JPH0445796A - 抗ｍｃｐモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、メンブレン・コファクター・プロテイン（以
下、ＭＣＰと略記する。）に結合するモノクローナル抗
体およびその製造法ならびに該抗体を用いるＭＣＰの定
量法に関する。

従来の技術 ＭＣＰの主な機能は補体から宿主細胞を保護することと
考えられている。即ち、正常血液細胞、内皮細胞などは
常時補体に晒されているが、補体系を活性化することな
く、補体の攻撃を受けることはない。その理白はヒト細
胞は、一般にＭＣＰを含む３種の補体制御因子を備えて
おり、これらによって補体から標識、破壊されることか
ら守られているた９と考えられている。この際、ＭＣＰ
は他の２種の補体制御因子、即ちＤＡＦ　（デイケイ・
アクセレレイティング・ファクター；　Ｄｃａｙ＾ｃｃ
ｅｌｅｒａｔｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ）、ＣＲＩ（口３ｂ
／Ｃ４ｂレセプター）とともに自己細胞への補体Ｃ３の
沈着および増幅を防いでいることが最近明らかになった
。

一方、補体によって異物と認識されたものは、補体によ
って障害をうける。一般に補体によって破壊される細胞
は補体制御因子を欠いている。この補体による異物排除
反応は、抗体の関与なしにも誘導される。また、この反
応は　主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）などの拘束
性もない。

異物排除反応の実体は、異物に結合した補体成分、特に
Ｃ３の引き起こす２種の細胞障害反応であることが明ら
かになりつつある。即ち、■免疫細胞融解（ｉｍｍｕｎ
ｏｃｙｔｏｌｙｓｉｓ）の−型として細胞膜にイオンチ
ャンネルを形成し、異物細胞を破壊に導く反応、■宿主
の食細胞（ρｈａｇｏｃｙｔｅｓ）　、キラー細胞（ｋ
ｉｌｌｏｒ　ｃｅｌｌｓ）などの補体レセプターを介し
て誘導されるオブソニン作用、抗体産生の増強、キラー
細胞の活性化、走化性の増強などの細胞障害反応群で造
る。従って、このＣ３またはその生理活性断片を用いて
腫瘍細胞などの除去したい細胞を標識し、破壊すること
ができるが、そのためには補体制御因子を除去または不
活性化しなくてはならない。また、それが可能であれば
、どのような細胞も特異抗原の有無にかかわらず、また
ＭＣＨに拘束されず、補体によって標識化され、除去さ
れることになる。

一般に正常ヒト細胞はＭＣＰのほかにＤＡＦ。

ＣＲＩを優位に表現している。しかしながら、ヒト細胞
が癌化すると、一般にＭＣＰのみが優位に表現され、Ｃ
ＲＩはほとんど消失する。従って、ヒト腫瘍細胞からＭ
ＣＰを特異的に除去することができれば、腫瘍細胞はＣ
３によって標識され、補体源である血清またはリンパ球
、好中球などの血液細胞と接触するだけで破壊に導くこ
とが可能である。この際、ＤＡＦｌＣＲＩの破壊すべき
細胞における表現量がその細胞におけるＣ３の標識の程
度に影響する。前工己したように正常ヒト細胞に右いて
は、ＤＡＦ％ＣＲＩを優位に表現しているので、上記の
細胞障害反応は一般に正常ヒト細胞にはおきない。

ヒトＭＣＰに結合する抗血清（ポリクローナル抗体）に
ついては、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロ
ジー（Ｅｕｒ、Ｊ、　１ｍｍｕｎｏｌ、）１８．１２８
９−１２９４　（１９８８）に報告があるが、ヒトＭＣ
Ｐに結合するモノクローナル抗体については、今まで知
られていない。

発明が解決しようとする課題 本発明の目的は、ＭＣＰに結合するモノクローナル抗体
、該抗体の製造法および該抗体を用し）るＭＣＰの定量
法を提供することにある。

課題を解決するたｔの手段 本発明者らは、ＭＣＰに結合するモノクローナル抗体を
作成し、このモノクローナル抗体を用いれば各種ヒト細
胞におけるＭＣＰを定量することができ、かつこのモノ
クローナル抗体でヒト腫瘍細胞を処理すれば、Ｃ３で！
！！識をすることができることを見出し、本発明を完成
させた。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明のモノクローナル抗体は、ＭＣＰと結合する。本
発明のモノクローナル抗体の具体例としては、ハイブリ
ドーマ株Ｍ７５、Ｈ１７７およびＨ１６０が生産するモ
ノクローナル抗体があげられる。

ハイブリドーマ株Ｍ７５、Ｈ１７７、Ｈ１６０は、平成
２年５月１１日付けで工業技術院微生物工業技術研究所
に、それぞれＦＢＲＩｉ　ＢＦ−２８９４，ＦＥＲＭＯ
Ｐ−２８９６，ＦＢＲＭ　ＢＰ−２８９５として寄託さ
れている。

以下に、本発明のモノクローナル抗体の製造法について
説明する。

（１）動物の免疫と抗体産生細胞の調製８〜１０週令マ
ウスに、公知の方法〔ジャーナル・オブ・エクスベリメ
ンタル・メディスン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｃｌ、Ｈ６３，
８３７−８５５（１９８６））で精製したヒ）　ＭＣＰ
を免疫して、その動物の膵臓から抗体産生細胞を調製す
る。免疫の方法は、動物の皮下あるいは静脈内あるいは
腹腔内に適当なアジュバント〔例えば、フロイントの完
全アジュバント（口ｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ
　Ａｊｕｖａｎｔ）または、水酸化アルミニウムゲルと
百日咳菌ワクチンなど〕とともにＭＣＰを投与する。以
後、１〜２遍問おきに抗原を２〜５回投与する。各免疫
後３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清がマウ
スＭＣＰと反応することを以下に示すプロティンＡロゼ
ツトアッセイ法〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー（Ｆｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）±
、　５００−５０７（１９７４）　Ｅなどで調べる。

プロティンＡロゼツトアッセイ法 ７２大のテラサキブレー）　（Ｆａｌｃｏｎ社製）にヒ
ト赤芽球性細胞株に５６２　Ｃジャパニーズ・キャンサ
ー・リサーチ・リソーシズ・バンク　（ＪＣＲ３）製〕
をコートし、ＰＢＳ　　　（リン酸二ナトリウム１．８
３ｇ、　　リン酸−カリウム０．２１ｇ、食塩０．２１
ｇ、蒸留水Ｉｉ）で各濃度に希釈した試料（マウス血清
、ハイブリドーマ培養上清、精製モノクローナル抗体）
を加え、ＣＯ２インキユベーター内に３７℃で３０分間
放置する。ＰＢＳで洗浄後、プロティンＡ（ファルマシ
ア社製）をコートしたヒツジ赤血球を加えてロゼツトの
形成反応を顕微鏡で観察する。

細胞融合するにあたって、融合処理の３〜４日前に、０
．５〜２μｇのＭＣＰを免疫化マウスの腹腔内に投与し
、膵臓を摘出し、脾細胞を調製する。即ち、膵臓をＭＥ
Ｍ　（日永製薬社製）中で細断し、ビンセットでほぐし
、１．２０Ｏｒｐｍ。

５分間遠心分離し、上清を捨て、トリス−塩化アンモニ
ウム緩衝液（ｐＨ７，６５）で１〜２分間処理して赤血
球を除去し、ＭＥＭで３回洗浄して融合用肺細胞として
提供する。

（２）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞を使
用する。例えば、８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬ
Ｂ／ｃ由来）骨髄挿細抱株Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕｌ　
　（Ｐ３−０１）　　［カレント・トピックス・イン・
ミクロバイオロジー１アンド０イムノロジー（Ｃｕｒｒ
ｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎＭｉｃｒｏｂ＋ｏｌｏｇｙ
　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）８１１１−７＜１９
７８：ｌ、Ｐ３／ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１　　（ＮＳ−
１）〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー
（［Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ、１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　
　６，５１１−５１９（１９７６）Ｅ、ＳＰ２１０−Ａ
ｇ１４　　（ＳＰ−２）　　Ｃネイチャー　（Ｎａｔｕ
ｒｅ）　２７６．２６９−２７０（１９７８）：］　、
Ｐ　３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）　　［ジャー
ナル・才ブ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ）　１２３．１５４８−１５５０（１９７９）　Ｅ、
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８　　（Ｘ６３）　　［ネイチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）　２５６．４９５−４９７（１９７５
）Ｅなどが用いられる。これらの細胞株は、８−アザグ
アニン培地［ＲＰＭ　ｌ−１６４０培地にグルタミン（
１，５ｍＭ）。

２メルカプトエタノール（５Ｘ　ｌ　Ｏ−’Ｍ）　、　
ジェンタマイシン（１０μｇ／−）および牛胎児血清（
ＦＣ３，ＣＬＳ社製）（１０％）を加えた正常培地に、
さらに８−アザグアニン（１５μｇ／−）を加えた培地
〕で継代するが、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継
代し、融合当日２Ｘ１０’以上の細胞数を確保する。

（３）細！ｌ！１ＩＩｋ合 （１）で免疫した抗体産生細胞と（２）で得られた骨髄
腫細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数
が抗体産生細胞：骨髄腫細胞＝５〜１０：１になるよう
に混合する。遠心分離（１，２０Ｏｒｐｍ、　５分）し
た後、上清を播で、沈澱した細胞群をよくほぐした後、
攪拌しながら、３７℃でポリエチレングリコール−１，
０００（Ｐ　Ｅ　Ｇ−１，００（１）１〜４ｇ、ＭＥＭ
１〜４ＩＩ！およびジメチルスルホキシド０．５〜１．
０−の混液０．１〜１．０　ｍｇ／１０”抗体産生細胞
を加える。その後、１０分毎にさらにＭＥＭ３−を数回
加えた後、ＭＥＭ培地を加えて５０−になるようにする
。遠心分離（９，００叶ρｍ、５分）後上清を揄で、ゆ
るやかに細胞をほぐした後、正常培地（ＲＰＭ　Ｉ　−
１６４０、ＦＣ３ＩＯ％＞１００−を加え、メスピペッ
トによる吸い込み、吹き出しでゆるやかに細胞を懸濁す
る。この懸濁液を９６穴培養用プレートに１００μβ／
穴ずつ分注し、５％ＣＯ，インキュベーター中、３７℃
で３〜５日間培養する。

培養プレートに１００μｊ２／穴のＨＡＴ培地Ｃ正常培
地にヒポキサンチン（１０−’Ｍ）、チミジン（１，５
Ｘ　１０−’Ｍ）およびアミノプテリン（４Ｘｌ０−’
Ｍ　＞を加えた培地］を加え、さらに３日間培養する。

以後３日間毎に培養上清を半容量捨て、新たに同量のＨ
ＡＴ培地を加え、ＣＯ，インキュベーター中、３７℃で
約２週間培養する。

コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清半容量を揄で、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からア
ミノプテリンを除いた培地）を同量加え、４日間培養す
る。培養上清の一部を取り、プロティンＡロゼツトアッ
セイ法によりＭＣＰに対する抗体価を測定する。ＭＣＰ
に反応する穴について限定希釈法によりクローニングを
４回繰り返し、安定してＭＣＰに抗体価の認められたも
のを抗ＭＣＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株
として選択する。

（４）モノクローナル抗体の調製 プリスタン処理Ｃ２，６，１０，１４−テトラメチルペ
ンタデカン　（Ｐｒｉｓｔａｎｅ）　０．５−を腹腔内
投与し、２週間飼育する。〕した８〜１０．１ｌｌｉｌ
令のＢＡＬＢ／ｃ雌マウスに　（３）で得られた抗ＭＣ
Ｐモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞２〜４×
１０６個／匹腹腔内注射する。２〜ＤＩ間でハイブリド
ーマは腹水癌化する。このマウスから腹水を採取し、遠
心分離（３，０００ｒｐω、５分〉して、固形分を除去
後、５０％硫酸アンモニウムにて塩析し、ＰＢＳで１〜
２遍間透析する。この透析面分をプロティンＡセファロ
ースカラムに通塔し、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクロ
ーナル抗体とする。

抗体のイソタイプの決定は、オクタロニイ（Ｏｕｃｔｅ
ｒｌｏｎｙ　）法（二重免疫拡散法）（免疫学実験入門
、生物化学実験法１５、学会出版センター刊、７４頁、
１９８１年）によって行う。

蛋白質の定量は、フォーリン法および２８０ｎｍでの吸
光度ＣＬ、４　（ＯＤ２ｅｏ）−イムノグロブリン１１
１ｇ／ｍＲ〕より算出する。

得られたモノクローナル抗体のＭＣＰ依存ファクターＩ
・コファクター活性に対する抑制活性は、公知の方法［
ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メデイｘン（
Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｉ）　１６３゜８３７−８５５　（１
９８６）　］に従って、液相系測定法によって定量する
。即ち、蛍光ラベルしたＣ３ｂとファクターＩを、あら
かじめ抗体処理した一定量のＭＣＰと混合し、一定時間
インキコベートした後、Ｃ３ｂのＣ３ｂ１への変換をＳ
Ｏ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で解析し、蛍光
光度計を用いて定量する。

（５）抗原特異性 得られたモノクローナル抗体の特異性は、■細胞表面を
ヨードラベルしたＨＳＢ−２、に５６２等のヒトリンパ
球由来の細胞株を用いる免疫沈降反応〔ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー（Ｊｌｍｍｕｎｏｌ、）　１３８．３
８５０−３８５５（１９８７＞　］■ＭＣＰがコファク
ターとして働くファクターＩによるＣ３ｂ分解反応に対
する阻害試験〔バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ　　Ｊ　）２６４．５８１−５８８＜１９８９）
Ｅ＠＊ｓ免疫測定法（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ法）Ｃ”＋−ｔル
・才ブ・イムノロジー（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　）１
４２．２７４３−２７５０（１９８９）　］により調べ
た。

本発明の抗ＭＣＰモノクローナル抗体またはその活性断
片は放射性物質で標識し、これを指標にして細胞表面の
ＭＣＰを定量することができる。即ち、放射性物質で標
識した抗ＭＣＰモノクローナル抗体またはその生理活性
断片を測定する細胞に加え、ＣＯ，インキ二ベーター内
で３７℃、１時間反応させる。非結合の標識化合物を遠
心分離して除き、細胞表面に結合した抗ＭＣＰモノクロ
ーナル抗体またはその活性断片の放射能を測定し、細胞
１個当たりに存在するＭＣＰを定量する。

以下に本発明の実施例を示す。

実施例１．抗ＭＣＰモノクローナル抗体の製造（１）抗
体産生細胞の調製 ヒトＭＣＰ０．４μｇ／匹を８〜１０週令のマウスの皮
下に水酸化アルミニウムゲル２ｍｇ／匹、百日咳死菌ワ
クチンｌＸｌ０”個／匹とともに腹腔内投与した。以後
１０日おきに０．４μｇ／匹の同一抗原を３回投与した
。これら免疫処理したマウスのうち、その抗血清がマウ
スＭＣＰと強く反応したマウスを免疫マウスとして選択
し、そのマウスより脾細胞を調製し、細胞融合に供した
。

（２）マウス骨髄腫細胞のａｍ ８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株ＭＳ−１を正
常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞
を得、細胞融合に親株として供した。

（３）ハイブリドーマの作製 （１）と（２）で得られた脾細胞と骨髄腫細胞とを１０
：１の割合で用い、前述した方法で融合させ、ＨＡＴ培
地で３７℃、１４日間、５％Ｃ０３インキユベーター中
で培養し、融合細胞を選択し、ＨＴ培地に変えてさらに
培養し、マウスＭＣＰに対する抗体価を測定して活性な
穴を選び、さらに正常培地に変え、４回クローニングを
繰り返して、プロティンＡロゼツトアッセイ法によりマ
ウスＭＣＰに反応するモノクローナル抗体を産生ずるハ
イブリドーマ株Ｍ７５、Ｍ１７７およびＭ２Ｂ５を選択
した。

（４）モノクローナル抗体の精製 プリスタン処理した８〜１０ｊｉ令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マ
ウスに（３）で得られたハイブリドーマ株Ｍ７５、Ｍ１
７７およびＭ２Ｂ５をそれぞれ３Ｘ１０’個／匹腹腔内
に注射した。２〜３ｊ１間後に、ハイブリドーマは腹水
癌化した。−腹水のたまったマウスから腹水を採取し、
遠心分離（３，００Ｏｒｐｍ、　５分）して固形分を除
去した。５０％硫酸アンモニウムにて塩析し、ＰＢＳで
透析後、プロティンＡセファロースカラム（ファルマシ
ア社製）　（ベットボリューム　２０献）のカラムに通
塔し、ＩｇＧ面分を集め、ハイブリドーマ株Ｍ７５、Ｍ
１７７およびＭ２Ｂ５より、それぞれ精製モノクローナ
ル抗体Ｍ７５、Ｍ１７７およびＭ２Ｂ５を得た。

得られたモノクローナル抗体のイソタイプをオクタロニ
イ法で調べたところ、すべての抗体がＩｇＧクラスに属
するモノクローナル抗体であり、Ｍ２ＳおよびＭ１７７
はＩ　ｇＧｔ　、Ｍ２Ｂ５はＩｇＧａｍにそれぞれ属す
ると同定された。

（５）抗原特異性 （４）で得られたモノクローナル抗体Ｍ７５、Ｍ１７７
およびＭ２Ｂ５の抗原特異性を免疫沈降反応、Ｃ３ｂ分
解反応およびＥＬＩＳＡ法で調べた。免疫沈降反応の結
果を第１−１図および第１−２図に示す。

第１−１図および第１−２１！ｌに示したようにＭ２Ｓ
、Ｍ２Ｂ５およびＭ１７７ともヨードラベルしたＴ　Ｉ
Ｊンバ球細胞株Ｈ５Ｂ２Ｊよび赤芽球性細胞株に５６２
表面上のＭＣＰと特異的に免疫沈降を生じたが、抗ＣＲ
Ｉモノクローナル抗体は、ＭＣＰと免疫沈降を生じなか
った。

Ｃ３ｂ分解反応に対する阻害活性およびＥＬＩＳ八法を
へいて算出したＭＣＰに対する結合定数を第１表にそれ
ぞれ示した。

なお、Ｃ３ｂ分解反応に対する各モノクローナル抗体の
阻害活性の値は、次式に従って算出した。

第 表 実施例２．細胞表面のＭＣＰの定量 ペプシン（シグマ社１１）０．６■を０．１５Ｍ塩化す
）＋１ウムを含む酢酸緩衝液（ｐＨ４，５）２５ｄに溶
解し、これにモノクローナル抗体Ｍ１７７の５０■を加
え、ＣＯ，インキュベーター内で３７℃で１２時間反応
させた。反応液をプロティンＡセファロースカラム（フ
ァルマシア社製）２０−に通塔し、通過液をＦ（ａｂ’
）ｚとして用いた。得られたＦ　（ａｂ“）２をジャー
ナル・オブ・イムノロジー（Ｊ。

１ｍｍｕｎｏ１．＞　１３９．１２６０−１２６７（１
９８７）にＭ己載の方法を用いてヨードラベルし、”’
　Ｉ　　Ｍ１７７　Ｆ　（ａｂ’）ｓを得た。

赤芽球様細胞に５６２細胞（ＩＸＩＯ’個）に２ｓＩ　
−Ｍ１７７　Ｆ（ａｂ’Ｌ２０μｌを加え、３７℃で１
時間、ＣＯ，インキュベーター内で反応させた１反応液
を７タル酸ジブチルエステル−フタル酸ジノニルエステ
ル（８：２）の混合液２２５４を入れたマイクロテスト
チューブに重層し、８，０００Ｘｇで２分間遠心分離し
て非結合性の標識化合物を除去した後、細胞に結合した
ｌ″ｓ工の放射能をγカウンターを用いて測定した。ま
た、１２’　Ｉ　−Ｍ１７７Ｆ（ａｂ’）ｉの代わりに
ヨードラベルしないＦ（ａｂ’）。

２０戚と”　Ｉ　−１１７７Ｆ　（ａｂ’）２の２μβ
とを用いて上記と同様に行って放射能を測定し、これを
バックグランドの値とし、＋２’ｌ　　Ｍ１７７　Ｆ　
（ａｂ’　＞ｚ存在下の放射能から差し引いた。第２図
に細胞の数と１２Ｊ　　Ｍ１７７　Ｆ　（ａｂ’　）２
の放射能との関係を示ス。

細胞表面に結合した”Ｊ　　Ｍ１７７　Ｆ　（ａｂ’Ｌ
の量、すなわち、細胞表面のＭＣＰの量は１２Ｊ　−Ｍ
１７７Ｆ（ａｂ’）２１分子当たりの放射能（５，４Ｘ
　１０−’ｃｐｍ　）で割ることにより算出される。

次に、Ｋ５６２細胞の代わりに各種ヒト正常細胞および
細胞株を用い、上記と同様に行い各細胞表面のＭＣＰ量
を測定した。ヒト正常細胞を用いた結果を第２表に、細
胞株を用いた結果を第３表に示す。

第 細胞 ＭＣＰ量 （モ＆／　細胞） 第 細胞株 ＭＣＰ量 （モ＆／　細胞） 赤芽球性細胞株 Ｇ１ １４、８００ ＨＰＩ Ｕ３１２ Ｌ６０ Ｔリンパ球様細胞株 ＳＢ２ ＡＬＬＩ ＴＩ ＨＬ口しＩ ＣＣＲＦ−Ｓ日 １７、１００ ２４、６００ １２、３００ ３２．６００ １０．２００ １２．１００ １７．１００ １８、７００ ａｍｏｓ ５、６２０ 実施例３．抗ＭＣＰモノクローナル抗体による細胞上の
ＭＣＰ活性の阻害作用 抗ＭＣＰモノクローナル抗体Ｍ１７７が細胞上のＭＣＰ
活性を阻害することを細胞へのＧ３沈着を指標にして調
べた。細胞へのＧ３沈着は、ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（Ｊ、Ｉｆｆ１ｍｕｎｏ＋、）　１４２　。

４１００−４１０４（１９８９）　！２載の方法を用い
た。即ち、２５％ヒト血清を含むゼラチンベロナール緩
衝液２０〇−にヒトＴリンパ球様細胞ＣＣＲＦ−ＣＥｌ
ｌ１５　Ｘ　１０　’個を懸濁させ、モノクローナル抗
体Ｍ１７７を５■加え、ＣＯ２インキュベーター内で３
７℃、９０分間反応させた。次に、細胞をＰＢＳで洗浄
後、抗ヒトＣ３ｃウサギ血／ＩＩ（Ｃａｐｐｅ１社製）
を２μｇ加え、３７℃で１時間反応させた。さらにＦＩ
ＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　１ｓｏｔｈ＋ｏｃｙａ
ｎａｔｅ）で標識したヤギの抗ウサギイムノグロブリン
ｌ　ｇ　Ｇ　（Ｃａｐｐｅ１社製）を加え、３７℃、１
時間反応させ、細胞への０３の沈着をフローサイメトリ
ー法〔ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・イムノロジー
（Ｅｕｒ、　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏ１．）１８、１２８９
−１２９４　（１９８８）　〕を用いて調べ、Ｍ１７７
非存在下で同様に行って得られた結果と比較した。

結果を第３図に示す。モノクローナル抗体Ｍ１７７が存
在することによりピークが右にシフトしており、このこ
とは細胞に沈着したＣ３が細胞表面に表現されているこ
とを示唆している。またＣＣＲＦ−ＣＥＭの代わりにヒ
）　Ｔ　ＩＪンバ球様細胞ＴＡＬＬを用い、Ｍ１７７０
代わりにＭ２ＳおよびＭ７Ｃ３をそれぞれ用いて同様に
行い、Ｍ７５によびＭ７Ｃ３によるＴＡＬＬ細胞への０
３の沈着の誘導を調べた。その結果を第４図に示す。Ｍ
２ＳおよびＭ７Ｃ３もＭ１７７と同様に０３の細胞への
沈着を誘導した。

発明の効果 本発明によりＭＣＰの定量および抗腫瘍剤として有用な
抗ＭＣＰモノクローナル抗体が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１−１図はヨードラベルしたＴリンパ球細胞株を用い
た免疫沈降反応の結果を示す。レーン１はＭ２Ｓ、レー
ン２はＭ７Ｃ３、レーン３はＭ　１７７、レーン４はポ
リクローナル抗ＭＣＰ抗体、レーン５は抗ＣＲＩモノク
ローナル抗体、レーン６はマウスイムノグロブリンをそ
れぞれ示す。矢印がＭＣＰを示す。 第１−２ＴｌｌＪは、ヨードラベルした赤芽球細胞株に
５６２を用いた免疫沈降反応の結果を示す。レーン１は
、Ｍ１７７、レーン２はＭ７Ｃ３、レーン３はＭ２Ｓ、
レーン４はマウスイムノグロブリンをそれぞれ示す。矢
印がＭＣＰを示す。 第２図はに５６２細胞の量と１２’Ｉ−Ｍ　１７７Ｆ（
ａｂ’）２の放射能との関係を示す。 第３図はＣＣＲＦ−ＣＥＭ細胞への０３沈着を示す。実
線はＭ１７７非存在下での０３沈着を、点線はＭ１７７
存在下での０３沈着をそれぞれ示す。 第４図はＴＡＬＬ細胞への０３沈着を示す。 実線は抗ＭＣＰモノクローナル抗体非存在下、点線はＭ
１７７存在下、−点鎖線はＭ７５存在下、二点鎖線はＭ
１６０存在下でのＣ３沈着をそれぞれ示す。 図面の浄書（内容に変更なし） 分子蓋（ｘｌσ３） Ｖ面の浄書（内容に変更なし） 第１−２図 第２図 に５６２ 蓋（ｘｌＯ−５） 第３図 第４ 図 覚九恢友 手続補正書（方式） ％式％ 事件の表示 平成２年特許願第１５１１０６号 発明の名称 抗ＭＣＰモノクローナル抗体 補正をする者 事件との関係　　特許出願人 郵便番号　　１００ 住　所　東京都千代田区大手町−丁目６番１号名　称　
（１０２）協和醗酵工業株式会社平成２年８月１３日（
発送臼、同２年８月２８日）補正の対象 図面 補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）メンブレン・コファクター・プロテインと結合す
   るモノクローナル抗体。 （２）該モノクローナル抗体がＩｇＧ＿１イソタイプに
   属するモノクローナル抗体Ｍ７５であることを特徴とす
   る請求項１記載のモノクローナル抗体。 （３）該モノクローナル抗体がＩｇＧ＿１イソタイプに
   属するモノクローナル抗体Ｍ１７７であることを特徴と
   する請求項１記載のモノクローナル抗体。 （４）該モノクローナル抗体がＩｇＧ＿２＿ａイソタイ
   プに属するモノクローナル抗体Ｍ１６０であることを特
   徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体。 （５）メンブレン・コファクター・プロテインと結合す
   るモノクローナル抗体を生産するハ イブリドーマ。 （６）ハイブリドーマ株Ｍ７５（ＦＢＲＭＢＰ−２８９
   ４）（７）ハイブリドーマ株Ｍ１７７（ＦＥＲＭＢＰ−
   ２８９６）（８）ハイブリドーマ株Ｍ１６０（ＦＥＲＭ
   ＢＰ−２８９５）（９）マウスをメンブレン・コファク
   ター・プロテインで免疫して得られる脾細胞とマウ スの骨髄腫細胞とを融合して得られるハイ ブリドーマであって、メンブレン・コファ クター・プロテインに結合するモノクロー ナル抗体を生産するハイブリドーマを培地 中に培養するか、またはマウスの腹腔内に 投与して腹水癌化し、培養物または腹水中 にメンブレン・コファクター・プロテイン に結合するモノクローナル抗体を生成蓄積 させ、該培養物または腹水からこれを採取 することを特徴とするメンブレン・コファ クター・プロテインに結合するモノクロー ナル抗体の製造法。 （１０）メンブレン・コファクター・プロテインと結合
   するモノクローナル抗体またはその 活性断片を放射性物質で標識し、これをメ ングレン・コファクター・プロテインに結 合させ、その放射能を測定することを特徴 とするメンブレン・コファクター・プロテ インの定量法。