CN109942703A - α1-微球蛋白多克隆抗体的制备及α1-微球蛋白检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α1‑微球蛋白多克隆抗体的制备及α1‑微球蛋白检测试剂盒；所述试剂盒由R1试剂、R2试剂两部分组成，其中R1试剂为含有解离蛋白剂的磷酸盐缓冲体系，R2试剂为含有包被有α1‑微球蛋白多克隆抗体的致敏胶乳颗粒的缓冲液。本发明采用一种解离蛋白剂，最大限度暴露样本中的抗原位点，增加抗原抗体的结合率，并且采用一种更稳定、放大信号效果更理想的乳胶粒子包被一种特定的α1‑微球蛋白多克隆抗体，通过这些手段，从而实现本发明试剂的高灵敏度；解决了目前市场上α1‑MG试剂检测灵敏度不高，价格昂贵等问题。

Description

α1-微球蛋白多克隆抗体的制备及α1-微球蛋白检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种医学免疫体外诊断领域，具体涉及一种α1-微球蛋白多克隆抗体的制备及α1-微球蛋白检测试剂盒。

背景技术

α1-MG是由人体的肝脏和淋巴细胞合成，分子量约为33000道尔顿的糖蛋白。它由167个氨基酸组成，与人类白细胞抗原HLA-A 11，HLA-B20和HLA-51等抗原决定簇有交叉反应。

α1-MG广泛存在于人体各种体液及淋巴细胞膜表面，血液中的α1-MG以两种形式存在，即游离的α1-MG和与IgA结合的α1-MG(α1MG-1gA)。正常情况下，α1-MG-1gA约占血液中总α1-MG的40～70％，血液中免疫球蛋白水平对α1-MG及α1-MG-1gA之间的比例有影响。血液中游离的α1-MG可自由通过肾小球滤过膜，95％～99％在肾近曲小管重吸收和代谢，只有微量从终尿排出；而结合型的α1-MG则不能通过肾小球，其在尿液中的浓度为零。

一般认为α1-MG在血清及尿液中增高的原因有：

①肾小管重吸收和代谢α1-MG的能力降低；

②肾小球滤过功能受损；

③体内合成过多；

④淋巴细胞破坏释放。

基于上述①、②两点以及大量的临床实验研究证实，目前人们普遍认为血清及尿液中α1-MG的测定可作为反应肾小管重吸收功能受损的一项灵敏指标，而且在某种程度上还优于β2-微球蛋白。

α1-微球蛋白目前的检测方法有ELISA、放射免疫法、胶体金法、胶乳免疫比浊法等。在这些方法中ELISA、放射免疫法、胶体金法操作相对复杂，容易出现结果的偏差，且价格相对昂贵，检测时间和成本都较高。而胶乳免疫比浊法可以在临床检验科室必备的全自动生化分析仪上使用，检测方便，能够快捷迅速的发出检测报告，并且对轻中度溶血和轻度黄疽、脂血有一定的抗干扰能力，可以得到广泛的应用。

目前市场上的α1-微球蛋白检测试剂普遍存在灵敏度低的问题，重复性差等问题，而进口试剂价格又比较昂贵。

通过对现有专利文献的检索发现，申请号201410193619.9的中国发明专利申请公开了一种α1-微球蛋白检测试剂盒，所述试剂盒基于胶体金免疫比浊法，包括试剂R2，所述试剂R2为含有标记了α1-微球蛋白抗体的金纳米颗粒的溶液，所述金纳米颗粒的粒径为62.2nm-79.1nm，所述金纳米颗粒和抗体质量比为50：20～60。本发明试剂盒具有灵敏度高，特异性强，反应迅速，稳定性好的特点。然而，胶体金法的测试操作繁琐，准确度不高，成本昂贵。

申请号201510847828.5的中国发明专利申请公开了一种可以同时检测尿液和血清样本中α1-微球蛋白的试剂盒，包括试剂1和试剂2，所述的试剂1为含有抗人类风湿因子抗体和促凝剂的缓冲液；所述的试剂2为含有包被有抗人α1-微球蛋白单克隆抗体的大粒径聚苯乙烯纳米颗粒的缓冲液。具有高灵敏度、宽线性、特异性更好、抗干扰能力强，且可以检测人尿液和血清的优点。然而，单克隆抗体在稳定性及灵敏度上远远不如多克隆抗体。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种α1-微球蛋白多克隆抗体的制备方法及含有该抗体的α1-微球蛋白多检测试剂盒，该试剂盒用于检测血清中α1-MG的含量，以达到操作简便、灵敏度高、特异性好，快速、测定结果准确可靠的目的。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供了一种α1-微球蛋白多克隆抗体，所述α1-微球蛋白多克隆抗体是由包含以下步骤的方法制备而得：

S1、免疫原的制备：在重组α1-微球蛋白氨基酸链中加入保护氨基酸链6-His及10-Cys，并加入2个酶切位点HindⅢ和BamHⅠ，重组表达得到抗原；

S2、免疫动物：选用兔免疫途径，采用淋巴结免疫法，首次与第二次免疫间隔为15天，第二次后间隔10天；

S3、抗血清的纯化和保存：使用亲和柱对抗血清进行亲和和纯化，纯化后的抗体除盐后添加甘油保存。

作为优选方案，步骤S1具体为：在重组α1-微球蛋白氨基酸链中，加入保护氨基酸链6-His于原氨基酸链的头部，加入保护氨基酸链10-Cys于原氨基酸链的尾部，并于头部6-His氨基酸链中加入HindⅢ酶切位点，于尾部10-Cys氨基酸链中加入BamHⅠ酶切位点。

作为优选方案，步骤S3中，使用的亲和柱为琼脂糖凝胶亲和柱、纯化溶液为PBS缓冲液。

第二方面，本发明还提供了一种α1-微球蛋白检测试剂盒，包括R1试剂和R2试剂，所述R1试剂为含有解离蛋白剂的磷酸盐缓冲体系，所述试剂R2为含有前述的α1-微球蛋白多克隆抗体包被的致敏胶乳颗粒的缓冲体系。

作为优选方案，所述R1试剂包含如下成分：pH为7.0～7.6、浓度为10～100mmol/L的磷酸盐缓冲液，浓度为5～20mmol/L的乙二胺四乙酸二钠，浓度为200～500mmol/L的盐酸胍、浓度为10～50mmol/L的氯化钠，浓度为10～100mmol/L的聚乙二醇以及体积分数为0.01％～0.05％的防腐剂。

作为优选方案，所述R2试剂包含如下成分：pH为7.0～7.6、浓度为10～100mmol/L的磷酸盐缓冲液，浓度为10～100ml/L的所述α1-微球蛋白多克隆抗体包被的致敏乳胶颗粒。

作为优选方案，所述的致敏乳胶颗粒为聚甲基丙烯酸甲酯微球或聚苯乙烯微球。

作为优选方案，所述α1-微球蛋白多克隆抗体包被的致敏乳胶颗粒是通过包含如下步骤的方法制备而得：

A1、将α1-微球蛋白多克隆抗体加入粒径为150～300nm的致敏乳胶颗粒中，控制所述α1-微球蛋白多克隆抗体与致敏乳胶颗粒的体积比为0.5～1：1，室温孵育1.5-2.5小时，得到溶液；

A2、在所述溶液中加入碳化二亚胺，控制每毫升致敏乳胶颗粒对应5～10mg碳化二亚胺，室温孵育1.5-2.5小时，得到悬浮液；

A3、将所述悬浮液进行固液分离后，取固体部分用磷酸盐缓冲液洗涤分散即可。

作为优选方案，所述的致敏乳胶颗粒为聚甲基丙烯酸甲酯微球或聚苯乙烯微球。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明通过一种α1-微球蛋白多克隆抗体的制备方法，得到一种特殊的α1-微球蛋白多克隆抗体，该抗体稳定性好，特异性强，能很大程度上提高抗原抗体结合率，使试剂灵敏度大大提高，在样品浓度低至0.1mg/L时仍可检测出结果，而现有技术的试剂的最低检测限为0.5mg/L；

2、本发明中的抗体与胶乳结合能力强，包被过程中损耗量少，可适用于目前市场上多数的胶乳颗粒，适用范围广泛。并且和胶乳结合后致敏颗粒更加稳定，使得试剂的稳定性提高，线性范围更广；试剂稳定性可达到18个月，线性范围可到200mg/L；由于包被过程中的损耗减少，大大节省了成本，使得试剂盒的价格更具有竞争力；

3、本发明的试剂盒适用于全自动生化仪，操作简便，准确度高，成本较低；

4、本发明在试剂R1中解离蛋白剂盐酸胍，能使样本中的抗原位点得到充分的暴露，提高抗原抗体的结合率；本发明的试剂盒稳定性盒灵敏度远远优于目前市场水平。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为5种不同含量的α1-MG参考标准的标准曲线；

图2为分别采用本发明试剂和德国罗氏公司的α1-MG试剂对50份人血清(包含正常和异常标本)测定结构的相关性分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例提供一种α1-微球蛋白多克隆抗体，其是通过如下方法制备而得的：

(1)在原有的α1-微球蛋白氨基酸链(商品化抗体内自带氨基酸链序列)中的头部加入了一段保护性的氨基酸链6-His，在尾部加入了一段保护性的氨基酸链10-Cys。同时添加了2组酶切位点HindⅢ和BamHⅠ(具体为：于头部6-His氨基酸链中加入HindⅢ酶切位点，于尾部10-Cys氨基酸链中加入BamHⅠ酶切位点)；使用重组蛋白表达技术，表达并提取抗原；

(2)将提取抗原加入免疫佐剂后，对兔进行淋巴结免疫，每次计量0.1ml，首次与第二次免疫时间间隔为15天，二次后间隔为10天；

(3)检测抗体效价达标后，对抗体血进行采集，并亲和纯化，除盐后添加甘油保存。

实施例2

本实施例提供一种α1-MG检测试剂盒，组成如下：

1.试剂R1为：

2.试剂R2为：

磷酸盐缓冲液(PH 7.0) 10mmol/L

α1-微球蛋白多克隆抗体

包被的致敏乳胶颗粒 10ml/L；

上述α1-微球蛋白多克隆抗体包被的致敏乳胶颗粒的制备过程如下：

S1：将实施例1的α1-微球蛋白多克隆抗体加入粒径为150nm的致敏乳胶颗粒中，控制抗体与乳胶粒子的体积比为0.5：1，室温孵育2小时，得到溶液；

S2：在上述溶液中加入碳化二亚胺，控制每毫升乳胶粒子中加入5mg碳化二亚胺，室温孵育2小时，得到悬浮液；

S3：将上述悬浮液进行固液分离后，取固体部分用磷酸盐缓冲液洗涤分散即可。

本实施例描述的α1-MG检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表1。分析方法：两点终点法，即试剂R1、R2的用量分别为240μl和60μl，样本量2μl；240μl试剂R1加入2μl样本于37℃孵育5min后，加入60μl试剂R2，37℃孵育30s，读取吸光度，然后再孵育4.5min后读取另一点；检测主波长为600nm。

采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的5种不同含量的α1-MG校准品的曲线(如图1所示)，每个点代表一个含量的参考校准品，其中X轴表示α1-MG含量(mg/L)；Y轴表示吸光度。

表1

实施例3

本实施例提供一种α1-MG检测试剂盒，组成如下：

1.试剂R1为：

2.试剂R2为：

磷酸盐缓冲液(PH 7.6) 50mmol/L

α1-微球蛋白多克隆抗体

包被的致敏乳胶颗粒 50ml/L。

上述α1-微球蛋白多克隆抗体包被的致敏乳胶颗粒的制备过程如下：

S1：将实施例1的α1-微球蛋白多克隆抗体加入粒径为200nm的致敏乳胶颗粒中，控制抗体与乳胶粒子的体积比为0.8：1，室温孵育2小时，得到溶液；

S2：在上述溶液中加入碳化二亚胺，控制每毫升乳胶粒子中加入7.5mg碳化二亚胺，室温孵育2小时，得到悬浮液；

S3：将上述悬浮液进行固液分离后，取固体部分用磷酸盐缓冲液洗涤分散即可。

试剂盒具体操作方法同实施例1。

实施例4

本实施例提供一种α1-MG检测试剂盒，组成如下：

1.试剂R1为：

2.试剂R2为：

磷酸盐缓冲液(PH 7.2) 100mmol/L

α1-微球蛋白多克隆抗体

包被的致敏乳胶颗粒 100ml/L；

上述α1-微球蛋白多克隆抗体包被的致敏乳胶颗粒的制备过程如下：

S1：将实施例1的α1-微球蛋白多克隆抗体加入粒径为300nm的致敏乳胶颗粒中，控制抗体与乳胶粒子的体积比为1：1，室温孵育2小时，得到溶液；

S2：在上述溶液中加入碳化二亚胺，控制每毫升乳胶粒子中加入5～10mg碳化二亚胺，室温孵育2小时，得到悬浮液；

S3：将上述悬浮液进行固液分离后，取固体部分用磷酸盐缓冲液洗涤分散即可。

试剂盒具体操作方法同实施例1。

实施例5：检测试剂的相关性试验

使用本法发明试剂盒(具体配方同实施例1)和对照试剂德国罗氏公司的BMG试剂，采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关性分析。按照与上述“表1”中的参数进行测定；测定结果见图2，X，Y轴均为测定值(α1-MG的含量mg/L)，

由图2的结果看出，两种试剂的相关系为R²＝0.99，回归方程为y＝0.9997x+0.3277。结果表明本试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。此外，以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。

试验例6：最低检测限试验

本实验目的是检测试剂在测试临床样本时的最小检出感度。

采用实验例1试剂、对照试剂(宁波美康生物)、校准品、空白溶液(生理食盐水)、正常人血清样本，低值样本。

机器：日立7170自动生化分析仪。

操作步骤：使用生理食盐水或是去离子水溶解低值样本，然后50％稀释成5个点，和零点一起每一个样本测试5次，计算平均值，求得SD数值。

结果解析：根据检测数据，计算SD数值和CV数值，分别计算1SD，2SD，从最小的开始，其平均值－2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂的最小检出感度。表2显示，本发明试剂盒试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清时，稀释平均值－2SD的数值均大于零点平均值+2SD，表明本发明试剂盒试剂最低检测限至少可以达到0.1mg/L。表3显示，宁波美康生物试剂测定稀释1/16、1/8、1/4、1/2血清，并比较血清平均值－2SD与零点平均值+2SD大小，1/8和1/16稀释血清平均值－2SD的数值均小于零点平均值+2SD，表明宁波美康生物试剂最低检测限为0.5mg/L左右。

表2

表3

试验例7：灵敏度实验

本实验目的是试剂盒试剂在测试生理盐水以及一定浓度的血清时的吸光度变化值。

采用实验例1试剂、对照试剂(宁波美康)、校准品、空白溶液、0.9％的生理食盐水，浓度的血清时的吸光度变化值。

机器：日立7170自动生化分析仪。

操作步骤：使用生理食盐水、低值样本，每个样本测试5次，计算吸光度。

表4、5显示，本发明试剂测定生理盐水时吸光度变化为-0.0092，理论浓度为10mg/L血清样本时吸光度变化为0.0157；宁波美康试剂测定生理盐水时吸光度变化为-0.0047，理论浓度为10mg/L血清样本时吸光度变化为0.0135。表4、5分别表示发明试剂盒试剂、宁波美康试剂的灵敏度，本发明试剂盒试剂灵敏度稍好于好于宁波美康生物试剂。

表4

表5

综上所述，本发明的体系中采用一种解离蛋白剂，最大限度暴露样本中的抗原位点，增加抗原抗体的结合率，并且采用一种更稳定、放大信号效果更理想的乳胶粒子包被一种特定的α1-微球蛋白多克隆抗体，通过这些手段，从而实现本发明试剂的高灵敏度；解决了目前市场上α1-MG试剂检测灵敏度不高，价格昂贵等问题。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (8)

1.一种α1-微球蛋白多克隆抗体，其特征在于，所述α1-微球蛋白多克隆抗体是由包含以下步骤的方法制备而得：

S1、免疫原的制备：在重组α1-微球蛋白氨基酸链中加入保护氨基酸链6-His及10-Cys，并加入2个酶切位点Hind III和BamH I，重组表达得到抗原；

S2、免疫动物：选用兔免疫途径，采用淋巴结免疫法，首次与第二次免疫间隔为15天，第二次后间隔10天；

S3、抗血清的纯化和保存：使用亲和柱对抗血清进行亲和和纯化，纯化后的抗体除盐后添加甘油保存。

2.如权利要求1所述的α1-微球蛋白多克隆抗体，其特征在于，步骤S1具体为：在重组α1-微球蛋白氨基酸链中，加入保护氨基酸链6-His于原氨基酸链的头部，加入保护氨基酸链10-Cys于原氨基酸链的尾部，并于头部6-His氨基酸链中加入Hind III酶切位点，于尾部10-Cys氨基酸链中加入BamH I酶切位点。

3.如权利要求1所述的α1-微球蛋白多克隆抗体，其特征在于，步骤S3中，使用的亲和柱为琼脂糖凝胶亲和柱、纯化溶液为PBS缓冲液。

4.一种α1-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂和R2试剂；所述R1试剂为含有解离蛋白剂的磷酸盐缓冲体系，所述R2试剂为含有如权利要求1所述的α1-微球蛋白多克隆抗体包被的致敏胶乳颗粒的缓冲体系。

5.如权利要求4所述的α1-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂包含如下成分：pH为7.0～7.6、浓度为10～100mmol/L的磷酸盐缓冲液，浓度为5～20mmol/L的乙二胺四乙酸二钠、浓度为200～500mmol/L的盐酸胍、浓度为10～50mmol/L的氯化钠、浓度为10～100mmol/L的聚乙二醇以及体积分数为0.01％～0.05％的防腐剂。

6.根据权利要求4所述的α1-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂包含如下成分：pH为7.0～7.6、浓度为10～100mmol/L的磷酸盐缓冲液、浓度为10～100ml/L的所述α1-微球蛋白多克隆抗体包被的致敏乳胶颗粒。

7.根据权利要求6所述的α1-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述α1-微球蛋白多克隆抗体包被的致敏乳胶颗粒是通过包含如下步骤的方法制备而得：

A1、将α1-微球蛋白多克隆抗体加入粒径为150～300nm的致敏乳胶颗粒中，控制所述α1-微球蛋白多克隆抗体与致敏乳胶颗粒的体积比为0.5～1∶1，室温孵育1.5-2.5小时，得到溶液；

A2、在所述溶液中加入碳化二亚胺，控制每毫升致敏乳胶颗粒对应5～10mg碳化二亚胺，室温孵育1.5-2.5小时，得到悬浮液；

A3、将所述悬浮液进行固液分离后，取固体部分用磷酸盐缓冲液洗涤分散即可。

8.根据权利要求6或7所述的α1-微球蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述的致敏乳胶颗粒为聚甲基内烯酸甲酯微球或聚苯乙烯微球。