JPH067193A

JPH067193A - モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH067193A
Application number: JP33956091A
Authority: JP
Inventors: Yukiya Koike; 行也小池; Koji Suzuki; 宏治鈴木; Yataro Ichikawa; 弥太郎市川
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1991-11-29
Filing date: 1991-11-29
Publication date: 1994-01-18

Abstract

(57)【要約】【目的】リポプロテイン結合性凝固系インヒビター
（ＬＡＣＩ）の特定部位を認識するモノクローナル抗体
の提供。【構成】下記アミノ酸配列で表わされるポリペプチドを認識するモノクローナル抗
体、それを用いたＬＡＣＩの精製法及びＬＡＣＩ含量の
測定法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血液凝固インヒビター
の特定部位に結合するモノクローナル抗体に関するもの
である。さらに詳しくは、組織因子インヒビター（Tiss
ue Factor Inhibitor : ＴＦＩ）、リポプロテイン結合
性凝固系インヒビター（LipoproteinAssociated Coagul
ation Inhibitor：ＬＡＣＩ）あるいは組織因子経路イ
ンヒビター（Tissue Factor Pathway Inhibitor ：ＴＦ
ＰＩ）の特定部位に結合するモノクローナル抗体に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】外因系血液凝固は、血液が組織トロンボ
プラスチン（以下、組織因子あるいはＴＦと呼ぶ）に接
触することによって開始される。組織因子（ＴＦ）は、
膜タンパク質であって、特に脳及び肺に多量に存在す
る。ＴＦと接触するとVII 因子またはその活性型VII ａ
因子がＴＦと複合体を形成し、ついで蛋白分解的にＸ因
子がＸａ因子に活性化される。

【０００３】ＴＦによって開始する外因系血液凝固の調
節に関するこれまでの研究で、ＴＦを血清とともにイン
キュベーションするとそのｉｎｖｉｔｒｏでの活性が
抑制されることが明らかにされている。この因子の少く
とも１つは組織因子インヒビター（ＴＦＩ）あるいはリ
ポプロテイン結合性凝固系インヒビター（ＬＡＣＩ）と
定義されるものである。

【０００４】Broze らによれば、Hep Ｇ２細胞（ヒト
ヘパトーマセルライン）が、血清（血漿）中に存在す
るＴＦＩと同様の特性を有する抑制成分を分泌すること
が示されている（Broze et al; Blood，69，150-155 (1
987)）。またＬＡＣＩについてはNature，vol,338,518-
520(1989) にアミノ酸配列及び２次構造が記載されてい
る。

【０００５】このリポプロテイン結合性凝固系インヒビ
ター（以下ＬＡＣＩと称す）の生体内における機能、及
び生理的な活性については、最近の研究から、血栓症や
動脈硬化との関連で重要性が示唆されている。

【０００６】従って、ＬＡＣＩの作用機構を明らかに
し、また蛋白の構造・活性の相関を解明することができ
れば、基礎医学、臨床医学の領域において非常に重要な
意味を持つと考えられる。

【０００７】また、ヒト血液中のＬＡＣＩの含量や分
布、存在形態を解析することができれば、血栓性の疾患
や動脈硬化の進展を診断しうる可能性が考えられる。

【０００８】一方モノクローナル抗体は単一の抗原決定
基に対して特異的であり、かつ同一の特異性を有する抗
体を安定的に産生できるという利点から抗原蛋白質の機
能及び構造の解析あるいは免疫測定（ＥＩＡ，ＲＩＡ）
に近年、一般的に広く利用されるようになってきた。特
に生理活性を有する蛋白質の機能解析、分子解析には当
該蛋白の機能に関与する部位、または特殊な構造部位を
認識する抗体を見出すことが有力な手段となり得る。

【０００９】そこで本発明者らは、ＬＡＣＩの３個のク
ーニッツ（Kunitz）ドメインと呼ばれる構造部位に着目
し、各クーニッツドメインに対応する部分合成ペプチド
を抗原として研究を進めた結果、本発明のモノクローナ
ル抗体を見出した。

【００１０】

【発明の構成】すなわち本発明は、ＬＡＣＩのＮ端から
１番目のクーニッツ部位（以下、Ｋ１部位と称す）のア
ミノ酸配列：ＡｌａＰｈｅＬｙｓＡｌａＡｓｐＡｓｐＧｌｙＰｒｏＣｙｓＬｙｓＡｌａＩｌｅＭｅｔＬｙｓＡｒｇＰｈｅＰｈｅＰｈｅＡｓｎＩｌｅＰｈｅ …［Ｉ］のポリペプチドを認識し、結合するモノクローナル抗体
であり、血液凝固系のインヒビターであるＬＡＣＩを、
高感度で検出しうるモノクローナル抗体である。

【００１１】ここで、本明細書において、アミノ酸配列
はＩＵＰＡＣ―ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用さ
れた方法により略記するものとし、たとえば下記の略号
を用いる。

【００１２】ＡｌａＬ―アラニンＡｒｇＬ―アルギニンＡｓｎＬ―アスパラギンＡｓｐＬ―アスパラギン酸ＣｙｓＬ―システインＧｌｎＬ―グルタミンＧｌｕＬ―グルタミン酸ＧｌｙグリシンＨｉｓＬ―ヒスチジンＩｌｅＬ―イソロイシンＬｅｕＬ―ロイシンＬｙｓＬ―リジンＭｅｔＬ―メチオニンＰｈｅＬ―フェニルアラニンＰｒｏＬ―プロリンＳｅｒＬ―セリンＴｈｒＬ―スレオニンＴｒｐＬ―トリプトファンＴｙｒＬ―チロシンＶａｌＬ―バリン

【００１３】本発明のモノクローナル抗体を用いて精製
されたＬＡＣＩは後述の実施例で示される如く、Ｘａ因
子阻害活性とＴＦ阻害活性を有する。

【００１４】しかして本発明はまた、ヒトＬＡＣＩに対
する上記モノクローナル抗体を不溶性担体と結合させた
吸着体に、ヒトＬＡＣＩ含有混合物を接触せしめて、該
吸着体にヒトＬＡＣＩを結合せしめることを特徴とする
ヒトＬＡＣＩ含有混合物からの高い抗凝固活性を有する
ヒトＬＡＣＩの分離方法及び精製方法である。

【００１５】さらに本発明のモノクローナル抗体を用い
れば、後述の実施例で示される如く、ヒト血液（血漿）
中のＬＡＣＩを高感度で検出可能である。

【００１６】しかして本発明はまた、サンドイッチ法に
よる免疫学的測定試薬において、不溶性担体に結合した
抗体か標識抗体かのいずれか一方が、上記モノクローナ
ル抗体であることを特徴とする、ＬＡＣＩに対するモノ
クローナル抗体を用いたＬＡＣＩの免疫学的測定試薬で
ある。

【００１７】本発明のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞はケーラーとミルシュタインの方法
［Kohler & Milstein; Nature: 256，495-497 (1975)］
によって得られる。

【００１８】すなわち、前記アミノ酸配列［Ｉ］で表わ
される、ＬＡＣＩの部分合成ペプチドでマウスを免疫し
た後、このマウスの脾臓細胞をマウスミエローマ細胞と
融合させ、得られたハイブリドーマ細胞はマイクロタイ
タープレートに固定された前記ペプチドと反応する抗体
に対し、系統的に検査し、選択される。

【００１９】本発明のモノクローナル抗体はかかる新規
なハイブリドーマ細胞が産生する産生物から得られ、ヒ
トＬＡＣＩのＫ１部位に対し、特異的に作用する。

【００２０】本発明のモノクローナル抗体は、ヒトＬＡ
ＣＩのＫ１部位に対し高度に特異的に結合する性質を有
するため、ヒトＬＡＣＩを抗凝固活性を維持したまま分
離・精製する場合、非常に有利である。すなわち、不溶
性担体に本発明におけるモノクローナル抗体の１種類を
固定化し、血液または、他のヒトＬＡＣＩ含有混合物、
あるいはそれらの粗抽出物、粗精製物及び溶液からヒト
ＬＡＣＩを吸着、分離し、適当な緩衝液（例えば、２０
ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ，０．５ＭＮａＣｌ，ｐＨ
７．４）で洗浄後、溶液をカオトロピックイオンを含む
溶液等（例えば３ＭＮａＳＣＮ，ｐＨ７．０）に置き
換えてヒトＬＡＣＩを溶出することができる。

【００２１】さて、一般に抗原の２つの異なる位置に結
合する抗体を使って抗原の有無またはその量を測定する
方法は、サンドイッチ法と呼ばれている。

【００２２】かかる本発明のヒトＬＡＣＩの免疫学的測
定試薬は、使用する２種類のモノクローナル抗体として
ＬＡＣＩのそれぞれ異なる抗原決定部位を認識する抗
体、特にＬＡＣＩの３個のクーニッツ部位のいずれかを
認識する抗体を使用する。その際いずれか一方に前記本
発明の抗体を用いる。本発明によれば、試薬の品質差が
なく、恒常的に精度良く溶液状態の（例えば血液中
の）、ヒトＬＡＣＩを測定することが可能となる。また
直接にＬＡＣＩをつかまえて測定するので他の夾雑物の
影響を受けず正確に且つ短時間に測定することができ
る。

【００２３】従って、本発明によれば、従来報告のなか
った、ヒトＬＡＣＩを正確かつ迅速に測定し得る試薬及
びキットが提供される。

【００２４】次に本発明におけるモノクローナル抗体を
製造する具体的方法について詳細に説明する。

【００２５】Ａ．抗原本発明において用いられる抗原としては、下記式［Ｉ］ＡｌａＰｈｅＬｙｓＡｌａＡｓｐＡｓｐＧｌｙＰｒｏＣｙｓＬｙｓＡｌａＩｌｅＭｅｔＬｙｓＡｒｇＰｈｅＰｈｅＰｈｅＡｓｎＩｌｅＰｈｅ …［Ｉ］で表わされるアミノ酸配列を有する合成ペプチド、特
に、該ペプチドをＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin
）などのキャリアー蛋白に結合したものが好ましい。

【００２６】Ｂ．上記抗原によるマウスの免疫雌Balb／ｃマウスを用いることができるが、他の系（st
rain）のマウスを使用してもよい。その際、免疫計画、
及び抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けた、リンパ
球が形成されるように選ばれるべきである。例えばマウ
スに５０μｇの抗原を２週間間隔で腹腔に３回免疫後、
さらに３０μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日後に
融合のために脾臓細胞をとり出す。

【００２７】Ｃ．細胞融合上記の如く免疫したマウスの脾臓を無菌的に取り出し、
そこから単細胞懸濁液を調製する。それらの脾臓細胞を
適当なラインからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進
剤の使用により、細胞融合させる。脾臓細胞対骨髄腫細
胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約１０⁸個の脾臓細胞について０．５〜１．５mlの
融合媒体の使用が適当である。

【００２８】細胞融合に用いるマウス骨髄腫細胞は良く
知られているが、本発明ではＰ３―Ｘ６３―Ａｇ８―Ｕ
１細胞（Ｐ３―Ｕ１）［Yelton, D.F et al, Current.
Topics in Microbiology and Immunology, 81,１(1978)
参照］が好ましい。

【００２９】好ましい融合促進剤としては、例えば、平
均分子量１０００〜４０００ポリエチレングリコールを
有利に使用できるが、この分野で知られている他の融合
促進剤を使用することもできる。

【００３０】Ｄ．融合した細胞の選択別の容器内（例えばマイクロタイタープレート）で未融
合の脾臓細胞、未融合のマウス骨髄腫細胞および融合し
たハイブリドーマ細胞の混合物を未融合のマウス骨髄腫
細胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死
滅させるのに十分な時間（約１週間）培養する。培地
は、薬物抵抗性（例えば８―アザグアニン抵抗性）で未
融合のマウス骨髄腫細胞を支持しないもの（例えばＨＡ
Ｔ培地）が使用される。この選択培地中では未融合の骨
髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾臓細胞は非腫瘍性
細胞なので、ある一定期間後（１週間後）死滅する。こ
れらに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の腫瘍性
と、親脾細胞の性質を合せ持つため、選択培地中で生存
できる。

【００３１】Ｅ．各容器中の抵抗の確認かくしてハイブリドーマ細胞が検出された後、その培養
上清を採取し、前期式［Ｉ］の合成ペプチドに対する抗
体について酵素免疫定量法（Enzyme Linked Immuno-Sor
bent Assay）によりスクリーニングする。

【００３２】Ｆ．目的の抗体を産生するハイブリドーマ
細胞のクローン化目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を適当な方法
（例えば限界希釈法）でクローン化すると、抗体は２つ
の異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ば、ハイブリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養す
ることにより、その培養上清からそのハイブリドーマ細
胞の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。
第２の方法によれば、ハイブリドーマ細胞は同質遺伝
子、または半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射する
ことができる。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水
中より、そのハイブリドーマ細胞の産生するモノクロー
ナル抗体を得ることができる。

【００３３】Ｇ．ヒトＬＡＣＩ含有混合物からのヒトＬ
ＡＣＩの分離・精製本発明のヒトＬＡＣＩに対するモノクローナル抗体を不
溶性担体に固定化または結合させて吸着体を得る。その
際使用される不溶性担体としては、モノクローナル抗体
を用いた測定試薬または測定用キットの基材として一般
的に使用されるものであればよい。例えば材質としてセ
ファローズ、ポリアクリルアミド、セルロース、デキス
トラン、またはマレイン酸ポリマーあるいはこれらの混
合物が好ましく用いられる。これら不溶性担体の形態と
しては、粉末状、粒状、ペレット状、ビーズ状、繊維状
など種々の形態であることができる。また一般に血漿、
またはその分画成分の測定や分離に用いられる多数の凹
状のくぼみを有するプレート（ウエル）を用いることが
有利である。

【００３４】前期吸着体を用い、これにヒトＬＡＣＩ含
有混合物を接触せしめると、該吸着体に固着したモノク
ローナル抗体とヒトＬＡＣＩとが結合して、結果的にヒ
トＬＡＣＩが該吸着体に結合する。かくすることにより
ヒトＬＡＣＩを分離または除去することが可能である。

【００３５】また前期の如くしてヒトＬＡＣＩを吸着体
に結合させ、出来れば残余の混合物を洗滌して除去し、
次いで吸着体に結合したヒトＬＡＣＩをカオトロピック
イオン（ＳＣＮ^-）等を含む適当な溶液と接触または洗
滌すると、ヒトＬＡＣＩは該吸着体から離脱し、これを
単離することによって抗凝固活性を有するヒトＬＡＣＩ
を単離することができる。

【００３６】Ｈ．ヒトＬＡＣＩの含有量の測定方法本発明のヒトＬＡＣＩに対するモノクローナル抗体（第
１抗体）を適当な不溶性担体（例えばプラスチック容
器）に固定化する（以下これを“固定化抗体”とい
う）。ついで不溶性担体と測定しようとする試薬または
検体試料との非特異的結合を避けるために適当な物質
（例えば牛血清アルブミン）で不溶性担体の表面を被覆
する。

【００３７】このようにして得られた第１抗体が固定化
された不溶性担体を検体試料と一定時間及び一定温度で
接触させ反応させる。

【００３８】この間に固定化抗体と検体試料中のＬＡＣ
Ｉが結合する。ついで適当な洗浄液で洗浄後、適当な標
識物質（例えば酵素）で標識したＬＡＣＩに対する抗体
（第２抗体）の溶液を、不溶性担体の固定化抗体に結合
したＬＡＣＩと一定時間及び一定温度で接触させて第２
抗体と反応させる。

【００３９】これを適当な洗浄液で洗浄後、不溶性担体
上に存在する第２抗体に標識された標識物質の量を測定
する（例えば、標識物質が酵素であれば、発色性の合成
基質を用いて吸光度を測定する）。かくして、その値か
ら検体試料中のＬＡＣＩの含有量を算出することができ
る。

【００４０】かくして本発明のモノクローナル抗体を用
いれば、ヒトＬＡＣＩを含有する混合物からのヒトＬＡ
ＣＩの除去、該混合物からのヒトＬＡＣＩの分離及び精
製、該混合物中のヒトＬＡＣＩの含有量の測定などが極
めて簡単な操作で達成される。

【００４１】さらに、本発明のモノクローナル抗体は、
ＬＡＣＩのＮ端から１番目のクーニッツ部位を認識する
特異性の高い抗体であるので、組織の免疫学的染色やイ
メージング用に使用することもできる。例えば、動脈硬
化巣におけるＬＡＣＩの集積性や、生体内における動脈
硬化巣部位の診断・特定に応用できるものと考えられ
る。

【００４２】以下、実施例により本発明を更に詳しく説
明する。

【００４３】

【実施例１】合成ペプチド―ヘモシアニン（ＫＬＨ）複合体の作製ＫＬＨ（keyhole limpet hemocyanin ）０．３mgと合成
ペプチド［アミノ酸配列；ＡｌａＰｈｅＬｙｓＡ
ｌａＡｓｐＡｓｐＧｌｙＰｒｏＣｙｓＬｙ
ｓＡｌａＩｌｅＭｅｔＬｙｓＡｒｇＰｈｅ
ＰｈｅＰｈｅＡｓｎＩｌｅＰｈｅ］１mgを
０．５mlの蒸留純水に溶解した。この溶液にＥＤＣＩ
（１―ethyl ―３― (３―dimethylaminopropyl)carbod
iimide―ＨＣｌ）３０mgを加え、遮光して室温で１晩反
応させた。反応液を蒸溜水２リットルに対して充分に透
析した。かくして合成ペプチド結合ＫＬＨ溶液（約０．
６mg／ml濃度）を得た。該溶液を抗原として免疫に用い
た。

【００４４】

【実施例２】マウスの免疫実施例１で得られた合成ペプチド結合ＫＬＨ溶液（０．
６mg／ml）０．５mlと完全フロインドアジュバント
（Complete Freund's Adjuvant）０．５mlとを連結した
２本の注射筒を用いて混合し、この混合液を２匹のマウ
スの腹腔に０．５mlずつ投与した。

【００４５】２週間後に、同様にマウスの腹腔に上記混
合液を０．５mlずつ投与した。続いて４週間後に合成ペ
プチド結合ＫＬＨ溶液（０．６mg／ml）０．５mlと不完
全フロインドアジュバント（Incomplete Freund's Ad
juvant）０．５mlとを混合し、この混合液を上記マウス
の腹腔に０．５mlずつ投与した。４週間後に合成ペプチ
ド結合ＫＬＨ溶液５０μｇ／１００μｌを上記２匹のマ
ウスに静脈内投与し、その３日後に脾臓を摘出し、以
下、実施例３に示すように細胞融合を行なった。

【００４６】

【実施例３】細胞融合及び目的とするモノクローナル抗体を産生する
ハイブリドーマ細胞の選択と取得摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（Ｐ３Ｕ１）とを約６：１の割合で混合し、５０％ポリ
エチレングリコール１５４０を融合促進剤として細胞融
合を行なった。融合後の細胞は１×１０⁶cells ／mlの
細胞濃度となるように１０％牛血清を含むＲＰＭＩ１
６４０培地に懸濁し、９６ウエルマイクロプレートに
１ウエルあたり１００μ１ずつ分注した。

【００４７】ハイブリドーマ（融合細胞）は、ＣＯ₂イ
ンキュベーター（５％ＣＯ₂，３７℃）中で培養し、ヒ
ポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培地
（ＨＡＴ培地）で培地交換を行ない、ＨＡＴ培地中で増
殖させて、脾臓細胞と骨髄腫細胞からなるハイブリドー
マのスクリーニングを行った。

【００４８】ハイブリドーマの培養上清中の抗体は、前
記合成ペプチドを吸着させたマイクロタイタープレート
を用い、ＥＬＩＳＡ法により検出した。抗体産生陽性ウ
エルのうちハイブリドーマの増殖能、及び前記合成ペプ
チドに対する結合性の強い、８ウエルについて限界希釈
法によるクローニングを２回繰り返して行なった。ＥＬ
ＩＳＡ法により、抗体産生能が高く抗原結合性が強いモ
ノクローン４個を選別した。得られたクローンは、１０
％ＤＭＳＯを含む９０％牛血清溶液中に懸濁させ、液体
窒素中に保存した。各クローンの産生するモノクローナ
ル抗体は、クローンをBalb／ｃマウスの腹腔内で増殖さ
せ、その腹水からプロテインＡ―セファロース４Ｂカラ
ムを用いて精製した。

【００４９】

【実施例４】精製モノクローナル抗体のクラスの決定マウス腹水から精製した各クローンのＩｇＧについてオ
クタロニー法によりサブクラスを選定した。

【００５０】

【表１】

【００５１】１Ｇ１系と２Ｆ２系は異なるエピトープを認識した。２
Ｆ２Ｄ９および２Ｆ２Ｅ２でＬＡＣＩを精製したら、両
方とも活性を有するＬＡＣＩが得られた。

【００５２】

【実施例５】ヒト肝細胞（Hep Ｇ２）無血清培養上清からのモノクロ
ーナル抗体カラムによるＬＡＣＩの精製実施例４記載のモノクローナル抗体２Ｆ２Ｄ９［Ｋｄ＝
１×１０^-9Ｍ］５mgをブロムシアン（ＣＮＢｒ）活性化
セファロース（ファルマシア（株））にカップリングさ
せ、抗体セファロースカラム２．５mlを作製した。続い
てヒト肝細胞（Hep Ｇ２）の無血清培養上清（ＩＴＥＳ
―ｅＲＤＦ培地）１リットルを該カラムに４０ml／時間
の流速で通し、接触せしめた。０．５ＭＮａＣｌ、
０．０５％Tween ２０及び１０Ｕ／mlアプロチニンを含
む２０ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ７．４）２００ml
でカラムを洗浄後、３ＭＮａＳＣＮ（ｐＨ７．０）１
５mlでカラムに吸着した蛋白を溶出した。溶出した画分
の総蛋白量は、約５０μｇであった。

【００５３】

【実施例６】モノクローナル抗体カラムにより精製したＬＡＣＩのＸ
ａ因子活性に及ぼす影響モノクローナル抗体カラムにより精製し、いろいろな濃
度に調製したＬＡＣＩ１０μｌとＸａ因子（ウシ、０．
１５μｇ／ml）１０μｌ、及び５０ｍＭＴｒｉｓ―Ｈ
ＣｌｐＨ７．８（０．１５ＭＮａＣｌ、５mg／mlＢ
ＳＡ、５ｍＭＣａＣｌ₂を含有）１０μｌとを混合し、
３７℃で１０分間反応した。これに続いて、あらかじめ
１６０μｌ／ウエル５０ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣｌｐＨ
７．８（０．１５ＭＮａＣｌ、５mg／mlＢＳＡを含
有）を入れた９６ウエルマイクロプレートに該反応液
２０μｌを加えた。最後に２．５ｍＭ Spectrozyme Ｘ
ａ（合成基質ＭｅＯ―ＣＯ―Ｄ―ＣＨＧ―Ｇｌｙ―Ａｒ
ｇ―ｐＮＡ）１０μｌをウエルに加え、ＥＬＩＳＡＡ
ＮＡＬＹＺＥＲ（東洋測器（株）、ＥＴＹ―９６）で吸
光度Ａ₄₀₅ｎｍを測定した。結果をまとめて図１に示
す。

【００５４】その結果、精製したＬＡＣＩはいずれも濃
度依存的にＸａ因子の活性を阻害することが判明した。

【００５５】

【実施例７】モノクローナル抗体カラムにより精製したＬＡＣＩのＴ
Ｆ活性に及ぼす影響ウサギ脳トロンボプラスチン（４０mgアセトン粉末、シ
グマ社、２ml）を１mg／mlＢＳＡを含む０．１２５Ｍ
ＮａＣｌ溶液によって１／２０に希釈し、ＴＦ溶液を調
製した。ＴＦ溶液２００μｌと２５ｍＭＣａＣｌ₂溶
液２０μｌとを混合し、３７℃で２分間反応させた。こ
のうち２００μｌを、２０μｇ／ml濃度のＬＡＣＩ溶液
２０μｌを添加したヒト血漿１２０μｌに加え、プロト
ロンビン時間（ＰＴ）を血液凝固時間測定装置（Sysmex
社、ＣＡ―１００）を用いて測定した。結果をまとめて
図２に示す。

【００５６】その結果、ＬＡＣＩはＴＦ活性を阻害し、
血液凝固時間（ＰＴ）を延長することが判明した。

【００５７】以上の実施例６及び実施例７の検討の結果
から、モノクローナル抗体によって精製したＬＡＣＩ
は、Ｘａ因子阻害活性とＴＦ阻害活性を有することが確
かめられた。

【００５８】

【実施例８】抗ＬＡＣＩモノクローナル抗体によるヒト血液中のＬＡ
ＣＩの検出本発明者（出願人も同じ）による先願Ｐ２５６１４―０
１（平成３年１０月３１日出願）記載のモノクローナル
抗体、すなわちＬＡＣＩのＮ端から３番目のクーニッツ
部位を認識し結合するモノクローナル抗体の１種であ
る、２Ａ１Ｈ８［Ｋｄ＝０．９×１０^-9Ｍ］を２０μｇ
／ml濃度で、マイクロタイタープレート（９６ウエルプ
レート）に吸着後、１％ＢＳＡと０．１５ＭＮａＣｌ
を含む２０ｍＭＴｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ７．４）によ
って固相をブロッキングした。

【００５９】洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．
５％ＢＳＡ及び０．１５ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で２回、ウエルを洗浄
した。

【００６０】次にヒト血漿（健常人由来）を洗浄液を用
いて５，５０，２００倍希釈し、それぞれをウエルに加
えて、プレート固相に吸着したモノクローナル抗体と３
７℃で２時間、反応させた。洗浄液で３回洗浄後、パー
オキシダーゼ酵素標識化した、本発明のモノクローナル
抗体の１種である２Ｆ２Ｅ２［Ｋｄ＝１×１０^-9Ｍ］溶
液（４００ng／ml）を加え、３７℃で２時間反応させ
た。洗浄液で３回洗浄後、基質溶液（ＡＢＴＳ）を加
え、ＥＬＩＳＡＡＮＡＬＹＺＥＲ（東洋測器（株），
ＥＴＹ―９６）で波長４１５ｎｍにおける吸光度Ａ₄₁₅
を測定した。各希釈倍率における、ヒト血液中のＬＡＣ
Ｉの検出の割合を図３に示した。

【００６１】本発明のモノクローナル抗体を用いれば、
高感度でヒト血液中のＬＡＣＩを検出可能である。

【００６２】

【比較例】実施例８で示した、モノクローナル抗体２Ａ
１Ｈ８を固相化したウエルに、同様に希釈したヒト血液
を反応させた。洗浄後、パーオキシダーゼ酵素標識化し
たモノクローナル抗体（ＬＡＣＩのＮ端から２番目のク
ーニッツ部位［Ｋ２］を認識し結合する抗体の１種類）
２Ｇ９Ｆ１［Ｋｄ＝１×１０^-9Ｍ］溶液（４００ng／m
l）を加え、３７℃で２時間反応させた。洗浄液、基質
溶液（ＡＢＴＳ）を加え、吸光度を測定した。各希釈倍
率における、ヒト血液中のＬＡＣＩの検出の割合を図４
に示した。この結果、実施例８に比べて、ＬＡＣＩの検
出感度が低く、定量性も劣ることが判明した。

【００６３】例えばヒト血液１／５希釈溶液中のＬＡＣ
Ｉの検出の割合（吸光度Ａ₄₁₅ｎｍ）は図３においては
０．６９５であるのに対し、図４（比較例）では０．３
１６であり、その割合は半分以下であった。

【００６４】従ってＬＡＣＩの測定系に用いる抗体の組
合せとしては、本発明のＫ１を認識するモノクローナル
抗体を固相化抗体あるいは酵素標識化抗体として使用す
ることが、測定系の特性上、必要であると考えられる。

【００６５】尚、Ｋ２を認識するモノクローナル抗体２
Ｇ９Ｆ１は、下記アミノ酸配列ＰｈｅＬｅｕＧｌｕＧｌｕＡｓｐＰｒｏＧｌｙＩｌｅＣｙｓＡｒｇＧｌｙＴｙｒＩｌｅＴｈｒＡｒｇＴｙｒＰｈｅＴｙｒＡｓｎＡｓｎＧｌｎを有する合成ポリペプチドを用い、実施例１〜４と同様
にして取得した。２Ｇ９Ｆ１のＨ鎖はγ_2b，Ｌ鎖はκで
あった。

【００６６】

【配列表】

【００６７】配列番号：１配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列：ＡｌａＰｈｅＬｙｓＡｌａＡｓｐＡｓｐＧｌｙＰｒｏＣｙｓ¹ ⁵ ＬｙｓＡｌａＩｌｅＭｅｔＬｙｓＡｒｇＰｈｅＰｈｅＰｈｅ¹⁰ ¹⁵ ＡｓｎＩｌｅＰｈｅ ²⁰

【００６８】配列番号：２配列の長さ：２１配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチドフラグメント型：中間部フラグメント配列：ＰｈｅＬｅｕＧｌｕＧｌｕＡｓｐＰｒｏＧｌｙＩｌｅＣｙｓ¹ ⁵ ＡｒｇＧｌｙＴｙｒＩｌｅＴｈｒＡｒｇＴｙｒＰｈｅＴｙｒ¹⁰ ¹⁵ ＡｓｎＡｓｎＧｌｎ ²⁰

【図面の簡単な説明】

【図１】モノクローナル抗体カラムによって精製したＬ
ＡＣＩのＸａ因子活性に及ぼす影響を示したものであ
る。

【図２】モノクローナル抗体カラムによって精製したＬ
ＡＣＩのＴＦ活性に及ぼす影響を示したものである。

【図３】モノクローナル抗体によるヒト血液中のＬＡＣ
Ｉの検出に関して示したものである。

【図４】比較例におけるヒト血液中のＬＡＣＩの検出を
示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 17/02 8517−4ＨＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/537 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 9015−2Ｊ // Ｃ０７Ｋ 7/10 ＺＮＡ 7537−4ＨＣ１２Ｎ 15/06 (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ０７Ｋ 99:00

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミノ酸配列ＡｌａＰｈｅＬｙｓＡｌａＡｓｐＡｓｐＧｌｙＰｒｏＣｙｓＬｙｓＡｌａＩｌｅＭｅｔＬｙｓＡｒｇＰｈｅＰｈｅＰｈｅＡｓｎＩｌｅＰｈｅのポリペプチドを認識し、結合するモノクローナル抗
体。
【請求項２】リポプロテイン結合性凝固系インヒビタ
ー（Lipoprotein Associated Coagulation lnhibitor：
ＬＡＣＩ）のＮ端から１番目のクーニッツ部位を認識
し、結合するモノクローナル抗体。
【請求項３】組織因子阻害活性と血液凝固Ｘａ因子阻
害活性とを有する蛋白物質を認識し結合する請求項１記
載のモノクローナル抗体。
【請求項４】上記第１，２及び３項のいずれかのモノ
クローナル抗体を不溶性担体に結合させた吸着体に、ヒ
トＬＡＣＩ含有混合物を接触せしめ、該吸着体にヒトＬ
ＡＣＩを結合せしめることを特徴とするヒトＬＡＣＩ含
有混合物からのヒトＬＡＣＩの分離方法。
【請求項５】サンドイッチ法による免疫学的測定試薬
において、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とは、
ＬＡＣＩのそれぞれ異なるクーニッツ部位を認識し結合
するモノクローナル抗体であり、一方が上記第１，２及
び３項のいずれかのモノクローナル抗体であることを特
徴とするＬＡＣＩに対するモノクローナル抗体を用い
た、ＬＡＣＩの免疫学的測定試薬。