997). Otros ejemplos de enlaces inestables hidrolíticamente adecuados incluyen esteres de carboxilato, esteres de fosfato, disulfuros, acétales, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos. Típicamente, la tasa de degradación del conjugado debe controlarse de tal manera que la degradación sustancial no ocurre hasta que 15 el conjugado pasa dentro del cerebro de un animal. Muchos péptidos en su estado nativo se someten a degradación sustancial en la circulación sanguínea y en órganos tales como hígado y riñon. Los enlaces hidrolíticamente degradables pueden formarse de tal manera que la vida media del conjugado es más larga que el tiempo requerido para la circulación 20 del conjugado en la corriente sanguínea para alcanzar la barrera hematoencefálica. Algunos grados menores de experimentación pueden requerirse para determinar el enlace hidrolíticamente degradable entre agentes neuroactivos específicos y derivados de PEG, esto estando bien dentro de la capacidad de un experto en la técnica una vez comunicada la presente descripción. El enlace covalente entre un péptido y un polímero puede formarse mediante hacer reaccionar un derivado del polímero tal como un PEG activado con una porción activa en el péptido. Una o más moléculas PEG pueden enlazarse a un péptido. Contrariamente, múltiples péptidos, incluyendo péptidos con capacidad de transporte y/u otros tipos de agentes neuroactivos, pueden enlazarse a una molécula PEG. Típicamente, dicha molécula PEG tiene múltiples porciones reactivas para la reacción con el péptido y agentes neuroactivos. Para este propósito, todos los PEG bifuncionales, PEG colgantes, y PEG dendríticos pueden utilizarse. Los PEG reactivos también han sido sintetizados en los cuales varios grupos funcionales se han colocado a lo largo de la estructura básica del polímero. Por ejemplo, los conjugados lisina-PEG han sido preparados en la técnica en los cuales un número de grupos activos se han colocado a lo largo de la estructura básica del polímero. Zalipsky et al., Bioconjugate Chemistry, (1993) 4:54-62. En una modalidad de esta invención, un conjugado que tiene una estructura en forma de pesa se provee en donde un péptido con capacidad de transporte u otro agente neuroactivo con capacidad de transporte capaz de pasar la barrera hematoencefálica de un animal se enlaza covalentemente a un extremo de una molécula de polietilenglicol, y otro agente neuroactivo a ser administrado dentro del cerebro de un animal se enlaza al otro extremo de la molécula de PEG. Este otro agente neuroactivo puede ser un péptido con capacidad de transporte, o cualquier otro agente neuroactivo. Típicamente, éste no tiene capacidad de transporte y no puede pasar por sí mismo la barrera hematoencefálica. Por lo tanto, el péptido con capacidad de transporte u otro agente en un extremo de la molécula de PEG actúa como un vehículo para administrar el agente neuroactivo sin actividad de transporte dentro del cerebro. Para este propósito, pueden utilizarse los PEG bifuncionales, ya sean PEG homobifuncionales o heterobifuncionales. Como se utiliza en la presente "PEG bifuncional" significa un derivado que tiene dos porciones activas cada una siendo capaz de reaccionar con una porción activa en otra molécula. Las dos porciones activas pueden estar en los dos extremos de una cadena PEG, o próximas entre sí a un extremo ahorquillado de una molécula de cadena PEG, que permite impedimento estérico, en caso de que lo haya. Los péptidos con capacidad de transporte adecuados para uso en esta invención se describieron anteriormente incluyendo, pero no limitados a, dinorfinas, encefalinas, bifalin, endorfinas, endomorfinas, y derivados y análogos de las mismas. El conjugado de esta invención puede administrarse a un animal para propósitos de tratamiento, mitigación o alivio del dolor. Los ejemplos de animales hospederos incluyen, pero no se limitan a, mamíferos tales como humanos, y animales domésticos incluyendo gatos, perros, ganado, caballos, ratones, y ratas.

El conjugado de esta invención puede administrarse de cualquier manera adecuada a un animal. Por ejemplo, el conjugado puede administrarse parenteralmente mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, o inyección subcutánea. Alternativamente, el conjugado de esta invención también puede introducirse dentro del cuerpo mediante inhalación intranasal o inhalación pulmonar o mediante administración oral o bucal. Preferiblemente, la inyección intravenosa se utiliza de tal manera que substancialmente todo el conjugado en una dosis de inyección se administra dentro del torrente sanguíneo del animal, a través del cual el conjugado circula a la barrera hematoencefálica del animal. El conjugado puede ser inyectado en la forma de cualquier tipo adecuado de formulación. Por ejemplo, una composición inyectable puede prepararse mediante cualesquiera métodos en la técnica que contiene el conjugado de esta invención en un solvente tal como agua o una solución, incluyendo solución salina, solución de Ringer. Uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables que son compatibles con los otros ingredientes en la formulación también pueden añadirse a la formulación. Los excipientes, incluyendo manitol, alginato de sodio, y carboximetilcelulosa, también pueden incluirse. Otros componentes farmacéuticamente aceptables, incluyendo antisépticos tales como feniletilalcohol; estabilizantes tales como polietilenglicol y albúmina; agentes isotonizantes tales como glicerol, sorbitol, y glucosa; auxiliares de disolución; amortiguadores estabilizantes tales como citrato de sodio, acetato de sodio y fosfato de sodio; conservadores tales aiütünifüataitti»- Aa*«?t»i*ftí*uÉtfu ^ j^ como bencilalcohol; espesantes tales como dextrosa, y otros aditivos comúnmente utilizados también pueden incluirse en las formulaciones. La formulación inyectable también puede prepararse en una forma sólida tal como forma liofilizada. Los péptidos polietilenglicosilados con capacidad de transporte de la invención pueden administrarse en una variedad de formulaciones, incluyendo, por ejemplo, administración intranasal, bucal, y oral. La dosis del conjugado administrado a un humano u otro animal variará dependiendo del animal hospedero, los tipos de péptidos con capacidad de transporte y/o agentes neuroactivos utilizados, los modos de administración, y los síntomas padecidos por el animal. Sin embargo, los intervalos de dosis adecuados en una situación específica deben determinarse fácilmente por un experto en la técnica sin llevar a cabo experimentación. La invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos, los cuales se pretenden solamente para propósitos de ilustración y no deben considerarse en ningún sentido limitantes de la invención.

EJEMPLO 1 Modulación v purificación de PEG-Dinorfina A La Dinorfina A (1-11 ) (H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-lle-Arg-Pro-Lys-NH2) (1.47 mg) se disolvió en 0.25 ml de agua deionizada y 0.25 ml de amortiguador NaP 25 mM, pH 5.8 en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml.

El reactivo, NHS-PEG2?-Fluoresceína (1.0 mg), se añadió a la solución del péptido en aproximadamente un exceso molar de 2 veces. Después de 30 minutos de tiempo de reacción, 0.1 ml de amortiguador de fosfato de sodio 25 mM, pH 7.4 se añadió y la reacción se dejó proceder a temperatura ambiente por 3 horas. La conjugación de NHS-PEG2?-Fluoresceína se monitoreó mediante electroforesis capilar (CE) y espectrometría de masas (MALDI). La purificación del conjugado PEG-Dinorfina A se llevó a cabo sobre una columna de intercambio catiónico HiTrap SP a partir de Amersham/Pharmacia utilizando un gradiente de elución de amortiguador de fosfato de sodio 5 mM, pH 4.0 a amortiguador de fosfato de sodio 50 mM, NaCI 1.5 M, pH 7.5 por 53 minutos. Las fracciones se colectaron y los contenidos se analizaron mediante MALDI. Estas fracciones se agruparon y se almacenaron en congelación antes del ensayo in vivo.

EJEMPLO 2 Modificación v purificación de PEG-Endomorfina II La Endomorfina II (H-Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2, 2.3 mg) se disolvió en 1.15 ml de amortiguador de fosfato de sodio 5 mM, pH 8.0. La modificación de la Endomorfina II se llevó a cabo en 1 ,5 horas a temperatura ambiente mediante la adición de mPEG ooo-SPA (38 mg) en un exceso de 5 moles. La mezcla de reacción se analizó medíante espectrometría de masas (MALDI) para determinar el grado de modificación. MALDI se utilizó para verificar que la reacción entre 1T1PEG2000-SPA y Endomorfina II se llevó hasta completarla. La muestra se dializó contra agua utilizando una membrana 2000 MWCO y se liofilizó antes del ensayo in vivo.

EJEMPLO 3 Perfusión in situ, depleción capilar, extracción cerebral y estudios de unión a proteína de PEG-Dinorfina A y PEG-Endomorfina II El protocolo de los experimentos de perfusión de cerebro de rata se aprobó por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (Institutional Animal Care and Use Committee) en la Universidad de Arizona. La perfusión in situ, depleción capilar, extracto cerebral y estudios de unión de proteína se llevaron a cabo como se reportó previamente (Williams et al., J. Neurochem., 66 (3), pp 1289-1299, 1996). PEG-Dinorfina A (PdynA) tiene un valor RBr de toma in situ muy alto de 0.343 ±1.84. En contraste la perfusión in situ con I125 Dynorfin, dio un RBr muy alto de aproximadamente 0.96. La radioactividad total se recuperó en el frente del solvente del HPLC subsecuente, mostrando que la dinorfina A marcada (1-11 ) se degrada rápidamente, probablemente a l125Tyr. Los estudios de depleción capilar del PdynA se llevaron a cabo, y revelaron que aproximadamente el 88% de la radioactividad estaba asociada con la fracción capilar más que con el parénquima cerebral.

La toma in situ de PEG-endomorfina II (Pend) dio un valor RBr de 0.057 ± 0.008, similares a aquellos previamente reportados para los péptidos. La depleción capilar subsecuente mostró que la radioactividad entraba al cerebro, 32% estuvo asociada con la fracción capilar con 67% en el parénquima cerebral. La unión de la proteína de Pend se estudió utilizando el sistema de filtro sin centrifugación. Se encontró que 30% de las 25,000 dpm de Pend se unieron a 1 % de la solución de BSA. La principal contribución es que la polietilenglicosilación mejoró la estabilidad enzimática cerebral y sanguínea dramáticamente. La endomorfina y dinorfina son muy inestables ya sea en el cerebro o en la sangre con vidas medias del orden de minutos. Después de la polietilenglicosilación, aquellas vidas medias se incrementan a horas para endomorfina II. En el caso de la endomorfina II, la vida media en el plasma sanguíneo fue de 3.2 minutos, y en el tejido cerebral fue de 13 minutos. Después de la polietilenglicosilación, aquellas vidas medias se incrementaron a más de dos horas.

EJEMPLO 4 Conjugación de PEG-Doxorubicina a Endomorfina I La endomorfina I (H-Tyr-Pro-NH2, 3.0 mg, 4.9E-6 moles) se disolvió en 1 ml de amortiguador de fosfato de sodio 50 mM, pH 8.2 que contenía NaCI 150 mM y DTT 50 mM. Un exceso molar de cuatro veces del reactivo de Traut (2.7 mg) se añadió y se dejó reaccionar a temperatura ambiente por 2 horas. La endorfina modificada con tiol se purificó a partir de DTT y el reactivo de Traut utilizando una columna de exclusión por tamaño Superdex 30 (Pharmacia). Las fracciones de endomorfina modificada se colectaron y se liofilizaron. Se disolvió hidrocloruro de doxorubicina (3.0 mg, 5.2E-6 moles) en 1.0 ml de amortiguador de fosfato de sodio 50 mM, pH 7.2 que contenía NaCI 150 mM. El pH de la solución se tituló a 8.0 con hidróxido de sodio 0.1 N. Un exceso molar de diez veces de PEG heterobifuncional (NHS-PEG2?- OPSS) se añadió a la solución de doxorubicina. La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente por 2 horas. La OPSS-PEG2«-doxorubicina se purificó a partir de PEG no reaccionado y doxorubicina libre utilizando una columna de exclusión por tamaño Superdex 30. Las fracciones OPSS-PEG2?-doxorubicina se colectaron y se liofilizaron. Los polvos liofilizados de la endomorfina I modificada y OPSS- PEG2?-doxorubicina se reconstituyeron en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM, pH 6.0. Una cantidad equimolar de cada solución se mezclaron juntas y las dos se hicieron reaccionar a temperatura ambiente por 6 horas. El conjugado doxorubicina-PEG2?-endomorf¡na se purificó en una columna de exclusión por tamaño Superdex 30.

EJEMPLO 5 Conjugación de PEG a DPDPE 3.0 mg de DPDPE (Tyr-D-Pen-Gly-Phe-D-Pen) se disolvieron en 5 ml de acetonitrilo anhidro. Un exceso molar del 20% de reactivo PEG (ya sea mPEG-SPA 5K [27.9 mg] o mPEG-SPA 2K [11.1 mg] y trietilamina (0.8 µl) se añadieron al DPDPE. La reacción se dejó proceder a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón por 2 días. La muestra se diluyó a 15 ml con agua deionizada y se liofilizó. El polvo PEG-DPDPE se reconstituyó con agua deionizada y se liofilizó. El polvo PEG-DPDPE se reconstituyó en 5 ml de agua deionizada y se purificó en una columna de exclusión por tamaño Superdex 30. Las fracciones pertinentes se agruparon juntas, se dializaron contra agua y se congelaron hasta utilizarlas en los experimentos de perfusión in situ. Tanto PEG2?-DPDPE como PEG5?-DPDPE se ¡odinaron y se evaluaron en la perfusión in situ, depleción capilar, extracción cerebral y estudios de unión de proteína como en el ejemplo 3. Un incremento significativo en la toma cerebral se observó para ambos PEG2K-DPDPE y PEGSK-DPDPE. Se determinó que para ambos compuestos, el incremento en la toma se debió a la entrada del péptido al cerebro más que al que fuera atrapado en los capilares. m,.z.M. z¿., ........A.. .._,.,....4 ...»-*. . ..^.,^...^-...,-.-,^^^^,^^^1.^ ^^^^ Ji?.yzki?.¿ EJEMPLO 6 Conjugación de PEG a Bifalina a. (mPEG??)?-B¡falina 5 La bifalina (21.1 mg, 0.046 mmoles) se disolvió en 15 ml de acetonitrilo anhidro y se trató con 16 µl de trietilamina (0.115 mmoles, exceso molar de 2.5 veces). Al mismo tiempo, mPEG2?-SPA (110 mg, 0.055 mmoles, exceso molar de 1.2 veces) se disolvió en 5 ml de acetonitrilo. El mPEG2?- SPA disuelto se añadió lentamente dentro de la solución de bifalina 10 anteriormente mencionada y la mezcla de reacción se agitó 66 horas a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno. [(mPEG2?)2-bifalina] di-propilenglicosilada y bifalina [mPEG2?- bifalina] mono-propilenglicosilada se separaron a partir de PEG no reaccionado y bifalina libre sobre una columna de fase reversa Vydac C18 a 1 15 ml/min y un detector a 215 nm UV utilizando un gradiente de elución de solvente B al 30% a 60%. El solvente A es TFA al 0.1% en agua y el solvente B es TFA al 0.1% en acetonitrilo. 20 Disolver 118.7 mg de metoxi-PEG5K-SPA (2.374 x 10"5 moles, exceso molar de 1.5 veces) en 3.0 ml de acetonitrilo anhidro. Bajo un flujo lento de argón, añadir 10.0 mg de Bifalina (1.583 x 10'5 moles del grupo -NH2) seguido por pipeteo de 4.4 µl de trietilamina (3.166 x 10"5 moles, exceso molar .t_ *±-..-+»-i ^«JaAjy&iiif&A^ de 2.0 veces) dentro de la solución. Agitar a temperatura ambiente durante toda la noche. Evaporar solvente en un evaporador rotatorio a 40°C hasta que esté casi seco, luego secar adicionalmente a alto vacío por 5 minutos (utilizar una trampa de nitrógeno líquido cuando se aplique el vacío). Disolver el remanente en 10 ml de agua deionizada. El pH de la solución es de 4.5. cargar la solución mediante inyección dentro de un cassette de diálisis prehidratado Slide-A-Lyzer con 3500 MWCO (Límite de Peso Molecular) (a partir de PIERCE) y diálisis en contra de 2 x 900 ml de agua deionizada durante tres días. Cargar la solución sobre 2 ml de una columna de Sepharose DEAE. Colectar el eluyente. Eluír la columna con 125 ml adicionales de agua deionizada, y colectar el eluyente (pH 7.6). Combinar las dos fracciones, congelar la solución mediante nitrógeno líquido, y luego liofilizar en un secador por congelamiento. c. (mPEGi7?)t-Bifalina Disolver 141.4 mg de metoxi-PEG?2?-SPA (1.187 x 10"5 moles, exceso molar de 1.5 veces) en 2.0 ml de acetonitrilo anhidro. Bajo un flujo lento de argón, añadir 5.0 mg de Bifalina.2TFA (7.915 x 10"6 moles del grupo - NH2) seguido por pipeteo de 2.2 µl de trietilamina (1.583 x ' 05 moles, exceso molar de 2.0 veces) dentro de la solución. Agitar a temperatura ambiente durante toda la noche.

Evaporar solvente a alto vacío a temperatura ambiente hasta que esté casi seco (utilizar una trampa de nitrógeno líquido cuando se aplique el vacío). Disolver el remanente en 10 ml de agua deionizada. Cargar la solución mediante inyección dentro de un cassette de diálisis prehidratado con 10000 MWCO (a partir de PIERCE) y diálisis en contra de 2 x 800 ml de agua deionizada durante tres días. Diluir la solución a 18 ml mediante agua deionizada. Cargar la solución sobre 10 ml de una columna de Sepharose DEAE. Colectar el eluyente. Eluír la columna con 90 ml adicionales de agua deionizada. Combinar las dos fracciones, congelar la solución mediante nitrógeno líquido, y luego liofilizar en un secador por congelamiento. d. (mPEG?n?)?-Bifalina Disolver 255.2 mg de Metoxi-PEG20?-SPA (1.187 x 10"5 moles, exceso molar de 1.5 veces) en 3.0 ml de acetonitrilo anhidro. Bajo un flujo lento de argón, añadir 5.0 mg de Bifalina.2TFA (7.915 x 10"6 moles del grupo -NH2) seguido por pipeteo de 2.2 µl de trietilamina (1.583 x 10"5 moles, exceso molar de 2.0 veces) dentro de la solución. Agitar a temperatura ambiente durante toda la noche. Evaporar solvente a alto vacío a temperatura ambiente hasta que esté casi seco (utilizar una trampa de nitrógeno líquido cuando se aplique el vacío). Disolver el remanente en 10 ml de agua deionizada. Cargar la solución mediante inyección dentro de un cassette de diálisis prehidratado con 10000 l?jkA?xí*timL-*y- ¡-?Sy~~ pfif. ír?r MWCO (a partir de PIERCE) y diálisis en contra de 2 x 800 ml de agua deionizada durante tres días. Diluir la solución a 25 ml mediante agua deionizada. Cargar la solución sobre 15 ml de una columna de Sepharose DEAE. Colectar el eluyente. Eluír la columna con 150 ml adicionales de agua deionizada. Combinar las dos fracciones, congelar la solución mediante nitrógeno líquido, y luego liofilizar en un secador por congelamiento. La pureza de cada muestra se determinó mediante HPLC de fase reversa y mediante espectrometría de masas (MALDI).

EJEMPLO 7 Ensayo de analgesia Animales Los ratones ICR (20-25 g) o ratas macho Sprague-Dawley (250- 300 g) (Harían Sprague-Dawley Inc., Indianapolis, IN) se utilizaron para estos experimentos. Los animales se alojaron cuatro por caja en una instalación de cuidado animal mantenida a 22 ± 0.5°C con un ciclo alternante de 12 horas de luz-oscuridad. El agua y el alimento se abastecieron ad libitum. Los animales se utilizaron sólo una vez.

Protocolo Todos los fármacos se disolvieron en solución salina estéril y se prepararon de manera que la dosis apropiada pudo ser administrada en 5 µl (i.c.v.), 100 µl (i.v.), 100 µl (s.c.) y 100 µl (i.m.) del vehículo. Todos los 5 roedores se registraron para latencia de línea basal antes de la inyección del fármaco. Una morfina control se utilizó con los procedimientos de inyección i.c.v. e i.v. para comparar las eficiencias analgésicas de los compuestos prueba. 10 Invección I.C.V. Los roedores se colocaron dentro de una botella que contenía gasa empapada con éter etílico hasta que éstos caen en un sueño ligero. Los roedores se retiraron inmediatamente a partir de la botella y se realizó una incisión de 1.25 cm con un escalpelo para exponer la parte superior del 15 cráneo. El ventrículo lateral derecho se localizó al medir 2 mm laterales de la línea media y 2 mm caudales a partir del punto de Bregma. En este punto, una jeringa Hamilton (22G, 1.25 cm) se colocó a 2 mm través del cráneo y se administró una inyección de 5 µl del compuesto. Los roedores se colocaron de vuelta dentro de sus cajas hasta el tiempo especificado de evaluación. El azul 20 de metileno se colocó dentro del sitio de la inyección para asegurarse de la administración apropiada del compuesto dentro del ventrículo lateral.

^ • • -'•-"»-- ^ - — " "" ,....XZXX. , X .. yyZ Z- -. .-tJXAtJ?yX Aiák???zi Invección I.V. Los roedores se colocaron dentro de un sujetador de confinamiento y sus colar se colocaron dentro de un vaso de precipitado con agua caliente y luego se frotaron con etanol para maximizar la vasodilatación en las venas de la cola. Se seleccionó una vena y el confinamiento se aseguró para prevenir movimiento excesivo. Una aguja 30G se seleccionó como el tamaño apropiado para la administración de los compuestos. La aguja se insertó cuidadosamente dentro de la vena de cada ratón y un bolo de 100 µl se administró lentamente. El blanqueado de la vena con dirección hacia el cuerpo fue indicativa de administración adecuada.

Invección S.C. Las ratas fueron confinadas a mano para prevenir movimiento excesivo. Una aguja 30G se seleccionó como el tamaño apropiado para la administración de los compuestos. La aguja se insertó cuidadosamente dentro de la nuca del cuello de cada rata y se administró lentamente un bolo de 100 µl.

Inyección I.M. Las ratas fueron confinadas a mano para prevenir movimiento excesivo. Una aguja 30G se seleccionó como el tamaño apropiado para la administración de los compuestos. La aguja se insertó cuidadosamente dentro del músculo de la pierna trasera derecha de cada rata y se administró lentamente un bolo de 100 µl.

Evaluación de analgesia 5 Los roedores se colocaron dentro de sujetadores y sus colas se colocaron adecuadamente bajo un haz caliente radiante. El haz se apagó y el tiempo hasta que el animal sacudió su cola de debajo del haz se registró en cada punto del tiempo. En los casos en los que el animal movió su cola sin sacudirla, los animales se evaluaron nuevamente solamente si el tiempo 10 pasado debajo del haz radiante era menor de 5 segundos.

Evaluación de los datos analgésicos Los datos sin analizar (tiempos registrados) se convirtieron a un porcentaje del efecto máximo posible (% de M.P.E.) el cual se determinó 15 como 15 segundos. El % de M.P.E. se determinó mediante la siguiente ecuación: % de M.P.E. = (Tiempo registrado -Línea basal)/ (15 - Línea basal) X 100 Estos porcentajes permitieron que el compuesto se graficara de r conformidad al % de M.P.E. vs. Tiempo. La curva puede analizarse entonces 20 para determinar el área bajo la curva (AUC). Los resultados de la administración i.c.v. del PEG-DPDPE claramente indican que la polietilenglicosilación no interfiere con la capacidad de DPDPE para producir un efecto analgésico (figura 1). Además, el estudio fc- i. A.fafcai?i.. - ¿- . yy-A> — •My ., --,.x.y?.. ... ...{.-i x .yy .. ¿áüta ^^,««ito-iHaai8tt».feafc? . Í?ÍÍßl^tÍ.? iÍÍ mostró una tendencia hacia una prolongación del efecto analgésico del compuesto polietilenglicosilado cuando se comparó con el compuesto parental. La inyección intravenosa de PEG-DPDPE mostró que el compuesto polietilenglicosilado es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica, en cantidades suficientes, como para mantener sus propiedades analgésicas (figura 2). Este estudio también ayudó a confirmar que la polietilenglicosilación para DPDPE prologa significativamente la duración del efecto analgésico. Todas las muestras de bifalina polietilenglicosilada y bifalina exhibieron una potente respuesta analgésica en los ratones con una respuesta máxima de 80-90% alcanzada entre los 30-45 minutos. La (mPEG2k)2-bifalina continuó a prolongar el efecto analgésico con un M.P.E. del 50% observándose en la marca de los 400 minutos del estudio en comparación con la marca de los 90 minutos para la bifalina nativa. Estos datos también muestran una relación inversa entre el peso molecular de PEG y el % de M.P.E. (figura 3). Cuando se compara el efecto analgésico de la bifalina monopolietilenglicosilada (mPEG2?-bifalina) con el de la bifalina di- polietilenglicosilada [(mPEG2?)2-bifalina] a la misma concentración en los ratones, la duración del efecto analgésico para mPEG2?-bifalina es casi la mitad del de (mPEG2?)2-bifalina a 50% del M.P.E. (figura 4). De hecho hay un efecto analgésico casi equivalente de mPEG2?-bifalina a la mitad de la dosis de (mPEG2?)2-bifalina. La administración intravenosa de (mPEG2?)2-bifalina da un efecto analgésico con duración más larga en las ratas que la bifalina nativa en las diversas dosis ensayadas (figura 5). Las ratas a las que se les da (mPEG2?)2-bifalina mediante administración subcutánea o intramuscular mostraron niveles elevados y sostenidos de actividad analgésica en comparación con la bifalina analgésica a la misma concentración (figura 6).

EJEMPLO 8 Estudios de perfusión in situ de PEG-DPDPE v PEG-Bifalina El protocolo para los experimentos de perfusión de cerebro de rata se aprobó por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (Institutional Animal Care and Use Committee) en la Universidad de Arizona. La perfusión in situ, depleción capilar, extracto cerebral y estudios de unión de proteína se llevaron a cabo como se reportó previamente (Williams et al., J. Neurochem., 66 (3), pp 1289-1299, 1996). PEG2K-DPDPE tiene un valor RBr de toma in situ muy alto de 3.41 ± 0.15. La perfusión in situ con I125 DPDPE es comparable a la del DPDPE monopolietileglicosilado, RBr = 3.54 ± 0.30. La bifalina marcada con I125 tiene una toma de perfusión in situ de 7.26 ± 0.11, mientras que la toma in situ de (mPEG2?)2-bifalina fue dramáticamente menor, valor RBr = 2,70 ± 0.27.

Muchas modificaciones y otras modalidades de la invención se les ocurrirán a los expertos en la técnica a los cuales pertenece la invención teniendo el beneficio de las enseñanzas presentadas en las descripciones precedentes y los dibujos anexos. Por lo tanto, se debe entender que la invención no se limita a las modalidades específicas descritas y que las modificaciones y otras modalidades se pretende que se incluyan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Aunque los términos específicos se emplean en la presente, éstos se utilizan en sentido genérico y descriptivo solamente y no para propósitos de limitación. 10

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un conjugado sustancialmente hidrófilo caracterizado porque comprende un péptido covalentemente unido a un polímero no peptídico, soluble en agua, en donde dicho péptido se selecciona a partir del grupo que consiste de bifalin y [D-pen2, D-Pen5] encefalina (DPDPE).

2.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque tiene la propiedad de extender el efecto analgésico en mamíferos en comparación con el péptido nativo.

3.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho polímero no peptídico soluble en agua, se caracteriza adicionalmente por la ausencia de porciones lipófilas.

4.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho polímero no peptídico y dicho péptido se conjugan a partir de la solución.

5.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además por la ausencia de enlaces covalentes.

6.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además por la conjugación del péptido en al menos un extremo del mismo.

7.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además por la conjugación del péptido en al menos un extremo N del mismo.

8.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, 5 caracterizado además porque dicho polímero no peptídico soluble en agua es polietilenglicol o un copolímero de polietilenglicol y polipropilenglicol.

9.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho polímero no peptídico soluble en agua es polietilenglicol. 10

10.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque dicho polietilenglicol se selecciona a partir del grupo que consiste de monometoxipolietilenglicol, polietilenglicol ramificado, polietilenglicol con enlaces degradables en la estructura básica, polietilenglicol homobif uncional, polietilenglicol heterobifuncional, polietilenglicol de múltiples 15 brazos, polietilenglicol colgante, y polietilenglicol ahorquillado.

11.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho péptido se conjuga con al menos una molécula de polietilenglicol.

12.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, 20 caracterizado además porque dicha bifalina tiene dos porciones polietilenglicol covalentemente unidas.

13.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque dicho polímero no peptídico es polietilenglicol que tiene un peso molecular promedio nominal de aproximadamente 200 daltones a aproximadamente 100,000 daltones.

14.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho polietilenglicol tiene un peso molecular promedio nominal de aproximadamente 1000 daltones a aproximadamente 40,000 daltones.

15.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque dicho polietilenglicol tiene un peso molecular promedio nominal de 2000 daltones.

16.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un conjugado como se reclama en la reivindicación 1 y un vehículo farmacéuticamente aceptable para dicho conjugado.

17.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende un agente neuroactivo, el cual puede ser el mismo o diferente a partir de dicho péptido, conjugado a dicho polímero no peptídico.

18.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además por una estructura en forma de pesa y que comprende adicionalmente un agente neuroactivo, el cual puede ser el mismo o diferente a partir de dicho péptido, conjugado a dicho polímero no peptídico.

19.- El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque comprende doxorubicina o un agente de contraste conjugado a dicho polímero no peptídico.

20.- Un método para tratar dolor que comprende administrar a un mamífero a través de la circulación general una cantidad efectiva de una preparación farmacéutica que comprende el conjugado como se reclama en la reivindicación 1. 5

21.- Un método para administrar un péptido dentro del cerebro de un animal a través de la barrera hematoencefálica caracterizado porque comprende: proveer una composición farmacéutica que comprende un conjugado entre un péptido y un polímero no peptídico soluble en agua en donde el péptido se selecciona a partir del grupo que consiste de bifalina y [D- 10 pen2, D-Pen5] encefalina (DPDPE); y administrar la composición dentro del torrente sanguíneo de un animal.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque dicho polímero se selecciona a partir del grupo que consiste de copolímeros de polietilenglicol y propilenglicol, 15 monometoxipolietilenglicol, polietilenglicol ramificado, polietilenglicol con enlaces degradables en la estructura básica, polietilenglicol homobifuncional, polietilenglicol heterobifuncional, polietilenglicol de múltiples brazos, polietilenglicol colgante, y polietilenglicol ahorquillado. ^

23.- El método de conformidad con la reivi ndicación 21, 20 caracterizado además porque el paso de administración de la composición comprende inhalación pulmonar e intranasal dentro de dicho animal.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque el paso de administración de la composición es por administración oral, ocular, bucal, transdermal, o rectal.

25.- Un método para administrar un péptido opioide dentro del 5 cerebro de un animal a través de la barrera hematoencefálica caracterizado porque comprende: proveer una composición farmacéutica que comprende un conjugado entre un péptido opioide y un polímero no peptídico soluble en agua en donde el péptido se selecciona a partir del grupo que consiste de dinorfina, encefalina, endorfina, y endomorfinas; y administrar la composición 10 dentro del torrente sanguíneo de un animal.