JP2887329B2 - 局所用フィブリノーゲン複合体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本申請は1991年９月５日提出の米国特許第755,156号
の一部継続出願である。

発明の背景 技術分野 本発明はフィブリノーゲン組成物及びその製法に関
し、この組成物はトロンビン及びカルシウムと共用して
傷口閉鎖に用いることが出来る。

背景技術 フィブリノーゲン（線維素原）を局所の止血達成に用
いる試みは既に20世紀初頭に検討され、当時止血用のフ
ィブリノーゲン貼布が脳手術の際に用いられた。後に、
血清とトロンビンの混合物が皮膚移植及び結核治療の
際、空洞内注射に用いられた。しかしながら、これら初
期の試みには２つの主要な欠点があった。即ち、フィブ
リノーゲンの源泉が血清であるためフィブリノーゲンの
濃度が低く、不十分な強度のフィブリン膜しか出来ない
結果となり、またフィブリン膜が比較的速やかに崩壊す
るような通常の生理学的フィブリン溶解過程を阻止する
ことが不可能であった。

効果的なフィブリンシーラント（線維素密封剤）を開
発するこれまでの試みもまた、これら製剤は大抵高レベ
ルのプラスミノーゲンを含むので、フィブリンシールの
時期尚早の崩壊を防止するため抗繊維素溶解試薬を別に
付加する必要があるという事実が足枷となっていた。抗
繊維素溶解試薬は普通、ヒト以外の起源由来であるの
で、患者がこのような異種タンパク質に、特にこれら試
薬の多重適用に際して、異常反応を示す可能性も無視出
来ない。ローズ（Rose）ら（米国特許4,627,879）は、
必ずしも抗繊維素溶解性付加剤の存在を必要としないフ
ィブリン接着剤（ばんそうこう）の作製を報告している
が、これに関連して開示されている組成物にはこれら以
前のフィブリンシール組成物のも一つの主要な欠点、即
ち、血清中にＢ型肝炎ウイルスあるいはヒト免疫不全ウ
イルスのような感染病原体の存在する可能性に対する処
置はされていない。その結果、Roseの文献はそこに記載
されている組成物は、集積貯蔵された血清に混在してい
るかも知れない感染病原体の伝送をさけるために単一の
献血者由来であることを要求している。

このような次第で集積貯蔵された血清由来で、抗繊維
素溶解性化合物、動物タンパク質、及びウイルスのよう
な感染病原体を含まないフィブリンシーラントに対する
多大の要請がある。本発明はこのような組成物を提供す
ることによってこれらの要請に取り組むものである。

発明の開示 本発明は集積貯蔵血清が、血液凝固第VIII因子を相当
に除去された場合でさえ、トロンビン及びカルシウムと
反応するフィブリノーゲン標品を生成し、止血促進に用
い得るフィブリンシーラントを作製するように処理出来
るという発見に基づいている。

詳しくは、本発明は、本質的に血液凝固第VIII因子及
びプラスミノーゲンを含まないことに加え、抗繊維素溶
解性試薬を用いる必要がなく、脂質外套膜を持つウイル
スのような感染病原体の存在を除去するための処理をさ
れたフィブリノーゲン組成物を提供する。この組成物の
もう一つの利点は、この組成物中に存在するタンパク質
の殆ど全てがヒト由来、即ち、ヒトDNA配列によってコ
ードされていることである。

本発明の組成物は、一時的な体内存在を通じて、医療
効果を得るのに十分な期間存続し、変性に際して宿主人
体への障害を本質的に示さず、しかも止血を促進する機
械的強度を与えるマトリックスを提供する。

図面の簡単な説明 図１は局所用フィブリノーゲン複合体調製の概略図で
ある。

図２はフィブリン重合体形成に対するカルシウムイオ
ン濃度の影響を説明する図である。

フィブリノーゲン（90mg/ml）及びトロンビン（500U/
ml）を混合し10分間放置した。レーンA:分子量マーカ
ー；レーンB;対照フィブリノーゲン； レーンC:0mM C
a⁺⁺; レーンD:1mM Ca⁺⁺; レーンE:3mM Ca⁺⁺ レー
ンF:6mM Ca⁺⁺; レーンG:10mM Ca⁺⁺; レーンH:20mM
Ca⁺⁺; レーンI:30mM Ca⁺⁺; レーンJ:分子量マーカ
ー。

図３はフィブリン重合体形成に対するカルシウムイオ
ン濃度の影響を説明する図である。

フィブリノーゲン（130mg/ml）及びトロンビン（500U
/ml）を混合し10分間放置した。レーンA:分子量マーカ
ー； レーンB:対照フィブリノーゲン； レーンC:0mM
Ca⁺⁺; レーンD:1mM Ca⁺⁺; レーンE:3mM Ca⁺⁺;
レーンF:6mM Ca⁺⁺; レーンG:10mM Ca⁺⁺;レーンH:20m
M Ca⁺⁺; レーンI:30mM Ca⁺⁺; レーンJ:分子量マー
カー。

図４はフィブリン重合速度を説明する図である。

フィブリノーゲン（130mg/ml）及びトロンビン（500U
/ml）をカルシウムイオン（40mM CaCl₂）の存在下に混
合した。レーンA:分子量マーカー； レーンB:0分；
レーンC:1分； レーンD:3分；レーンE:5分； レーン
F:10分； レーンG:30分； レーンH:60分； レーンI:
2時間； レーンJ:4時間； レーンK:8時間； レーン
L:24時間； レーンM:フィブリノーゲン及びトロンビン
対照； レーンN:分子量マーカー。

実施例 我々は、従来の技術を大きく改良した線維素密封剤を
生産するため組成物を考案した。これら、居所的線維素
原複合体（Topical Fibrinogen Complex;TFC）と呼ばれ
る組成物は、非ヒト蛋白質及び想定されるウイルス性病
原体非存在下で使用することが可能であり、これによ
り、その部位で長く存続して止血を誘導するため利用価
値が高い。

本発明の組成物は、線維素原の多くを除去していな
い、いかわる血液由来の分画を初発物質としても生産す
ることができる。この組成物を生産するのに好適な血液
分画は、血漿、寒冷沈殿物、及び第VIII因子を除去した
低温（cold）沈澱物である。一般的に、工程には、第VI
II因子（F VIII）及び線維素原が豊富な寒冷沈殿物の生
成が含まれる。次いで、低温沈殿を行ない、線維素原に
富み、F VIIIを非常に微量しか含まない沈殿物を得る。
低温沈殿工程中にカルシウムイオン源を添加すると、フ
ィブロネクチンと同時に線維素原の沈殿が促進され、低
温沈殿物中におけるこれらの物質の濃度が上昇する。組
成物中の線維素原濃度を上昇させるために、ポリエチレ
ングリコール（PEG）を添加することもできる。

さらに特定すると、本発明の方法は、典型的には凍結
血漿を初発物質に使用する。例１に記載する通り、制御
された環境下で凍結血漿を融解した後、寒冷沈殿物を回
収する。

低温沈殿物を生成する前に、血液分画を処理して寒冷
沈殿物を作製する。この寒冷沈殿物は、血液分画（例え
ば、血漿）が凍結し、その後約＋６℃を上回らない温度
に暖めることにより作製することができる。寒冷沈殿物
は、約20℃〜35℃の蒸留水中で融解する。塩化カルシウ
ムを約１μＭ〜約1000μＭの濃度で添加する。線維素原
の沈殿を促進するためには、塩化カルシウムを約40μＭ
の濃度で添加し、pHを6.8±0.3に調整することが好まし
い。

次いで、融解した寒冷沈殿物を混合しながら10℃±２
℃に冷却し、低温沈殿物を呼ばれる沈殿物を生成する。
遠心分離（例えば、5600g〜7200g）により沈殿物を溶液
から分離する。沈殿物は−60℃（または必要であればそ
れ以下）で保存することができる。好適な実施例におい
て、局所的線維素原複合体を取得するための初発分画
は、まず初めに寒冷沈殿を行ない、次いで低温沈殿を行
なうことにより作製する。

その結果として得られた繊維素原に富む沈殿物を、混
合しながらpHを7.2±0.1に調整して緩衝液に溶解する。
低温沈殿物は、例えば、PPACK（Ｄ−Phe−Ｌ−pro−Ｌ
−arg−クロロメチルケトン）、ヘパリンコファクターI
I、またはヒルディンのようなプロテアーゼインヒビタ
の再懸濁して、混入している恐れのあるトロンビンを阻
害することが好ましい。約0.75μＭ〜約1.75μＭのPPAC
Kがトロンビンインヒビタとして最も好適である。トロ
ンビンインヒビタは、PEG沈殿及びDEAEカラム工程にお
いて除去される。トロンビンに対する他のプロテアーゼ
インヒビタ及びその有効な濃度は、当業者に既知のもの
である。

低温沈殿物懸濁物を、例えば、リン酸カルシウム塩
（第三）のような塩を含有する緩衝液溶液中に移す。リ
ン酸カルシウムは、線維素原に富む溶液からプロトロン
ビンを除去する。これにより、プロトロンビンがトロン
ビンに変換されるのを最小限に抑制する。もしこのよう
な変換反応が生じると、線維素原はフィブリンに変換さ
れてしまう。リン酸カルシウムは遠心分離及び／または
濾過により、工程から除去する。プロトロンビンを除去
するその他の技術は、ムラノ（Murano,Prothorombin an
d Other Vitamin K Proteins,Vol.II,Seegers and Wal
z,eds.,CRC Press,Inc.Boca Raton,Fl.,1986）；ヘイス
テックら（Heystek,et al.,Vox Sang.,25:113,1973）；
バノウリフら（Banowcliffe,et al.,Vox Sang.,25:426,
1973）；チャンドラら（Chandra,et al.,Vox Sang.,41:
257,1981）;andカノスら（Chanas,et al.,US.4,465,62
3）、本発明の参考文献に取り入れられている、に記載
されている。

好適な実施例においては、溶解した低温沈殿物を約23
〜27℃に暖め、リジン−セファーロース4Bと接触させ
る。線維素原に富む分画はほとんどリジン−セファロー
ス4Bに結合しないため、アフィニティ吸着剤により分離
される。溶解した、プロトロンビン非含有低温沈殿物
を、例えばセファロースのような固体マトリクスに結合
したリジンと接触させ、低温沈殿物に残存しているプラ
スミノゲンを吸着させる。プラスミノゲンは、線維素原
及びフィブリス分子を破壊することのできる溶解性チモ
ーゲンであるため、プラスミノゲンを除去することは重
要である。次いで、リジンマトリクスに結合しなかった
物質を、好ましくはポリエチレングリコール（PEG）を
添加することにより濃縮する。次いで、ポリエチレング
リコール（3000〜8000MW）を最終濃度約３％〜約７％、
好ましくは４％（W/W）で添加する。遠心分離を行なう
前にPEG沈殿物を溶解し、pHを8.6±0.1に調整する。濃
縮工程にPEGを使用する場合、PEGの重量範囲はヒトに毒
性を示さない範囲内にしなければならない。代わりの実
施例において、PEG沈殿工程をリジンマトリクスによる
吸着の前に行なうこともできる。

濾過後、ウイルスを不活性化するのに有効な量の作用
薬（例えば、典型的に、Ｂ型肝炎ウイルス、HIV、HTLV
のようなウイルスの脂質エンベロープを破壊するデター
ジェント）を用いて組成物を処理する。「ウイルスを不
活性化するのに有効な量」とは、存在すると思われる事
実上すべてのビリオンを不活性化するのに十分な濃度の
デタージェント（洗浄剤）を意味する。もちろん、デタ
ージェント濃度は、組成物がフィブリン密封剤を適切に
生成するよう機能する能力を著しく阻害するものであっ
てはならない。有用なデタージェントは、陰イオン性、
陽イオン性及び非イオン性デタージェントのような既知
のものから選択することができる。例えば硫酸化オキシ
エチル化アルキルフェノール（Triton W−30及びTriton
X−100）、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム（N
acconol NR）、２−スルホエチルオレイン酸ナトリウム
（lgepon A）、コリン酸ナトリウム、デオキシコロン酸
ナトリウム、ドデシルスルホン酸ナトリウム、塩酸ドデ
シルジメチルベンジルアンモニウム（Triton K−60）、
オキシエチラートアミン（Ethomeen）、Ｎ−ドデシルア
ミノエタンスルホン酸、酸化エチレン−酸化プロピレン
縮合物（Pluronic copolymers）、ポリオキシエチラー
ト誘導体（polyoxyethylated derivatives）のエステル
（Tween 80及びPolysorbate 80）、ポリオキシエチレン
脂肪酸アルコールエーテル（Brij 35）、nonidet P−40
およびLubrox PXのような硫酸化アルコール及びナトリ
ウム酸塩などである。蛋白質濃度が0.6％である好適な
実施例においては、Triton X−100（最終濃度1.0％）と
Polysorbate−80（最終濃度0.3％）を三（Ｎ−ブチル）
リン酸（TNBP）（最終濃度0.3％）のような有機溶媒を
用いて混合しウイルスを不活性化する。さらに、カオト
ロピズム性のデタージェントを用いてウイルスを不活性
化することもできる。これらの作用薬は線維素原の活性
を大きく阻害することはない。

本発明の好適な実施例の実施にあたって使用する有機
溶媒及びデタージェントの濃度は、処理する組成物及び
選択した溶媒またはデタージェントに依存する。アルキ
ルリン酸は、処理する混合物の約0.10mg/ml〜10mg/mlの
濃度で使用され、約0.1mg/ml〜約10mg/mlであることが
好ましい。デタージェントまたは湿潤薬（wetting agen
t）は有機溶媒とウイルスの接着性を促進するため使用
するものなので、これらの量は決定的なものではない。
有用な非イオン性物質の大部分に対して湿潤薬は、処理
する水性混合物中の脂肪性物質の量に依存して、水性混
合物の約0.001％〜10％、好ましくは約0.01％〜約２
％、の範囲内で使用することができる。溶媒及びデター
ジェントの量も相互に依存している。

従来の技術において、蛋白質の構造及び活性を維持し
たまま、脂肪性エンベロープを有するウイルスを破壊
し、不活性化するために、濃縮された蛋白質溶液に有機
溶媒及びデタージェントを添加することが記載されてい
る（例えば、米国特許第4,540,573号、本発明の参考文
献に取り入れられている。）Tween 80またはTriton X−
100のいずれかを含有する有機溶媒は、蛋白質の活性に
悪影響を及ぼすことなく、蛋白質濃縮液中に存在するウ
イルスを効果的に死滅させる試薬であることが示されて
いる。しかし、濃縮液からのデタージェント混合物の除
去は困難であるとされてきたため、このような溶媒−デ
タージェント混合物の使用は従来的には避けられてき
た。そのため、コリン酸ナトリウムやデオキシコリン酸
ナトリウムのような、他のデタージェントがより一般的
に使用されてきた。これらのデタージェントは、例え
ば、セファデクスＧ−25のようなゲル排除クロマトグラ
フィにより組成物から除去することができる。いずれの
場合も、所定のデタージェントを選択するにあたって
は、線維素原の凝塊形成能を阻害して不活性化するよう
なデタージェントを避けることが重要である。

好適な実施例においては、線維素原組成物から溶媒／
デタージェントを除去するマトリクスとしてDEAEジエチ
ルアミノエチルセルロース（DE 52）を使用する。非結
合物質とデタージェントを洗い流した後、DE 52セルロ
ースに結合した線維素原を0.3M NaClを用いて溶出す
る。溶媒／デタージェントの除去に使用される他のイオ
ン交換マトリクスには、特にQAE（第四アミン）誘導
体、ecteola（エピクロロヒドリントリエタノールアミ
ン）、TEAE（トリエチルアミノエチル）誘導体、及びAE
（アミノエチル）マトリクスを含むがこれに限定されな
いポリサルフェーティドアガロースなどのセルロース及
びアガロースが含まれる。これらの種々のイオン交換マ
トリクスに対する吸着及び溶出の特定のパラメータは、
当業者に既知のものであり、不要な実験を行なうことな
く容易に確認することができる。

イオン交換樹脂から溶出した後、溶解度を向上させる
ために線維素原組成物にヒト血清アルブミン（HSA）及
びPolysorbate−80のような賦形剤を添加する。HSA、ヒ
ドロキシエチルスターチ、デキストランまたはこれらの
組み合わせを添加することにより最終産物の安定性が向
上する。HSA及びPolysorbate−80を溶出液中の蛋白質1m
gあたりそれぞれ80mg及び15mg添加することが好まし
い。

好適な実施例において、本発明の線維素原組成物は、
治療的目的で使用するため再構成する場合、限外濾過、
凍結乾燥または他の従来法により最終的に濃縮する前に
組成を整える。典型的には、組成を整えた後、バルクを
元の溶出量の約20％〜約50％に濃縮し、次いで、濃縮前
の溶出量まで希釈する。次いで、滅菌処理及び凍結乾燥
の前にバルクを最終蛋白質濃度４±1g％（w/v）に濃縮
する。

好適な実施例においては、NaClを除去するが蛋白質分
子は残存させる大きさの分子から成る膜を使用した限外
濾過により濃縮を行なう。この濾過は分画分子量30,000
の膜を使用することが最も好ましい。本発明のTFC組成
物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥前の容量は通常、凍結
乾燥物を使用する際に再懸濁する容量よりも大きい。こ
のため、限外濾過を含む上述の好適な方法で組成物を調
整した場合、凍結乾燥後再構成した時の容量は、凍結乾
燥前の容量の約33％である。いずれの場合においても、
再構成された凍結乾燥物中のNaCl濃度は約0.1M〜約0.2M
であることが好ましい。

必要に応じて、本発明の組成物は蛋白質性薬物同様、
非蛋白質性薬物を含有するよう変更することもできる。
「非蛋白質性薬物」とは、例えば、マイトマイシンＣ、
ダウノルビシン及びビンブラスチンのような薬物に分類
される化合物を指す。

本発明の線維素原組成物に添加することのできる蛋白
質性薬物には、イムノモジュレータ及び他の生物学的応
答モディファイヤが含まれる。「生物学的応答モディフ
ァイヤ」とは、例えば、細菌細胞の細胞溶解または表皮
細胞の増殖などの特定の治療効果を増強することにより
免疫応答または組織の増殖、再生などの生物学的応答を
調整する物質を指す。応答モディファイヤの例にはリン
ホカインなどの物質が含まれる。リンホカインの例に
は、腫瘍壊死因子、インターロイキン、リンホトキシ
ン、マクロファージ活性化因子、増殖阻害因子、コロニ
ー刺激因子、及びインターフェロンが含まれる。さら
に、これらの蛋白質性薬物から派生した、または別個に
作製したペプチドまたは多糖類断片も、本発明の線維素
原組成物に混入させることができる。蛋白質性または非
蛋白質性薬物として作用する他の物質は、当業者に知ら
れる、または容易に確認されるものである。

本発明の組成物はラジオプラーク作用薬のような診断
薬を含有するよう変更することもできる。このような作
用薬により、医師は、肝臓、胆のう、尿路、気管、肺、
心臓、血管、及び脊柱管のように体内で生じている創傷
治癒の進行をモニタすることができる。このような化合
物には硫酸バリウム、及びヨウ素を含有する種々の有機
化合物が含まれる。後者の化合物の例として、アイオセ
タミック酸（iocetamic acid）、アイオディパミド（io
dipamide）、アイオキサメート メグルミン（iodoxmat
e meglumine）、アイオパニック酸（iopanic acid）、
及びジアトリゾエート、ナトリウム（diatrizoate sodi
um）のようなジアトリゾエート（diatrizoate）誘導体
などがある。本発明の組成物に利用することのできる他
の対比作用薬（contrast agent）は、当業者により容易
に確認できる。

組成物中の薬物または診断薬の濃度は化合物の性質、
生理学的機能、及び望まれる治療または診断効果により
異なる。「治療上効果的な量」とは、最小限の毒性で、
望まれる効果を現すのに十分な量の治療薬が組成物中に
存在することを指す。このため、細胞溶解性の治療効果
を提供するために使用する抗性物質の濃度は、線維素原
複合体を投与した部位の免疫細胞の増殖を刺激する治療
効果を有する免疫応答モジュレータの濃度とは異なるこ
とが多い。「診断上効果的な量」とは、潜在的な毒性を
最小限に抑えながら、フィブリン密封剤をモニターする
のに効果的な診断薬濃度を指す。いずれの場合も、特定
の化合物に対する特定の例における望ましい濃度は当業
者により容易に確認される。

上記の記載は、本発明を一般的に説明している。以下
に記載する特定の例を参照することによりさらなる理解
が得られるが、これらの例は、説明することのみを目的
としており、特に記載されていない限りこれらに限定さ
れるものではない。

例１ 局所的線維素原複合体 局所的線維素原複合体（TFC）は、まず始めに血漿を
寒冷沈殿することにより生産した。これらに使用する寒
冷沈殿物は、血漿の物理的形状により２種の異なる方法
により調製した。

一つの方法においては、密封されたプラスチック容器
に入った凍結血漿を、空気または水のような熱交換媒体
に接触させることにより制御された環境下で融解した。
熱交換媒体の温度及び流量をプログラムして制御するこ
とにより、血漿の最高温度が＋６℃を越えないようにし
た。次いで容器を開封し、内容物をジャケット付きのス
テンレス製溶解タンクに移した。溶解タンク中で血漿を
穏やかに暖め（混合しながら）、残りの氷を解凍した。
次いで、溶解した血漿を遠心分離機に直接注入するか、
または2.5℃±3.5℃に維持されたジャケット付きのステ
ンレス製ホールディングタンクに注入した。血漿を遠心
分離して寒冷沈殿物を除去した。このようにして調製し
た寒冷沈殿物は−25℃またはそれ以下の温度で保存する
か、または直ちに抗血友病因子（ヒト）で処理した。寒
冷沈殿物の少ない血漿は、ジャケット付きステンレス製
反応タンクから回収した。

その他の方法においては、凍結血漿の入った密封プラ
スチック容器を液体窒素中に数秒間つけた。液体窒素か
ら容器を引上げ、壊れた容器を血漿から除去した。次い
で血漿をジャケット付きのステンレス製溶解タンクに移
した。その他の方法としては、凍結血漿の入った密閉容
器を暖め、凍結血漿によりプラスチックを破壊した。次
いで容器を開封し、内容物をジャケット付きのステンレ
ス製溶解タンクに移した。溶解タンク中で血漿を混合し
ながら穏やかに暖め、残りの氷を解凍した。次いで、溶
解した血漿を遠心分離機に直接注入するか、または2.5
℃±3.5℃に維持されたジャケット付きのステンレス製
ホールディングタンクに注入した。血漿を遠心分離して
寒冷沈殿物を除去した。このようにして調製した寒冷沈
殿物は−25℃またはそれ以下の温度で保存するか、また
は直ちに抗血友病因子（ヒト）で処理した。寒冷沈殿物
の少ない血漿は、ジャケット付きステンレス製反応タン
クから回収した。

寒冷沈殿物を調製した後、20℃〜35℃の蒸留水に溶解
した。プロトコールのこの部分は図１に簡略に示してい
る。最低カルシウム濃度が約40μＭになるよう十分な塩
化カルシウムを添加し、pHを6.8±0.3に調整した。溶液
を混合しながら10℃±２℃に冷却した。生成した沈殿物
を遠心分離（5600g〜7200g）により除去した。沈殿物は
−60℃またはそれ以下の温度で保存するか、または直ち
に局所的線維素原複合体（ヒト）で処理した。次いで、
沈殿物を、沈殿物1kgに対し４リットルのProcess Solut
ion Iの比率でProcess Solution Iに懸濁した。Process
Solution Iは、0.5Mグリシン、0.5M塩化ナトリウム及
び0.1Mクエン酸ナトリウム（pHはNaOHにより7.2±0.1に
調整した）、及びプロテアーゼインヒビタ:0.75〜1.75
μM PPACK（Ｄ−phe−Ｌ−pro−Ｌ−arg−クロロメチル
ケトン）またはそれと同等のもの;0.6±0.1U/mlヘパリ
ンから成る。温度を24〜32℃に調整し、懸濁物を約１時
間混合した。

沈殿物をProcess Solution Iに懸濁した後、10〜15℃
の200リットルのProcess Solution IIの入ったタンクに
懸濁物を移し、最低30分間撹拌した。Process Solution
IIは、７±1mMリン酸ナトリウム一塩基一水化物、18±
2mMリン酸二塩基七水化物、リン酸カルシウム三塩基、
0.25％（w/v）から成る。次いで、、懸濁物を最低30分
間静置した。この段階で懸濁物を遠心分離し（5600g〜7
200g）、沈殿物を除去することもできる。次いで、最初
に0.45μフィルター、次に0.2μフィルターにより濾過
して懸濁物を清澄にした。

濾過物を23〜27℃に暖め、リジンセファロース4Bカラ
ムまたはそれと同等のものに通した。ゲルはクロマトグ
ラフィカラムに詰め、10カラム容量の0.1M酢酸、３カラ
ム容量の蒸留水で処理し、５カラム容量のProcess Solu
tion III（25mMリン酸緩衝液;7±1mMリン酸ナトリウム
一塩基一水化物、18±2mMリン酸二塩基七水化物）で平
衡化した。必要に応じて、３カラム容量の1.0M NaCl、
３カラム容量の蒸留水、３カラム容量の0.1N酢酸及び３
カラム容量の蒸留水をカラムに順次通して再生すること
により、カラムを再度使用することができる。長期保存
の場合は、カラムを３カラム容量の、20％エタノールを
含む蒸留水で洗浄してから保存した。非結合物質はタン
ク中に回収した。最低２ゲル容量のProcess Solution I
IIによりカラムを洗浄した。非結合分画を回収した。次
いで、回収した非結合分画の入ったバルクの温度を14±
４℃に調整した。ポリエチレングリコール3350を最終濃
度が４％（w/w）になるよう添加した。懸濁物を最低30
分間混合し、10〜18℃で遠心分離（8700g）して沈殿物
を除去した。その結果得られたPEG沈殿物を、沈殿物1kg
あたり約15リットルのProcess Solution IV（リン酸に
よりpHを8.6±0.1に調整した39mMトリス−リン酸）中に
懸濁した。懸濁物中の蛋白質濃度を0.6±0.2g％（w/v）
に調整し、次いで、懸濁物を濾過（0.2μ）して清澄化
した。Triton X−100、三（Ｎ−ブチル）リン酸（TNB
P）及びPolysorbate−80の混合物を最終濃度がそれぞれ
1.0％（v/v）、0.3％（v/v）及び0.3％（v/v）になるよ
う添加した。蛋白質−デタージェント溶液を１時間混合
した。

次いで、バルク溶液をDE52イオン交換セルロースまた
はそれと同等のものを詰めたクロマトグラフィカラムに
通した。樹脂はクロマトグラフィカラムに詰め、３カラ
ム容量の1.0M NaCl、３カラム容量の0.5M HCl、３カラ
ム容量の0.9％生理食塩水、及び３カラム容量の0.5M Na
OHを順次通すことにより再生し、３カラム容量の0.5Mト
リス−リン酸緩衝液（pH8.6）及び３カラム容量のProce
ss Solution IVにより平衡化した。カラムは再生後再使
用することができ、0.1M NaOH中で保存することができ
る。

次いで、イオン交換カラムを最低20カラム容量のProc
ess Solution v（0.02Mヒスチジン、0.01M NaCl、6N HC
lによりpHを7.0±0.1に調整）を用いてすべての非結合
物質及びデタージェントが除去されるまで洗浄した。Pr
ocess Solution VI（0.02Mヒスチジン、0.3M NaCl、6N
HClによりpHを7.0±0.1に調整）を用いてバルクを溶出
した。

バルクにヒト血清アルブミン（治療用の５％または25
％ヒトアルブミン）を蛋白質１グラムあたり80mgのアル
ブミン濃度になるよう添加した。Polysorbate−80を蛋
白質１グラムあたり最終濃度15mgになるよう添加した。

最終的に、バルクを分画分子量30,000の膜を用いて限
外濾過して元の容量の約25％になるよう濃縮し、次い
で、濃縮前の濃度になるようProcess Solution VII（0.
02Mヒスチジン、pH7.0±0.1）を用いて希釈した。再度
限外濾過により、蛋白質の最終濃度が４±1g％（w/v）
になるようバルクを濃縮した。バルクを滅菌濾過し（0.
2μ）、滅菌済みの最終容器に無菌的に充填し、無菌的
条件下で凍結乾燥して滅菌容器に密閉した。

例２ in vitro実験におけるTFC A.凝塊形成評価 迅速な凝塊形成を行なうフィブリン密封剤（Fibrin S
calant;FS）成分の組成を決定する実験を行なった。迅
速な凝塊形成は、任意に１〜２秒と定義した。これ以上
短時間の場合、一般的に注入装置内で凝固してしまい、
これ以上長時間の場合、疾病部位方向に流れる成分の混
合物はゆるいものになってしまう。

これらの実験を行なう場合、清潔なパイレックスプレ
ートを水平軸から−30゜の位置に置いた。FS投与領域を
定義するために、下側に２″線を引いた。

100〜1000NIH U/mlのウシトロンビン（Armour Pharma
ceutical Co.）を含みCa⁺⁺を含まない、全蛋白質50〜13
0mg/mlのヒト線維素原を試験した。線維素原濃度は全蛋
白質の値と同等であると見なした。［Ca⁺⁺］の効果を1
0、20、40および60mMにおいて試験した。

フィブリン密封剤は実験用の２シリンジ装置（Fenwa
l）を用い、上部末端から上述の２″線に沿って下方向
に移動しながら注入した。

表１は、カルシウム非存在下において、100〜1000NIH
U/mlのウシトロンビンを含む全蛋白質50〜130mg/mlの
ヒト線維素原を試験したデータをまとめたものである。
各データ値は、４回の実験の平均値である。

表１に示す通り、トロンビン濃度が低く（例えば、10
0NIH U/ml）蛋白質含有量が低い（例えば、50mg/ml）場
合、凝塊形成時間は長かった。それと同時に混合物は
「ゆるい（runny）」ことが観察された。トロンビン濃
度が高い（例えば、1000NIH U/ml）と一般に注入装置内
で凝固してしまうため不適切であった。CaCl₂を添加す
ると凝塊の形状が改善され、凝塊形成時間は一般に短縮
した。

表２は０〜60mMの範囲の［Ca⁺⁺］の影響を示してい
る。CaCl₂溶液はトロンビンの再構成に使用されるた
め、FSの1:1混合物中の最終［Ca⁺⁺］は表２に報告され
ているものの半分である。

上記の結果に基づき、90〜130mg/mlの総蛋白質及び25
0〜500NIH U/mlのトロンビン濃度が以降の実験に適切で
あると結論づけた。凝塊の促進にはカルシウムイオンの
添加が必要であることも明白であった。したがって、Ca
⁺⁺濃度は以後の実験でも可変とした。

B.交差結合速度 これらの実験では、フィブリンのポリマー化における
Caイオンの役割と［Ca⁺⁺］の効果、及びフィブリンのポ
リマー化に伴なう交差結合速度の決定に主眼をおいた。

フィブリンの交差結合反応は、SDS/PAGEを用いて還元
条件下でのシステムで試験した。シュワルツら（Schwar
tz.et al.,Journal of Clinical Investigation,50:150
6,1971）により載された方法で7.5％の分離ゲル及び3.7
5％の濃度ゲルを作製した。

目的のモル数、すなわち０、２、６、12、20、40また
は60mM、のCaCl₂溶液存在化または非存在下でトロンビ
ン（Armour Pharmaceutical）を再構成した。線維素原
を水を用いて再構成し、12×75mmの試験管中でトロンビ
ンと迅速に混合し、適当な時間にサンプリングした。凝
塊を0.15M NaClで洗浄し、次いで、95±５℃の沸騰水中
で、凝塊の体積の３倍量の、３％ SDS及び３％ β−
メルカプトエタノールを含有する9M尿素に溶解した。次
いで、ゲル電気泳動を行なうまで溶解した凝塊溶液を５
℃で保存した。

CaCl₂濃度の影響は、500NIH U/mlのトロンビン及び90
mg/mlと130mg/mlの線維素原を用い、凝塊形成時間10分
で試験した。γ−バンドが消失してγ−γ２量体になる
速度に対するCa⁺⁺濃度の影響を図２及び図３に示す。

図２及び図３に示す通り、フィブリンの完全なポリマ
ー化にはCa⁺⁺が必要である。20〜60mMの範囲のカルシウ
ムイオンにおいて同様の結果が得られたため、中間値の
濃度、40mMを用いて最適なポリマー化の確認を行なっ
た。また、実験を行なった時間（10分間）においては、
２種の線維素原濃度（90mg/ml及び130mg/ml）の間でフ
ィブリンのポリマー化に差は認められなかった。

成分濃度を変化させた場合の影響を調べるため、40mM
CaCl₂中250 NIH U/mlまたは500NIH U/mlのトロンビン
及び90mg/mlまたは130mg/mlの線維素原の４種の組み合
わせを用いて試験を行なった。10分間凝塊形成させた
後、試料をゲル電気泳動に供した。トロンビン（40mM C
aCl₂中）及び線維素原の４種の組み合わせの電気泳動に
おいては、実験を行なった時間（10分間）では、顕著な
差は見られなかった。

反応時間の影響を調べるため、24時間以上にわたりサ
ンプリングを行なった。24時間の間のフィブリンのポリ
マー化反応の進行を図４に示す。図４に示す通り、Ca⁺⁺
存在下では非常に迅速にγ−γ２量体が形成された（１
分以内）。このシステムにおいては、αポリマーは10分
以上インキュベートするまで検出されなかった。インキ
ュベート時間の延長（24時間まで）に伴なうαポリマー
の増加に従い、αモノマーバンドの強度は減少した。以
上をまとめると、反応時間の実験から、初期のポリマー
化（γ−γ２量体）は反応物の混合後ほとんど瞬間的に
生じるが、αポリマーはより緩慢に形成することが示さ
れた。本研究より、ポリマー化にはCaイオンが必要であ
ると結論づけることができ、この結果はすでに報告され
ている文献のものと類似している（T.Seelich,J.Head
＆ Neck Pathol.,３:65−69,1982;M.Schwartz,et al.,
J.Clinical Inv.,50:1506−1513,1971）。

C.抗張力 フィブリン密封剤の抗張力は、バルク物質に亀裂が入
るまで凝塊に張力を加え、その時必要な力を測定するこ
とにより評価した。さらに、密封剤の作製に使用したポ
リマー化混合物の成分を変化させた場合の亀裂の入り方
の変化を試験した。

フィブリン密封剤の抗張力を試験するために、ナウオ
トニーら（Nowotny,et al.,Biomaterials,２:55,1981）
の方法を若干変更したものに基づいて型（mold）を作製
した。新たに設計した型は、凝塊形成が観察できるよう
透明なプラスチック製にした。清浄を容易にするため、
凝塊は使い捨ての凝塊ホルダー中で形成させた。

凝塊ホルダーは、プラスチック製の使い捨てピペット
（SAMCO、San Fernando Mfg.Co.）を切断して作製し
た。凝塊形成用混合物を保持するため、両端に湿らせた
スポンジの小片を詰めた。スポンジを詰めた凝塊ホルダ
ーを、エンドホルダーを通して型の中に挿入した（エン
ドホルダーは型の中に入っている）。張力測定器（T1
0、Monsanto）を用いて凝塊の最大亀裂ストレスを測定
し、記録した。エンドホルターを固定するため、T10グ
リッパーに対するアダプターを作製した。

２シリンジ投与装置（Fenwall）及び３インチ22ゲー
ジ注射針を用いて等量の繊維素原及びトロンビン（CaCl
₂存在下または非存在下）を注入することにより凝塊を
形成させた。シリンジをホルダーに入れる前に気泡をす
べて除去した。注射針を、上部スポンジ及び型を通して
下部スポンジに挿入した。パラフィルム（American Can
Co）を型の下に置き、余分な混合物の流出を防止し
た。型の中に凝塊形成用混合物を満たした後、注射針を
引き抜いた。

試験の約２〜５分前に凝塊を型から取り出し、T10グ
リッパー中に置いた。試験時には、１分間に100mmの割
合で凝塊を引っ張った。ゲージの長さ（ある程度可変）
は6.0cmに設定し、凝塊の断面積は0.049cm²とした。T10
のストレス値はKgf/cm²で表示された。

抗張力（最大ストレス）の測定は、凝塊形成用混合物
注入の10分後に行なった。表３の結果は、トロンビンが
250 NIH U/mlまたは500NIH U/mlの時のCaCl₂濃度の変化
の影響を示している。３種の線維素原濃度（90、110及
び130mg/ml）について試験した。各最大ストレス値は、
Ｎ回の測定の平均で表した。各測定ポイントにおいて、
最低８回測定を行なった。

表３に示した通り、Ca⁺⁺非存在下では、両方のトロン
ビン濃度及びすべての線維素原レベルにおいて、凝塊の
ストレス値は最も低かった。10〜60mMの範囲のCaイオン
を添加すると、すべてのトロンビン／線維素原条件にお
いて抗張力は増大した。一般に、高いトロンビン濃度、
すなわち500 NIH U/mlの場合に抗張力値も高く、20〜60
mMの範囲の［Ca⁺⁺］の場合、ある程度類似した値を示し
た。CaCl₂が40mMの場合に標準偏差（SD）は最低となっ
た。

これらの知見を確認するために、第二ロットのヒト線
維素原について試験を行ない、40mMと60mMのCaCl₂及び5
00NIH U/mlのトロンビンの場合のデータを比較した。第
二ロットの線維素原を試験した結果、特に110及び130mg
/mlのような高濃度の線維素原の場合、一般に類似の最
大ストレス値が得られ、90mg/mlの場合、より高い値が
得られた。

凝塊の抗張力に対する反応時間の影響は、500NIH U/m
lのトロンビン及び40mMのCaCl₂存在下で90mg/mlと130mg
/mlの線維素原を用いて24時間以上試験した。24時間以
上にわたり、顕著な抗張力値の低下は見られなかった。
時間の経過にしたがい交差結合が進むため、最大ストレ
スは徐々に増加すると思われる。

D.凝塊の溶解性試験 プラスミノゲンアクチベータ存在下及び非存在下にお
いて、無菌的な湿潤状態で37℃でインキュベートした場
合にフィブリン凝塊が固体状態を維持している時間を決
定した。反応混合物にプロテアーゼインヒビタ（アプロ
チニンに）を添加した場合の凝塊保持時間への影響も試
験した。

以下の希釈液： a.滅菌水（すなわち、ゼロ KIU/mlアプロチニン） b.1000KIU/mlのアプロチニン水溶液 c.3000KIU/mlのアプロチニン水溶液 を使用して３種の濃度（90、110、または130mg/ml）の
うち１種の無菌的なヒト線維素原溶液を調製した。

トロンビンは40mMのCaCl₂溶液を用いて250または500
NIH U/mlとなるよう再構成した。こうして６種類の、ト
ロンビンと線維素原の組み合わせを試験した。ウロキナ
ーゼ（Abbott）は、通常の生理食塩水中5U/mlの濃度で
調製した。

フィブリン凝塊は、等量の線維素原（H₂Oまたはアプ
ロチニン中）及びトロンビン（CaCl₂溶液中）を円筒形
のシリコン製チューブ（内径5mm）内で混合して形成さ
せた。混合物は、２シリンジ投与装置（Fenwall）を用
いて注入した。注入装置及びシリコンチューブはすべて
オートクレーブにより滅菌処理した。

10cmのシリコンチューブの片方のパラフィルムで密封
した。チューブを垂直から約10゜の角度に保持し、Fenw
al装置を用いて注射針（22g）をパラフィルムに刺すこ
とにより、線維素原及びトロンビンを迅速にチューブ内
に注入した。凝塊を20分間固化させた後、10cmのシリコ
ンチューブを3cmずつに切断し、590μｌの容積の凝塊を
得た。各3cmの断片を半分に切断し、半分の断片２個
を、滅菌した24ウエルプレート（Corning）の１つのウ
エル内に置いた。気泡の入った断片は除外した。チュー
ブの一方の端を穏やかに絞って凝塊をチューブから取り
出した。凝塊断片を1mlの滅菌生理食塩水で洗浄した
後、ウエルに1mlのウロキナーゼまたは生理食塩水を添
加し、プレートを37℃の無菌的で湿潤状態の保たれたイ
ンキュベータ内に入れた。24時間毎に各ウエルから上清
を回収し、Fibrin（ogen）Degradation Products agglu
tination kit（Baxter Dade）を用いて試験した。

プレートを37℃インキュベータに戻す前に、毎日新し
いウロキナーゼ及び生理食塩水に交換した。調製操作及
び上清回収操作はすべて無菌的条件下で行なった。凝塊
を肉眼で観察し、その形状を記録した。14日後に実験を
終了した。合計36種の条件について試験し、すべての条
件は２連で実験を行なった。

表４は、ウロキナーゼ存在下でアプロチニンを含有し
ない場合の凝塊溶解時間（凝塊が円筒形ではなくなった
時間で定義した）をまとめたものである。その結果、７
〜11日目（平均8.66±1.5日）の範囲が観察された。Fib
rin（ogen）Degradation Products（FDP）を測定した結
果、一般的活性の最大値は凝塊がはっきりとした形状を
失った時、またはその直後に対応することが判明した。

凝塊をウロキナーゼを含有しない通常の生理食塩水の
みの中でインキュベートした場合、アプロチニンの有無
にかかわらず、凝塊は全観察期間（すなわち14日間）を
通じて元の形状を維持した。FDP測定により、顕著の凝
塊の溶解が無いことが確認された。

この実験から、凝塊がin situにおいていかなるプラ
スミノゲンアクチベータの影響も受けない場合、凝塊は
最低14日間維持されると思われる。ウロキナーゼが存在
する場合、凝塊は最低７日間維持される。これらの期間
は創傷治癒機構が自然に機能するのに十分な時間である
と思われる。これらの結果から、線維素原調製物中の微
量のプラスミノゲンは凝塊の維持に悪影響を及ぼすこと
はなく、アプロチニンのようなプロテアーゼインヒビタ
の添加は必要ないと結論づけることができる。

例３ TFCのin vivo試験 in vivoモデルを使用して、最適TFC濃度の評価試験を
行なった。Swiss Webster マウス（20〜25g）を５匹ず
つ10群に分けて試験した。この実験では、各マウスを麻
酔し、体重を測定した後、背中から皮膚の小片を採取し
た。皮膚試料を生理食塩水に浸し、Gottlob装置に装着
した。次いで、種々の濃度の等量のTFC及びトロンビン
を同時に創傷を加え、皮膚をマウスに戻して、その部位
に約２分間保持した。

麻酔したマウスを腹ばいに乗せた台を張力測定器（Mo
nsanto Company）上に置き、Gottlob装置をグリッパー
に装着した。張力測定器のパラメータは：（１）面積:
1.76cm²;（２）速度:10.0mm/分；（３）ゲージ:1.0cm;
（４）ストレス範囲:500.0％に設定した。マウスの背中
から（皮膚試料と共に）離れるのに必要な力をg/cm²の
単位で記録した。これらの実験から得られたデータを、
RS1/Discover software（BBN Software Corp.,Cambridg
e,MA）を用いて統計的に評価した。

この実験の結果を分析したところ、TFCが120〜130mg/
ml、トロンビンが250 U/mlの時、吸着応答が最大になる
ことが示された。

in vivoにおいて、凝塊が組織に吸着する能力は、止
血を維持するために重要である。この実験において、試
験した試薬の範囲内で最大吸着応答が認められ、これに
より例２のin vitroにおける知見が確認された。

上述の例及び記載は本発明の理解を補助するために提
供されたものであるため、これらは例に過ぎず、限定す
るものではない。本発明の精神及び範囲を逸脱すること
なく、状況に応じて他の物質または方法が使用できるこ
とは、当業者に認識されるところである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マンカリオス サミア エス アメリカ合衆国 カリフォルニア州 コ スタ メサ カナリー ドライブ 2728 (72)発明者 リュー シュー レン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 セ リトス リール アベニュー 17149 (72)発明者 トーマス ウィリアム アール アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ラ グナ ニゲル ブリガンタイン ドライ ブ 33571 (72)発明者 アルパーン メライネ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ロ ング ビーチ ジュリアン アベニュー 3270 (72)発明者 エノモト スタンレー ティー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 バ ン ニュイス ウィッシュ アベニュー 7433 (72)発明者 ガランチョン カタリン エム アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ノ ースリッジ パソ ロブレス アベニュ ー 9151 (56)参考文献 特開 平３−128398（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−110556（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−501974（ＪＰ，Ａ)

Claims (68)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒトの血漿あるいは血漿画分に由来するフ
   ィブリノーゲン含有組成物を含有する止血促進組成物を
   調製する方法であって、この方法において、ヒトの血漿
   あるいは血漿画分はフィブリノーゲン、血漿凝固第VIII
   因子、及びプラスミノーゲンを含み、該フィブリノーゲ
   ン含有組成物は以下のステップ： （ａ）ヒトの血漿あるいは血漿画分から寒冷沈降性血漿
   標品を提供するステップ、 （ｂ）上記寒冷沈降性血漿標品より寒冷沈降物を分離す
   るステップ、 （ｃ）上記寒冷沈降物を媒質に溶解して媒質を冷却する
   ことにより冷却沈降物を形成するステップであって、こ
   の冷却沈降物は上記寒冷沈降物よりも血液凝固第VIII因
   子を著しく少なく含む、ステップ、 （ｄ）ステップ（ｃ）の上記冷却沈降物を浮遊させ、次
   いでこの浮遊液をリン酸カルシウムを含む媒質に加える
   ステップ、 （ｅ）ステップ（ｄ）の上記浮遊液から得られた上清を
   アフィニティクロマトグラフィーで処理してプラスミノ
   ーゲンをカラムに吸着させるステップ、 （ｆ）本質的にプラスミノーゲンを含まぬ画分を集める
   ステップ、 （ｇ）ステップ（ｆ）の上記画分をウイルス不活性化に
   有効な量の抗ウイルス剤と接触させるステップ、 （ｈ）ステップ（ｇ）で得られた上記のウイルスを不活
   性化した試料より抗ウイルス剤を除去するステップ、お
   よび （ｉ）フィブリノーゲン含有組成物を回収するステッ
   プ、 を含むプロセスにより調製される、方法。
2. 【請求項２】請求項１に記載の方法であって、ステップ
   （ｃ）における上記寒冷沈降物を先ず温度約20℃から約
   35℃の水に溶解し、温度10℃±５℃に保持して冷却する
   ことを特徴とする、方法。
3. 【請求項３】請求項１に記載の方法において、フィブリ
   ノーゲン沈降を高めるため、上記ステップ（ｃ）の溶解
   された寒冷沈降物にカルシウムイオンを十分な濃度で加
   えることを特徴とする、方法。
4. 【請求項４】請求項３に記載の方法において、上記カル
   シウムイオンがカルシウム塩の形であることを特徴とす
   る、方法。
5. 【請求項５】請求項４に記載の方法において、上記カル
   シウム塩がCaCl₂であることを特徴とする、方法。
6. 【請求項６】請求項５に記載の方法において、上記CaCl
   ₂が最終濃度約0.001mMから約1mMで加えられることを特
   徴とする、方法。
7. 【請求項７】請求項６に記載の方法において、上記CaCl
   ₂が最終濃度約0.040mMで加えられることを特徴とする、
   方法。
8. 【請求項８】請求項１に記載の方法であって、ステップ
   （ｄ）の前にステップ（ｃ′）を含み、ここでステップ
   （ｃ′）は上記冷却沈降物に対してトロンビン活性を阻
   害するのに十分な濃度のプロテアーゼ阻害剤処理を行う
   ことを特徴とする、方法。
9. 【請求項９】請求項８に記載の方法において、プロテア
   ーゼ阻害剤はPPACK、ヘパリン補因子II、ヒルジン、及
   び抗トロンビンIII（AT III）からなるグループから選
   択されることを特徴とする、方法。
10. 【請求項１０】請求項９に記載の方法において、PPACK
    の濃度が約0.75μＭから約1.75μＭであることを特徴と
    する、方法。
11. 【請求項１１】請求項１に記載の方法であって、ステッ
    プ（ｅ）のアフィニティクロマトグラフィが吸着剤とし
    てリジン結合の固体マトリックスからなることを特徴と
    する、方法。
12. 【請求項１２】請求項11に記載の方法において、固体マ
    トリックスがアガロースであることを特徴とする、方
    法。
13. 【請求項１３】請求項１に記載の方法であって、ステッ
    プ（ｇ）の前にステップ（ｆ′）を含み、ここでステッ
    プ（ｆ′）は上記画分をポリエチレングリコール（PE
    G）を加えて処理することを含むことを特徴とする、方
    法。
14. 【請求項１４】請求項13に記載の方法において、上記PE
    Gが約3,000から約8,000の分子量を持つことを特徴とす
    る、方法。
15. 【請求項１５】請求項14に記載の方法において、上記PE
    Gが約3350の分子量を持つことを特徴とする、方法。
16. 【請求項１６】請求項13に記載の方法におけるステップ
    （ｆ′）において、上記PEGが最終濃度約３％から約７
    ％に加えられることを特徴とする、方法。
17. 【請求項１７】請求項13に記載の方法におけるステップ
    （ｆ′）において、上記PEGが約４％（重量比）の最終
    濃度で加えられることを特徴とする、方法。
18. 【請求項１８】請求項１に記載の方法におけるステップ
    （ｇ）において、上記抗ウイルス剤が洗浄剤であること
    を特徴とする、方法。
19. 【請求項１９】請求項18に記載の方法において、上記洗
    浄剤が非イオン性であることを特徴とする、方法。
20. 【請求項２０】請求項19に記載の方法において、上記洗
    浄剤の濃度が約0.001％（容量比）から約10％（容量
    比）であることを特徴とする、方法。
21. 【請求項２１】請求項20に記載の方法において、洗浄剤
    の上記濃度が約0.01％（容量比）から約２％（容量比）
    であることを特徴とする、方法。
22. 【請求項２２】請求項18に記載の方法において、洗浄剤
    の混合物が使用されることを特徴とする、方法。
23. 【請求項２３】請求項22に記載の方法において、上記混
    合物が非イオン性であることを特徴とする、方法。
24. 【請求項２４】請求項23に記載の方法において、上記混
    合物が硫酸化オキシエチル化アルキルフェノール及びポ
    リオキシエチラートエステル誘導体を含むことを特徴と
    する、方法。
25. 【請求項２５】請求項24に記載の方法において、上記硫
    酸化オキシエチル化アルキルフェノールがトリトンＸ−
    100であることを特徴とする、方法。
26. 【請求項２６】請求項24に記載の方法において、上記ポ
    リオキシエチラートエステル誘導体がポリソルベート−
    80であることを特徴とする、方法。
27. 【請求項２７】請求項23に記載の方法において、洗浄剤
    混合物の上記最終全濃度が約１％（容量比）から約２％
    （容量比）であることを特徴とする、方法。
28. 【請求項２８】請求項23に記載の方法において、洗浄剤
    混合物の上記最終全濃度が約１％（容量比）から約1.5
    ％（容量比）であることを特徴とする、方法。
29. 【請求項２９】請求項23に記載の方法において、洗浄剤
    混合物の上記最終全濃度が約1.2％（容量比）から約1.4
    ％（容量比）であることを特徴とする、方法。
30. 【請求項３０】請求項25に記載の方法において、トリト
    ンＸ−100の上記最終濃度が約0.8％（容量比）から約1.
    2％（容量比）であることを特徴とする、方法。
31. 【請求項３１】請求項26に記載の方法において、ポリソ
    ルベート−80の上記最終濃度が約0.2％（容量比）から
    約0.4％（容量比）であることを特徴とする、方法。
32. 【請求項３２】請求項１に記載の方法におけるステップ
    （ｇ）において、上記抗ウイルス剤が有機溶媒であるこ
    とを特徴とする、方法。
33. 【請求項３３】請求項32に記載の方法において、上記有
    機溶媒がアルキルリン酸であることを特徴とする、方
    法。
34. 【請求項３４】請求項33に記載の方法において、上記ア
    ルキルリン酸がトリ（ｎ−ブチル）リン酸であることを
    特徴とする、方法。
35. 【請求項３５】請求項34に記載の方法において、トリ
    （ｎ−ブチル）リン酸の上記最終濃度が約0.2％（容量
    比）から約0.4％（容量比）であることを特徴とする、
    方法。
36. 【請求項３６】請求項18または請求項32に記載の方法に
    おいて、繊維素原を陰イオン交換樹脂に吸着し、樹脂に
    結合しない上記抗ウイルス剤を洗い流すことにより抗ウ
    イルス剤を除去することを特徴とする、方法。
37. 【請求項３７】請求項36に記載の方法において、上記陰
    イオン交換樹脂の一部分がジエチルアミノエチル（DEA
    E）であることを特徴とする、方法。
38. 【請求項３８】請求項37に記載の方法において、上記DE
    AEがセルロースに結合していることを特徴とする、方
    法。
39. 【請求項３９】請求項38に記載の方法において、上記陰
    イオン交換マトリックスがDE52セルロースであることを
    特徴とする、方法。
40. 【請求項４０】請求項36に記載の方法において、上記陰
    イオン交換樹脂に結合した上記物質が約0.25Mから約0.4
    0MのNaClによって溶出されることを特徴とする、方法。
41. 【請求項４１】請求項１に記載の方法であって、上記プ
    ロセスがさらに以下のステップ： （ｊ）ステップ（ｉ）の回収された上記フィブリノーゲ
    ン含有組成物に安定剤及び／または溶解補助剤を加える
    ステップ、 （ｋ）ステップ（ｊ）の上記フィブリノーゲン含有組成
    物をその原容量の約20％から約50％にまで濃縮するステ
    ップ、 （ｌ）ステップ（ｋ）の上記フィブリノーゲン含有組成
    物の濃縮物を濃縮前の容量に希釈するステップ、 （ｍ）ステップ（ｌ）の上記フィブリノーゲン含有組成
    物を約3g％から約5g％（重量／容量比）に濃縮するステ
    ップ、および （ｎ）上記ステップ（ｍ）のフィブリノーゲン含有組成
    物を滅菌処理するステップ、 を含む、方法。
42. 【請求項４２】請求項41に記載の方法におけるステップ
    （ｎ）において、上記フィブリノーゲン含有組成物がさ
    らに凍結乾燥されることを特徴とする、方法。
43. 【請求項４３】請求項42に記載の方法において、上記フ
    ィブリノーゲン含有組成物の凍結乾燥前の容量が、凍結
    乾燥品の再浮遊後のフィブリノーゲン含有組成物の容量
    の約３倍であることを特徴とする、方法。
44. 【請求項４４】請求項43に記載の方法において、再浮遊
    後の凍結乾燥品中のNaCl濃度が約0.1Mから約0.2Mである
    ことを特徴とする、方法。
45. 【請求項４５】請求項41に記載の方法におけるステップ
    （ｊ）において、上記安定剤がヒト血清アルブミン（HS
    A）であることを特徴とする、方法。
46. 【請求項４６】請求項45に記載の方法において、上記HS
    Aが溶出液中のタンパク質１グラム当り約70mgから約100
    mgであることを特徴とする、方法。
47. 【請求項４７】請求項41に記載の方法におけるステップ
    （ｊ）において、上記溶解補助剤がポリオキシエチラー
    トエステル誘導体であることを特徴とする、方法。
48. 【請求項４８】請求項47に記載の方法において、上記ポ
    リオキシエチラートエステル誘導体がポリソルベート−
    80であることを特徴とする、方法。
49. 【請求項４９】請求項48に記載の方法において、上記ポ
    リソルベート−80が溶出液中のタンパク質１グラム当り
    約10mgから約20mgであることを特徴とする、方法。
50. 【請求項５０】請求項41に記載の方法におけるステップ
    （ｋ）及びステップ（ｍ）において、上記濃縮が限外濾
    過によって達成されることを特徴とする、方法。
51. 【請求項５１】請求項50に記載の方法において、上記限
    外濾過に分子量30,000遮断濾過膜を利用することを特徴
    とする、方法。
52. 【請求項５２】請求項１〜51のいずれかに記載の方法に
    より調製される止血促進組成物であって、以下の特性： （ａ）本質的にプラスミノーゲンを含まない、 （ｂ）添加されたフィブリン溶解阻害剤を含有しない、 を持つことを特徴とし、ここで、該止血促進組成物中に
    含まれるプラスミノーゲンの量は、インビトロにおい
    て、該止血促進組成物を用いて形成された凝塊が、フィ
    ブリン溶解阻害剤の添加なしに14日間もとの形状を維持
    する量である、組成物。
53. 【請求項５３】請求項52に記載の上記組成物が凍結乾燥
    されることを特徴とする、組成物。
54. 【請求項５４】請求項52に記載の組成物がさらに安定剤
    及び／または溶解補助剤を含むことを特徴とする、組成
    物。
55. 【請求項５５】請求項54に記載の上記組成物において、
    上記安定剤がHSAであることを特徴とする、組成物。
56. 【請求項５６】請求項55に記載の上記組成物において、
    上記HSAが約0.5g％から約1.5g％の濃度であることを特
    徴とする、組成物。
57. 【請求項５７】請求項54に記載の上記組成物において、
    上記溶解補助剤がポリオキシエチラートエステル誘導体
    であることを特徴とする、組成物。
58. 【請求項５８】請求項57に記載の上記組成物において、
    上記ポリオキシエチラートエステル誘導体がポリソルベ
    ート−80であることを特徴とする、組成物。
59. 【請求項５９】請求項58に記載の上記組成物において、
    上記ポリソルベート−80が約0.1％から約0.3％であるこ
    とを特徴とする、組成物。
60. 【請求項６０】請求項52に記載の上記組成物が、さらに
    治療有効量の薬物を含むことを特徴とする、組成物。
61. 【請求項６１】請求項60に記載の上記組成物において、
    上記薬物がタンパク質性であることを特徴とする、組成
    物。
62. 【請求項６２】請求項61に記載の上記組成物において、
    上記タンパク質性薬物がコロニー刺激因子または生長因
    子であることを特徴とする、組成物。
63. 【請求項６３】請求項60に記載の上記組成物において、
    上記薬物が非タンパク質性であることを特徴とする、組
    成物。
64. 【請求項６４】請求項63に記載の上記組成物において、
    上記非タンパク質性薬物が抗生物質であることを特徴と
    する、組成物。
65. 【請求項６５】請求項52に記載の上記組成物が、さらに
    診断的有効量の診断試薬を含むことを特徴とする、組成
    物。
66. 【請求項６６】請求項65に記載の上記組成物において、
    上記診断試薬が放射線不透過性試薬であることを特徴と
    する、組成物。
67. 【請求項６７】請求項66に記載の上記組成物において、
    上記放射線不透過試薬がヨード化有機化合物であること
    を特徴とする、組成物。
68. 【請求項６８】請求項67に記載の上記組成物において、
    上記ヨード化有機化合物がジアトリゾエート誘導体であ
    ることを特徴とする、組成物。