ES2585398B1 - Exopolisacárido bacteriano - Google Patents
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Abstract
Exopolisacárido bacteriano.#Pseudomonas sp. CECT8437 es una bacteria adaptada al frío aislada de una muestra de sedimento marino recogida de la Isla Decepción (Islas South Shetland, Antártida) que destaca por la apariencia altamente mucosa de sus colonias. Un exopolisacárido (EPS) se produce por esta cepa, que comprende glucosa, galactosa, fucosa y ácido urónico en una relación molar de 2:1:1:0,3 aproximadamente. El EPS muestra los siguientes porcentajes en peso, aproximadamente: 37,29% C, 6,17% H, 2,25% N y 0,41% S. Su peso molecular es mayor de 2 x 10{sup,6} Da. El EPS es útil para los siguientes propósitos: (i) agente crioprotector; (ii) agente emulsionante; (iii) agente espesante, estabilizante o texturizante; (iv) agente dermoprotector; y (v) agente para aumentar la elasticidad de la piel. El EPS puede usarse en composiciones cosméticas.
Description
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Salmonella typhimurium y Enterobacter sp. o Serratia sp. El analisis del EPS que producen muestra una composition de glucosa, galactosa, fucosa y acido glucuronico con una relation molar constante de 1:2:2:1.
En los ultimos anos, el analisis de EPSs bacterianos de ambientes polares se ha convertido en un campo de investigation activo, pero se han estudiado pocos de bacterias polares marinas psicrofilas o psicrotolerantes. Se han encontrado EPSs en bacterias marinas antarticas y del hielo artico invernal, que modifican el ambiente fisico-qwmico de las celulas bacterianas, participan en la adhesion celular a superficies y favorecen la retention de agua, la concentration de nutrientes, retienen y protegen los enzimas extracelulares contra la desnaturalizacion fria y actuan como crioprotectores.
Pseudoalteromonas sp. SM20310, aislada del hielo artico invernal, secreta un EPS compuesto principalmente por manosa, y trazas de glucosa, galactosa, ramnosa, N- acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina y xilosa (Sheng-Bo et al., "Structure and ecological roles of a novel exopolysaccharide from the Arctic sea ice bacterium Pseudoalteromonas sp. SM20310”, 2012, Applied and Environmental Microbiology doi:10.1128/AEM.01801-12). Otras bacterias adaptadas al frio aisladas de la Antartida son Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125, la cual sintetiza un EPS consistente en manosa y trazas de glucosa (Corsaro et al., "Influence of growth temperature on lipid and phosphate contents of surface polysaccharides from the Antarctic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis TAC 125”, Journal of Bacteriology, 2004, vol. 186. pp. 29-34), y Pseudoalteromonas arctica KOPRI 21653, con un EPS compuesto de galactosa y glucosa (Sung, J. K. et al., "Cryoprotective properties of exopolysaccharide (P-21653) produced by the Antarctic bacterium, Pseudoalteromonas arctica KOPRI 21653”, Journal of Microbiology, 2007, vol. 45, pp. 510-514).
Tambien se han descrito EPSs mas complejos de ambientes antarticos, incluyendo Pseudoalteromonas sp. CAM025, Pseudoalteromonas sp. CAM036, y otras cepas del mismo genero. El EPS producido por Pseudoalteromonas sp. CAM025 es un heteropolisacarido sulfatado con elevados niveles de acidos uronicos con grupos acetilo, y su composicion monosacaridica se estima que es glucosa, galactosa, ramnosa y acido galacturonico. La cepa Pseudoalteromonas sp. CAM036 tambien sintetiza un heteropolisacarido sulfatado con elevados niveles de acidos uronicos con grupos acetilo, compuesto principalmente por glucosa, manosa, arabinosa, acido
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galacturonico y N-acetilgalactosamina (Mancuso et al. “Production of exopolysaccharides by Antarctic marine bacterial isolates”, Journal of Applied Microbiology, 2004, vol. 96, pp. 1057-1066). Otros estudios han confirmado que los datos de composition quimica y peso molecular pueden ser muy diversos entre los EPSs producidos por aislamientos antarticos (Mancuso Nichols et al. “Chemical characterization of exopolysaccharides from Antarctic marine bacteria”, Microbial Ecology, 2005, vol. 49, 578-589), y es destacable que muchos de ellos presenten un alto contenido proteico.
Un hecho comun al analizar muchos ME secretados por bacterias adaptadas al frio, es su complejidad. Aunque los estudios de caracterizacion de ME bacterianos demuestran claramente que los EPSs son el mayor constituyente quimico, ahora esta claro que otras moleculas, concretamente protemas, lipidos, y acidos nucleicos tambien estan presentes en el ME. Un hallazgo importante es la presencia de estructuras particuladas llamadas Vesmulas de Membrana Externa (VMEs) en el ME que aumentan el contenido proteico de los EPSs. Las VMEs se producen durante el transcurso del metabolismo y crecimiento celular normal de la mayoria de bacterias Gram-negativas. Estas son vesmulas esfericas de bicapa lipidica extruidas de regiones de la membrana externa bacteriana y contienen lipopolisacarido, protemas periplasmicas, protemas de membrana externa y fosfolipidos (Kulp A. et al., “Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles”, Annual Review of Microbiology, 2010, vol. 64, pp. 163-184).
La complejidad del ME esta claramente demostrada en bacterias antarticas de diferentes generos, p.ej. Pseudoalteromonas, Shewanella, Psychrobacter, Marinobacter y otros. La mayoria del ME analizado estaba compuesto por heteropolisacaridos capsulares y grandes cantidades de VMEs (Frias, A. et al. “Membrane vesicles: a common feature in the extracellular matter of cold-adapted Antarctic bacteria”, Microbial Ecology, 2010, vol. 59, pp. 476-486 (errata en Microbial Ecology, 2010, vol. 60, p. 476). Muchas bacterias del genero Pseudomonas y otras bacterias patogenas producen grandes cantidades de VMEs implicadas en la liberation de toxinas frente a celulas eucariotas (Tashiro Y. et al, “Multifunctional membrane vesicles in Pseudomonas aeruginosa’’, Environmental Microbiology, 2011, doi:10.1111/j.1462-2920.2011.02632x). La presencia de VMEs secretadas por bacterias, como sucede en la mayoria de Pseudoalteromonas y otras cepas Gram- negativas, es un inconveniente ya que pueden dificultar la extraction y purification de
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los EPSs y al mismo tiempo aumentar su toxicidad y/o antigenicidad. El analisis de los componentes de las VMEs ha demostrado que las vesteulas contienen una amplia variedad de factores de virulencia. Estos factores de virulencia incluyen protemas, concretamente adhesinas, toxinas, y enzimas as^ como antigenos no proteicos como lipopolisacaridos (Ellis T.N. et al., "Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles”, Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2010, vol. 74, pp. 81-94). Ademas, el pequeno tamano de las VMEs, entre 20-200 nm, complica su separacion de los EPSs que son secretados simultaneamente por las bacterias.
El genero Pseudomonas es una de las fuentes de EPSs mas estudiadas. Varias especies del genero Pseudomonas son capaces de sintetizar una amplia variedad de exopolisacaridos. Muchos de ellos son polimeros de tipo alginatos, siendo los componentes principales el acido manuronico y el acido glucuronico. Tambien el exopolisacarido gelan, compuesto principalmente por glucosa, ramnosa y glucuronato esta sintetizado por especies del genero Pseudomonas. Cuando se utiliza la glucosa como fuente de carbono, Pseudomonas putida y Pseudomonas fluorescens sintetizan un EPS compuesto por glucosa, galactosa y piruvato. Se ha descrito que el EPS producido por P. fluorescens Biovar II esta compuesto por galactosa, manosa, ramnosa, glucosa, fucosa, ribosa, arabinosa y xilosa. El EPS purificado de P. putida G7 contiene los monosacaridos glucosa, ramnosa, ribosa, N-acetilgalactosamina y acido glucuronico. Similarmente, algunos investigadores han demostrado que el EPS aislado de Pseudomonas caryophylli CFR 1705 cultivada en un medio con lactosa esta compuesto por ramnosa, manosa y glucosa. Mas recientemente, un heteropolisacarido, compuesto por los azucares neutros galactosa, glucosa, manosa y ramnosa y que contiene grupos acetilo ha sido identificado en una cepa de Pseudomonas oleovorans crecida en glicerol puro o productos ricos en glicerol.
Aunque estudios moleculares han demostrado que la presencia de bacterias del genero Pseudomonas es bastante comun en ambientes marinos polares, hasta el conocimiento de los inventores, pocas de ellas procedentes de regiones polares han sido clasificadas a nivel de especie y no se han analizado los EPSs de estas cepas (Reddy et al. "Psychrophilic pseudomonads from Antarctica: Pseudomonas antarctica sp. nov., Pseudomonas meridiana sp. nov. and Pseudomonas proteolytica sp.”, Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, vol. 54, pp. 713-719).
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Asi pues is interesante encontrar alternativas a los EPSs bacterianos, que esten libres de protemas, para un uso adecuado y eficiente en la industria.
EXPLICACION DE LA INVENCION
Un aspecto de la presente invention se relaciona con a una cepa de Pseudomonas sp. depositada el 1.10.2013 con el numero CECT8437 en la "Coleccion Espanola de Cultivos Tipo", con direction en: "Edificio 2 CUE. Parc Cientific. Universitat de Valencia. Calle Catedratico Agustm Escardino, 9. 46980 Paterna (Valencia), Espana". La materia extracelular de esta cepa esta practicamente libre de VME en comparacion con otras bacterias de la Antartida.
Otro aspecto de la invencion se relaciona con un EPS bacteriano aislado de un cultivo de Pseudomonas sp. CECT8437. En una realization particular, el EPS comprende glucosa, galactosa, fucosa y acido uronico en una relation molar de 2:1:1:0,3 aproximadamente. en otra realizacion particular, el EPS tiene una composition elemental, en porcentajes en peso, de 37,29% C, 6,17% H, 2,25% N y 0,41% S. aproximadamente. En otra realizacion particular, el EPS tiene un espectro de infrarrojo transformado de Fourier con (en cm-1): una banda a 3400, un pico a 2930, un pico a 2985, una banda entre 1200 y 900, una banda a 1720, un pico a 1640 y un pico a 1540. Tambien son partes de la presente invencion las composiciones cosmeticas que comprenden cantidades efectivas del EPS e ingredientes o portadores cosmeticamente aceptables.
Otro aspecto de la presente invencion se relaciona con el uso de los EPSs antes mencionados para los siguientes propositos: (i) agente crioprotector; (ii) agente emulsionante; (iii) agente espesante, estabilizante o texturizante; (iv) agente dermoprotector; y (v) agente para aumentar la elasticidad de la piel.
Los EPSs de la presente invencion pueden ser hidrolizados, parcial o completamente, quimicamente, mecanicamente (p.ej. por sonicacion) o enzimaticamente, en condiciones analogas a las conocidas en la tecnica, para producir oligosacaridos de distintas longitudes, con caracteristicas diferentes de las de los nativos. Los respectivos productos hidrolizados obtenidos tambien son parte de la presente invencion; ellos pueden usarse como fuente de oligosacaridos y de monomeros de azucar como la L-fucosa, utiles en productos cosmeticos, productos farmaceuticos y
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suplementos alimenticios. En una realization particular la hidrolizacion es qwmica; preferiblemente por tratamiento con un acido; y mas preferiblemente por tratamiento con acido sulfurico, acido clorhidrico o acido trifluoroacetico. Por ejemplo, la hidrolizacion con acido sulfurico puede hacerse por tratamiento a 100-120 °C durante 0,5 hasta 8 horas, preferiblemente a 100-120°C durante 0,5 hasta 2 horas. Estos tratamientos de hidrolizacion producen mono- y/o oligosacaridos que frecuentemente son derivatizados en acetatos de alditol, metil glucosidos trimetil sililados, y glucosidos (-2)-butil trimetil sililados.
El EPS de la invencion es nuevo respecto a otros EPSs producidos por otras bacterias adaptadas al frio, Pseudomonas sp. u otras bacterias reportadas hasta la fecha.
El EPS de la invention tiene una actividad emulsionante frente diferentes aceites alimentarios y cosmeticos que es muy superior a la de emulsionantes comerciales, concretamente goma xantana, goma arabiga o Span 20. Forma emulsiones altamente estables frente al aceite cosmetico cetiol V, exhibiendo un comportamiento de flujo pseudoplastico, baja tixotropia y punto de fluidez, y confiere una crioproteccion significativa para la propia cepa asi como para otras bacterias, incluyendo E. coli, indicando un papel crioprotector universal. La actividad crioprotectora del EPS mostro una clara relation dosis-respuesta a -20 °C y -80 °C, a diferencia de lo que se observo cuando el estabilizante de membrana Suero Bovino Fetal (SBF) fue anadido a las celulas.
Debido a la amplia diversidad de composition y diferentes propiedades fisico- quimicas, los EPSs han emergido como nuevos materiales polimericos industrialmente importantes, los cuales se estan convirtiendo gradualmente en economicamente competitivos con las gomas naturales producidas por algas marinas y plantas. Ademas, los EPSs derivados de recursos naturales tienen una ventaja competitiva, debido a su biodegradabillidad y a menudo biocompatibilidad.
El EPS de la invencion no contiene cantidades detectables de VMEs, excluyendo por tanto proteinas potencialmente toxicas o compuestos antigenicos, concretamente lipopolisacaridos. Ademas, la ausencia de VMEs favorece sus procesos de obtencion y purification, todo lo cual lo hace deseable para usos particulares. Asi pues el EPS CECT8437 es un material atractivo para aplicaciones medicas tales como agente espesante, estabilizante, de union o texturizante.
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El EPS de Pseudomonas sp. CECT8437 es un polisacarido de tipo limo que esta unido debilmente a la superficie celular y, a diferencia de los polisacaridos capsulares, es principalmente excretado al medio extracelular. Cabe destacar que el ME de esta cepa no contiene cantidades significativas de VMEs, contrariamente a lo que se observa en el material extracelular de varias bacterias antarticas adaptadas al frio. La presencia de protemas y otros compuestos derivados principalmente de VMEs en los EPSs puede ser antigenica o toxica. El hecho de que la cepa de la invencion este libre de VMEs significa una ventaja tecnologica evidente sobre otros EPSs extraidos de Pseudomonas u otras bacterias Gram-negativas. El valor comercial del EPS de la invencion se basa principalmente en esta propiedad.
Se ha encontrado que el EPS de la presente invencion es un emulsionante mas eficiente frente a varios aceites alimentarios y el hidrocarburo n-hexadecano que otros EPSs bacterianos o gomas de plantas descritos en el estado de la tecnica, principalmente goma xantana y goma arabiga. Similarmente, el EPS demuestra una actividad emulsionante frente al aceite cosmetico cetiol V superior al emulsionante comercial utilizado como control positivo, Span 20. Ademas, se observo que el EPS de Pseudomonas sp. CECT8437 forma emulsiones estables a largo plazo con comportamiento pseudoplastico. Estos resultados, junto con su estabilidad, resaltan las potenciales aplicaciones del EPS de Pseudomonas sp. CECT8437 como agente emulsificante, con las atracciones adicionales de una produccion sostenible, no toxicidad y biodegradabilidad.
Las principales propiedades del EPS, concretamente su capacidad para formar emulsiones estables a largo plazo frente a diferentes aceites alimentarios y cosmeticos y su actividad crioprotectora universal, lo hacen una alternativa prometedora a los polisacaridos comerciales descritos en el estado de la tecnica.
A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras caracteristicas tecnicas, aditivos, componentes o pasos. Ademas, la palabra "comprende" abarca el caso "consiste en". Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la invencion se desprenderan en parte de la descripcion y en parte de la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustracion, y no se pretende que sean limitativos de la presente invencion. Ademas, la presente invencion cubre
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todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aqul indicadas.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
FIG 1: Espectro de Infrarrojo del EPS producido por Pseudomonas sp. CECT8437 (cf. Ejemplo 6).
FIG 2: Espectro 1H-RMN del EPS producido por Pseudomonas sp. CECT8437 (cf. Ejemplo 6).
FIG 3: Actividades emulsionantes (A540) del EPS, goma xantana y goma arabiga frente a los aceites de oliva, girasol y malz, y n-hexadecano tras 24h a temperatura ambiente. A: Aceite de oliva. B: Aceite de girasol. C: Aceite de malz. D: n-Hexadecano. Punteado: EPS. Diagonal: Goma xantana. Llneas planas: Goma arabiga. (cf. Ejemplo 7).
FIG 4: Reograma de las emulsiones con un 2% de EPS de Pseudomonas sp. CECT8437 y una mezcla de agua y cetiol V (1:2; v/v). El esfuerzo de cizalla (SS, shear stress) se representa por una llnea negra. La viscosidad (V) se representa por una llnea gris. SR = Indice de cizalla (shearrate) (cf. Ejemplo 9).
FIG 5: Perfiles de backscattering (BS) de la emulsion con un 2% de EPS y una mezcla de agua y cetiol V (1:2; v/v) en funcion de la altura de la muestra (SH, sample height), analizados a dlas 0 y 30 de almacenamiento a temperatura ambiente. Llnea gruesa: dla 0. Llnea gris: dla 30 (cf. Ejemplo 11).
FIG 6: Imagenes de microscopla electronica de transmision de celulas salvajes (wild- type) de Pseudomonas sp. CECT8437 (A), y celulas mutantes no productoras de EPS (B) (cf. Ejemplo 12).
FIG 7: Tasas de supervivencia (SUR, survival rates) de cultivos de E.coli ATCC 10536 congelados a -20 °C con EPS o SBF. Las tasas de supervivencia estan expresadas como porcentaje de celulas viables con respecto a las celulas no congeladas (n = 3). Marca en llnea basal: SBF. Entramado en diagonal: EPS (cf. Ejemplo 12).
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FIG 8: Tasas de supervivencia (SUR, survival rates) de cultivos de E.coli ATCC 10536 congelados a -80 °C con EPS o SBF. Las tasas de supervivencia estan expresadas como porcentaje de celulas viables respecto a las celulas no congeladas (n = 3). Marca en lmea basal: SBF. Entramado en cuadros: EPS (cf. Ejemplo 12).
FIG 9: Micrografias de microscop^a electronica de transmision de secciones ultrafinas de bacterias antarticas adaptadas al frio tras fijacion por alta presion y criosustitucion (High pressure-freezing and freeze-substitution, HPF-FS). Las barras son 200 nm. A: Pseudomonas sp. CECT8437. B: Pseudoalteromonas sp. C: Shewanella sp. NF22. D: Marinobacter sp. E: Psychrobacter sp. NF23. F: Shewanella sp. M7 (cf. Ejemplo 13).
FIG 10: Elasticidad (EL) de la piel tratada con placebo o con 0,2% de EPS. La elasticidad de la piel se expresa como el % de la elasticidad-neta en el dia 9 respecto al dia 0 y el control. Columna blanca: placebo. Columna negra: 0,2% de EPS.
FIG 11: Perdida de agua transepidermica (TEWL, transepidermal water loss) de la piel tratada con placebo o con 1% de EPS despues de la exposition a SLS. TEWL se expresa como porcentaje de TWEL tras el tratamiento won SLS con respecto al TEWL inicial. Columna blanca: placebo. Columna negra: 1% de EPS.
DESCRIPCION DETALLADA DE REALIZACIONES PARTICULARES
Pseudomonas sp. CECT8437 es una bacteria adaptada al frio que se aislo de una muestra de sedimento marino recogida en la Deception Island (South Shetland Islands, Antartida); es remarcable la apariencia altamente mucosa de sus colonias. El peso molecular del EPS de la invention se evaluo mediante cromatografia de exclusion por tamano (size exclusion chromatography, SEC) usando estandards convencionales de dextrano de peso molecular entre 8.8 x103 a 2 x 106, siendo el peso molecular de la EPS de la invention mayor de 2 x 106 Da (cf. Ejemplo 5). El analisis de monosacaridos y acido uronico del EPS de la invencion revela que comprende glucosa, galactosa, fucosa y acido uronico en una relation molar de 2:1:1:0.3 (cf. Ejemplos 2, 3).
La capacidad emulsionante del EPS de Pseudomonas sp. CECT8437 se ensayo frente a varios compuestos hidrofobicos, concretamente aceites alimentarios, cosmeticos e hidrocarburos. La FIG 3 muestra las actividades emulsionantes del EPS bajo
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condiciones neutras frente a tres aceites alimentarios diferentes y el n-hexadecano. El EPS exhibe una elevada capacidad emulsionante para los aceites de oliva, girasol y maiz, con una absorbancia a una longitud de onda de 540 nm (A540) de 1,28, 1,15 y 0,66, respectivamente. En todos los casos, el EPS mostro una mayor capacidad emulsionante que los emulsionantes comerciales goma xantana y goma arabiga, con la exception del aceite de girasol, con el cual el EPS mostro la misma actividad emulsionante que la goma xantana. El EPS tambien demostro una capacidad emulsionante superior frente al n-hexadecano a los controles positivos. La actividad emulsionante del EPS tambien fue ensayada frente al aceite cosmetico cetiol V utilizando otro protocolo de emulsification, y se comparo con el emulsionante cosmetico comercial Span 20. Se formaron emulsiones estables con una consistencia cremosa con un 2% de EPS, mientras que se necesito un 6% de Span 20 para conseguir el mismo grado de emulsificacion (cf. Ejemplo 7).
El comportamiento pseudoplastico del EPS de Pseudomonas sp. CECT8437 (cf. Ejemplo 9) lo convierte en un material atractivo para aplicaciones industriales y medicas como agente espesante, estabilizante, de union o texturizante, similar a otros EPSs bacterianos comercializados actualmente.
El potencial zeta (PZ) representa la carga electrica de la superficie de la particula de la emulsion, representando un parametro importante que permite la prediction de la estabilidad fisica de la emulsion. Si el valor del PZ es >|25|, las suspensiones de particulas tenderan a estabilizarse ya que las fuerzas de repulsion excederan a las de atraccion. Por otra parte, si el PZ es <|25|, las particulas se uniran hasta la floculacion ya que las fuerzas de atraccion seran mas fuertes. El valor PZ de las emulsiones con un 2% de EPS y una mezcla de agua y cetiol V (1:2; v/v) fue 0,1 ± 0,4 mV, lo que indico que las particulas de la emulsion tenian una carga superficial debil (cf. Ejemplo 10).
Los resultados del Turbiscan demuestran que la emulsion del EPS de la invencion con cetiol V fue altamente estable, y no se detecto variation del backscattering que indicara fenomenos de desestabilizacion como sedimentation, cremado, floculacion o coalescencia (cf. Ejemplo 11). Esta estabilidad no es debida a la carga electrostatica de las particulas, representada por el bajo valor PZ mostrado por el EPS. Es probable que la estabilidad de las emulsiones del EPS de Pseudomonas sp. CECT8437 sea debida a la estabilizacion esterica, un proceso comun entre los exopolisacaridos de
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elevado peso molecular, los cuales estabilizan las emulsiones formando una extensa red en la fase continua. El EPS consecuentemente se convierte en altamente viscoso, de manera que los movimientos de las gotas y encuentros se reducen.
Varios estudios han demostrado que la produccion de EPS en bacterias a bajas temperaturas es un mecanismo de adaptacion a temperaturas frias. Se ha descrito que Pseudoaltemmonas sp. CAM025 produjo 30 veces mas EPS a -2 °C y 10 °C comparado con 20 °C (cf. C.A. Mancuso Nichols et al., "Production of exopolysaccharides by Antartic marine bacterial isolates", Journal of Applied Microbiology, 2004, vol. 96, pp. 1057-1066). La produccion de EPS por la bacteria marina psicrofila Colwellia psychrerythraea cepa 34H es alrededor de 10 veces mas elevada a -8 °C que a -4 °C. El EPS de la invencion aumenta las tasas de supervivencia a temperaturas de congelacion de Pseudomonas sp. CECT8437 y celulas de otras especies (cf. Ejemplo 12). Esto indica los beneficios del EPS de la invencion para su uso como crioprotector.
A no ser que se especifique, los protocolos citados son accesibles en el libro de texto C. A. Reddy et al. (eds.), "Methods for General and Molecular Microbiology", 3rd Edition, ASM Press, Washington, USA (de aqu en adelante, el "libro de texto"), y factibles para la persona con conocimientos medios de la tecnica. En general, se realizaron tres medidas, y la estimacion del error es el error estandard de la media.
Ejemplo 1: Produccion del EPS
Pseudomonas sp. CECT8437 fue cultivada en el medio mmimo MM1: 20 g/l glucosa; 0,5 g/l bacto-peptona; 0,1 g/l extracto de levadura; 0,4 g/l citrato; 7 g/l NaNO3; 2 g/l K2HPO4; 0,7 g/l NaNH5PO4 • 4H2O; 0,1 g/l MgSO4 • 7H2O; 0,018 g/l FeSO4 • 7 H2O; 1 ml elementos traza. El cultivo fue incubado a 11 °C en un agitador orbital a 150 rpm durante 120 h. Para la obtencion del EPS, las celulas fueron retiradas del cultivo por centrifugacion (6000 rpm, 25 min, 4 °C). El sobrenadante libre de celulas fue reservado y los sedimentos fueron lavados tres veces con una solucion Ringer (Scharlau) y centrifugados (40000xg, 20 min, 4 °C) para retirar el EPS adherido a la superficie celular. Los sobrenadantes de los lavados se juntaron con el primer sobrenadante del cultivo y fueron sometidos a un proceso de filtracion de flujo tangencial a traves de membranas de 0,22 ^m (Millipore). El filtrado fue sometido a un proceso de dialisis con agua destilada esteril 1:10 (v/v) a traves de membranas de 10000 Da (Millipore) para
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retirar sales, pigmentos y otros componentes del medio de cultivo y para obtener un EPS concentrado y purificado. El producto resultante fue liofilizado.
Ejemplo 2: Caracterizacion del contenido proteico y de acidos uronicos.
El contenido total de acidos uronicos del EPS fue 2,40% ± 0,33% del peso total del EPS determinado por el metodo metahidroxidifenil (N. Blumenkrantz et al., "New method for quantitative determination of uronic acids", Analytical Biochemistry, 1973, vol. 54, pp.484-489). No se detectaron ni acido galacturonico ni acido glucuronico por la tecnica de HPLC. El contenido proteico del EPS determinado por el ensayo de Bradford (BioRad) fue menor del 2% del peso total del EPS obtenido.
Ejemplo 3: Preparation del producto hidrolizado y analisis de monosacaridos
Con el fin de analizar la composition de azucares neutros, la muestra del EPS del Ejemplo 1 fue hidrolizada con 1% H2SO4 a 111 °C durante 0,5 horas. El hidrolizado fue utilizado para identificar y cuantificar los monosacaridos constituyentes por Cromatografia Liquida de Alta Resolution (High-Perfomance Liquid Chromatography, HPLC) utilizando las columnas Aminex HPLC para analisis de carbohidratos HPX-87P (300 x 7,8 mm) y HPX-87C (300 x 7,8 mm) (BioRad). Agua miliQ a 85 °C fue utilizada como eluyente, y la detection fue llevada a cabo con un detector de mdice de refraction Waters 2414 (Waters). 15 azucares y amino azucares comerciales fueron utilizados como patrones para la identification de monosacaridos. Los resultados mostraron la presencia de los siguientes azucares neutros: glucosa en un 17,04 ± 0,32%, galactosa en un 8,57 ± 1,15%, y fucosa en un 8,21 ± 1,12%, en relation al peso total del EPS obtenido. La relacion molar de estos azucares y del acido uronico es 2:1:1:0,3 y permanece constante para el EPS.
Ejemplo 4: Analisis elemental
La composicion elemental del EPS fue analizada utilizando un analizador elemental organico Thermo EA 1108 (Thermo Scientific), trabajando en las condiciones estandares recomendadas por el proveedor del instrumento (flujo de helio a 120 ml/min, horno de combustion a 1000 °C, horno de la columna cromatografica a 60 °C, bucle de oxigeno 10 ml a 157 kPa). Los resultados mostraron un contenido de 37,29%
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± 1,07 de Carbono; 6,17% ± 0,10 de Hidrogeno; 2,25% ± 0,21 de Nitrogeno; y 0,41% ± 0,16 de Azufre.
Ejemplo 5: Cromatografia de Exclusion por Tamano
El peso molecular (PM) del EPS fue determinado por (size-exclusion chromatography, SEC) en un equipo de HPLC Waters 2695 equipado con una columna Ultrahydrogel 500 (7,8 x 300 mm; Waters) y un detector de mdice de refraccion diferencial (Waters 2414). 0,1 M NaNO3 fue utilizado como eluyente a temperatura ambiente. Patrones de dextrano (Sigma-Aldrich) de PM de entre 8,8 x 103 y 2 x 106 Da fueron utilizados para calibrar la columna para la estimacion del PM. Los resultados mostraron un peso molecular superior al patron de dextrano de mayor peso molecular disponible 2 x 106 Da segun Sigma.
Ejemplo 6: Espectroscopia FT-IR y RMN
Todos los espectros de FT-IR fueron obtenidos en el modo de transmision, utilizando una celula de compresion de diamante Thermo (Thermo Scientific). Los espectros fueron obtenidos en un area de 100 ^m x 100 ^m, con una resolucion de 4 cm-1 y 64 escaneres.
Los espectros de infrarrojo del EPS fueron adquiridos con un microscopio FT-IR Thermo 173 IN10MX (Thermo Scientific), utilizando un detector MCT enfriado con nitrogeno liquido. En el espectro de Infrarrojo Transformado de Fourier (Fourier Transform Infrared, FT-IR), la ancha e intensa banda alrededor de 3400 cm-1 representa el enlace O-H de los hidroxilos y agua ligada; los picos de los enlaces CH2 y CH3 aparecen a 2930 cm-1 y 2985 cm-1, respectivamente; las senales bien definidas que se encuentran entre 1200 y 900 cm-1 representan el esqueleto C-O y las bandas de vibracion de C-C de los carbohidratos; La banda a 1720 cm-1 puede atribuirse a los enlaces C-O de los carbonilos de los grupos acilo; El pico C-O de la amida 1 a 1640 cm-1 y el pico del enlace N-H de la amida 2 a 1540 cm-1 son tipicos de protemas (FIG 1). Esta deteccion de protemas esta en consonancia con el bajo contenido proteico detectado por el ensayo de Bradford y probablemente se debe a la lisis celular durante los procesos de obtencion y purificacion del EPS. En cualquier caso, el proceso de centrifugacion a alta velocidad esta validado como uno de los mejores metodos para
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evitar la lisis celular en la obtencion de EPSs de cultivos bacterianos (libro de texto pagina 366, caprtulo 15.3.8).
Los espectros de Resonancia Magnetica Nuclear de Proton (1H-RMN) se obtuvieron en D2O 99.96% (Euriso-top) a 25 °C usando un espectrometro Varian VNMRS500 (500 MHz, Varian Ltd). Los resultados estan en consonancia con la composition de carbohidratos del biopolimero, con picos marcados del componente glicano predominante (FIG 2). El analisis detallado del espectro del EPS no fue posible debido a la complejidad de la muestra, pero se puede observar la presencia de azucares en la region de protones anomericos (4,2-5,5 ppm) y en la region de protones de anillo (3,24 ppm). Las senales intensas a 1,2 ppm en el espectro del EPS podrian corresponder a los protones H6 metilo de la fucosa.
Ejemplo 7: Actividad emulsionante frente a aceites alimentarios, cosmeticos y n- hexadecano
Para ensayar la actividad emulsionante del EPS, se llevo a cabo un protocolo descrito (cf. Gutierrez et al., "Emulsifying and metal ion binding activity of a glycoprotein exopolymer produced by Pseudoalteromonas sp. strain TG12", Applied and Environmental Microbiology, 2008, vol. 74, pp. 4867-4876). La goma xantana y la goma arabiga (Sigma-Aldrich) se utilizaron como controles positivos. Las emulsiones se prepararon como se describe a continuation: se anadieron 20 mg del emulsionante analizado (EPS, goma xantana y goma arabiga) a 5 ml de PBS 0,1 M (0,02% p/v), y luego se mezclaron con 0,8 ml de n-hexadecano (Sigma-Aldrich), aceite de oliva, aceite de girasol o aceite de maiz utilizando un homogeneizador Ultra-turrax T10 basic (IKA) a velocidad 5 durante 1 min. Las emulsiones se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 24 h. Tras este tiempo, se determino la actividad emulsionante (A540) midiendo la turbidez de la capa acuosa inferior utilizando un espectrofotometro UV-1800 (Shimadzu) a 540 nm. Las actividades emulsionantes fueron comparadas bajo condiciones neutras (PBS 0,1 M, pH 7). Muestras de los aceites alimentarios correspondientes o el n-hexadecano y solucion salina tamponada con fosfato (phosphate-buffered saline solution, PBS) sin el EPS fueron utilizadas como control, y los valores A550 de estos controles se restaron a los del EPS, goma xantana y goma arabiga para obtener sus actividades emulsionantes finales.
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Tambien se ensayo la actividad emulsionante del EPS frente al aceite cosmetico cetiol V (Fagron), y se comparo con el emulsionante comercial Span 20 (Croda). Con este proposito, se preparo una mezcla de agua y el compuesto hidrofobico cetiol V en la proportion 1:2 v/v respectivamente. Despues, se anadio el EPS de la invention o Span 20 a diferentes muestras de la mezcla a una concentration de entre el 1% y el 12%, y las emulsiones se prepararon utilizando un homogeneizador Ultra-turrax T10 basic (IKA) a velocidad 5 durante 2 min. Emulsiones estables con una consistencia cremosa se formaron con un 2% de EPS, mientras que se necesito un 6% de Span 20 para conseguir el mismo grado de emulsification.
Se ensayo la estabilidad de la emulsion del EPS bajo varias condiciones de pH, temperatura y salinidad, resultando que las emulsiones se mantuvieron estables durante mas de cuatro meses a pH de entre 5 y 8, temperaturas de 4 °C a 42 °C y concentraciones de NaCl hasta 1 M.
Ejemplo 8: Analisis de tamano de las particulas
El analisis de tamano de las particulas de las emulsiones con un 2% de EPS, y una mezcla de agua y cetiol V (1:2; v/v) se llevo a cabo por difractometria laser (DL) utilizando un Mastersizer Hydro 2000MU (Malvern instruments) obteniendo el volumen de distribution de las particulas. Para el analisis DL se utilizaron los diametros 10, 50 y 90%: por ejemplo, un valor de DL90% indica que el 90% (distribucion de volumen) de las particulas medidas poseen un diametro igual o inferior que el valor dado. Las emulsiones con un 2% de EPS y una mezcla de agua y cetiol V (1:2; v/v) revelaron valores LD10% < 4,57 ^m ± 0,001, LD50% < 10,66 ^m ± 0,006 y LD90% < 20,36 ^m ± 0,03, respectivamente, indicando que las particulas de la emulsion estaban en el rango micrometrico, con el pico principal alrededor de 12 ^m.
Ejemplo 9: Medidas reologicas
Las medidas reologicas de las emulsiones con un 2% de EPS, y una mezcla de agua y cetiol V (1:2, v/v) se realizaron en un reometro Haake RheoStress 1 (Thermo Scientific) equipado con geometria cono y placa (diametro de placa 35 mm, angulo de cono 2°). Todas las medidas se llevaron a cabo a 25 °C. Se realizaron estudios de cizalla continua para evaluar el esfuerzo de cizalla (Pa) en funcion de la velocidad de cizalla (s-1). Este estudio se llevo a cabo con una velocidad de cizalla de 0-100 s"1
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durante 3 min, 100 s-1 durante 1 min y vuelta a 0 s-1 durante 3 min. Se midieron el esfuerzo de cizalla y la viscosidad resultantes. En los estudios reologicos, la curva de flujo de la emulsion con un 2% de EPS exhibio un comportamiento de flujo pseudoplastico, y una baja tixotropia y punto de fluidez (FIG 4). Sin embargo, las curvas de flujo del agua y cetiol V sin el EPS mostraron un comportamiento Newtoniano (datos no mostrados), indicando que las pseudoplasticidad era debida a la presencia del EPS en la emulsion. Ademas, la viscosidad estimada de la emulsion fue de 4,46 ± 0.007 Pas.
Ejemplo 10: Medida del potencial zeta
El potencial zeta (PZ) de las emulsiones con un 2% de EPS y una mezcla de agua y cetiol (1:2; v/v) se determino utilizando un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments) a 25 °C. El PZ se calculo a partir de la movilidad electroforetica utilizando la ecuacion de Helmholtz- Smoluchoswski (cf. S.R. Deshiikan et al. "Modified booth equation for the calculation of zeta potential", Colloid and Polymer Science, 1998, vol. 276, pp. 117124). El procesamiento de los datos fue realizado con el software incluido en el sistema. El valor PZ de las emulsiones con un 2% de EPS y una mezcla de agua y cetiol V (1:2; v/v) fue 0,11 ± 0,4 mV, el cual indico que las particulas de la emulsion teman una carga superficial debil.
Ejemplo 11: Estabilidad de la emulsion
La estabilidad de las emulsiones con un 2% de EPS y una mezcla de agua y cetiol V (1:2; v/v) se evaluo midiendo las variaciones en el backscattering utilizando un Turbiscan Lab Expert (Formulaction), basado en la dispersion multiangulo de luz laser. Debido a la opacidad de las muestras, solo se utilizaron los perfiles de backscattering (BS) para evaluar la estabilidad fisico-quimica de las emulsiones. Las medidas se llevaron a cabo a 25 °C con la emulsion recien preparada (dia 0) y un mes mas tarde despues de almacenarla a temperatura ambiente (dia 30).
La estabilidad de la emulsion del EPS tambien fue estudiada bajo varias condiciones de temperatura, salinidad y pH. Para las pruebas de estabilidad de pH, se prepararon mezclas con un 2% de EPS, agua con un pH de entre 5 y 9 y cetiol V (1:2; v/v) y se almacenaron a temperatura ambiente. Para las pruebas de estabilidad de temperatura, se prepararon mezclas con un 2% de EPS, agua ajustada a pH 7 y cetiol V (1:2; v/v) y
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se almacenaron a temperaturas de entre 4 °C y 42 °C. Finalmente, para los estudios de estabilidad de salinidad, se prepararon emulsiones con un 2% de EPS y mezclas de agua conteniendo hasta 1 M NaCl y cetiol V (1:2; v/v) y tambien se almacenaron a temperatura ambiente. La estabilidad de las emulsiones fue evaluada durante un periodo de 4 meses observando cambios en su apariencia macroscopica.
La estabilidad de la emulsion fue evaluada a partir del % BS a dias 0 y 30 en muestras almacenadas a temperatura ambiente. Como se puede observar en la FIG 5, los perfiles de la emulsion a dias 0 y 30 fueron extremadamente similares, y no se observaron fenomenos de coalescencia, floculacion, cremado, o sedimentacion, indicando una estabilidad a largo plazo de la emulsion del EPS. Ademas, las emulsiones permanecieron estables durante mas de cuatro meses a pH de entre 5 y 8, temperaturas de 4 °C a 42 °C y concentraciones de NaCl de hasta 1 M.
Ejemplo 12: Actividad crioprotectora
Obtencion de una cepa mutante no productora de EPS: Se obtuvo una cepa mutante no productora de EPS mediante mutagenesis con luz ultravioleta para evaluar la influencia del EPS en la preservation de las celulas cuando son sometidas a varias temperaturas de congelation. Para confirmar que la cepa mutante no produda EPS se utilizo una tincion con tetraoxido de rutenio para revelar los polisacaridos alrededor de las celulas bacterianas. Con este proposito, las celulas fueron sometidas a fijacion qtimica con un 5% de glutaraldetido en tampon cacodilato 0,1 M a pH 7,3 y 4 °C durante un periodo de una noche. Despues de ser lavadas durante 10 min con tampon cacodilato 0,1 M a pH 7,3 cinco veces, las muestras fueron incubadas dos veces con
0.25% de tetraoxido de rutenio y 0.25% de ferrocianida potasica en tampon cacodilato 0.1 M a pH 6.8 durante 1 h en oscuridad a 4 °C. Las muestras se lavaron cinco veces durante 15 min con agua miliQ a 4 °C y mantenidas en cacodilato 0,1 M a pH 6,8 y 4 °C hasta la criofijacion por alta presion. Para la criosustitucion, se utilizo una solution que contetia: 1% tetraoxido de osmio, 0,5% acetato de uranilo y 3% de glutaraldehido en metanol. La criosustitucion empezo a 72h a -90 °C, seguida de un calentamiento hasta 4 °C con una rampa de 5 °C/h, punto en el cual la temperatura se mantuvo durante 4 h. Una vez finalizado el proceso, las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente y en oscuridad a 4 °C. Despues fueron lavadas dos veces con metanol durante 2 h y lavadas tres veces con acetona durante 15 min. Finalmente, las muestras fueron infiltradas en Epon: metanol 1:3, 2:2 y 3:1 durante 3 h en cada paso y
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embebidas en Epon. Se obtuvieron secciones ultrafinas utilizando el ultramicrotomo UCT (Leica Mycrosystems), y se tineron con un 2% de acetato de uranilo y citrato de plomo. Las muestras fueron observadas con un microscopio electronico de transmision TEM Tecnai Spirit Twin (FEI) 120Kv. En las celulas salvajes (wt) de Pseudomonas sp. CECT8437, se observo claramente un material polimerico tenido alrededor de las celulas (FIG 6A), mientras que en las celulas mutantes no se observo esta capa en absoluto (FIG 6B) confirmando que la cepa mutante no era capaz de producir el EPS.
Ensayos de crioproteccion con Pseudomonas sp. CECT8437: Se cultivaron las celulas salvajes (wt) y mutantes (mt) de Pseudomonas sp. CECT8437 en placas de Triptona Soja Agar (TSA; Oxoid) a 10 °C durante 5 dias para alcanzar un crecimiento confluente. Se prepararon suspensiones de celulas wt y mt en una solucion Ringer y se ajustaron a una densidad optica de 0,6 (540 nm). Se prepararon alicuotas de 1 ml y se centrifugaron a 12000 rpm durante 30 min. Los sobrenadantes se descartaron, y los sedimentos celulares se congelaron a -20 °C y -80 °C. Tras una semana, se descongelaron las muestras, y los sedimentos se resuspendieron en 1 ml de solucion Ringer. La viabilidad celular se determino por el metodo de diluciones seriadas, y la tasa de supervivencia se expreso como el porcentaje de celulas viables respecto a las celulas no congeladas (Tabla 1). Queda demostrado que la cepa wt exhibio tasas de supervivencia significativamente mas elevadas que la cepa mt en todas las temperaturas ensayadas.
Tabla 1: Tasas de supervivencia de las cepas salvaje y mutante despues de congelar las celulas a -20 °C y -80 °C, expresadas como el porcentaje de celulas viables respecto a las celulas no congeladas (n = 8)
- Cepa salvaje Cepa mutante
- -20 °C
- 75,19 ± 8,06 40,27 ± 5,97
- -80°C
- 93,53 ± 12,18 49,94 ± 7,43
Ensayos de crioproteccion con E.coli.: Escherichia coli ATCC 10536 fue cultivada en Caldo de Triptona y Soja (TSB) hasta una densidad optica de 0,6 (540 nm). Se mezclaron alicuotas de 0,1 ml con diferentes concentraciones del EPS de entre 0% y 10%, hasta un volumen final de 1 ml. Las muestras se congelaron a -20 °C y -80 °C
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durante una semana, se descongelaron y se determino el numero de celulas viables mediante el metodo de diluciones seriadas. La tasa de supervivencia se expreso como el porcentaje de celulas viables respecto a las celulas no congeladas. El suero bovino fetal (SBF) se utilizo como control porque se utiliza como estabilizante de membranas en procedimientos de congelation. Como se muestra en FIG 7 y FIG 8, el EPS tambien confirio crioproteccion a las celulas de E.coli, con una clara relation dosis- respuesta en todas las temperaturas ensayadas y una tasa de supervivencia maxima (35,68% a -20 °C y 64,13% a -80 °C) con una concentration de EPS del 10%, y sin la adicion de ningun agente crioprotector que pudiera penetrar en las celulas, como el dimetilsulfoxido (DMSO) o el glicerol. Esta relacion dosis-respuesta no se observo con el SBF, y las tasas de supervivencia obtenidas a cualquier concentracion de SBF fueron inferiores al 0,4% y consideradas nulas en los graficos.
Ejemplo 13. Ultraestructura del material extracelular y EPS de Pseudomonas sp. CECT8437 y otras bacterias antarticas adaptadas al frio.
Todas las cepas fueron cultivadas en trypticase soy agar (TSA, Oxoid) e incubadas durante 3 dias a 15° C. Se seleccionaron colonias bacterianas al azar para el examen por microscopia electronica de transmision (MET) seguida de fijacion por alta presion y criosustitucion (High-pressure freezing and freeze substitution, HPF-FS) (libro de texto, paginas 66, 67, caprtulo 4.2.4). Se cortaron secciones ultrafinas con un ultramicrotomo Leica UCT y se montaron en rejillas recubiertas de carbon Formvar. Las secciones fueron tenidas posteriormente con un 2% (p/v) de acetato de uranilo acuoso y citrato de plomo y examinadas en un microscopio electronico Tecnai Spirit (FEI Company) a un voltaje de aceleracion de 120 kV. Como se muestra en la FIG 9, todos los materiales extracelulares de bacterias antarticas adaptadas al frio que se analizaron, con exception de Pseudomonas sp. CECT8437, aparecieron como una malla en forma de red compuesta de un polimero capsular alrededor de las celulas y grandes cantidades de vesiculas de membrana externa (VMEs, ver flechas).
Ejemplo 14: Tests in vivo de elasticidad y propiedades dermoprotectoras en seres humanos
Se realizaron tests con eficacia de 0.2%, 1% y 5% de EPS sobre voluntarios humanos entre 24 y 64 anos, durante 9 dias.
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A todos los voluntarios se les instruyo para evitar el uso de ningun producto topico sobre el antebrazo derecho durante las 48 h previas al experimento. Para obtener medidas fiables, los voluntarios se aclimataron durante 15 min en una sala climatizada, 23 °C y 50% de humedad relativa, antes de realizar los ensayos.
Para estudiar el efecto del EPS sobre las propiedades de la piel, se delimitaron cinco areas de 4 cm2 en el antebrazo derecho de cada voluntario: cuatro areas para aplicaciones topicas de las formulaciones (tres concentraciones diferentes de EPS y del placebo) y un area no tratada como control. En el dia 0, se midieron la elasticidad y la perdida transepidermica de agua (transepidermal water loss, TEWL) en cada area. Despues, se aplicaron 20 ^l de cada muestra diariamente durante 7 dias. Se midio la TEWL por triplicado en los dias 2, 4 y 9, midiendo la elasticidad por triplicado en los dias 0 y 9.
La elasticidad de la piel se evaluo con un dispositivo Cutometer® SEM 575 (Courage & Khazaka). Los voluntarios tratados con 0,2% de EPS mostraron un incremento del 13.28% en elasticidad de la piel comparados con aquellos tratados con el placebo (FIG 10).
El efecto dermoprotector del EPS tambien se evaluo. Para ello, tras acabar todas las medidas cutaneas, todas las areas previamente tratadas se pusieron en contacto con un 2% del tensioactivo laurilsulfato sodico (LSS) durante 2 h, y se evaluo la TEWL 2h 30 min despues de la exposicion al LSS.
Con el fin de evaluar la funcion protectora de piel, se uso un dispositivo Tewameter® TM 300 (Courage & Khazaka) para medir la TEWL. Los voluntarios tratados con 1% de EPS mostraron un porcentaje mas bajo de TEWL (154.28%) tras la aplicacion del agente irritante LSS, en comparacion con los tratados con el placebo (181.83%; FIG 11). Esto muestra que el EPS es un agente dermoprotector que fortalece la piel contra agresiones externas.
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REIVINDICACIONES
1. Una cepa de Pseudomonas sp. con numero de deposito CECT 8437.
2. Un exopolisacarido aislado de un cultivo de Pseudomonas sp. con numero de deposito CECT8437.
3. El exopolisacarido segun la reivindicacion 2, que comprende glucosa, galactosa, fucosa y acido uronico en una relacion molar de 2:1:1:0,3 aproximadamente.
4. El exopolisacarido segun cualquiera de las reivindicaciones 2-3, que comprende los siguientes porcentajes en peso, aproximadamente: 37,29% C, 6,17% H, 2,25% N y 0,41% S.
5. El exopolisacarido segun cualquiera de las reivindicaciones 2-4, con un espectro de infrarrojo transformado de Fourier que comprende, en cm-1: una banda a 3400, un pico a 2930, un pico a 2985, una banda entre 1200 y 900, una banda a 1720, un pico a 1640 y un pico a 1540.
6. Uso del exopolisacarido definido en cualquiera de las reivindicaciones 2-5, como agente crioprotector.
7. Uso del exopolisacarido definido en cualquiera de las reivindicaciones 2-5, como agente emulsionante.
8. Uso del exopolisacarido definido en cualquiera de las reivindicaciones 2-5, como agente espesante, estabilizante o texturizante.
9. Uso del exopolisacarido definido en cualquiera de las reivindicaciones 2-5, como agente dermoprotector.
10. Uso del exopolisacarido definido en cualquiera de las reivindicaciones 2-5, para aumentar la elasticidad de la piel.
Claims (3)
11. Una composition cosmetica que comprende una cantidad cosmeticamente efectiva del exopolisacarido definido en cualquiera de las reivindicaciones 2-5, e ingredientes o portadores cosmeticamente aceptables.
5 12. Un producto hidrolizado obtenido por hidrolizacion del exopolisacarido definido en
cualquiera de las reivindicaciones 2-5, siendo la hidrolizacion quimica y/o mecanica y/o enzimatica.
13. El producto hidrolizado segun la reivindicacion 12, donde la hidrolizacion es 10 quimica.
14. El producto hidrolizado segun la reivindicacion 13, donde la hidrolizacion quimica se lleva a cabo por tratamiento con un acido.
15 15. El producto hidrolizado segun la reivindicacion 14, donde el acido se selecciona del
grupo que consiste en acido sulfurico, acido clorhidrico y acido trifluoroacetico.
FIG 1
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