JP2777489B2 - ペプチド、抗体、抗体の製法並びにα１―ミクログロブリンを測定する方法及び試験片 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、試料液体中のヒトα１
−ミクログロブリンをイムノアッセイ法により測定する
方法並びに試料液体中のα１−ミクログロブリンを分析
測定するための試験担体及び試料液体を本発明による試
験担体で分析試験する方法に使用することのできるペプ
チド及び抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質ＨＣとしても知られているα
１−ミクログロブリンはヒト血清、脳脊髄液及び尿中に
出現する。血しょう中ではα１−ミクログロブリンは遊
離形でもまたＩｇＡとの複合体でも出現する。それはα
２μ−グロビン−タンパク質系に包含され、この系には
例えばタンパク質α２μ−グロビン、β−ラクトグロブ
リン、レチノール結合タンパク質、アポリポタンパク質
Ｄ、嗅上皮からのＢＧタンパク質及びα１−ミクログロ
ブリンも包含される。これらのタンパク質の生物学的機
能は体液中の疎水性低分子の結合及び輸送であると思わ
れる［Ｈｕｎｔ及びその他共著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． １４９（１９８
７），２８２〜２８８；Ｇｏｄｏｖａｃ−Ｚｉｍｍｅｒ
ｍａｎｎ，ＴＩＢＳ １３（１９８８），６４〜６
６］。α１−ミクログロブリンはインタ−α−トリプシ
ンインヒビターと一緒に“プレプロ”−タンパク質とし
て合成されかつプロセシングにより遊離される［Ｋａｕ
ｍｅｙｅｒ及びその他共著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１４（１９８６），７８３９〜７８５０］。

【０００３】α１−ミクログロブリン（以下α１Ｍとも
記載する）はアミノ酸１８３個からのモノマータンパク
質であり［Ｋａｕｍｅｙｅｒ及びその他共著、Ｎｕｃ
ｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４（１９８６）、７８３９
〜７８５０、第２図参照、ａａ２０〜ａａ２０２、Ｎ末
端Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｖａｌ、Ｃ末端Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａ
ｒｇ］、このタンパク質は３つのアミノ酸部位５、１７
及び９６で炭水化物側鎖を有しかつＣｙｓ⁷²及びＣｙｓ
¹⁶⁹の間でジスルフィド架橋を形成する［タカギ及びそ
の他共著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎ．９８（１９８１）、９９７〜１００１、
Ｋａｕｍｅｙｅｒ及びその他によるアミノ酸部位、前記
文献参照］。α１−ミクログロブリン−タンパク質と詳
細不明の発色団が会合し、この発色団はタンパク質を黄
褐色に着色する。

【０００４】尿中のα１−ミクログロブリン濃度は健康
者で＜１０ｍｇ／ｌである。腎臓に障害がある場合、分
子量約３０ｋＤのα１−ミクログロブリンを含む低分子
量タンパク質が不完全にしか吸収されずかつ尿中に多量
に出現する（タンパク質尿）。α１−ミクログロブリン
の場合は２００ｍｇ／ｌまでの濃度に達する［Ｗｅｂｅ
ｒ及びその他共著、Ｋｌｉｎ．Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ．
６３（１９８５）、７１１〜７１７］。α１−ミクログ
ロブリンは臨床的に重要な尿のｐＨ範囲４〜１０で安定
であり［Ｙｕ及びその他共著、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ
ｏｌ．３６（１９８３）、２５３〜２５９］かつ−２０
℃で安定に貯蔵することができる［Ｗｅｂｅｒ及びその
他共著、前記文献参照］。それ故、α１−ミクログロブ
リンは尿細管腎機能の好適な指標になる。

【０００５】従来はα１Ｍの検出に関しては混濁測定だ
けが知られている。その際に例えば試料中に含まれてい
るα１Ｍを場合によりラテックス結合している、α１Ｍ
に対する抗体と直接凝集させかつ生成した混濁を比濁分
析により測定する。しかしこの方法は比濁計でしか実施
し得ない。

【０００６】他の方法は、生成した混濁を暗い背景に対
して視覚的に測定することである。しかしこの方法は時
間的ロスが大きく、数個の作業工程を必要とし、かつ定
性的結果だけが得られる。

【０００７】イムノアッセイでは単離したヒトα１−ミ
クログロブリンを使用することが不利である。それとい
うのもこのタンパク質は単一の物質ではなく、顕著な負
荷不均質性を呈しかつ既に記載したように従来詳細不明
の発色団を含有しているからである［Ｇｒｕｂｂ及びそ
の他共著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（１９８
３)、１４６９８〜１４７０７参照]。このタンパク質は
ヒト体液から取得しなければならない。それ故、多量に
かつ均一な品質で製造することは困難である。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】それ故、本発明は、技
術水準の欠点を排除し、かつ視覚的に実施可能であり、
かつほぼ定量的結果をもたらすか又は自動分析計で規定
通りに進行するα１Ｍ試験を開示することをベースとし
ていた。更に、α１−ミクログロブリンに類似の免疫特
性を有し、かつそれ故α１−ミクログロブリンを測定す
るための免疫検定に簡単に使用することのできる物質を
開示することが必要である。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明によりこの課題
は、最高でアミノ酸４０個の長さでありかつ構造Ａ−Ｒ
−Ｂを有し、ここでＲはヒトα１−ミクログロブリンの
アミノ酸１４４と１８３との間のアミノ酸部分配列： Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ− Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ− Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ− Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ− Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ からの少なくとも６個の連続する、ヒトα_１−ミクログ
ロブリンに対する抗体に結合性のアミノ酸配列を含有
し、Ａ及びＢは任意のアミノ酸配列であるペプチドによ
り解決され、その際にこのペプチドがアミノ酸１５８〜
１８３の部分配列からの少なくとも６個の長さのアミノ
酸配列を含有すると優れている。

【００１０】本発明中には、最高でアミノ酸４０個の長
さでありかつ構造Ａ−Ｒ−Ｂを有し、ここでＲはヒトα
１−ミクログロブリンのアミノ酸１〜２０： Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ａｓｎ− Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ− Ｓｅｒ−Ａｒｇ のアミノ酸部分配列からの少なくとも６個の長さのアミ
ノ酸配列を含有し、Ａ及びＢは任意のアミノ酸配列であ
るペプチドに関しても記載する。

【００１１】本発明によるペプチドはヒトα１−ミクロ
グロブリンの特別な部分配列からの少なくとも６個のア
ミノ酸と共に、任意に選択することのできる総数最高４
０までの他のアミノ酸を含有していてよい。本発明の優
れた実施形ではこの他のアミノ酸は、天然ヒトα１−ミ
クログロブリン中の前記の少なくとも６個のアミノ酸に
隣接しているものと同じである。

【００１２】本発明の優れた実施形では、本発明による
ペプチドは前記のアミノ酸に加えて担体タンパク質部分
を有し、本発明によるペプチドは融合タンパク質であ
る。このような融合タンパク質は高い発現性について
も、担体タンパク質部分が関与する他の性質についても
望ましい。例えば、この担体タンパク質部分は融合タン
パク質を遺伝子工学的に製造する際に発現生成物の有利
な局在化をもたらし、それ故簡単に取得することができ
る。その製造は公知方法で、例えば相応して融合された
ＤＮＡを発現ベクター中に挿入し、次に発現させかつ融
合タンパク質を取得することにより行なうことができ
る。本発明範囲において担体タンパク質部分が３個のア
ミノ酸だけ短縮した、ガラクトース結合タンパク質ＧＢ
Ｐのタンパク質配列であると有利である。他の優れた実
施形では担体タンパク質部分はα１Ｍの部分配列、殊に
２０個までのアミノ酸を含有していてよい。担体タンパ
ク質部分の発現に使われるＥ．コリ（ｃｏｌｉ）からの
ｍｇｌＢ遺伝子はクローン化されておりかつそのＤＮＡ
配列は知られている［Ｎ．Ｍｕｅｌｌｅｒ著、Ｍｏｌ．
Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８５（１９８２）、４７３〜４
８０；Ｓｃｈｏｌｌｅ及びその他共著、Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０８（１９８７）、２４７〜２５
３］。プラスミド−コード化ＧＢＰタンパク質（ｐＶＢ
１プラスミド、Ｓｃｈｏｌｌｅ及びその他共著、前記文
献参照）はｍｇｌＢプロモータの抑制解除後にＥ．コリ
全タンパク質の３０％まで過剰発現した。比較可能な過
剰発現は、３′末端に局在化した特異的なＥｃｏＲＩ制
限切断部位の、ｍｇｌＢ構造遺伝子の停止コドンの前の
１２個の塩基対を介して構成されたＧＢＰ融合タンパク
質に関して見出された。これによりＣ末端で３個のアミ
ノ酸が短縮したＧＢＰ融合成分（３０７アミノ酸）が生
成する。分泌したＧＢＰ融合タンパク質は可溶性であり
かつ簡単に浸透圧ショックにより宿主細胞の溶解なしに
遊離する［Ｎｅｗ及びＨｅｐｐｅｌ共著、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５４（１９６５）、７５２９〜７５３
３］。特に優れた融合タンパク質は担体タンパク質部分
と共に、Ｎ末端配列内に（アミノ酸１〜２０）かつまた
Ｃ末端配列内に（アミノ酸１４４〜１８３）存在する本
発明によるペプチド配列を含有する。

【００１３】本発明によるペプチドは化学的に合成する
か又は相応するＤＮＡ配列をプラスミド中に導入しかつ
好適な宿主細胞中で発現させることにより得られる。本
発明によるペプチドは、α１−ミクログロブリンの免疫
学的反応性を必要とするが、構成及び均質性に関して標
準化された抗原が有利であるすべての使用分野に好適で
ある。

【００１４】本発明の他の優れた実施形ではペプチドは
結合対の１つの成分と結合しており、その際にそれは有
利にビオチンであり、結合対の他の成分は（ストレプ
ト）−アビジンである。他の好適な結合対は例えばハプ
テンとこれに対して作用する抗−ハプテン−抗体であ
る。

【００１５】本発明の他の目的は、本発明によるペプチ
ドとも、またヒトα１−ミクログロブリンとも特異的に
結合性である抗体である。本発明範囲ではポリクローナ
ル抗体もまたモノクローナル抗体も含まれる。しかし本
発明の優れた実施形ではモノクローナル抗体である。特
に優れているのは細胞系ＥＣＡＣＣ９００７１９０６か
ら得られるようなモノクローナル抗体である。

【００１６】本発明の他の目的は、公知方法で好適な動
物を天然α１−ミクログロブリン又は本発明によるペプ
チドで免疫化し、抗体を取得し、かつ天然ヒトα１−ミ
クログロブリンともまた本発明によるペプチドとも特異
的に結合性である抗体を選択する、本発明による抗体の
製法である。

【００１７】本発明方法はポリクローナル抗体の製法も
またモノクローナル抗体の製法も包含する。このような
方法は当業者に公知である。

【００１８】本発明によるモノクローナル抗体を取得す
るに当り、実験動物、例えばマウスを患者の尿からのヒ
トα１−ミクログロブリンで免疫化する。免疫化に当
り、免疫原を例えばアジュバントと組合せて常法で投与
する。アジュバントとしては水酸化アルミニウムをボル
デテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａｐｅｒｔｕ
ｓｉｓ）又はフロイントアジュバントと一緒に使用する
と優れている。免疫化を数カ月間にわたって４〜６週間
間隔で少なくとも４回免疫化すると有利である（腹腔内
注射）。

【００１９】このように免疫化した動物の脾臓からＢリ
ンパ細胞を取得し、これを永久骨髄腫と融合させる。こ
の融合は公知方法により行なう［Ｋｏｅｈｌｅｒ及びＭ
ｉｌｓｔｅｉｎ共著、Ｎａｔｕｒｅ２５６（１９７５）
４９５〜４９７］。形成されたハイブリッド細胞の一次
培養物を常法で、例えば市販の細胞選別機の使用下に又
は“限界稀釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏ
ｎ）”によりクローン化する。好適な試験法で、例えば
酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ法）で患者の尿から単
離したα１−ミクログロブリンに対してもしくは例１〜
８又は１３〜１４に挙げたペプチドに対してポジチブに
反応する培養物をそれぞれ更に処理する。このようにし
て、本発明によるモノクローナル抗体を産生する数個の
ハイブリドーマ細胞系が得られる。公知方法によりこの
細胞系を培養しかつそれから産生されたモノクローナル
抗体を単離することができる。このようにして得られた
細胞系の例はクローン６．０４５．７５（ＥＣＡＣＣ９
００７１９０６）である。この細胞系は寄託機関ＥＣＡ
ＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に前記の
番号で寄託されている。

【００２０】本発明による抗体の選択は例１５に記載さ
れているように行なうことができる。

【００２１】本発明の他の目的は試料液体中のヒトα１
−ミクログロブリンをイムノアッセイにより測定する方
法であり、その際に試料液体を規定量の本発明による成
分の抗体及びペプチドと同時に又は順次に接触させ、そ
の際に成分の一方が標識化されておりかつこの標識を介
して測定を行なう。イムノアッセイとしてはすべての公
知の測定法が好適である。

【００２２】例えば標識した本発明による抗体を試料液
体と予備恒温保持することができ、その際に抗体は試料
中のα１−ミクログロブリンの予測量に対して過剰量で
存在し、その後で予め恒温保持したバッチを固相に結合
した本発明によるペプチドと恒温保持すると、過剰分の
標識抗体はこれにより分離される。相分離後、液相中で
抗体の標識を測定し、それにより試料中に存在するα１
−ミクログロブリンの量を求めることができる。成分の
恒温保持を同時に行なうことができるが、この場合は抗
体を試料中のα１−ミクログロブリンの予測される濃度
とほぼ同量で添加する。試験を実施するための他の可能
性は、第１工程で固相に結合している本発明によるペプ
チドを標識した本発明による抗体と恒温保持し、その後
で試料液体を添加し、それによりペプチドは試料中のα
１−ミクログロブリンと抗体に対して競合反応をし、か
つ固相に結合している本発明によるペプチドに結合して
いる抗体の一部が分離しかつ試料からのα１−ミクログ
ロブリンに結合することである。検出は固相でも液相で
も行なうことができる。

【００２３】他の試験別法は、本発明による抗体を固体
担体に結合させかつ標識した本発明によるペプチド及び
試料液体と恒温保持することである。この場合も両方の
抗原が抗体に対して競合し、検出は抗体を介して固相に
結合した本発明によるペプチドの標識を介して行なう。
最後に、ＦＰＩＡ原理（けい光−分極−イムノアッセ
イ）により実施する方法も好適である。この際に、けい
光染料で標識した本発明によるペプチドを抗体及び試料
液体からの抗原と恒温保持し、その際にペプチドの標識
が抗体への結合により変化する。

【００２４】本発明の優れた実施形では標識していない
成分を固体担持材料に結合させかつ標識の測定は液相及
び固相の分離後に行なう。

【００２５】本発明で標識としては、酵素標識、けい光
染料標識、放射性標識、金又は二酸化セレンによる標識
もしくは着色重合体、例えばラテックス粒子による標識
を適用することができる。しかし本発明では標識として
酵素を使用しかつこれを酵素色素形成反応を介して検出
すると優れている。特に優れている酵素はβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ又はペルオキ
シダーゼであり、これらは基質のクロルフェノールレッ
ド−β−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−ニトロフェノール−ホ
スフェート及びＡＢＴＳを介して相応して検出される。
本発明の他の優れた実施形では標識としてけい光染料を
使用し、そのけい光量子収量又は脱分極能が試料液体中
のα１−ミクログロブリンの濃度に相応する抗体への結
合により変化する。

【００２６】本発明方法では抗体としてモノクローナル
抗体を使用すると優れている。固体担体への一方の成分
の結合は特異的結合対を介して、つまり特異的結合対の
一部を固体担体に結合させかつ結合対の他方の部分を成
分と結合させて行なうと有利である。本発明範囲で特に
優れた特異的結合対はビオチン／（ストレプト）−アビ
ジン系である。

【００２７】検出反応を微量滴定板又は試験管中で実施
することも優れており、それらの固体担体としての凹部
の底又は壁に一方の成分を結合させておく。

【００２８】本発明は、ベース層上に相互に平均に設け
られており、毛管作用物質より成り、相互に液体接触す
る数個のゾーンを有する、試料液体中のα１−ミクログ
ロブリンを分析測定するための試験片にも関し、該試験
片が、成分である本発明による抗体及び本発明によるペ
プチドの一方を固定形で含有しかつ他方の成分を標識形
で含有する第１試薬系を１つの反応ゾーン中に包含し、
かつ場合により、他方の成分の標識の測定を可能にする
第２試薬系を包含する検出フィールドを有することを特
徴とする。本発明による試験片のゾーンは、相互に液体
接触するので液体搬送区間を形成し、この区間に沿って
液体が毛管力により反応ゾーンから検出フィールドに流
動する。その際に、試料液体は規定量の本発明による成
分の抗体及びペプチドと同時に又は順次に接触し、その
際に成分の一方は標識されておりかつ測定を検出フィー
ルド上のこの標識を介して行なう。更に、標識成分は複
合体とも表わされる。

【００２９】このような試験担体、その成分及び試験担
体を使って行なう原理的な試験は一般的にヨーロッパ特
許公開第０３７４６８４号明細書、同第０３５３５７０
号明細書及び同第０３５３５０１号明細書に記載されて
いる。しかしながら本発明による試験担体はα１−ミク
ログロブリンの特異的測定のために構想されているので
あり、それ故相応する本発明による抗体を含有する。

【００３０】試験担体を構成するのに使われる材料につ
いては前記のヨーロッパ特許公開第０３７４６８４号明
細書、同第０３５３５７０号明細書及び同第０３５３５
０１号明細書に記載されている。

【００３１】本発明による試験片では固定した抗体と標
識した本発明によるペプチドとの組合せ物を複合体とし
て又は固定した本発明によるペプチド及び標識した抗体
を複合体として使用すると有利である。

【００３２】本発明による試験片は基本的に２つの部
分、即ち反応ゾーン及び検出フィールドより成る。

【００３３】反応ゾーンで試料液体を吸収させる。本発
明の優れた実施形では反応ゾーンは最適な反応経過の条
件（例えばイオン濃度、ｐＨ値）を調節することのでき
る他の物質を含んでいる。反応ゾーンで抗体と試料から
のα１−ミクログロブリンとの間で免疫反応が行なわれ
る。この反応に基いて試料中のα１Ｍ含量と相関関係に
ある、標識された複合体の量が検出フィールドに到達
し、かつそこで標識を介して相応する検出法（例えばけ
い光又は反射）により検出する。

【００３４】本発明による試験片の反応ゾーンは基本的
に相互に並んで設けられている毛管作用の試験フィール
ド１個又は数個より成り、それは相互に液体接触するの
で、それが液体搬送区間を形成し、この区間に沿って液
体が毛管力により搬送ゾーンを通って検出フィールドに
流動する。反応ゾーンのフィールド数は絶対的ではなく
かつ免疫反応に必要な試薬を別個に又は一緒にフィール
ドに施すべきかどうかに左右される。それ故、すべての
試薬を一緒に唯一のフィールドに施すこともでき、また
は反応ゾーンを異なるフィールドに、例えば開始フィー
ルド、緩衝液フィールド、複合体フィールド及び捕集フ
ィールドに分割することもでき、これらは連続的に設け
られていなければならない。隣接するフィールドは任意
に組合せることもできる。例えば緩衝液フィールドと複
合体フィールド又は吸収フィールド、緩衝液フィールド
及び複合体フィールドが１つのフィールドを形成するこ
とができる。

【００３５】それ故、本発明の優れた実施形では本発明
による試験片は、反応ゾーンが種々のフィールドに区分
されていて、そのフィールドが検出フィールド方向に開
始フィールド、緩衝液フィールド、複合体フィールド及
び捕集フィールドの順序を有し、その際に開始フィール
ドでは試料液体の採取が行なわれ、緩衝液フィールドは
反応経過の最適化のための物質を含有し、複合体フィー
ルドは第１試薬系の標識成分及び捕集フィールドは固定
成分を含有し、かつ隣接するフィールドは記載の順序で
任意に相互に組合わせうるように構成されている。

【００３６】この実施形では、本発明による試験片は場
合により第１フィールドとして開始フィールドを含む。
開始フィールドは試料液体への接触をもたらす。それ
故、このフィールドは液体を自然にかつ完全に吸収しか
つ更に良好に導くかもしくは放出するようなものであ
る。これを保証するために、試験片の開始フィールドを
例えば測定の間常に試料液体中に含浸しておいてよい。

【００３７】開始フィールドから場合により分離してい
る緩衝液フィールドは、最適な反応経過の条件（例えば
イオン濃度、ｐＨ値）をもたらす補助物質を含有する。
緩衝液フィールドは多孔性材料、殊にセルロース、ポリ
エステル又はナイロンをベースとするフリースより成
る。

【００３８】緩衝液フィールドには場合により複合体フ
ィールドが接続している。複合体フィールドは基本的に
標識とα１−ミクログロブリンに対する抗体もしくは本
発明によるペプチドとから複合体を分離可能な形で含有
する。好適な担体材料及び複合体を施す方法は例えばヨ
ーロッパ特許公開第０３５３５７０号明細書に記載され
ている。特に好適なのはポリエステル、セルロース又は
ガラス繊維をベースとする多孔性材料である。

【００３９】複合体フィールドには場合により捕集フィ
ールドが接続している。このフィールドは、複合体とし
て抗体と標識とからの複合体を使用する場合には本発明
によるペプチドを又は複合体として本発明によるペプチ
ドと標識とからの複合体を使用する場合には固定化抗体
を結合形で含有する。固定化は公知方法で、例えば化学
的に又は免疫沈降により行なう。捕集フィールドの物質
に生物学的結合成分、例えば（ストレプト）−アビジン
が結合しかつ抗体もしくは本発明によるペプチドが他の
生物学的結合成分、例えばビオチンに結合するように添
加すると有利である。生物学的結合成分の結合（例えば
ビオチン／ストレプトアビジン−結合）を介して本発明
によるペプチドもしくは抗体の固定化を達成する。この
ような固定化法は例えばヨーロッパ特許公開第０３７４
６８４号明細書に記載されている。

【００４０】優れた実施形では少なくとも複合体フィー
ルドと緩衝液フィールドが組合わされている。他の優れ
た実施形では少なくとも複合体フィールドと捕集フィー
ルドを組合せておく。その場合、免疫学的予備反応で固
定化成分に既に複合体、つまり標識成分が結合してい
る。試料の添加後に、試料中に含有されているα１−ミ
クログロブリンが複合体の部分量を圧排するかもしくは
複合体として標識抗体を使用する場合には圧排反応にお
いてこの抗体を固定化ペプチドから分離する。この圧排
された複合体が検出フィールドに流動しかつそこで検出
される。

【００４１】他の優れた実施形では、反応ゾーンは少な
くとも２つの分離したフィールドを包含する。第１フィ
ールド（緩衝液／複合体フィールド）では反応誘導に最
適な条件の調節並びに試料のα１−ミクログロブリンと
標識抗体との間の免疫反応が行なわれる。反応ゾーンの
第２フィールド（捕集フィールド）では免疫反応の固定
化成分との反応が行なわれ、その際に試料中に含まれる
α１−ミクログロブリンの量に相応する量の複合体が溶
解しておりかつそれが検出フィールドに搬送される。

【００４２】反応ゾーンに、場合によりその捕集フィー
ルドに検出フィールドが接続している。この検出ゾーン
が捕集フィールドの上方に又は下方に設けられていると
有利である（ヨーロッパ特許公開第０３５３５００号明
細書参照）。殊に、検出ゾーンは、標識成分と接触する
際に観察することのできる変化を受ける、標識に好適で
ある検出基質を含む試薬系を含有するか、あるいは直接
測定することのできる標識（例えばけい光標識）を使用
する際には複合体の直接的な検出に有用である。基質が
含まれている場合、殊にこのゾーンは疎水性に封鎖され
ている溶出可能なフィルム又は織物もしくはフリースか
ら成る。このような担体は例えばヨーロッパ特許公開第
０３５３５０１号明細書に記載されている。こうするこ
とにより、試料液体がフィールド末端に到達した後で基
質を担体から溶出しかつ検出反応が開始される。

【００４３】このような試験片はヨーロッパ特許公開第
０３７４６８４号明細書に記載されている。

【００４４】本発明の他の目的は本発明による試験片を
試料液体中のα１−ミクログロブリンの測定に使用する
ことであり、その際に試料液体を反応ゾーンもしくは場
合により存在する開始ゾーンに施しかつ測定を基質フィ
ールドに到達した標識成分の標識を介して行なう。

【００４５】本発明によるペプチド、抗体及び試料液体
中のα１−ミクログロブリンの定性的及び定量的検出法
でのその使用並びにこの検出を実施するための試験片に
より、尿中のα１−ミクログロブリンの量により明らか
にすることのできる腎機能の試験系を開示することがで
きる。本発明によるそのような試験片並びにそのような
試験片を使用する測定により連続試験に好適な形で、腎
機能に障害がある場合にはその障害について迅速に解明
することができる。その際に例えば試料液体の尿を試験
片の反応ゾーンと接触させるだけでかつ一定の作用時間
後に検出フィールドの色の変化を測定する。

【００４６】

【実施例】次に本発明を添付図面の図１〜３並びに下記
の配列番号ＳＥＱ ＩＤＮＯ．１〜９により操作順に詳
説する。

【００４７】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１：α１Ｍ（ａａ１
６１〜１８３）のＣ末端領域の合成に使用したオリゴデ
オキシヌクレオチド（例２．１） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２：ｍｇｌＢ−Δα１Ｍ−Ｃ−融
合遺伝子のＤＮＡ配列及びそれから誘導したＧＢＰ−Δ
α１Ｍ−Ｃ−融合タンパク質のタンパク質配列（例２．
１） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３〜８：α１−ミクログロブリン
遺伝子の部分領域の合成に使用した（ａａ５４〜８７）
−（ａａ１６１〜１８３）オリゴデオキシヌクレオチド
（例２．２） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９：ｍｇｌＢ−Δα１Ｍ−融合遺
伝子のＤＮＡ配列及びそれから誘導したＧＢＰ−Δα１
Ｍ−融合タンパク質のタンパク質配列（例２．２） ＤＮＡ操作に当っては標準法を使用した［例えばＭａｎ
ｉａｔｉｓ及びその他共著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ出版、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８
９）に記載されている］。

【００４８】略語： ＡＢＴＳ（登録商標）：２，２′−アジノ−ジ−［３−
エチルベンズチアゾリン−スルホン酸−（６）］ジアン
モニウム塩 ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム ａａ：アミノ酸ツイーン（Ｔｗｅｅｎ：登録商標）２
０：ポリエトキシソルビタンラウレート ＰＯＤ：ペルオキシダーゼ ＲＳＡ：牛血清アルブミン Ｆｃγ：ＩｇＧのＦｃフラグメント Ｍｔｒ：メトキシトリメチルフェニルスルホニル Ｏｔ Ｂｕ：オキシ第三ブチル Ｓｔ Ｂｕ：ｔ−ブチルスルフェニル

【００４９】

【化１】

【００５０】

【化２】

【００５１】

【化３】

【００５２】

【化４】

【００５３】

【化５】

【００５４】

【化６】

【００５５】

【化７】

【００５６】

【化８】

【００５７】

【化９】

【００５８】

【化１０】

【００５９】

【化１１】

【００６０】例１ 基本発現プラスミドｐＶＢ１ ＥＨ（ＤＳＭ６０８１）
の構成 ハイブリッドタンパク質の発現のためにｐＶＢ１プラス
ミドもしくはその誘導プラスミドを使用する。ｐＶＢ１
はＥ．コリプラスミドｐＢＲ３２２からの２．３ｋＢｐ
の長さのＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩＩ−ベクターフラグメン
ト（アンピシリン耐性、複製開始点）及び付加的にＥ．
コリからの完全なｍｇｌＢ遺伝子をコードする長さ２．
２ｋＢｐのＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ−フラグメント［Ｓｃ
ｈｏｌｌｅ及びその他共著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ． ２０８（１９８７）２４７〜２５７］を含有す
る。融合タンパク質を構成するに当り、停止コドンの前
方で、３′末端に局在する単独のＥｃｏＲＩ制限切断部
位１２Ｂｐを使用する。

【００６１】ＧＢＰ融合タンパク質の構成に当り（Ｅｃ
ｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−フラグメントの挿入）、ｐＶ
Ｂ１プラスミド中の単独ＤｒａＩＩ制限切断部位をクレ
ノウポリメラーゼで埋めかつＨｉｎｄＩＩＩリンカー
（ｄ（ＣＧＡＡＧＣＴＴＣＧ））を使用する（構成：ｐ
ＶＢ１ＥＨ；図１）。

【００６２】例２ ＧＢＰ−Δ１α−ミクログロブリン（ＧＢＰ−Δα１
Ｍ）融合タンパク質の構成、発現及び分泌 ２．１ ＧＢＰ（ａａ１〜３０６）−α１Ｍ（ａａ１６
１〜１８３） α１−ミクログロブリン遺伝子のＣ末端領域（アミノ酸
部位１６１〜１８３）をハイブリッド化（反応緩衝液：
１２．５ｍｍｏｌ／ｌ トリス／ＨＣｌ，ｐＨ７．０及
び１２．５ｍｍｏｌ／ｌ ＭｇＣｌ₂）により２つの化
学合成したオリゴデオキシヌクレオチド（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ．１）から製造した。

【００６３】その後、“ＤＮＡ−アダプター”を長さ約
４．５ｋＢｐのｐＶＢ１／ＥＨ ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ−ベクターフラグメントに連結した（構成：ｐＶ
Ｂ１／ＥＨ−Δ１αＭ−Ｃ）。ＤＮＡ配列決定によりア
ダプターのＤＮＡ配列を固定した。ＧＢＰ−Δ１αＭ−
Ｃ融合タンパク質及びコードするそのＤＮＡ配列はＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ．２に詳しく記載されている。

【００６４】２．２ ＧＢＰ（ａａ１〜３０６）−α１
Ｍ（ａａ５４〜８７）−α１Ｍ（ａａ１６１〜１８３）
融合タンパク質 ２．２．１ α１−ミクログロブリン遺伝子の部分領域
の化学合成 α１−ミクログロブリン遺伝子（約２００Ｂｐ）の中央
部（ａａ５４〜８７）及び選択したＣ末端（ａａ１６１
〜１８３）の領域をオリゴデオキシヌクレオチド６個を
介して直接融合合成した。２つのバッチでそれぞれ３つ
の相補性オリゴヌクレオチドを“アニーリングし”かつ
２つの所望のハイブリッド化生成物をゲル電気泳動によ
り精製した。両方の単離した約１００Ｂｐの長さの遺伝
子ブロックを再度アニーリングした後で５′−もしくは
３′末端で単独のＢａｍＨＩ−及びＨｉｎｄＩＩＩ制限
切断部位を有する長さ約２００Ｂｐの遺伝子ブロックを
長さ約４ｋＢｐのｐＢＲ３２２ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｂａｍ
ＨＩ−ベクターフラグメント（構成：ｐＢＲ３２２−Δ
α１Ｍ）に連結した。その後で挿入断片を配列決定し
た。使用したオリゴデオキシヌクレオチド及びクローニ
ング戦略はＳＥＱ ＩＤＮＯ．３〜８及び図２に示され
ている。遺伝子合成はＷｏｓｎｉｋ及びその他により研
究された方法［Ｇｅｎｅ６０（１９８７）１１５〜１２
７］により行なう。

【００６５】２．２．２ プラスミドｐＶＢ１／ＥＨ−
Δα１Ｍの構成 プラスミドｐＢＲ３２２−Δα１ＭをＢａｍＨＩで消化
させ、ＢａｍＨＩ切断部位の突出している５′末端をク
レノウポリメラーゼで埋めかつＤＮＡ末端に適合するＥ
ｃｏＲＩリンカー（ｄＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ）を設
けた。その後ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで後切断し
かつ長さ約２００ＢｐのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−
フラグメントを長さ約４．５ｋＢｐのｐＶＢ１／ＥＨ−
ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ−ベクターフラグメントに
連結した（構成ｐＶＢ１／ＥＨ−Δα１Ｍ）。ＧＢＰ−
Δα１−ミクログロブリン−融合タンパク質及びコード
するそのＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に記載さ
れている。

【００６６】２．３ Ｅ．コリ中で融合タンパク質の発
現 宿主菌株としてＥ．コリＫ１２菌株ＲＭ８２ｌａｃ
⁺［ｍｅｔ⁺、ｌａｃ⁺ＥＤ８６５４の復帰突然変異体；
Ｍｕｒｒａｙ及びその他共著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．１５０（１９７７）５３〜６１、ＤＳＭ５４４
６］を使用した。この菌株をプラスミドｐＶＢ１／ＥＨ
−Δα１ＭもしくはｐＶＢ１／ＥＨ−Δα１Ｍ−Ｃで形
質転換しかつアンピシリン５０ｍｇ／ｌ及び１％グルコ
ースを含有するＤＹＴ培地［１．６％バクトトリプトン
（Ｄｉｆｃｏ）、１％イーストエキス（Ｄｉｆｃｏ）、
０．５％ＮａＣｌ］中で３０℃で発現させて５５０ｎｍ
で５〜８の光学密度まで培養した。ｍｇｌＢプロモータ
の抑制解除に当り遠心分離した細胞を１容量の醗酵培地
からグルコースを含まず５０ｍｇ／ｌアンピシリンを含
有する５〜１０容量の新しいＤＹＴ培地に移しかつ１４
〜２０時間抑制解除した。その後、細胞をこの抑制培地
１ｍｌから収穫しかつＧＢＰ−Δα１Ｍ−融合タンパク
質の発現及び細胞局在化を例３に記載されているように
細胞分別、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット分
析により解明した。細胞分別に当りペリプラズムタンパ
ク質を浸透圧ショック［Ｎｅｕ及びＨｅｐｐｅｌ共著、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４（１９６５）７５２９
〜７５３３］によりＥ．コリ細胞から遊離させかつ残留
する細胞ペレットを例３に記載されているように砕解し
た（細胞画分：ａ）ペリプラズムタンパク質；ｂ）残留
可溶性Ｅ．コリタンパク質；ｃ）カオトロピック試薬で
抽出可能な不溶性Ｅ．コリタンパク質）。

【００６７】融合タンパク質は天然プラスミドコード化
ＧＢＰタンパク質（３０８ａａ）と同様に試験宿主菌株
中でＥ．コリ全タンパク質に対して３０％まで合成され
た。＞９０％がペリプラズム中に分泌され、可溶性であ
り、凝集せずかつ浸透圧ショックにより細胞から遊離し
た。ＧＢＰ−Δα１Ｍ−融合タンパク質のα１−ミクロ
グロブリンエピトープは、天然α１Ｍタンパク質に対し
て作用するポリクローナル（Ｄａｃｏｐａｔｔｓ及びＳ
ｅｒｏｔｅｃ社のα１Ｍ−抗血清）及びモノクローナル
の抗体により認識された。

【００６８】２．４ ＧＢＰ−Δα１Ｍ−融合タンパク
質の単離 ローラ培地もしくは振盪培地（前記参照）５ｍｌ中での
培養に基いて、プラスミドｐＶＢ１／ＥＨ−Δα１Ｍで
形質転換したＲＭ８２ｌａｃ⁺細胞を５ｌ醗酵槽中で培
養し（バイオマス収量：約２０ｇ／ｌ湿式重量）、ＧＢ
Ｐ−Δα１Ｍ融合タンパク質を浸透圧ショック［Ｎｅｕ
及びＨｅｐｐｅｌ共著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５
４（１９６５）７５２９〜７５３３］により細胞から遊
離しかつ残留細胞を遠心分離した。この簡単だがまさに
効率的な精製工程の後で、所望のＧＢＰ−Δα１Ｍ−融
合タンパク質を公知のタンパク質精製工程、例えばイオ
ン交換クロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、Ｈ
ＩＣクロマトグラフィ（疎水性相互作用クロマトグラフ
ィ）、ゲル濾過、親和性クロマトグラフィ及び沈殿によ
り簡単に均質になるまで精製することができる。濾過し
た（ニトロセルロースフィルター、孔径０．４５μｍ）
“浸透圧ショック調製物”からＧＢＰ−Δα１Ｍ−融合
タンパク質をクロマトフォーカシング（平衡化緩衝液：
２５ｍｍｏｌ／ｌピペラジン（ＨＣｌ）、ｐＨ５．５；
ｐＨ範囲：５→４）、次にフェニルセファロースを用い
る疎水性クロマトグラフィ［平衡化緩衝液：１０ｍｍｏ
ｌ／ｌトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．０、４０％硫酸アンモ
ニウム（４℃に対するＡＳ飽和値）；溶離勾配：１０ｍ
ｍｏｌ／ｌトリス／ＨＣｌ展開緩衝液、ｐＨ７．０中で
ＡＳ４０％→０％、エチレングリコール０％→７０％
（ｖ／ｖ）］及び透析により精製した。

【００６９】例３ 細胞砕解、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロット分析 遠心分離した培地１ｍｌからの細胞ペレットを１０ｍｍ
ｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液ｐＨ６．８及び１ｍｍｏｌ／ｌ
ＥＤＴＡ０．２５ｍｌ中に再懸濁させかつ細胞を超音
波処理により砕解した。遠心処理後、上澄みに１／５容
量の５×ＳＤＳ−試料緩衝液（１×ＳＤＳ−試料緩衝
液：５０ｍｍｏｌ／ｌトリス（ＨＣｌ）ｐＨ６．８、１
％ＳＤＳ、１％メルカプトエタノール、１０％グリセリ
ン、０．００１％ブロムフェノールブルー）を加え、不
溶の細胞砕解物フラクションを６〜８ｍｏｌ／ｌ尿素を
含有する１×ＳＤＳ−試料緩衝液０．３ｍｌ中に再懸濁
し、試料を９５℃で５分間恒温保持しかつ遠心処理し
た。その後、タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分離し［Ｌａｅｍｍｌｉ著、Ｎａｔ
ｕｒｅ２２７（１９７０）６８０〜６８５］かつクマシ
ーブリリアントブルーＲで着色した。

【００７０】交互に平行して電気泳動で分離したタンパ
ク質をニトロセルロースフィルター上に移し、固定し
［Ｔｏｗｂｉｎ及びその他共著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６（１９７９）４３５０］かつＧ
ＢＰ−Δα１Ｍ−融合タンパク質の免疫活性をポリクロ
ーナル及び／又はモノクローナル抗体で測定した。

【００７１】例４ 化学的に製造したα１Ｍタンパク質の部分領域をα１Ｍ
−抗体により測定 微量滴定板（Ｎｕｎｃ）を、鉢型容器（Ｎａｐｔ）１個
当りリン酸塩緩衝液ｐＨ９．６中の１ｍｌ当り５μｇの
ポリハプテン（例１０、１２及び１４により製造）の溶
液１００μｌと一緒に室温で２０時間恒温保持した。洗
浄（洗浄液０．９％ＮａＣｌ、０．１％ツイーン２０）
した後で試料緩衝液（０．１ｍｏｌ／ｌリン酸塩緩衝液
ｐＨ７．４、０．９％ＮａＣｌ、０．１％ツイーン２
０）中のα１Ｍに対する抗血清（羊から、尿から単離し
たα１Ｍで免疫化）を稀釈度を高めながら添加した。抗
血清の稀釈はリン酸塩緩衝液ｐＨ７．４中０．９％Ｎａ
Ｃｌ及び０．１％ツイーン２０で行なった。

【００７２】稀釈抗血清１２５μｌを加え、室温で１時
間振盪下に恒温保持し、引続いて３回洗浄緩衝液で洗浄
した。ＰＯＤと羊Ｅｃγに対するポリクローナル抗体
（１０Ｕ／ｌ）からの複合体１００μｌを添加した。基
質溶液を加えた（１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩−クエン
酸塩緩衝液ｐＨ４．４、３．２ｍｍｏｌ／ｌ過硼素酸ナ
トリウム、９ｍｍｏｌ／ｌ ＡＢＴＳ）。

【００７３】室温で３０分間恒温保持しかつＥＬＩＳＡ
−ＲＥＡＤＥＲを用いて４０５／４９０ｎｍで呈色を測
定した。

【００７４】評価は半対数尺度で相応する抗血清稀釈度
（Ｘ軸対数）に対して吸光度（Ｙ軸）をプロットした。
抗血清の滴定は半最大吸光度から確定した。

【００７５】Ｃ末端ペプチドからのポリハプテン（例１
０）を使用する際に平均力価１：３２００が得られた。
Ｎ末端ペプチドからのポリハプテン（例１４）の使用で
は平均力価は同様に１：３２００であった。α１Ｍの中
央領域からのペプチド（例１２）を使う際にはもはや有
意な力価は得られなかった。

【００７６】例５ 微量滴定板のα１−ミクログロブリンの測定 微量滴定板（Ｎｕｎｃ）をサーモ（Ｔｈｅｒｍｏ）−Ｒ
ＳＡ−ストレプタビジンの溶液（ヨーロッパ特許公開第
０２６９０９２号明細書により製造、１００ｎｇ／ｍ
ｌ；３００μｌ／鉢型容器）と室温で２０時間恒温保持
した。洗浄（３×洗浄溶液：０．９％ＮａＣｌ、０．１
％ツイーン２０）後、０．９％塩化ナトリウム、０．３
％牛血清アルブミン及び２％サッカロースの溶液３５０
μｌ／鉢型容器を添加しかつ室温で３０分間恒温保持し
た。引続いて３回洗浄溶液で洗浄した。

【００７７】鉢型容器１個に対しビオチニル化融合タン
パク質（２５ｎｇ／ｍｌ）［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１５４（１９８６）３６８により製造］１００μｌ
を添加しかつ室温で１時間振盪した。引続いて洗浄溶液
で３回洗った。

【００７８】α１−ミクログロブリンに対するモノクロ
ーナル抗体の溶液（濃度約５〜１０ｎｇ／ｍｌ）１００
μｌを添加し、室温で１時間振盪しかつ洗浄溶液で３回
洗った。

【００７９】ペルオキシダーゼ及びマウスＦｃγに対す
るポリクローナル羊抗体より成る複合体の溶液１００μ
ｌ／鉢型容器を添加し（ペルオキシダーゼ活性２５ｍＵ
／ｍｌ）かつ室温で１時間振盪した。引続いて洗浄溶液
で３回洗いかつ鉢型容器１個当り基質溶液１００μｌ
（１００ｍｍｏｌ／ｌリン酸塩−クエン酸塩緩衝液ｐＨ
４．４、３．２ｍｍｏｌ／ｌ過硼素酸ナトリウム、２．
５ｍｍｏｌ／ｌ Ｈ₂Ｏ_２中の１ｍｇ／ｍｌ ＡＢＴ
Ｓ）を添加しかつ室温で５０分間振盪した。その後吸光
度を４０５ｎｍで測定した。同様にしてビオチニル化融
合タンパク質の代りに例８からのビオチニル化ペプチド
を使用することができる。

【００８０】例６ ペプチド１ ＨＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＶａｌＰｒｏＧｌｙ
ＧｌｕＧｌｎＧｌｕＰｒｏＧｌｕＰｒｏＩｌｅＬｅｕＩ
ｌｅＰｒｏＡｒｇＯＨの合成 このペプチドは永久α−アミノ保護基としてフルオレニ
ルメトキシカルボニル−（Ｆｍｏｃ）−基の使用下に固
相合成により製造した［例えばＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ及
びその他共著、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔ
ｅｉｎ Ｒｅｓ．１３、３５〜４２（１９７９）に記
載］。合成補助手段として半自動ペプチド合成装置ＳＰ
６４０（Ｌａｂｏｒｔｅｃ社、スイス国Ｂｕｂｅｎｄｏ
ｒｆ在）を使用した。

【００８１】Ｆｍｏｃ−アミノ酸はＢａｃｈｅｍ社（ス
イス国Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ在）から入手した。

【００８２】Ｃ末端Ｆｍｏｃ−アミノ酸Ｆｍｏｃ Ａｒ
ｇ（Ｍｔｒ）ＯＨはＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒが記載してい
るようにｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂（Ｂａ
ｃｈｅｍ社、スイス国Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ在）に結合さ
せた。

【００８３】 合成サイクルの記録 工程 時間 試薬／溶剤 １ ２＊１分 ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド） ２ １＊３分 ピペリジン／ＤＭＦ １：４ ３ １＊７分 ピペリジン／ＤＭＦ １：４ ４ ４＊１／２分 ＤＭＦ ５ ２＊１／２分 イソプロパノール ６ 停止 ニンヒドリン試験 ７ ２＊１分 ＤＭＦ ８ 停止 ＤＭＦ中の最初のＦｍｏｃ−アミノ酸及び ＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）の添加 ９ ２分 振盪 １０ 停止 ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）の添加 １１ ９０分 結合 １２ ３＊１分 ＤＭＦ １３ ２＊１分 イソプロパノール １４ 停止 ニンヒドリン試験 工程８〜１１による結合にはＦｍｏｃ−アミノ酸及びＤ
ＣＣをそれぞれ開始樹脂の負荷に対して３倍モル量を使
用し；ＨＯＢｔは４．５倍モル量である。

【００８４】ペプチド１を合成するに当り開始樹脂Ｆｍ
ｏｃ Ａｒｇ（Ｍｔｒ）ｐ−アルコキシベンジルアルコ
ール樹脂１ｇを使用する；負荷度０．４ｍｍｏｌ／ｇ。
合成サイクルにおいて次のＦｍｏｃアミノ酸を使用す
る：１．） ＦｍｏｃＰｒｏＯＨ； ２．） Ｆｍｏｃ
ＩｌｅＯＨ； ３．）ＦｍｏｃＬｅｕＯＨ；４．）Ｆｍ
ｏｃＩｌｅＯＨ； ５．）ＦｍｏｃＰｒｏＯＨ；６．）
ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ； ７．）ＦｍｏｃＰ
ｒｏＯＨ； ８．）ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ；
９．）ＦｍｏｃＧｌｎＯＨ； １０．）ＦｍｏｃＧｌ
ｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ； １１．）ＦｍｏｃＧｌｙＯＨ；
１２．）ＦｍｏｃＰｒｏＯＨ； １３．）ＦｍｏｃＶ
ａｌＯＨ； １４．）ＦｍｏｃＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＯＨ 最後のＦｍｏｃ−アミノ酸の結合後、Ｆｍｏｃ保護基の
脱離のために合成サイクルの工程１〜５を継続する。そ
の後ペプチドを樹脂から分離する［例えばＳｉｂｅｒ
著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８、
１６３７（１９８７）に記載］。

【００８５】粗製生成物をセファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ：登録商標）Ｇ−１０（溶離剤０．１％酢酸）で
クロマトグラフィ処理することにより予備精製し、その
後ポリゴシル（Ｐｏｌｙｇｏｓｉｌ：登録商標）Ｃ１
８、５μｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆ Ｎａｇｅｌ）でクロ
マトグラフィ処理する（水中０．１％トリフルオル酢酸
から０．１％トリフルオル酢酸含有水中の６５％までの
イソプロパノールの傾斜溶液）。

【００８６】収量：ペプチド１ １７７ｍｇ； ＦＡＢ質量スペクトルのＭＨ^＋：１７６５ 例７ ペプチド２ ＨＣｙｓＶａｌＰｒｏＧｌｙＧｌｕＧｌｎ
ＧｌｕＰｒｏＧｌｕＰｒｏＩｌｅＬｅｕＩｌｅＰｒｏＡ
ｒｇＯＨの合成 システイン保護基を脱離するに当り、例６により得られ
たペプチド１を０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ
８．５ １３０ｍｌ中に溶かし、数回排気しかつその都
度窒素を通気する。この溶液にジチオトレイトール７８
０ｍｇを加えかつ窒素下に２４時間放置する。引続いて
塩酸でｐＨ５の酸性にしかつ例６と同様にポリゴシルＣ
１８を用いてクロマトグラフィ処理を行なう。

【００８７】収量：ペプチド２ １３３ｍｇ 例８ ペプチド３のビオチニル−６−アミノカプロイル−Ｃｙ
ｓ（ＳｔＢｕ）ＶａｌＰｒｏＧｌｙＧｌｕＧｌｎＧｌｕ
ＰｒｏＧｌｕＰｒｏＩｌｅＬｅｕＩｌｅＰｒｏＡｒｇＯ
Ｈ ペプチド１ ２５０ｍｇを０．１ｍｏｌリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ８．５ ５０ｍｌ中に溶かす。これにＤＭＦ
１２ｍｌ中のビオチニル−６−アミノカプロン酸−Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステル３９２．７ｍｇの溶
液を加えかつ４０時間撹拌する。凍結乾燥しかつ例６に
記載したようにポリゴシルＣ１８を用いてクロマトグラ
フィ処理をする。

【００８８】収量：ペプチド３ １１０ｍｇ 例９ ペプチド２及びエデスチンから免疫原１の合成 大麻の種子（Ｒｏｔｈ）からのエデスチン５ｇを０．１
ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０ ５００ｍｌ中
で撹拌しかつエタノール１００ｍｌ中のマレイミドヘキ
サン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル５００
ｍｇの溶液を加える。溶液を室温で９０分間撹拌し、固
体物質を吸引濾取し、各１００ｍｌの水で２回、各１０
０ｍｌのエタノールで４回及び各１００ｍｌの水で２回
洗浄する。固体物質を水１５０ｍｌ中に懸濁させかつ凍
結乾燥する。

【００８９】収量：マレイミドヘキサノイル−エデスチ
ン４．３４ｇ マレイミドヘキサノイル−エデスチン１５５ｍｇ及びペ
プチド２ ４２ｍｇをアルゴン下に０．０５ｍｏｌリン
酸カリウム緩衝液ｐＨ６．５ １５ｍｌで懸濁させかつ
室温で２．５日間撹拌する。遠心分離し、残渣を水５０
ｍｌで洗いかつ２０ｍｌ中に懸濁している残渣を水に対
して透析する。

【００９０】凍結乾燥後、免疫原１ ８０ｍｇが得られ
る。

【００９１】例１０ ペプチド２及び牛血清アルブミンからのポリハプテン１
の合成 牛血清アルブミン１ｇを０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩
衝液ｐＨ７．５ ３０ｍｌ中に溶かす。この溶液にエタ
ノール１５ｍｌ中に溶かしたスクシンイミジルピリジル
ジチオプロピオネート２２６ｍｇを加える。室温で４０
分間撹拌しかつ全反応溶液をウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏ
ｇｅｌ）ＡＣＡ２０２（３１＊３ｃｍ）；（ＪＢＦ，Ｖ
ｉｌｌｅｎｅｕｖｅ，フランス国）を介してクロマトグ
ラフィ処理をする；溶離液０．１ｍｏｌリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ６．０。

【００９２】ペプチド２ １０ｍｇ及びピリジルジチオ
プロピオニル牛血清アルブミン溶液１．７５ｍｌをアル
ゴン下に１２時間撹拌する。０．１ｍｏｌリン酸カリウ
ム緩衝液ｐＨ６．０ ６ｍｌで稀釈しかつ前記のように
ウルトロゲルＡＣＡ２０２のカラムを介してクロマトグ
ラフィ処理をする。

【００９３】０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ
６．０中の濃度０．９３ｍｇ／ｍｌのポリハプテン１の
溶液１０ｍｌが得られる。

【００９４】例１１ ペプチド４のＨＣｙｓＧｌｙＡｌａＴｙｒＧｌｕＬｙｓ
ＴｈｒＡｓｐＴｈｒＡｓｐＧｌｙＬｙｓＰｈｅＬｅｕＴ
ｙｒＨｉｓＬｙｓＳｅｒＬｙｓＯＨの合成 ＨＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＧｌｙＡｌａＴｙｒＧｌｕＬｙｓ
ＴｈｒＡｓｐＴｈｒＡｓｐＧｌｙＬｙｓＰｈｅＬｅｕＴ
ｙｒＨｉｓＬｙｓＳｅｒＬｙｓＯＨを例６と同様にして
固相合成により製造する。開始樹脂としてＦｍｏｃＬｙ
ｓ（ＢＯＣ）ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂１
ｇを、負荷度０．４４ｍｍｏｌ／ｇで使用する。合成サ
イクルで次のＦｍｏｃアミノ酸を使用する：１．）Ｆｍ
ｏｃＳｅｒ（ｔＢｕ）ＯＨ； ２．）ＦｍｏｃＬｙｓ
（ＢＯＣ）ＯＨ； ３．）ＦｍｏｃＨｉｓ（Ｔｒｔ）Ｏ
Ｈ； ４．）ＦｍｏｃＴｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ； ５．）
ＦｍｏｃＬｅｕＯＨ； ６．）ＦｍｏｃＰｈｅＯＨ；
７．）ＦｍｏｃＬｙｓ（ＢＯＣ）ＯＨ； ８．）Ｆｍｏ
ｃＧｌｙＯＨ； ９．）ＦｍｏｃＡｓｐ（ＯｔＢｕ）Ｏ
Ｈ； １０．）ＦｍｏｃＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ； １
１．）ＦｍｏｃＡｓｐ（ＯｔＢｕ）ＯＨ； １２．）Ｆ
ｍｏｃＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ； １３．）ＦｍｏｃＬｙ
ｓ（ＢＯＣ）ＯＨ； １４．）ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢ
ｕ）ＯＨ； １５．）ＦｍｏｃＴｙｒ（ｔＢｕ）ＯＨ；
１６．）ＦｍｏｃＡｌａＯＨ； １７．）ＦｍｏｃＧ
ｌｙＯＨ； １８．）ＦｍｏｃＣｙｓ（ＳｔＢｕ）Ｏ
Ｈ： その後ペプチドを樹脂から分離しかつ精製するために例
６と同様に行なう。セファデックスＧ１０カラムの後で
精製ペプチド４５４ｍｇが得られる。そのうちの５０ｍ
ｇをポリゴシルＣ１８を用いて精製する。

【００９５】収量：ペプチドＨＣｙｓ（ＳｔＢｕ）Ｇｌ
ｙＡｌａＴｙｒＧｌｕＬｙｓＴｈｒＡｓｐＴｈｒＡｓｐ
ＧｌｙＬｙｓＰｈｅＬｅｕＴｙｒＨｉｓＬｙｓＳｅｒＬ
ｙｓＯＨ ５．３ｍｇ ＨＣｙｓ（ＳｔＢｕ）ＧｌｙＡｌａＴｙｒＧｌｕＬｙｓ
ＴｈｒＡｓｐＴｈｒＡｓｐＧｌｙＬｙｓＰｈｅＬｅｕＴ
ｙｒＨｉｓＬｙｓＳｅｒＬｙｓＯＨ ２０５ｍｇを例７
と同様にジチオトレイトール２７７ｍｇで処理しかつ後
処理する。

【００９６】収量：ペプチド４ １７１．６ｍｇ 例１２ ペプチド４及び牛血清アルブミンからのポリハプテンの
合成 牛血清アルブミン５ｇを０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩
衝液ｐＨ６．０ ３０ｍｌ中に溶解する。これにＤＭＦ
２ｍｌ中のマレイミドヘキサン酸−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル４４７ｍｇの溶液を加える。１．５
時間撹拌しかつ全反応溶液をウルトロゲルＡＣＡ２０２
（４５＊５ｃｍ）を介してクロマトグラフィ処理をす
る；溶離剤０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．
０。

【００９７】マレイミドヘキサノイル−牛血清アルブミ
ンの溶液１８４ｍｌが得られる、ｃ＝２７．５ｍｇ／ｍ
ｌ。

【００９８】この溶液１１０ｍｇをペプチド４ ６９．
９ｍｇと０．１ｍｏｌリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．０
１０ｍｌ中でアルゴン下に１５時間反応させる。例１
０と同様に溶液をＡＣＡ２０２を介してクロマトグラフ
ィ処理をする。

【００９９】例１３ ペプチド５ ＨＧｌｙＰｒｏＶａｌＰｒｏＴｈｒＰｒｏ
ＰｒｏＡｓｐＡｓｎＩｌｅＧｌｎＶａｌＧｌｎＧｌｕＡ
ｓｎＰｈｅＣｙｓＯＨの合成 ペプチド５を例６と同様に固相合成により製造する。

【０１００】開始樹脂としてＦｍｏｃＣｙｓ（Ｔｒｔ）
ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂５ｇを負荷度
０．６８ｍｍｏｌ／ｇで使用する。合成サイクルにおい
て次のＦｍｏｃアミノ酸を使用する： １．）ＦｍｏｃＰｈｅＯＨ； ２．）ＦｍｏｃＡｓｎＯ
Ｈ； ３．）ＦｍｏｃＧｌｕ（ＯｔＢｕ）ＯＨ；
４．）ＦｍｏｃＧｌｎＯＨ； ５．）ＦｍｏｃＶａｌＯ
Ｈ； ６．）ＦｍｏｃＧｌｎＯＨ； ７．）ＦｍｏｃＩ
ｌｅＯＨ； ８．）ＦｍｏｃＡｓｎＯＨ； ９．）Ｆｍ
ｏｃＡｓｐ（ＯｔＢｕ）ＯＨ； １０．）ＦｍｏｃＰｒ
ｏＯＨ； １１．）ＦｍｏｃＰｒｏＯＨ； １２．）Ｆ
ｍｏｃＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ； １３．）ＦｍｏｃＰｒ
ｏＯＨ； １４．）ＦｍｏｃＶａｌＯＨ； １５．）Ｆ
ｍｏｃＰｒｏＯＨ； １６．）ＦｍｏｃＧｌｙＯＨ 例６と同様にして樹脂から脱離しかつペプチドを精製す
る。

【０１０１】ペプチド５が得られ、ＦＡＢ質量スペクト
ルのＭＨ⁺：１８５４ 例１４ ペプチド５及び牛血清アルブミンからのポリハプテン３
の合成 例１２と同様にして、マレイミドヘキサノイル−牛血清
アルブミン溶液４．５ｍｌ及びペプチド５ ３３ｍｇか
らポリハプテン３ ７０ｍｌが得られる、ｃ＝０．５ｍ
ｇ／ｍｌ 例１５ ヒトα１−ミクログロブリンに対するモノクローナル抗
体の取得 生後８〜１２週間のＢａｌｂ／ｃ−マウスをα１−Ｍ
（患者の尿から単離）もしくはペプチド免疫原（例９に
より製造）又は免疫原としての融合タンパク質（例２に
より製造）１０μｇで完全フロイントアジュバントと共
に腹腔内で免疫化する。６週間後、４週間間隔で更に３
回免疫化する。その際にその都度免疫原１００μｇを水
酸化アルミニウム及びボルデテラ・ペルツシスに吸着さ
せて腹腔内に投与する。最後の免疫化から１週間後に採
血しかつ実験動物の血清中の抗体力価を測定する。免疫
化が明確に進行している場合は融合する。融合の４日前
にそれぞれリン酸塩緩衝化食塩溶液中の免疫原１００μ
ｇで再度静脈内で免疫化する。Ｇａｌｆｒｅ［Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、７３（１９８
１）３頁］が記載したように、免疫化したマウスの脾臓
細胞１×１０⁸を骨髄腫細胞（Ｐ３×６３Ａｇ８−６５
３、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ８３７５）２×１０⁷と混合しか
つＰＥＧ溶液と融合する。融合細胞を２４波型プレート
（Ｎｕｎｃ社）の凹部１個当り細胞５×１０⁴個を播き
かつ選択培地（ヒポキサンチン／アザセリン−培地）中
で培養する。７〜１０日後に、クローンの成長が観察可
能である場合、一次培養物の培養上澄みを特異性（α１
−Ｍ、ペプチドもしくは融合タンパク質の認識）に関し
てＥＬＩＳＡ法で試験する。抗原特異性抗体を含有する
一次培養物がけい光活性細胞により単一細胞沈殿（Ｅｉ
ｎｚｅｌｚｅｌｌａｂｌａｇｅ）になる。このようにし
てハイブリドーマ細胞系クローン６．０４６．７５を単
離することができた（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ．９００７１９
０６免疫原：患者の尿からのα１Ｍ）。

【０１０２】抗体特異性の測定は次のように実施する：
免疫化したマウスの血清又はハイブリッド細胞の培養上
澄み中のα１−ミクログロブリン／ペプチド／融合タン
パク質に対する抗体の存在及び特異性を確認するために
試験原理としてＥＬＩＳＡ法を適用する。

【０１０３】試験１： 単離した天然α１−ミクログロブリンに対する抗体の結
合の検査 微量滴定板（Ｎｕｎｃ社）を被覆緩衝液（０．２ｍｏｌ
／ｌ炭酸ナトリウム／−重炭酸ナトリウム、ｐＨ９．
４）中の４００ｎｇ／ｍｌポリクローナル抗α１−ミク
ログロブリン免疫グロブリン（羊−抗−ヒトα１−ミク
ログロブリン、Ｓｅｒｏｔｅｃ社）で塗布する。０．９
％塩化ナトリウム溶液及び１％牛血清アルブミンで後塗
布する。洗浄溶液（０．９％塩化ナトリウム溶液）で洗
浄後、５０μｇ／ｍｌ抗原（尿から単離ヒトα１−ミク
ログロブリン）と共に恒温保持する。再度洗浄後、抗体
試料（マウス血清もしくは培養上澄み）を添加しかつ恒
温保持後再度洗浄する。検出用抗体としてポリクローナ
ル羊−抗−マウス−Ｆｃγ、Ｆａｂ−ペルオキシダーゼ
−複合体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍＧ
ｍｂＨ社、２５ｍＵ／ｍｌ）を使用する。洗浄溶液で更
に洗浄した後で、ペルオキシダーゼ活性を常法でＡＢＴ
Ｓにより３０分間の恒温保持及び４０５ｎｍで吸光度差
ｍＥの測定後に測定する。

【０１０４】試験２ ポリハプテンもしくは融合タンパク質に対する抗体の結
合の検査 微量滴定板（Ｎｕｎｃ社）を１μｇ／ｍｌポリハプテン
（例１０及び１２により製造）もしくは融合タンパク質
（例２により製造）と共に被覆緩衝液（試験１参照）中
で恒温保持する。洗浄工程後、抗体試料（マウス血清も
しくは培養上澄み）の恒温保持を行なう。再度洗浄した
後、検出抗体をポリクローナル羊抗−マウス−Ｆｃγ、
Ｆａｂ−ペルオキシダーゼ−複合体と共に恒温保持し、
更に洗浄しかつペルオキシダーゼ活性を試験１と同様に
ＡＢＴＳにより測定する。例１０によるポリハプテン及
び融合タンパク質に結合するが例１２によるポリハプテ
ンには結合しない多数の抗体が見出された。

【０１０５】試験３ 患者尿試料中の天然α１−ミクログロブリンに対する抗
体の結合の検査 α１−ミクログロブリン含量を比濁分析法もしくは分割
抗原試験（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）により測定した患
者尿試料を使用する。

【０１０６】初めに抗体の反応性を試験２で測定する。
抗体と患者尿中のα１−ミクログロブリンとの結合及び
壁結合のペプチドもしくは融合タンパク質との結合との
間の競合試験において特異性を検査する。抗体試料を上
昇する濃度でα１−ミクログロブリンを含有する尿試料
もしくは陰性対照としての正常提供者尿試料と共に予備
恒温保持する。試験２におけるように１μｇ／ｍｌポリ
ハプテンで塗布した微量滴定板を予備恒温保持した試料
で塗布する。洗浄後二次抗体複合体（羊−抗−マウスＦ
ｃγ、Ｆａｂ−ペルオキシダーゼ、試験１及び２と同様
に）を恒温保持する。壁結合ペプチドに対する抗体試料
の残留結合の定量化を試験１及び２と同様にペルオキシ
ダーゼ活性をＡＢＴＳにより測定することにより行な
う。本発明によるモノクローナル抗体６．０４６．７５
（ＥＣＡＣＣ９００７１９０６）は、それが例６、７及
び８のペプチド、例２．１及び２．２の融合タンパク質
及び患者の尿から単離した天然α１−ミクログロブリン
と結合しもしくは認識する点で優れている。抗体とα１
−ミクログロブリン含有患者尿試料との予備恒温保持に
よりペプチドもしくは融合タンパク質への結合を阻止す
ることができる。抗体はサブクラスＩｇＧ１，κに含ま
れる。

【０１０７】例１６ 試験片によるα１−ミクログロブリンの測定 １６．１ 試験片の構成：開始フィールド（ＳＦ） 開始フィールドは厚さ１．０ｍｍ及び吸収能１８００ｍ
ｌ／ｍ²を有する、クラロン（Ｂｉｎｚｅｒ）１０％を
含有するポリエステル１００％からのフリースより成
る。

【０１０８】緩衝液フィールド（ＰＦ） 厚さ０．７ｍｍ及び吸収能４８０ｍｌ／ｍ²を有するフ
リース材料ＳＬ４２０７ＫＡ（Ｋａｌｆｆ社、ドイツ
国、Ｅｕｓｋｉｒｃｈｅｎ在；ポリエステル９０％、ス
テープルファイバー１０％及び少量のアクリレートより
成る）を次の溶液で含浸しかつ引続いて乾燥させる： −２００ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．８ −１重量％牛血清アルブミン 複合体フィールド（ＫＦ）クラロン１０％で厚さ０．２
ｍｍに固化したガラス繊維１００％より成りかつ吸収能
２００ｍｌ／ｍ²を有するガラス繊維フリースを次の溶
液で含浸し、引続いて乾燥させる： −７０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．４ −０．５重量％牛血清アルブミン −６ｋＵ／ｌ β−ガラクトシダーゼ及び被分析物特異
性抗体（ＩｇＧ）からの複合体 捕集フィールド（ＡＦ） 厚さ０．５ｍｍ及び吸収能４５０ｍｌ／ｍ²を有するポ
リエステル５０％、木綿リンター５０％及びエタジュリ
ン（Ｅｔａｄｕｒｉｎ）３％より成る混合フリースを次
の溶液で含浸し、引続いて乾燥させる： −１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．５ −サーモ−ＲＳＡ−ストレプタビジン（２００ｍｇ／
ｌ、ヨーロッパ特許公開第０２６９０９２号明細書によ
り製造） サーモ−ＲＳＡ−ストレプタビジンの固定化はヨーロッ
パ特許公開第０３７４７７８号明細書に記載したように
行なう。

【０１０９】引続いて、予備含浸したフリースを次の溶
液で再度含浸しかつ乾燥させる： −１０ｍｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウムｐＨ７．５ −ビオチニル化α１Ｍ−融合タンパク質、例２．１もし
くは２．２により製造（１μｍｏｌ／ｌ）、例５による
ビオチニル化 検出フィールド（ＮＦ） 厚さ０．１ｍｍのポリカーボネートシート上に次の処方
の可溶性フィルムを施す： −モビオール（Ｍｏｗｉｏｌ）１８／８８ ４．５ｇ
（Ｈｏｅｃｈｓｔ社、ドイツ国、フランクフルト・アム
・マイン在） −クロルフェノールレッドβ−Ｄ−ガラクトシド０．３
ｇ フィールドをヨーロッパ特許公開第０３７４６８４号明
細書に記載されているように溶融接着剤を用いて担体上
に接着させる。

【０１１０】１６．２ 記載の試験片を用いて水溶液中
のα１−ミクログロブリンの検出例１６．１により製造
した試験片を吸収性フリースと共にα１Ｍ含有試料（例
えば尿）中に配置する。５分後、試料濃度を検出フィー
ルドで発生する色と相関させる。このようにして記載の
試験片により被分析物を含まない溶液では黄色、被分析
物５、２０、１００ｍｇ／ｌでは赤色濃度が濃くなる。
このようにして被分析物を半定量的に視覚的に測定する
ことができる。

【０１１１】試験片を試料を施して５分後に拡散反射光
度測定により測定する場合に定量測定が可能である。図
３は例２．２によるα１Ｍ−融合タンパク質を使用する
際に得られる検量曲線である。

【０１１２】ビオチニル化融合タンパク質の代りに例８
によるビオチニル化ペプチド（１μｍｏｌ／ｌ）を使用
する場合にも同じ結果が得られる。

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＶＢ１ ＥＨの地図である。

【図２】α１−ミクログロブリン部分領域の合成戦略を
示す図である。

【図３】例２．２によるα１Ｍ−融合タンパク質を使っ
て得られた検量曲線である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 15/00 Ｃ (72)発明者 クリスティアン クライン ドイツ連邦共和国 ヴァイルハイム ブ リューテンシュトラーセ 16 (72)発明者 ディーター マンゴルト ドイツ連邦共和国 マックスドルフ ヒ ュッテンミュラーシュトラーセ 33 (72)発明者 ヴェルナー シュトック ドイツ連邦共和国 グレーフェルフィン グ ヘルマン−フンメル−シュトラーセ 11 (72)発明者 ライナー シュリプフェンバッハー ドイツ連邦共和国 ランペルトハイム ベートーヴェンシュトラーセ ９ (56)参考文献 特開 昭56−106153（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−500684（ＪＰ，Ａ) Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ Ｖｏｌ．96 Ｎｏ．25 Ｐ．553 96：215697ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔ ｓ Ｖｏｌ．96 Ｎｏ．21 Ｐ．350 96：177154ｍ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ Ｖｏｌ．14 Ｎｏ．20 Ｐ. 7839−7850 （1986)

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アミノ酸の長さが最高４０個であり、か
   つ構造Ａ−Ｒ−Ｂを有し、ここでＲはヒトα１−ミクロ
   グロブリンのアミノ酸１４４〜１８３： のアミノ酸部分配列からの少なくとも６個の連続する、
   ヒトα_１−ミクログロブリンに対する抗体に結合性のア
   ミノ酸配列を含有し、Ａ及びＢは任意のアミノ酸配列で
   あることを特徴とするペプチド。
2. 【請求項２】 Ｒがアミノ酸１５８〜１８３の部分配列
   からの少なくとも６個のアミノ酸を含有することを特徴
   とする請求項１によるペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のペプチド及びヒト
   α１−ミクログロブリンと特異的に結合性であることを
   特徴とする抗体。
4. 【請求項４】 細胞系ＥＣＡＣＣ９００７１９０６から
   得られる請求項３記載の抗体。
5. 【請求項５】 公知方法で好適な動物を天然α１−ミク
   ログロブリンか又は請求項１又は２記載のペプチドで免
   疫化し、抗体を取得し、かつ該抗体から天然ヒトα１−
   ミクログロブリン及び請求項１又は２記載のペプチドと
   特異的に結合性であるものを選択することを特徴とする
   請求項３又は４記載の抗体の製法。
6. 【請求項６】 イムノアッセイにより試料液体中のヒト
   α１−ミクログロブリンを測定する方法において、試料
   液体を規定量の成分である抗体及びペプチドと同時に又
   は順次に接触させ、その際に成分のうちの一方が標識さ
   れており、かつこの標識を介して測定を行ない、この際
   ペプチドはアミノ酸の長さが最高４０個であり、かつ構
   造Ａ−Ｒ−Ｂを有し、ここでＲはヒトα１−ミクログロ
   ブリンのアミノ酸１４４〜１８３： のアミノ酸部分配列からの少なくとも６個の連続する、
   ヒトα１−ミクログロブリンに対する抗体に結合性のア
   ミノ酸配列を含有し、Ａ及びＢは任意のアミノ酸配列で
   あるペプチドであり、かつ抗体は前記ペプチド及びヒト
   α１−ミクログロブリンと結合性である抗体であること
   を特徴とするα１−ミクログロブリンの測定法。
7. 【請求項７】 Ｒがヒトα１−ミクログロブリンのアミ
   ノ酸１４４〜１８３のアミノ酸部分配列からの少なくと
   も６個の連続する、ヒトα_１−ミクログロブリンに対す
   る抗体に結合性のアミノ酸配列を含有し、かつ抗体成分
   が細胞系ＥＣＡＣＣ９００７１９０６から得られる抗体
   を含有する請求項６記載の測定法。
8. 【請求項８】 ベース層上に相互に平行に設けられてい
   て、毛管作用物質より成り、相互に液休接触する数個の
   ゾーンを包含する、試料液体中のα１−ミクログロブリ
   ンを分析測定するための試験片において、該試験片が成
   分であるペプチド及び抗体の一方を固定形で含有しかつ
   他方の成分を標識形で含有する第１試薬系を反応ゾーン
   中に包含し、この際、ペプチドはアミノ酸の長さが最高
   ４０個であり、かつ構造Ａ−Ｒ−Ｂを有し、ここでＲは
   ヒトα１−ミクログロブリンのアミノ酸１４４〜１８
   ３： のアミノ酸部分配列からの少なくとも６個の連続する、
   ヒトα_１−ミクログロブリンに対する抗体に結合性のア
   ミノ酸配列を含有し、Ａ及びＢは任意のアミノ酸配列で
   あるペプチドであり、かつ抗体は前記ペプチド及びヒト
   α１−ミクログロブリンと結合性である抗体であり、か
   つ場合により、他方の成分の標識の測定を可能にする第
   ２試薬系を包含する検出フィールドを有することを特徴
   とするα１−ミクログロブリンを測定する試験片。
9. 【請求項９】 Ｒがヒトα１−ミクログロブリンのアミ
   ノ酸１４４〜１８３のアミノ酸部分配列からの少なくと
   も６個の連続する、ヒトα_１−ミクログロブリンに対す
   る抗体に結合性のアミノ酸配列を含有し、かつ抗体成分
   が細胞系ＥＣＡＣＣ９００７１９０６から得られる抗体
   を含有する請求項８記載の試験片。
10. 【請求項１０】 試料液体中のα１−ミクログロブリン
    を測定する方法において、請求項８記載の試験片を使
    い、その際試料液体を反応ゾーンもしくは場合により存
    在する開始ゾーン上に施し、かつ基質フィールドに達し
    た標識成分の標識を介して測定することを特徴とするα
    １−ミクログロブリンの測定法。