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JP2944223B2 - ウイルス生産に有用なヒト胎児肺線維芽細胞二倍体細胞株およびこれを用いた水痘帯状疱疹ウイルスの製造方法 - Google Patents

ウイルス生産に有用なヒト胎児肺線維芽細胞二倍体細胞株およびこれを用いた水痘帯状疱疹ウイルスの製造方法

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JP2944223B2
JP2944223B2 JP9529211A JP52921197A JP2944223B2 JP 2944223 B2 JP2944223 B2 JP 2944223B2 JP 9529211 A JP9529211 A JP 9529211A JP 52921197 A JP52921197 A JP 52921197A JP 2944223 B2 JP2944223 B2 JP 2944223B2
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vzv
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、ウイルス生産に有用な新規なヒト胎児肺線
維芽細胞二倍体細胞株、およびこれを宿主細胞として用
いて水痘帯状疱疹ウイルスを製造する方法に関する。
従来技術の説明 ウイルスは、麻疹、風疹、お多福風邪、水痘、流行性
出血熱、日本脳炎、小児麻痺、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ
型肝炎および天然痘を引き起こす。これらのウイルス性
疾病は、病原性ウイルスを不活性化、またはその毒性を
弱化させて製造したワクチンを接種して予防することが
できる。
一般に、これらのウイルスワクチンを生産するための
宿主細胞として鶏卵の受精卵、新生ラットの脳細胞およ
び哺乳動物の二倍体細胞が用いられてきた。鶏卵の受精
卵または新生ラットの脳細胞をウイルス宿主細胞として
用いると、生産費用を減らすことはできるが、これらは
ウイルスに対する感受性が低く、精製過程が複雑である
だけでなく、異種蛋白質が含まれることによって副作用
を生じさせるという問題がある。これに対して、ヒトに
由来する正常二倍体細胞を用いると、異種蛋白質による
副作用を減らすことができるためウイルスワクチン生産
により適している。
代表的なヒト二倍体細胞としては、MRC−５細胞株（A
TCC,CCL 171）、WI−38細胞株（ATCC,CCL 75）およびHE
L299細胞株（ATCC,CCL 137）があり、より具体的には、
MRC−５細胞株は14週齢の雄胎児の肺組織に由来し［Pro
c.Symp.Human Diploid Cells,Yugoslavia.Acad.SCI.Art
s.Zagreb.,pp43−45（1970）；およびNature（Londo
n）,227、pp168−170（1970）参照］;WI−38細胞は３ヶ
月齢の雌胎児の肺組織に由来し［Exp.Cell Res.、25;p5
85（1961）、およびAm.J.Hyg.、75、p240（1962）参
照］；また、HEL299細胞株は雄胎児の肺組織から得た
（W.D.Peterson,Jr.et al.,Proc.Soc.Exp.Biol.Med.、1
28、p772（1968）］。
水痘は、水痘帯状疱疹ウイルス（Varicella Zoster V
irus;VZV）による感染によって子供、老人および免疫性
が弱くなった患者において発病し、非常に伝染性の強い
疾患である。VZVはヒト羊膜細胞、ヒト甲状腺細胞、ヒ
ト肺細胞、ヒト子宮癌細胞およびサル腎臓細胞のような
種々の細胞で培養することができると報告されている
［E.V.Meurisse et al.,J.Microbiol.、2,317（1969）
参照］。また、米国特許第3,985,615号は、モルモット
１次胎児細胞株（Guinea Pig Primary Embryonic Tissu
e Cell;GPEC）でオカ（Oka）ウイルスを多段階の弱毒化
過程を経た後、VZVワクチンを生産する方法を開示して
おり；米国特許第4,000,256号は、VZVを含むヒト胎児線
維芽細胞WI−38細胞株を10なしい80回連続継代培養する
ことによってVZVワクチンを製造する方法を記述してお
り；米国特許第4,000,317号は、WI−38細胞株で温度変
化に敏感な変種水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）の製造を
報告しており；米国特許第5,360,736号は、MRC−５細胞
株でVZVワクチンを製造する改良方法を開示している。
しかし、GPEC細胞ではVZVの収率がとても低い。ま
た、WI−38およびMRC−５細胞株は継代数が多くなるの
でVZV生産能力が減少する。したがって、前記方法は、V
ZVワクチンの大量生産に適用することができない。さら
に、VZVは、細胞依存性があり、細胞無含有環境（cell
−free environment）では不活性化する傾向がある。
発明の要約 したがって、本発明の目的は、種々のウイルス、特に
VZVに対する感受性が高く、VZVの高収率生産に適した新
規なヒト二倍体細胞株を提供することである。
本発明の他の目的は、VZVを生産する改善された方法
を提供することである。
本発明の一つの態様によれば、ヒト胎児肺細胞から由
来された線維芽細胞二倍体細胞株LBHEL（KCTC 0127BP）
が提供される。
本発明の他の態様によれば、さらに、 （ａ）ヒト胎児肺線維芽細胞二倍体細胞株LBHEL（KCTC
0127BP）を培養器で培養することによって培養されたLB
HEL細胞を得る段階； （ｂ）前記培養されたLBHEL細胞をVZVで感染させてVZV
−感染細胞を得る段階； （ｃ）前記VZV−感染細胞を培養し、採取する段階； （ｄ）前記採取された細胞を破砕して細胞均質物を得る
段階；および （ｅ）前記細胞均質物を遠心分離して細胞無含有VZV（c
ell−free VZV）を含む上澄液を得る段階 を含む細胞無含有水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）を生産
する方法が提供される。
図面の簡単な説明 本発明の前記および他の目的および特徴は、明細書に
添付した図面を参照した下記の説明から明らかになるで
あろう。
図１−１および図１−２は本発明のLBHEL細胞株の核
型を示し； 図２は、本発明のLBHEL細胞株（◆）、MRC−５細胞株
（■）およびHEL299細胞株（△）の成長曲線を示し； 図３は、５％または10％のFBSを含有するDME培地で本
発明のLBHEL細胞株、MRC−５細胞株およびHEL299細胞株
の培養後に計数された細胞数を示し； 図４は、感染多重度（MOI）による本発明のLBHEL細胞
株での細胞無含有VZVのプラーク形成単位（PFU）の変化
を示し； 図５は、細胞変性効果（CPE）による本発明のLBHEL細
胞株中の細胞無含有VZVのプラーク形成単位（PFU）の変
化を示し； 図６は、非感染LBHEL細胞含量による細胞無含有VZVの
プラーク形成単位（PFU）の変化を示し； 図７は、細胞培養器表面の細胞飽和度による飽和無含
有VZVのPFUの変化を示す。
発明の詳細な説明 本明細書に用いられた用語“細胞無含有ウイルス（ce
ll−free virus）”はその宿主細胞と結合していないウ
イルスを示す。
ヒト胎児肺線維芽細胞二倍体細胞に由来する本発明の
新規なLBHEL細胞株は下記の通り製造することができ
る。
まず、図１−１および図１−２の核型を有する20週齢
の雌胎児からヒト胎児肺組織の一部を得る。前記組織を
細かく切り刻み、リン酸塩緩衝液（pH7.1〜7.3）で洗浄
する。次いで、前記組織を36〜37℃の温度範囲および５
％CO2の雰囲気下でコラゲナーゼ（collagenase）および
ディスパーゼ（dispase）を含有するリン酸塩緩衝液
（“分解酵素液”）中で５〜10分間培養する。生成した
培養液を30xg〜50xgで遠心分離し、沈殿した肺組織を前
記分解酵素液で36〜37℃の温度範囲で20〜40分間培養す
る。次いで、生成した培養液の上澄液を５％（v/v）ウ
シ胎児血清（fetal bovine serum:FBS）で中和する。結
合組織だけが残るまで前記分解酵素液処理を３〜４回繰
り返す。
次いで、組織抽出物を集め、４〜５℃で１時間放置し
て細胞凝集物を沈殿させ、単一細胞を含む上澄液を分離
し、800〜100rpmで１〜２分間遠心分離する。沈澱した
細胞を集め、５〜10％（v/v）FBSを含有するダルベコ修
正イーグル培地（DME培地）に分散して５〜10x106細胞/
mlの濃度となるようにした後、36〜37℃でT80フラスコ
中で培養器表面が細胞で覆われるまで培養する。トリプ
シンで処理した後、培養細胞を連続継代培養する。
前記のように製造した本発明のLBHEL細胞株は、特許
手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条
約に基づいて寄託番号KCTC 127BPで韓国遺伝子銀行（Ko
rean Collection for Type Cultures:KCTC;住所：大韓
民国大田広域市305−600、儒城郵便局私書箱115、韓国
科学技術研究院生命工学研究所）に1994年11月９日付で
寄託した。
本発明のLBHEL細胞株は染色体異常試験によって正常
二倍体細胞株であることが確認され、動物試験において
腫瘍を生じさせない。また、MRC−５およびHEL299のよ
うな従来の細胞株より成長速度が著しく早く、種々のウ
イルスに対してより高い感受性を示す。さらに、30継代
以上を超えても同じ成長速度を維持する。
本発明の新規なLBHEL細胞株は下記の特性を有する。
（１）細胞成長速度 MRC−５標準細胞株に比べてLHHEL細胞株は約２倍位早
く成長し、固定された表面積においてこれから製造され
る細胞の数はMRC−５の場合より1.7倍以上多い。
（２）プラーク確認 本発明のLBHEL細胞株をウイルスの力価を決定するた
めの宿主細胞として用いる場合、形成されたプラークを
容易に識別することができ、MRC−５の場合に比べて再
現性の高いデータを得ることができる。
（３）FBS含量 MRC−５、WI−38およびHEL299を含む従来のヒト二倍
体正常細胞株は一般的に10％（v/v）のFBSを含有する培
地で培養されが、本発明のLBHEL細胞株はFBS含量がたっ
た５％の培地でもよく成長する。FBSが高価であるためL
BHEL細胞株は生産費用を減らすのに少なからず有利であ
る。
（４）VZVに対する感受性 表Ｉに示すように、本発明のLBHEL細胞株は、MRC−
５、HEL299およびLu18を含む従来のヒト二倍体正常細胞
株と比較すると、VZVに対する著しく高い感受性を示
す。これは前述した従来のヒト二倍体正常細胞株の場合
よりLBHEL細胞株でVZVがより効果的に増殖することを示
す。
本発明のLBHEL細胞株は、麻疹、風疹、Ａ型肝炎およ
び水痘の製造に宿主細胞として用いることができる。
細胞外VZVは、本発明のLBHEL細胞株を用いて次のよう
に製造し得る。
（１）細胞培養 本発明のLBHEL細胞株は、５〜10％（v/v）のFBSを含
有するDME培地（Gibco BRL,U.S.A.,Cat.No.12800−08
2）で36〜37℃の温度範囲で５％CO2雰囲気下で単層培養
され得る。
単層での細胞増殖比率は1:5〜1:10の範囲であり得
る。培養器表面の70〜80％が細胞で飽和するまで細胞培
養を行うことが好ましく、次いで、培養された細胞は連
続継代培養をする。
（２）VZVの増殖 VZVは、1:15〜1:20範囲の感染多重度（MOI）で前記の
ように製造したLBHEL細胞株に接種し得る。接種後１〜
1.5時間後、感染細胞は、２〜５％のFBSを含有するDME
培地で36〜37℃の温度範囲で５％CO2雰囲気下に40〜48
時間培養することができる。感染細胞は、顕微鏡（x10
0）で観察したとき、細胞変性効果が50％以下、好まし
くは30〜45％であるとき収穫する。特に、細胞培養液を
リン酸塩緩衝液（pH7.2）で洗浄し、0.01〜0.03％EDTA
で処理する。その結果得られた物を５分間培養し、遠心
分離してVZV−感染細胞を収穫する。
（３）細胞破砕および細胞無含有VZVの分離 前記のようにして収穫したVZV−感染細胞は超音波お
よびガラスビーズのような任意の通常の方法に従って破
砕することができる。次いで、遠心分離および濾過のよ
うな任意の通常の方法を用いて細胞残骸物を除いて細胞
無含有VZVを含む上澄液を得ることができる。
VZVの生存可能性はその細胞依存性のため宿主細胞の
外に出た場合ほとんど０である。したがって、ウイルス
で感染させた宿主細胞を破砕する場合、ウイルスは不活
性化しやすくなる。前述の米国特許第4,000,256号に
は、細胞破砕の際、リン酸塩緩衝液にスクロースを約7.
5重量％加えることによってVZVを保護しようとする試み
が記載されている。超音波によってウイルス感染細胞を
破砕する場合、ウイルス自体もしばしば破壊され、不活
性化した。しかし、スクロース・クッション（sucrose
cushion）はこのようなウイルスの破壊および不活性化
を防止できない。
超音波処理中に起る細胞無含有ウイルスの収率の減少
は、超音波段階以前に非感染LBHEL細胞を感染細胞と混
合することによって効果的に防止することができる。本
発明の実施では、非感染LBHEL細胞を1:4〜3:2の比率で
感染細胞と混合する。
しかし、前記方法は、しばしば大量の細胞残骸物を生
成し、これによって濾過および遠心分離のような精製段
階において細胞無含有ウイルスが多少失われる。この問
題を解決するために、本発明では、遠心分離のような精
製段階でスクロース溶液を用いる。スクロースの濃度は
15重量％以上、好ましくは15〜45重量％以上である。
前記で得られたVZVは、ウイルスを弱毒化するか、ウ
イルス性抗原を加えるなどの通常の方法によってワクチ
ンの製造に用いることができる。
本発明は、実施例および試験例によってさらに詳細に
例示されるが、これは本発明の範囲を制限するものでは
ない。
市販のVZV、バリセラ・ビケン・オカ（Varicella Bik
en Oka）ウイルス（ATCC VR−795、Lot no.6w）が実施
例で用いられた。本発明以前および以後において、ATCC
から提供されたMRC−５、HEL299およびLu18継代培養物
は継代数１との番号を付した。
本発明において用いられた用語および略語は特に言及
しない限り通常の意味を有する。たとえば、“℃”はセ
ルシウス（celsius）温度；“M"はモル濃度；“v/v"は
体積／体積；“w/v"は重量／体積を示す。
実施例1:LBHEL細胞株の製造 図１の核型を有する20週齢の雌胎児から少量のヒト胎
児肺組織を採取した。前記組織を細かく切り刻み（2mm
x 2mm）、リン酸塩緩衝液（pH7.2）で３回洗浄した。生
成した組織の断片を36℃で130単位/mlのコラゲナーゼお
よび1mg/mlのディスパーゼを含有するリン酸塩緩衝液
（pH7.2）（“分解酵素液”）中で５分間培養した。培
養液を200xgで２分間遠心分離して肺組織を沈澱させ
た。肺組織を集め、前記分解酵素液中で37℃で30分間培
養した。前記培養液を50xgで２分間遠心分離し、上澄液
を５％（v/v）ウシ胎児血清（fetal bovine serum;FB
S）で中和した。結合組織のみが残るまで前記分解酵素
液の処理を４回繰り返した。
次いで、上澄液を集めて５％FBSで中和し、４℃で１
時間放置して細胞凝集物を沈澱させ、単一細胞を含有す
る上澄液を分離して1000rpmで２分間遠心分離した。沈
澱した細胞を集め、10％FBSを含有するDME培地（Gibco
BRL,U.S.A.Cat.No.12800−082）に分散し、3 x 105細胞
/mlの濃度となるようにした後、T80フラスコ中で培養器
表面が細胞で覆われるまで37℃で培養した。0.25％トリ
プシン溶液で処理した後、培養された細胞を連続継代培
養した。
実施例2:LBHEL細胞株でのVZV生産 （段階１）細胞培養 実施例１で製造したLBHEL細胞株を５％FBSを含有する
DME培地（Cibco BRL,U.S.A.Cat.No.12800−082）中で37
℃で５％CO2雰囲気下に単層培養した。単層培養液での
細胞増殖比率は1:4に調整した。培養器表面の85〜95％
が細胞で飽和するまで細胞培養を行い、培養された細胞
を連続継代培養した。
（段階２）VZVの増殖 バリセラ・ビケン・オカ・ウイルス（ATCC VR−795 l
ot no.6w）を1:20の感染多重度（MOI）で培養されたLBH
EL細胞株に接種した。ウイルス活性は100,000〜200,000
プラーク形成単位（PFC）/T80フラスコ（2ml）であっ
た。VZV−感染細胞を37℃で５％CO2雰囲気下に培養し
た。顕微鏡で観察した細胞変性効果が25〜45％であると
き、培養液をリン酸塩緩衝液（pH7.2）で３回洗浄した
後、0.02％EDTAで処理した。結果物を５分間培養し、感
染細胞を集め、1000rpmで約３分間遠心分離して感染細
胞を収穫する。
（段階３）細胞破砕 感染細胞をSPGE破砕液（pH7.2、7.5％（w/v）スクロ
ース、0.0038Mリン酸カリウム（１塩基）、0.0072Mリン
酸カリウム（２塩基）、0.0049Mグルタミン酸ナトリウ
ム、0.2％EDTA）中で５〜10 x 106細胞/1mlの濃度で懸
濁した。氷浴で超音波破砕機（Sonifier,Branson450）
を使ってマイクロティップ（microtip、T80フラスコ）
またはホルン（horn、多層培養板CF−10）で原形質が残
らないまで細胞を破砕した。
（段階４）細胞外VZVの分離 得られたものを1000rpmで10分間遠心分離してVZVを含
む上澄液を得た。
試験例1:LBHEL細胞株の正常性 １）染色体異常の試験 実施例１で製造されたLBHEL細胞株を染色体多倍数性
試験、二数性試験、形態異常試験、染色体切断試験およ
び核型分析試験を含む染色体異常試験を行った。すべて
の試験は大韓民国保社部によって公示された“生物学的
製剤基準および試験方法（1992）”に従ってMRC−５細
胞株を陰性対照群として用いて行われた。図１−１およ
び図１−２は本発明のLBHEL細胞株の核型を示す。
２）腫瘍形成試験 実施例１で製造されたLBHEL細胞株およびACTTから提
供されたHela細胞株2 x 106細胞を各々５匹以上の細胞
性免疫を持たないヌードマウス（nude mouse）に皮下注
射した。注射28日後、LBHELが注射されたマウスでは腫
瘍が観察されなかったが、Hela細胞株が注射されたすべ
てのマウスでは腫瘍が形成された。
これらの試験結果は本発明のヒト胎児肺線維芽細胞LB
HEL細胞株が正常の二倍体細胞であることを明らかにす
る。
試験例2:細胞株の成長曲線比較 本発明のLBHEL細胞株（KCTC 0127BP）の成長曲線を下
記のように成長時間に対する細胞数を測定して作成し、
MRC−５（ATCC CCL171）およびHEL299（ATCC CCL137）
細胞株の成長曲線と比較した。
実施例２の段階１の手順に従って、試験細胞株の各々
をT80フラスコで単層培養した。細胞をリン酸塩緩衝液
（pH7.2）で３回洗浄し、0.25％トリプシンを処理し
た。約２分後、細胞を収穫し、1000rpmで約３分間遠心
分離した。
沈澱した細胞をDME培地（５％FBS:LBHEL、10％FBS:MR
C−５およびHEL299）に懸濁し、2 x 106細胞／フラスコ
の量でT80フラスコに加えた。細胞を５％CO2雰囲気下、
37℃で培養した。
24時間間隔で細胞数を次のように測定した。まず、培
養液をリン酸塩緩衝液（pH7.2）で３回洗浄し、0.25％
トリプシンで処理した。約２分後、細胞を収穫して1000
rpmで約３分間遠心分離した。沈澱した細胞をDME培地に
懸濁し、ヘモサイトメーター（hemocytometer,Hausser
Scientific）で点滴した。100倍率の顕微鏡で細胞数を
計数した。
図２は、本発明のLBHEL細胞株（◆）、MRC−５細胞株
（■）およびHEL299細胞株（△）の培養時間に対して計
数された細胞株を示す。図２に示したように、LBHEL細
胞株はMRC−５およびHEL299細胞株と比べてログ期（log
phase）が一日先に現われ、LBHEL細胞株の数はMRC−５
およびHEL299細胞株に比べて約1.5倍位大きい。
図３は、５％または10％FBSを含有するDME培地中で４
日間培養した後の本発明のLBHEL細胞株、MRC−５細胞株
およびHEL299細胞株の細胞数を示す。図３に示したよう
に、５％FBSを含有するDME培地で培養されたLBHEL細胞
の数は10％FBSで得られた結果とほとんど同じである。
一方、MRC−５およびHEL299細胞株は５％FBSを含有する
培地では十分成長できない。これは本発明のLBHEL細胞
株が他の従来の細胞株より一層経済的であることを示
す。
また、本発明のLBHEL細胞株は20継代以上でもよく成
長した。これは多層培養板（multitray unit,Nunc 1643
27,6000cm2）でもよく成長し、これはLBHEL細胞株がウ
イルスの大量生産に用いられ得ることを示す。
試験例3:VZVに対する感受性 実施例２の段階１の手順に従って、表IIに示した各々
の細胞株を直径60mmのペトリ皿で単層培養し、培養細胞
をリン酸塩緩衝液（pH7.2）で３回洗浄した。
バリセラ・ビケン・オカ・ウイルスを３％FBSを含むD
ME培地で連続希釈した。希釈したワクチンを細胞に0.1m
l/皿ずつ接種した。これにDME（３％FBS）培地を加え、
37℃、５、％CO2雰囲気下、37℃で７日間培養した。
形成されたプラーク数を40倍率の顕微鏡で計数し、プ
ラーク形成単位（Plaque forming unit;PFU）を計算し
て各細胞株のウイルスに対する感受性を評価した。結果
は表IIに示す。
前記表IIに示したように、LBHEL細胞株はMRC−５、HE
L299およびLu18細胞株より約10倍程度高い感受性を示し
た。したがって、本発明のLBHEL細胞株はVZVワクチン生
産に有用である。
試験例4:細胞株でのVZVの増殖 （段階１）VZV接種および感染細胞の収穫 実施例２の段階１の手順に従って表IIIに示した各々
の細胞株をT80フラスコに単層培養し、培養した細胞株
をリン酸塩緩衝液（pH7.2）で３回洗浄した。
バリセラ・ビケン・オカ・ウイルスが感染MRC−５細
胞を前記細胞に接種してウイルス活性が100,000〜200,0
00PFC/フラスコ（2ml）となるようにした。
１時間後、これに３％FBSを含有するDME培地を加え、
５％CO2雰囲気下、37℃で約48時間培養した。細胞変性
効果が25〜45％程度に達したとき、培養物をリン酸塩緩
衝液（pH7.2）で３回洗浄し、0.02％EDTAで処理した。
得られたものを５分間培養し、感染細胞を集め、1000rp
mで約３分間遠心分離して感染細胞を収穫した。
（段階２）ウイルスの分離 前記で得られた感染細胞を、SPGE破砕溶液（pH7.2、
7.5％（w/v）スクロース、0.0038Mリン酸カリウム（１
塩基）、0.0072Mリン酸カリウム（２塩基）、0.0049Mグ
ルタミン酸ナトリウム、0.2％EDTA）で５〜10 x 106細
胞/1mlの濃度となるまで加えた。
氷浴中で、超音波破砕機（Sonifier;Branson450）を
使ってT80フラスコの場合マイクロティップ（microti
p）を、多層培養板（CF−10）の場合ホルン（horn）で
原形細胞がほとんど残らない程度まで破砕した。得られ
たものを４℃で1000rpmで10分間遠心分離してウイルス
を含有する上澄液を得た。
（段階３）ウイルス活性 実施例２の段階１の手順に従って、LBHEL細胞株をペ
トリ皿（直径60mm）で単層培養し、培養した細胞をリン
酸塩緩衝液（pH7.2）で３回洗浄した。感染細胞の活性
を測定するために、段階１で収穫された感染細胞を0.3m
l/皿の量で前記単層培養された細胞に加えた。また、細
胞無含有ウイルスの活性を測定するため、段階２で得ら
れたウイルスを含有する上澄液を４倍容量のDME培地で
連続的に希釈し、0.1ml/皿の量で前記単層培養された細
胞に加えた。培養物を５％CO2雰囲気下、37℃で60分間
維持してウイルスを細胞に吸着させた。次いで、これに
３％FBSを含有するDME培地を加え、前記と同様の条件下
で培養を続けた。
６日後、形成されたプラーク数を40倍率の顕微鏡で計
数し、これからPFCおよびPFUを計算して感染細胞の活性
および細胞無含有ウイルス活性を各々決定した。結果は
表IIIに示す。
表IIIに示したように、本発明のLBHELでのVZV活性が
他の従来の細胞株でより高かった。特に、他の従来の細
胞株のPFCはLBHEL細胞の約50％であり、PFUはLBHEL細胞
の30％にも及ばなかった。
試験例5:感染多重度（MOI）による影響 試験例４の段階１の手順に従って、LBHEL宿主細胞を
単層培養し、バリセラ・ビケン・オカ・ウイルス−感染
MRC−５細胞を各々1:10、1:15、1:20、1:25および1:50
のMOIで接種した。試験例４の段階２および段階３の手
順に従ってPFU値を測定した。
図４は、本発明のLBHEL細胞株において感染多重度（M
OI）による細胞無含有VZVの活性（PFU）の変化を示す。
図４に示したように、MOIが1:20であるとき、細胞無含
有ウイルスの収率がもっとも高かった。
試験例6:PFUに対する細胞変性効果（CPE）の影響 試験例４の段階１の手順に従って、LBHEL細胞を単層
培養してバリセラ・オカ・ウイルス−感染MRC−５細胞
を1:20のMOIで接種した。細胞変性効果が各々12.5、2
5、37.5、62.5、75および87.5％であるとき、感染細胞
を収穫した。収穫した細胞を超音波で破砕し、試験例４
の段階２および３の手順に従ってPFU値を測定した。
図５は、本発明のLBHEL細胞株において種々の細胞変
性効果（CPE）による細胞無含有VZVの活性（PFU）を示
したグラフである。CPEが50％以下であるとき、細胞無
含有ウイルスの収率が高かった。
試験例7:非感染細胞の安定化効果 試験例４の段階１の手順に従ってVZV−感染LBHEL細胞
を製造し、LBHEL細胞の全体数を基準として０％、20
％、40％、60％および80％の量で非感染細胞を前記感染
細胞に加えた。混合物を超音波で破砕し、試験例４の段
階２および３の手順に従ってPFU値を測定した。
図６は、非感染LBHEL細胞含量による細胞無含有VZV活
性（PFU）の変化を示す。図６に示したように、非感染
細胞が存在する場合、細胞無含有ウイルスの活性が増加
し、非感染細胞の含量がLBHEL細胞の全体数を基準とし
て20〜60％であるとき最大になる。
また、多層培養板（CF−10）を用いて非感染細胞の混
合効果を評価し、結果を表IVに示す。
表IVに示したように、非感染細胞はウイルスの大量生
産の際に細胞無含有VZVを安定化するのに効果的に使用
することができる。
試験例8:スクロースの効果 試験例４の段階１および２の手順に従って感染LBHEL
細胞を製造し、超音波破砕した。
表Ｖに示すようなスクロース溶液（pH7.2、15−37.5
％（w/v）スクロース、0.0038Mリン酸カリウム（１塩
基）、0.0072Mリン酸カリウム（２塩基）、0.0049Mグル
タミン酸ナトリウム、0.2％EDTA）の不存在下または存
在下で前記で得られたものを1000rpmで10分間遠心分離
し、ウイルスを含有した上澄液を集めた。
次いで、試験例４の段階３の方法に従ってPFU値を測
定した。結果は表Ｖに示す。
表Ｖに示したように、15〜37.5％（w/v）の濃度範囲
でスクロース溶液を加えることによってVZVが安定化さ
れた。
試験例9:細胞培養器表面の細胞飽和度の影響 実施例２の段階１に従って、T80フラスコ中で培養器
総表面積の50、75または100％を覆うまで本発明のLBHEL
細胞株を単層培養した。VZV−感染バリセラ・オカ菌株
を前記細胞に接種し、５％CO2の雰囲気下、37℃で48時
間培養した。次いで、試験例４の段階２および３の手順
に従ってPFU値を測定した。
図７は細胞培養器表面の飽和度による細胞外VZVの活
性（PFU）の変化を示し、ここから本発明のLBHEL細胞株
は100％単層をなす場合より75％単層をなす場合にVZVに
対する感受性が高くなることが分かる。
前記結果は本発明のLBHEL細胞株が水痘、麻疹、風
疹、お多福風邪、流行性出血熱、Ｂ型日本脳炎、小児麻
痺、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎および天然痘に対す
るワクチン製造に有用であることを示す。
本発明の実施形態を記述して説明したが、添付した特
許請求範囲によって定義される本発明の範囲内で本発明
を多様に変形および変化させ得ることは当然である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 パク，ジュ・ホン 大韓民国305−345デジョン、ユソン− グ、シンソン−ドン、デリム・デゥレ・ アパートメント101−1303

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】細胞成長速度がMRC−５細胞株に比べて早
    く、VZVに対する感受性がMRC−５、HEL299およびLu18細
    胞株に比べて高いヒト胎児肺線維芽細胞二倍体細胞株LB
    HEL（KCTC 0127BP）。
  2. 【請求項２】（ａ）ヒト胎児肺線維芽細胞二倍体細胞株
    LBHEL（KCTC 0127BP）を培養器で培養し、培養LBHEL細
    胞を得る段階； （ｂ）前記培養LBHEL細胞をVZVで感染させ、VZV−感染
    細胞を得る段階； （ｃ）前記VZV−感染細胞を培養し、収穫する段階； （ｄ）前記収穫された細胞を破砕し、細胞均質物を得る
    段階；および （ｅ）前記細胞均質物を遠心分離して細胞無含有VZV（c
    ell−free VZV）を含む上澄液を得る段階 を含む細胞無含有水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）を生産
    する方法。
  3. 【請求項３】段階（ａ）において前記LBHEL細胞株を、
    ３〜10％（v/v）ウシ胎児血清を含有するダルベコ修正
    イーグル培地（DME培地）で単層培養する、請求項２記
    載の方法。
  4. 【請求項４】段階（ａ）の単層培養において前記培養細
    胞が培養器表面の70〜80％を占める、請求項３記載の方
    法。
  5. 【請求項５】培養器表面の70〜80％が培養LBHEL細胞で
    覆われたとき、段階（ａ）で得られた培養LBHEL細胞を
    1:5〜1:10の細胞増殖比率で継代培養する段階をさらに
    含む、請求項３記載の方法。
  6. 【請求項６】段階（ｂ）の培養LBHEL細胞に対するVZVの
    接種比率（MOI）が1:15〜1:20である、請求項２記載の
    方法。
  7. 【請求項７】段階（ｃ）において細胞変性効果（Cytopa
    thic effect、CPE）が50％以下であるとき培養LBHEL細
    胞株を収穫する、請求項２記載の方法。
  8. 【請求項８】細胞変性効果（CPE）が30〜45％であると
    き培養LBHEL細胞を収穫する、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】非感染LBHEL細胞を段階（ｃ）で収穫したV
    ZV−感染LBHEL細胞に加える段階を段階（ｄ）以前にさ
    らに含む、請求項２記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記非感染LBHEL細胞をLBHEL細胞の総細
    胞数を基準として20〜60％範囲で加える、請求項９記載
    の方法。
  11. 【請求項１１】段階（ｄ）で得られた細胞均質物に15％
    （w/v）以上の濃度のスクロース溶液を加える段階を段
    階（ｅ）以前にさらに含む、請求項２記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記スクロース溶液の濃度が15〜45％
    （w/v）である、請求項11記載の方法。
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