CN1180377A - 适于生产病毒的人胚肺成纤维细胞二倍体细胞株和利用该细胞株生产水痘带状疱疹病的方法 - Google Patents

Abstract

人胚肺成纤维细胞二倍体细胞株LBHEL(KCTC0127BP)对水痘带状疱疹病毒(VZV)高度易感。无细胞水痘带状疱疹病毒(VZV)是由下列步骤产生的:(a)在培养容器中培养权利要求1的人胚肺成纤维细胞二倍体细胞株LBHEL(KCTC0127BP);(b)用VZV感染培养的LBHEL细胞得到VZV感染的细胞;(c)培养和收获VZV感染的细胞;(d)破碎收获的细胞以获得细胞匀浆;和(e)离心细胞匀浆以获得含有无细胞VZV的上清液。

Description

适于生产病毒的人胚肺成纤维细胞二倍体细胞株和利用 该细胞株生产水痘带状疱疹病毒的方法

发明领域

本发明涉及适于生产病毒的新的人胚肺成纤维细胞二倍体细胞株和利用该细胞株作为宿主细胞制备水痘带状疱疹病毒的方法。

现有技术的描述

病毒引起各种疾病如麻疹，风疹，流行性腮腺炎，水痘，流行性出血热，流行性乙型脑炎，婴儿脊髓灰质炎，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎和天花。用从灭活的或减毒的致病病毒制备的疫苗接种可以防止这些病毒疾病。

通常，可以利用成胚胎的鸡蛋，幼鼠的脑细胞和哺乳动物的二倍体细胞作为生产这些病毒疫苗的宿主细胞。虽然可以利用成胚胎的鸡蛋或幼鼠的脑细胞作为宿主细胞以便减少生产费用，但由于对病毒的低敏感性，复杂的纯化过程和由于存在外源蛋白污染引起的副作用，它们不具备优势。相反，使用起源于人的正常二倍体细胞能减少外源蛋白引起的副作用，所以，制备病毒疫苗时它们更优选。

代表性的二倍体细胞包括MRC-5细胞株(ATCC CCL 171)，WI-38细胞株(ATCC CCL75)，和HEL 299细胞株(ATCC CCL 137)：具体地说，MRC-5细胞株起源于14周龄的雄性胚胎的肺组织[Proc.Sym p.Human Diploid Cells，Yugoslavia，Acad.SCI.Arts.Zagreb.，pp43-45(1970)；和自然(伦敦)，227，pp168-170(1970)]；WI-38细胞起源于3个月大的雌性胚胎的肺组织[Exp.Cell Res.，25，p585(1961)；和Am.J.Hyg.，75，p240(1962)]；HEL299细胞株从雄性胚胎的肺组织得到[W.D.Peterson，Jr.et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，128，p772(1968)]。

水痘是高度接触传染的疾病，它使免疫力降低的儿童，成年人由于感染了水痘带状疱疹病毒(VZV)而遭受折磨。已经有报道，VZV可以在各种细胞如人羊膜细胞，人甲状腺细胞，人肺细胞，人宫颈癌细胞和猴肾细胞中培养[E.V.Meurisse et al.，J.Microbiol.，2，317(1969)]。另外，美国专利3,985,615中公开了通过在豚鼠初级胚胎组织细胞(GPEC)中多次减毒0ka病毒生产VZV疫苗；美国专利4,000,256叙述了将含有VZV病毒的人胚成纤维细胞WI-38细胞株传代培养10-80次来生产VZV疫苗；美国专利5,360,736公开了在MRC-5细胞株中生产VZV疫苗的改进方法。

然而，GPEC细胞中VZV的产量是非常低的。另外，WI-38和MRC-5细胞株有高的传代数，从而减低了它们生产VZV的能力。所以，上述方法不能用于大规模生产VZV疫苗。另外，由于其依赖细胞的特性，VZV在无细胞环境趋于失活。

发明概述

因此，本发明的一个目的是提供对于各种病毒特别是VZV具有高敏感性并提供高产量的VZV的新的人二倍体细胞株。

本发明的另一个目的是提供改进的生产VZV的方法。

根据本发明的一个方面，提供了起源于人胚肺细胞的成纤维细胞二倍体细胞株LBHEL(KCTC 0127BP)。

根据本发明的另一个方面，提供了生产无细胞水痘带状疱疹病毒(VZV)的方法，该方法包括如下步骤：

(a)在培养容器中培养人胚肺成纤维细胞二倍体细胞株LBHEL(KCTC 0127BP)得到培养的LBHEL细胞；

(b)用VZV感染培养的LBHEL细胞得到VZV感染的细胞；

(c)培养和收获VZV感染的细胞；

(d)破碎收获的细胞以得到细胞匀浆；和

(e)离心细胞匀浆以得到含有无细胞VZV的上清液。

附图的简要说明

配合附图，根据下面的说明本发明的上面的和其它的目的和特征将变得明了：

图1-1和1-2示出本发明的LBHEL细胞株的核型；

图2示出了本发明的LBHEL细胞株(◆)，MRC-5细胞株(■)和HEL299细胞株(△)的生长曲线；

图3示出了在含有5％或10％FBS的DME培养基中培养本发明的LBHEL细胞株，MRC-5细胞株和HEL299细胞株后的细胞计数；

图4表示了本发明的LBHEL细胞株中的无细胞VZV的噬斑形成单位(PFU)随感染复数的变化；

图5表示在本发明的LBHEL细胞株中的无细胞VZV的PFU对细胞病变效应的依赖性；

图6证明了作为未感染的LBHEL细胞株含量的函数的无细胞VZV的PFU的变化；和

图7说明了无细胞VZV的PFU随着细胞培养容器表面的细胞覆盖程度而变化的方式。

发明的详细说明

如本文所用，术语“无细胞病毒”指未与其宿主细胞结合的病毒。

可以按如下所述生产源于人胚肺成纤维细胞二倍体细胞的本发明的新的LBHEL细胞株：

首先，从具有图1-1和1-2的核型的20周龄的雌性胚胎中取出一小部分人胚肺组织。将组织切成小片并用磷酸盐缓冲液(pH7.1-7.3)洗涤。然后在含有胶原酶和分散酶的磷酸盐缓冲液(“酶溶液”)中在36-37℃，5％CO₂气氛下培养该组织5-10分钟。在30-50xg离心得到的培养物并在上述酶溶液中在36-37℃培养沉淀的肺组织20-40分钟。然后用5％(v/v)胎牛血清(FBS)中和得到的培养物的上清液。重复该酶处理3或4次直到只留下结缔组织。

然后，将合并的细胞提取液在4-5℃静置约1小时沉淀细胞聚合体，分离得到的含有单个细胞的上清液并在800-100rpm离心1-2分钟。收集沉淀的细胞，分散于含有5-10％(v/v)FBS的Dulbecco改良的eagle培养基(DME培养基)中直到浓度为5-10×10⁶个细胞/ml，然后在T80培养瓶中在36-37℃培养直到细胞覆盖培养容器的表面。在用胰蛋白酶处理后，对培养细胞进行连续传代培养。

根据用于专利程序目的的国际承认的微生物保藏布达佩斯条约的条款，将如上产生的本发明的LBHEL细胞株于1994年11月9日保存于韩国典型培养物保藏中心(KCTC)(地址：GERI，KIST，P.O.BOX 115，Yusong，Taejon，305-600，韩国)，登记号为KCTC0127BP。

通过染色体异常试验证明本发明的LBHEL细胞株是正常的二倍体细胞株并且在动物试验中它不会导致产生肿瘤。另外，它比常规细胞株如MRC-5和HEL299生长得更快并对各种病毒具有增强的敏感性。此外，甚至在30代传代培养后它仍保持同样的生长速度。

本发明的新的LBHEL细胞株具有下述特征：

(1)细胞生长速度

与MRC-5标准细胞株相比，LBHEL细胞株的生长约快2倍，并且在固定表面面积上产生的细胞的数目比MRC-5多1.7倍或更多倍。

(2)噬斑鉴定

当利用本发明的LBHEL细胞株作宿主细胞测定病毒的效价时，可以容易地鉴定形成的噬斑并且它的再生能力比MRC-5高。

(3)FBS含量

通常在含有10％(v/v)FBS的培养基中培养常规人二倍体正常细胞株如MRC-5，WI-38和HEL299，而本发明的LBHEL细胞株在只具有5％的FBS含量的培养基中生长良好。由于FBS是昂贵的，所以LBHEL细胞株在降低生产成本方面具有相当大的优点。

(4)对VZV的易感性

如表1所示，本发明的LBHEL细胞株比常规人二倍体正常细胞株如MRC-5，HEL299和Lu18具有更高的对VZV的敏感性。这表明VZV在本发明的LBHEL细胞株中比在上面提到的常规人二倍体正常细胞株中更容易生长。

                  表1

细胞株(传代数)	易感性(PFU/小管)
		LBHEL(+16)	3625
MRC-5(+8)	325
		HEL299(+10)	300
Lu18(+8)	375

在生产各种病毒如麻疹，风疹，甲型肝炎和水痘疫苗时可以利用本发明的LBHEL细胞株作宿主细胞。

通过利用本发明的LBHEL细胞株可以如下所述生产无细胞VZV：

(1)细胞培养

在含有5-10％(v/v)FBS的DME培养基(Gibco BRL，U.S.A。，Cat.No.12800-082)中，于36-37℃，5％CO₂气氛下培养本发明的LBHEL细胞株；从而形成单层。

在单层培养物中细胞分离比例(split ratio)可在1∶5-1∶10范围。优选地，将细胞培养直到细胞覆盖培养容器表面的70-80％，然后对培养细胞进行连续的传代培养。

(2)VZV的繁殖

可以将VZV以1∶15-1∶20的感染复数(MOI)接种到如上制备的培养的LBHEL细胞株中。接种1-1.5小时后，可以在含有2至5％FBS的DME培养基中，于36至37℃，5％CO₂气氛下将感染细胞培养40-48小时。当显微镜(100x)下观察到的细胞病变效应达50％或更少，优选地30-45％时收获感染细胞。具体地说，用磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤细胞培养物并用0.01-0.03％的EDTA处理。培养得到的培养物5分钟，然后离心收集VZV感染的细胞。

(3)破碎细胞和分离无细胞VZV

通过常规方法如超声波处理和玻璃珠可以破碎如上收集的VZV感染的细胞。然后，通过任何常规方法离心和过滤除去细胞碎片，得到含有无细胞VZV的上清液。

由于依赖细胞的特性，当离开宿主细胞时VZV的成活力接近零。因此，当将病毒感染的宿主细胞破碎时病毒容易失活。前面提到的美国专利4,000,256叙述了试图通过在磷酸盐缓冲液中加入约7.5％(重)的蔗糖而在细胞破碎步骤中保护VZV的计划。当用超声波破碎病毒感染的细胞时，病毒本身经常被粉碎和失活，从而减少了无细胞病毒的产量。但是，使用蔗糖缓冲物可以防止病毒发生这样的粉碎和失活。

在超声波步骤之前，将未感染的LBHEL细胞与感染细胞混合可以有效地防止超声波处理过程中无细胞病毒的产量的减少。在实施本发明时，将未感染的LBHEL细胞与感染的LBHEL细胞以1∶4-3∶2的比例混合。

但是，上述方法经常产生大量细胞碎片，从而在纯化步骤如过滤和离心过程中引起一些无细胞病毒的损失。为了解决这一问题，本发明在纯化步骤如离心过程中使用了蔗糖溶液。蔗糖浓度可以是15wt％或更多，优选为15-45wt％。

通过如减弱病毒或加入病毒抗原等常规方法制备疫苗时可以利用上面得到的VZV。

在实施例和试验实施例中进一步说明和解释了本发明，但是它们不限制本发明的范围。

在实施例中使用了商业购买得到的VZV，Varicella Biken Oka病毒(ATCC VR-795，Lot no.6w)。在本文中，从ATCC得到的MRC-5，HEL299和Lu18传代培养物编号为传代数1。

除非特别定义，本文所用的术语和简写具有通常的意义，例如：“C”指摄氏温度；“M”指摩尔数；“v/v”指体积/体积；和“w/v”指重量/体积。实施例1：制备LBHEL细胞株

从具有图1核型的20周龄雌性胚胎中取出一小部分人胚肺组织。将该组织切成小片(2mm×2mm)，并用磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤3次。在含有130单位/ml的胶原酶和1mg/ml的分散酶的磷酸盐缓冲液(pH7.2)(“酶溶液”)中，于36℃培养得到的组织薄片5分钟。在200×g离心该培养物2分钟以便沉淀肺组织。收集该组织，于37℃，在上述酶溶液中培养30分钟。以50xg离心培养物2分钟并加入5％胎牛血清(FBS)中和上清液。重复这一酶处理4次直到只留下结缔组织。

用5％FBS中和合并的上清液，在4℃静置1小时沉淀细胞聚合体，并以1000rpm离心含有单个细胞的上清液2分钟。收集沉淀细胞，分散于含有10％FBS的DME培养基(Gibco BRL，U.S.A.，Cat.No.12800-082)中至浓度为3×10⁵个细胞/ml，然后在37℃，在T培养瓶中培养直到细胞覆盖了培养瓶表面。在用0.25％胰蛋白酶溶液处理后，对细胞进行连续的传代培养。实施例2：在LBHEL细胞株中生产VZV病毒(步骤1)细胞培养

在含有5％FBS的DME培养基(Gibco BRL，U.S.A.，Cat.No.12800-082)中，在37℃，5％CO₂气氛下培养实施例1制备的LBHEL细胞株以形成单层。将单层培养物中细胞的分离比例调节成1∶4。进行培养直到细胞覆盖了培养容器的85-95％的表面，然后对培养细胞进行连续的传代培养。(步骤2)VZV的繁殖

将Varicella Biken Oka病毒(ATCC VR-795 lot No.6W)以MOI为1∶20接种到培养的LBHEL细胞株中。病毒活性是100,000-200,000个噬斑形成细胞(PFC)/T80培养瓶(2ml)。在37℃，5％CO₂气氛下培养VZV感染细胞。当显微镜下观察到的细胞病变效应达到25-45％时，用磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤培养物3次，然后用0.02％EDTA处理。培养得到物5分钟，以1000rpm离心约3分钟收集感染细胞。(步骤3)破碎细胞

将感染的LBHEL细胞悬浮于SPGE破碎溶液(pH7.2，7.5％(w/v)蔗糖，0.0038M磷酸钾(一元碱的)，0.0072M磷酸钾(二元碱的)，0,0049M谷氨酸钠，0.2％EDTA)直到浓度为5-10×10⁶个细胞/ml。用小尖头(T80培养瓶)或角状物(复盘装置，CF-10)在冰浴上通过使用超声波器(Sonifier，Branson450)破碎细胞直到没有原生质体留下。(步骤4)分离无细胞VZV

在1000rpm离心得到物10分钟以获得含有VZV的上清液。试验实施例1：LBHEL细胞株的正常状态

1)染色体异常试验

对实施例1制备的LBHEL细胞株进行染色体异常试验包括染色体多倍体试验，二倍体试验，形状异常试验，染色体切割试验和核型分析试验。根据韩国公共健康部出版的“生物学配方标准和其试验方法(1992)”，将MRC-5细胞株作阴性对照进行所有试验。图1-1和1-2显示了本发明的LBHEL细胞株的核型。

2)肿瘤发生试验

将实施例1制备的LBHEL细胞株和ATCC提供的人宫颈癌(Hela)细胞株的各约2×10⁶个细胞皮下注射到5个或更多个患有细胞免疫缺陷的裸鼠中。在注射的28天后，在注射LBHEL的鼠中没有观察到肿瘤，而在接受人宫颈癌细胞株注射的所有鼠中都形成了肿瘤。

这些实验结果证明本发明的人胚肺成纤维细胞LBHEL细胞株是正常的二倍体细胞。

试验实施例2：比较细胞株的生长曲线

通过如下测定相对于生长时间的细胞数制备本发明的LBHEL细胞株(KCTC 0127BP)的生长曲线，然后与MRC-5(ATCC CCL171)和HEL299(ATCC CCL 137)细胞株的生长曲线比较。

根据实施例2的方法(步骤1)在T80培养瓶中培养每种试验细胞株以形成单层。用磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤细胞3次并用0.25％胰蛋白酶处理。约2分钟后，以1000rpm离心3分钟收集细胞。

将沉淀细胞悬浮于含有5％FBS(LBHEL)或10％FBS(MRC-5和HEL299)的DME培养基中，然后以2×10⁶个细胞/培养瓶的量加入T80培养瓶中。在37℃，5％CO₂气氛下培养细胞。

以24小时的间隔，如下测定细胞数：首先，用磷酸盐缓冲液溶液(pH7.2)洗涤培养物3次和用0.25％胰蛋白酶处理。在约2分钟后，以1000rpm离心约3分钟收集细胞。将沉淀细胞悬浮于DME培养基中并点在细胞计数器(Hausser Scientific)上。用显微镜(100X)计数细胞数。

图2示出了对于本发明的LBHEL细胞株(◆)，MRC-5细胞株(■)和HEL299细胞株(△)，相对于培养时间的细胞数。如图2所示，LBHEL细胞株与MRC-5和HEL299细胞株相比早一天显示对数期，并且LBHEL细胞株的细胞数比MRC-5和HEL299大约多1.5倍。

图3描述了在含有5％或10％FBS的DME培养基中培养4天后本发明的LBHEL细胞株，MRC-5细胞株和HEL299细胞株的细胞数。如图3所示，培养在含有5％FBS的培养基中的LBHEL细胞数接近于在含有10％FBS的培养基中得到的细胞数。相反，在含有5％FBS的培养基中MRC-5或HEL299细胞株生长不良。这表明本发明的LBHEL比其它常规细胞株更具有经济优势。

另外，在20代传代培养后，本发明的LBHEL细胞株仍生长良好。在复盘装置(Nunc 164327，6000cm²)中它的生长也好，这表明LBHEL细胞株可用于大规模的病毒生产。

试验实施例3：对VZV的易感性

根据实施例2的程序(步骤1)将表2中显示的各个细胞株在直径为60m培养平皿中培养形成单层，用磷酸盐缓冲液(pH7.2)将培养的细胞洗涤三次。

用含有3％FBS的DME培养基连续稀释Varicella Biken Oka病毒。以每个平皿0.1毫升的量将稀释的疫苗接种到细胞。向其中加入含有3％FBS的DME培养基，将得到的培养物于37℃，5％CO₂气氛中培养7天。

用显微镜(40X)对此形成的噬斑计数，计算出PFU以便对各个细胞株对该病毒的易感性进行评估。结果显示于表2。

                 表2

细胞株(传代数)	PFU/小管
		LBHEL(+16)	3625
LBHEL(+20)	3000
		LBHEL(+24)	2625
MRC-5(+8)	325
		MRC-5(+10)	350
MRC-5(+12)	125
		HEL299(+8)	325
HEL299(+10)	300
		HEL299(12)	125
Lu18(+8)	375
		Lu18(10)	325
Lu18(+12)	350

如表2所示，LBHEL细胞株的易感性比MRC-5，HEL299和Lu18细胞株大约高10倍。因此，本发明的LBHEL细胞株可用于生产VZV疫苗。

试验实施例4：VZV在细胞株中的繁殖

(步骤1)：VZV的接种和感染细胞的收获

根据实施例2的程序(步骤1)，将显示于表3中的各个细胞株培养于T80培养瓶中形成单层，用磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗涤培养的细胞三次。

以每瓶(2ml)100,000到200,000PFC的病毒活性将Varicella Biken Oka病毒感染的MRC-5细胞接种到这些细胞。

1小时后，向其中加入含有3％FBS的DME培养基，于37℃，5％CO₂气氛中将得到的培养物培养约48小时。当细胞病变效应达到25-45％时，用磷酸盐缓冲液(pH7.2)将培养物洗涤3次，然后用0.02％EDTA处理。得到的培养物继续培养5分钟，收集感染细胞，并以1000rpm离心约3分钟以收获被感染的细胞。

(步骤2)：病毒的分离

将上述获得的感染细胞加入到SPGE破碎溶液(pH7.2，7.5％(w/v)蔗糖，0.0038M磷酸钾(一元碱)，0.0072M磷酸钾(二元碱)，0.0049M谷氨酸钠，0.2％EDTA)中至浓度为5-10×10⁶个细胞/ml。

使用超声波处理器(Sonifier，Branson 450)，通过用于T80培养瓶的小尖头或用于复盘装置的角状物，在冰浴中破碎细胞，直到没有留下完整细胞。将得到的裂解液于4℃和1000rpm离心10分钟，获得含有该病毒的上清液。

(步骤3)病毒的活性

根据实施例2程序的(步骤1)在直径为60mm的培养平皿中培养LBHEL细胞株，用磷酸盐缓冲液(pH7.2)将培养的细胞洗涤3次。将在(步骤1)收获的感染细胞以0.3ml/平皿的量加入到单层培养细胞中以测定感染细胞的活性。另外，用4倍体积的DME培养基将(步骤2)获得的含有病毒的上清液连续稀释，并以0.1ml/平皿的量加入到单层培养细胞，以测定无细胞病毒的活性。通过在37℃，5％CO₂气氛中培养60分钟使病毒吸附到细胞。然后，向其中加入含3％FBS的DME培养基，以如上所述相同条件继续培养。

6天之后，用显微镜(40X)对形成的噬斑计数，由此计算出PFC和PFU，以分别测定感染细胞和无细胞病毒的活性。结果显示于表3中。

                       表3

细胞株(传代数)	PFC/T80培养瓶	PFU/T80培养瓶
			LBHEL(+16)	2,900,000	345,000
LBHEL(+22)	2,800,000	412,500
			LBHEL(+26)	2,600,000	180,000
MRC-5(+8)	1,910,000	105,000
			MRC-5(+11)	250,000	60,000
MRC-5(+14)	1,300,000	7,500
			HEL299(+8)	1,960,000	122,500
HEL299(+11)	1,725,000	127,500
			HEL299(14)	1,375,000	120,000
Lu18(+8)	1,635,000	120,000
			Lu18(12)	1,265,000	62,500

如表3所示，在本发明的LBHEL中VZV的活性高于在其他常规细胞株中的活性。具体地说，其他常规细胞株的PFCs约为LBHEL细胞的PFC的50％，而它们的PFU最高约为LBHEL细胞的PFU的30％。

试验实施例5：感染复数(MOI)的影响

根据试验实施例4的程序(步骤1)，制备LBHEL宿主细胞的单层培养物并分别以1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶50的MOI用Varicella Biken Oka病毒感染的MRC-5细胞接种。根据试验实施例4(步骤2和3)的程序测定PFU值。

图4表示本发明的LBHEL细胞株中无细胞VZV的活性(PFU)随MOI的变化。如图4所示。当MOI是1∶20时，无细胞病毒的产量最高。

试验实施例6：细胞病变效应对PFU的影响

根据试验实施例4(步骤1)的程序，制备LBHEL细胞的单层培养物并以1∶20的MOI用Varicella Biken Oka病毒感染的MRC-5细胞接种。当细胞病变效应是12.5，25，37.5，50，62.5，75和87.5％时收获感染细胞。通过超声处理破碎收获的细胞，根据试验实施例4(步骤2和3)的步骤测定PFU值。

图5显示在处于各种细胞病变效应的本发明的LBHEL细胞株中无细胞VZV的活性(PFU)。当细胞病变效应低于50％时无细胞病毒的产量是高的。

试验实施例7：未感染细胞的稳定化作用

根据试验实施例4(步骤1)的程序制备VZV感染的LBHEL细胞，以占LBHEL细胞总数的0％，20％，40％，60％和80％的量向感染的LBHEL细胞中加入未感染的LBHEL细胞。将混合物进行超声波处理，并且根据试验实施例4(步骤2和3)的程序测定PFU的值。

图6表示无细胞VZV的活性(PFU)变化与未感染LBHEL细胞含量的函数关系。如图6所示，当存在未感染细胞时无细胞病毒的活性增高，当未感染细胞含量在LBHEL细胞总数中为20-60％时活性达到最高。

另外，利用复盘装置(CF-10)对混合未感染细胞的作用进行评估，结果显示于表4。

                      表4

感染细胞(％)	未感染细胞(％)	PFU/CF10
			100	0	36,270,000
80	20	45,330,000
			60	40	49,130,000
40	60	21,500,000
			20	80	8,310,000

如表4所示，可将未感染细胞有效地用于在大规模生产病毒时稳定无细胞VZV。

试验实施例8：蔗糖的作用

根据试验实施例4(步骤1和2)所述，制备感染的LBHEL细胞并通过超声处理破碎。

如表5所述，在没有或有蔗糖溶液(pH7.2，15-37.5％(w/v)蔗糖，0.0038M磷酸钾(一元碱)，0.0072M磷酸钾(二元碱)，0.0049M谷氨酸钠，0.2％EDTA)存在时，以1000rpm将得到的混合物离心10分钟，收集含有病毒的上清液。然后，根据试验实施例4(步骤3)的程序测定PFU的值。结果显示于表5中。

                             表·5

样品	蔗糖％(w/v)	蔗糖的体积(ml)	PFU
				T80培养瓶	-	-	441,250
T80培养瓶	15	1	483,750
				T80培养瓶	22.5	1	491,340
T80培养瓶	30	1	509,120
				T80培养瓶	37.5	1	512,500
CF10	-	-	37,320,000
				CF10	15	80	39,860,000

如表5所示，加入15-37.5％(w/v)浓度的蔗糖溶液使VZV稳定。

试验实施例9：培养容器表面细胞饱和度的作用

根据实施例2(步骤1)所述，在T80培养瓶中培养本发明的LBHEL细胞株，以形成覆盖50，75或100％培养容器总表面的单层。将VZV感染的Varicella Oka株接种到所述细胞株，并在37℃，5％CO₂气氛中培养48小时。然后，根据试验实施例4(步骤2和3)的程序测量PFU值。

图7显示了无细胞VZV的活性(PFU)随细胞培养容器表面细胞饱和程度的变化，其中本发明的LBHEL细胞株在75％单层覆盖时其对VZV的易感性高于在100％单层覆盖时的易感性。

上述结果显示本发明的LBHEL细胞株可用于生产抗水痘，麻疹，风疹，腮腺炎，流行性出血热，流行性乙型脑炎，婴儿脊髓灰质炎，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎和天花的各种病毒疫苗。

前面已经描述并阐明了本发明的实施方案，在不脱离本发明精神情况下对此进行各种改变和修饰是显而易见的，本发明仅受权利要求书的范围的限制。

Claims (12)

1、一种人胚肺成纤维细胞二倍体细胞株LBHEL(KCTC 0127BP)。

2、用于生产无细胞水痘带状疱疹病毒(VZV)的方法，包括下列步骤：

(a)在培养容器中培养人胚肺成纤维细胞二倍体细胞株LBHEL(KCTC 0127BP)以得到培养的LBHEL细胞；

(b)用VZV感染培养的LBHEL细胞得到VZV感染的细胞；

(c)培养和收获VZV感染的细胞；

(d)破碎收获的细胞，获得细胞匀浆；和

(e)离心细胞匀浆，获得含有无细胞VZV的上清液。

3、根据权利要求2所述的方法，其中利用含有3-10％(v/v)胎牛血清的Dulbecco′s改良的Eagl ′s培养基在步骤(a)中培养LBHEL细胞株以形成单层。

4、根据权利要求3所述的方法，其中在步骤(a)的单层培养物中培养的LBHEL细胞覆盖70-80％的培养容器的表面。

5、根据权利要求3所述的方法，进一步包括当培养容器的70-80％表面被培养的LBHEL细胞覆盖时，将步骤(a)中获得的培养的LBHEL细胞以1∶5-1∶10的分离比例加入到传代培养物中的步骤。

6、根据权利要求2所述的方法，其中步骤(b)中加入到培养的LBHEL细胞中的VZV感染复数为1∶15-1∶20。

7、根据权利要求2所述的方法，其中当细胞病变效应是50％或更低时在步骤(c)中收获培养的LBHEL细胞。

8、根据权利要求7所述的方法，其中当细胞病变效应为30-45％时收获培养的LBHEL细胞。

9、根据权利要求2所述的方法，进一步包括在步骤(d)之前向步骤(c)中收获的VZV感染的LBHEL细胞加入未感染的LBHEL细胞的步骤。

10、根据权利要求9所述的方法，其中以占LBHEL细胞总数20-60％的量加入未感染的LBHEL细胞。

11、根据权利要求2所述的方法，进一步包括在步骤(e)之前向步骤(d)中获得的细胞匀浆加入浓度为15％(w/v)或更高浓度的蔗糖溶液的步骤。

12、根据权利要求11所述的方法，其中蔗糖溶液的浓度为15-45％(w/v)。

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