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JP2856992B2 - ポリサッカライド、製造および産生株 - Google Patents

ポリサッカライド、製造および産生株

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JP2856992B2
JP2856992B2 JP4254818A JP25481892A JP2856992B2 JP 2856992 B2 JP2856992 B2 JP 2856992B2 JP 4254818 A JP4254818 A JP 4254818A JP 25481892 A JP25481892 A JP 25481892A JP 2856992 B2 JP2856992 B2 JP 2856992B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規ポリサッカライ
ド、シュードモナス(Pseudomonas)種の微生物を培養す
ることによりこれを得る方法およびその微生物、および
本ポリサッカライドを、濃厚化、ゲル化または安定化懸
濁液の粘性剤(viscosity agent)としての使用に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】種々の微生物によるポリサッカライド産
生が知られており、特にポリサッカライドの流動学的特
性は、水性媒体において懸濁化剤または濃厚化剤または
ゲル化剤としてのポリサッカライドの使用を可能にして
いる。例えば、キサンタンはインク、ペンキ、食品添加
物または医薬に含まれる。スクレオグルカンは石油掘削
に使用される。
【０００３】
【発明の構成】シュードモナス(Pseudomonas)属の微生
物株は、ノーマンディーの土壌試料から単離され、有機
炭素および窒素源、無機塩を含む通常の栄養培地で培養
されることにより、水性培体中での流動学的特性が特に
優れ、キサンタンと同じ型であるが、かなり低濃度でも
キサンタンと同程度であるポリサッカライドを分泌す
る。
【０００４】本発明の第１の態様はＰＳ−５Ｔ１と呼ば
れている細菌に関連し、このサンプルは１９９１年１１
月２４日にコレクション・ナショナル・ド・キュルテュ
ール・ミクロオーガニスム（ＣＮＣＭ）パリ、フランス
に番号Ｉ−１１４５でブタペスト条約にのっとって寄託
した。ＰＳ−５Ｔ１細菌は、グラム陰性菌である。平均
１．１−１．４５μｍ Ｘ０．７−０．８μｍの大きさ
の桿菌である。この株は、ＤＩＦＣＯ社製の寒天栄養培
地であるプレート・カウント・アガー上で丸く、ドーム
状の、黄色で光沢のあるコロニーを形成し、４８時間、
２８℃で直径２ｍｍに到達する。ＭＹ寒天培地（ＤＩＦ
ＣＯ社）中では、コロニーの見かけは同じで、もしイン
キュベーションを継続すると直径は大きくなる。
【０００５】ＰＳ−５Ｔ１細菌に関する物理学的および
生物学的特性は、ノエル・アール・クライヒら（１９７
４年）ベルギーズ・マニュアル(Bergey's Manual)、お
よびモルチマー・ピー・スタールら（１９８１年）ザ・
プロカリオーテス(The Prokaryotes)、に記載の方法に
従って測定し、第１表の通りである。
【表１】 第１表 ・チトクロームオキシダーゼ ＋ ・カララーゼ ＋ ・酸化−発酵試験 酸化 ・嫌気培養 − ・種々のＮａＣｌ濃度での増殖 ０．５％ ＋ １．０％ ＋ ２．０％ ＋ ２．５−６．０％ − ・６０℃３０分後の生存 ＋ １０9細胞中１０2細胞／ｍｌ ・種々の温度での増殖 ４℃ − ２０℃ ＋ ３０℃ ＋ ３２℃ − ３７−４０−５０℃ − ・トリフェニルテトラゾリウム存在下での増殖 ０．０１％で ＋ ０．０２％で ＋ ０．０５％で − ０．１％で − ・種々のｐＨでの増殖 ４；５；５．５ − ６．５；７；７．５ ＋ ８−９ ＋ １０から１２ − ・３個の糖鉄寒天上での増殖 （傾斜試験官の）斜面 色が変化 沈降物 − ・ガス産生 − ・Ｈ2Ｓ産生 − ・キングＡ培地上の色素 − ・キングＢ培地上の色素 − ・バーク培地上での増殖 − ・マロン酸の取り込み − ・セルロースの加水分解 − ・ペクチンの加水分解 − ・脱硝試験 −
【０００６】第２表は全の反応物をてＡＰＩシステム
社、ラ バルム−レ−グロト ３８３９０、モントリウ
ベールシウ（フランス）によって販売されているものを
用いて行った通常の酵素試験の結果である。
【表２】第２表 ・インドール − ・ボーゲス−プロスカウエル（ＶＰ） ＋ ・シモンのクエン酸 ＋ ・窒素還元 ＋ ・アルギニンジヒドロラーゼ − ・リジン脱炭酸酵素 − ・オルニチン脱炭酸酵素 − ・Ｈ2Ｓ産生 − ・ウレアーゼ試験 − ・卵黄反応（レクチナーゼ） − ・澱粉の加水分解 ＋ ・ゼラチンの加水分解 ＋ ・プロテアーゼ ＋
【０００７】本発明のポリサッカライドは通常の方法で
掻き混ぜられ、空気にさらされている適当な培養培地で
の細菌の発酵により得ることが可能である。ＰＳ−５Ｔ
１細菌は、アンモニウム塩が唯一の窒素源である培地で
は成育しないが、発酵培地には例えば酵母抽出液、豆粉
末、とおもろこし浸透リカー、ゼラチン、蒸留ドラフス
またはペプトンのような種々の蛋白起源が窒素源として
可能である。この特性は、水性液体培地中の濃度が０．
１％から１％（ｗ／ｖ）の濃度のとき引き出され、等価
の全窒素の重量は約０．１６から１．６ｇ／ｌである。
【０００８】この細菌は、例えばガラクトース、グルコ
ース、マンノース、アミグダリン、セロビオース、マル
トース、澱粉、グリコーゲンおよびラクトースのような
多数のの炭化水素を炭素源として用いることが可能で、
栄養培地はこれらの物質のうち１つまたはこれらの混合
物を含むことができる。一般的に、これらは２％から６
％（ｗ／ｖ）で液体発酵培地に添加されている。ＰＳ−
５ＴＩ細菌の培養に使用できる増殖因子である無機塩
は、Ｎａ、Ｋ、ＮＨ4、Ｃａ、Ｍｇ、ＰＯ4、ＳＯ4、Ｃ
ｌまたはＣＯ3イオンを提供する塩から選択される。Ｃ
ｕ、Ｍｎ、ＦｅまたはＺｎのような微量元素もまた、通
常の方法で、数ｐｐｍの濃度で栄養培地中に添加するこ
とが好ましい。
【０００９】本発明のポリマーを産生することを可能に
する発酵は、温度が２０℃から３２℃の間、好ましくは
２８℃で、培地のｐＨは６．５から９．０の間、好まし
くは７．０付近で、もし必要なら発酵の間中調製されて
ある撹拌および通気されている培地で行うことができ
る。発酵は３０時間から８０時間で培地が濃厚になり過
ぎる前まで続けられる。ポリサッカライドは発酵培地か
ら、培養の終了時に、好ましくは沈殿によって単離す
る。これを行うためには、エタノール、メタノールおよ
び好ましくはイソプロパノールのようなアルコールまた
はアセトンのようなケトンのような水と混合し得る溶媒
を滅菌後培地に添加する。細胞体および塩と共沈殿した
粗ポリサッカライドを、この方法で単離する。このポリ
サッカライドは天然のままであるという。
【００１０】これはそのまま、または塩を除去するため
に特に透析により、および上記の溶媒の１種の添加によ
り、一般にはイソプロパノールの添加により、１〜５ｇ
／ｌ、また好ましくは２〜３ｇ／ｌの低濃度水溶液によ
る再沈殿により、精製を行った後に用いることが可能で
ある。液体培地中での分散性を改善するために、本発明
のポリマーは他のポリペプチドに行うようにグルタール
アルデヒドのような脂肪族ジアルデヒドで処理すること
ができる。本発明の他の主題は、ＰＳ−５Ｔ１細菌の培
養により得られる５Ｔ１と名付けられた種々の形態での
ポリサッカライドであり、各主鎖に２個のＤ−マンノー
ス基、２個のＤ−グルコース、１個のＤ−ガラクトー
ス、１個のＤ−グルクロン酸、１個のＤ−キシロース、
１個のＬ−リキソースおよび１個のＬ−フコースで構成
される繰り返し単位を含むことを特徴とし、繰り返し単
位の中のあるサッカライドの水酸基は所望により、特に
酢酸エステル形にエステル化されていてもよい。
【００１１】培養および単離の条件に依存して、ポリサ
ッカライドは種々の形を取ることが可能で、主鎖に酢酸
エステル基およびピルビン酸エステル基を多かれ少なか
れ含むことができる。それぞれのポリサッカライドの構
造および配列は、通常の分析技術を用いて実際上均一の
マスサンプルから測定し、さらに具体的には５Ｔ１ポリ
サッカライドの形態は１連の９個のサッカライド基を主
鎖に含み、それにピルビン酸基がグラフト結合されてお
り、下記の構造式Ｉ：
【化２】 〔式中、Ｒは所望によりリキソース上に存在可能であ
り、Ｃ1−Ｃ6基を示す〕で表される。
【００１２】特定の形態の１種では、５ＴＩポリサッカ
ライドは３個の酢酸エステル基を結合している式Ｉで表
される生成物からなる。本発明の新規ポリマーの流動学
的特性は、特に下記の点で優れている。 −任意の温度での著しい溶解性 −牛乳との適合性 −高い収率 −溶液でキサンタンより粘性が高いことである。１％溶
液の粘度は２０％酢酸のような酸性媒体中、またはＮａ
Ｃｌ、Ｎａ2ＳＯ4またはＣａＣｌ2のような塩の存在下
でさえ安定で、溶液の温度が２０℃から９０℃に上昇し
た時でも変化しないが、ｐＨ＞１０で、粘性は消滅す
る。 −水性媒体中、Ａｌ3+、Ｆｅ3+またはＣｒ3+のような３
価カチオンの存在下での５Ｔ１ポリサッカライドゲル
は、このように、５０ｐｐｍのＡｌ3+、１００ｐｐｍの
Ｆｅ3+または２００ｐｐｍのＣｒ3+を含むポリマーの
０．５％水性溶液から安定なゲルが得られる。 単独または他の濃厚剤およびゲル化剤である、カラゲナ
ン、キサンタン、グアー、カローブ、アルギナートなど
との混合物で工業的または食品添加物として用いること
ができる。特に、化粧品、医薬または植物保護組成物、
織物用プリント色素、印刷用インク、ペンキ、セメント
およびドレッシング、クリーム状デザートのような食品
組成物、果物を含む、特にペクチンと混合した甘味組成
物、特にカラゲニンと混合したミルク用組成物に添加で
きる。
【００１３】以下は、本発明のポリサッカライドの製造
に関する実施例、構造および流動学的特性の測定法およ
び適応例を述べる。 実施例１ Ｉ−１１４５株であるシュードモナス細菌はＭＹ寒天培
地で培養した。４８時間、２８℃でインキュベーション
後、得られた培養培地はフラスコで１００ｍｌＭＹブロ
ス中での培養に用い、２４時間、２８℃でのインキュベ
ーション後、１０００ｍｌの同ブロスに導入し、培養し
た。最後に、１２時間の培養後、最終的に得られた細菌
を、５Ｔ１ポリサッカライドを産生するのに適当な、グ
ルコース（３５ｇ／ｌ）、豆粉末（５ｇ／ｌ）、Ｋ2Ｈ
ＰＯ4（３ｇ／ｌ）、ＭｇＳＯ4（１ｇ／ｌ）、ＭｎＳＯ
4（５０μｇ／ｌ）、ＦｅＳＯ4（５０μｇ／ｌ）、Ｚｎ
ＳＯ4（５０μｇ／ｌ）およびＣｕＳＯ4（５０μｇ／
ｌ）を含む１０リットルの栄養培地に添加し、発酵は２
８℃で、培地を掻き混ぜ、通気して、培地のｐＨを７に
維持して行った。約５０時間後、混合物を１５分間８０
℃で、いわゆる滅菌操作を行った。室温に戻した後、
２．５容のイソプロパノールを５Ｔ１ポリサッカライド
を沈殿させるために添加した。５５℃での乾燥の後、２
０ｇの期待した天然のポリマーを単離した。このように
して得られたポリッカライドは、約１０リットルの蒸留
水中へ添加し、懸濁液をキーセルゲル層を通して濾過す
ることができる、すなわち、３から５容のイソプロパノ
ールを濾液に添加することにより、いわゆる純粋なポリ
サッカライドが沈殿する。
【００１４】５Ｔ１ポリサッカライドの特性 粘度の測定は、２０℃で標準キサンタンについて、およ
び上記の実施例で得られたポリサッカライドについて、
塩化カリウム（１０ｇ／ｌ）の存在下で水溶液で、カン
パニー・コントラーブ（フランス）が市販しているレオ
マト・エルエス３０粘度計を用いて、１０ｇ／ｌ含む溶
液で種々の剪断速度で、または薄い濃度のための０．０
１秒-1の剪断速度のいずれかで行った。得られた曲線は
添付のFig.１および２に示した。軸を含み、標点が２ま
たは３で、１分間に３０回転し、所望により１０ｇ／ｌ
の塩化カリウムを含むことができる、種々の濃度の溶液
について、ブロックフィールド粘度計、ＬＶＦモデルを
用いて行った他の測定結果は、第３表に示した。 第３表 ポリマーの ＫＣｌ 軸の標点 粘度(mPa) 濃度(g/100ml) 天然物 精製物 ─────────────────────────────────── ０．５ − ３ ７６０ １２００ ０．５ ＋ ３ １２４０ １６４０ ０．２ − ２ １９０ ２８０ ０．２ ＋ ２ ２４０ ３５０ ０．０７５ − ２ ４４ ６２ ０．０７５ ＋ ２ ４６ ７０ ───────────────────────────────────
【００１５】構造研究 サッカライド断片は、所望により前処理およびアセチル
化可能である８０℃でＣＨ3ＯＨ／ＨＣｌでのポリマー
の断片化、またはトリフルオロ酢酸で１００℃で加水分
解後、還元およびついでアセチル化のいずれかで得た。
それらは一般的なガスクロマトグラフィーおよびマスス
ペクトルの組み合わせた方法で検討をした。上記実施例
の条件で得た精製５Ｔ１ポリサッカライドはつぎのよう
に前処理した： −ウロン酸を分解するためエチレンジアミン中のリチウ
ムで、 −鹸化の前および後に、キシロース、リキソースおよび
マンノースのみを分解するメタ過ヨウ素酸ナトリウム
で、 −イカトリアルのアノマー立体配置に過アセチル化され
たサッカライドを破壊する、酢酸中のＣｒＯ3で、 −β−脱離により過剰メチル化されたポリサッカライド
のウロン酸を分解する無水媒体中での強塩基（ジメチル
スルホキシド中のＬｉＣＨ3ＳＣ-）で。 酢酸置換基の存在の同定は、イオン交換カラム上液体ク
ロマトグラフィーで、５Ｔ１ポリサッカライドの加水分
解後行った。おそらくガラクトースの４および６ヒドロ
キシル基にアセタール結合により架橋しているピルビン
酸基は、ポリサッカライドおよびその過メチル化誘導体
のメタノリシスにより同定した。
【００１６】実施例２ 人造セメントの安定化 ８日間室温でまたは、４日間５０℃貯蔵後、ポルトラン
ドタイプセメントを５０重量％およびＰＳ−５Ｔ１を１
％含む水溶液は均一性および可鍛性を保っており、わず
かな表面硬化のみを示した。
【００１７】実施例３ クリーム状デザート 以下の組成をもつクリームを調製した： バニラクリーム チョコレートクリーム −スキムミルク粉 ３．５重量％ １．５ −砂糖 １０％ １２％ −澱粉 １．７％ １．７％ −ココア −− ３％ −バニラ香味料 ０．３％ −− −安定化剤＊ ０．２％ ０．１８％ −全ミルク 適量を加えて１００ 適量を加えて１００ ＊６５％（Ｗ／Ｗ）カラゲナンおよび３５％ＰＳ−５Ｔ１を含む。 乾燥させて前混合した材料を冷ミルク中へ分散させた。
１５分間水和した後、混合物をプレート交換機を通過さ
せ、以下の処理を行った： −９０℃での殺菌 −５０ｋｇ／ｃｍ2での均質化 −１３０℃での滅菌 −６５℃への冷却。 ついで、それらを詰めた。両方の場合にも、クリームの
最終的なテクスチャーは濃厚、滑らか、光沢があり、気
泡はなかった。カラゲナンまたはキサンタンのみを安定
化剤として含む対照クリームは、均一性の少ないテクス
チャーおよび外観であり、気泡があった：加えて、本発
明のクリームは装置中でよく流動した。
【００１８】実施例４ サラダドレッシング 以下の組成をした酸性サラダドレッシングを調製した、
即ち、 −水道水 ２５．０５重量％ −白ビネガー８° １５．９０％ −トマトピューレ（２８％） ３．６０％ −塩 ４．２０％ −こしょう ０．６０％ −砂糖 １０．４０％ −大豆油 ４０．００％ −安定化剤＊ ０．２５％ ＊安定化剤：キサンタンまたはＰＳ−５Ｔ１ポリサッカライド。 安定化剤は撹拌しながら、油中に分散させた（混合物
１）。他の乾燥材料は水中に撹拌しながら分散させた
（混合物２）。ビネガーはトマトピューレと混合した
（混合物３）。混合物１、２ついで３をハーバートホモ
ジナイザーへ連続して入れ、３分間真空で乳濁化し、詰
め、室温で保存した。ドレッシングの粘性は、詰める前
に測定した： ブルックフィールド ボストウィック(14cm) 粘性 流出時間 キサンタン ２４５０ｃｐｓ ５１秒 ＰＳ−５Ｔ１ ２８００ｃｐｓ ９４秒 本発明のドレッシングは、保存の間のより安定性である
ことが観察された。
【００１９】実施例５ 練歯磨： 以下の組成をした練歯磨を調製した： サッカリンナトリウム ０．２重量％ 安息香酸ナトリウム ０．５％ 安定化剤＊ １％ ピロリン酸ナトリウム ０．２５％ グリセリン ２２％ リン酸カルシウム ５３％ ラウリル硫酸ナトリウム １．５％ 香味料 適量 水 適量を加えて１００ ＊安定化剤：ＰＳ−５Ｔ１ポリサッカライドまたはキサンタン。 サッカリン、安息香酸塩、ＰＳ−５Ｔ１およびピロリン
酸塩を最初にグリセリン中へ分散させた。５分間撹拌後
水を添加し、ついで溶液を７５℃の水浴に１５分間おい
た。ついで撹拌しながら、リン酸カルシウム中へ注い
だ。１０分後、ラウリル硫酸塩および香味料をこの混合
物中へ注いだ。本発明の練歯磨は、外観が滑らかな心地
よいテクスチャーをしており、対照としてキサンタンで
得られたものより約３０％より安定である粘性を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】 10g/lを含む溶液の剪断速度を関数とする粘
度を示すグラフである。
【図２】 0.01秒-1の剪断速度での濃度を関数とする粘
度を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 7/16 Ａ２３Ｌ 1/195 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:38） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 19/04 A23L 1/05 C08B 37/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ２個のＤ−マンノース基、２個のＤ−グ
    ルコース基、１個のＤ−ガラクトース基、１個のＤ−グ
    ルクロン酸基、１個のＤ−キシロース基、１個のＬ−リ
    キソース基および１個のＬ−フコース基を含む主鎖をも
    つノナサッカライドを繰り返し単位として有するポリサ
    ッカライドであって、シュードモナス５Ｔ１ ＣＮＣＭ
    Ｎｏ．Ｉ−１１４５を２０−３２°Ｃで、ｐＨ６．５
    −９で、炭素源、有機窒素源および増殖因子を含有する
    通気した栄養培地中で培養し、エタノール、メタノー
    ル、イソプロパノールおよびアセトンから選ばれる水混
    和性溶媒で沈殿させることによって製造しうる該ポリサ
    ッカライド。
  2. 【請求項２】 １０ｇ／ｌの濃度で、約０．０１−１４
    ０秒-1の剪断速度で、約１０．５−３０００ｍＰａ．ｓ
    の範囲の粘度を有する請求項１記載のポリサッカライ
    ド。
  3. 【請求項３】 約５０−１０００ｐｐｍの濃度で、０．
    ０１秒-1の剪断速度で、約２−２０００ｍＰａ．ｓの範
    囲の粘度を有する請求項１記載のポリサッカライド。
  4. 【請求項４】 繰り返しノナサッカライド単位が式Ｉ 【化１】 （式中、Ｒは水素原子またはＣ1−Ｃ6基である。）で示
    される請求項１記載のポリサッカライド。
  5. 【請求項５】 Ｒが水素原子である請求項４記載のポリ
    サッカライド。
  6. 【請求項６】 ノナサッカライド単位の３個のサッカラ
    イドの水酸基がエステル化され、アセテートを形成して
    いる請求項４記載のポリサッカライド。
  7. 【請求項７】 シュードモナス５Ｔ１ ＣＮＣＭ Ｎ
    ｏ．Ｉ−１１４５を２０−３２°Ｃで、ｐＨ６．５−９
    で、炭素源、有機窒素源および増殖因子を含有する通気
    した栄養培地中で培養し、エタノール、メタノール、イ
    ソプロパノールおよびアセトンから選ばれる水混和性溶
    媒で沈殿させることを特徴とする請求項１−６のいずれ
    かに記載のポリサッカライドの製造法。
  8. 【請求項８】 Ｎｏ．Ｉ−１１４５でＣＮＣＭに寄託さ
    れたシュウードモナス菌株。
  9. 【請求項９】 ３価のカチオンの存在下水性ゲルを作製
    するための請求項１−６のいずれかに記載のポリサッカ
    ライドの使用。
  10. 【請求項１０】 濃厚化または安定化懸濁液を作製する
    ための粘性剤としての請求項１−６のいずれかに記載の
    ポリサッカライドの使用。
  11. 【請求項１１】 ノナサッカライド単位に少なくとも１
    個のピルビン酸基が結合している請求項１記載のポリサ
    ッカライド。
  12. 【請求項１２】 ３価のカチオンの存在下で、請求項１
    〜５および８のいずれか１項に記載のポリサッカライド
    を使用する水性ゲル化方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜５および８のいずれか１項
    に記載のポリサッカライドを含む濃厚化または安定化懸
    濁液のための粘性剤。
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