JP2952830B2

JP2952830B2 - 血圧降下剤

Info

Publication number: JP2952830B2
Application number: JP2316117A
Authority: JP
Inventors: 新介三吉; 俊之金子; 康子吉沢; 博巳石川
Original assignee: Showa Sangyo Co Ltd
Current assignee: Showa Sangyo Co Ltd
Priority date: 1990-11-22
Filing date: 1990-11-22
Publication date: 1999-09-27
Anticipated expiration: 2014-09-27
Also published as: JPH04187643A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、血圧降下剤に関するものであり、特に近年
増加の傾向が著しく、対策が望まれている高血圧症の予
防及び治療に有効な医薬品または食品への利用が期待さ
れる血圧降下剤に関するものである。

（従来の技術）高血圧症は近年増加の傾向にあり、対策が望まれてい
る。従来、高血圧症の予防、治療に有効な物質は数多く
知られている。また、一方、日常の食物の摂取を通じて
病気の予防に役立てようとする機能性食品に対する関心
が高まっている。

こうした観点から安全性の高い食品またはそれらの加
水分解物から血圧降下作用を有する物質を見い出す研究
が、最近とみに盛んに行われている。その例は枚挙に暇
のないほどであるが、例えば、牛乳カゼインのトリプシ
ン加水分解物由来のACE（アンジオテンシン変換酵素）
阻害物質を単離し、あるいは更にペプチダーゼで処理し
た血圧降下剤（特公昭60−23085号、同60−23086号、同
60−23087号、特開昭61−36226号、同61−36227号）、
魚類蛋白質または大豆蛋白質をバチルス属細菌由来のセ
リンプロテーアーゼ、バチルス属由来の金属プロテアー
ゼまたは植物由来のチオールプロテアーゼで加水分解し
て得たペプチドを有効成分とする血圧降下剤、とうもろ
こし蛋白質の一成分であるγ−ゼイン中に含まれるVal
−His−Leu−Pro−Pro−Proを基本単位とする繰り返し
構造部分からサーモライシンによる加水分解後、更に酵
素的または酸で分解して得られる、Ｃ末端アミノ酸配列
がLeu−Pro−Porであるアミノ酸重合度３〜５のペプチ
ドを有効成分とするACE阻害剤、等々数多くの提案がな
されている。

一方、小麦蛋白質中にはグルテンを形成する成分とし
てグルテニンとグリアジンが存在すること、グルテニン
はエタノールに不溶、希酸に溶解する性質を有し、これ
を酵素キモトリプシンで加水分解するとき、Ser−Gln−
Gln−Gln−Gln−Pro−Pro−Pheなるオクタペプチドが多
量生成することが知られている（Z.Lebensm Unters For
sch 187:27−34,（1988））。

（発明が解決しようとする課題）本発明は優れた血圧降下作用を有し、安全性が極めて
高く、安価かつ大量に供給でき、医薬品としてのみなら
ず機能性食品としても有用な血圧降下剤を提供すること
を目的とする。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、血圧降下剤作用を有する物質を種々検
索した結果、安価で最も一般的な食品用蛋白質の一つで
ある小麦蛋白質中のグルテニンを酵素キモトリプシンで
加水分解して得られる一定のペプチド、更には該加水分
解処理において、最も収量が多く得られる成分であるSe
r−Gln−Gln−Gln−Gln−Pro−Pro−Pheなるオクタペプ
チドが特に強い血圧降下作用を有することを見い出し、
本発明を完成した。

すなわち、請求項１記載の本発明は小麦グルテニンを
キモトリプシンで加水分解して得られる特定分子量範囲
のペプチドを有効成分とする血圧降下剤であり、請求項
２記載の本発明は上記加水分解液中に多量に生成するSe
r−Gln−Gln−Gln−Gln−Pro−Pro−Pheなるオクタペプ
チドを有効成分とする血圧降下剤である。

以下、本発明を詳しく説明する。

本発明に使用する小麦グルテニンは、例えば、グルテ
ンの細粉を50〜70％（v/v）エタノール水溶液に懸濁し
て放置した後、遠心分離等の適宜の手段で分離した不水
溶解物を0.2％水酸化ナトリウムで抽出し、次いで酢酸
で中和して沈殿させる、等の公知の方法により調製する
ことができる。

使用する酵素キモトリプシンは、脊椎動物の膵臓から
小腸に分泌される酵素であり、ウシ膵臓等を起源とする
市販製品をそのまま用いることができる。

グルテニンのキモトリプシンにより加水分解は、通
常、単に水中または緩衝液（例えばトリス塩酸緩衝液、
リン酸緩衝液）中で行う。処理液中のグルテニンの濃度
は、反応自撹はん混合ができる範囲内であればいずれも
よいが、撹はんが容易な２〜20％（w/v）の範囲で行う
のが望ましい。

酸素キモトリプシンの添加量は、その力価により異な
るが、通常は蛋白質当たり0.01重量％以上、好ましくは
0.1〜10重量％が適当である。反応液のpH、温度はキモ
トリプシンの至適pH、至適温度付近を用いればよく、pH
は６〜10より好ましくは７〜８、温度は20〜70℃より好
ましくは30〜50℃がそれぞれ適当である。反応中のpHの
調製は必要に応じ水酸化ナトリウム水溶液、塩酸等によ
り行う。

反応時間は、基質濃度、酵素の添加量、反応温度、反
応pH、等の要因により異なるため一定ではないが、通常
は１〜50時間程度である。

加水分解反応の停止は、加水分解物の加熱あるいはク
エン酸、リンゴ酸等の有機酸、または塩酸、リン酸等の
無機酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカ
リの添加によるpHの変化等による酸素の失活、限外ろ過
膜等による酵素のろ別など、公知の方法に従って行うこ
とができる。

本発明でいう小麦グルテニンのキモトリプシン加水分
解物であって、分子量が10,000以下の画分の含有量が固
形分基準で30重量％以上である加水分解物としては、小
麦グルテニンを上述のようにして加水分解して得られる
加水分解液もしくはこれを必要に応じ固液分離（例えば
遠心分離、ろ過等）して得られる液を、分別（例えば限
外ろ過、ゲルろ過等による）して得られる分子量か10,0
00以下の画分を含有する液またはそのの濃縮物（例えば
濃縮液、噴霧乾燥物、凍結乾燥物、流動床乾燥物等）を
包含する。なお、本発明でいう固形分基準における固形
分とは水分を蒸発、乾燥させた乾燥物という意味である
が、より詳しくいえば105℃で４時間乾燥したものをい
う。

本発明の上記加水分解物は、経口または非経口的（静
脈注射、復腔内注射等）に投与することによって、優れ
た血圧降下作用を発揮するが、本加水分解物中に多量存
在し、これから分別するなどして得られるSer−Gln−Gl
n−Gln−Gln−Pro−Pro−Pheなるオクタペプチド及びそ
の塩は、特に強い血圧降下作用を示す。

グルテニン加水分解物から上記オクタペプチドを分別
する一法としては、分解物をゲルろ過（例えばセファデ
ックスＧ−25使用）、及び陽イオン交換樹脂（例えばDO
WEX 50WX2）を行っていくつかのフラクションに分画
し、上記オクタペプチドを含む画分を陰イオン交換樹脂
（例えば、Durrum DAX2−20使用）等に付して単一のオ
クタペプチドを分別する。

また、有機化学的合成法としては液相法、固相法の２
種があり、前者ではBoc（ターシャリーブチルオキシカ
ルボニル）基などで保護したアミノ酸をDMF（ジメチル
ホルムアミド）に溶解し、DCC（ジシクロヘキシルカル
ボジイミド）及びHO Bt（１−ヒドロキシベンゾトリア
ゾール）の存在下で一昼夜反応させ、カルボキシ末端側
から順次結合させる。また、後者ではアプライド・バイ
オシステルズ社製ペプチド合成装置（430A型）などで、
PAM（フェニルアセタミドメチル）樹脂にアミノ酸を順
次伸長させ、フッ化水素などにより樹脂及び各種保護基
を切断し、目的とするオクタペプチドを得る。

本発明の請求項１の小麦グリアジン加水分解物及び請
求項２のペプチド（以下、両者を合わせて「本発明の物
質」と総称することがある）は、いずれもそのまま、あ
るいは通常少なくとも１つの製造薬補助剤を加え、製薬
組成物として使用する。これらはいずれも非経口的（静
脈注射、直腸投与等）または経口的にヒトを初めとする
ほ乳類に投与し、各投与方法に適した形態に製造するこ
とができる。

本発明の物質の急性毒性はいずれもLD₅₀（ラット経口
投与）＞5g/kgである。

また、本発明の物質は多量に採取しても全体に悪影響
を与えないことから、そのまま、あるいは種々の栄養分
等を加えて、もしくは飲食物中に含有させて血圧降下作
用、高血圧予防の機能をもたせた機能性食品、健康食品
として食してもよい。

（実施例）次に本発明を実施例により説明する。

実施例１小麦グルテン（関東化学（株）製）を20倍容の60％
（v/v）エタノール水溶液に分散し、時々撹はんしなが
ら５時間放置した。遠心分離により上澄液を除き、不溶
解物には60％（v/v）エタノール水溶液５倍容を加え１
時間撹はんした。この操作をもう１度繰り返した後、分
離した不溶解物に10倍容の0.2％水酸化ナトリウムを加
え、２時間撹はん抽出を行った。遠心分離により不溶物
を除去した後、これを酢酸で中和した。沈殿物を５倍容
の水に分散させた後遠心分離を行う洗浄操作を２回行
い、次いで凍結乾燥を行ってグルテニンの乾燥物を得
た。

上記により得たグリテニン100g（固形分）を純水２
に分散し、これにキモトリプシン（関東化学（株）製ウ
シ膵臓由来）を加え、50℃で15時間撹はん反応させた。
反応中2N水酸化ナトリウムを適宜滴下してpH8.0に保っ
た。次いでキモトリプシンを更に1g追加し、50℃で24時
間、pHを8.0に保って反応させた。反応後、反応液をオ
ートクレーブ中で105℃で５分間加熱し、酵素を失活さ
せた。

得られた加水分解物を5,000rpmで10分間遠心分離し上
清をアミコン（Amicon）PM−10（限外ろ過膜、分画分子
量10,000、アミコン社）を用いる限外ろ過に付し、ろ液
を凍結乾燥して分画画分濃縮物94.2g（固形分）を得
た。

本明加水分解物の分子量分布は以下により測定した。
すなわち、セファデックスＧ−25（ファイン）のカラム
（1.3φ×820cm）に予め分子量既知の標準品を流し（溶
媒:0.1M 酢酸アンモニウム）分子量と溶出位置の関係を
決定した。用いた標準品及びその分子量は次のとおりで
ある。

リボヌクレアーゼＡ 13,700 アプロチニン 6,500 ダイノルフィン 2,147 バシトラシン 1,411 オキシトシン 1,007 グリシルグリシルアラニン 203 次に同一条件下に前記膜透過画分を流して得たゲルろ
過パターンから、膜透過画分は実質上分子量200〜5,000
のペプチドからなっており、分子量5,000を越えるペプ
チド、並びに同200未満のペプチド及びアミノ酸を殆ど
含有していないことが明らかであった。

実施例２グルテニン加水分解物からSer−Gln−Gln−Gln−Gln
−Pro−Pro−Pheの調製実施例１で得た加水分解物500mgを0.1M N−エチルモ
ルホリン酢酸（pH6.5）に溶解し、セファデックスＧ−2
5スーパーファインのカラムに添加して同一溶媒で溶出
した。血液降下作用の大きなフラクションを集め減圧濃
縮した。なお、この場合のカラム処理条件は次の通りで
ある。

カラム φ３×100cm 溶出溶媒 0.1M N−エチルモルホリン酢酸（pH6.5）流速 25ml/hr 次に、前記セファデックスG25で分画した活性フラク
ションを、陽イオン交換樹脂カラム（Dowex50WX2 200〜
400mesh）のカラムに添加し、以下により分画を行っ
た。

カラム φ0.9×110cm 溶出溶媒 0.2Mピリジン−酢酸緩衝液（pH3.1） 100ml 同上緩衝液300mlと1.0Mピリジン−酢酸緩衝液（pH4.
2）300mlによる直線濃度勾配溶出 1.0Mピリジン−酢酸緩衝液（pH5.0）150ml 流速 32ml/hr 上記陽イオン交換樹脂クロマトグラフィーで分画した
血圧降下作用の大きなフラクションを濃縮し、更に以下
条件による陰イオン交換樹脂Durrum DAX2−20のカラム
に供した。

カラム 0.9φ×60cm 溶出溶媒Ｎ−エチルモルホリン15ml、α−ピコリン20ml、ピリ
ジン10ml及び水955mlからなる溶液を酢酸でpH9.4に調整
した緩衝液20ml 上記組成の溶液をpH8.4に調整した緩衝液30ml 上記組成の溶液をpH6.5に調整した緩衝液40ml 0.5M酢酸60ml 2.0M酢酸100ml 流速 20ml/hr 次に、前記で得た活性フラクションをセファデックス
LH−20カラムに添加し、脱塩を行う。

この場合の処理条件は以下の通りである。

カラム 2.0φ×60cm 溶出溶媒純水流速 0.4ml 前記により脱塩した試料を減圧乾固すると、白色粉末
物質が得られる。

本物質を6N塩酸に溶かし、真空下で110℃24時間加熱
後、アミノ酸分析計により分析したところ、次の結果が
得られた。

アミノ酸セリンに対するモル比 Ser（セリン） 1.00 Glu（グルタミン酸） 4.20 Pro（プロリン） 2.15 Phe（フェニルアラニン） 1.10 更に、前記白色粉末試料をペプチド構造自動解析装置
によりエドマン分解を行った。生成した８個のPTHアミ
ノ酸を高速液体クロマトグラフィーで同定し、アミノ酸
の一次配列を決めたところ、Ser−Gln−Gln−Gln−Gln
−Pro−Pro−Pheなる構造を有することが確認された。

実施例３合成法によるSer−Gln−Gln−Gln−Gln−Pro−Pro−P
heの調製アプライド・バイオシステムズ社製ペプチド合成装置
（430A型）に0.5ミリモルのBoc−Ｌ−Phe−OCH₂−PAM樹
脂及び各２ミリモルのBoc−Ｌ−Pro、Boc−Ｌ−Pro、Bo
c−Ｌ−Gln、Boc−Ｌ−Gln、Boc−Ｌ−Gln、Boc−Ｌ−G
ln及びBor−Ｌ−Serを装着し、DCCによる無水対称法に
より、Ｌ−Ser−Ｌ−Gln−Ｌ−Gln−Ｌ−Gln−Ｌ−Gln
−Ｌ−Pro−Ｌ−Pro−Ｌ−Pre−Ｏ−OH₂−PAMを合成し
た。次に、ペプチド研究所製フッ化水素処理装置に上記
合成ペプチド樹脂を導入し、アニソール1.5mlを添加
後、液体フッ化水素10mlを導入した。−20℃30分、０℃
30分の反応後、フッ化水素を減圧下に除去し、ペプチド
を無水エーテルとクロロホルムで交互に３回洗浄し、次
いで2N酢酸60mlに溶解して凍結乾燥した。この方法によ
りSer−Gln−Gln−Gln−Gln−Pro−Pro−Pheの白色粉末
213mgを得た。

本ペプチドの構造解析のため、6N塩酸による加水分解
後のアミノ酸分析（日立Ｌ−8500型アミノ酸分析計によ
る）、質量分析（日本電子JMX−DX 303型による）、ア
ミノ酸配列分析（島津プロテインシークエンサーPSQ−
１システムによる）を、それぞれ実施した。結果を表１
に示す。

試験例１グルテニンのキモトリプシン加水分解物の血圧降下作
用動物は10周令の自然発症高血圧ラット（SHR）（日本
ラット（株）、♂、体重240〜280g,1群６匹）を用い
た。試料を生理食塩水に溶解し、有効成分として2g/kg
−体重を腹腔内に投与した。対照としては生理食塩水を
腹腔内に投与した。

血圧はラット・マウス用非観血血圧計TK−350（ユニ
コム社製）を用い、投与前及び投与後経時的にTail−Cu
ff法で測定した。結果を表２に示す。

表２に見られるように、グルテニンのキモトリプシン
加水分解物の投与によって、１〜５時間にわたって顕著
な血圧降下作用が認められた。

試験例２ペプチド「Ser−Gln−Gln−Gln−Gln−Pro−Pro−Ph
e」の血圧降下作用ペプチドの投与量を150mg/kg−体重とした以外は、試
験例２と同様に試験を行った。結果を表３に示す。

表３に見られるように、ペプチドSer−Gln−Gln−Gln
−Gln−Pro−Pro−Pheの投与によって、投与後１〜５時
間にわたって顕著な血圧降下作用が認められた。

（発明の効果）請求項１及び２記載の本発明によれば、安価な蛋白質
原料である小麦グルテニンを原料とする等して、優れた
効果を有る血圧効果剤が提供される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 38/00,35/78 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】小麦グルテニンのキモトリプシン加水分解
物であって、分子量が10,000以下の画分の含有量が固形
分基準で30重量％以上である加水分解物を有効成分とす
る血圧降下剤。
【請求項２】ペプチドSer−Gln−Gln−Gln−Gln−Pro−
Pro−Phe及びその塩類を有効成分とする血圧降下剤。