JP2001019644A - ヒトフィブリノゲン組成物の製剤用のトラネキサム酸の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ヒトアルブミンの同時添加による、ヒト血
漿、組換え法または形質転換法により得られるヒトヒブ
リノゲン組成物の凍結乾燥製剤の生理学的に相溶性の溶
媒を添加したときの可溶化時間を短縮させる製剤化の方
法を提供する。 【解決手段】 生成物を可溶化したときのトラネキサム
酸濃度が２〜８％になるように組成物に加え凍結乾燥
し、加熱手段によりウイルス不活化した製剤を用いるこ
とにより好適なフィブリノゲン製剤を得ることができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、生理学的に相溶性の溶媒を添加
したときの可溶化時間を短縮させるための、ヒトアルブ
ミンの同時添加による、ヒト血漿からまたは組換え法ま
たは形質転換法により得られるヒトフィブリノゲン組成
物の製剤用のトラネキサム酸の使用に関するものであ
る。本組成物は乾燥させ、加熱によりウイルス不活化体
とするものである。この製剤の溶液は、接着剤、即ちヒ
トの器官または組織を接合するための生物学的接着剤と
して局所的に適用できる。

【０００２】市販されているこのタイプの蛋白製剤は、
フィブリン凝固補助プロテクターとして、（動物由来
の）アプロチニン、または、例えば（合成由来の）ε−
アミノカプロン酸などの抗繊維素溶解剤を含む。フィブ
リノゲンを生物学的接着剤として使用する場合、これら
外因性化合物を基本的な凝固性フィブリノゲン成分に添
加する必要性は、この必要性を支持する臨床成績が欠如
していることから、大いに議論され、かつ論争の的とな
っている。

【０００３】さらに、この技術は現在、本発明のプロセ
スに関係する従来技術のうち、最も関連の深いものとし
て、次の項目が議論されている。アプロチニンなどの抗
繊維素溶解剤の使用は、１９７０年代に遡る（アプロチ
ニンは、現在、アンタゴサン（Ａｎｔａｇｏｓａｎ）、
ファーズ（Ｆａｓｅ）、イニプロール（Ｉｎｉｐｒｏ
ｌ）その他の登録商標で市販されている）。生物学的接
着剤としての適用性については、既に、ドイツ特許３０
０２９３３号（優先日：１９７９年２月１５日）に開示
されているが、そこでは形成されるフィブリン接着剤の
特徴および抗繊維素溶解剤により与えられる安定性の特
徴について特記し、開示している。

【０００４】分子内に尿素またはグアニジン基を含有す
るアミノ酸で形成された容易に可溶化する凍結乾燥組成
物については、スペイン特許第５１９４６９号（優先
日：１９８２年２月４日）に記載されている。

【０００５】それからかなり後になって、尿素の前付加
（ＷＯ特許第９１／１９５１９号：優先日；１９９０年
６月１５日）、および非イオン性洗剤の存在（スペイン
特許第２０８０１５５号：優先日；１９８９年８月１
日）、ＷＯ特許第９５／２５７４８号：優先日；１９９
４年３月１８日）により、無水フィブリノゲン製剤の溶
解性の改良および／または溶液中の安定性を改良する組
成物が記載された。

【０００６】フィブリノゲンのウイルス不活化の特異的
または非特異的な方法に関連して、種々の特許が出願さ
れている。スペイン特許第５３６８５０号（優先日：１
９８３年１０月１９日）には、乾燥状態で酸性および塩
基性アミノ酸の存在下での、フィブリノゲンを含む蛋白
質の熱処理によるウイルス不活化を特許請求の範囲に記
載している。スペイン特許第５２４９９２号（優先日：
１９８２年８月１９日）も、安定化剤の存在下での、６
０℃で１０時間液体中で低温殺菌することによるウイル
ス不活化法に関する。

【０００７】スペイン特許第２０５１９１４号（優先
日：１９８８年４月２９日）には、軟骨、骨を修復させ
るために使用できる化合物の組成および調製が記載され
ており、それは、生分解性の生物学的接着剤により構成
され、その調製形態は、それより以前に米国特許第４６
４２１２０号（優先日：１９８３年３月２８日）に記載
されていた。スペイン特許第２０５１９１４号または以
前の米国特許第４６４２１２０号の特許請求の範囲に記
載されたゲルは、とりわけトロンビンと塩化カルシウ
ム、アンチプロテアーゼ（抗プラスミンなどのアプロチ
ニン、イプシロン−アミノカプロン酸、トラネキサム酸
または他の蛋白阻害剤）で構成される。上記特許によれ
ば、この化合物は、インキュベーション温度で２、３日
間、低温下で２、３年間保持できる。この特許の特許請
求の範囲に記載された適用は、１０％以上の血清を含む
固定化媒介物質（接着剤）と共に骨髄細胞を使用するこ
とにのみ関連している。

【０００８】ＷＯ特許第９２／２２３１２号（優先日：
１９９１年６月１７日）には、生分解性フィブリノゲン
またはフィブリンおよび生体適合性ポリマーを含む接着
特性を有する組成物を具体的に特許請求の範囲に記載し
ているので、この組成物は、基本的には少なくともこれ
らの種類の化合物の標準的な製剤の既知の臨床適用を維
持している接着剤である。既に知られているいくつかの
ヒト由来（抗プラスミン）、動物由来（アプロチニン）
および合成由来（トラネキサム酸）の抗繊維素溶解剤の
利用について、その製剤用に記載されている。

【０００９】生物学的接着剤に関連するもう１件の特許
は、ＥＰ ０５３４１７８号 Ａ２（優先日：１９９１
年９月２７日）である。この特許は、粗製フィブリノゲ
ンの化合物Ａ、および好ましくはヘビ毒（バトロキソビ
ン）またはトロンビンから得られる蛋白分解酵素から構
成されるもう１つの化合物Ｂに基づく接着製剤を記載し
ている。この特許は、アプロチニンなどの蛋白分解酵素
阻害剤を添加する可能性を考慮している。化合物Ａの製
剤のために、出発物質として氷冷沈殿物の使用のみを記
載しており、その物質の組成（５回の献血血漿サンプル
を合わせて）は、総蛋白７５ｍｇ／ｍｌ（１００％）、
フィブリノゲン３６ｍｇ／ｍｌ（総蛋白に対して４８％
相対濃度）およびファクターＸＩＩＩ ４．１０ＩＵ／
ｍｌであると述べている。この特許の記載によれば、処
理生成物、即ち、クエン酸生理食塩水で抽出し、アルミ
ニウムゲル存在下で濾過後の生成物は最初の濃度（総蛋
白量７０〜８０ｍｇ／ｍｌ）と等しい蛋白濃度を有し、
プラスチックバッグに凍結した状態で保存する（凍結乾
燥は選択肢としてのみ考慮される）。

【００１０】ＷＯ特許第９４／２２５０３号（優先日：
１９９３年３月３０日）には、フィブリン接着剤の製造
と適用が記載されているが、この発明で示された利点
は、この製剤の接着剤が機械的により大きな強度をもつ
ことにある。トラネキサム酸は、アプロチニンを含有す
る他の製剤に比べると、免疫反応の少ない抗繊維素溶解
剤であり、十分な引張り強度をもつことができるアプロ
チニンの代替物として明白に記載されている。しかし、
この明細書に示されているようなトラネキサム酸、また
はその誘導体を単独で、または他の成分と組み合わせて
凍結乾燥の際、フィブリノゲンの賦形剤として利用する
こと、またはその顕著な溶解効果についての記述は全く
なく、この発明者によって発見されていない。問題の特
許で請求されているこのタイプの製剤の特徴がいくつか
公表されている（ＪａｃｋｓｏｎＭ．Ｒ．，ＭａｃＰｈ
ｅｅ Ｍ．Ｊ．，ら、Ｆｉｂｒｉｎ Ｓｅａｌａｎｔ：
Ｃｕｒｒｅｎｔ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｂｌｏｏｄ
Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌ
ｙｓｉｓ（フィブリンシーラント：臨床応用の現状と可
能性。血液凝固作用とフィブリン溶解反応）；７、７３
７−７４６頁；１９９６年）。

【００１１】一方、トラネキサム酸（抗繊維素溶解剤）
の化学合成および静脈内、皮下、経口または局所（軟膏
および水溶剤）による治療適応症がベルギー特許第６１
７２１６号（優先年：１９６１年）に開示されている
が、そこではＣａ（２＋）イオン存在下でフィブリノゲ
ンとトロンビンにより形成されるフィブリン凝固を溶解
するという点で、この製剤のプラスミンの存在に対する
阻害作用に関する、その製剤の特異的な活性を強調して
いる。この特許はまた、この生成物を、繊維系溶解活性
を促進する性質を有する他の活性素因または成分と組み
合わせて利用する可能性についても特許請求の範囲に記
載している。

【００１２】本発明で開示する製剤の新規組成物は、現
在、局所的に使用される凝集性フィブリノゲン化合物に
よって示されているいくつかの問題を解決するが、これ
は以下の事柄を含む： １．製剤の活性に影響し、その治療上の有用性を低下さ
せる凝集性蛋白質の濃度が低い化合物の使用。 ２．今日では、ウイルス不活化滅菌の物理的および／ま
たは化学的方法は、ヒト血漿由来の生成物に対し、ヒト
免疫不全やＢ型またはＣ型（およびごく僅かにＧ型）肝
炎を引き起こすウイルス、または脂質エンベロープを有
するあらゆる既知のウイルスなどの血漿を介して伝染す
る、非常に危険性の高い大多数の病原性ウイルスに感染
するリスクを与えることは、事実上ゼロである。しかし
ながら、血漿を介して伝染する、脂質エンベロープを持
たないウイルスを完全滅菌する絶対確実な方法は存在し
ない。 ３．乾燥（凍結乾燥）状態で保存され熱により不活化
し、水性媒体中では容易に高濃度で溶解する凝集性フィ
ブリノゲン製剤の製造は、この製剤の局所的使用に関す
る限り最大の治療効果を上げる要因の１つとなってい
る。 本発明者らは、上記に示された点に取り組み、従来技術
の現在の等価な生成物よりも優れた接着性蛋白複合組成
物を提供する。

【００１３】本発明が生物学的接着剤として関わる蛋白
複合体の局所的使用に関しては、接着性フィブリンの凝
結を形成するための補助的化合物が必要である。トロン
ビンなどの活性化された酵素によって構成される補助化
合物は、カルシウムイオンの存在下で本発明の蛋白複合
体と接触すると、強力なフィブリン格子を形成し始め
る。

【００１４】本発明の製剤を形成する主要な蛋白質の１
つは、凝集性フィブリノゲンである。この主要な蛋白質
にその他の接着性蛋白質が伴うが、接着剤として局所使
用の場合これらの蛋白質は、接着性を向上させることに
よって組織の接着機構に寄与するため、特に大切であ
る。このように、この蛋白複合体は、主としてフィブリ
ノゲンを含むことに加えて、フィブロネクチンおよびフ
ァクターＸＩＩＩおよびその他の少数の蛋白質を伴うと
いう特徴をもっている。

【００１５】凝集性フィブリノゲンの濃度は、本発明に
おける興味あるテーマの１つである。フィブリン格子の
形成速度とその強度はともに、使用される蛋白複合体中
の凝集性蛋白質の濃度の関数である。したがって、活性
物質と接触した際、フィブリン架橋の強力な格子を形成
させるためには、フィブリンを高濃度に局所投与するこ
とが必須条件である。

【００１６】本発明は、製剤を室温下または冷蔵庫内に
保存できるように、冷凍温度を必要としない条件で製剤
を保存する問題に取り組み、この目的のため、薬局方の
要件を満たす凍結乾燥製剤を得ることを可能にする剤形
を特に開発したが、この観点から、既に登録され、販売
されている、または開発段階にあるいくつかの製剤より
も優れている。

【００１７】本発明に特に関連するもう１つの点は、認
められる効果のある少なくとも１つの特殊なウイルス不
活化ステップを組み入れている点である。この不活化
は、乾燥状態（例えば、凍結乾燥により生じる）での高
温最終加熱処理により、また、最終生成物の最終包装に
おいて達成される。このような処理をしたフィブリノゲ
ン化合物では、その生物学的および物理的性質に変化を
受けずに保たれる。以上の点を示す性質を有する接着性
蛋白質の製剤を得るため、本発明者らは、生物学的接着
剤として局所的に利用するための最適な組成物を開発し
た。

【００１８】フィブリン接着剤に関するヨーロッパ薬局
方のモノグラフの示すところによると、凝集性フィブリ
ノゲン成分は、６０ｇ／ｌ以上の、そしてまた１０ Ｉ
Ｕ以上の溶解ファクターＸＩＩＩ／ｍｌを含んでいなけ
ればならず、また、凍結乾燥生成物の再溶解時間は、指
定された好適な温度において２０分以上であってはなら
ない。

【００１９】接着性蛋白複合体の生成用に、例えば低温
沈殿物を出発物質とし、簡単なプロセスにより得られる
製剤組成物中に上記のフィブリノゲン濃度を達成するこ
とは、付随する大量の蛋白質が基本のフィブリノゲン製
剤を汚染するため、容易ではない。しかし、たとえそれ
らの方法によって必要なフィブリノゲン濃度の達成が可
能であるとしても、得られた材料は、使用されるまで冷
凍状態で保存することが好ましい。乾燥（凍結乾燥）し
た製剤は、生物学的組織接着剤として使用されるために
必要とする濃度において妥当な時間内では可溶性が低い
ので、溶液は、冷凍状態で保存される（「自家製」製剤
に利用される）。

【００２０】現在、１人のドナーから、またはごく少数
のドナー（例えば５人）の混合物から得られた自家血漿
の低温沈殿物を出発物質としてフィブリノゲン化合物を
製造することが一般的な慣行となっている。このような
タイプの製剤（「自家製」または家内製剤）は、病院の
中央施設で、当事者利用（内部利用）のために製造され
ているが、それらは製剤の品質の点で明らかに標準化お
よび反復性を欠いていることが示されており、したがっ
て使用成績も不明確で、治療的な有効性が低い。この方
法ではウイルス感染の危険性を完全に除くことはできず
（自家血漿の場合を除いて）、また得られる最終的なフ
ィブリノゲン濃度も非常に低く、凝集フィブリノゲンと
して約１０〜２９ｍｇ／ｍｌ（１％〜２．９％）の範囲
である（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｍ．Ｒ．，ＭａｃＰｈｅｅ
Ｍ．Ｊ．ら、Ｆｉｂｒｉｎ Ｓｅａｌａｎｔ：Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕ
ｌａｔｉｏｎ ａｎｄＦｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ（フィ
ブリンシーラント：臨床応用の現状と可能性。血液凝固
作用とフィブリン溶解反応）；７、７３７−７４６頁；
１９９６年）。

【００２１】同様に、上記フィブリノゲン製剤の使用
は、残りの付随蛋白質（含まれる凝集性フィブリノゲン
は、約５０％、如何なる場合でも７０％以下と推測され
る）の１種による著しい打消し効果を有する可能性があ
り、したがって、局所的に利用する際に、先ずフィブリ
ノゲンを、それから形成されたフィブリン格子を安定化
し、保護するプロテアーゼ阻害剤を加えることが事実上
必要不可欠である。

【００２２】凍結乾燥製剤の可溶性は、アルギニンやイ
ソロイシンなどの尿素またはグアニジン基を含むアミノ
酸を組み込む方法により、または尿素自身などのカオト
ロピック剤によって向上した。可溶性の脂肪酸や界面活
性剤の使用に関しても記載があり、公表された記載によ
ると、これらは凍結乾燥物の可溶性を促進する可能性が
ある。

【００２３】いずれの場合でも、フィブリン格子形成時
の生理的イオン強度の状態をおおよそ保持することが必
要である。最終的なイオン濃度が生理的数値を明らかに
超える（例えば、その数値の２倍以上である）溶液の調
製は許容できないと考えられている。

【００２４】本発明者らは、凝集性蛋白質を高濃度で提
供する目的で、目的の接着性蛋白質およびファクターＸ
ＩＩＩを大部分含み、凍結乾燥状態で保存され、乾燥状
態で加熱することによるウイルス不活化を可能にするフ
ィブリノゲン製剤の安定性を維持するという課題を解決
した。

【００２５】驚いたことに、最終的な組成物または処方
によって、賦形剤の最適量では、凝集蛋白質として６０
ｇ／ｌ以上の高濃度の凍結乾燥したフィブリノゲン化合
物を可溶化することが可能となり、その再構成にかかる
時間は、凍結乾燥生成物の可溶化のために必須な２０分
よりも明らかに少なく、一般に５〜１０分であること
を、本発明者らは見出した。本発明の製法によって、製
剤の機能性を損ねることなく、高温加熱による効果的な
ウイルス不活化が可能となり、また同様に、問題となる
ような変化を生じることなくその物理的性質を保持する
ことができる。

【００２６】この製剤による免疫反応の発生に関して
は、精製度の高い化合物の注入においては事実上ゼロに
することができ、免疫グロブリン（イソアグルチニン
類）の存在も十分に減少していた。主に最終段階の加熱
による不活化の熱作用による新抗原形成の可能性は、凍
結乾燥生成物の乾燥程度と固体を加熱するのに相応しい
空気（酸素の不在）を効率的に抑制すれば、事実上除く
ことができた。

【００２７】既に示したフィブリノゲン化合物のウイル
スに対する安全性については、もしこの製剤が、効果の
認められた不活化方法（溶媒−界面活性剤）の１つによ
って処理されるならば、脂質エンベロープを有するウイ
ルスに対しては、現状では、事実上リスクゼロの状態で
ある。歴史的にみて、１９７０年代またはそれ以前に使
用されてきたフィブリノゲンは、出発原料として、何百
人、何千人ものドナーの血漿を合わせたものが使用さ
れ、製剤の製造にウイルスを不活化する特別なステップ
を取り入れていない場合は、主に肝炎（Ｂ型および／ま
たは非Ａ、非Ｂ）によって生じるウイルス疾病の感染の
リスクが非常に高かった。したがって、フィブリノゲン
を自家血漿から、または非常に少数の管理できる数のド
ナーの血漿から製造する必要があった。

【００２８】現在、血漿分画会社は、ウイルス除去に関
する高能率の特殊ステップを少なくとも１ステップ取り
入れて、ウイルスを不活化した凝集性フィブリノゲン化
合物を市販している（脂質エンベロープを有するウイル
スに対しては、全製造ステップのうち、最初のウイルス
含量を少なくとも約８〜１０Ｌｏｇ（１０）減少させて
残りの感染率をゼロにするステップを少なくとも１つ取
り入れる必要があると推測される）。このように、現在
開発されているフィブリノゲン製品は、その製品に十分
な安全性を与えるためには、少なくとも１ステップは、
脂質エンベロープのないウイルスに対しても効果を有す
るステップを含む二重のウイルス不活化ステップを有し
ている必要がある。

【００２９】本発明の方法は、相補的で選択的な、製品
の精製段階に取り入れられる化学的不活化（溶媒−界面
活性剤）および、最後の包装への充填時での高効率な加
熱による不活化とを、組み合わすことができる二重の不
活化という課題に合致するものである。

【００３０】乾燥状態での加熱手段によるウイルス不活
化は、凍結乾燥処理された製品の可溶化速度を低下させ
るように働き、得られる溶液の品質を低下させ易いこと
に注目すべきである。新規の凍結乾燥製剤法を用いるこ
とにより、本発明の方法は、この主要な困難を克服し、
加熱による不活化を考慮した上での好適なフィブリノゲ
ン製剤を得ることができる。

【００３１】本発明者らは、蛋白質、アミノ酸、化学的
試薬を好適に組み合わせることにより、脱水化物の可溶
化を促進できることを見出した。驚いたことに、アルブ
ミン、グリシン、クエン酸ナトリウム塩と好適に混合し
たフィブリノゲンの接着性複合体に、正確な濃度におい
て、非線状炭化水素鎖を有するアミノ置換カルボン酸で
形成した群のうち少なくとも１種の可溶化剤を添加する
と、製品の乾燥状態での保存に関するモノグラフの詳細
を十分に満足させる製剤となることを見出した。

【００３２】問題の可溶化剤は、より具体的には６個の
炭素単位を有し、また同様に４位、即ち“パラ”位が末
端アミノメチル基により置換された脂環式環に結合した
カルボン酸基により形成される化学合成化合物の構造式
に対応する。この開発中の構造式は、ＮＨ３ＣＨ２−Ａ
−ＣＯ．ＯＨで表されるものに相当し、ここでＡはシク
ロヘキサン環である。挙げられる化合物は、ＡＭＣＨＡ
（またはＡＭＣＡ）という略称で知られる４−アミノメ
チルシクロヘキサンカルボン酸であり、これには、２つ
の位置異性体、シス−ＡＭＣＨＡおよびトランス−ＡＭ
ＣＨＡがあり、後者は抗繊維素溶解活性を有し、トラネ
キサム酸、シクロカプロン（Ｃｙｋｌｏｋａｐｒｏ
ｎ）、またはその他の名称でも知られている（米国特許
出願第３４９９９２５号、優先年：１９６５年）。

【００３３】驚くべきことに、この化合物は乾燥（凍結
乾燥）状態で、他の成分（アルブミン、グリシン、塩）
との好適な組合せの一部を形成する場合、フィブリノゲ
ン（および付随する接着性蛋白質）の可溶化剤として働
くことを、本発明者らは見出したので本明細書に記載す
る。上記の成分のうち、アルブミン、グリシン、塩のい
ずれか１種が欠けても、添加ＡＭＣＨＡの可溶化作用は
著しく低下する。

【００３４】製品の可溶性の点で、所望の目的を達成す
るために、どのような組成が定性的にも定量的にも許容
されるかを見出すべく、本発明者らは徹底的に実験研究
を行い、その最適化を達成することができた。

【００３５】本発明の生成物の組成は、加熱によるウイ
ルス不活化ステップのより高温での利用を可能にする非
常に大きな利点を付加し、溶媒／界面活性剤による化学
的不活化と組み合わせれば、ウイルスに対する安全性を
最大レベルに上げることができる。この組成物の賦形剤
または安定化剤は加熱処理条件下で加熱抵抗性がある。
この製剤に使用されるアルブミンは加熱操作の間、生成
物の安定化に寄与し、置換されたカルボン酸は、その処
理後の凍結乾燥製品の可溶化を容易にする働きをする。

【００３６】本発明の組成物およびその製造方法につい
ての詳細な説明を以下に記載する。出発原料の蛋白溶液
は、精製し、総蛋白を約４％まで濃縮し、そのうち少な
くとも９０％が凝集性フィブリノゲンとするが、これを
好ましくは６．０〜８．０のｐＨにおいて、グリシン濃
度０．０５Ｍ〜０．２Ｍ、塩化ナトリウム濃度０．０５
Ｍ〜０．２Ｍ、クエン酸ナトリウム濃度０．０１Ｍ〜
０．０５Ｍを含む水性媒体の溶液である。

【００３７】出発生成物は、高分子量のフィブリノゲン
凝集体や不安定なリポ蛋白化合物、および凍結乾燥によ
って、またはその他の乾燥操作によって変化するような
化合物を実際には含まない。

【００３８】０．２５％〜０．７５％のヒト血清アルブ
ミンを生成物の溶液に加えてから、置換環式カルボン
酸、好ましくは４−アミノメチルシクロヘキサン酸（Ａ
ＭＣＨＡ）で構成された相溶性の可溶化剤の濃い溶液を
加え、この溶液が３％〜４％のフィブリノゲン濃度に調
整されている場合は、好ましくは１％〜４％、より好ま
しくは２％〜２．５％の濃度とする。

【００３９】乾燥（凍結乾燥、噴霧乾燥）する前に、こ
の調整溶液を精製し、０．２ミクロン以下の孔径フィル
タで濾過して除菌し、所望のプレゼンテーションに必要
な適当量を計り、好ましくは目的の再構成体積の２倍に
相当する体積を測る。例えば３％〜４％フィブリノゲン
溶液１０ｍｌは、僅か５ｍｌの溶媒（注射用水）で再構
成される。

【００４０】この生成物を好ましくは好適な凍結乾燥サ
イクル（好ましくは、生成物を約−６０℃かそれ以下の
温度で予備凍結し、高度真空下、＋３０℃〜４０℃で最
終乾燥する）により、または噴霧乾燥し、次にこの生成
物を温度感受性のウイルスを不活化するのに効果的な加
熱ステップに供し、最終密閉容器内で真空下、≧８０℃
〜１１５℃の高温に、好ましくは５分〜１００時間曝
す。

【００４１】接着剤としての使用を目的とする凍結乾燥
したフィブリノゲン化合物を加熱によりウイルス不活化
し、最終フィブリノゲン濃度６０ｍｇ／ｍｌ以上、好ま
しくは６０〜８０ｍｇ／ｍｌとなるような溶媒体積を用
いて、好ましくは注射用水に溶解させる。総蛋白におけ
る凝集性フィブリノゲン含有量は７０％以上である。同
様に、脱水生成物が可溶化した場合の賦形剤の濃度は、
塩化ナトリウムが好ましくは０．１Ｍ〜０．４Ｍ、クエ
ン酸ナトリウムが好ましくは０．０２Ｍ〜０．１Ｍ、グ
リシンが好ましくは０．１Ｍ〜０．４Ｍ、ヒトアルブミ
ンが好ましくは０．５％〜１．５％であり、置換環式カ
ルボン酸（ＡＭＣＨＡ）の濃度が好ましくは２％〜８
％、より好ましくは４％〜５％である。回転撹拌下での
生成物の可溶化時間は２０分未満であり、生成物が熱処
理されていない場合は、一般に２〜１０分、そして上記
の好ましい条件下で加熱される場合は、好ましくは２〜
１５分である。凍結乾燥物を溶解する温度は、室温（約
２２℃）か、それより高温であってもよいが、４０℃を
超えてはならない。好ましくは乾燥固体は、３５〜３７
℃の温度において水で溶かし、溶解が完全に行われるま
でこの生成物の懸濁液を含む容器（バイアル）を適度の
一定の撹拌に供するが、これは手動、機械的（回転）、
いずれの手段によって提供されてもよい。得られる溶液
は透明で無色であるか、または僅かに黄色味を帯びた色
合いを有する。

【００４２】本発明の接着性フィブリノゲン化合物への
活性化剤（トロンビン）の添加により、抵抗性を有し、
安定で、生物学的に相溶性であり、吸着しうるフィブリ
ン凝集体を形成して、速やかな活性化が促進され、この
タイプの製剤の臨床効能特性を有する組織接着剤として
使用することができる。本発明に係るプロセスを、その
模式図によって以下に示す。

【００４３】

【数１】

【００４４】

【実施例】実施例１ 生物学的接着剤として局所的に利用される可能性を有す
る、凍結乾燥した最終生成物を得る目的で、グリシンで
沈殿させ精製したフィブリノゲン（蛋白複合体）を得る
ための加工バッチ（Ｎｏ．７００６）を処理した。

【００４５】出発原料は、グリシンで沈殿させたフィブ
リノゲンの沈殿物４７４ｇを可溶化溶液１４２２ｇに懸
濁させたものである。沈殿物可溶化溶液の１４２２ｇに
は、１０．６９ｇの塩化ナトリウム、８．３６ｇのクエ
ン酸三ナトリウム・二水和物、４５．５０４ｇのショ糖
を含有する。沈殿物は、約３０℃の温度で４５分以上撹
拌を続けた。懸濁液のｐＨを１モルの酢酸で６．６に再
調整した後、懸濁液を約２３℃の温度下、４０００ｒｐ
ｍの速度で商標Ｓｏｒｖａｌｌの遠心分離機ＲＣ−３型
により遠心分離した。遠心分離後の沈殿物の重量は、１
１．６ｇであった。遠心分離した上澄み液は、１０６Ｎ
ＴＵの濁度、２８０ｎｍでの光学密度は４９．９ＵＡを
示した。次に上記の上澄み液をＣＰ−２０（商標Ｍｉｌ
ｌｉｐｏｒｅ）を用いた濾過により精製し、１７３０ｇ
の濾液を得た。この濾液の２８０ｎｍでの光学密度は、
４９．６ＵＡ、濁度は１０３ＮＴＵであった。

【００４６】次いで、公称分子部分および１５平方フィ
ートの総表面積をもった３個の１００−ｋＤａカセット
付き、蛋白吸着能の低いポリエーテルスルホンで構成さ
れた限外濾過装置（商標Ｐａｌｌ−Ｆｉｌｔｒｏｎのオ
メガシリーズ）を用いてダイアフィルトレーションを行
った。限外濾過の条件は、このタイプの操作に通常用い
られているところの供給圧力１．０〜１．４バール、保
持分圧が０．５バール未満であった。２３℃付近での濾
過速度は、操作開始時約１５０ｍｌ／分であった。溶液
は、添加減少法により、最大６分量までの透析溶液を用
いて、分画液を添加することにより完全濾過に供した。
透析溶液はｐＨ６．５〜６．７で０．１２４モルの塩化
ナトリウムおよび０．０２モルのクエン酸ナトリウムの
組成である。最後に、生成物溶液を２８０ｎｍでの光学
密度が６２．６ＵＡになるように濃縮した。

【００４７】この濃縮した最終溶液の一部分量に、１
％、２％、３％までの種々の濃度のアルギニンを添加し
た。この溶液約２４０ｍｌに２０％に濃縮した医療用ア
ルブミン３．０ｍｌを加えた。アルブミンで安定化され
たこの溶液を２部分に分け、そのうちの１つにグリシン
を０．１Ｍ濃度になるまで加えた。種々の濃度のＡＭＣ
ＨＡを前の２つの溶液に加え、最終濃度を０％、１％、
２％とした。異なる組成を有する各溶液を、直径４７ｍ
ｍのディスク形をした０．２２ミクロン孔径のＰＶＤＦ
膜（商標Ｄｕｒａｐｏｒｅ）を用いて濾過し除菌した。

【００４８】これらを公称１０ｍｌ容量のバイアルへ計
り入れた。これらのバイアルを約−７０℃で分室にて冷
凍し、次に高度真空下で凍結乾燥したが、この最後の乾
燥操作は約３７℃で２４時間以上実施した。

【００４９】凍結乾燥したバイアルを注射用に３５℃〜
３７℃の温度で５ｍｌの水で再溶解すると、それぞれが
６０ｍｇ／ｍｌ以上のフィブリノゲン濃度を有している
が、この濃度は、表１の凍結乾燥物の溶解時間に反映さ
れる。

【００５０】

【表１】

【００５１】注：全ての組成物は、ｐＨ６．５〜６．７
で、０．１２４モルの塩化ナトリウムおよび０．０２モ
ルのクエン酸ナトリウムも含んでいた。ＡＭＣＨＡで形
成された組成物は、０．５％までのアルブミンを含有し
ていた。

【００５２】３５℃〜３７℃における凍結乾燥生成物の
水（５ｍｌ）での可溶化時間によれば、その組成中にＡ
ＭＣＨＡを含有する群がきわだっている。製剤が塩化ナ
トリウム−クエン酸ナトリウム−アルブミンの他に０．
１モルのグリシンも含有する場合、約２％濃度のＡＭＣ
ＨＡは、可溶化時間が４分延びる。

【００５３】この結果により、塩化ナトリウム、クエン
酸ナトリウム、０．５％アルブミンの基本組成物中にＡ
ＭＣＨＡおよびグリシンを含有する場合は、実質的に２
０分未満の可溶化時間が得られることを示している。Ａ
ＭＣＨＡおよび／またはグリシンを欠いた場合は、可溶
化時間は明らかに増加する。

【００５４】実施例２ 最終のフィブリノゲン化合物に存在するいずれのウイル
スをも効果的に加熱不活化するために、生成物の組成の
最適条件を求めて、生成物の最終組成中に種々の濃度の
アルブミン添加を試験し、回収フィブリノゲンとそれに
付随するファクターＸＩＩＩを測定した。

【００５５】フィブリノゲン複合体を構成している精製
生成物は、実施例１と同様に加工した。その組成物は、
最終濃度が塩化ナトリウム０．１２４モル、クエン酸ナ
トリウム０．０２モル、グリシン０．１モル、並びに種
々の量のアルブミン、即ち０．４％、０．６％、０．８
％濃度となるように調整した。生成物を凍結乾燥してか
ら、１００℃で１時間加熱した。

【００５６】熱処理前後の生成物を水で可溶化し、バイ
オラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）による蛋白質の定量化によ
り、また、フィブリノゲンおよびファクターＸＩＩＩの
凝集活性により定性化し、この物質の可溶化時間もまた
測定した。得られた結果を表２に示す。

【００５７】

【表２】 Ｎ．Ｄ．：未測定

【００５８】可溶化時間は、非加熱処理生成物において
１４〜２０分であり、生成物の加熱処理後では全ての例
で２０分以上であった。前工程の含量におけるフィブリ
ノゲンおよびファクターＸＩＩＩの加熱生成物の相対回
収量を総蛋白含量に補正して表３に示す。

【００５９】

【表３】

【００６０】一方、上記表２および表３の結果は、約５
％濃度のフィブリノゲンに水を加えて再生した最終凍結
乾燥物中におけるファクターＸＩＩＩの高濃度を反映し
ている。全ての場合、ファクターＸＩＩＩの活性は、４
０ＩＵ／ｍｌよりも大きい。一方、熱処理を利用して生
成するフィブリノゲンおよびファクアーＸＩＩＩにおけ
る両者の活性回収値を表３に掲げる。この結果から、フ
ィブリノゲンは、調製された組成物中のアルブミンのい
ずれの濃度においても十分に安定であることが推測され
る。試験したアルブミン濃度、即ち０．４％〜０．８％
を有する組成物では、ファクターＸＩＩＩの活性は、加
熱保持時間に大きく依存する。しかしながら、組成物中
のアルブミン濃度の低下と相関してファクターＸＩＩＩ
の活性は、加熱によってかなり低下する。

【００６１】実施例３ 所望の最終製剤を得るために、精製フィブリノゲン複合
体の各種バッチを、加工し、次いでこの最終生成物を凍
結乾燥し可溶化した。精製フィブリノゲン複合体の３つ
のバッチ（バッチ番号：７００６、７００７、７００
８）のそれぞれから採取した出発物質の重量は、各例で
約５００ｇとほぼ等しく、この出発物質は、別個に実施
例１に記載の加工を行って最終凍結乾燥生成物を得た。
調製した種々の最終生成物の組成を、表６に示す。凍結
乾燥物の溶解時間、トロンビン（約１００ＩＵ／ｍｌの
溶液）存在下でのフィブリン凝固形成に要する時間、再
生された凍結乾燥物の濁度、およびゲル化時間に関して
得られた結果を表４に示す。

【００６２】

【表４】 （＊）：バイアル１本の単回測定 Ｎ．Ｄ．：未測定 注：（１）表示したＡＭＣＨＡの％濃度は、各例におけ
る１０ｍｌおよび５ｍｌの計量再生容量の凍結乾燥前の
溶液に相当するものである。 （２）フィブリン凝固形成時間を測定するために、ヒト
トロンビン調製物の２つの異なるバッチを使用し、１つ
を、加工バッチ番号７００６に適用し、他の１つはバッ
チ番号７００８に適用した。 Ｎ．Ｄ．：未測定

【００６３】各組成物の３つの加工バッチの可溶化平均
時間の結果を、表５に掲げる。

【表５】

【００６４】上記の結果は、可溶化剤の濃度が２％〜３
％の範囲にある場合、生成物にＡＭＣＨＡを添加した組
成物が、有意に可溶化時間を減少させていることを示し
ている。可溶化剤の添加は、１％濃度（計量溶液）にお
いてもまた、再生溶液の濁度の減少を有意に促進し、
２．５％以上の濃度で、ほぼ最小値に到達する。ＡＭＣ
ＨＡの存在は、ゲル化時間を減少せず（溶液サンプルの
２４時間目では陰性）、トロンビンとの凝集時間は、０
％の対照と比較してＡＭＣＨＡを含有する製剤ではいく
らか増加する。

【００６５】実施例４ この適用例では、加熱によるウイルス不活化および生成
物のいくつかの特性に及ぼす、その効果を実証する。前
記実施例３に記載の各種組成物群の凍結乾燥バイアルを
出発物質として使用し、エンベロープの無いいくつかの
ウイルス不活化に有効な加熱処理に供した。この目的の
ために、関連バイアルが約５０分以内で１００〜１０２
℃に到達するように（制御プローブ付きのバイアル）熱
風オーブンに入れて、さらに正確に１時間、その温度範
囲で熱的に制御された状態に置いた。その直後に、バイ
アルを最終の周囲温度になるまで冷却した。

【００６６】凍結乾燥物の溶解時間、トロンビン（約２
５０〜５００ＩＵ／ｍｌ）存在下でのフィブリン凝固形
成に要する時間、再生された凍結乾燥物の濁度、および
ゲル化時間に関して得られた結果を表６に示す。

【００６７】

【表６】 注：（１）表示したＡＭＣＨＡの％濃度は、各例におけ
る１０ｍｌおよび５ｍｌの計量再生容量での、凍結乾燥
前の溶液に相当するものである。 （２）フィブリン凝固形成時間を測定するために、ヒト
トロンビン調製物の２つの異なるバッチを使用し、１つ
は、加工バッチ番号７００６に適用し、他の１つは、バ
ッチ番号７００８に適用した。 Ｎ．Ｄ．：未測定

【００６８】調製した全てのバッチの各組成の可溶化平
均時間を、表７に掲げる。

【表７】

【００６９】加熱による不活化後の最終生成物で得られ
た結果は、最終段階、即ち生成物を製剤化し、容器詰め
した際での、この処理が実施可能であることを確証する
ものである。必要な可溶化剤の濃度は、２％〜３％（計
量溶液で）が好ましい。なぜならばその濃度範囲での可
溶化時間または溶解物質の濁度に関して、濃度間の有意
差が認められないからである。同様にこれらの結果か
ら、２％〜３％のＡＭＣＨＡを有する製剤での非加熱処
理生成物と比較すると、加熱処理は、可溶化時間を３〜
５分延長させるだけで、ほとんど影響を与えないことが
推測される。

【００７０】ＡＭＣＨＡの濃度が、１％に等しいかまた
はそれ以下の場合、加熱処理は液体状態における有用な
寿命を減少させることにより、化合物のゲル化を促進す
るものと思われる。生成物の濁度は、記載した加工条件
下での加熱処理の結果として増加しない。

フロントページの続き (72)発明者 イェズス フェルナンデス ロドリゲス スペイン国．08850 ガヴァ（バルセロ ナ），アヴェニダ ディアゴナル，24

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生理学的に相溶性の溶媒を添加する際の
   可溶化時間を短縮させるための、ヒトアルブミンの同時
   添加による、ヒト血漿から、または組換え法または遺伝
   形質転換法により得られるヒトフィブリノゲン組成物の
   製剤用のトラネキサム酸の使用。
2. 【請求項２】 生成物を可溶化したときのトラネキサム
   酸濃度が、好ましくは２％〜８％であり、より好ましく
   は４％〜５％であり、組成物を加熱処理によりウイルス
   不活化することを特徴とする請求項１に記載のヒトフィ
   ブリノゲン組成物。
3. 【請求項３】 可溶化したときの製剤の主要蛋白質濃度
   が、アルブミンの場合０．５％〜１．５％であり、フィ
   ブリノゲンの場合６％〜８％であり、同様に組成物は、
   総蛋白に対して凝固性蛋白を７０％以上含有することを
   特徴とする請求項１に記載のヒトフィブリノゲン組成
   物。
4. 【請求項４】 可溶化した最終生成物中のグリシン濃度
   が０．１Ｍ〜０．４Ｍであることを特徴とする請求項１
   に記載のヒトフィブリノゲン組成物。
5. 【請求項５】 生成物を可溶化したときの生理食塩クエ
   ン酸塩の濃度が、塩化ナトリウム０．１Ｍ〜０．４Ｍで
   あり、クエン酸ナトリウム０．０２Ｍ〜０．１Ｍである
   ことを特徴とする請求項１に記載のヒトフィブリノゲン
   組成物。
6. 【請求項６】 加熱によるウイルスの不活化を、乾燥最
   終生成物について８０℃〜１１５℃の温度、５分〜１０
   ０時間の曝露時間で実施し、水性媒体中の可溶化を２０
   分未満、好ましくは２〜１５分、３５℃〜３７℃の好適
   な温度で実施することを特徴とする請求項１に記載のヒ
   トフィブリノゲン組成物。