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CN107942069A - 一种ngal胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

一种ngal胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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CN107942069A
CN107942069A CN201711132885.0A CN201711132885A CN107942069A CN 107942069 A CN107942069 A CN 107942069A CN 201711132885 A CN201711132885 A CN 201711132885A CN 107942069 A CN107942069 A CN 107942069A
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J&W Beijing Biotech Co Ltd
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Abstract

本发明公开了一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法，选择聚乙二醇六氨作为抗体结合胶乳颗粒的封闭剂；应用本发明进行中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测特异性强、灵敏度高、试剂盒稳定性好，可高效检测尿液、血浆、血清中的NGAL含量，并且检测结果与荧光免疫层析法和酶联免疫吸附法相关良好。

Description

一种NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法，具体地说，涉及一种以聚乙二醇六氨为封闭剂的NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
急性肾损伤(AKI)是一种发病率和死亡率均较高的疾病，由于该病发病机理不明，并且缺乏准确可靠的早期诊断标志物，因此临床上尚未出现有效治疗药物。传统的肾损伤标志物(如血清肌酐、胱抑素C，α1微球蛋白、β2微球蛋白及视黄醇结合蛋白)多为功能性标志物，但绝大多数AKI的结构变化发生在功能性障碍之前，因此，结构性肾损伤标志物对AKI的诊断要更为敏感，其中研究最充分、变化幅度最显著的就是中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)。
NGAL是一种小型且较隐秘的多肽，能直接从尿液中检测出来。大量研究证明，顺铂诱导AKI后约2h就能在尿中检测到NGAL，而检测出血肌酐的明显改变要3-4天。另外，儿童心脏手术后发生急性肾衰的患者在手术后2h的血、尿NGAL浓度明显升高，而血肌酐明显升高在1-3d后。由于测定血液中NGAL浓度既能避免因极度少尿带来的麻烦，又能减轻因使用利尿药进行治疗所带来的干扰，因此，其测定对AKI的早期诊断更加有力。总而言之，通过NGAL进行AKI的早期临床诊断，对提高AKI的治疗效果、降低死亡率具有重要价值。
目前对于NGAL的检测方法主要包括酶联免疫法(ELISA)、传统免疫比浊法、胶乳免疫比浊法等，其中，胶乳免疫比浊法通过将样本中的NGAL抗原与试剂盒中连接到胶乳颗粒上的特异性抗人NGAL抗体发生免疫反应，形成抗原抗体免疫复合物，使胶乳颗粒连接成网状，从而增加了反应溶液体系的浊度。浊度高低与NGAL抗原浓度在一定范围内呈正相关，通过测定特定波长(540nm-700nm)的反应溶液的吸光度，参照校准曲线即可计算出样本中NGAL的含量。相对于酶联免疫法来说，胶乳免疫比浊法通量大，耗时短，可实现自动化，并且可减少人为因素对检测结果的影响；而与传统的免疫比浊法相比，使用胶乳颗粒可增加试剂的灵敏度及准确度；因此，胶乳免疫比浊法具有较好的应用前景。
然而，根据健康人群体检数据，尿液中NGAL含量一般在10ng/mL以下，而根据文献记录，发生急性肾损伤时尿液中的NGAL可达几千甚至上万ng/mL，所以需要在保证试剂线性范围的基础上，增加试剂的灵敏度，否则临床检验时需要稀释样本才能保证高浓度NGAL的测试准确性，使用非常不便。
另外，丹麦BIOPORTO公司是世界上最早研究NGAL诊断试剂的公司，其NGAL ELISA及胶乳免疫比浊法检测试剂在临床上的应用已获得世界范围内的认可。而国内现有自产的NGAL试剂与BIOPORTO公司生产的检测试剂的相关性均偏低，极大地限制了国产试剂在临床上的应用。
因此，亟待在常规的NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒的制备基础上进行改良，以提高NGAL胶乳免疫比浊法试剂的灵敏度及准确度，改善试剂的稳定性。
发明内容
基于现有技术的不足，本发明提供了一种以聚乙二醇六氨为封闭剂的NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法，以改善胶乳免疫比浊法检测试剂的灵敏度、特异性以及抗体结合胶乳颗粒的稳定性。
本发明为了实现上述目的所采取的技术方案是：
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品，其中，所述试剂R2包括抗体、胶乳颗粒和R2缓冲液，其特征在于：所述试剂R2制备过程中所使用的封闭剂为聚乙二醇六氨，聚乙二醇六氨的化学结构式为H-(O-CH2-CH2)n-(NH)5-NH2。
所述试剂R1包括胶乳免疫比浊法检测试剂盒常规使用的缓冲液，如磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液等，其使用浓度为10-250mM。
试剂R1还可包括常规的电解质、表面活性剂、非特异性反应阻断剂、促凝剂、防腐剂、生物稳定剂等成分。
进一步地，非特异性反应阻断剂可选用抗HAMA抗体，抗RF抗体、羊血清、鼠血清或兔血清等。
所述抗体为特异性抗人NGAL抗体，可选用单克隆抗体或多克隆抗体。
优选地，所述抗体为鼠抗人单克隆抗体、兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体中的任意一种。
优选地，所述胶乳颗粒粒径为100-400nm，表面电荷为0.05-0.2mmol/g。
优选地，所述R2缓冲液包括缓冲液，所述缓冲液可选用磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液等，其使用浓度为10-500mM，pH为5.0-10.0。
进一步优选地，所述缓冲液pH为6.0-8.0。
所述R2缓冲液还可包括电解质、表面活性剂、防腐剂、生物稳定剂等试剂，上述物质在使用时溶于缓冲液中，用于已包被有抗体的胶乳颗粒的重悬和稀释。
所述校准品为NGAL重组蛋白或天然NGAL蛋白。
一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒的制备方法，其中，所述试剂R2的制备包括如下步骤：
(1)使用包被缓冲液分别对胶乳颗粒与抗体进行稀释，将稀释后的胶乳颗粒与抗体混合均匀，形成胶乳颗粒与抗体的混合液；
(2)向胶乳颗粒与抗体的混合液中加入EDC进行活化，搅拌后离心去上清；
(3)向步骤(2)离心后的沉淀中加入聚乙二醇六氨，搅拌过夜后离心去上清；
(4)向步骤(3)离心后的沉淀中加入R2缓冲液进行重悬，超声分散均匀，并于25-60℃熟化16-72小时，得到稳定的抗体包被的胶乳颗粒；
(5)使用R2缓冲液将步骤(4)得到的抗体包被的胶乳颗粒稀释到0.05-0.2％wt，4-10℃保存。
优选地，所述步骤(2)中的搅拌时间为2-3小时；所述步骤(3)中的搅拌时间为2-4小时。
优选地，所述包被缓冲液可选用磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液等，其使用浓度为10-500mM，pH为5.0-10.0。
进一步优选地，所述包被缓冲液pH为6.0-8.0。
优选地，所述聚乙二醇六氨的使用浓度为0.1-0.5％wt，所述聚乙二醇六氨的使用体积与步骤(2)中胶乳颗粒与抗体的混合液体积相同。
优选地，所述步骤(1)、(2)、(3)中搅拌过程的温度为25-55℃。
进一步优选地，所述步骤(1)、(2)、(3)中搅拌过程的温度为25-45℃。
优选地，所述步骤(4)中熟化温度为30-50℃。
有益效果：本发明公开了一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒及其制备方法，选择聚乙二醇六氨作为抗体结合胶乳颗粒的封闭剂；聚乙二醇六氨含有聚乙二醇链和6个氨基，其氨基可与胶乳颗粒上被活化的羧基及环氧基结合，使颗粒表面更具有亲水性，从而防止生物由来物质的吸附，降低非特异性反应；同时，聚乙二醇六氨还有利于与胶乳颗粒结合后的抗体的立体构造和/或其方向的稳定性，进而改善抗体结合胶乳颗粒后性能的稳定性。
综上所述，应用本发明进行中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测特异性强、灵敏度高、试剂盒稳定性好，可高效检测尿液、血浆、血清中的NGAL含量，并且检测结果与荧光免疫层析法和酶联免疫吸附法相关良好。
附图说明
图1所示为七种封闭剂封闭多抗包被试剂的灵敏度对比；
图2所示为七种封闭剂封闭单抗包被试剂的灵敏度对比；
图3所示为六种封闭剂封闭试剂的血清影响率；
图4所示为本发明NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒(J&W)与对比例1校准品曲线；
图5所示为对64组NGAL正常值范围尿液样本进行检测时J&W及对比例1与荧光免疫层析法检测结果相关对比图；
图6所示为对71组NGAL异常值范围尿液样本进行检测时J&W及对比例1与荧光免疫层析法检测结果相关对比图；
图7所示为BIOPORTO公司ELISA试剂校准曲线；
图8所示为J&W与酶联免疫吸附法检测结果相关对比图；
图9所示为J&W检测血清中NGAL的抗干扰试验结果；
图10所示为J&W检测尿液中NGAL的抗干扰试验结果；
图11所示为J&W4-8℃保存稳定性曲线；
图12所示为J&W 37℃保存稳定性曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详述：
实施例1：以聚乙二醇六氨为封闭剂的NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒的增感作用
1.本发明NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒的制备
试剂R1包括：25mM HEPES缓冲液(pH7.5)，150mM氯化钠，10mMEDTA-2Na，1％wtBSA，1％wt聚乙二醇6000，0.01％wt吐温-20，1％wt兔血清或小鼠血清，0.1％wt叠氮钠。
试剂R2包括：兔抗人多克隆抗体或鼠抗人单克隆抗体(5mg/mL)，10％wt胶乳颗粒(粒径300nm、表面电荷0.15mmol/g)，0.5％wt聚乙二醇六氨(聚乙二醇分子量为2000或5000)，0.1％wt BSA，0.1％wt叠氮钠和50mM HEPES缓冲液(pH7.5)。
校准品包括：10mM HEPES缓冲液(pH7.5)，1％wtBSA，0.1％wt吐温-20，0.1％wt叠氮钠和NGAL重组蛋白，其中NGAL重组蛋白浓度分别为150ng/mL，600ng/mL,1500ng/mL，3000ng/mL，5000ng/mL。
其中，多抗包被试剂R2制备时：
使用50mM HEPES缓冲液稀释兔抗人多克隆抗体，使得抗体终浓度为1mg/mL，体积为10mL，室温环境下搅拌5分钟。使用50mM HEPES缓冲液稀释胶乳颗粒，使得胶乳颗粒终浓度为2％wt，体积为10mL，室温环境下搅拌5分钟。
将稀释的兔抗人多克隆抗体与稀释的胶乳颗粒混合，25℃水浴搅拌2小时。向胶乳颗粒与抗体的混合液中加入1％wt EDC 0.6mL进行活化，25℃水浴搅拌2h后离心去上清；向离心后的沉淀中加入50mM HEPES缓冲液稀释的0.5％wt聚乙二醇六氨20mL进行封闭，25℃水浴搅拌过夜后离心去上清；离心后的沉淀中加入混合有0.1％wt BSA和0.1％wt叠氮钠的50mM HEPES缓冲液，将胶乳反应溶液稀释到1％wt，超声分散均匀，并于37℃熟化20小时，得到稳定的抗体包被的胶乳颗粒；使用混合有0.1％wt BSA和0.1％wt叠氮钠的50mM HEPES缓冲液将得到的抗体包被的胶乳颗粒稀释到0.1％wt，4-10℃保存。
单抗包被试剂R2制备时：
使用50mM HEPES缓冲液分别稀释鼠抗人单克隆抗体1、鼠抗人单克隆抗体2，使得各抗体终浓度为1mg/mL，体积为10mL，室温环境下搅拌5分钟。使用50mM HEPES缓冲液稀释胶乳颗粒，使得胶乳颗粒终浓度为2％wt，体积为10mL，室温环境下搅拌5分钟。
将稀释的鼠抗人单克隆抗体分别与稀释的胶乳颗粒混合，25℃水浴搅拌2小时。向胶乳颗粒与抗体的混合液中加入1％wt EDC 0.6mL进行活化，25℃水浴搅拌2h后离心去上清；向离心后的沉淀中加入50mM HEPES缓冲液稀释的0.5％wt聚乙二醇六氨20mL进行封闭，25℃水浴搅拌过夜后离心去上清；离心后的沉淀中加入混合有0.1％wt BSA和0.1％wt叠氮钠的50mM HEPES缓冲液，将胶乳反应溶液稀释到1％wt，超声分散均匀，并于42℃熟化20小时，得到稳定的抗体包被的胶乳颗粒；将两种抗体包被的胶乳颗粒混合，使用混合有0.1％wtBSA和0.1％wt叠氮钠的50mM HEPES缓冲液将两种抗体包被的胶乳颗粒分别稀释到0.04％wt，即两种抗体包被的胶乳颗粒总浓度为0.08％wt，4-10℃保存。
2.增感作用试验
实验组：以聚乙二醇(MW5000)六氨(PEG(5000)-6N)为封闭剂或以聚乙二醇(MW2000)六氨(PEG(2000)-6N)为封闭剂；
对照组：分别以BSA，N101，PEG1000，mPEG-N-5000，mPEG-N-20000为封闭剂代替实验组中的聚乙二醇六氨，其中：N101主要成分为2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱与甲基丙烯酸丁酯聚合物(MPC-BMA)的共聚物。
对比七种封闭剂封闭单抗或多抗包被试剂对NGAL低值(150ng/mL)反应性的影响，将2μLNGAL样本与240μL试剂R1混匀，并在37℃保温5分钟，然后加入试剂R260μL，37℃保温20秒后记录540nm吸光度A1，5分钟后记录吸光度A2，spline校准。
实验结果如图1-2所示，与BSA封闭相比，多抗包被试剂中，PEG(5000)-6N封闭后试剂灵敏度更高，单抗包被试剂中，PEG(2000)-6N封闭后试剂灵敏度更高，由此可见，聚乙二醇六氨具有良好的增感效果。
实施例2：以聚乙二醇六氨为封闭剂的NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒的血清影响率
对比反应性较好的六种封闭剂(BSA，N101，PEG(5000)-6N，PEG(2000)-6N，PEG1000，mPEG-N-5000)对试剂测值准确度的影响。具体方法为：向0.9％NaCl、人由来正常血清(EXA-N)、人由来异常血清(EXA-A)中分别添加浓度为20000ng/mL的人NGAL重组抗原，使各基质的NGAL终浓度为200ng/mL。使用上述封闭剂封闭的试剂对这三种基质的样本进行检测，以0.9％NaCl检测结果为对照进行比对。
实验结果如图3所示，与传统的封闭剂BSA相比，PEG(5000)-6N、PEG1000、mPEG-N-5000封闭单抗包被试剂的血清影响率更接近1.00，测值更准确。进一步地，以PEG(5000)-6N、PEG1000、mPEG-N-5000封闭的多抗包被试剂对这三种基质的样本进行检测，PEG(5000)-6N封闭多抗包被试剂的血清影响率更接近1.00，测值更准确。
实施例3：以聚乙二醇六氨为封闭剂的NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒的特异性
1.本发明NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒(J&W)的制备
试剂R1包括：50mM HEPES缓冲液(pH8.0)，150mM氯化钠，10mMEDTA-2Na，1％wtBSA，0.8％wt聚乙二醇6000，0.01％wt吐温-20，1％wt兔血清和0.1％wt叠氮钠。
试剂R2包括：兔抗人多克隆抗体(5mg/mL)，10％wt胶乳颗粒(粒径200nm、表面电荷0.2mmol/g)，0.5％wt聚乙二醇六氨(聚乙二醇分子量为5000)，0.1％wtBSA，0.1％wt叠氮钠和50mM HEPES缓冲液(pH8.0)。
校准品包括：10mM HEPES缓冲液(pH8.0)，1％wtBSA，0.1％wt吐温-20，0.1％wt叠氮钠和NGAL重组蛋白，其中NGAL重组蛋白浓度分别为150ng/mL，600ng/mL,1500ng/mL，3000ng/mL，5000ng/mL。
试剂R2制备以及检测样本的方法如实施例1所示。
2.设置对比例
对比例1：其他厂家胶乳免疫比浊法(LETIA)试剂
试剂R1：pH7.3，主要成分为：甘氨酸50mM，NaCl 0.15M，EDTA 10mM，BSA0.1％wt，兔IgG 1％wt；
试剂R2：pH7.0，主要成分为：HEPES 20mM，叠氮钠0.1％wt，小粒径胶乳2％wt，大粒径胶乳0.5％wt。
校准品：HEPES 50mM，NaCl 0.15M，EDTA 10mM，叠氮钠0.1％wt，BSA0.5％wt，蔗糖0.5％wt，其余为去离子水。
对比例2：市售荧光免疫层析(FCIA)试剂盒进行检测
3.与荧光免疫层析法的相关性试验
本发明NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒(J&W)与对比例1校准品曲线如图4所示。
使用本发明NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒(J&W)与对比例1、2试剂进行尿液样本检测，三套试剂建议的人尿样本中NGAL正常值范围均为100ng/mL以下。分别检测正常值范围样本(≤100ng/mL)和异常值样本(>100ng/mL)，并且将对比例2中的检出结果分别与J&W和对比例1相关联。
如图5-6所示，无论是正常值范围样本(≤100ng/mL)还是异常值样本(>100ng/mL)，本发明J&W试剂盒均与FCIA法测值相关性更好，尤其是检测正常值范围样本时，PEG(5000)-6N封闭的胶乳免疫检测试剂可有效避免假阳性反应。
4.与酶联免疫吸附法的相关性试验
使用本发明NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒(J&W)与BIOPORTO公司ELISA试剂(BIOPORTO Diagnostics，NGAL Rapid ELISAKit，KIT037RUO，Lot.NR-1309-02)进行20组血清样本检测，图7所示为BIOPORTO公司ELISA试剂校准曲线；如图8所示，使用本发明NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒(J&W)与BIOPORTO公司ELISA试剂相关可达R2>0.90(R>0.95)。由此可见，PEG(5000)-6N封闭的胶乳免疫检测试剂与酶联免疫吸附法检测相关良好。
5.抗干扰试验
向正常人血清或正常人尿液中添加浓度为20000ng/mL的人NGAL重组抗原，另加入各高浓度干扰因子或同样体积的干扰因子稀释液，使血清或尿液中的NGAL终浓度为200ng/mL，干扰因子如表1所示。对比添加了稀释液(-)或干扰因子(+)样本的测值。
表1
如图9-10，所示与(-)相比，测值均能控制在±5％以内，可见，J&W抗干扰能力优异。
6.稳定性试验
对本发明NGAL胶乳免疫比浊法检测试剂盒(J&W)进行4-8℃及37℃保存的稳定性测试，分别测定其在NGAL低值(150ng/mL)和高值(600ng/mL)下的信号，与0天时测定信号进行对比。如图11-12所示，本发明4-8℃保存两年半稳定性良好，37℃可保存至少33天。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒，包括试剂R1、试剂R2和校准品，其中，所述试剂R2包括抗体、胶乳颗粒和R2缓冲液，其特征在于：所述试剂R2所用封闭剂为聚乙二醇六氨，聚乙二醇六氨的化学结构式为H-(O-CH2-CH2)n-(NH)5-NH2。
2.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于：所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于：所述胶乳颗粒粒径为100-400nm，表面电荷为0.05-0.2mmol/g。
4.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于：所述R2缓冲液包括缓冲液，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液中的任意一种或几种；所述缓冲液pH为5.0-10.0。
5.根据权利要求1所述的一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒，其特征在于：所述R2缓冲液还包括电解质、表面活性剂、防腐剂、生物稳定剂中的任意一种或几种，所述电解质、表面活性剂、防腐剂、生物稳定剂中的任意一种或几种使用时混合于所述缓冲液中。
6.一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述试剂R2的制备包括如下步骤：
(1)使用包被缓冲液分别对胶乳颗粒与抗体进行稀释，将稀释后的胶乳颗粒与抗体混合均匀，形成胶乳颗粒与抗体的混合液；
(2)向胶乳颗粒与抗体的混合液中加入EDC进行活化，搅拌后离心去上清；
(3)向步骤(2)离心后的沉淀中加入聚乙二醇六氨，搅拌过夜后离心去上清；
(4)向步骤(3)离心后的沉淀中加入R2缓冲液进行重悬，超声分散均匀，并于25-60℃熟化16-72小时，得到稳定的抗体包被的胶乳颗粒；
(5)使用R2缓冲液将步骤(4)得到的抗体包被的胶乳颗粒稀释到0.05-0.2％wt，4-10℃保存。
7.根据权利要求6所述的一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述包被缓冲液包括磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼酸缓冲液、醋酸缓冲液或柠檬酸缓冲液中的任意一种或几种；所述包被缓冲液pH为5.0-10.0。
8.根据权利要求6所述的一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述聚乙二醇六氨的使用浓度为0.1-0.5％wt，所述聚乙二醇六氨的使用体积与步骤(2)中胶乳颗粒与抗体的混合液体积相同。
9.根据权利要求6所述的一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白胶乳免疫比浊法检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)、(2)、(3)中搅拌过程的温度为25-55℃。
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