JP3042543B2

JP3042543B2 - 褐藻植物より得られた硫酸化ポリサッカライド類、抗凝固剤、抗補体剤及びその製法

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Publication number: JP3042543B2
Application number: JP2508929A
Authority: JP
Inventors: コリエ，シルヴァ; ブレトゥディエ，ジャクリーヌ; デュラン，パトリック; フシェ，アンヌ―マリ; ジョゼホンビッツ，ジャクリーヌ; クロアレ，ベルナール; ヴィダ，カトゥリーヌ
Original assignee: フレメール−アンスティティフランセドゥルシェルシュプールレックスプロアタシオンドラメール
Priority date: 1989-06-14
Filing date: 1990-06-13
Publication date: 2000-05-15
Anticipated expiration: 2015-05-15
Also published as: EP0676207A2; DE69033626D1; FR2648463A1; DE69033626T2; ATE131176T1; EP0676207A3; DE69023957T2; AU5841090A; PT94359A; IE902153A1; EP0676207B1; WO1990015823A1; EP0403377B1; FR2648463B1; DD296937A5; EP0403377A1; DE69023957D1; JPH04506089A; IE902153L; CN1051564A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は、褐藻植物（Phaeophyceae:brown algae）
から抽出したフカン（fucan）の調節溶解でえた新規な
硫酸化ポリサッカライド類、その製法ならびに、新規な
抗凝固剤、抗血栓剤と新規な抗補体剤に関する。

抗凝固効果は血漿中での活性トロンビン生成の阻害と
して定義され、一方抗血栓効果は、血栓の発生および／
またはその生長の阻害と定義される。

現在使用されている殆どの抗凝固剤はヘパリンで、ヘ
パリンは、グルコサミン単位とグルクロン酸単位の１
−〉４結合からなる硫酸化ポリサッカライドで、硫酸基
は、グルコサミンのアミン官能、および／またはグルコ
サミンとウロン酸のアルコール官能に存在する。ヘパリ
ンは、２つの血漿阻害剤の抗凝固作用を上昇して凝固に
作用する。第１のものは抗トロンビンIII（AT III）で
トロンビン（因子II aとしても知られている）と活性化
因子Χ（または因子Χ a）の双方に作用し、ヘパリン補
因子２（HC III）と称せられる第２のものは、因子II a
に作用し、因子Χ aには作用しない。

その上、血栓の防止に関して、脱高分子化で得られた
低分子量のヘパリンの使用が増大しつつある。これの全
凝固に関する作用は弱い。例えば、低分子量のヘパリン
は、全体的に、体内経路による血漿凝固、すなわち因子
VIIと血小板因子を除く全血漿因子を検査するセファリ
ンカオリン時間（CKT）で生体外で効果がない。反対
に、生体内で、実験的血栓の防止をする。そして、この
ものは因子Χ aに関してAT IIIの阻害活性を上昇させ、
因子Χ aに関する活性は弱いことが判明している。しか
し、血栓防止の作用は、低残渣の抗II a活性によって本
質的に奏されるとみるのがより適切とみられる。

ヘパリンの抗補体性も知られている。補体系は免疫防
禦機構で重要な役割をする一組の血漿あるいは膜蛋白で
ある。補体系は、生体の防禦（感染剤の分解、免疫複合
物の浄化）と炎症タイプの病状工程に関与している。血
中では、赤血球の溶血又は溶解に付加的に感応してい
る。

補体蛋白は、血漿中で不活性化され、２つのシーケン
ス、すなわち別の経路と古典的経路で特殊な順序で活性
化される。別経路の活性化は、ターゲット表面（細菌、
ウィルス、寄生物、腫瘍細胞）の認識について非特異的
な機構に基づいている。古典的経路での活性化は、抗体
によるターゲットの特異的認識に基づいている。別経路
では、初期は、C3（C3b）の分裂産物の固定とC3aの放出
（炎症反応に感応のアナフィラトキシンについて）でト
リガーされる。C3bは、表面でヒドロキシ基とアミノ基
に共有結合する。一旦結合すると、因子Ｂに結合でき、
因子Ｂが因子Ｄで活性化された後、別のC3コンバーター
ゼを形成する。古典経路では、初期は、主に抗原−抗体
反応のレベルで行われるC1の活性化でトリガーされる。
C1の活性化後に、成分C4とC2が順次活性化され、表面
で、酵素複合体、古典的C3コンバーターゼを形成する。
C4の活性化は、C4bとC4aの放出を伴い、C3の活性化に類
似である。C4bはC3bと同じタイプの化学基に共有結合で
固定化する。

ヘパリンは、C3コンバーターゼとの相互作用で、補体
活性化の阻害として作用する。ヘパリンのこの抗補体活
性はヘパリンの抗血栓（sic）活性と全体として無関係
であり、この活性は、アミン感応の置換基がスルファー
ト基でないときで観察されない抗凝固活性に反し、スル
ファート基又はアセチル基のアミン官能の存在と関連し
ていることが分っている。ウロン酸のアルコール官能の
１つにスルファート基の存在することが抗補体活性に重
要な役割をするとみられている〔KAZATCHINEら,J.Clin.
Invest.,67,（1981）〕。

他のポリサッカライドの抗凝固性および／または抗血
栓性も知られている。例えば、デルマタンスルファート
は、抗凝固活性はヘパリンより弱いが、抗血栓活性はヘ
パリンと同等である。このデルマタンスルファートは、
トロンビンを阻害し、補因子HC IIの阻止効果を上昇さ
せる。反対に、補因子AT III経由で作用せず因子Χ aに
作用しない。

血栓防止に繁用されているペントサンポリスルファー
トも、HC IIよりトロンビンの阻害を触媒して作用す
る。

一方、これらのポリサッカライドはヘパリンに比較し
うる抗補体活性を奏しない。KAZATCHINEらは上記の刊行
物で、デルマタンスルンファートは、ガラクトサミンの
アミン官能がアセチル化されているが、ウロン酸のアル
コール官能は硫酸化されていないものであり、その抗補
体活性がヘパリンより14倍少ないことを報告している。

フカンは、カッソウ類の葉状体から抽出された、高い
平均分子量（100〜800KDa）の硫酸化ポリサッカライド
である。この化合物は、α−1,2−ｌ−フコース４−
スルファートのポリマーで、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラ
クトース及びウロン酸を含むことがある。フカンのウロ
ン酸は、ヘパリンとは異なり、硫酸化されていない。そ
の上、フカンはアミン糖を含まず、ヘパリン及びデルマ
タンスルファートと異なる。

粗製のフカンで行なった研究により、１つ及び同じ粗
抽出物から、各種のサブクラスのフカン、すなわち平均
分子量と物質化学的の性質を異にするものを分離するこ
とが可能になった。

この研究は、フカン分子のポリサッカライド骨格を分
解しない、非凝集性分劃法（分劃沈澱、ゲル濾過など）
を使用するもので、実際に天然のサブクラスのフカンの
存在が判明した。

粗製フカンの抗凝固性は1957年にSPRINGERらにより例
証され、以来多数の著者によって確認されている〔BERN
ARDI ＆ SPRINGER,The Journal of Biological Chemist
ry,237.1,（1962）MORIら,Marine Algae in Pharmaceut
ical Science,2,1982〕。

本発明者による粗製フカンの凝固に関する作用機序の
研究では、粗製フカンはセファリンカオリン時間（CK
T）及び特にトロンビン時間（TT）（これはフィブリノ
ーゲンのトロンビン影響下でのフィブリンクロットへの
変換、凝固の最終段階を調べるもの）を延長することが
分った。この研究は、粗製フカンが殆ど独占的にトロン
ビン（因子II a）に作用し、かつこれは主にHC II阻害
剤の効果（ヘパリンと同じ濃度で）及び抗トロンビンII
Iの効果（ヘパリンより30倍大きい濃度で）を上昇する
ものであることが分った。

同じ観察が、粗製フカンの性質を研究した他の著者ら
〔CHURCHら,The Journal of Biological Chemistry;26
4.6（1989）〕によってもなされている。これらの著者
は、粗製フカンがトロンビンのAT IIIによる阻害を弱く
触媒し、トロンビンのHC IIによる阻害を強く触媒する
ことを提案（sic）した。

従って、フカンは、公知の抗凝固剤とは異なる作用機
序のため新しい凝固剤の新しいカテゴリーを構成する。
事実、フカンはHC IIの阻害活性をトロンビンに関してA
T IIIの阻害活性を上げるもので、HC IIの阻害活性のみ
を独占的に上げるデルマタンスルファートと異なる。一
方、フカンはデルマタンスルファートと同様で、かつヘ
パリンとは異なり、因子Χ aの阻害作用はない。すなわ
ちフカンは、トロンビンの独占的阻害剤である。本発明
者は、また、フカンは、ヘパリンとは異なりアミノ糖又
は硫酸化ウロン酸を含有しないが、意外にも補体の活性
化を阻止する性質を有することを認めた。

補体活性化阻害剤は、移植拒絶現象の防止にある役割
を果すことができる。すなわち、腎臓透析を行っている
人や心筋梗塞から回復中の人の処置への使用が提案され
ている。体外循環装置での補体の活性化を阻止する抗補
体活性がもたらされる利点もある。

古くからフカンの抗凝固性が知られているが、粗フカ
ンは治療に用いられておらず、これは残留蛋白が比較的
高いため免疫現象を誘因するリスクがあり、一方分子量
が高いため溶解性が悪く、高濃度での使用がかなり制限
されるからである。

ここに、フカンの抗凝固作用、特に、粗フカンの分劃
で得られた各種のフカンの細分についての抗凝固活性を
今日まで行った研究により、抗凝固活性が、フカン分子
の大きなサイズに正確に関連することが示唆された。あ
るチームは、抗凝固活性が高分子量に関連しているとの
結論に達した〔USUIら,Agr.Biol,Chem.,44〜８（198
0）〕。

他の研究による、20KDaの低減が存在し、それ以下は
みるべき抗凝固活性が認められない観察に一致する。例
えば、英国特許第890,207号では、粗フカンをエタノー
ルを用いての分劃沈澱により、５〜50,000の間の分子量
の７つの異なる区分を得たことを記載している。この特
許では、フラクション中、20,000以上の分子量の区分に
のみ顕著な抗凝固活性を奏している。

西野ら［Carbohydrate Research,186（1989）,119〜1
29］は非分解フカンから得た区分の抗凝固活性を研究
し、この20KDaの限界を確かめている。その上、そこで
記載された精製区分は粗フカンと異なる作用機序を有す
るとしている。これは、精製区分が、粗フカンと同様
に、因子Χ aよりトロンビンにより活性とみられるが、
精製区分の作用は、それ自体本質的に凝固の全機序に現
れ、セファリン、カオリン時間（CKT）の延長をするこ
とになる。反対に、トロンビン時間についてはごく僅か
しか効果を示さず、そのため凝固の最終段階では活性が
少ない。

従って、これまで粗フカンの非分解分劃によって得ら
れたポリサッカライドの細分は、凝固について作用を有
するが、これは各細分によって変動するもので、粗フカ
ンでの観察されたものと異なるとみられる。一方、今日
までの研究から、溶解性で特に優れている20KDaより低
い分子量の区分は実質的に凝固作用を有さないことが明
らかである。

本発明者は、この仮説を進めた。すなわち、粗フカン
のポリサッカライド長鎖を分断すると、低分子量の区分
が得られるであろう。しかしフカン分子のサッカライド
骨格をカットする溶解工程の使用が必要で、これにはフ
カンの性質の欠損につながる過剰分解を避けるように調
節できることが必要である。

この指針で行った実験では、中間の分子量を有する区
分を与えるフカンの分解法の開発に至っていない。実
際、使用した方法では、分解が不十分で40KDaより大き
い分子量の区分を与えるが、殆ど全分解されて、抗凝固
活性のない区分を与える［V.COLLIEC et al.,1Vmes J
ournes d'hmostase et de thrombose,Paris,March
1988］，［FISCHER et al.,International Congress on
thrombosis（Athens）,May 1988］，［COLLIEC et a
l.,Polymers in Medicine,Warsaw,October 1988］。

結果として、この発明の目的は褐藻植物（brown alga
e）のフカンを調節溶解（lysis）して得た比較的低分子
量のポリサッカライド区分を提供することである。また
この発明は、活性が因子ａの阻害で奏されること、何れ
の抗Χ a活性も有さないこと、高分子量及び粗フカンの
高い残留蛋白含量による欠点を表さないことで特に有り
であり、かつ大量に容易に入手しうる原料である褐藻植
物から得られる抗凝固剤および抗血栓剤を提供すること
を目的とする。また、褐藻植物のフカンから得られる新
規な拡補体剤を提供することを目的とする。

この発明は、分子量が、ポリサッカライド標品を比較
としてゲル濾過で測定し、5KDaより大で40KDaより小さ
く、硫黄含量が夾雑蛋白の0.15％より少ない、もとのフ
カンより溶解性であり、抗凝固と拡血栓性を有すること
で特徴付けられる褐藻植物のフカンから得られた硫酸化
ポリサツカライドに関する。

この発明の硫酸化ポリサッカライドは、褐藻植物から
抽出した粗フカンの調節溶解によって得ることができ
る。

この発明による硫酸化ポリサッカライドの好ましい具
体例によれば、その平均分子量は20KDaより小さいか等
しい。

この発明による硫酸化ポリサッカライドの他の好まし
い具体例では、その平均分子量は、20KDaと35KDaの間で
ある。

この発明の硫酸化ポリサッカライドの同様に好ましい
具体例では、その硫酸含量は、原フカンのものより２〜
20％大きい。

この具体例の特に有用な構成によれば、硫酸化ポリサ
ッカライドは、フコスベシクロサス（Fucus vesiculo
sus）から抽出されたフカンを調節酸加水分解によって
得られ、その硫黄含量が原フカンより約15〜20％大で、
蛋白含量が0.05％少ない。

この具体例の他の有利な構成によると、硫酸化ポリサ
ッカライドは、アスコフリウムノドサム（Ascophyllu
m nodosum）から抽出のフカンの調節酸加水分解によっ
て得られ、その硫黄含量が原フカンより約２〜５％大で
あり、蛋白含量が0.05％少ない。

この具体例の他の有利な構成では、硫酸化ポリサッカ
ライドは、ペルベチアカナリクラタ（Pelvetia canal
iculata）からの抽出のフカンを調節酸加水分解で得ら
れ、硫黄含量が原フカンより約15〜20％大で蛋白含量が
0.05％より少ない。

この具体例の更に他の有利な構成では、硫酸化ポリサ
ッカライドは、ウンダリヤピナチフィダ（Undaria pi
nnatifida）の抽出によるフカンを調節酸加水分解で得
られ、硫黄含量が原フカンより約10〜15％大で、蛋白含
量が0.05％より少ない。

本発明者は、この発明による硫酸化ポリサッカライド
が抗凝固と抗血栓（sic）の両方を有することを生体外
と生体内で例証した。西野らの低分子量のポリサッカラ
イド細分と異なり、この発明のポリサッカライドは本質
的に凝固の最終段階に作用する。

この発明は、また、上で定義した少なくとも１つの硫
酸化ポリサッカライドからなることを特徴とする補因子
HC IIとAT IIIの活性剤に生体外と生体内ともに活性な
抗凝固、抗血栓剤に関する。

さらに、この発明は、褐藻植物を源とする粗フカンの
調節溶解が行われ、得られた溶解産物ゲル濾過で分劃さ
れ、5KDaより大で40KDaより小さい分子量の区分を回収
することを特徴とする、前に定義した硫酸化ポリサッカ
ライドの収得方法に関する。

この発明の方法の好ましい実施態様では、フカンの調
節溶解は酸加水分解で行なわれる。

この実施態様の特に有用な構成では、酸分解は0.5〜1
NH₂SO₄で、40〜50℃の温度で１〜４時間行なわれる。

この発明の方法による他の好ましい態様では、フカン
の調節溶解は、フカンを照射、特に、ガンマー線に付し
放射分解により行なわれる。

この発明の方法の更に他の好ましい実施態様では、フ
カンの調節溶解は酵素分解によって行なわれる。この態
様にはフカンの炭化水素骨格を細分しうる少なくとも１
つの酵素、例えばα−１−２−フコシダーゼタイプの
酵素、例えば海軟体動物（sea molluscs）の胃液から作
られた酵素の混合物または、海軟体動物から得られた酵
素の使用が含まれる。また、それ以外に藻を分解する細
菌中に含まれる酵素が使用できる。

この発明の方法の他の好ましい実施態様では、フカン
の調節溶解は、物理的方法特に音波処理で行なわれる。

この発明の方法の有利な実施態様では、20KDaより小
さいか等しい分子量の区分が回収される。

この発明により硫酸化ポリサッカライドの分子量は、
高濃度でも、血漿及び注射液への溶解を可能とする。そ
の上、粗フカンと比較して、夾雑蛋白の含量が小さい。
そのため、ヒトに医薬として使用ができる。この発明に
よる硫酸化ポリサッカライドの抗血栓性をある種の適
用、特に、抗血栓剤の皮下注射で静脈血栓の防止に特に
有利である。この適用には、非分劃フカンでは不可能で
あった比較的濃度の高い溶液の使用を必要とするもので
ある。またこの発明の硫酸化ポリサッカライドを経口的
及び経皮的に使用することも考えられる。

その上、フカンから得られる５〜100KDaの分子量を有
する区分は、非分劃フカンと等しいか大きい補補体活性
を有する。

従って、この発明は、褐藻植物から抽出したフカンお
よび／またはその区分からなることを特徴とする補体の
活性を阻害する剤に関する。

この発明による補体活性阻害剤の好ましい具体例で
は、褐藻植物から抽出したフカンから得られた50KDa以
上の分子量を有する区分からなる。

この発明の補体活性阻害剤の好ましい具体例では、褐
藻植物から抽出したフカンから得られた５〜50KDaの分
子量を有する区分からなる。

この発明の補体活性阻害剤の好ましい他の具体例で
は、上記で定義した硫酸化ポリサッカライドからなる。

この発明は、以下の記述からより理解されるであろ
う。この記述には各種の褐藻から抽出したフカンよりこ
の発明の硫酸化ポリサッカライドを収得する実施例及び
これらのポリサッカライドの活性の実証に関する。

しかし、これらの実施例は、発明の主題の例証のため
であり、これによって限定されるものではない。

Ｉ−この発明による硫酸化ポリサッカライドの収得実施例1:フカンの分劃とフラクションの精製Ａ）フカンの褐藻からの抽出褐藻の若枝の子房壁材料から通常の抽出法でフカンを
抽出する。この方法は、BLACKら［J.Sci.Food Agric.
（1952）］の方法に由来する。

抽出原理の要旨は次の通りである。若枝（thalli）を
５重量％のホルマリン含有の無水エタノールで粉砕す
る。得られる粉砕物を５重量％のホルマリン含有の95％
エタノールによる第１抽出に付し、2/1（V/V）のアセト
ン／トルエン混液による第２抽出に付す。

オーブンで乾燥後、２重量％のCaCl₂含有の0.01M HCl
を用いて一回以上の酸抽出に付す。

水酸化ナトリウムで中和後、酸抽出物をＮ−セチルピ
リジニウムクロリドと処理し、殆んど高度に硫酸化し
たフカンとのコンプレックスを形成し、前記の硫酸化フ
カンでの製剤を濃厚にすることが可能となる。

次いで得られた沈澱物は、3M CaCl₂に再溶解し、凍
結乾燥する。

Ｂ）抽出フカンの分劃第１工程：粗抽出部の分解ａ）酸加水分解酸抽出物を1N−H₂SO₂液に10mg/mlの割合で溶解し、温
度を45℃に固定する。分解は粘度測定（流管直径0.5mm
のウーベローデ型粘度計）を行い、フカンの全加水分解
が起る前に水酸化ナトリウム液（Ｍ−NaOH）を加えて停
止する。分解中、減少した比粘度（η spec./c）を30分
ごとに計算する。分解した酸抽出物の溶液を濃縮し、10
00ダルトンのカットオフ閾値を有する膜を用いる限外濾
過に付し、最後に凍結乾燥した。

ｂ）放射線分解放射化学的加水分解を、60,000Ciコバルト−60源から
の照射で行う。粗フカンを全サンプルに対し、線量率20
81ラッド／分は又は照射量11.5ラッドで室温で92時間照
射する。

ｃ）酵素分解ハリオチス（Haliotis tuberculata）とアプリシア
（Aplysia californica）からの胃液の粗抽出物を用い
て、ペルベチアカナリクラタ（Pelvetia canaliculat
a）の粗抽出物の酵素分解を次のようにして行う。粗フ
カンをpH5.8のクエン酸−リン酸緩衝液（クエン酸＝0.0
1M C₅H₈O₇;リン酸水素２ナトリウム＝0.2M Na₂HPO₄・
2H₂O）中10mg/mlの濃度に溶解する。このフカン溶液を3
7℃に加熱し、200μの胃抽出物を１時間ごとに活性酵
素の定濃度になるように加える。粘度測定で分解をモニ
ターし、減少した比粘度（η sp）/cを各種のサンプリ
ング時に計算する。反応は0.2M−炭酸ナトリウム（Na₂C
O₃）溶液を加えて停止する。

第２工程：分解粗抽出物の予備的分劃ａ）実験質スケールについて 500mgの溶解産物0.2M食塩水に入れ、分劃ゲル（セフ
ァクリル（SEPHACRYL）Ｓ−200又はＳ−300）のカラム
（高さ35〜45cm×4.8cm）に導入する。

直線流量は3.33cm/時である。カラムの出口で差異屈
折計とUV検出器（280nm）を用いて２重検出を行う。シ
グナルを２重チャンネルレコダーに記録する。クロマト
グラフで検討し、カラムの出口から得た各種フラクショ
ン（5ml）について３又は４フラクションに合す。各フ
ラクションを濃縮し、第１フラクション用に10,000ダル
トンのカットオフ閾値を有する膜で、また他のフラクシ
ョン用に1000ダルトンのカットオフ閾値を有する膜で限
外濾過に付し、凍結乾燥する。

ｂ）半パイロットスケールについて 30gの溶解産物を0.2M食塩水125mlに入れ、セファクリ
ル（SEPHACRYL）Ｓ−200カラム（高さ60cm×直径11.3c
m）に導入する。線流速は15cm/時間。

カラム出口で、差異屈折計をUV検出量（280nm）を用
いて２重検出を行う。シグナルを２重チャンネル記録計
に記録する。クロマトグラフを調べ、カラム出口で得た
各種フラクション（30ml）を３又は４つのフラクション
に合す。各フラクションを濃縮し、第１フラクション用
に10,000ダルトンのカットオフ閾値の膜と他のフラクシ
ョン用に1000ダルトンのカットオフ閾値の膜で限外濾過
に付し、凍結乾燥した。

Fig.1は、フカン酸抽出物を1N−硫酸を使用し45℃で
分解したもののセファクリルＳ−200ゲルでの予備分劃
（分劃範囲250×13³〜５×10³ダルトン）で、A₁は第１
フラクション（分子量＞20KDa）、A₂は第２フラクショ
ン（20KDa分子量＞10KDa）、A₃は第３フラクション（分
子量＞10KDa）、Vdはデッド容量、Vtは全容量。

破線の曲線は差異屈折計で測定した溶出材の量を示
す。実線の曲線は280nmでのUV吸収で測定した蛋白量を
表す。

実施例2:得られたフラクションの物理化学的特性赤外スペクトル： Figはフコスベシクロサス（Fucos vesiculosus）の
壁から抽出した粗フカンと、この酸抽出物を調節酸加水
分解して得た平均分子量13×10³のA₂フラクション（2
b）の赤外スペクトルである。1240cm^-1でのピークは、
硫酸基の特徴である。850cm^-1でのピークは、大部分の
スルファート基がＬ−フコースのC₄位にあり、スルファ
ート基のあるものは820cm^-1でのショルダーで示される
ようにC₅位にある。

カルボキシル官能の大部分は、1720cm^-1でのピークで
示されるように非解離で、解離したカルボキシル官能を
表す1420cm^-1での弱いショルダーに比較される。

分子量の測定：フカンフラクションのg/moleでの分子量測定は、Si
−ジオール（Si−Diol）500カラム（分劃範囲5000〜10⁶
ダルトン）に、標準ポリサッカライド（プルラン、ポリ
マーラボラトリー社）の50μ、又は測定対象のフカン
フラクションの50μを0.2M食塩水中2mg/mで、流速1
ml/mm、屈折測定で検出する分析用高速流体クロマトグ
ラフィー（HPLC）で行った。クロマトグラフは貯蔵し、
GPCプログラムを有するマイクロコンピュータで分析す
る（透過ゲル上立体エクスクルージョンクロマトグラフ
ィー）、結果はプリンター上に記録する。

ＳとＮの含量：フカンフラクションと硫黄と窒素含量は元素分析で
％（純品の重量で）として出す。

蛋白含量：蛋白含量は、ブラトフォードカラーメトリーテスト
（“バイオ−ラッド”（Bio−Rad）テスト）を使用し、
参照として牛ウルブミンを用い、％（純品の重量で）と
測定する。

表１は、４種の褐藻（アスコフリウムノドサム（A
n），フコスベシクロサス（Fv），ペルベチアカナ
リクラタ（Pc），ウンダリアピナチフィダ（Up）から
抽出の粗フカンすなわち未分劃の酸抽出物（AE）と、こ
れらの粗フランの酸加分解によって得たA₂フラクション
として表した本発明による硫酸化ポリサッカライドにつ
いての物理化学的性質の比較である。

表２は、３種の褐藻（アスコフリウムノドサム（A
n）、フコスベシクロサス（Fv）とペルベチアカナ
リクラタ（Pc）についての未分劃酸抽出部（AE）と、放
射線分解で得たA₂フラクションとして表示した本発明の
硫酸化ポリサッカライドについての物理化学的物質の比
較である。

II−粗フカンとこれの調節溶解で得たフラクションの生
物学的活性の比較実施例3:生体外での抗凝固活性非分解フカンと、10と20KDaの間の分子量を有する分
解フカンの抗凝固活性を、セファリンカオリン時間
（CKT）を用いて評価する。活性は、次の関係：フカンフラクションの直線スロープ／標準ヘパリン
の直線スロープ×標準ヘパリン（ラボラトリーズチヨ
ア Laboratoires CHOAY）からのヘパリンH180のIU/mg活
性により、産物のmg当りの国際単位（IU/mg）で表す。

スロープは、抗凝固濃度（ヘパリン0.5〜１μg/ヘパ
リンのmlの濃度とフカン10〜50μg/mlの濃度）の関数と
して、凝固時間（秒）の対数をプロットして得た直線か
ら計算する。

表IIIは、褐藻（アスコフリウムノドサム（An），
フコスベシクロサス（Fv），ペルベチアカナリクラ
タ（Pc）とウンダリアピナチフィダ（Up））の酸抽出
物（粗フカン）（AE）と酸加水分解で得たA₂フラクショ
ンについて抗凝固活性の比較である。

表IVは、本発明による硫酸化ポリサッカライドの抗凝
固活性のより精密な分析を示すもので、A₂フラクション
及びヘパリンのクイック時間（QT）、セファリンカオ
リン時間（CKT）、トロンビン時間（TT）とレプリラー
ゼ時間（RT）のそれぞれの効果の比較である。

上記は、本発明による硫酸化ポリサッカライドがトロ
ンビン時間で本質的で活性であるこを示す。

実施例4:生体内抗凝固活性＝本発明の硫酸化ポリサッカ
ライドの凝固指数への影響本発明のポリサッカライドフラクションの抗凝固活
性をウサギで評価する。実施例１の酸加水分解で作った
平均分子量15000Daのフラクションを3kg体重のウサギに
注射する。ウサギから所定間隔で採血し、凝固指標をト
ランビン時間（TT）とセファリンカオリン時間（CK
T）を測定して評価する。

表Ｖは、本発明の硫酸化ポリサッカライドの溶媒アス
コフリウムノドサムの酸加水分解で得たフラクション
A₂（sic）の0.05mlの注射、（但し、100mg/ml,400mg/ml
と30mg/ml）の時間関数として凝固指標の変化を、ヘパ
リンの注射（但し2mg/ml）と比較して示す。

実施例5:生体外抗血栓活性：実験的血栓 1.方法使用した実験的血栓は、ウサギでのウエスラー、ハウ
プトマン〔STANFORD WESSLER,STANLEY M.REIMER,MINDEL
C.SHEPS−J.Appl.Physiol（1959）14,943〜946頁〕に
よるもので、このモデルは、剤トリガー血栓として、因
子Χ a（J.HAUPTMANN.B.KAISER,F.MARKWARDT,G.NOUAK−
Thromb.Haemostaris（sic）Stuttgart 43（1980）,118
〜123頁）を使用するものである。

テストは、実施例１で記載のように、粗フカンの酸加
水分解で得た平均分子量20,000＋2,000のポリサッカラ
イドで行う。このものを血栓誘因前に、0.150,0.625,1.
25,2.5及び5mg/kgの用量で静液する。各用量共５匹のウ
サギで行う。抗血栓のED50（生成した血栓の50重量％減
ずる量に対応する、有効量50）の測定は、対数回帰で行
い、0.40mg/kg（0.23mg/kgと0.66mg/kgの間）の平均値
が出る。採血は、静脈凝集の創製直後の静注後10分で行
う。各用量での平均結果を表VIに要約する。

これらの結果は、生体外で観察し、実施例３の表VIで
報告したものを確認するものである。

実験的血栓プトロコールに対し、但しA₂フラクション
の溶液のみを与えたコントロールのウサギでの結果もこ
の表に示す。表VIIに、0.25,0.625,1:25と5mg/kg用量で
の対側性血管から採取の湿潤トロンビュの平均重量を表
VIIに示す。

実施例6;フカンとそのフラクションの全体的抗補体活性
の測定抗補体活性をフカンの存在又は不存在下にHC50（溶血
補体50）のアッセイで測定する。HCアッセイは、ヒト血
漿の補体系の古典的経路についての全体的官能活性を評
価するものである。このテストは、ヒツジの赤血球〔こ
の赤血球は、ヒツジ赤血球に対するウサギ抗体で最大に
感作性にされている（Se＝感作血球）〕の所定数の50％
溶解しうる新たに回収したヒト血漿の最小量を測定する
ものである。

補体系の古典的経路の蛋白は、外来要素としてこれら
の赤血球を認識し、これらの赤血球に反応し継続的分解
により活性化され、赤血球を溶解するヘパリンやフカン
のようなポリマーの存在下でHC50をアッセイすることに
よりこれらのポリマーの阻害性を測定することができ
る。

阻害性は、ポリマー濃度の関数として細胞の溶解につ
いての用量／応答カーブを作り、細胞の溶解を50％阻止
しうる４分の１に希釈のヒト血漿のml当たりのポリマー
mg濃度として与える。ポリマーの阻害性が弱い程、抗補
体活性が大きい。フカンの抗補体活性の測定には、酸抽
出物（粗フカン）ならびに粗フカンの酸加水分解で得た
異なる分子量のフラクションを用いた。実験条件は次の
通りである。

50μの純NHS（正常ヒト血漿）を異なる濃度（0.2〜
0.5mg/ml）のフカン50μと混合し、37℃で30分培養
後、4900μのVBS⁺⁺バッファーを加える。溶液Ａを得
る。

その上、0.3〜0.8mlのVBS⁺⁺バッファーを０〜0.5mlの
溶液Ａを混合し全量0.8mlとし、0.2mlの感作赤血球を混
合物に加える。37℃で45分培養後、混合物を４℃で1300
gで10分遠心分離し、414mmでODの読みを行う。

VBS⁺⁺バッファーの組成 NaCl（sic） 42.5 g ベロナール（ジエチルバルビタールナトリウム） 1.875g ジエチルバルビツール酸 2.85 g 蒸留水加えて 1000 ml pHは7.4に調製する。この溶液20mlを蒸留水80mlと混
合し、0.03M CaCl₂0.5mlと0.01M MgCl₂の0.5mlを加え
る。

得られた結果は、表VIII（第２欄）に示される。フカ
ンフラクションは、同一条件下で分析したヘパリンH108
より３〜100倍活性である。この活性は抗凝固活性と無
関係である。

粗フカンならびに５〜100KDaの平均分子量を有するフ
ラクションは、全体的に補体の活性を阻害し、ヘパリン
より大きい抗補体活性を有することが分る。実際、細胞
溶解を50％阻止するのにポリマーのヘパリン4mg/mlを必
要とするのに対し、同じ効果を得るのに粗フカン又は分
劃フカンでは0.035〜1.95mg/ml（分子量による）のみで
ある。実施例１で記載のように作られた平均分子量1800
0KDaのフラクションは、1.3mg/mlの濃度で細胞溶解の50
％を阻害し、平均分子量３〜10KDaのフラクションは0.2
0mg/mlの濃度で細胞溶解の50％を阻止する。

実施例7:C3aとC4aの放射線免疫アッセイによる測定活性化中液体層で遊離した蛋白C3aとC4aの濃度を放射
線免疫アッセイ測定（sic）により上澄液で測定する。

アッセイはC3a−デサルグ125上放射線アッセイキッ
ト（アマースハム（Amersham）より市販）を用いて次の
ようにして行なう。

セファデックスで活性化した純NHSの50μを、50μ
のVBS⁺⁺バッファーと100μの各種濃度のフカン（0.
1〜5mg/ml）と混合する。混合物を37℃で30分間培養
し、次いで1700gで５分間遠心分離する。160μの上澄
液を除去し、それに、（補体の活性化をブロックする）
10μのEDTA（8.66×10^-2M）を加え、次いで（アッセ
イキットに備えられた）沈澱剤の170μを加える。
室温で５分間培養後に、混合物を10000gで２分間遠心分
離し、上澄液をRIAに付す前に希釈する（1/4〜1/51
2）。

サンプルの活性（LD50）は、NHS希釈1/4の1mlに通常
発生するC3aの量を50％阻害するのに必要なフカン量と
して表す。この阻害量は、フカンmg/NHS希釈1/4mlとし
て表す。結果は表VIII（第３欄）に示す。

NHS希釈1/4中のA₂（An）の0.21mg/ml溶液は、NHSの自
発活性化以下でC3の活性化の減少をする。

加えて、同じフラクションの0.5mgは、NHS希釈1/4の1
ml中に含まれかつ補体の全活性に必要な量より大きな量
でアクチベター（15mg/mlの濃度で、補体の全活性化に
もたらす、セファデックス）に付したC3の活性化を全体
的に阻害するのに十分である。

C4aに関する結果は、表VIII（第４欄）に示す。

上記の記載から明らかなように、この発明は、手段の
やり方、具体例及びより詳細に記載した、適用の仕方に
限定されない。反対に、この発明の枠又は範囲から離脱
することなく、当業者に理解される変形を含むものであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者デュラン，パトリックフランス、44400 レズ、リゥドゥラコンミューンドゥ 1871、61 (72)発明者フシェ，アンヌ―マリフランス、75013 パリ、パシジュ．トルベール―ベリエ、15 (72)発明者ジョゼホンビッツ，ジャクリーヌフランス、60260 ラモルラエ、ドゥジームアベニュ、65 (72)発明者クロアレ，ベルナールフランス、29250 サン―ポール―ドゥ ―レオン、リゥドゥラリブ、81 (72)発明者ヴィダ，カトゥリーヌフランス、75020 パリ、リゥデグランシャン、60 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C08B 37/00 A61K 35/80

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】褐藻植物を源とする粗フカンの調節溶解を
行い、得られた溶解産物をゲル濾過で分劃し、ポリサッ
カライド標品と比較して、5KDaより大で40KDaより小さ
い分子量のフラクションを回収することにより得られ、
硫黄含量が原フカンより大であること、夾雑蛋白が0.15
％より少ないこと、溶解性が原フカンより溶けやすいこ
とおよび抗凝固性と抗血栓性を有することで特徴付けら
れる褐藻植物から抽出したフカンから得られた硫酸化ポ
リサッカライド。
【請求項２】平均分子量が20KDaより小さいか等しいこ
とを特徴とする請求項１による硫酸化ポリサッカライ
ド。
【請求項３】平均分子量が20KDaと30KDaの間であること
を特徴とする請求項１による硫酸化ポリサッカライド。
【請求項４】硫黄含量が原フカンより２％〜20％大であ
ることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１つによる
硫酸化ポリサッカライド。
【請求項５】フコスベシクロサス（Fucus vesiculosu
s）から抽出されたフカンの調節酸加水分解によって得
られること、硫黄含量が原フカンより約15〜20％大であ
ることおよび蛋白含量が0.5％少ないことを特徴とする
請求項４による硫酸化ポリサッカライド。
【請求項６】アスコフリウムノドサム（Ascophyllum
nodosum）から抽出されたフカンの調節酸加水分解によ
って得られること、硫黄含量が原フカンより約２〜５％
大であることおよび蛋白含量が0.05％少ないことを特徴
とする請求項４による硫酸化ポリサッカライド。
【請求項７】ペルベチアカナリクラタ（Pelvetia can
aliculata）から抽出されたフカンの調節酸加水分解で
得られること、硫黄含量が原フカンより約15〜20％大き
いこと、蛋白含量が0.05％より小であることを特徴とす
る請求項４による硫酸化ポリサッカライド。
【請求項８】ウンダリアピナチフィダ（Undaria pinn
atifida）から抽出されたフカンの調節酸加水分解で得
られること、硫黄含量が原フカンより約10〜15％大きい
こと、蛋白含量が0.05％より小であることを特徴とする
請求項４による硫酸化ポリサッカライド。
【請求項９】請求項１〜８の何れか１つによる少なくと
も１種の硫酸化ポリサッカライドからなることを特徴と
する生体外と生体内の両方で活性で、補因子HC IIとAT
IIIの活性化剤である抗凝固、抗血栓剤。
【請求項１０】褐藻植物を源とする粗フカンの調節溶解
を行い、得られた溶解産物をゲル濾過で分劃し、5KDaよ
り大で40KDaより小さい分子量のフラクションを回収す
ることからなることを特徴とする請求項１による硫酸化
ポリサッカライドの収得方法。
【請求項１１】フカンの調節溶解が酸加水分解で行われ
ることを特徴とする請求項10による方法。
【請求項１２】フカンの酸化水分解が、0.5〜１規定硫
酸を40〜50℃の温度で１〜４時間作用させて行われるこ
とを特徴とする請求項11による方法。
【請求項１３】フカンの調節溶解が、放射線分解、すな
わちフカンを特にガンマー線照射に付して行われること
を特徴とする請求項10による方法。
【請求項１４】フカンの調節溶解が酵素加水分解によっ
て行われることを特徴とする請求項10による方法。
【請求項１５】フカンの調節溶解が、物理的方法、特に
超音波で行われることを特徴とする請求項10による方
法。
【請求項１６】分子量が20KDaより小さいか等しいフラ
クションが回収されることを特徴とする請求項11〜15の
いずれか１つによる方法。
【請求項１７】褐藻植物から抽出されたフカンおよび／
またはそのフラクションからなることを特徴とする請求
項11〜15の何れか１つによる補体活性化阻害剤。
【請求項１８】褐藻植物から抽出されたフカンより得ら
れ、50KDaより大きな分子量を有するフラクションから
なることを特徴とする請求項17による補体活性化阻害
剤。
【請求項１９】褐藻植物から抽出されたフカンより得ら
れ、５〜50KDaの平均分子量を有するフラクションから
なることを特徴とする請求項17による補体活性体阻害
剤。
【請求項２０】請求項１〜８の何れか１つによる硫酸化
ポリサッカライドからなることを特徴とする補体活性化
阻害剤。