JP2747839B2 - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JP2747839B2 JP2747839B2 JP1207947A JP20794789A JP2747839B2 JP 2747839 B2 JP2747839 B2 JP 2747839B2 JP 1207947 A JP1207947 A JP 1207947A JP 20794789 A JP20794789 A JP 20794789A JP 2747839 B2 JP2747839 B2 JP 2747839B2
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- gly
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、モノクローナル抗体、更に詳細には、マク
ロファージ走化活性を有するポリペプチドに特異的に反
応する新規なモノクローナル抗体及びその製法に関する
ものである。
ロファージ走化活性を有するポリペプチドに特異的に反
応する新規なモノクローナル抗体及びその製法に関する
ものである。
本発明に係るモノクローナル抗体は、マクロファージ
走化活性を有するリンホカイン、サイトカインに特異的
に反応する特性を有しているので、本発明は、各種免疫
機構の解明や組織染色法、鑑別診断法等医療の技術分野
において特に有効に利用されるものである。
走化活性を有するリンホカイン、サイトカインに特異的
に反応する特性を有しているので、本発明は、各種免疫
機構の解明や組織染色法、鑑別診断法等医療の技術分野
において特に有効に利用されるものである。
一般的に、マクロファージ走化性因子（以下MCFと略
す）は、リンパ球及びリンパ球系株化細胞から特異的ま
たは非特異的に分泌されるマクロファージ走化活性を有
するリンフォカインの一種として知られている。また末
梢血リンパ球（以下PBLと略す）をレクチンたとえばフ
ィトヘムアグルチニン（以下PHAと略す）で刺激した
後、その刺激リンパ球を培養した上清には高いマクロフ
ァージ走化活性が認められることは既に知られている。
す）は、リンパ球及びリンパ球系株化細胞から特異的ま
たは非特異的に分泌されるマクロファージ走化活性を有
するリンフォカインの一種として知られている。また末
梢血リンパ球（以下PBLと略す）をレクチンたとえばフ
ィトヘムアグルチニン（以下PHAと略す）で刺激した
後、その刺激リンパ球を培養した上清には高いマクロフ
ァージ走化活性が認められることは既に知られている。
さらに永続生存性を持たせるために白血病細胞株と上
記刺激リンパ球を融合させて得られたハイブリドーマの
培養上清にもマクロファージ走化活性が認められる（特
開昭60−181018号公報）。
記刺激リンパ球を融合させて得られたハイブリドーマの
培養上清にもマクロファージ走化活性が認められる（特
開昭60−181018号公報）。
一方、遅延型過敏症において、感作動物に惹起反応を
生じさせ、皮膚反応が最大となる約48時間後において、
その組織中にリンパ球の他マクロファージの浸潤が著明
であることから、遅延型過敏症発症においてMCFの関与
が考えられている。
生じさせ、皮膚反応が最大となる約48時間後において、
その組織中にリンパ球の他マクロファージの浸潤が著明
であることから、遅延型過敏症発症においてMCFの関与
が考えられている。
このようにMCFは反応局所にマクロファージを集合さ
せる活性を有することで定義されるので、抗腫瘍剤とし
て医薬への応用が期待されている。
せる活性を有することで定義されるので、抗腫瘍剤とし
て医薬への応用が期待されている。
このようなMCFの構造解析の検討はすでに行なわれて
おり、末梢血リンパ球より得たハイブリドーマからの精
製及び一次構造の決定が本発明者らの手によって成され
（特願昭63−173785）、また、化学的合成法によっても
合成されており、その一次構造は、下記の式（Ｉ）に示
すとおりである。
おり、末梢血リンパ球より得たハイブリドーマからの精
製及び一次構造の決定が本発明者らの手によって成され
（特願昭63−173785）、また、化学的合成法によっても
合成されており、その一次構造は、下記の式（Ｉ）に示
すとおりである。
H-Y-Leu-Gly-Arg-X-Asp-Gly-Ser-Glu-OH …（Ｉ） （式中、ＸはGlu又はGlnを表わし、ＹはTrp又はArgを表
わす。） 本発明は上記のMCF活性を有するペプチドに特異的に
結合するモノクローナル抗体及び抗血清に関するもので
あるが、このようなものは従来知られておらず、新規で
ある。
わす。） 本発明は上記のMCF活性を有するペプチドに特異的に
結合するモノクローナル抗体及び抗血清に関するもので
あるが、このようなものは従来知られておらず、新規で
ある。
このような技術の現状において、MCF活性を有するペ
プチドと特異的に反応する物質の開発がなされれば、こ
の物質は、MCF活性の阻害剤としてあるいはMCF活性を有
するペプチドの精製剤として有効に使用されるはずであ
る。
プチドと特異的に反応する物質の開発がなされれば、こ
の物質は、MCF活性の阻害剤としてあるいはMCF活性を有
するペプチドの精製剤として有効に使用されるはずであ
る。
また一方、MCFが前述したように遅延型過敏症に関与
するため、MCF活性を有するペプチドと特異的に反応す
る物質が開発されれば、この物質は、免疫機構の関与の
有無を検索するための組織染色法又は鑑別診断法におい
て有効に利用されるはずである。
するため、MCF活性を有するペプチドと特異的に反応す
る物質が開発されれば、この物質は、免疫機構の関与の
有無を検索するための組織染色法又は鑑別診断法におい
て有効に利用されるはずである。
このような観点から、MCF活性を有するペプチドと特
異的に反応する物質の開発が当業界において待望されて
いたのである。
異的に反応する物質の開発が当業界において待望されて
いたのである。
本発明は、上記した業界のニーズに応えるためになさ
れたものであって、MCF活性を有するペプチドと特異的
に反応する物質について各方面から検討した結果、この
ような物質として、抗体、特にモノクローナル抗体に着
目した。
れたものであって、MCF活性を有するペプチドと特異的
に反応する物質について各方面から検討した結果、この
ような物質として、抗体、特にモノクローナル抗体に着
目した。
そして本発明者らは、MCF活性を有するペプチドを化
学合成し、これに担体蛋白質を結合せしめこれを免疫原
として動物を免疫し、その動物のリンパ球とミエローマ
細胞とを融合させることにより得られたハイブリドーマ
細胞株が、MCFに対し特異的に反応しそして上記用途に
十分に使用できるモノクローナル抗体を生産するという
新知見を得、本発明を完成した。
学合成し、これに担体蛋白質を結合せしめこれを免疫原
として動物を免疫し、その動物のリンパ球とミエローマ
細胞とを融合させることにより得られたハイブリドーマ
細胞株が、MCFに対し特異的に反応しそして上記用途に
十分に使用できるモノクローナル抗体を生産するという
新知見を得、本発明を完成した。
次に本発明を詳細に説明する。
本発明のモノクローナル抗体を調製するためには、ま
ず、抗原を用意しなければならない。本発明において、
抗原の作製は、生体試料又はその培養物を用いる生化
学的な方法、あるいは化学的にアミノ酸を順次結合さ
せる化学合成法によって行い、たとえばグルタールアル
デヒドのような、ペプチドとタンパク質を結合させる試
薬を用い、かさ貝のヘモシアニンや血清アルブミン、卵
白アルブミンなどの担体タンパク質と結合させて用いる
が、具体的には以下に述べる方法による。
ず、抗原を用意しなければならない。本発明において、
抗原の作製は、生体試料又はその培養物を用いる生化
学的な方法、あるいは化学的にアミノ酸を順次結合さ
せる化学合成法によって行い、たとえばグルタールアル
デヒドのような、ペプチドとタンパク質を結合させる試
薬を用い、かさ貝のヘモシアニンや血清アルブミン、卵
白アルブミンなどの担体タンパク質と結合させて用いる
が、具体的には以下に述べる方法による。
生体試料又はその培養物を用いる生化学的な方法。
ａ）ヒト末梢血リンパ球を用いる方法。
本発明におけるMCF活性を有するペプチド（以下、本
発明のペプチドと略称することもある）を製造する原料
としては、ヒト末梢血リンパ球（以下、PBLと略す）を
用いる方法がある。
発明のペプチドと略称することもある）を製造する原料
としては、ヒト末梢血リンパ球（以下、PBLと略す）を
用いる方法がある。
PBLは、ヒト末梢血を用い、比重によってリンパ球を
分離する方法によって取得される。
分離する方法によって取得される。
すなわち、シグマ社Histohypaque液やファルマシア社
製FicolやPercoll液の適当な比重液に末梢血を重層し、
例えば1500rpm×20minの強さの遠心をかけると、リンパ
球が豊富な画分を得ることができる。この画分をプラス
チックシャーレにはりつけ、非付着細胞をリンパ球とし
て用いることもできる。
製FicolやPercoll液の適当な比重液に末梢血を重層し、
例えば1500rpm×20minの強さの遠心をかけると、リンパ
球が豊富な画分を得ることができる。この画分をプラス
チックシャーレにはりつけ、非付着細胞をリンパ球とし
て用いることもできる。
本発明のペプチドを製造するには、通常用いられる培
地たとえば10％牛胎児血清（FCS）含有RPMI1640培地にP
BLを浮遊させ、レクチン（コンカナバリンＡやフィトヘ
ムアグルチニンなど）を加えて培養されるが、例えば20
hrなど適当な時間培養しておいたリンパ球を用いる方が
培養効率がよいのでより好ましい。
地たとえば10％牛胎児血清（FCS）含有RPMI1640培地にP
BLを浮遊させ、レクチン（コンカナバリンＡやフィトヘ
ムアグルチニンなど）を加えて培養されるが、例えば20
hrなど適当な時間培養しておいたリンパ球を用いる方が
培養効率がよいのでより好ましい。
本発明のペプチドを得るためには、PBLを無血清培地
に再懸濁させ、通常の培養方法、たとえば５％CO2存在
下37℃で１時間から数日間培養する方法で培養したの
ち、その上清液を用いる。
に再懸濁させ、通常の培養方法、たとえば５％CO2存在
下37℃で１時間から数日間培養する方法で培養したの
ち、その上清液を用いる。
PBLの無血清培地への再懸濁、培養を行なわないで、P
BL細胞をそのまま破壊し、比較的大きな細胞器管を除く
ための遠心分離を行なってその上清液（セルライセー
ト）を用いることもできる。この際の遠心分離は、例え
ば10,000×ｇ、20分程度行なえば良い。
BL細胞をそのまま破壊し、比較的大きな細胞器管を除く
ための遠心分離を行なってその上清液（セルライセー
ト）を用いることもできる。この際の遠心分離は、例え
ば10,000×ｇ、20分程度行なえば良い。
PBLの培養上清又はセルライセートから本発明のペプ
チドを得るには、まず、培養上清又はセルライセートか
ら限外ろ過など分子のサイズでわける方法を用いて高分
子画分を除く。この溶液を陰イオン交換体に吸着させ、
塩濃度を上昇させることによりペプチドを溶出させるこ
とができる。尚、陰イオン交換体としてはDEAE（ジエチ
ルアミノエチル交換体）やQAE（第４級アミノエチル交
換体）さらに、ファルマシア社製Mono Qなども用いるこ
とができる。
チドを得るには、まず、培養上清又はセルライセートか
ら限外ろ過など分子のサイズでわける方法を用いて高分
子画分を除く。この溶液を陰イオン交換体に吸着させ、
塩濃度を上昇させることによりペプチドを溶出させるこ
とができる。尚、陰イオン交換体としてはDEAE（ジエチ
ルアミノエチル交換体）やQAE（第４級アミノエチル交
換体）さらに、ファルマシア社製Mono Qなども用いるこ
とができる。
さらに、ここに得られる活性画分を、陽イオン交換体
に吸着させ、塩濃度を上昇させることにより溶出させる
ことができる。尚、陽イオン交換体としてはファルマシ
ア社製Mono Sやカルボキシメチル交換体などを用いるこ
とができる。
に吸着させ、塩濃度を上昇させることにより溶出させる
ことができる。尚、陽イオン交換体としてはファルマシ
ア社製Mono Sやカルボキシメチル交換体などを用いるこ
とができる。
さらに、ここに得られる活性画分を逆相クロマトグラ
フィーに供与し、通常アセトニトリルなどの有機溶媒の
濃度を上昇させることによって溶出してほぼ純粋なペプ
チドを得ることができる。
フィーに供与し、通常アセトニトリルなどの有機溶媒の
濃度を上昇させることによって溶出してほぼ純粋なペプ
チドを得ることができる。
ｂ）株化されている細胞を用いる方法 本発明の新規ペプチドを製造する原料としては、株化
されている細胞を用いることができる。原料としての効
率を考慮に入れなければ、白血病細胞株CEMなどを用い
ることもできるが、末梢血リンパ球と白血病細胞株との
ハイブリドーマを用いた方が、本発明のペプチドを効率
よく製造することができるので好ましい。
されている細胞を用いることができる。原料としての効
率を考慮に入れなければ、白血病細胞株CEMなどを用い
ることもできるが、末梢血リンパ球と白血病細胞株との
ハイブリドーマを用いた方が、本発明のペプチドを効率
よく製造することができるので好ましい。
株化された細胞を用いて本発明のペプチドを製造する
には、PBLを用いて本発明のペプチドを製造する際に採
用した手順をそのまま採用することができる。
には、PBLを用いて本発明のペプチドを製造する際に採
用した手順をそのまま採用することができる。
上記ａ）及びｂ）で精製したペプチド又は部分的に精
製したペプチドを抗原として用いることができる。
製したペプチドを抗原として用いることができる。
化学的にアミノ酸を順次結合させる化学合成法 ペプチドの化学合成法としては、固相合成法が広く用
いられている。本発明のペプチド類を合成する際にも、
この方法を用いることができる。
いられている。本発明のペプチド類を合成する際にも、
この方法を用いることができる。
固相合成法においては、種々のアミノ酸部分の反応性
側鎖を適当な保護基で保護することにより、保護基が最
後に除去されるまで反応性側鎖で起こる可能性のある化
学反応を防止することができる。例えば、Asp、Gluにお
ける側鎖保護基としては、OBzl、OtBuを用いることがで
き、Ser、Thr、Tyrにおける側鎖保護基としてBzl、Br−
Ｚ、tBuを用いることができる。また、LysにおいてCl−
Ｚ、Tosが、ArgにおいてTos、MTS、Mtrが、Hisにおいて
Tos、DNP、Trt・OHが、TrpにおいてCHOが、Cysにおいて
は４−MeBzl、４−MeOBzlが側鎖保護基として用いられ
る。Metはスルホキシドの形で保護することができる。
固相合成法としては、Boc法、Fmoc法が代表的であり、
どちらの方法も本発明のペプチド類合成の際に利用でき
る。固相合成は、例えば、α−アミノ保護アミノ酸を用
いてペプチドのＣ−末端から開始することができる。適
当な出発材料は、例えば必要なα−アミノ保護アミノ酸
をクロロメチル樹脂、オキシメチル樹脂、ベンズヒドリ
ルアミン樹脂に付加することにより調製できる。また、
α−アミノ基及び側鎖基が保護されたアミノ酸の付加し
た４（オキシメチル）フェニルアセタミドメチル樹脂が
市販されており、本発明のペプチド類合成の際にも使用
することができる。また、本発明のペプチド類は、自動
固相合成機を利用しても合成することができる。
側鎖を適当な保護基で保護することにより、保護基が最
後に除去されるまで反応性側鎖で起こる可能性のある化
学反応を防止することができる。例えば、Asp、Gluにお
ける側鎖保護基としては、OBzl、OtBuを用いることがで
き、Ser、Thr、Tyrにおける側鎖保護基としてBzl、Br−
Ｚ、tBuを用いることができる。また、LysにおいてCl−
Ｚ、Tosが、ArgにおいてTos、MTS、Mtrが、Hisにおいて
Tos、DNP、Trt・OHが、TrpにおいてCHOが、Cysにおいて
は４−MeBzl、４−MeOBzlが側鎖保護基として用いられ
る。Metはスルホキシドの形で保護することができる。
固相合成法としては、Boc法、Fmoc法が代表的であり、
どちらの方法も本発明のペプチド類合成の際に利用でき
る。固相合成は、例えば、α−アミノ保護アミノ酸を用
いてペプチドのＣ−末端から開始することができる。適
当な出発材料は、例えば必要なα−アミノ保護アミノ酸
をクロロメチル樹脂、オキシメチル樹脂、ベンズヒドリ
ルアミン樹脂に付加することにより調製できる。また、
α−アミノ基及び側鎖基が保護されたアミノ酸の付加し
た４（オキシメチル）フェニルアセタミドメチル樹脂が
市販されており、本発明のペプチド類合成の際にも使用
することができる。また、本発明のペプチド類は、自動
固相合成機を利用しても合成することができる。
典型的なBoc法ペプチド合成の工程を示す。例えば、
出発材料として、α−アミノ基をBoc基で保護したアミ
ノ酸樹脂を使用する。
出発材料として、α−アミノ基をBoc基で保護したアミ
ノ酸樹脂を使用する。
1. DCMで洗浄（３回） 2. TFA/DCMで脱Boc化 3. DCMで洗浄（３回） 4. DIEA/DMFで中和 5. DMFで洗浄（５回） 6. Bocアミノ酸無水物と反応 7. DCMで洗浄（５回） 8. 工程２〜７の繰り返し 9. DCMで洗浄（２回） 10. Arガスで乾燥 11. アニソール／メチルスルフィド添加 12. −70℃でHFを添加、−20℃/30分、０℃/30分反応 13. HFを留去 14. クロロホルム・エーテルで洗浄（３回） 15. 5N−酢酸水溶液で合成ペプチドを抽出 16. 合成ペプチドをHPLCにて精製 典型的なFmoc法ペプチド合成の工程を示す。例えば、
出発材料として、α−アミノ基をBoc基で保護したアミ
ノ酸樹脂を使用する。
出発材料として、α−アミノ基をBoc基で保護したアミ
ノ酸樹脂を使用する。
1. DCMで洗浄（３回） 2. TFA/DCMで脱Boc化 3. DCMで洗浄（３回） 4. DMFで洗浄（３回） 5. Fmocアミノ酸無水物と反応 6. DMFで洗浄（５回） 7. ピペリジン/DMFで脱Fmoc化 8. 工程４〜７の繰り返し 9. DMFで洗浄（５回） 10. DCMで洗浄（２回） 11. Arガスで乾燥 12. アニソール／メチルスルフィド添加/1,2エタンジ
チオール添加 13. −70℃でHFを添加、−20℃/30分、０℃/30分反応 14. HFを留去 15. クロロホルム・エーテルで洗浄（３回） 16. 5N−酢酸水溶液で合成ペプチドを抽出 17. 合成ペプチドをHPLCにて精製 尚、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性基等が本明細
書において記号で示される場合、IUPAC及びIUPにより規
定された或いは、ペプチド化学の分野で使用される通常
の記号を用いる。記号の例は次の通りである。
チオール添加 13. −70℃でHFを添加、−20℃/30分、０℃/30分反応 14. HFを留去 15. クロロホルム・エーテルで洗浄（３回） 16. 5N−酢酸水溶液で合成ペプチドを抽出 17. 合成ペプチドをHPLCにて精製 尚、アミノ酸、ペプチド、保護基、活性基等が本明細
書において記号で示される場合、IUPAC及びIUPにより規
定された或いは、ペプチド化学の分野で使用される通常
の記号を用いる。記号の例は次の通りである。
Ala…Ｌ−アラニン Arg…Ｌ−アルギニン Asn…Ｌ−アスパラギン Asp…Ｌ−アスパラギン酸 Cys…Ｌ−システイン Gln…Ｌ−グルタミン Glu…Ｌ−グルタミン酸 Gly…グリシン His…Ｌ−ヒスチジン Ile…Ｌ−イソロイシン Leu…Ｌ−ロイシン Lys…Ｌ−リジン Met…Ｌ−メチオニン Phe…Ｌ−フェニルアラニン Pro…Ｌ−プロリン Ser…Ｌ−セリン Thr…Ｌ−スレオニン Trp…Ｌ−トリプトファン Tyr…Ｌ−タイロシン Val…Ｌ−バリン HPLC…高速液体クロマトグラフィー ODSカラム…C18カラム HMPレジン…ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸レジン
（樹脂） PAMレジン…フェニルアセタミドレジン（樹脂） BHAレジン…ベンズヒドリルアミンレジン（樹脂） DCM…ジクロロメタン DMF…ジメチルホルムアミド TFA…トリフルオロ酢酸 Arガス…アルゴンガス Bzl…ベンジル基 tBu…ｔ−ブチル基 Ｚ…ベンジルオキシカルボニル基 Boc…ブチルオキシカルボニル基 Toc…トシル基 MTS…メシチレン−ニ−スルホニル基 Trt…トリチル基 DNP…2,4−ジニトロフェニル基 Mtr…４−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホ
ニル基 Fmoc…９−フルオレニルメトキシカルボニル基 上記化学的方法で合成したペプチドを抗原として用い
ることができる。
（樹脂） PAMレジン…フェニルアセタミドレジン（樹脂） BHAレジン…ベンズヒドリルアミンレジン（樹脂） DCM…ジクロロメタン DMF…ジメチルホルムアミド TFA…トリフルオロ酢酸 Arガス…アルゴンガス Bzl…ベンジル基 tBu…ｔ−ブチル基 Ｚ…ベンジルオキシカルボニル基 Boc…ブチルオキシカルボニル基 Toc…トシル基 MTS…メシチレン−ニ−スルホニル基 Trt…トリチル基 DNP…2,4−ジニトロフェニル基 Mtr…４−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホ
ニル基 Fmoc…９−フルオレニルメトキシカルボニル基 上記化学的方法で合成したペプチドを抗原として用い
ることができる。
また、本発明において抗原として使用するペプチド
は、上記した方法で製造するだけでなく、他の化学合成
法や当該ペプチドに対応するDNAを得て、これを適当な
ベクターに挿入し、動物細胞や微生物で発現せしめる遺
伝子操作技術によって製造することもできる。
は、上記した方法で製造するだけでなく、他の化学合成
法や当該ペプチドに対応するDNAを得て、これを適当な
ベクターに挿入し、動物細胞や微生物で発現せしめる遺
伝子操作技術によって製造することもできる。
なお、当該ペプチドのみでは、これを動物に免疫して
も抗体を産生しない場合があるが、このような場合に
は、担体蛋白質を利用すればよい。担体蛋白質として業
界で常用されているものが適宜使用でき、例えば、かさ
貝のヘモシアニン、血清アルブミン、卵白アルブミン等
が使用できる。
も抗体を産生しない場合があるが、このような場合に
は、担体蛋白質を利用すればよい。担体蛋白質として業
界で常用されているものが適宜使用でき、例えば、かさ
貝のヘモシアニン、血清アルブミン、卵白アルブミン等
が使用できる。
次にこのペプチドを用いてモノクローナル抗体を製造
するのであるが、それには常法、例えばケーラーとミル
シュタインの方法（Nature,256,495−497,1975）、特公
昭58−45407号、同59−2276号に記載の方法、にしたが
って行えばよい。
するのであるが、それには常法、例えばケーラーとミル
シュタインの方法（Nature,256,495−497,1975）、特公
昭58−45407号、同59−2276号に記載の方法、にしたが
って行えばよい。
すなわち、該ペプチドを用い、必要あればアジュバン
トと併用して動物を免疫する。血清をELISA法等によっ
てバイオアッセイを行い、血清が該ペプチドと反応する
ことを確認する。
トと併用して動物を免疫する。血清をELISA法等によっ
てバイオアッセイを行い、血清が該ペプチドと反応する
ことを確認する。
このようにして免疫された動物から、リンパ球を採取
する。リンパ球調製には脾臓、リンパ節、末梢血等が用
いられる。このリンパ球を骨髄腫細胞（ミエローマ細
胞）と融合させる。骨髄腫細胞としては、特定酵素の欠
損した細胞、例えはマウスミエローマP3−X63−Ag8−U1
（P3−U1）、P3−X63−Ag8−653（X63−653）、P3−NS1
−１−Ag4−１（NS−１）、ラットミエローマ210−RCY3
−Ag123等既知の株が適宜使用される。細胞融合は、融
合剤としてポリエチレングリコール、センダイウイルス
等を用いて常法にしたがって行う。
する。リンパ球調製には脾臓、リンパ節、末梢血等が用
いられる。このリンパ球を骨髄腫細胞（ミエローマ細
胞）と融合させる。骨髄腫細胞としては、特定酵素の欠
損した細胞、例えはマウスミエローマP3−X63−Ag8−U1
（P3−U1）、P3−X63−Ag8−653（X63−653）、P3−NS1
−１−Ag4−１（NS−１）、ラットミエローマ210−RCY3
−Ag123等既知の株が適宜使用される。細胞融合は、融
合剤としてポリエチレングリコール、センダイウイルス
等を用いて常法にしたがって行う。
細胞融合の終了後、選択培地、例えばHAT（ヒポキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン）培地によりハイブ
リドーマを選択する。
ンチン−アミノプテリン−チミジン）培地によりハイブ
リドーマを選択する。
当該ペプチドに対する抗体を産生しているハイブリド
ーマを、後記の酵素免疫測定法により選出しその後限界
希釈法によるクローニングを数回くり返すと、モノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞が得られる。
ーマを、後記の酵素免疫測定法により選出しその後限界
希釈法によるクローニングを数回くり返すと、モノクロ
ーナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞が得られる。
こうして得られたモノクローナル抗体産生ハイブリド
ーマ細胞株を好ましくは同系の動物の腹腔内に接種し、
増殖させたのち腹水を採取することにより、あるいは培
養器で培養することにより、目的のモノクローナル抗体
を得ることができる。
ーマ細胞株を好ましくは同系の動物の腹腔内に接種し、
増殖させたのち腹水を採取することにより、あるいは培
養器で培養することにより、目的のモノクローナル抗体
を得ることができる。
こうして得られた抗体は必要に応じ精製して使用する
ことができる。すなわち硫安分画、イオン交換体、ゲル
濾過、アフィニティクロマトグラフィーなどの、通常タ
ンパク質に適用される方法を用いて精製することができ
る。
ことができる。すなわち硫安分画、イオン交換体、ゲル
濾過、アフィニティクロマトグラフィーなどの、通常タ
ンパク質に適用される方法を用いて精製することができ
る。
次に本発明の実施例について述べる。
実施例 （１）動物の免疫と抗体生産細胞の調製 ８〜10週令、望ましくは８週令のマウスを、化学的に
合成され、アミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチド（ペプ
チドＡ）をグルタールアルデヒドでカサ貝ヘモシアニン
と結合されたもの（抗原Ｂ）で免疫して、その動物の
脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を調製する。免
疫するマウスは、担体タンパク質として用いるカサ貝ヘ
モシアニンで前処理して免疫寛容にしておくのが好まし
い。
合成され、アミノ酸配列（Ｉ）を有するペプチド（ペプ
チドＡ）をグルタールアルデヒドでカサ貝ヘモシアニン
と結合されたもの（抗原Ｂ）で免疫して、その動物の
脾、リンパ節、末梢血中の抗体産生細胞を調製する。免
疫するマウスは、担体タンパク質として用いるカサ貝ヘ
モシアニンで前処理して免疫寛容にしておくのが好まし
い。
免疫の方法は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは腹
腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完
全アジュバント（Complete Freund's Adjuvant）また
は、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕
とともに抗原Ｂを投与する。以後、１〜２週間おきに、
抗原Ｂを２〜５回投与する。各免疫後３〜７日目に眼窩
静脈叢より採血し、その血清がペプチドＡと反応するこ
とを以下に示す酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ELIS
A）：医学書院刊1976年〕などで調べる。
腔内に、適当なアジュバント〔例えば、フロインドの完
全アジュバント（Complete Freund's Adjuvant）また
は、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなど〕
とともに抗原Ｂを投与する。以後、１〜２週間おきに、
抗原Ｂを２〜５回投与する。各免疫後３〜７日目に眼窩
静脈叢より採血し、その血清がペプチドＡと反応するこ
とを以下に示す酵素免疫測定法〔酵素免疫測定法（ELIS
A）：医学書院刊1976年〕などで調べる。
酵素免疫測定法： 96穴のEIA用プレート〔フロー・ラボラトリーズ（Flo
w Laboratories）社製〕に、ペプチドＡ（10〜1000μg/
ml）を100〜200μ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩放
置して、上清を抜き去った後、10％BSA（牛血清アルブ
ミン）−PBSを100〜200μ／穴分注し、４℃で１〜２
晩放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基を
ブロック（ブロッキング）した。その後、BSA−PBSを捨
て、第１抗体として、BSA−PBSで希釈した試料（マウス
血清、ハイブリドーマ培養上清、粗精製モノクローナル
抗体）を100μ／穴分注し、４℃で１晩放置する。レ
ジン水で１回、2MNaCl溶液で６回洗浄した後、第２抗体
としてヤギのビオチン化抗マウスイムノグロブリンIgG
〔ベクターラボラトリーズ社製、販売元フナコシ薬品
（株）〕の100倍希釈液を100μ／穴分注し、室温で15
分間放置する。PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ア
ビジン−ビオチン複合体〔同上〕の50倍希釈液を100μ
／穴分注し、室温で15分間放置する。
w Laboratories）社製〕に、ペプチドＡ（10〜1000μg/
ml）を100〜200μ／穴ずつ分注し、４℃で１〜２晩放
置して、上清を抜き去った後、10％BSA（牛血清アルブ
ミン）−PBSを100〜200μ／穴分注し、４℃で１〜２
晩放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基を
ブロック（ブロッキング）した。その後、BSA−PBSを捨
て、第１抗体として、BSA−PBSで希釈した試料（マウス
血清、ハイブリドーマ培養上清、粗精製モノクローナル
抗体）を100μ／穴分注し、４℃で１晩放置する。レ
ジン水で１回、2MNaCl溶液で６回洗浄した後、第２抗体
としてヤギのビオチン化抗マウスイムノグロブリンIgG
〔ベクターラボラトリーズ社製、販売元フナコシ薬品
（株）〕の100倍希釈液を100μ／穴分注し、室温で15
分間放置する。PBSで洗浄後、ペルオキシダーゼ結合ア
ビジン−ビオチン複合体〔同上〕の50倍希釈液を100μ
／穴分注し、室温で15分間放置する。
さらにPBSでよく洗浄後、ABTS基質液〔2,2′−アジノ
ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
二アンモニウム550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）１
に溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１μ/ml
を加えた溶液〕を用い、発色をOD415nmの吸光度で測定
する。このとき、ペプチドＡに対して強く反応するマウ
スを免疫マウスとしてハイブリドーマ作製のための抗体
産生細胞の供給源として用いる。
ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
二アンモニウム550mgを0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）１
に溶かした溶液に、使用直前に過酸化水素１μ/ml
を加えた溶液〕を用い、発色をOD415nmの吸光度で測定
する。このとき、ペプチドＡに対して強く反応するマウ
スを免疫マウスとしてハイブリドーマ作製のための抗体
産生細胞の供給源として用いる。
酵素免疫測定法を行うにあたって、抗原として、細胞
そのものを用いる場合は、ファルコン（Falcon）3072プ
レート中で、標的細胞を培養し、0.25％グルタールアル
デヒド−PBSを加え、室温に１〜２時間放置し、PBSでよ
く洗浄後、１％BSA−PBS 100〜200μを加え、２時間
放置し、レジン水またはPBSでよく洗浄し、そのプレー
トを用いて、一般の抗原コートプレートを用いるのと同
様の方法にて、抗体価の測定を行った。
そのものを用いる場合は、ファルコン（Falcon）3072プ
レート中で、標的細胞を培養し、0.25％グルタールアル
デヒド−PBSを加え、室温に１〜２時間放置し、PBSでよ
く洗浄後、１％BSA−PBS 100〜200μを加え、２時間
放置し、レジン水またはPBSでよく洗浄し、そのプレー
トを用いて、一般の抗原コートプレートを用いるのと同
様の方法にて、抗体価の測定を行った。
細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処
理の３〜４日前に、抗原Ｂを20〜400μg/匹腹腔内に投
与し、脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。すなわち、脾
臓をMEM（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほ
ぐし、1200rpm、５分間遠心分離にかけ、上清を捨て、
トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で１〜２分
間処理し赤血球を除去し、MEMで３回洗浄して融合用脾
細胞として提供する。
理の３〜４日前に、抗原Ｂを20〜400μg/匹腹腔内に投
与し、脾臓を摘出し、脾細胞を調製する。すなわち、脾
臓をMEM（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほ
ぐし、1200rpm、５分間遠心分離にかけ、上清を捨て、
トリス−塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で１〜２分
間処理し赤血球を除去し、MEMで３回洗浄して融合用脾
細胞として提供する。
（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を
使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（BA
LB/c由来）骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1（P3−U1）〔カ
レント・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・アン
ド・イムノロジィ−１（Current Topics in Microbiolo
gy and Immunology−１）〕〔ヨーロピアン・ジャーナ
ル・オブ・イムノロジィ（European J.Immunology）６,
511−519（1976）〕、SP2/0−Ag14（SP−２）〔ネイチ
ャー（Nature）276,269−270（1978）〕、P3−X63−Ag8
653（653）〔ジャーナル・オブ・イムノロジィ（J.Immu
nology）123,1548−1550（1979）〕、P3−X63−Ag8（X6
3）〔ネイチャー（Nature）256,495−497（1975）〕、N
S−１（正式名称:P3/NS1/1−Ag4−１）〔（Eur.J.Immun
ol.vol 6,p511,1976）（購入先 大日本製薬株式会
社）〕などが用いられる。
使用する。たとえば、８−アザグアニン耐性マウス（BA
LB/c由来）骨髄腫細胞株P3−X63Ag8−U1（P3−U1）〔カ
レント・トピックス・イン・ミクロバイオロジィ・アン
ド・イムノロジィ−１（Current Topics in Microbiolo
gy and Immunology−１）〕〔ヨーロピアン・ジャーナ
ル・オブ・イムノロジィ（European J.Immunology）６,
511−519（1976）〕、SP2/0−Ag14（SP−２）〔ネイチ
ャー（Nature）276,269−270（1978）〕、P3−X63−Ag8
653（653）〔ジャーナル・オブ・イムノロジィ（J.Immu
nology）123,1548−1550（1979）〕、P3−X63−Ag8（X6
3）〔ネイチャー（Nature）256,495−497（1975）〕、N
S−１（正式名称:P3/NS1/1−Ag4−１）〔（Eur.J.Immun
ol.vol 6,p511,1976）（購入先 大日本製薬株式会
社）〕などが用いられる。
これらの細胞株は、８−アザグアニン培地〔RPMI−16
40培地にグルタミン（1.5mM）、２メルカプトエタノー
ル（５×10-5M）、ジェンタマイシン（10μg/ml）およ
び牛胎児血清（FCS）（ハイクローンラボラトリーズ社
製）（10％）を加えた正常培地に、さらに８−アザグア
ニン（15μg/ml）を加えた培地〕で継代するが、細胞融
合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×107
以上の細胞数を確保する。
40培地にグルタミン（1.5mM）、２メルカプトエタノー
ル（５×10-5M）、ジェンタマイシン（10μg/ml）およ
び牛胎児血清（FCS）（ハイクローンラボラトリーズ社
製）（10％）を加えた正常培地に、さらに８−アザグア
ニン（15μg/ml）を加えた培地〕で継代するが、細胞融
合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×107
以上の細胞数を確保する。
なお、本実施例では、上記細胞株の内、NS−１を使用
した。
した。
（３）細胞融合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨
髄腫細胞をMEM培地またはPBSでよく洗浄し、細胞数が、
抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜10:1になるように混合
し、遠心分離（1,200rpm、５分）した後、上清を捨て、
沈殿した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら、37℃
で、ポリエチレングライコール1,000（PEG−1,000）2
g、MEM2mlおよびジメチルスルホキド0.7mlの混液0.2〜1
ml/103抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎にMEM1〜2ml
を数回加えた後、MEMを加えて全量が50mlになるように
する。遠心分離（900rpm、５分）後、上清を捨て、ゆる
やかに細胞をほぐした後、正常培地（RPMI−1640、FCS1
0％）100mlを加え、メスピペットによる吸込み、吹出し
でゆるやかに細胞を懸濁する。
髄腫細胞をMEM培地またはPBSでよく洗浄し、細胞数が、
抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜10:1になるように混合
し、遠心分離（1,200rpm、５分）した後、上清を捨て、
沈殿した細胞群をよくほぐした後、撹拌しながら、37℃
で、ポリエチレングライコール1,000（PEG−1,000）2
g、MEM2mlおよびジメチルスルホキド0.7mlの混液0.2〜1
ml/103抗体産生細胞を加え、１〜２分間毎にMEM1〜2ml
を数回加えた後、MEMを加えて全量が50mlになるように
する。遠心分離（900rpm、５分）後、上清を捨て、ゆる
やかに細胞をほぐした後、正常培地（RPMI−1640、FCS1
0％）100mlを加え、メスピペットによる吸込み、吹出し
でゆるやかに細胞を懸濁する。
この懸濁液を24穴培養用プレートに1ml/穴ずつ分注
し、５％CO2インキュベーター中、37℃で24時間培養す
る。培養プレートに1ml/穴のHAT培地〔正常培地にヒポ
キサンチン（10-4M）、チミジン（1.5×10-5M）および
アミノプテリン（４×10-7M）を加えた培地〕を加え、
さらに24時間培養する。以後２日間、24時間毎に、培養
上清1mlを捨て、新たに同量のHAT培地を加え、CO2イン
キュベーター中、37℃で10〜14日間培養する。
し、５％CO2インキュベーター中、37℃で24時間培養す
る。培養プレートに1ml/穴のHAT培地〔正常培地にヒポ
キサンチン（10-4M）、チミジン（1.5×10-5M）および
アミノプテリン（４×10-7M）を加えた培地〕を加え、
さらに24時間培養する。以後２日間、24時間毎に、培養
上清1mlを捨て、新たに同量のHAT培地を加え、CO2イン
キュベーター中、37℃で10〜14日間培養する。
コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴に
ついて、上清1mlを捨て、HT培地（HAT培地からアミノプ
テリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間24時間毎
にHT培地への変換を行う。
ついて、上清1mlを捨て、HT培地（HAT培地からアミノプ
テリンを除いた培地）を同量加え、以後２日間24時間毎
にHT培地への変換を行う。
HT培地で３〜４日間培養後、培養上清の一部をとり上
記の酵素免疫測定法により、ペプチドＡに対する抗体価
を測定する。限界希釈法によりクローニングを２回くり
返し、安定してペプチドＡに強い抗体価の認められたも
のを抗MCFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株と
して選択する。
記の酵素免疫測定法により、ペプチドＡに対する抗体価
を測定する。限界希釈法によりクローニングを２回くり
返し、安定してペプチドＡに強い抗体価の認められたも
のを抗MCFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株と
して選択する。
（４）モノクローナル抗体の調製 プリスタン処理〔2,6,10,14−テトラメチルペンタデ
カン（Pristane）0.5mlを腹腔内投与し、２週間飼育す
る〕した８〜10週令のC57BL/6雌マウスに、（３）で得
られた抗MCFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細
胞２〜４×106細胞／匹を腹腔内注射する。10〜21日で
ハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を
採取し、遠心分離（3,000rpm、５分）して固形分を除去
後、50％硫酸アンモニウムにて塩析し、PBSにNaCl0.5M
を加えた液で透析し、セファクリルS300（ファルマシア
・ファイン・ケミカル社製）（ベットボリューム750m
l）のカラムに流速15ml/hrで通塔し、IgG、IgM画分を集
め、精製モノクローナル抗体とする。
カン（Pristane）0.5mlを腹腔内投与し、２週間飼育す
る〕した８〜10週令のC57BL/6雌マウスに、（３）で得
られた抗MCFモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細
胞２〜４×106細胞／匹を腹腔内注射する。10〜21日で
ハイブリドーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を
採取し、遠心分離（3,000rpm、５分）して固形分を除去
後、50％硫酸アンモニウムにて塩析し、PBSにNaCl0.5M
を加えた液で透析し、セファクリルS300（ファルマシア
・ファイン・ケミカル社製）（ベットボリューム750m
l）のカラムに流速15ml/hrで通塔し、IgG、IgM画分を集
め、精製モノクローナル抗体とする。
抗体のイソタイプの決定は、オクタロニイ（Ouchterl
ony）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門、生物化
学実験法15、学会出版センター刊、P.74、1981年）によ
って行う。
ony）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門、生物化
学実験法15、学会出版センター刊、P.74、1981年）によ
って行う。
蛋白量の定量は、フォーリン法および280nmの吸光度
〔1.4（OD280）≒イムノグロブリン1mg/ml〕より算出す
る。
〔1.4（OD280）≒イムノグロブリン1mg/ml〕より算出す
る。
以上の如く得られたモノクローナル抗体のペプチドＡ
に対する結合性とイムノグロブリンのサブタイプを第１
表に示す。
に対する結合性とイムノグロブリンのサブタイプを第１
表に示す。
（発明の効果） 本発明に係るモノクローナル抗体は、従来未知の新規
物質であって、マクロファージ走化活性を有するリンホ
カイン、サイトカインに特異的に反応する特性を有して
いるので、本発明は、MCFの分離精製のほか、各種免疫
機構の解明や組織染色法、鑑別診断法等医療や生化学の
技術分野において特に有効に利用されるものである。
物質であって、マクロファージ走化活性を有するリンホ
カイン、サイトカインに特異的に反応する特性を有して
いるので、本発明は、MCFの分離精製のほか、各種免疫
機構の解明や組織染色法、鑑別診断法等医療や生化学の
技術分野において特に有効に利用されるものである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/577 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】下記アミノ酸配列（Ｉ）で表わされるペプ
チドに特異的に結合し、 Ｈ−Ｙ−Leu−Gly−Arg−Ｘ−Asp−Gly−Ser−Glu−OH …（Ｉ） （式中、ＸはGlu又はGlnを表わし、ＹはTrp又はArgを表
わす。） サブクラスがIgG又はIgMであること、を特徴とするマク
ロファージ走化活性（MCF活性）を有するリンフォカイ
ン又はサイトカインに特異的に結合するモノクローナル
抗体。 - 【請求項２】下記アミノ酸配列（Ｉ）で表わされるペプ
チドに特異的に結合し、 Ｈ−Ｙ−Leu−Gly−Arg−Ｘ−Asp−Gly−Ser−Glu−OH …（Ｉ） （式中、ＸはGlu又はGlnを表わし、ＹはTrp又はArgを表
わす。） サブクラスがIgG又はIgMであること、を特徴とするマク
ロファージ走化活性（MCF活性）を有するリンフォカイ
ン又はサイトカインに特異的に結合し、MCF活性を阻害
するモノクローナル抗体。 - 【請求項３】下記アミノ酸配列（Ｉ）で表わされるペプ
チドに必要に応じて担体蛋白質を結合せしめた後、 Ｈ−Ｙ−Leu−Gly−Arg−Ｘ−Asp−Gly−Ser−Glu−OH …（Ｉ） （式中、ＸはGlu又はGlnを表わし、ＹはTrp又はArgを表
わす。） これを抗原としてヒトを除く哺乳動物を免疫し、該哺乳
動物から抗体産生細胞を得、次いでこの細胞を培養し、
培養液中からアミノ酸配列（Ｉ）で表わされるペプチド
に特異的に結合するとともにサブクラスがIgG又はIgMで
あるモノクローナル抗体を取得すること、を特徴とする
マクロファージ走化活性を有するリンフォカイン又はサ
イトカインに特異的に結合するモノクローナル抗体の製
造法。 - 【請求項４】請求項１又は２に記載のモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ。
Priority Applications (4)
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|---|---|---|---|
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| DE69023717T DE69023717T2 (de) | 1989-08-14 | 1990-08-02 | Monoklonaler Antikörper. |
| EP90308507A EP0413477B1 (en) | 1989-08-14 | 1990-08-02 | Monoclonal Antibody |
| US07/561,762 US5126434A (en) | 1989-08-14 | 1990-08-02 | Monoclonal antibody specific for a human macrophage chemotactic factor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1207947A JP2747839B2 (ja) | 1989-08-14 | 1989-08-14 | モノクローナル抗体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0372896A JPH0372896A (ja) | 1991-03-28 |
| JP2747839B2 true JP2747839B2 (ja) | 1998-05-06 |
Family
ID=16548175
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1207947A Expired - Lifetime JP2747839B2 (ja) | 1989-08-14 | 1989-08-14 | モノクローナル抗体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0413477B1 (ja) |
| JP (1) | JP2747839B2 (ja) |
| DE (1) | DE69023717T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5112948A (en) * | 1986-10-10 | 1992-05-12 | Jones C Michael | Methods and compositions for inducing monocyte cytotoxicity |
| US5633149A (en) | 1994-12-07 | 1997-05-27 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Polynucleotide encoding novel chemokine expressed in inflamed adenoid |
| US6692920B1 (en) * | 1994-12-07 | 2004-02-17 | Incyte Corporation | Antibodies to a chemokine expressed in inflamed adenoid |
| KR20030010904A (ko) * | 2001-07-27 | 2003-02-06 | 장섭 | 세탁물 건조장치 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| DE3789413T2 (de) * | 1986-10-03 | 1994-07-28 | Ciba Geigy Ag | Lymphokin-ähnliche Peptide. |
| JP2729836B2 (ja) * | 1988-07-14 | 1998-03-18 | 花王株式会社 | 新規ペプチド |
-
1989
- 1989-08-14 JP JP1207947A patent/JP2747839B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-08-02 EP EP90308507A patent/EP0413477B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-02 US US07/561,762 patent/US5126434A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-02 DE DE69023717T patent/DE69023717T2/de not_active Expired - Fee Related
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| JPH0372896A (ja) | 1991-03-28 |
| DE69023717T2 (de) | 1996-04-18 |
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