HU225738B1 - Recombinant mistletoe lectin - Google Patents

Description

A találmány preproproteineket kódoló nukleinsavmolekulákra vonatkozik. Ezek a nukleinsavmolekulák olyan preproproteineket kódolnak, amelyek érés után a fagyöngy-lektin-dimer biológiai aktivitásával rendelkeznek. A találmány vonatkozik még az említett nukleinsavmolekulákkal transzformált gazdasejtekre és olyan polipeptidekre, illetve polipeptiddimerekre, amelyeket ezek a nukleinsavmolekulák kódolnak. A találmány szerinti polipeptidek, illetve polipeptiddimerek terápiásán sokoldalúan alkalmazhatók. A találmány ezenkívül olyan immuntoxinokra, valamint gyógyszerekre vonatkozik, amelyek a találmány szerinti polipeptideket, illetve polipeptiddimereket tartalmazzák. Vonatkozik még a találmány olyan diagnosztikus készítményekre, amelyek a találmány szerinti nukleinsavmolekulákat, a találmány szerinti polipeptideket, illetve polipeptiddimereket és/vagy olyan primereket tartalmaznak, amelyek a találmány szerinti nukleinsavmolekulákkal specifikusan hibridizálnak. Végül a találmány olyan növényvédő szerekre vonatkozik, amelyek a találmány szerinti polipeptideket és/vagy polipeptiddimereket tartalmazzák.

A fagyöngykivonatokat évszázadok óta használják gyógyításra. A jelen század elejétől váltakozó sikerrel már használták a fagyöngykészítményeket rák terápiájában [V. Bocci, J. of Biological Regulators and Homeostatic Agents, 7, 1-6 (1993); H.-J. Gabius et al., Planta Med., 60, 2-7 (1993); H.-J. Gabius, S. Gabius, PZ, 139, 9-16 (1994); C. Ganguly, S. Das, Chemotherapy, 40, 272-278 (1994)]. Hajtó és munkatársai [T. Hajtó et al., Cancer Rés., 49, 4803-4808 (1989); T. Hajtó et al., Cancer Rés., 50, 3322-3326 (1990)] kimutatták, hogy terápiás hatás érhető el különösen az úgynevezett fagyöngy-lektinek [viszkuminok, Viscum album agglutininek (VAA)] révén. Citotoxikus hatásán kívül ma különösen aspecifikus immunstimuláló hatásáról beszélnek; és ezeket a pozitív hatásokat tumoros betegek kiegészítő terápiájában és utókezelésében használják ki. Ilyen betegeknél az életminőség javítását valószínűleg a saját szervezetük által kiválasztott endorfin közvetíti [B.-M. Heiny, J. Beuth, Anticancer Research, 14, 1339-1342 (1994)].

Számos in vitro vizsgálat [T. Hajtó et al., Cancer Rés., 50, 3322-3326 (1990); D. N. Mannel et al., Cancer Immunoi. Immunother., 33, 177-182 (1991); J. Beuth et al., Arzneim. Forsch., 43, 166-169 (1993)] és in vivő vizsgálat [T. Hajtó, Oncology, 43, kiég., 1., 51-65 (1986); T. Hajtó et al., Cancer Rés., 49, 4803-4808 (1989); J. Beuth et al., In vivő, 5, 29-32 (1991); J. Beuth et al., Clin. Invest., 70, 658-661 (1992)], valamint klinikai tanulmány [J. Beuth et al., Clin. Invest., 70, 658-661 (1992)] igazolja, hogy megnövekszik a gyuiladáskeltő citokinek (TNF-α, IL-1, IL—6) felszabadulása, és hogy az immunrendszer sejtkomponensei (Th-sejtek, NK-sejtek) aktiválódnak.

A fagyöngykivonatok lényeges aktív komponensének ma egy 60 kD tömegű fagyöngy-lektin-proteint (ML-protein) tartanak, amely a kivonatokból biokémiai úton izolálható [H. Franz et al., Acta bioi. med. germ., 36, 113-117 (1977); H.-J. Gabius et al., Anticancer Rés., 12, 669-676 (1992)]. Az ML-protein kovalens kötésű diszulfidhíddal összekapcsolt két alegységből áll, ezek közül az A-lánc riboszómák enzimes inaktiválódásáért [Y. Endo et al. FEBS Lett., 231, 378-380 (1988); Biochem. Biophys. Rés. Comm., 150, 1032-1036 (1988)], és a B-lánc a szénhidrátkötésért felelős. A biológiai aktivitás - eddigi ismereteink szerint - főképpen a B-lánc lektinaktivitására vezethető vissza [T. Hajtó et al., Cancer Rés., 50, 3322-3326 (1990)].

A fagyöngy-lektinek (ML) szerkezete és hatása közötti összefüggésről azonban máig keveset tudunk. Nem tisztázott, hogy az egyes láncok és ezek különböző biokémiai és enzimes aktivitása mennyiben járul hozzá a megfigyelt hatáshoz, illetve a terápiás hatékonysághoz. A szerkezet és hatás közötti összefüggés analízisét megnehezíti, hogy a készítmények a fagyöngy más növényi anyagaival szennyezettek [G. Stein, P. A. Berg, Eur. J. Clin. Pharmacol., 47, 33-38 (1994)]. Feltételezik, hogy az extraktumokat tartalmazó készítmények aktivitása a kivonatok különböző összetételétől függ, és függ a gazdafa (például: almafa, erdei fenyő, nyárfa) fajtájától is [H. Hülsen et al., Drug. Rés., 36, 433-436 (1986)]. Feltételezik, hogy a viszkotoxinoknak [F. Garcia-Olmedo, Biochim. Biophys. Acta, 740, 52-56 (1983); E. Mendez et al., Eur. J. Biochem., 194, 533-539 (1990)] és a többi viszkuminnak (például: ML-2, ML-3) hasonló a hatásuk [R. Eifler et al., közlemény a „Lectins Biology-Biochemistry, Clinical Biochemistry” (Bog-Hansen, szerk.) 9. kötetében, Wiley, New Delhi (1994)]. Még a biokémiai úton nagymértékben tisztított (affinitáskromatográfia) ML-készítmények is jelentős heterogenitást mutatnak (8. ábra). Ez a heterogenitás a láncok biokémiailag mérhető aktivitására vonatkozik, a kiváltott in vitro és in vivő hatékonyságra és magára a proteinszerkezetekre is. Feltételezik, hogy a szerkezeti változatok keletkezésének alapjául az ML A- és B-lánc glikoziláltsága, valamint a szekvenciaváltozatok szolgálnak. H.-J. Gabius és munkatársai [Anti-Cancer Rés., 12, 669-676 (1992)] és J. B. Dietrich és munkatársai [Anti-Cancer Drugs., 3, 507-511 (1992)] kimutatták az ML-1 A1 és A2 láncainak szekvenciavariabilitását.

Ahhoz, hogy a fagyöngy-lektin terápiás hatásait pontosabban lehessen vizsgálni, szükség lenne ennek szerkezetileg homogén, tisztított anyag formájában való előállítására. Ezenkívül a szakterületnek is érdeke, hogy a fagyöngy-lektint vagy hatásos alkotórészeit nagy mennyiségben, tiszta formában lehessen előállítani, hogy ezeket például nagyüzemileg, mint hatásos gyógyszeralapanyagokat tudják felhasználni. Ezeket a célokat a technika állása szerint ismert eljárásokkal eddig megközelítőleg sem lehetett megvalósítani. Növényi anyagból való izolálásnál a technika jelenlegi állása szerint mindig heterogén anyagkeveréket kapunk.

A növényi fagyöngy-lektin-készítmények heterogenitását többek között az ML-1 poszttranszlációs feldolgozása eredményezi, amikor is ML-2 és ML-3 izoformák keletkeznek, így tehát a fagyöngy-lektin-készítményekben az izolálási módszertől vagy a fermentációs időtől függően az ML-1-, ML-2- és ML-3-tartalom változik [C. Jággy. Arzneim. Forsch./Drug Rés., 45,

HU 225 738 Β1

905-909 (1995)]. Mindegyik említett izoforma ezenkívül még további mikroheterogenitást is mutat, amelyet a 8. ábrán, az ML-1 izoelektromos kromatofokuszálása révén példaként mutatunk be.

A találmány tehát feladatául tűzte ki, hogy a fagyöngy-lektint tiszta formában és olyan mennyiségben bocsássa rendelkezésre, amely nagyüzemi hasznosítást tesz lehetővé. A feladatot az igénypontokban ismertetett kiviteli alakokkal oldjuk meg.

A találmány ennélfogva egy olyan nukleinsavmolekulára vonatkozik, amely (a) egy preproproteint kódol, amely érés után a fagyöngy-lektin-dimer biológiai funkciójával rendelkezik, és amelynek a nukleotidszekvenciáját a 4c. ábra mutatja be; (b) az (a) szerinti preproprotein egy fragmentumát kódolja, amikor is a fragmentum a fagyöngy-lektin-dimer egy biológiailag aktív alkotórésze; (c) a genetikai kód degeneráltsága következtében az (a) vagy (b) szerinti nukleinsavmolekulától különbözik; vagy (d) az (a), (b) vagy (c) szerinti nukleinsavmolekulával szigorú feltételek mellett hibridizál, és ez az (a) vagy (b) pontban ismertetett biológiai funkcióval, illetve aktivitással rendelkező polipeptidet kódolja.

A fagyöngy-lektin génszekvenciájának előállításakor - ebből a szekvenciából kiindulva - először rekombináns, nagy tisztaságú egyedi láncokat (rMLA, rMLB) kaphatunk, amelyeket in vitro összekapcsolhatunk, és így egy olyan rML-holoproteinhez juthatunk, amely proteinkémiai és szerkezeti szempontból, valamint enzimaktivitás szempontjából homogén. Az összekapcsolt (reasszociált) rekombináns protein nem mutat variabilitást és mikroheterogenitást, főképpen a primer szerkezet és a poszttranszlációs módosulások (glikoziláció, foszforiláció) vonatkozásában, és akár holoprotein, akár láncrész formában, továbbá szubfragmentumok formájában különösen alkalmasak terápiás célokra.

Egy fagyöngy-lektin-preproprotein „fragmentuma” alatt a találmány szerint minden olyan fragmentum tehát nem csak egy természetszerűen előforduló fragmentum - értendő, amely a fagyöngy-lektin-dimer egy biológiailag aktív alkotórésze. Magyarázatképpen arra utalunk, hogy a szakemberek a fagyöngy-lektin-dimer egy ilyenfajta biológiailag aktív alkotórésze alatt természetesen olyan alkotórészeket is értenek, amelyek a dimer egyes láncainak az alkotórészeit képezik. Ezért tehát természetesen az egyes láncok és az ezekből származó fragmentumok, amelyek a 4c. ábrán bemutatott szekvencia részeinek felelnek meg, a találmány tárgyát képezik.

A „természetszerűen kifejezés a „fagyöngy-lektin alkotórészével összefüggésben a találmány szerint azt jelenti, hogy az így jellemzett fragmentum vagy a fagyöngy-lektin-dimer egy láncának felel meg, vagy a lánc egy olyan szubfragmentumáról van szó, amely a láncban természetszerűen előfordul. Ezek a fragmentumok előnyösen biológiailag aktívak.

A „biológiailag aktív” jellemzés alatt a találmány szerint azt értjük, hogy ezek a fragmentumok a láncoknak vagy a dimernek legalább egy itt leírt biológiai funkciójával vagy az egyes láncoknak vagy dimernek egy további biológiai funkciójával rendelkeznek. A „biológiailag aktív” kifejezés alatt ezenkívül farmakológiai és/vagy immunológiai aktivitás értendő.

A rekombináns ML-proteinek segítségével először vált lehetővé, hogy kiegészítő kísérletekkel az egyes domének és szubdomének határait megvizsgáljuk. A rekombináns ML-proteinek és rekombináns alegységek/láncrészek képezik az alapját a megfelelően definiált homogén anyagból álló készítményeknek, amelyek a kivonatkészítmények és standardizált extraktumok helyettesítésére szolgálnak.

A fagyöngy-lektint kódoló gén klónozását, meglepő módon, egy új klónozási stratégia alapján lehetett megvalósítani, miután a hagyományos klónozási stratégiák csődöt mondtak.

Az ML-1 fagyöngy-lektin számos proteinkémiai adata ismert. A molekulatömeg és az alegységszerkezet mellett főképpen olyan rövid N-terminális peptidek voltak ismertek, amelyeknek az aminosavszekvenciáit Dietrich és munkatársaitól [Anti-Cancer Drugs, 3, 507-511 (1992)] és Gabius és munkatársaitól [Anti-Cancer Rés., 12, 669-676 (1992)] függetlenül írtak le (lásd még: DE 4221836 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi leírás). Az A-, illetve B-lánc N-terminális peptidjeiből kiindulva - ezek aminosav-összetétele és a belőlük levezethető nukleinsavszekvenciák magas fokú degeneráltsága miatt - gyakorlatilag lehetetlen olyan szintetikus oligonukleotidokat előállítani, amelyekben eléggé alacsony a degeneráltság foka ahhoz, hogy a genomiális géntárak szűrésekor ML-génfragmentumok azonosításához juthassunk. Ez vonatkozik olyan cDNS-génbankokra is, amelyeket Viscum album poli(A+)RNS-ből kiindulva állítottak elő.

A polimeráz-láncreakció (PCR) lehetővé teszi az olyan DNS-szakaszok sokszorozását (amplifikációját), amelyek ismert szakaszok között helyezkednek el [H. A. Erlich et al., Natúré, 331, 461 (1988)]. Egy, az MLA N-terminális végéről származó „szensz” oligonukleotiddal és egy MLB N-terminális „antiszensz” oligonukleotiddal a közöttük lévő génszakasz sokszorozása elképzelhető lenne az ML-gén intronszabadságának a feltétele mellett (1a. ábra). A B-lánc N-terminális szekvenciájának az analízise a gyakorlatban azt mutatta, hogy ennek az amplifikációnak az eredményes kiviteléhez azonban az oligonukleotidok lehetséges kombinációinak a degeneráltsági foka igen magas. Ez főképpen azzal magyarázható, hogy a B-lánc N-terminális végének nem kedvező a szekvenciája oligonukleotid szerkesztéséhez, ezért az ismert aminosavszekvencia-területekből kiindulva az ML-génszekvenciák sokszorozása nem valósítható meg a gyakorlatban (1b. ábra). Ezért az ML-gén klónozásához, próbaképpen, egy megváltoztatott PCR-stratégiát vettünk igénybe, mégpedig úgy, hogy az amplifikációs oligonukleotidok szerkesztéséhez további proteinadatokat vontunk be, főként a fagyöngy-lektinnek a riboszómainaktiváló proteinek (RIP) I típusú és II típusú osztályaival való rokonsági kapcsolatai alapján [F. Stirpe, Bio/Technology, 10, 405-412 (1992)]. Az (a) I típusú RIP proteinek és a ricin A-láncok és (b) az abrin és ricin B-láncok többszöri egymáshoz illesztése (alignement) révén összesen

HU 225 738 Β1 állandó szakasz szekvenciáját azonosítottuk. Ezekből a szekvenciaszakaszokból kiindulva és a rokon fajok kodonhasználati táblázatának figyelembevételével összesen 21 oligonukleotidot szerkesztettünk, amelyeket különböző kombinációkban, több mint 200 sokszorozási kísérletben alkalmaztunk. Azonban egyetlen esetben sem sikerült specifikus amplifikációs termékhez jutnunk, jóllehet a PCR-feltételeket, ami az anellálási hőmérsékletet, Mg²⁺-tartalmat, valamint a ciklusparamétereket illeti, széles határok között változtattuk.

Sem a genomiális- és cDNS-bankok szűrésével, sem a PCR-technikák alkalmazásával nem tudtunk az említett meggondolások alapján specifikus ML-DNSszekvenciákhoz jutni.

Ezért újabb utakat kerestünk, azaz a ricin és az abrin szerkezetének további strukturális tulajdonságait vontuk be az amplifikációs oligonukleotidok szerkesztésébe.

Minthogy a riboszómainaktiváló proteinek (RIP-ek) enzimes mechanizmusa - főként a II típusú RIP ricin mechanizmusa - az ML-éhez hasonlít [Y. Endo et al., FEBS Lett., 231, 378-380 (1988); Biochim. Biophys. Rés. Comm., 150, 1032-1036 (1988)], nem volt kizárható, hogy a funkciós primer és tercier szerkezeti területek szintjén is vannak strukturális egyezések. A ricin kristályszerkezetéből kiindulva [B. J. Katzin et al., Proteins, 10, 251-259 (1991); E. Rutenber, J. D. Robertus, Proteins, 10, 260-269 (1991); S. A. Weston et al., J. Mól. Bioi., 244, 410—422 (1994)] a ricin A-láncának láncflexibilitási analízise rámutatott az Arg180 - ez egy állandó szekvenciaszakaszon belül helyezkedik el gyenge mobilitására. Elvégeztük továbbá az aktív centrumnak ezen a területén a lánc gerincének térbeli elhelyezkedése alapján az adott lehetséges aminosavszubsztitúciók analízisét, a szubsztrátum-kölcsönhatások figyelembevétele mellett. Ezen meggondolások eredményeit most már összekapcsoltuk a ricin-A-lánc és a további I típusú RIP-ek szekvenciáinak teljes körű egymáshoz igazításának kiértékelésével.

A szekvenciák összehasonlításával kapott eredmények szerkezeti adatokkal történő kibővítése révén valószínűségi adatokat kaptunk meghatározott aminosavcsoportok meghatározott pozíciókban való előfordulásáról. Ezáltal lehetővé vált, hogy erre a területre egy sorozat elméleti ML-aminosavszekvenciát vélelmezzünk, és ezek alapján egy megfelelő, rendkívül kevéssé degenerált oligonukleotidot (RMLA2) szerkesszünk (1c. ábra).

Az RMLA1 (egy olyan degenerált oligonukleotid, amelyet az MLA-lánc N-terminális aminosavszekvenciájából vezettünk le; vő. az 1b. ábrával) és a fenti meggondolások alapján szerkesztett „activesite RMLA2 oligonukleotid kombinációjával, meghatározott PCR-paraméterek mellett, most már komplex genomiális ML-DNS-ből kiindulva, fragmentumokat tudtunk előállítani, miután minden erre vonatkozó más eljárás, mint fent leírtuk, eredménytelen volt.

A génszekvenciáról való tájékozódást specifikus, nem degenerált oligonukleotidprimerrel - amelyet az MLA-génben lévő szekvenciarészből az „a” fragmentum (3. ábra) klónozásával és szekvenálásával vezettünk le - és degenerált oligonukleotidokkal - amelyeket RIP l-ből és ricin/abrin szekvencia összehasonlításokból vezettünk le - végzett további PCR-sokszorozások segítségével egészítettünk ki. A degenerált B-lánc oligonukleotidok szerkesztéséhez a ricin és az abrin B-láncok szekvenciáinak egymáshoz illesztését használtuk fel, ahol ugyancsak találtunk néhány feltűnően állandó szakaszt.

A holoprotein 5’- és 3’-végének, a B-lánc részfragmentumainak, valamint az 5’ és 3’ nem transzlatált szakaszoknak az előállításához, izolált fagyöngy-RNS-ből kiindulva, reverz transzkripció révén analóg cDNS-t, és RACE-technika segítségével [M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 8998-9002 (1988)] előállítottuk a megfelelő géndarabokat. Miután nagyszámú egymást átfedő génfragmentumot kaptunk (3. ábra), a teljes A-lánc és B-lánc génrészeket mindenkor a komplex genomiális fagyöngy-DNS-ből kiindulva, újból specifikus PCR-rel állítottuk elő. Az rMLA és rMLB génszekvenciákat - a terminális módosításokkal együtt - a 4a. ábra és a 4b. ábra mutatja be. Az 5' és 3' nem transzlatált területeket, valamint az endopeptideket és szignálpeptideket kódoló géndarabokat magában foglaló teljes ML-génszekvenciát a 4c. ábra tartalmazza.

A találmány szerinti nukleinsavmolekulának egy előnyös kiviteli formájában a fragmentum a rekombináns fagyöngy-lektin A-lánca, amelyet a 4a. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia (rMLA) kódol.

A találmány szerinti nukleinsavmolekulának egy előnyös kiviteli formájában a fragmentum a rekombináns fagyöngy-lektin B-lánca, amelyet a 4b. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia (rMLB) kódol.

A találmány egy további előnyös kiviteli alakja egy olyan nukleinsavmolekulára vonatkozik, amely egy DNS-molekula.

A találmány szerinti „DNS-molekula alatt vagy genomiális, vagy cDNS-molekulát, vagy egy (fél)szintetikus DNS-molekulát értünk. Ezen különböző DNS-molekulák előállítására szolgáló eljárásokat - a találmány szerinti útmutatások ismeretében - a szakemberek ismerik.

A találmány egy további előnyös kiviteli formájában a nukleinsavmolekula egy RNS-molekula.

A találmány ezenkívül egy olyan nukleinsavmolekulára vonatkozik, amely egy előzőleg leírt, találmány szerinti nukleinsavmolekulának egy antiszensz szála. Egy ilyen antiszensz szálat fel lehet használni például transzkripciógátlás céljára, és ennélfogva a növényben az expresszió vagy a szabályozás tanulmányozására.

A találmány egy olyan vektorra is vonatkozik, amely legalább egy találmány szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaz.

A találmány szerinti vektor tartalmazhat például egyetlen olyan találmány szerinti nukleinsavmolekulát, amely a teljes fagyöngy-lektin-preproproteint kódolja. Amennyiben ez a vektor expressziós vektor, a preproprotein egy alkalmas transzformált gazdasejtben feldolgozásra kerülhet, és a monomeregységek in vivő vagy

HU 225 738 Β1 in vitro fagyöngy-lektinné kapcsolódhatnak össze. Egy másik kiviteli alakban a találmány szerinti vektor egy olyan vektor, amelyet csak a találmány szerinti nukleinsav szaporítására használunk.

Egy előnyös kiviteli formában a találmány szerinti vektor egy olyan nukleinsavmolekulát tartalmaz, amely a fagyöngy-lektin A-láncát vagy ennek egy fragmentumát kódolja, és még egy olyan nukleinsavmolekulát is tartalmaz, amely a B-láncot vagy ennek egy fragmentumát kódolja. A monomerek fragmentumai előnyösen biológiailag aktívak.

Egy további előnyös kiviteli formában a találmány szerinti vektor egy expressziós vektor. A szakemberek pontosan tudják, hogy a különböző gazdaszervezetek számára hogyan állítsák elő az alkalmas expressziós vektorokat.

Heterológ expresszióhoz a találmány szerint egy, a fagyöngy-lektin A-láncát kódoló szekvenciát állítottunk elő specifikus PCR-rel, komplex genomiális fagyöngyDNS-ből kiindulva. Az alkalmazott oligonukleotidprimerek nem komplementer szakaszain keresztül ehhez transzlációs kontrollelemeket, valamint restrikciós endonukleáz felismerő szekvenciákat adtunk, miáltal, kiindulván a meglévő prepro-fagyöngy-lektin-génből, lehetővé vált a fagyöngy-lektin A-lánc klónozása és elkülönített expressziója.

Az rMLA-t kódoló szekvencia 5’-részét, amely a tirozin¹-tirozin¹⁷ szakasznak felel meg [J. B. Dietrich et al., Anti-Cancer Drugs, 3, 507-511 (1992); H.-J. Gabius et al., Anti-Cancer Rés., 12, 669-676 (1992)], egy transzlációs startkodon elébe kapcsolásával, két oligonukleotid hibridizálása és klónozása révén, mint szintetikus génfragmentumot állítottuk elő. A kodonkiválasztásnál a génszekvencia optimalizálására törekedtünk, ahogyan ezt az Escherichia coliban erősen kifejeződő génekre leírták [M. Gribskov et al., Nucl. Acids Rés., 12, 539-549 (1983)]. A szintetikus rMLA génfragmentum 3’-végén, valamint a PCR-rel előállított rMLA-génfragmentum 5’-végén a TAC tirozin¹⁷ kodonnak TAT kodonná való célzott kicserélése révén egy Sspl restrikciós helyet vezettünk be, amely lehetővé tette a két rMLA-génfragmentum fúzióját a pML14-17 vektor előállítása mellett (5. ábra). Az rMLA-kódoló szekvenciát DNS-szekvenálással igazoltuk (4a. ábra). Az rMLA Escherichia coliban való kifejezéséhez a génszekvenciát a pML14-17 vektorból izoláltuk, és a pT7-7 expressziós vektorba [F. W. Studier, B. A. Moffart, J. Mól. Biok, 189, 113-130 (1986)] való beépítése révén a T7-RNS polimeráz promoter és egy transzkripcióterminátor szabályozása alá helyeztük. A kapott pT7-MLA expressziós vektorral (5. ábra) transzformáltuk az E. coli BL21 expressziós törzset. A génexpresszió létrejöttét egy proteinsáv megjelenése jelezte, amely a nem glikolizált, rekombináns fagyöngy-lektin A-láncának amelynek relatív molekulatömege 25 kD - felelt meg. A rekombináns expressziós termék azonosítását Western-blot-analízissel, specifikus MLA-antitest használatával végeztük (7. ábra).

A fagyöngy-lektin B-láncának heterológ expressziójához az MLB-kódoló szekvenciát komplex genomiális

Viscum album DNS-ből specifikus PCR-rel sokszoroztuk, amikor is a felhasznált oligonukleotidprimerek nem komplementer szakaszain keresztül transzlációszabályozó elemeket, valamint restrikciós endonukleáz felismerő szekvenciákat vezettünk be (6. ábra). A kapott 0,8 kb méretű PCR-terméket beklónoztuk a pCRII TA-klónozó vektorba, majd a pT7-7 expressziós vektorba való beépítésével transzkripciószabályozó elemek szabályozása alá helyeztük, és az így keletkezett pT7-MLB expressziós vektorral transzformáltuk az E. coli BL21 expressziós törzset.

Az rMLB-kódoló szekvencia integritását DNS-szekvenálással igazoltuk (4b. ábra). Az expresszió kimutatását Western-blot-analízissei végeztük, specifikus anti-MLB-antitest [TB33; A. G. Tonevitsky, Immunoi. Lett., 44, 31-34 (1995)] használatával, amikor is a génexpresszió indukciója után 2 órával egy 31 kD relatív molekulatömegű immunreaktlv protein jelent meg, amely a nem glikozilált, rekombináns fagyöngy-lektin B-láncának felelt meg (7b. ábra). Az E. coli sejtek összsejtfeltárása után a sejtfrakciók analízise azt mutatta, hogy a szintetizált rMLB-lánc az E. coli sejt feltárásnál kapott felülúszóban egy oldható részre és az üledékben egy oldhatatlan, „inclusion bodies” („zárványtestek”) részre vált szét, és az indukció után 4 órával az oldható, illetve oldhatatlan rész az összkitermelés mindenkori 50%-át tette ki (7b. ábra).

A találmány egy olyan gazdára is vonatkozik, amely legalább egy találmány szerinti vektorral van transzformálva, illetve egy ilyen vektort tartalmaz.

A szakember - célkitűzésétől függően - a találmány szerinti gazdasejttel előállíthatja a két monomer közül csak az egyiket, vagy előnyösen előállíthatja a két monomer kombinációját, mint asszociált dimert. A találmány szerinti gazda lehet eukarióta vagy prokarióta sejt vagy transzgenikus növény vagy transzgenikus állat.

Előnyös, ha a találmány szerinti gazda emlőssejt, növényi sejt, baktérium, gombasejt, élesztősejt, rovarsejt vagy egy transzgenikus növény.

Egy különösen előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti gazda az E. coli baktérium vagy egy Aspergillus sejt vagy egy Spodoptera sejt, előnyösen egy Spodoptera frugiperda sejt.

A találmány vonatkozik továbbá egy olyan polipeptidre, amelyet a találmány szerinti nukleinsavmolekula vagy a találmány szerinti vektor kódol, és a találmány szerinti gazda termeli.

A találmány szerinti polipeptid előnyösen a fagyöngy-lektin A-láncának vagy B-láncának biológiai aktivitásával rendelkezik. Más kiviteli formákban azonban a találmány szerinti polipeptid csak részleges biológiai aktivitást is kifejthet, vagy lehetséges, hogy már egyáltalán nincs biológiai aktivitása. A „részleges biológiai aktivitás” alatt a találmány szerint csökkent aktivitást és/vagy a biológiai aktivitásspektrumból egy bizonyos számú aktivitást értünk. A találmány szerinti polipeptid az A- vagy B-lánc egy fragmentuma is lehet, amely az előzőleg említett tulajdonságokat mutatja.

HU 225 738 Β1

Az rMLA, rMLB és rML-holoprotein tulajdonságainak vizsgálata (I) Relatív molekulatömeg és szerkezet

A relatív molekulatömeget redukáló körülmények között, SDS-poliakrilamid-gél elektroforézissel határoztuk meg, a protein festését ezüsttel, illetve Coomassie-brilliant-blue színezékkel végeztük, illetve egy Western-blot-analízis keretében immunológiai festést alkalmaztunk.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy a rekombináns, nem glikozilált fagyöngy-lektin A-lánc relatív molekulatömege 25 kD, és ezzel jelentősen különbözik a természetes fagyöngy-lektin A-láncáétól, ugyanis az Ατ-lánc molekulatömege 31 kD, illetve az A₂-láncé 29 kD. A relatív molekulatömegre kapott különbség mindenekelőtt azért meglepő, mivel a technika jelenlegi állása szerint abból indultunk ki, hogy az A-lánc nem glikozilált. A rekombináns fagyöngy-lektin B-lánc relatív molekulatömege 31 kD, ami lényegesen kisebb, mint a glikozilált, természetes fagyöngy-lektin B-lánc 36 kD molekulatömege (7. ábra).

A természetes ML-proteineknél tapasztalt heterogenitás, amely a glikoziláció és/vagy a szekvenciavariációk következménye, és amely SDS-gélben széles sávként mutatkozik meg, a rekombináns típusoknál egyetlen esetben sem lépett fel.

A reasszociált rMLA/rMLB relatív molekulatömegei összeadódnak, így a holoprotein (rML) molekulatömege a nehezebb nML 65-67 kD molekulatömegéhez képest 56 kD-t tesz ki.

(II) Izoelektromos homogenitás

Az rMLA izoelektromosan homogén protein - izoelektromos pontja 6,8 - a nagy tisztaságú természetes fagyöngy-lektin A-láncaihoz viszonyítva. Négy ilyenfajta A-lánc van, amelyeknek az izoelektromos pontja 5,2; 5,4; 5,7 és 6,2 (8. ábra).

Az rMLB izoelektromosan homogén protein - izoelektromos pontja 5,1 - ellentétben a természetes fagyöngy-lektin B-láncával, amelyből legalább kétfajta van, 7,1 és 7,3 izoelektromos ponttal (8. ábra).

Ebből adódik, hogy a természetes ML-holoproteint számos molekulaváltozat és -kombináció képviseli (8. ábra, alul), míg a rekombináns fagyöngy-lektin-proteinek izoelektromos fokuszáláskor egységes mobilitást mutatnak, és ez a természetes proteinfajták mikroheterogenitásával szemben az rML homogenitását dokumentálja.

(III) Az rMLA enzimaktivitása

Immunaffinitással tisztított rMLA-készítményeket használtunk egy összetett transzkripciós/transzlációs assay-ben, amellyel kimutattuk, hogy mind az oldható expressziós termékrészből izolált rMLA-nak, mind az oldhatatlan „inclusion bodies részből izolált rMLA-nak transzlációgátló aktivitása van.

A természetes fagyöngy-lektin A-lánccal összehasonlítva, az rMLA-gátlásnak mások a jellemzői a transzlációgátlás dózisfüggősége vonatkozásában, valamint a használt retikulocitalizátumban a nem gátolható transzlációs maradék aktivitás vonatkozásában (lásd a 9. ábrát). Az enzimatikus hatás, amely az ML-holoprotein toxikus hatásának alapját képezi, a rekombináns formánál jelentősen gyengébb.

(IV) Az rMLB szénhidrátkötő aktivitása

A primer expressziós termékekből renaturálással és reoxidációval előállított rMLB-láncok, úgy, mint az in vitro reasszociált rMLA/rMLB, rMLA/MLB és MLA/rMLB holoproteinek is, szénhidrátkötő aktivitást mutatnak, amelyet „Enzyme-linked-lektin-assay” (ELLA) segítségével, aszialofetuin vagy fetuin szénhidrát mátrixokhoz való kötődésük révén ki lehet mutatni. A rekombináns rMLB-lánc szénhidrát-specificitása galaktózzal, β-laktózzal, N-acetil-galaktóz-aminnal (GalNAc) és szialinsawal (N-acetil-neuraminsav=NANA) szemben ELLA rendszerben, kompetitív feltételek mellett meghatározható és mérhető. A kompetitív ELLA meglepő módon azt mutatja, hogy az nMLB és rMLB szénhidrát-specificitása különbözik. A kötési affinitást rendszerspecifikus IC50-értékekkel, azaz a proteinek immobilizált aszialofetuinligandumból galaktózzal (IC50 nMLB: 4,5 mM; IC50 rMLB: a túl csekély kölcsönhatás következtében nem meghatározható), β-laktózzal (IC50 nMLB: 4,9 mM; IC50 rMLB: >70 mM), N-acetil-galaktóz-aminnal (IC50 nMLB: 20,7 mM; IC50 rMLB: 109 mM) vagy immobilizált fetuinligandumból szialinsawal (IC50 nMLB: 49,8 mM; IC50 rMLB: 47,1 mM) való félmaximális kiszorításával írjuk le.

Míg az nMLB-lánc - amelyet mint galaktózspecifikus lektint írtak le -, mint várható, galaktózért és β-laktózért versenyeztethető, addig a rekombináns, E. coliban előállított rMLB-lánc kimutatható kölcsönhatást a galaktózzal nem mutat, a β-laktózzal pedig csekély kölcsönhatást mutat. A rekombináns rMLB-nek azonban jelentős affinitása van N-acetil-galaktóz-aminhoz és szialinsavhoz, és így a növényi nMLB-vel összehasonlítva szénhidrát-specificitása meglepő módon jelentősen eltolódik egy N-acetil-galaktóz-amin/szialinsav specifikus lektin felé. Az rMLB és az rMLB-t tartalmazó holoproteinek biológiai aktivitását tekintve ezeknél egy szélesebb vagy eltérő ligandum-, receptor- vagy célsejtspektrum mutatkozik a növényi fagyöngy-lektin-proteinekéhez képest.

Egy előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti polipeptid legalább egy kémiai vagy enzimatikus módosítást tartalmaz.

Ez a módosítás a polipeptid adott esetben létező biológiai aktivitását megváltoztathatja, csökkentheti vagy megnövelheti. Egy ilyenfajta módosításra például a transzláció és a polipeptid izolálása után kerülhet sor. Egyébként az ilyen módosításokat a találmány szerinti polipeptid kémiai vagy szintetikus előállításakor vezethetjük be. Ezeket a módosításokat a szakemberek ismert eljárásokkal vezethetik be annak érdekében, hogy a fagyöngy-lektin farmakológiai aktivitását megváltoztassák, illetve előnyösen megjavítsák.

Egy további előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti polipeptid egy fuzionált protein. A fuzionált protein előnyösen az előbbiekben meghatározott biológiai aktivitással rendelkezik.

HU 225 738 Β1

Előnyös, ha a találmány szerinti polipeptidnek ez a kiviteli formája is alkalmas arra, hogy a fagyöngy-lektin-polipeptid farmakológiai tulajdonságait további célok érdekében sejtszinten megváltoztassa és előnyösen megjavítsa.

A találmány vonatkozik még egy, a fagyöngy-lektin biológiai aktivitásával rendelkező polipeptiddimerre, amelyben mindkét monomert a találmány szerinti nukleinsavmolekulák kódolják.

A „fagyöngy-lektin biológiai aktivitása” kifejezés a fagyöngy-lektin ossz biológiai aktivitásának spektrumából minden egyes biológiai aktivitásra vonatkozik. Ilyen funkció például a fagyöngy-lektin farmakológiai hatása.

A növényi fagyöngy-lektin-1 számos emberből és egérből származó tumorsejtvonalban indukál sejthalált apoptotikus mechanizmusok révén [O. Janssen et al., Arzneim. Forsch., 43, 1221-1227 (1993)]. A fagyöngy-lektin-1, illetve a B-lánc egymaga, egészséges humán véradók perifériás mononukleáris sejtjeiből citokinek felszabadulását indukálja [T. Hajtó et al., Cancer Rés., 50, 3322-3326 (1990)]. A fagyöngy-lektin-1 rákos betegek neutrofil granulocitáiból szuperoxidanionok szekrécióját indukálta (Timoshenko, 1993). A fagyöngy-lektin-1 egészséges humán véradók perifériás limfocitáin az interleukin-2 receptor (CD25), illetve a HLA-DQ-antigén A-láncának kifejeződését indukálta [J. Beuth, et al., Clin. Invest., 70, 658-661 (1992)]. Az egerekben alkalmazott fagyöngy-lektin-1-ről kimutatták, hogy a timuszban csökkenti a timuszsejtszámot, a citotoxikus T-limfociták számát (Lyt—2+) és a segítő (helper) T-sejtek (L3T4+) számát. Csökkent továbbá a peritoneális makrofágok száma, speciálisan azoké is, amelyek a MAC-3 aktiválási markert hordozzák (J. Beuth, 1994). A kísérleti állatok timuszában az L3T4+/Lyt2+ arány is megnőtt. Fagyöngy-lektin-1-gyei való kezelés után az egerek perifériás vérében a leukociták, limfociták, monociták sűrűsége általában megnő, mégpedig speciálisan azoké a limfocitáké, amelyek a sejt felületén interleukin-2 receptort, mint aktiválódási markert fejeznek ki, valamint azon monocitáké, amelyek MAC-3 aktiválási markert fejeznek ki (J. Beuth, 1995). Rákos betegek vérében a fagyöngy-lektin-1 megnövelte a T-limfociták (CD4+, CD8+), a természetes ölősejtek és a B-limfociták sűrűségét [J. Beuth etal., Clin. Invest., 70, 658-661 (1992)].

Kimutatták ezenkívül, hogy fagyöngy-lektin-1 alkalmazása után emlőkarcinómás betegek vérplazmájában az endogén β-endorfin opiát mediátor szintje megemelkedik [B.-M. Heiny, J. Beuth, Anti-Cancer Rés., 14, 1339-1342 (1994)]. Emellett kimutatták, hogy a fagyöngy-lektin-1 megnöveli a perifériás, természetes ölősejtek K-562 tumorsejtek elleni citotoxikus hatását és a perifériás vérben a nagy, granulákat tartalmazó limfociták (LGL) sűrűségét [T. Hajtó et al., Cancer Rés., 49, 4803-4808 (1989)]. Megállapították, hogy a fagyöngylektin-1 egerek szarkómasejtjeire antimetasztatikus hatást fejt ki [J. Beuth et al., In vivő, 5, 29-32 (1991)].

Egy másik kiviteli formában a találmány szerinti polipeptiddimer biológiai aktivitásspektruma azonos a természetes fagyöngy-lektinével.

(V) A rekombináns fagyöngy-lektin biológiai aktivitásai

Az rML-holoproteinek rekombináns technikával való előállításához külön szintetizált egyedi láncokat használtunk, vagy felgombolyodott oldható láncokból kiindulva, vagy denaturált rMLA- és rMLB-láncokból kiindulva, együttes felgombolyítás keretében, amelyben az rMLB-t előnyösen moláris feleslegben, az rMLA-t pedig glutation-redoxrendszer jelenlétében és részben protein-diszulfid-izomeráz jelenlétében is vitro reasszociáltuk. A heterodimernek megfelelő rML-holoprotein izolálását és tisztítását úgy végeztük, hogy a reasszociációs reakcióelegyből N-acetil-galaktóz-amin-agarózon vagy laktozil-agarózon való affinitáskromatográfiával leválasztottuk a szabad rMLA-t és rMLA-dimereket. Analóg eljárással állítottuk elő az rMLA/rMLB (rML) és rMLA/nMLB heterodimerholoproteineket.

Citotoxikus aktivitás

A reasszociált holoproteinek egyik biológiai aktivitása például a citotoxikus hatás, amelyet egy humán monocita-leukémia-sejtvonalon (MOLT-4) teszteltünk. Mind a B-lánc (felületi kötés), mind az A-lánc (enzimes riboszómainaktiválás) hozzájárul a megfigyelt citotoxikus hatáshoz. Egy in vitro reasszociált rMLA/rMLB holoproteint, valamint egy in vitro reasszociált rMLA/nMLB holoproteint két sarzs természetes nML-holoproteinnel hasonlítottunk össze. A rekombináns rMLA/rMLB és az rMLA/nMLB holoprotein hasonlóan magas citotoxikus tulajdonságot mutatott, 10-30 pg/ml IC50-értékekkel (11. ábra), ami a rekombináns láncok használatával in vitro reasszociált rML-holoproteinek funkcionális integritását és biológiai aktivitását igazolja. A citotoxikus aktivitás kifejtéséhez szükség van arra, hogy a B-láncot az enzimatikusan aktív A-lánccal működőképesen kapcsoljuk össze, ugyanis - meglepő módon - az izolált rMLB-lánc nem mutatott citotoxikus aktivitást. A növényi fagyöngy-lektin B-lánc készítmények máig vitatott citotoxikus aktivitása eszerint a legnagyobb valószínűséggel maradék nML-holoprotein-tartalmukra vezethető vissza. Az egyedi láncok rekombináns előállításával először van meg annak lehetősége, hogy a fagyöngylektin szénhidrátkötő és enzimatikus aktivitását külön jellemezzük és alkalmazzuk.

Apoptózis indukciója (Apoptosis=programozott sejthalál)

A fagyöngy-lektin egyik biológiai aktivitását az apoptózisra való indukciós képessége jellemzi. A rekombináns rML-holoproteinek ezen akvititását U937 monocita sejtvonalon mutattuk ki. A sejteket 70 pg/ml rML-holoproteinnel kezeltük, és 24 óra múlva ki tudtuk mutatni az apoptózis indukcióját (12. ábra). MOLT-4 sejteken és perifériás vér mononukleáris sejteken (PBMC=peripheral blood mononuclear cell) fagyöngy-lektinnel végzett vizsgálatokkal ki tudtuk mutatni, hogy alacsony dózistartományban a programozott sejthalálfolyamatok indukálása képezi a fagyöngy-lektin citotoxikus aktivitásának az alapját. Minthogy alacsony citotoxicitású koncentrációtartományban követ7

HU 225 738 Β1 kezik be a citokinindukció (13. és 14. ábra), az apoptózisindukáló aktivitással való korreláció elfogadható nézet. Ezzel szemben magas dózisú tartományban, valamint hosszabb inkubációs idő mellett az apoptózist nekrotikus hatások fedik el. A szenzitív MOLT-4 sejtek rekombináns B-lánccal való kezelésénél nem állapítottunk meg apoptózis következményeként jelentkező citotoxicitást, így tehát az apoptózisindukció - mint az alacsony dózistartományban megjelenő biológiai aktivitás - csak a holoprotein hatására vezethető vissza.

Immunstimuláló aktivitás

A rekombináns fagyöngy-lektin-holoprotein immunstimuláló hatásait - mint biológiai aktivitásokat - a következő példák segítségével mutattuk ki: egészséges véradóktól származó emberi mononukleáris sejtekből a tumornekrózis-faktor-α (TNF-a) és a γ-interferon (IFN-γ) felszabadulás indukciójával (PBMC-modell), továbbá emberi primer keratinociták és bőrfibroblasztsejtek együttes tenyészetében interleukin-1a (IL- 1a) és interleukin-6 (IL—6) felszabadulás indukciójával (skin²-ZK1200-modell). PBMC-modellben 3-48 ng/ml rekombináns rML-holoprotein a TNF-α és IFN-γ dózisfüggő felszabadulását eredményezte, skin²-modellben 0,25-8 ng/ml rekombináns rML-holoprotein az IL-1a és IL—6 dózisfüggő felszabadulását eredményezte.

Az említett citokinek az emberi immunrendszer lényeges, stimuláló mediátorai, amelyek központi funkciójukat mindenekelőtt a celluláris immunválasz aktiválásában töltik be.

Az eddigi ismeretekkel ellentétben - mely szerint az immunstimuláló aktivitás a B-lánc lektinaktivitására vezethető vissza [T. Hajtó et al., Cancer Rés., 50, 3322-3326 (1990)] - egymagával az rMLB-lánccal nem lehetett a fent említett citokinfelszabadulásokat indukálni. Az immunstímuláló aktivitást alacsony dózistartományban kizárólag a működőképesen összekapcsolt rML-holoproteinnel lehetett elérni. Ez a meglepő eredmény arra enged következtetni, hogy az immunstimuláló növényi nMLB-lánc-készítmények még tartalmaztak nML-holoprotein-nyomokat, és hogy az nMLB-láncnak tulajdonított immunstimuláló hatás maradék nML-tartalomra vezethető vissza. Eszerint, míg az nMLB előállítására eddig leírt eljárások a holoproteintől való kvantitatív elválasztást nem tették lehetővé, addig a fagyöngy-lektin egyedi láncainak rekombináns előállításával először vált lehetővé homogén fagyöngy-lektin B-lánc készítmények vizsgálata és előállítása. Így először vált lehetővé külön az A-, és külön a B-lánc biológiai aktivitásainak leírása és alkalmazása, valamint az egyedi láncok és a működőképesen összekapcsolt holoprotein biológiai aktivitásainak a megkülönböztetése.

(VI) A rekombináns fagyöngy-lektin B-lánc (rMLB) biológiai aktivitásai

Az immunkompetens sejtek aktiválása jelzőjeként a CD69 sejtfelületi protein indukcióját vizsgáltuk. A T-sejtek, Β-sejtek és különösen a „natural killer” sejtek (természetes ölősejtek=NK-sejtek) aktiválása után a CD69 egyike az először megjelenő sejtfelületi antigéneknek. A CD69 a fent említett immunkompetens sejtpopuláció egyik aktiválási markereként jelenik meg, ugyanis ezt a sejtfelületi proteint a nyugvó limfociták nem fejezik ki. Ezenkívül kimutatták, hogy az indukálható CD69 felületi protein - funkciója szerint - fokozza az NK-sejtek és a TcR γ/δ T-sejtek citolitikus aktivitását [A. Moretta et al., J. Exp. Med., 172, 701-707 (1991)].

Folyadékcitometria (FACS) segítségével, egy antiCD69 monoklonális antitest használatával, 1-100 ng/ml koncentrációtartományban a mononukleáris sejtek aktiválódását észleltük, tekintve a CD69 sejtfelületen való megjelenését, valamint a CD69-pozitív sejtek részarányát. Itt egy dózisfüggőséget mutató, harang alakú görbét kaptunk, ami arra mutat, hogy a celluláris receptorok az rMLB-lánc két ligandumkötő helyén keresztül szükségszerűen térhálót alakítanak ki. Az ugyanekkor vizsgált PBMC-ken még a 100 ng/ml-es legmagasabb koncentrációnál sem lehetett citotoxikus hatást kimutatni.

Egy előnyös kiviteli alakban a találmány szerinti polipeptiddimerben a monomerek legalább egyike egy kémiailag vagy enzimatikusan módosított találmány szerinti polipeptid vagy egy találmány szerinti fuzionált protein.

A módosítások révén egyrészt optimalizálhatjuk a hatáserősséget, másrészt az egyes hatásféleségek (például a B-lánc szénhidrátkötőhelyei vagy az A-lánc glikozidázaktivitása) kiiktatása révén a terápiás alkalmazás lehetőségeit kiszélesíthetjük úgy, hogy az adott esetben előforduló mellékhatásokat kiküszöböljük. A megváltoztatott tulajdonságokkal rendelkező polipeptidek eszközül szolgálhatnak a hatásmechanizmusok felderítéséhez. Bizonyos terápiáknál szükség lehet a polipeptidek antigenitásának és immunogenitásának a csökkentésére és/vagy farmakokinetikai tulajdonságainak optimalizálására, ami egyes aminosavak célzott kicserélésével érhető el.

A találmány ezenkívül olyan antitestekre vagy ezek fragmentumaira vagy származékaira is vonatkozik, amelyek a találmány szerinti polipeptidekhez és/vagy polipeptiddimerekhez specifikusan kötődnek. Ezek nem ismerik fel a természetes fagyöngy-lektint vagy ennek egyes láncait. A találmány szerinti antitestek előnyösen olyan epitópokhoz kötődnek, amelyeket a természetes fagyöngy-lektinek glikoziláltsága elfed. Az antitestek lehetnek monoklonális, poliklonális vagy félszintetikus antitestek. A fragmentumok lehetnek például Fab’-, F(ab)₂- vagy F_v-fragmentumok. A technika állása szerint ismeretesek az antitestszármazékok is.

A találmány a továbbiakban a találmány szerinti polipeptid vagy polipeptiddimer előállítására szolgáló eljárásra is vonatkozik, amely abból áll, hogy a találmány szerinti gazdát alkalmas körülmények között tenyésztjük, és az így kapott polipeptidet vagy polipeptiddimert izoláljuk.

A szakemberek ismerik a tenyésztés és izolálás megfelelő feltételeit. A találmány szerinti polipeptid vagy polipeptiddimer például megfelelő expressziós rendszer segítségével a gazdából kinyerhető, majd a táptalajból izolálható. Másrészt ha a polipeptidek vagy

HU 225 738 Β1 polipeptiddimerek a sejtekben maradnak, ezeket onnan izolálhatjuk. Ezt követően a találmány szerinti eljárás egy további előnyös kiviteli formáját ismertetjük.

Az rMLA izolálásánál úgy jártunk el, hogy megfelelő expressziós vektorral transzformált E. coli sejtekből teljes sejtfeltárást végeztünk, majd centrifugálással választottuk el az oldható sejtalkotórészeket az oldhatatlanoktól. A sejtfrakciók analízise kimutatta, hogy a rekombináns fagyöngy-lektin A-lánc az expressziós feltételektől és az expresszió időtartamától függően 5-50%-ban oldható formában, illetve 50-95%-ban oldhatatlan proteinaggregátumok formájában („inclusion bodies) gyűlik össze.

Az oldható és oldhatatlan proteinek megjelenése amennyiben az rMLA-proteinek visszagombolyítása, illetve renaturálása lehetséges - következtében legalább két eljárás adódik az rMLA izolálására. A zárványtestekben aggregálódott rMLA-t, miután az üledéket az E. coli proteinek eltávolítása végett kimostuk [P. C. Babbitt et al., Bio/Technology, 8, 945-949 (1990)], denaturáló körülmények mellett feloldjuk, és megfelelő pufferben (10 mM trisz.HCI, 2 mM DTT, 1 mM EDTA, pH 8,0) 90-szeres hígítás segítségével visszagombolyítjuk.

E szerint az eljárás szerint egyrészt oldható, felgombolyodott olyan proteinfélék keletkeznek, amelyek - mint a 9. ábra mutatja - éppen úgy, mint a renaturált, eredetileg oldhatatlan, denaturált rMLA-félék, enzimatikusan teljesen aktívak. A renaturált rMLA-t ugyanúgy izolálhatjuk, mint az oldható rMLA-t, immunaffinitás-kromatográfiával, a specifikus TA5 anti-MLA-antitest használatával [A. G. Tonevitsky et al., Immunoi. Lett., 44, 31-34 (1995)].

Mivel az rMLB oldható formában és oldhatatlan zárványtestek formájában is előfordul, a rekombináns fagyöngy-lektin B-lánc izolálására két eljárást használhatunk.

Az E. coli citoplazma erősen redukáló közegéből az oldható rMLB-lánc izolálását úgy végeztük, hogy a láncközi diszulfidhidak kialakítása végett inkubálást végeztünk redukált és oxidált glutationból álló redoxrendszer jelenlétében, és az aktív, felgombolyodott termékek stabilizálása végett β-laktózligandum jelenlétében. A felgombolyító reakcióelegyből a szénhidrátkötő rMLB-láncot egylépéses eljárásban laktozil-agarózon vagy Nacetil-galaktóz-amin-agarózon való affinitáskromatográfiával szelektíven izoláltuk, illetve tisztítottuk.

Az oldhatatlan, zárványtestek formájában kapott expressziós termékrészből az rMLB-t úgy izoláltuk, hogy az E. coli összsejt feltárásnál kapott üledéket az E. coli proteinek eltávolítása végett kimostuk [P. C. Babbitt et al., Bio/Technology, 8, 945-949 (1990)] és denaturáló és redukáló körülmények mellett feloldottuk. A renaturálást hígítással végeztük, redukált és oxidált glutationból álló redoxrendszer, illetve β-laktózligandum jelenlétében, amikor is a renaturáló elegyből az aktív szénhidrátkötő rMLB-láncot N-acetil-galaktóz-amin-agarózon vagy laktozil-agarózon való affinitáskromatográfiával szeletíven izoláltuk és tisztítottuk.

A találmány ezenkívül egy olyan gyógyszerre is vonatkozik, amely a találmány szerinti polipeptidet vagy a találmány szerinti polipeptiddimert és/vagy az alább leírt találmány szerinti immuntoxint tartalmazza, adott esetben egy gyógyszerészeti szempontból elviselhető hordozóval.

A találmány szerinti polipeptidek, ezek asszociált vagy módosított származékai sokoldalúan alkalmasak a rák- és fertőző betegségek kezelésében való felhasználásra, a természetes fagyöngy-lektin ismert farmakológiai tulajdonságainak megfelelően. Az immunstimuláló hatások a tumorterápiában hasznosíthatók, amikor is közvetlen és/vagy közvetett stimuláció révén a szervezet saját immunológiai védekező rendszere képessé válik a tumor és adott esetben a metasztázisok hatékony leküzdésére. Ugyanez vonatkozik a fertőzésekre, és különösen a vírusos megbetegedésekre. A találmány szerinti polipeptideket más immunstimuláló szerekkel, például interferonokkal, citokinekkel vagy telepstimuláló faktorokkal kombinálva alkalmazhatjuk azért, hogy szinergetikus hatást érjünk el, illetve hogy a kombinációs partner szükséges dózisát csökkentve ennek mellékhatásait csökkentsük.

Citosztatikumokkal vagy besugárzással kombinációban a leukopénia/mieloszuppresszió mellékhatása enyhül vagy csökken, és ezáltal az immunrendszernek a jelenleg szokásos kezelési módszerek által előidézett meggyengülése csökken.

A polipeptidek glikozidázaktivitásukkal okozott közvetlen citotoxikus hatása a tumorsejtek programozott sejthalálához vezet, amelyet szintén ki lehet használni a terápiában. Ez az elv az immuntoxinok alkalmazásánál specifikusabban valósítható meg, ha a találmány szerinti polipeptideket megfelelő antitestekhez kötjük. A találmány tehát a továbbiakban olyan immuntoxinokra is vonatkozik, amelyek legalább egy találmány szerinti polipeptidet vagy polipeptiddimert tartalmaznak. Például: az aktív A-láncot vagy a holoproteint proteinkémiai módszerekkel antitestekhez vagy ezek fragmentumaihoz köthetjük. Az ilyen kötési eljárások a szakemberek számára ismertek, és a megfelelő konjugátumok sokoldalúan hasznosíthatók [E. S. Vitetta et al., Immunoi, today, 14, 252-259 (1993)]. Egyébként megfelelően szerkesztett olyan fúziós proteinszerkezetek is expresszálhatók, amelyek például antitestekből származó antigénkötő doméneket és ezenkívül a találmány szerinti polipeptid citotoxikus fragmentumait tartalmazzák.

A metasztázisok képződése megakadályozható, ha gátoljuk a tumorsejtek más sejtekhez való kötődését. A találmány szerinti polipeptidekkel - kompetitív lektinkötés révén - ez a kötődés meggátolható.

A találmány vonatkozik még egy olyan primerre és/vagy egy olyan primerpárra, amely a találmány szerinti nukleinsavmolekulával, illetve az ezzel komplementer szállal specifikusan hibridizál.

A találmány ezenkívül olyan diagnosztikus készítményekre is vonatkozik, amelyek legalább a következő alkotórészeket tartalmazzák:

a) a találmány szerinti nukleinsavmolekulát;

b) egy prímért és/vagy egy primerpárt, amely a találmány szerinti nukleinsavmolekulával, illetve

HU 225 738 Β1 az ezzel komplementer szállal hibridizál; és/vagy

c) a találmány szerinti polipeptidet és/vagy a találmány szerinti polipeptiddimert.

A találmány szerinti diagnosztikus készítménynek azt a kiviteli formáját, amely a prímért, illetve a primerpárt tartalmazza, arra használhatjuk, hogy lektingén jelenlétére vizsgáljunk át szervezeteket, hogy például olyan lektingéneket találhassunk, amelyek adott esetben farmakológiailag figyelemre méltó lektineket kódolnak. A találmány szerinti diagnosztikus készítményben lévő találmány szerinti nukleinsavmolekulát például Southern-blot- vagy Northern-blot-eljárásokban szintén arra használhatjuk, hogy különböző szervezeteket a megfelelő lektingének jelenlétére átvizsgáljunk. Ezenkívül a hibridizációs körülmények szigorúságának a változtatásával rokon lektingéneket is kereshetünk. A polipeptidet (polipeptiddimert) például olyan antitestek vagy antiszérumok termelésére is használhatjuk, amelyekkel például - ismert eljárásokkal - megfelelő (fagyöngy)-lektlneket mutathatunk ki különböző szervezetekben.

Végezetül a találmány egy olyan növényvédő szerre vonatkozik, amely a találmány szerinti polipeptidet és/vagy a találmány szerinti polipeptiddimert tartalmazza. A találmány szerinti polipeptidek, asszociációs vagy módosított változataik, a növényi fagyöngy-lektinnél említett funkcióknak megfelelően, felhasználhatók a növényvédelem keretében. Itt szóba jön a fagyöngy-lektin toxikus tulajdonságain alapuló funkciójának a használata a növények lerágása elleni védekezésben, valamint a membrán permeabilitására és konstitúciójára ható tulajdonságainak a használata az antivirális védekezésben.

Az ábrák rövid magyarázata

Az 1. ábra primer amplifikációs oligonukleotidok szerkesztését mutatja be. Az 1a. ábra a klónozási stratégia vázlatos szemléltetése. Az 1b. ábra az N-terminális Aés B-lánc oligonukleotidok szerkesztésének vázlata. Az 1c. ábra az RMLA2 „aktív hely (active site) oligonukleotid szerkesztését mutatja be.

A 2. ábra a Viscum albumból származó komplex genomiális DNS-ből nyert ML-génfragmentumok PCR-sokszorozásának termékét mutatja be.

A 3. ábra az ML-gén előállítására szolgáló klónozóstratégiát ábrázolja.

A 4. ábra az rMLA és rMLB expressziós vektorok inszertumait és a teljes ML-génszekvenciát mutatja be. A 4a. ábrán és a 4b. ábrán a pT7MLA és pT7MLB expressziós vektorok rekombináns inszertumai láthatók. A 4c. ábrán a prepro-fagyöngy-lektin nukleotidszekvenciája és az ebből levezetett aminosavszekvenciája látható. [Az aminosavszekvencia a fagyöngy-lektin-gén (ML-gén) „h” (1-204. nukleotidok), „f (205-909. nukleotidok), „e” (910-957. nukleotidok), „g (958-1746. nukleotidok) és „i (1747-1923. nukleotidok) klónozott génfragmentumaiból lett levezetve.]

Az 5a. és 5b. ábra a pT7-MLA MLA expressziós vektor szerkesztésének vázlatát, az 5c. ábra egy MLA-fragmentum amplifikálásának eredményét mutatja be.

A 6a. és 6b. ábra a pT7-MLB MLB expressziós vektor szerkesztésének vázlatát, a 6c. ábra egy MLB-fragmentum sokszorozásának eredményét mutatja be.

A 7. ábra az rMLA és rMLB expresszióját és immunológiai kimutatását ábrázolja. A 7a. ábra az rMLA-lánc expressziójára, a 7b. ábra az rMLB-lánc expressziójára vonatkozik.

A 8. ábrán az rMLA és rMLB izoelektromos kromatofokuszálásának eredményei láthatók a természetes (natúr) ML-lel (nMLA, nMLB) és az ML-1 holoproteinnel (ML-Holo) összehasonlításban.

A 9. ábrán az rMLA enzimaktivitásának mérési eredményeit mutatjuk be.

A 10. ábrán az rMLB szénhidrátkötő jellemzőit mutatjuk be.

A 11. ábrán az rML MOLT4-re kifejtett citotoxicitását mutatjuk be.

A 12. ábra az rML által indukált apoptózist (programozott sejthalál) mutatja be U937 sejteknél.

A 13. ábra a rekombináns fagyöngy-lektin (rML) immunstimuláló hatását mutatja be PBMC-modellben. A 13a. ábra a TNF-a felszabadulásának indukcióját, a 13b. ábra az IFN-γ felszabadulásának indukcióját ábrázolja.

A 14. ábra a rekombináns fagyöngy-lektin (rML) immunstimuláló hatását mutatja be skin²-ZK1200-modellben. A 14a. ábra az IL-1a felszabadulásának indukcióját, a 14b. ábra az IL-6 felszabadulásának indukcióját szemlélteti.

A 15. ábra az rML által indukált CD69-kifejeződést (CD69-indukció) mutatja PBMC-ken.

Az alábbi példák a találmány szemléltetését szolgálják, anélkül azonban, hogy korlátoznák a találmány oltalmi körét.

1. példa

A sokszorozott primer oligonukleotidok szerkesztése

A fagyöngy-lektin (ML) a riboszómainaktiváló proteinek osztályához tartozik [F. Stirpe et al., Bio/Technology, 10, 405-412 (1992)]. Ezek a proteinek a különböző taxonómiai eredetű növényekben igen elterjedt proteincsaládot képviselnek. Az ML-t, alegységei aktivitásai alapján, a riboszómainaktiváló proteinek II típusú csoportjába sorolják [Y. Endo et al., FEBS Lett., 231, 378-380 (1988a)].

HU 225 738 Β1

Az ML-génszekvencia kiderítéséhez azonban az a kézenfekvő kiindulás nem alkalmas, hogy a Viscum album cDNS-bankokat és genomiális génbankokat átvizsgáljuk. A Viscum album poli-A+ RNS génbankokban különböző DNS-szondák használata ellenére sem lehetett ML-specifikus kiónokat azonosítani. Azzal a feltételezéssel, hogy az ML-génszekvencia intronokat nem tartalmaz, egy PCR-stratégiát valósítottunk meg. Minthogy mind az MLA-, mind az MLB-láncok N-terminális aminosavszekvenciái ismertek voltak [J. B. Dietrich et al., Anti-Cancer Drugs, 3, 507-511 (1992); H.-J. Gabius et al., Anti-Cancer Rés., 12, 669-676 (1992)], úgy tűnt, hogy az MLA-kódoló szakasz sokszorozása a degenerált, ismert peptidekből levezetett amplifikációs nukleotidok felhasználásával lehetséges lesz (1a. ábra). Míg az MLA-lánc N-terminális végéből, csekély degenerációs fokkal, használható oligonukleotid vezethető le (RMLA1; 1b. ábra) addig az MLB-lánc N-terminális végéből nem lehet megfelelő, elégséges specificitással rendelkező oligonukleotidokat szerkeszteni (RMLB1, RMLB2, RMLB3; 1b. ábra).

Ezért más stratégiákat kellett kifejlesztetnünk, amelyek lehetővé tették, hogy rokon proteinek proteinadatainak a bevonásával a még ismeretlen ML-szekvencia-szakaszokból amplifikációs oligonukleotidokat vezessünk le. Ilyen módon az I típusú és a II típusú riboszómainaktiváló proteinek aminosavszekvencia-analízise néhány magas szekvenciahomológiával rendelkező állandó szakaszt mutatott ki. Az 1c. ábra a ricin aktív centrumának példáján bemutatja az I és II típusú RIP magas rokonsági fokát. Feltételezték, hogy a MlSEAARF szekvenciamotívumon belül az E177 és R180 vesz részt az enzimmechanizmusban [Y. Kim et al., Biochemistry, 31, 3294-3296 (1992); J. M. Lord et al., FASEB J„ 8, 201-208 (1994)]. Ebből arra következtettünk, hogy legalább ez a két csoport jelen lehet az ML-szekvenciában. További, az egyes csoportok jelenlétére vonatkozó szerkezeti megfontolásokból, amikor különösen azokat vettük figyelembe, ahol a kodonhasználat alacsony degenerációs fokot mutatott, jött létre az RML2 amplifikációs oligonukleotid szerkezete. Ennek az oligonukleotidnak a szekvenciája az 1c. ábrán látható.

2. példa

ML-gén-specifikus DNS-fragmentumok előállítása

Friss Viscum album levelekből (gazdafa: Populus wilsonii) nagy molekulájú genomiális DNS-t izoláltunk Baur és munkatársai [A. Baur et al., Ins. Soc., 40, 325-335 (1993)] módszere szerint. Az ML-gén-specifikus DNS-fragmentumok PCR-rel való előállításához minden sokszorozási menethez 100 ng DNS-t használtunk. A sokszorozási 50 μΙ össztérfogatban hajtottuk végre, amely PCR-puffert (10 mM trisz.HCI, 1,5 mM magnézium-klorid, 50 mM kálium-klorid, 0,25 mM dNTP, pH 8,3), 78 pM RMLA1 prímért és 50 pM (2. menet), illetve 100 pM (1. menet) RMLA2-t tartalmazott. A PCR-t Taq-DNS-polimerázzal (Boehringer Mannheim) (1,5 E/menet) végeztük Biometra Thermocycler készülékben. A PCR-paraméterek ciklusonként a következők voltak: 1 perc denaturálás 90 °C-on, 1 perc anellálás 50 °C-on, 1 perc elongáció 72 °C-on, összesen 30 ciklusban. A sokszorozási termékeket 5%-os poliakrilamid-gélben elektroforetizáltuk és etidium-bromid-festéssel analizáltuk (2. ábra). A 2. menetben kapott specifikus, körülbelül 500 bp méretű sokszorozott terméket a gélből elúcióval izoláltuk, amelyet TA-vektorokban való klónozáshoz használtunk fel.

3. példa

Klónozási stratégia

A primer PCR-hez felhasznált amplifikációs oligonukleotidok levezetését az 1. példában (1a. ábra) mutattuk be, a Viscum album ML-gén primer génfragmentumának előállítását - a következőkben „a-val jelöljük - a 2. példában (2. ábra) ismertettük. A klónozott „a génfragmentum szekvenciájából kiindulva és abból a feltételezésből kiindulva, hogy az ML-génben nincsenek intronok, mármost olyan szekvenclaspecifikus 5’-oligonukleotidokat tudtunk levezetni, amelyekkel a „b”, „c, „d” és „e” fragmentumok amplifikációja lehetségessé vált. Míg a 3’-oligonukleotidot „c”-hez szintén az „a DNS-szekvenciából vezettük le, addig a „b, „d”, „e” és „g” génfragmentumok sokszorozásához szükséges degenerált 3’-primer szerkesztésére az I típusú („b”) és II típusú („d”, „e”, „g) RIP proteinek homológ szakaszainak analízise révén került sor. Itt újból a proteincsaládokon belüli szekvencia-összehasonlításokból következtettünk az egyes csoportok jelenlétére, amikor is elsősorban a kodonhasználat szerinti alacsony degenerációs fokkal rendelkező csoportokat vettük figyelembe. Főképpen az ismert ricin és abrin cDNS-szekvenciákat és a levezetett proteinszekvenciákat használtuk a mintegy 50 ML-specifikus oligonukleotidkombináció megszerkesztéséhez. A 3. ábrán csak azokat a génfragmentumokat mutatjuk, amelyek mint specifikus amplifikációs termékek, klónozhatok voltak, és amelyeket további analízisekhez fel lehetett használni. Más oligonukleotidkombinációkból kiindulva nem lehetett ML-specifikus amplifikációs termékeket előállítani. Az „f” génfragmentum (az MLA-láncot kódolja) és a „g” génfragmentum (az MLB-láncot kódolja) előállítását az 5. példában és a 6. példában írjuk le részletesen.

Az ML-génben lévő transzlatált és nem transzlatált szekvenciarészek 5'- és 3'-szakaszainak az analíziséhez 5’- és 3'-RACE-hez szükséges feltételeket [M. A. Frohman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 8998-9002 (1988)] hoztunk létre, amelyek a „b”, „i” és „j” fragmentumok keletkezéséhez vezettek. A „j fragmentum sokszorozása RACE-PCR-rel a teljes MLB-génfragmentumok előállításának egy alternatív megoldása. A RACE-reakciókat olyan cDNS alkalmazásával hajtottuk végre, amelyet fagyöngylevelekből (gazdafa: Populus wilsonii) izolált Viscum album össz-RNS-ből reverz transzkripció segítségével preparáltunk.

4. példa rMLA és rMLB DNS-szekvencia és transzlációs termékek

A pT7-MLA és pT7-MLB expressziós vektorok inszertumait standardeljárásokkal, „primer walking stratégia segítségével (a két szál teljesen átfedő szekven11

HU 225 738 Β1 ciáinak a vizsgálata), különböző ML-specifikus oligonukleotidok alkalmazásával szekvenáltuk (4a., 4b. ábra). Az aláhúzott szekvenciarészek a pT7 expressziós vektorokba való klónozáshoz szükséges restrikciós hasítási helyeket jelölik. Mindkét génfragmentumot az expressziós vektorok szerkesztési sémájának megfelelően - ahogyan az 5. és a 6. példában leírjuk - módosítottuk.

A 4c. ábra a megjelölt fragmentumokból levezetett teljes ML-génszekvenciát mutatja. A szekvencia magában foglalja az 5' és 3’ nem transzlatált részeket is, valamint az endopeptidet és a szignálpeptidet kódoló szakaszokat.

5. példa

A pT7-MLA expressziós vektor szerkesztése

A heterológ expresszióhoz a fagyöngy-lektin A-láncot kódoló szekvenciát komplex genomiális fagyöngy-DNS-ből kiindulva, specifikus PCR-rel állítottuk elő és terminálisán módosítottuk. A felhasznált oligonukleotidprimerek nem komplementer szakaszai révén transzlációszabályozó elemeket, valamint restrikciós endonukleáz felismerő szekvenciákat iktattunk be, és ezáltal a genomiális alakban jelen lévő prepro-fagyöngy-lektin-génből kiindulva lehetővé vált a fagyöngy-lektin A-lánc klónozása és elkülönített expressziója.

Az 5b. ábra az MLA-kódoló génframentumok PCR-rel való előállítását ábrázolja. Az MLA-kódoló génszekvencia sokszorozását 50 pl össztérfogatban, PCR-pufferben (10 mM trisz.HCI, 50 mM kálium-klorid, 0,25 mM az egyes dNTP-kből, pH 8,3) végeztük, amely 200 ng genomiális Viscum album DNS-t, 1,5 mM (1. menet), illetve 2,5 mM (2. menet) magnézium-kloridot, az RML16 és RML17 oligonukleotidprimerekből 40-40 pM-t tartalmazott. A PCR-t Taq-polimeráz (1,5 E menetenként; Boehringer Mannheim) használatával, összesen 30 ciklusban végeztük. Ciklusonként! paraméterek: 1 perc denaturálás 94 °C, 1 perc anellálás 52 °C, 1,5 perc elongáció 72 °C. Az amplifikációs termékeket 1 %-os agarózgélben elektroforetizáltuk és etidium-bromiddal való festéssel analizáltuk (5b. ábra). A termékeket a gélből eluáltuk és TA-vektorokban való klónozáshoz használtuk.

Az rMLA-t kódoló szekvencia 5’-részét, amely a tirozinMirozin¹⁷ aminosavcsoportoknak felel meg [J. B. Dietrich et al., Anti-Cancer Drugs, 3, 507-511 (1992); H.-J. Gabius et al., Anti-Cancer Rés., 12, 669-676 (1992)], egy transzlációs startkodon elébe kapcsolása mellett, szintetikus génfragmentum gyanánt állítottuk elő két oligonukleotid hibridizálása és klónozása révén. Itt a kodonkiválasztást illetően - ahogyan ezt az Escherichia coliban intenzíven kifejeződő génekre írták le [M. Gribskov et al., Nucl. Acids Rés., 12, 539-549 (1984)] - a génszekvencia optimalizálását értük el. A szintetikus rMLA-génfragmentum 3’-végén, valamint a PCR-rel előállított rMLA-génfragmentum 5'-végén a tirozin ¹⁷-kodon célzott kicserélése - TAC helyett TAT révén egy Sspl restrikciós hasítási helyet vezettünk be, amely a két rMLA-génfragmentum fúzióját tette lehetővé, a pML14-17 vektor előállítása mellett (5. ábra).

A keletkezett teljes rMLA-kódoló szekvenciát DNS-szekvenálással igazoltuk (4a. ábra). Az rMLA Escherichia coliban való expressziójához a génszekvenciát a pML14-17 vektorból izoláltuk és pT7-7 expressziós vektorba építettük be, ahol a T7-RNS polimeráz promoter és transzkripcióterminátor szabályozása alá helyeztük. A kapott pT7-MLA expressziós vektorral transzformáltuk a BL21 E. coli expressziós törzset.

6. példa

A pT7-MLB expressziós vektor szerkesztése

Heterológ expresszióhoz a fagyöngy-lektin B-láncot komplex genomiális Viscum album DNS-ből specifikus PCR segítségével sokszoroztuk, amikor is a használt oligonukleotidprimerek nem komplementer részén keresztül transzlációszabályozó elemeket, valamint restrikciós endonukleáz felismerő szekvenciákat vezettünk be.

A 6b. ábra a PCR-rel előállított, rMLB-t egészében kódoló teljes génfragmentumot mutatja. Az rMLB-t kódoló DNS-fragmentum sokszorozását a PCR-menetekben mindig 200 ng genomiális Viscum album DNS-ből kiindulva végeztük, 50 pM RML25 oligonukleotidprimerrel és 30 pM (1. menet), illetve 10 pM (2. menet) RML26 oligonukleotidprimerrel, 50 μΙ Össztérfogatú PCR-pufferben (10 mM trisz.HCI, 50 mM kálium-klorid, 1,5 mM magnézium-klorid, dNTP-k á 0,25 mM; pH 8,3). A PCR-t Taq-polimeráz (1,5 E/menet; Boehringer Mannheim) használatával végeztük 30 ciklusban. Ciklusonként! paraméterek: 1 perc denaturálás 94 °C, 1 perc anellálás 52 °C, 1,5 perc elongáció 72 °C. A PCR-termékeket 1%-os agarózgélben elektroforetizáltuk és etidium-bromiddal festve analizáltuk. Egy 0,8 kb méretű PCR-terméket kaptunk, amelyet gélelúcióval izoláltunk és TA-vektorokba klónoztuk. Az rLMB-kódoló génfragmentumot a pT7-7 expressziós vektorba építettük be, ahol transzkripciószabályozó elemek szabályozása alá helyeztük, és a kapott pT7-MLB expressziós vektorral a BL21 E. coli expressziós törzset transzformáltuk. A PCR-rel létrehozott, teljes rMLB-kódoló szekvencia integritását DNS-szekvenálással igazoltuk (4b. ábra).

7. példa

Az rMLA és rMLB expressziója, immunológiai kimutatása, visszagombolyítása és in vitro reasszociációja (I) rMLA expressziója E. coliban

A rekombináns fagyöngy-lektin A-lánc kifejezése céljából - terelővei ellátott - 2 literes rázólombikokban 1000 ml LB_Amp-táptalajt 5 ml E. coli BL21/pT7-MLA stacioner növekedésű LB_Amp-előtenyészettel oltottunk be, és a sejteket 37 °C-on, rázás mellett tenyésztettük. A növekedést zavarosságméréssel - 578 nm-en - követtük. A génexpresszió OD₅₇₈~0,9-1,0 értéknek megfelelő sejtsűrűség elérésekor 0,5 mM IPTG hozzáadásával indukáltuk. A sejteket az indukció után 2 óra múlva arattuk le úgy, hogy 20 percig 5000 ford./perc mellett 4 °C-on GS-3 rotorban (Sorvall) centrifugálva ülepítettük, a táptalajt dekantáltuk, amikor is 1 liter tenyészetből 3-4 g sejtmasszát (nedves tömeg) nyertünk.

HU 225 738 Β1

A sejtfeltárást French-Press (SLM Instruments) használatával végeztük. A sejtüledéket 20 ml feltárópufferben (50 mM trisz.HCI, 100 mM nátrium-klorid, mM EDTA, 5 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 8,0) reszuszpendáltuk és két French-Press menetben 1500 psi (=102 atm) mellett tártuk fel. Ezután 30 percig, 10 000 ford./perc mellett 4 °C-on SS-34 rotorban (Sorvad) való centrifugálással az oldhatatlan sejtalkotórészeket és a zárványtesteket leülepítettük, és a felülúszóban maradt oldható E. coli proteinektől, illetve oldható expressziós termékektől elválasztottuk.

Az expresszió analízisénél úgy jártunk el, hogy a sejtfeltárásnál kapott frakciók azonos térfogatait 12,5%-os SDS-poliakrilamid-gél elektroforézissel, Coomassie-brilliant-blue-festéssel, továbbá TA5 MLA-specifikus antiszérum használatával végzett Westem-blot-módszerrel vizsgáltuk (7a. ábra). A TA5 monoklonális antitestet [A. G. Tonevitsky et al., Immunoi. Lett., 44, 31-34 (1995)] a szerző bocsátotta rendelkezésünkre. Mint a többi itt használt antitest, ez is standardeljárással, a megfelelő immunogén felhasználásával (a TA5 esetében ez ML-1 vagy MLA) állítható elő. Az expresszió kimutatására az E. coli-feltárás oldható frakciójának (2, 4, 6, 8 nyomsáv), valamint oldhatatlan zárványtestfrakciójának (1, 3, 5, 7 nyomsáv) azonos térfogatait rMLA-tartalomra vizsgáltuk. Az expresszió lefolyásának bemutatására a génexpresszió Indukciója előtt (1+2 nyomsáv) és az indukció után 2 órával (3+4 nyomsáv), 4 órával (5+6 nyomsáv) és 6 órával (7+8 nyomsáv) vett mintákat használtuk. Az expresszió az indukció után már 1 óra múlva egy immunreaktív, 25 kD tömegű expressziós termék megjelenésével mutatkozott, amely expressziós maximumát az indukció után már óra múlva elérte. Az rMLA megoszlása a sejtfeltárással kapott oldható, illetve oldhatatlan frakciókban az indukció után 2 órával mintegy 50-50%-os, ugyanakkor egy hosszabb expressziós időtartam az oldhatatlan zárványtestek csökkenő képződéséhez vezet.

(II) rMLA izolálása oldhatatlan zárványtestekből

Az E. coli sejt feltárás üledékét az E. coli proteinek eltávolítása végett kétszer mostuk 20-20 ml STET-pufferrel [50 mM trisz.HCI, 8%(tömeg/térf) szacharóz, 50 mM EDTA, 1,5% (térf/térf) Triton-X100; pH 7,4] Babbitt és munkatársai szerint [P. C. Babbitt et al., Bio/Technology, 8, 945-949 (1990)]. A visszamaradt üledéket, amely a zárványtesteket tartalmazta, 20 ml denaturálópufferben (6 M guanidinium-klorid, 100 mM DTT, 50 mM trisz.HCI; pH 8,0) oldottuk úgy, hogy 16 órán át szobahőmérsékleten rázás mellett inkubáltuk.

Az rMLA renaturálása céljából a denaturálópufferben lévő proteinoldatot lassan, 90-szeres térfogatú visszagombolyító pufferbe (50 mM trisz.HCI, 2 mM DTT, 1 mM EDTA; pH 8,0) csepegtettük és 16 órán át szobahőmérsékleten keverés mellett inkubáltuk. Az újból kicsapódó proteineket centrifugálással (30 perc; 6000 ford./perc; 4 °C; Sorvall GS-3 rotor) választottuk el. Az rMLA-t tartalmazó felülúszót 20% (térf/térf) glicerinnel tároltuk és 4 °C-on tartottuk el.

(Ili) rMLA tisztítása immunaffinitás-kromatográfiával

Az rMLA (oldható expressziós termékrész, illetve visszagombolyított protein) immunaffinitás-kromatográfiával történő egylépéses tisztításához 260 pg fagyöngy-lektin elleni monoklonális antitestet, azaz anti-nMLA-lgG-t [TA5; A. G. Tonevitsky et al., Immunoi. Lett., 44, 31-34 (1995)] CL4B protein-A-Sepharose-on (Sigma, Deisenhofen) kovalens kötéssel immobilizáltunk Harlowe és Spur módszere szerint [E. Harlowe és

D. Spur közleménye az „Anti-bodies című kiadványban; Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1988)]. Az immunaffinitás-mátrixot az rMLA-mintával inkubáltuk, majd a mátrixot 10 oszlopágy-térfogatnyi 1-es mosópufferrel (1 M nátrium-klorid, 10 mM foszfát-puffer; pH 7,0) és 10 oszlopágy-térfogatnyi 2-es mosópufferrel (10 mM foszfát-puffer; pH 7,0) mostuk az aspecifikusan megkötött proteinek eltávolítására. Ezután a specifikusan megkötött rMLA-t elúciós pufferrel (0,1 M glicin; pH 2,5) eluáltuk. A pH-érték visszaállítása végett az eluátumot 1 M foszfátpufferes (pH 8,0) előtérben fogtuk fel.

(IV) rMLB expressziója E. coliban

A rekombináns fagyöngy-lektin B-lánc kifejezéséhez 1000 ml LB_Amp-táptalajt tartalmazó - terelővei ellátott - rázólombikokat 5 ml E. coli BL21/pT7-MLB stacionárius növekedésű LB_Amp-előtenyészettel oltottuk be, és a sejteket 37 °C-on, rázás mellett tenyésztettük. A növekedést zavarosságméréssel - 578 nm-en - követtük. A génexpressziót OD₅₇₈«0,9-1,0 értéknek megfelelő sejtsürüség elérésekor 0,5 mM IPTG hozzáadásával Indukáltuk. Indukció után 4 órával a sejteket úgy arattuk le, hogy centrifugálással (20 perc, 5000 ford./perc; 4 °C; Sorvall GS-3 rotor) ülepítettük, majd a táptalajt dekantáltuk.

A sejtfeltárást French-Press (SLM Instruments) segítségével végeztük. A sejtüledéket 20 ml B feltárópufferben (20 mM foszfátpuffer, 50 mM nátrium-klorid, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF; pH 7,2) reszuszpendáltuk és két French-Press menetben 1500 psi (=102 atm) mellett tártuk fel. Egy ezt követő centrifugálással (30 perc; 10 000 ford./perc; 4 °C; Sorvall SS-34 rotor) az oldhatatlan sejtalkotórészeket, valamint a zárványtesteket leülepítettük, és a felülúszóban maradt oldható

E. coli proteinektől, illetve oldható expressziós terméktől elválasztottuk.

Az expresszió kimutatására a sejtfeltárásnál kapott frakciók azonos térfogatait 12,5%-os SDS-poliakrilamid-gél elektroforézissel, Coomassie-brilliant-bluefestéssel, továbbá a TB33 MLB-specifikus antitest használatával végzett Western-blot-módszerrel vizsgáltuk (7b. ábra). A TB33 monoklonális antitestet a szerző [A. G. Tonevitsky et al., Immunoi. Lett., 44, 31-34 (1995)] bocsátotta rendelkezésünkre. Ezek az antitestek standardmódszerekkel állíthatók elő. A szakemberek a megfelelő antitesteket ML-1 vagy MLB immunogénekkel, standardeljárások segítségével, szintén elő tudják állítani. Az expresszió kimutatására az E. coli-feltárásnál kapott oldható frakció (2, 4, 6, 8 nyom13

HU 225 738 Β1 sáv), valamint az oldhatatlan zárványtestfrakció (1, 3, 5, 7 nyomsáv) azonos térfogatait rMLB-tartalomra vizsgáltuk. Az expresszió lefolyásának bemutatására a génexpresszió indukciója előtt (1+2 nyomsáv), majd az indukció után 2 órával (3+4 nyomsáv), 4 órával (5+6 nyomsáv) és 6 órával (7+8 nyomsáv) vett mintákat használtunk. A Western-blot-analízis már az indukció után 1 órával egy immunreaktiv, 31 kD tömegű, rMLB-nek megfelelő proteinsávot mutatott ki. Az analízis szerint az expresszió az indukció után 4 óra múlva érte el maximumát. Az indukció után 4 órával az rMLB mennyisége 50-50%-ban oszlik meg a sejtfeltárás oldható, illetve oldhatatlan frakciói között. Hosszabb inkubációs időtartamok eredményeképpen a kifejezett rMLB akkumulációja az oldhatatlan zárványtestfrakcióban csökken.

(V) rMLB izolálása oldhatatlan zárványtestaktől

Az E. coli sejt feltárás üledékét az E. coli proteinek eltávolítása végett kétszer mostuk 20-20 ml STET-pufferrel [50 mM trisz.HCI, 8% (tömeg/térf) szacharóz, 50 mM EDTA, 1,5% (térf/térf) Triton-X100; pH 7,4] Babbitt és munkatársai szerint [P. C. Babbitt et al., Bio/Technology, 8, 945-949 (1990)]. A visszamaradt üledéket, amely a zárványtesteket tartalmazta, 20 ml denaturálópufferben (6 M guanidinium-klorid, 100 mM DTT, 50 mM trisz.HCI; pH 8,0) oldottuk úgy, hogy 16 órán át szobahőmérsékleten rázás mellett inkubáltuk.

Az rMLB renaturálása céljából a denaturálópufferben lévő proteinoldatot lassan, 90-szeres térfogatú visszagombolyító pufferbe [20 mM foszfátpuffer, 50 mM kálium-klorid, 1 mM EDTA, 100 mM glükóz, 10% (térf/térf) glicerin, 10 mM β-laktóz, pH 5,5] csepegtettük és 16 órán át szobahőmérsékleten keverés mellett inkubáltuk. Az újból kicsapódó proteineket centrifugálással (30 perc; 6000 ford./perc; 4 °C; Sorvall GS-3 rotor) választottuk el az oldható, felgombolyodott rMLB-frakciótól.

(VI) rMLB izolálása affinitáskromatográfiával,

N-acetil-D-galaktóz-amin-agarózon

Az aktív, szénhidrátkötő rMLB izolálásához egy N-acetil-galaktóz-amin-agaróz-affinitásmátrixot (PIERCE, USA) 10 oszlopágy-térfogatnyi kromatografálópufferrel [50 mM foszfátpuffer, 300 mM nátrium-klorid, 1 mM EDTA, 10% (térf/térf) glicerin, 0,05% (térf/térf) Tween-20; pH 7,0] hoztunk egyensúlyba. A minta felvitele „batch” technikával történt úgy, hogy az affinitásmátrixot az rMLB-tartalmú mintaoldatban inkubáltuk legalább 2 órán át 4 °C-on. Az affinitásmátrixot ezután kromatografálópufferrel mostuk az aspecifikusan megkötött proteinek eltávolítására, majd a megkötött rMLB-t kromatografálópufferben (pH 4,0) 0,3 M N-acetil-galaktóz-aminnal való kompetitív kiszorítással eluáltuk.

(VII) A fagyöngy-lektin-láncok in vitro reasszociációja a holoprotein előállítása céljából

A rekombináns fagyöngy-lektin-holoproteint (rML) előállíthatjuk izolált, felgombolyodott fagyöngy-lektin Aés fagyöngy-lektin B-láncból kiindulva, vagy pedig denaturált fagyöngy-lektin A- és fagyöngy-lektin B-láncból kiindulva, amikor is együttes felgombolyítással történő renaturáció során végezzük a reasszociációt.

A felgombolyított egyedi láncok reasszociációjához az izolált fagyöngy-lektin B-láncot (nMLB vagy rMLB) az rMLA moláris feleslegével 50 mM nátrium-klorid-, mM EDTA-tartalmú 20 mM foszfátpufferben (pH 7,2) inkubáljuk 16-48 órán át 4 °C-on. A láncközi diszulfidhidak kialakítását 6 mM glutationból (redukáltoxidált arány 5:1) vagy 10 mM glutationból (redukáltoxidált arány 2:1) +1 μΜ protein-diszulfid-izomerázból (Boehringer Mannheim) álló redoxrendszer jelenlétében való inkubálással végezzük.

A denaturált egyedi láncokból kiindulva, egy együttes felgombolyítás keretében végzett reasszociációnál úgy járunk el, hogy az rMLA-láncot 6 M guanidinium-klorid-, 2 mM DTT- és 5 mM trisz.HCI- (pH 8,0) tartalmú elegyben oldjuk úgy, hogy koncentrációja mg/ml legyen. Az rMLB-láncot, a ciszteincsoportok teljes redukálása végett, 6 M guanidinium-klorid-, 100 mM DTT- és 50 mM trisz.HCI- (pH 8,0) tartalmú elegyben oldjuk, és 20 perces szobahőmérsékleten való inkubálás után PD-10 gélen (Pharmacia, Svédország) - 6 M guanidinium-kloridot és 50 mM trisz.HCI-ot (pH 8,0) tartalmazó oldattal - visszük át, majd átpufferoljuk és 200 pg/ml koncentrációra állítjuk be. A reasszociáció az rMLB-nek és a moláris feleslegben lévő rMLA-nak az együttes felgombolyítása keretében megy végbe úgy, hogy a guanidiniumoldatokat lassan 30-szorosára hígítjuk konjugálópufferrel [50 mM nátrium-foszfát-puffer, 50 mM kálium-klorid, 1 mM EDTA, 10% (térf/térf) glicerin, 100 mM glükóz, 20 mM laktóz, pH 8,0] és 16 órán át 4 °C-on inkubáljuk. A láncközti diszulfidhidak kialakítását 2 mM glutationnal (redukáltoxidált arány 1:1) előállított redoxrendszer jelenlétében való inkubálással végeztük.

A konjugációs elegyeket tároláshoz alkalmas pufferrel szemben [50 mM nátrium-foszfát-puffer, 300 mM nátrium-klorid, 1 mM EDTA, 10% (térf/térf) glicerin, 0,05% (térf/térf) Tween-20, pH 8,0] dializáljuk. A képződött heterodimerek kimutatását és azonosítását SDS-PAGE módszerrel, nem redukáló körülmények mellett végeztük, ezt követte a Western-blot-analízis fagyöngy-lektin A-lánc (TA5), illetve fagyöngy-lektin B-lánc (TB33) elleni monoklonális antitestek használatával. A képződött holoprotein izolálása, illetve a szabad rMLA, illetve rMLA-aggregátumok leválasztása Nacetil-galaktóz-amin-Sepharose-on vagy laktozil-agarózon való affinitáskromatográfiával történt, a (VI) fejezetben leírtak szerint.

8. példa

Az rMLA és rMLB izoelektromos homogenitása

1-2 pg rMLA-t, természetes MLA-t, természetes MLB-t vagy ML-holoproteint lEF-protein-standardokkal (BioRad, USA) együtt fókuszáltunk Sarvalyt PreNets lEF-géleken (pH: 3-10; 125*125 mm; 150 pm; Serva, Heidelberg). A proteineket „semi-dry elektroblotting segítségével nitro-cellulóz-membránokon (0,2 pm; Schleicher-Schüll, Dassel) immobilizáltuk. A proteinek

HU 225 738 Β1 kimutatására immunológiai festést végeztünk. Az rMLA és nMLA kimutatását monoklonális, MLA-specifikus antitesttel [TA5; A. G. Tonevitsky et al., Immunoi. Lett., 44, 31-34 (1995)] végeztük, az rMLB, nMLB és az ML-holoprotein kimutatását pedig monoklonális MLB-specifikus antitesttel [TB33; A. G. Tonevitsky et al., Immunoi. Lett., 44, 31-34 (1995)] végeztük. Az immunkomplexeket alkalikus foszfatázzal konjugált antiegér IgG-IgG (Sigma, Deisenhofen) használatával jeleztük és NBT- és BCIP-szubsztrátumokkal való reakció révén festettük meg (NBT=nitrokék-tetrazolium; BCIP=5-bróm-4-klór-3-indolíl-foszfát) (8. ábra).

Míg a nagy tisztaságú növényi fagyöngy-lektin A-lánc, valamint a nagy tisztaságú fagyöngy-lektin B-lánc is izoelektromosan inhomogén proteineknek mutatkoznak, az nMLA-nál 5,2; 5,4; 5,5 és 6,2, illetve az nMLB-nél 7,1 és 7,3 izoelektromos ponttal, addig a rekombináns rMLA-lánc 6,8-es izoelektromos ponttal és a rekombináns rMLB-lánc 5,1-es izoelektromos ponttal homogén proteinnek tekintendő (8. ábra). Ebből következik, hogy a természetes ML-holoproteinnek számos molekulaváltozata van (8. ábra, alul), míg a rekombináns fagyöngyproteinek egységes mobilitása az rML homogenitását bizonyltja, a növényi fagyöngy-lektinek mikroheterogenitásával szemben.

9. példa

Az rMLA enzimatikus, riboszómainaktiváló aktivitásának kimutatása

Az immunaffinitás-kromatográfiával tisztított visszagombolyított rMLA és oldható rMLA, valamint a természetes MLA-lánc (nMLA) proteinkoncentrációját Bradford szerint [Μ. M. Bradford, Analaytical Biochemistry, 72, 248-254 (1976)], BSA standard használatával határoztuk meg (BSA=bovine serum albumin=marhaszérum-albumin).

Az MLA rRNS-N-glikozidáz-enzim akivitásának kimutatására és mérésére a „TNT cupled reticulocyte system” (Promega, USA) felhasználásával nem radioaktív tesztrendszert vezettünk be. Vizsgálatonként a TNT-System egyforma mennyiségeit (20 μΙ) 15 percig 30 °C-on előinkubáltuk. A transzlációgátlás méréséhez a kontrollelegyhez 2 μΙ megfelelő puffért, illetve a tesztelegyekhez 2 μΙ növekvő MLA-hígításokat (koncentrációtartomány 350-0 pM) adtunk, majd minden reakcióelegyből 8 percenként 2 mintát vettünk, amelyeket folyékony nitrogénben fagyasztottunk le a reakció leállítására. A transzlációs aktivitás mértékéül a relatív luciferázmennyiséget (sqrt - cpm) szcintilláció mérőműszer segítségével, biolumineszcenciateszttel határoztuk meg. Minden reakcióelegynél a két időmintánál mért sqrt - cpm különbségét vettük a relatív transzlációs aktivitás mértékéül, ugyanakkor a RIP nélküli kontrollelegy aktivitásánál 0% inaktiválási aránnyal (IAR) számoltunk.

A relatív transzlációinaktiválási aránynak a használt rMLA-koncentrációkkal szembeni felvitele révén azt a proteinkoncentrációt határoztuk meg - nemlineáris regressziós számítással -, amely a transzlációs aktivitás 50%-os gátlásához vezet a kontroll-reakcióelegyhez viszonyítva. Ennek az IC50-értéknek a nagysága rendszerfüggő, és ez az oldható rMLA és visszagombolyított rMLA enzimaktivitásának kimutatását és mérését teszi lehetővé az nMLA-val összehasonlítva (9. ábra).

A 9. ábrán a rekombináns MLA-lánc enzimatikus riboszómainaktiváló aktivitásának kimutatása látható. Itt az oldható expressziós termékrésznek az izolálásával is (oldható rMLA) és a zárványtestekből izolált protein visszagombolyításával is enzimatikusan aktív expressziós terméket kapunk. Az oldható rMLA és a visszagombolyított rMLA 10,7±1,3 pM, illetve 15,6±6,6 pM IC50-értékeik tekintetében egyező aktivitást mutatnak. Eszerint alacsonyabb toxikus aktivitást fejtenek ki, mint a természetes MLA-lánc (IC50=1,1±0,7 pM).

10. példa

A fagyöngy-lektin B-lánc szénhidrátkötő aktivitása

A rekombináns fagyöngy-lektin B-lánc szénhidrátkötő aktivitásának a kimutatását, valamint a rekombináns és növényi fagyöngy-lektin B-lánc szénhidrátkötő aktivitásának az összehasonlítását „Enzyme-Linked-Lectin-Assay” (ELLA) segítségével végeztük, versengő szénhidrátok jelenlétében. Az nMLB- és rMLBláncok kötődése immobilizált aszialofetuinmátrix használata esetén főképpen galaktóz- és N-acetil-galaktóz-amin-csoportokon megy végbe, az immobilizált fetuinmátrix használata esetén főképpen szialinsavcsoportokon megy végbe.

Egy szénhidrátmátrix immobilizálásához 11 ml 1,1 mg aszialofetuint (Sigma, Deisenhofen) tartalmazó és 11 ml 1,1 mg fetuint tartalmazó oldatot készítettünk, amelyből 100 μΙ-eket mértünk MaxiSorp C96 mikrotitrálólemezek (NUNC, Wiesbaden) tartályaiba, és a lemezeket 16 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. A mikrotitrálólemezeket háromszor mostuk, tartályonként 150 μΙ PBS-T-vel [10 mM nátrium-foszfát-puffer, 130 mM nátrium-klorid, 0,1% (térf/térf) Tween-20; pH 7,2], majd az aspecifikus kötőhelyek blokkolására a mikrotitrálólemezeket tartályonként bemért 200 μΙ PBS-T-1% BSA-val [10 mM nátrium-foszfát-puffer, 130 mM nátrium-klorid, 0,1% (tömeg/térf) BSA; pH 7,2] 1 órán át 36 °C-on inkubáltuk, és ezután újból mostuk, mint leírtuk. A vizsgálathoz 100 μΙ B-lánc-tartalmú készítményeket használtunk, amelyeknek a koncentrációja 100-500 ng/ml, előnyösen 400 ng/ml volt. A vizsgált koncentrációt próbahígftásokkal, 0,05% BSA PBS-sel [10 mM nátrium-foszfát-puffer, 130 mM nátrium-klorid, 0,05% (tömeg/térf) BSA; pH 7,2] állítottuk be. Az egyes vizsgált koncentrációkból és a kontroliokból 2-3 párhuzamot készítettünk. A vakértékek meghatározása PBS-0,05% BSA-val vagy a mindenkori preparatív pufferrel történt. A kötőspecificitás meghatározásánál a minták inkubálását szabad, versengésre képes cukor jelenlétében végeztük. Az rMLB, nMLB vagy ML-holoprotein aszialofetuin-, Illetve fetuinmátrixhoz való kötődésből való kiszorításához galaktózt (előnyösen 0-280 nM koncentrációtartományban), N-acetil-galaktóz-amint (0-280 mM koncentrációtartományban), laktózt (0-140 mM koncentrációtartomány) vagy

HU 225 738 Β1 szialinsavat (0-140 mM koncentrációtartományban) használtunk.

A lemezeket fedés után 2 órán át 36 °C-on inkubáltuk, ezután pedig, mint leírtuk, mostuk. A fedett lemezekhez tartályonként 100 μΙ kecskében termelt anti-fagyöngy-lektin-szérumot {a szérumpoolt PBS-T-0,1% BSA-Tx-ben [10 mM nátrium-foszfát-puffer, 130 mM nátrium-klorid, 0,1% (térf/térf) Tween-20, 0,1% (tömeg/térf) BSA, 1% (térf/térf) Triton X-100; pH 7,2] 1:19 800 arányban hígítottuk} adtunk, a lemezeket 2 órán át 36 °C-on inkubáltuk, ezután pedig, mint leírtuk, mostuk. Az immunkomplexek kimutatására minden fedett tartályhoz 100 μΙ torma-peroxidázzal konjugált antikecske IgG-lgG-t (Sigma, Deisenhofen) adtunk PBS-1% BSA-oldattal [10 mM nátrium-foszfát-puffer, 130 mM nátrium-klorid, 1% (tömeg/térf) BSA; pH 7,2] 1:3500-as hígításban, majd a lemezeket 1 órán át 36 °C-on inkubáltuk. A tartályokat ezután hatszor mostuk tartályonként 150 μΙ PBS-T-vel. A kifejlesztéshez tartályonként 100 μΙ szubsztrátoldatot [1 darab o-fenilén-diamin-tabletta (Sigma, Deisenhofen) 25 ml 65 mM citromsavban oldva+10 μΙ 30%-os hidrogén-peroxid] mértünk be, és a lemezeket 20 percig szoba-hőmérsékletű sötét helyen inkubáltuk. A reakciót tartályonként 100 μΙ 1 M kénsav hozzáadásával állítottuk le. A kiértékelést abszorpcióméréssel végeztük, 450 nm-en, 690 nm referencia-hullámhossz mellett. Az IC50-értékek kiszámítása 4-paraméter-fit segítségével a mérési adatok ábrázolásával történt.

A 10. ábrán bemutatjuk az rMLB és nMLB ELLA rendszerben megfigyelt kiszorítását az immobilizált aszialofetuinligandumokból növekvő mennyiségű galaktózzal (10a. ábra), β-laktózzal (10b. ábra) vagy N-acetil-galaktóz-aminnal (10c. ábra), továbbá immobilizált fetuinligandumokból való kiszorítását növekvő mennyiségű szilainsavval (10d. ábra). Az nMLB és rMLB kötési jellemzőit az IC50-értéknek megfelelő félmaximális kiszorítás írja le.

Míg a növényi nMLB-lánc szénhidrátkötése elsősorban galaktózzal (IC50=4,5 mM) és β-laktózzal (IC50=4,9 mM) versenyeztethető, addig a rekombináns rMLB-lánc meglepő módon jelentősen más szénhidrát-specificitást mutat. Az nMLB-vel ellentétben az rMLB szénhidrátkötő aktivitása nem versenyeztethető galaktózzal (IC50 meghatározhatatlan), és csak csekély mértékben versenyképes β-laktózzal (IC50 70 mM). A galaktózzal és β-laktózzal szembeni drasztikusan alacsony affinitás mellett azonban az rMLB-lánc ugyanakkor jelentős specificitást mutat N-acetil-galaktóz-aminnal szemben (IC50=109 mM). Egy további nMLB-re leírt aktivitást, a szialinsavligandumokhoz való kötődést, a rekombináns MLB-láncnál is ki lehetett mutatni (10c. ábra). Itt a növényi nMLB-lánc (IC50=49,8 mM) és a rekombináns rMLB-lánc (IC50=47,1 mM) egyező kötőaffinitást mutatnak.

A növényi, elsősorban galaktóz^-laktóz specifikus nMLB-lánchoz viszonyítva a rekombináns technikával előállított rMLB-lánc jelentősen különböző szénhidrát-specificitása az N-acetil-galaktóz-amin/szialinsav kötés felé tolódott el.

11. példa

In vitro reasszociált rML-holoproteinek humán limfoid leukémiasejtekre gyakorolt citotoxicitásának meghatározása

A fagyöngy-lektin-holoprotein integritását a MOLT-4 (European Collection of Animál Cell Cultures No. 85011413) humán mononukleáris (limfoid) leukémia-sejtvonallal szembeni citotoxicitásának kvantitatív meghatározásával mutattuk ki.

A MOLT-4 sejteket szérummentes MDC-1 táptalajban (PAN SYSTEMS, Aidenbach) tenyésztettük, és a vizsgálat céljára a beoltáshoz szükséges sejtsűrűséget 1,6*10⁵ MOLT-4 sejt/ml-re - >98% élősejtszám mellett - állítottuk be. A citotoxicitás meghatározásához egy 96 tartályos mikrotitrálólemez tartályait 90 μΙ 18 000 sejt/tartály - MOLT-4 sejtszuszpenzióval oltottuk be, majd tartályonként 10 μΙ mintaoldatot mértünk be. A vizsgálathoz fagyöngy-lektin-holoprotein-készítményeket [220793 számú sarzsok (Madaus)j használtunk, és a BRAIN 12/94 készítményt, amelyet fagyöngylevelekből vagy fagyöngyteából standardeljárással - Lactosyl-Sepharose-on [H. Franz et al., Acta bioi. med. germ., 36, 113-117 (1977)] - izoláltak, valamint in vitro reasszociált rML-holoproteint 1-100 pg/ml koncentrációtartományban (1,6 fM-tól 1,66 pM-ig). A sorozathígításokat MDC-1 sejttenyésztő táptalajjal végeztük. A minták hígításaiból és a kontroliból 6 párhuzamost készítettünk.

A sejteket 72 órán át 37 °C-on, 5% szén-dioxidot tartalmazó termosztátban inkubáltuk. A citotoxikus hatások mérése élősejt-meghatározással történt, WST-1 módszer [P. A. Scudiero et al., Cancer Rés., 48, 4827-4823 (1988)] szerint, oldható formazánszínezék segítségével, a megfelelő WST-1 Cell Proliferation Reagent (Boehringer Mannheim) használatával.

A rekombináns holoprotein, valamint az rMLB/nMLA kiméra holoprotein MOLT-4-citotoxicitás tekintetében a természetes proteinével egyező aktivitást mutattak, 10-30 pg/ml IC50-értékekkel. Ezzel szemben az rMLB-nek a vizsgált koncentrációtartományban (rMLB 1 ng/ml-ig) semmiféle citotoxikus aktivitása nem volt.

12. példa

Rekombináns fagyöngy-lektin (rML) által indukált apoptózis U937 humán monocíta sejtvonalon A rekombináns fagyöngy-lektin (rMLA/rMLB) által indukált apoptotikus folyamatokat (programozott sejthalált) a sejtmag fluoreszcens színezékkel - DAPI-val - való festésével [M. Hotz et al., Cancer Rés., 52, 1530-1535 (1992)] mutattuk ki. (DAPI=4,6-diamino-2-fenil-indol.) A mag morfológiájának apoptotikus elváltozásai mikroszkóp alatt ilyen módon tehetők láthatóvá, és mintánként 500-1000 sejt leszámolása révén mérhetők. A szérummentes táptalaj alkalmazása lényeges a vizsgálat érzékenysége szempontjából, mivel a szérumproteinek jelenléte a lektin rendelkezésre álló mennyiségét drasztikusan csökkenti [10% FCS mellett körülbelül 40-szeresével; G. Ribereau-Gayon et al., Phytotherapy Rés., 9, 336-339 (1995)]. A 24 órás inkubációs idő a MOLT-assay-vel közvetlen korrelációt

HU 225 738 Β1 csak feltételesen enged meg, mivel az élősejt-assayben a citotoxikus hatás csak 72 óra múlva lesz teljesen határozott, az apoptózis azonban egy korábbi hatás. Túl hosszú inkubációs idő mellett az apoptózist szekunder nekrózis fedi el.

A 12. ábra bemutatja, hogy rekombináns ML-holoproteinnel való kezelés után az apoptotikus U937 sejtek aránya jelentősen megnő. Az apoptotikus sejtek száma 70 pg/ml mellett, 24 óra múlva - két különböző szérummentes táptalajon tenyésztve - háromszorosára nő. A rekombináns fagyöngy-lektin tehát ugyanúgy, mint a természetes protein [O. Janssen et al., Arzneim. forsch., 43, 1221-1227 (1993)], programozott sejthalál indukálására képes.

13. példa

A rekombináns fagyöngy-lektin immunstimuláló hatása PBMC-modellben

A TNF-α (monociták, makrofágok) és az IFN-γ (T-helper sejtek) olyan citokinek, amelyek központi mediátor szerepet töltenek be az emberi immunrendszer komplex hálózatán belül.

Egészséges véradóktól levett emberi mononukleáris sejteket (PBMC; ez a sejtcsoport monocitákat és limfocitákat foglal magában) FICOLL-PAQUE sűrűséggradiens-centrifugálással - az előállító cég (Pharmacia, Svédország) előírásai szerint - izoláltunk.

TNF-a-felszabadulás indukálása végett a sejteket (4*10⁶ mononukleáris sejt/ml) 10% (térf/tórf) fetális borjúszérumot, 100 E/ml penicillint és 100 pg/ml sztreptomicint tartalmazó RPMI 1640 táptalajban inkubáltuk, először 18 órán át csak a rekombináns fagyöngy-lektin-proteinekkel, majd további 24 órán át 1 pg/ml Salmonella abortus equi eredetű lipopoliszachariddal, mint kostimuláló faktorral. Az inkubálást 37 °C-on, 5% szén-dioxidot és >95% relatív nedvességet tartalmazó termosztátban, U alakú tartályokkal ellátott mikrotiter-sejttenyésztő lemezeken végeztük. Ezután a sejtmentes felülúszókban ELISA módszerrel (Genzyme Diagnostics, Rüsselsheim) azonnal mértük a TNF-a-koncentrációt.

Az IFN-y-felszabadulás indukcióját úgy mértük, hogy a fent említett táptalajban először 1 órán át csak a rekombináns fagyöngy-lektinekkel inkubáltuk a sejteket, ezután további 65 órán át 0,5 pg/ml fitohemagglutinin-L, mint kostimuláló faktor hozzáadásával úgy, ahogyan fent leírtuk. Ezután a sejtmentes felülúszókban ELISA módszerrel (ENDOGÉN Inc., Cambridge, USA) azonnal mértük az IFN-y-koncentrációt.

14. példa

A rekombináns fagyöngy-lektin immunstimuláló hatása skin²-ZK1200-modellben A bioassay-ként kifejlesztett skin²-modell egy háromdimenziós fibroblaszttartalmú dermisből és egy el nem szarusodott keratinocitákból származó strukturált epidermisből áll, amely saját, természetben kiválasztott mátrixában helyezkedik el [P. W. Joller et al., Arzneim. forsch./Drug Rés., 46, 649-653 (1996)]. A bőrszövetdarabkákat [11*11 mm²; emberi primer sejtekből előállította az Advenced Tissue Sciences Inc., (ATS), La Jolla, USA] nejlonszövet rácson, agarózban forgalmazzák, amelyeket a szállítás után rögtön A-speciál táptalajba (ATS, La Jolla, USA) helyeztünk.

Mind az IL-1 a, mind az IL-6 az emberi immunrendszer jelentős stimulálócitokinjei.

Az IL-1 a, illetve IL-6 felszabadulásának indukálására a skin²-szövetdarabkákat a mindenkori vizsgálandó anyaggal, 2 ml B-speciál táptalajban (ATS, La Jolla, USA) inkubáljuk 12 tartályos sejttenyésztő lemezeken (Corning Glass Works, Corning, USA). Az inkubálást 24 órán át, 37 °C-on, 5% szén-dioxid-tartalmú levegőben, >95% relatív nedvességtartalom mellett végezzük. Ezután a sejtmentes felülúszókban ELISA módszerrel határozzuk meg az IL-1a (Quantikine humán IL-1a Assay, R and D Systems Inc., Minneapolis, USA), illetve az IL-6 mindenkori koncentrációját (h-interleukin 6 ELISA, Boehringer Mannheim GmbH, Németország).

A skin²-modellben kimutattuk, hogy 0,25-8 ng rML/ml dózisfüggően indukálta az IL-1a felszabadulását, és 0,5-8 ng rML/ml dózisfüggően indukálta az IL-6 felszabadulását (14. ábra). Meglepő módon, eddigi ismereteinkkel szemben, mely szerint az immunstimuláló aktivitás főként a B-lánc lektinaktivitására vezethető vissza [T. Hajtó et al., Cancer Rés., 52, 3322-3326 (1990)], a rekombináns rMLB-lánc egyedül nem tudta indukálni a fent említett felszabadulásokat.

15. példa

Immunkompetens sejtek aktiválása rekombináns fagyöngy-lektin B-lánccal (rMLB)

Az immunkompetens sejtek aktiválását a CD69 sejtfelületi protein indukciójának segítségével vizsgáltuk. A CD69 egyike az először megjelenő sejtfelületi antigéneknek a T-sejtek, B-sejtek és különösen a természetes ölősejtek (natural killer sejtek=NK-sejtek) aktiválódása után. Ez utóbbiaknak az a képessége, hogy felismerik és lizálják a daganatos sejteket, központi jelentőségű a tumor elleni természetes védekezésben. A CD69 a fent említett immunkompetens sejtpopulációnál aktivációs markerként jelenik meg, ugyanis ez a sejtfelületi protein nyugvó limfocitákon nem fejeződik ki. Ezenkívül kimutatták, hogy az indukálható CD69 felületi protein, funkciója szerint, elősegíti az NK-sejtek és TcR γ/δ T-sejtek citolitikus aktivitását [A. Moretta et al., J. Exp. Med., 172, 701-707(1991)].

Humán mononukleáris sejteken a felületi marker folyadék citometriával (FACS) való kimutatása végett PBMC-ket izoláltunk Hypaque (Sigma) sűrűséggradiens segítségével, a 13. példában leírtakhoz hasonlóan. A sejteket 5% FCS-t tartalmazó RPM11640 táptalajban vittük fel és mikrotitrálólemezekre oltottuk le, körülbelül 250 000 sejt/tartály mennyiségben. A lemezeket ezután 4 óra hosszat inkubáltuk a vizsgálandó rMLB 1, 10, 30 és 100 ng-jával. Ezután fluoreszcenciával jelzett anti-CD69 monoklonális antitesttel 20 percig inkubáltuk jégfürdőben, majd mosás következett 5% FCS-tartalmú Hank-oldattal. A leülepedett jelzett sejteket 200 pl „Sheat Fluid oldatban vettük fel és FACS17

HU 225 738 Β1 can készüléken (Becton Dickinson) mértük. A közepes fluoreszcenciát ábrázoltuk, amely a sejtenkénti CD69 felületi marker számnak felel meg, valamint az összsejt-populációban a CD69-pozit(v sejtek részarányának.

Megállapítottuk, hogy 1-100 ng/ml koncentrációtartományban a mononukleáris sejtek aktiválódnak, hogy a sejtek felületén CD69 jelenik meg, és meghatároztuk a CD69-pozitív sejtek részarányát. Itt dózisfüggőségre utaló, harang alakú görbét kaptunk. Citotoxikus hatást az Itt vizsgált PBMC-ken még a legmagasabb, 100 ng/ml-es koncentráció esetén sem tudtunk kimutatni.

Claims (25)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált nukleinsavmolekula, amely (a) a 4c. ábrán bemutatott nukleotidszekvenciával rendelkezik, és olyan preproproteint kódol, amely érés után a fagyöngy-lektin-dimer biológiai funkciójával rendelkezik;

   (b) az (a) szerinti preproprotein egy fragmentumát kódolja, amely fragmentum a fagyöngy-lektin-dimer egy biológiailag aktív alkotórésze;

   (c) az (a) vagy (b) szerinti nukleinsavmolekulától csak a genetikai kód degeneráltsága által különbözik;

   (d) az (a) vagy (b) szerinti nukleinsavmolekulával szigorú feltételek mellett hibridizál, és az (a) vagy (b) pontban megadott biológiai funkcióval, illetve aktivitással rendelkező polipeptidet kódolja.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amelynél az említett fragmentum a rekombináns fagyöngy-lektin A-lánca, amelyet a 4a. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia kódol.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, amelynél az említett fragmentum a rekombináns fagyöngy-lektin B-lánca, amelyet a 4b. ábrán bemutatott nukleotidszekvencia kódol.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula, amely egy DNS-molekula.
5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula, amely egy RNS-molekula.
6. 6. Nukleinsavmolekula, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula komplementere.
7. 7. Vektor, amely legalább egy, az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaz.
8. 8. A 7. igénypont szerinti vektor, amely egy 2. vagy 4. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát, valamint egy

   3. vagy 4. igénypont szerinti nukleinsavmolekulát is tartalmaz.
9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti vektor, amely egy expressziós vektor.
10. 10. Gazda, amely legalább egy, a 7-9. igénypontok bármelyike szerinti vektort tartalmaz, ahol az említett gazda nem humán és nem transzgén állat.
11. 11. A 10. igénypont szerinti gazda, amely egy növényi sejt vagy egy transzgenikus növény.
12. 12. A 10. igénypont szerinti gazda, amely egy emlőssejt, baktérium, gombasejt, élesztősejt vagy rovarsejt.
13. 13. A 12. igénypont szerinti gazda, ahol a baktérium E. coli, a gombasejt egy Aspergillus sejt és a rovarsejt egy Spodoptera sejt, előnyösen egy Stodoptera frugiperda sejt.
14. 14. Polipeptid, amelyet egy, az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula vagy a 7-9. igénypontok bármelyike szerinti vektor kódol, és egy 12. vagy 13. igénypont szerint gazda által termel.
15. 15. A 14. igénypont szerinti polipeptid, amely legalább egy kémiai vagy enzimatikus módosítással rendelkezik, ahol az enzimatikus módosítás nem a Viscum albumban előforduló glikozilációt jelenti.
16. 16. A 14. vagy 15. igénypont szerinti polipeptid, amely egy fúziós protein.
17. 17. Fagyöngy-lektin biológiai funkciójával rendelkező polipeptiddimer, amelyben az egyik monomert a 2.,

    4. vagy 5. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, a második monomert a 3-5. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekula kódolja, és a polipeptiddimert egy 12. vagy 13. igénypont szerinti gazda termeli.
18. 18. A 17. igénypont szerinti polipeptiddimer, amelyben a monomerek legalább egyike egy 15. vagy 16. igénypont szerinti polipeptid.
19. 19. Antitest vagy fragmentuma, amely specifikusan kötődik egy, a 14-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidhez és/vagy egy, a 17. vagy 18. igénypont szerinti polipeptiddimerhez.
20. 20. Eljárás egy, a 14-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid vagy a 17. vagy 18. igénypont szerinti polipeptiddimer előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 12. vagy 13. igénypont szerinti gazdát megfelelő körülmények között tenyésztünk, és a kapott polipeptidet vagy polipeptiddimert izoláljuk.
21. 21. Immuntoxin, amely magában foglal legalább egy 14-16. igénypontok szerinti polipeptidet vagy egy 17. vagy 18. igénypont szerinti polipeptiddimert.
22. 22. Gyógyszerkészítmény, amely egy 14-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és/vagy egy 17. vagy 18. igénypont szerinti polipeptiddimert és/vagy egy 21. igénypont szerinti immuntoxint tartalmaz adott esetben gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval együtt.
23. 23. Primer vagy primerpár, amely az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulával, illetve ennek komplementer szálával szigorú körülmények között specifikusan hibridizál.
24. 24. Diagnosztikai készítmény, amely legalább (a) egy 1-5. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulát, (b) egy 23. igénypont szerinti prímért vagy primerpárt, és/vagy (c) egy 14-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és/vagy egy 17. vagy 18. igénypont szerinti polipeptiddimert tartalmaz.
25. 25. Növényvédő szer, amely legalább egy 14-16. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet és/vagy egy 17. vagy 18. igénypont szerinti polipeptiddimert tartalmaz.