JP2741378B2 - 固体表面の生物適合性の改良 - Google Patents
固体表面の生物適合性の改良Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は生物化学の分野に関し、特に種々の表面の生
物適合性の強化に関する。 発明の背景 代用血管、合成物の眼内レンズ、電極、カテーテルそ
の他のような生体用材の体内および体表への移植は急速
に発展している医学の分野である。合成の血管用グラフ
ト（移植片）のような生体用材移植物を長期間使用する
際の第一の障害は満足すべきグラフト表面を持たないこ
とである。例えば、プラスチック製の合成血管の非処理
表面は、急速な血栓形成作用を刺激することが多い。種
種の血漿蛋白質はプラスチック表面において血小板およ
びフイプリン沈着を起こさせる。このような作用が血流
障害となる血管圧縮につながり、それに引き続く炎症反
応が合成移植物の機能を失わせることにつながる。 「生体用材」（バイオマテリアル）とは、実際上、体
液に不溶で、体内または体表面に置くか、体液と接触さ
せるように設計され、つくられた機材を云う。血管グラ
フトおよびコンタクトレンズが生体用材の例である。 理想的には、生体用材は次のような性質を持つ。 1.凝血、組織死、腫瘍形成、アレルギー反応、異物反応
（拒否反応）または炎症反応のような、体内での望まし
くない反応を誘導しない。 2.目的通りに機能するために要求される、強度、弾性、
透過性および柔軟性のような物理的性質を持つ。 3.容易に精製、製造および滅菌できる。 4.1時間であれ一生涯であれ、体内に移植され、または
体と接触している間は、その物理的性質および機能を実
際上保っている。 生物体に対し、正味で有益な効果を与えつつ生物体の
生物学的液体および／または組織と接触して機能し、存
在し得るならば、ここに使ったように、その生体用材の
固体表面は「生物適合性」としての性質を持つ。宿主生
物にとっての妨害を低減するために長期の生物適合性が
望まれる。 移植物体の生物適合性を改善するため多くの解決法が
提案されてきた。ひとつの解決法は、望ましくない蛋白
質の付着を防ぐために生体用材に低分極性表面、負荷電
表面または酵素、内皮細胞や蛋白質のような生物学的物
質によって被覆した表面を与えることによって、生体用
材の表面を修飾することであった。固体表面をヘパリ
ン、アルブミンおよびストレプトキナーゼのような生化
学材で被覆して血栓耐性を強化した。特にアルブミンは
ポリマー表面に物理的に吸着され、静電的および共有的
に結合される。 アメリカ特許第4,530,974号明細書においてマンロー
等（Munro et al）は、アルブミンが選択的に結合する
非イオン性疎水性脂肪族鎖を表面に共有結合させること
により、ポリウレタンのような水不溶性ポリマーにアル
ブミンを吸着させる方法を発表している。 アメリカ特許第4,378,224号明細書においてニンニ等
（Nimni et al）は、補綴物をつくるために使用される
動物組織を、主としてカルシウム化阻害剤からなる三次
元架橋マトリックスを形成させることにより被覆する方
法を示している。 生体用材の存在で起る副作用の一例はコンタクトレン
ズ上への蛋白質の沈着である。コンタクトレンズ装着者
は時間が経つにつれてコンタクトレンズに対してしばし
ば我慢ができなくなる。これは装着している間にレンズ
上に沈着した生化学物質（蛋白質、脂質、ムコ多糖その
他）に対する刺激およびアレルギー反応と結びついてい
る。現在行われている洗浄および消毒法でこれらの沈着
物をある程度除去できるが、これらの方法はしばしばレ
ンズに穴やひびを残し、それが装着者の眼への刺激を更
に加えたり、一層生化学物質沈着の中心になったりす
る。 アメリカ特許第3,959,078号明細書においてガイア（G
uire）はアミノエチルセルロースまたはアルキルアミン
ガラスに酵素を共有結合する試薬を使用することを記載
している。下記のものも参照。ガイア（Guire）、酵素
安定化および固定化のための段階的熱光化学的架橋；エ
ンザイム エンジニアリング３巻63-70頁（1978年）（E
nzyme Engineering 3:63-70（1978））およびガイア（G
uire）、酵素および他の生化学物質の光化学的固定化、
メソーズ イン エンザイモロジーXL IV巻、280-288
頁（1976年）（Methods in Enzymology XL IV:280-288
（1976））。固体表面に連結試薬を熱化学的にカップリ
ングさせ、次いでこの連結試薬に酵素を光化学的にカッ
プリングさせることにより、調節した孔を持つガラス、
セルロース、アガロースおよびポリアクリルアミドのよ
うな基質に酵素を共有的に結合させて体外診断分析を行
う際に有用な表面をつくる方法がこれらの文献に記載さ
れている。 発明の要約 本発明は望ましい生物適合性表面を与えられた生体用
材に関する。生体用材の固体表面を修飾する方法には、
生物適合性剤の分子と、活性化することにより固体表面
に共有結合することができる光化学反応性基および活性
化することにより生物適合性剤の離れた分子に共有結合
することができる別に反応性基を持つ化学的連結性基の
分子を使用する。これらの基の一方は他方の基が応答す
る刺激による活性化に対して応答しない。本方法は、刺
激を加えて基を順次活性化し、連結基の上記の別の反応
性基を生物適合性剤の分子に共有結合させ、次いで生物
適合性剤の分子が固体表面を効果的に覆いつくすに十分
な表面密度を持たせて固体表面に連結基を光化学的に共
有結合させることにより、生物適合性の効果ある表面を
得ることを特徴とする。 生物適合性の「効果ある」表面は、連結基を介して生
体用材の固体表面に共有結合的に連結されて、生物適合
性剤が持っているものと実質的に同じ生物適合性の性質
を持つ表面を得るようにした、生物適合性剤の複数の分
離した分子から形成されている。生物適合性剤の分子に
よって形成された効果ある表面は生体用材の全表面を覆
う必要はない。表面を点で覆ってよい。例えば、血管グ
ラフトの表面に沿った点をフィブロネクチンのような細
胞付着因子で被覆してよい。このような点で形成された
生物適性の効果ある表面はこの修飾した表面への細胞付
着の中心として働く。 連結基の別の反応性基は、最初に述べた光化学的な反
応性基が応答する刺激に応答せず、生物適合性剤が共有
結合する熱化学的基または光化学的基であることが望ま
しい。 本発明のもうひとつの実施態様として、化学的連結基
残基で器具の固体表面に共有的に連結された生物適合性
剤の離れた分子で形成された、生物適合性の効果ある表
面を持つ器具を得ることである。化学的連結基残基に
は、固体表面に共有的に結合された光化学的反応性基の
残基、および、生物適合性剤の分子に共有結合された別
の反応基の残基で、その反応基はもうひとつの反応基が
応答する刺激に応答しない反応基のひとつであるものを
含む。生物適合剤の個々の分子は、たがいに十分に近づ
いて固体表面を効果的に覆い、生物適合性の効果ある表
面となるように、固体表面に連結基残基を介して付着し
ている。 生物適合性剤はそれぞれの器具の機能を高めるような
ものを選択する。例えば、コンタクトレンズの機能は、
ポリエチレングリコール分子をレンズ表面に付着させて
表面へ蛋白質の沈着を低減することで高められる。もう
ひとつの例としては、フイブロネクチンまたはラミニン
のような細胞付着因子をポリ塩化ビニル表面を持つ器具
に結合させて器具への細胞付着を増加させる。これはカ
テーテルや付用血管のような移植物の場合に望ましい。 更に、もうひとつの本発明の実施態様に、生物適合性
剤をたがいに結びつけて生物適合性のフィルムとした生
物適合性剤の分子と、生体用材の固体表面にこのフィル
ムを連結することができる化学的連結基を使用する、生
体用材の固体表面を修飾する方法が含まれる。この化学
的連結基には、活性化によって固体表面に共有結合され
得る光化学反応性基、およびフィルムに共有結合された
（例えば、フィルムをつくっている生物適合性剤の残基
に共有結合された）反応基の残基が含まれる。反応基の
ひとつは他の反応基が応答する刺激に応答しない。この
方法には光化学的反応基を刺激で活性化して生物適合性
分子を共有結合させることが含まれる。本明細書で「結
びつける」ということは、隣接した生物適合性剤分子を
共有結合させるだけでなく、水素結合、イオン結合、フ
ァンデルバール力による結合その他のような力により引
起される相互作用を云う。 たがいに結びつけられてフィルムを形成した分子を持
つ生物適合性剤は、一種の剤の分子でもよいし、ヘパリ
ンとアルブミンのような二種以上の剤の分子でもよい。 望ましい実施態様の説明 本発明の生物適合性を示す固体表面は生理的液体に不
溶の合成または天然の材料が望ましい。その表面は、生
きている生物の組織および／または液体に接触して機能
するよう意図された器具のひとつ以上の表面であってよ
い。器具の固体表面は研磨されたチタンまたはステンレ
ススチールのようないかなる好適な金属、またはポリウ
レタン、ポリビニルピロリドン、シリコンエラストマ
ー、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ
−（ｐ−フェニレンテレフタルアミノード）、ポリ塩化
ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリエステ
ル、ポリアクリレート（ポリメタクリレートを含む）の
ようなポリマー；ヒドロキシアパタイトのようなミネラ
ルまたはセラミックス；骨、皮ふおよび歯のような人の
組織；木材、セルロースおよび圧縮炭素のような有機材
料；およびガラス、ゴム、木材のような他の天然および
合成の材料であってよい。本発明の生物適合性表面を持
った器具の例は、血管グラフトチューブ、透析チューブ
または膜、血液オキシジェネイターチューブまたは膜、
限外過膜、大動脈内バルーン、血液バック、カテーテ
ル、縫合糸、軟質または硬質組織補綴、合成補綴、人工
器官、およびコンタクトおよび眼内レンズのような眼の
ためのレンズである。 固体表面は熱化学的に反応性のないものが望ましい。
「熱化学的に反応性のない」とは熱化学的に反応する表
面の能力を高めるために考えられたいかなる表面処理も
さていないという意味である。熱化学的に反応性のない
表面の例はポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロ
リドン、シリコンエラストマー、ステンレススチールお
よびチタンである。 生物適合性剤の分子を生体用材の表面に付着させて生
物適合性を改善する。生物適合性剤は、内皮細胞増殖因
子、造骨細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板誘
導増殖因子、神経生長因子、または脈管形成生長因子の
ような増殖因子；ライソザイムまたはペニシリンのよう
な抗菌剤；ヘパリン、アルブミン、ストレプトキナー
ゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）またはウ
ロキナーゼのような抗血栓形成剤；コラーゲンのような
血栓形成剤またはポリエチレングリコール、ヒアルウロ
ン酸、キトサンまたはメチルセルロース、その他の蛋白
質、炭水化物、脂肪酸のような親水性ポリマーである。
生物適合性剤は上記の剤の一種の剤の分子であってもよ
いし、二種以上の剤の分子であってもよい。例えば、生
物適合性剤はアルブミンとヘパリン両方を含んでいてよ
い。 ひとつの実施態様において、生物適合性材料をたがい
に結びつけてフィルムとし、それを連結基により固体表
面に付着させる。生物適合性剤はヒアルウロン酸または
アルブミンが望ましい。フィルムを付着させた生物適合
性器具としてフィルムまたはヒアルウロン酸で被覆され
た人工股関節が挙げられる。 化学的連結基は、次式： Ａ−Ｘ−Ｂ （式中、 Ａは特別の活性化に応答して固体表面に共有的に結合
できる光化学的反応性基を表わし； ＢはＡで表わされる基が応答しない特別の活性化に応
答して生物適合性剤と共有結合を形成することができる
別の反応性基を表わし、 ＸはＡおよびＢで表わされる両基を結び合わせる相対
的に不活性で非妨害性の骨格基で、水性の生理的液体中
で分解されにくいものを表わす） で表わされることが望ましい。 この生理的液体とはＸが接触するであろう液体を云
う。 Ｘはポリメチレンのような炭素原子数１乃至10のアル
キル基、ポリメチロールのような炭水化物、ポリエチレ
ングリコールのようなポリオキシエチレン、またはポリ
リジンのようなポリペプチドであることが望ましい。 Ｂで表わされる反応性基は好適な活性化により蛋白性
またはその他の生物適合性剤と共有結合する基である。
典型的なこのような基は、本明細書で参照文献として示
したガイア（Guire）、アメリカ特許第3,959,078号明細
書に記載し例示されているような、熱化学的基および光
化学的基である。 光化学的反応性基（Ａ）（活性照射により活性化され
て共有結合）は、アリール、アルキルおよびアシルアジ
ド、オキサジデイン、イソシアネート（ニトレン生成
剤）、アルキルおよび２−ケトジアゾ誘導体およびジア
ジリン（カルペン生成剤）、芳香族ケトン（トリプレッ
ト酸素生成剤）、芳香族ジアゾニウム誘導体およびカル
ボニウムイオンおよびラジカル生成剤の多くの群で代表
される。参照文献であるフレデリックジェイ．ダーフラ
ー アンド アンドルー エム．トメツコ、ケミストリ
ー アンド バイオケミストリー オブ アミノアシッ
ズ、ペプタイズ アンド プロテインズ（ボリス ワイ
ンスタイン編）５巻、マーセル デッカー、インコーポ
レイテッド．ニューヨーク1978年の２章（Frederick J.
Darfler and Andrew M.Tometsko、chapter 2 of Chemis
try and Biochemistry of Aminoacids、Peptides and P
roteins（Borris Weinstain、ed.）vol.5、Marcel Dekk
er、Inc.New York、1978）に光化学的反応性基について
更に記載されている。暗黒下での化学反応条件に安定で
あり、ほとんどの生体用材に無害の波長の光による活性
化に応答して、生体用材のほとんどの部位について有用
である収率で共有結合を形成できる短寿命の反応性中間
体を形成できることから、アジドニトニフェニル、フル
オロアジドニトロベンゼンおよび芳香族ケトンが望まし
い基を形成する。 ニトロフェニルアジド誘導体（Ｘで表わされる基を含
むとして示される）は、大部分の光化学的反応性基がフ
ルオロ−２−ニトロ−４−アジドベンゼンから誘導され
るので使用するのに適当であり、４−アジド−２−ニト
ロフェニル（ANP）−４−アミノ−ブチリール、ANP−６
−アミノカプロイル、ANP−11−アミノウンデカノイ
ル、ANP−グリシル、ANP−アミノプロピル、ANP−メル
カプトエチルアミノ、ANP−ジアミノヘキシル、ANP−ジ
アミノプロピル、およびANP−ポリエチレングリコール
が含まれる。ANP−６−アミノカプロイル、ANP−11−ア
ミノウンデカノイル、およびANP−ポリエチレングリコ
ールが望ましい。光化学的反応性基として使用するに望
ましい芳香族ケトンにベンジルベンゾイルおよびニトロ
ベンジルベンゾイルが含まれる。 熱化学的反応性基（熱エネルギーで活性化される）は
ニトロフェニルハライド、アルキルアミノ、アルキルカ
ルボキシル、アルキルチオール、アルキルアルデヒド、
アルキルメチルイミデート、アルキルイソシアネート、
アルキルイソチオシアネートおよびアルキルハライド基
が代表的なもので、これらが含まれる。 熱化学的反応性基として使用するに適当な基にはカル
ボキシル基、ヒドロキシル基、第一アミノ基、チオール
基、マレイミドおよびハライド基が含まれる。６−アミ
ノヘキサン酸およびアミノウンデカン酸のような基のＮ
−オキシスクシンイミドカルボン酸エステル、メルカプ
トスクシニックアンヒドリドおよびβ−メルカプトプロ
ピオン酸、ホモシステインチオラクトン、およびポリエ
チレングリコール誘導体が望ましい。 本発明の器具は生物適合性剤の分子および化学的連結
基残基を含む生物適合性固体表面を持っている。化学的
連結基残基は、固体表面に結合された光化学的反応性基
の残基並びに生物適合性剤に共有結合された別の基の残
基を持っている。光化学的反応性基の残基は一般式にお
いて「Ａ」で表わされる光反応性基（前述）の一部で、
共有結合形成後も残っている。光反応基がANPで固体基
質がポリエチレンの時、その残基は炭素−窒素結合であ
る。ANPが光活性化されて形成されたニトレンはポリエ
チレンの炭素と反応して共有結合を形成する。光反応性
基がBBAで固体基質がポリエチレンである時、残基は炭
素−炭素結合である。BBAが光で刺激されると、２個の
フェニル基を結び合わせている炭素が活性化されてトリ
プレット状態となり、炭素−炭素結合をポリエチレンと
BBAの間に形成し、ヒドロキシル基を形成する。別の反
応性基（「Ｂ」）がNOSである場合、その残基はフィブ
ロネクチンのような生物適合性剤の酸素または窒素基に
結合された基のカルボキシル炭素である。 生物適合性剤として使用する酵素、細胞付着因子およ
びある種の他の物質はやゝ高温に感受性であるため、本
発明に使用する連結基上の別の反応性基は、中程度の熱
（例えば体温またはそれ以下）および光のような容易に
適用できて無害の刺激によって活性化（すなわち、それ
に応答して共有結合を生ずる）されることが望ましい。
光化学的反応性基が応答する刺激に応答しない反応性基
は、pH変化、またはもうひとつの化学分子種その他の添
加に反応する基である。 化学的連結基は、固体表面を遮蔽して生物適合性の効
果ある表面をつくり得るような密度で、表面に共有結合
することが望ましい。効果ある表面をつくるに必要な結
合化学基の密度は使用する生物適合性剤によって変る。 本発明は以下の非限定的な実施例を参照することによ
り理解が深かまる。第１表は以下の記載に使用した用語
の略記の表である。 実施例１ 内皮細胞付着／生育 1.プラスチック表面 種々の細胞因子をインビトロで（試験管で）試験する
ための重合体表面に結合させ、これらの因子の細胞付着
と過剰生育への効果を測定した。重合体表面としては、
ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリエチレン（PE）、ポリプ
ロピレン（PP）およびポリテトラフルオロエチレン（PT
FE）GORE-TEX（6mmの強化伸展PTFE、ダブリュー．エ
ル．ゴア アンド アソシエイツ、インコーポレイテッ
ド（W.L.Gore and Associates,Inc,）の商標付製品）で
あった。試験した市販のチューブはポリエステル（Dacr
on,D,6mmの真直に編んだダクロン ベロア、デュポン
（Dupont）の商標付製品）、シリコンエラストマー（Si
lasticR,S,0.03内径のチューブ、ダウ コーニング（Do
w Corning）の商標付製品）およびポリウレタンであ
る。ポリスチレンプレートを対照として使用した。 2.化学的連結基の調製 これらの実施例に使用した化学的連結基は４−アジド
−２−ニトロフェニルε−アミノカプロン酸（ANP-EAC
A）、４−アジド−２−ニトロフェニル アミノウンデ
カン酸（ANP-AUDA）およびベンゾイル安息香酸（BBA）
のＮ−オキシスクシンイミド（NOS）エステルであっ
た。ANP-EAC-NOSとANP-AUD-NOSは本明細書に参考文献と
して示したピー．ガイア、ディー．フリガーおよびジェ
イ．ホドグソン、「哺乳動物細胞への酵素の光化学的カ
ップリング」、ファーマコロジカル リサーチ コミュ
ニケーションズ、９巻、131-141頁（1977年）（P.Guir
e,D.Fliger and J.Hodgson,“Photochemical Coupling
of Engymes to Mammalian Cells",Pharmacolojical Res
earch Communications,Vol.9,pp131-141（1977））に記
載された方法で調製した。要約すると、フルオロ−２−
ニトロ４−アジドベンゼンをε−アミノカプロン酸また
はアミノウンデカン酸と反応させて比較的反応性の低い
フッ素をアミノアルキルカルボキシル基で置換する。次
いでカルボキシル基をカルボジイミド活性化によりＮ−
ヒドロキシサクシンイミドでエステル化してＮ−オキシ
スクシンイミドカルボン酸エステルを得る。ベンゾイル
安息香酸のNOSエステルはカルボキシル基をカルボジイ
ミド活性化によりＮ−ヒドロキシスクシンイミドでエス
テル化して調製した。 ANP-EAC-NOSまたはANP-AUD-NOSを化学的連結基として
使用した時、ANP基が前述の一般式Ａ−Ｘ−Ｂの「Ａ」
で表わされる光化学的反応性基である。NOS基はこの式
の「Ｂ」で表わされる別の反応性基である。EACまたはA
UD基は２個の反応性基の間でスペーサーとして作用し、
一般式の「Ｘ」で表わされる。 BBA-NOSが化学的連結基である場合には、ベンゾイル
安息香酸基が一般式「Ａ」で表わされる光化学的反応性
基であり、NOS基は「Ｂ」で表わされる別の反応性基で
ある。Ｘで表わされる基は２個の反応性基を結びつける
炭素である。 3.化学的連結基への生長因子の共有結合 生物適合性剤フイブロネクチン、ラミニン、コラーゲ
ン、内皮生育因子、およびヒト血漿アルブミンについて
合成生体用材への内皮細胞付着および過剰増殖を促進で
きるかどうかを試験した。これらの剤を４−アジド−２
−ニトロフェニルε−アミノカプロン酸（ANP-EACA）、
４−アジド−２−ニトロフェニル−ウンデカンアミノ酸
（ANP-AUDA）またはベンゾイル安息香酸（BBA）のＮ−
オキシスクシンイミド（NOS）エステルに次のようにし
てカップリングさせた。ここで使用する「光標識した」
とは別の反応性基によって化学的連結基にカップリング
させて光化学的反応性基を持つ生物適合性剤を云う。 A.連結基へのフイブロネクチンおよびラミニンの共有結
合 ヒトのフイブロネクチン（ウィスコンシン大学医学
部）およびマウスのラミニン（ベセスダ リサーチ ラ
ブBethesda Research Lab.から入手）を別々に0.1Mホウ
酸塩、pH9.0に1mg/mlの濃度で溶解した。脱水したジメ
チルホルムアミド（“DMF"）に溶解したANP-EAC-NOSま
たはANP-AUD-NOSまたは脱水したジオキサンに溶解したB
BA-NOSの溶液をフィブロネクチンまたはラミニン溶液に
対し、蛋白質のε−アミノ基（リジン残基）の濃度に当
モルになるように、暗黒下で16時間かけ、４℃で注射器
を使ってゆっくりと加えた。次いで、その混合物を冷却
しつつ４時間攪拌した。このフイブロネクチンまたはラ
ミニン溶液を遠心分離して不溶物を除き、セファテック
ス（Sephadex）G-75カラムに流して未カップリングの光
反応剤を除いた。画分について光基／蛋白質比を調べる
ため260nmと462nmで追跡した。 B.化学的連結基へのEGF、コラーゲンおよびHSAの共有結
合 ヒト胎盤IV型コラーゲン（シグマ ファーマシューテ
ィカルSigma Pharmaceutical）、内皮生長因子（シグマ
ファーマシューティカルSigma Pharmaceutical）、お
よびヒト血漿アルブミン（シグマ ファーマシューティ
カルSigma Pharmaceutical）を別々に0.1Mホウ酸塩、pH
9.0に2mg/mlの濃度で溶解した。DMFに溶解したANP-EAC-
NOS、DMFに溶解したANP-AUP-NOSまたはシオキサンに溶
解したBBA-NOSの溶液を、ε−アミノ基（リジン）の濃
度に対し5Xモル量で、生物適合性剤を含む溶液に対し
て、注射器を使い４℃で暗黒下、16時間かけてゆっくり
と加えた。次いで、この溶液をリン酸緩衝化食塩水（PB
S）1000mlを４回交換して透析し、不溶物を遠心分離で
除く。生成物について光基／蛋白質比を知るため260n
m、280nmおよび462nmで分析した。 4.プラスチック表面への生物適合性剤の共有結合 ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポ
リウレタン、ダクロン（DacronR）（ベロア）、シラス
チック（SilasticR）（医学用）、およびポリテトラフ
ルオロエチレンの種々のシート、チューブおよび平板片
を使用した。光標識した生物適合性剤０乃至500μg/ml
を含む溶液0.05mlをプラスチック表面各0.5cm2切片に加
える。この溶液を暗黒下、室温で３時間、各片に吸収さ
せた。過剰の液体を除き、適当な波長で（ANPにはタン
グステン「スポットライトSpotlite」およびBBAには長
波長UV）12時間光分解することにより生物適合性剤を表
面に共有結合させた。光分解後、光標識生物適合性剤の
共有結合していない分子を除くために標本片にPBSを４
秒間流して洗浄した。その後、標本片を組織培養中に置
き、下記により細胞因子への内皮細胞の反応を調べた。 5.修飾した表面について行ったインビトロ試験 A.放射性標識生物適合性剤 放射性標識した〔3H〕生物適合性剤を上記のようにし
て光標識し、プラスチック表面に光カップリングした。
このプラスチック表面をPBSで十分に洗浄し、有機溶剤
に溶解して液体シンチレーション分光法で測定した。代
表的な結果を第２表に示す。 これらの結果が示すように光標識生物適合性剤は表面
に共有結合されている。 B.修飾プラスチック表面へのウシ内皮細胞の付着 ウシ内皮細胞は長さ8-24インチの胎仔から集めた。角
膜、大動脈およびへその内皮細胞を無菌的に集めた。細
胞を、25mmole HEPES緩衝液、10％仔ウシ血清および2.5
μｇアンホテリシンB/mlを加えたダルベッコの改良イー
グル培地（アール．ダルベッコおよびジー．フリーマ
ン、バイロロジー８巻.396頁（1959年）（R.Dulbecco a
nd G.Freeman,Virology,Vol.8:396（1959））およびジ
ェイ．ディー．スミス、ジー．フリーマン、エム．ボグ
トおよびアール．ダルベッコ、バイロロジー12巻、185-
196頁（1960年）（J.D.Smith,G.Freeman,M.Vogt and R.
Dulbecco,Virology Vol.12:185-196（1960））に記載）
のような公知の高グルコース細胞生育培地（「生育培
地」）中で、37℃、５％CO2インキュベーターで生育さ
せた。プレート、チューブまたはシートを準備する毎
に、細胞培養は一次培養から調製した。細胞を0.25％ト
リプシン溶液で細胞株から取り、生育培地に再懸濁し
た。次いでトリパンブルー（0.4％）溶液と血球計を使
って細胞数を計測した。種々の濃度の細胞を準備した材
料の上に層状に置いた。細胞の付着を５分から14日間の
種々の時間間隔で追跡した。付着は少くとも２種の方法
で測定した。第一の方法においては、試料材料を培地か
ら離し、殺菌した食塩液で２回洗浄した。次いで細胞染
色を行い、表面上の全細胞数を計測した。第二の方法で
は、トリプシン溶液を使って細胞を表面から離し、トリ
パンブルー法で細胞数を計測した。 予備被覆したポリ塩化ビニルプラスチック上の内皮細
胞の付着および生育について代表的結果を第３表に示
す。各片に付着した生細胞数はトリパンブルー染色法で
測定した。 C.ヒト臍の内皮細胞の付着 一次のヒト内皮細胞を新鮮なヒト臍帯（４日令以前）
から採取した。帯を20mlのコード（cord）緩衝液（0.14
4MNaCl、0.004MKClおよび0.001MPO4）で２回洗浄して血
液および凝固物を除く。コラゲナーゼを帯の中に注入
し、室温で20分間放置した。温コード（cord）緩衝液10
mlを使い、コラゲナーゼと剥離した細胞を試験に噴出さ
せる。試験管内の懸濁液を合わせて、1500rpmで５〜10
分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を10mlのコード
（cord）緩衝液に再懸濁した。二回目の遠心分離後、細
胞をコード（cord）緩衝液に再懸濁し、組織培養ディス
クに置いた。すべての細胞を５％CO2を流した37℃のイ
ンキュベイター中でインキュベイトした。細胞は仔ウシ
血清を含まないコード（cord）培地中で51Crを使って放
射性標識した。 この放射標識した細胞を細胞付着試験に使用した。上
記のプラスチックのプレート、シートおよびチューブは
前述の通りに調製した。細胞をトリプシン処理し、トリ
パンブルー法で細胞数を測定した。細胞を調製したプラ
スチックに３時間乃至７日間付着させるようにした。細
胞をすすぎ落し、残りの付着してている細胞全数を付着
していない細胞数と比較した。代表的な結果を第３表に
示す。 D.内皮細胞を使った生育の測定 下記のようにして修飾した上記のプラスチック表面を
細胞が生育して覆う時に、開始時から次の方法で細胞の
生育を追跡した。細胞因子０乃至500μｇを含む生物適
合性剤溶液を１乃至6cmの長さの表面を濃度勾配をつけ
て被覆した。細胞を組織からトリプシンまたはなにかプ
ロテイナーゼを使って取るという処理は行わなかった。
この組織を勾配の低い方の開始点に置いて印をつけた。
室温で15分間組織を落ちつかせ、生育培地をプラスチッ
ク上を湿めって覆うように加えた。すべての手順は無菌
的に行った。次いで、プレートを５％CO2インキュベイ
ター中、37℃でインキュベートした。生育を２週間また
はプラスチックの長さが完全に覆われるまで毎日測定し
た。第３表に示したように、処理した表面上の生育を非
処理対照の表面と比較した。すべての材料をすすぎ、永
久走査電顕観察のために染色した。 これらの結果は、生育因子のフィブロネクチン（FN）
およびコラーゲン（COL）をプラスチック表面に共有的
に付着させると、プラスチックのウシ内皮細胞への生物
適合性が改善されることを示した。細胞がプラスチック
表面で生育した距離で示されるように、細胞は対照表面
より修飾表面に優先的に付着した。 6.イン ビボ（生体内）試験 この試験のために２匹の条件付けしたイヌ準備した。
GORE-TEX（強化伸展ポリテトラフルオロエチレン、ダブ
リュー．エル．ゴア アンド アソシエイツ、インコー
ポレイテッド（W.L.Gore and Associates,Inc.）の商標
付製品）の小片をFN,ANP-EAC-FN（吸着および光カップ
リング）、ANP-EAC-FN（吸着のみ）およびPBS対照によ
り前被覆した。試験はブラインド試験で行った。グラフ
トは文字によって標識されているが、外科のチームはど
のグラフトが修飾表面で、どれが対照かを知らない。各
イヌの左右の腸骨動脈に２個の6mm×5cmのGORE-TEX片を
移植した。グラフトをイヌの中で１ケ月（30日）間放置
した。ヒトでの移植手順を模倣するために、抗炎症剤ペ
ルソンチン（Persontine）およびアスピリン（Aspiri
n）をイヌに与えた。 両対照グラフト（PBSとFN）は開いていて十分な口径
を持っていた。吻合線はそのままで、内部表面は滑らか
であった。対照グラフトについては内皮化は不十分であ
った。有意な血栓の証拠はみられなかった。ANP-EAC-FN
が結合した両グラフト（光カップリングと吸着のみ）に
血栓はなく、内皮化は完全で、グラフト内部表面は平滑
で輝いて見えた。 実施例２ コンタクトレンズおよび眼内レンズ移植物の表面の修飾 本実施例の実験においては、化学的連結基に結合した
親水性ポリマー（生物適合性剤）の調製、コンタクトレ
ンズ表面への基の光カップリング、および非処理レンズ
と比較したこれらレンズへの人工涙液からのインビトロ
での蛋白の沈着測定を行った。生物適合性剤の角膜片と
のインビトロでの適合性およびインビボでのウサギ眼内
での適合性を知る実験を行い、レンズへの毒性または刺
激性反応がないことを確かめた。 1.化学的連結基への生物適合性剤の結合 A.光標識ポリエチレングリコールの調製 分子量1000（PEG-1000）と4000（PEG-4000）のポリエ
チレングリコールを、本明細書に参考文献で取り入れた
「キムラ、及びエス．レーゲン、ジャーナル オブ オ
ーガニック ケミストリー48巻、195頁（1983年）（Kim
ura,and S.Regen,Journal of Organic Chemistry 48:19
5（1983））」の相輸送法の修飾法により、フルオロニ
トロアジドベンゼン（FNAB）で標識した。要約すると、
４−アジド−２−ニトロフェニルポリエチレングリコー
ル（ANP-PEG）の相輸送合成では、60％水酸化カリウム
水溶液（「KOH」）／トルエンとFNABおよびPEGを混合
し、抽出して下記のように薄膜クロマトグラフィー（TL
C）精製を行う。 ANP-PEG-1000 ANP-PEG-1000は0.05mmole PEG-1000を5mlの60％KOHお
よび0.5mmole FNAB、10mlのトルエンに加えて調製し
た。この反応混液を室温で16時間、急速に攪拌した。生
成物を有機溶媒層から分離した。クロロホルム／メタノ
ール／H2O／酢酸または水酸化アンモニウム、85/15/1/1
でのTLCにより、非標識PEGからANP-PEG-1000のモノ−お
よびジ−置換誘導体を分離した。ANP-PEG-1000に相当す
るバンド（低いRf値）をシリカゲルからTLC溶媒で抽出
し、残存の酸または塩基を除くために共沸蒸溜した。最
絡生成物は水に可溶で、出発物質PEGの30-40％がANP-PE
G-1000に転換した。 ANP-PEG-4000 ANP-PEG-4000を、反応中にすべての試薬を溶液中に止
まらせつつ50℃で反応混液を急速に攪拌すること以外
は、上記と同じ方法で調製した。ANP-PEG-4000-OHの収
率は10％であった。 B.光標識ジエファミンの調製 ポリオキシプロピレンポリアミンおよびポリオキシエ
チレンポリアミン（ジエファミン（Jeffamines）と呼
ぶ。ジエファーソン ケミカル カンパニー、インコー
ポレイテッド（Jefferson Chemical Co.,Inc.）の商
標）を、これらポリマーにANP-EACA,BBAおよびnBBAのＮ
−オキシスクシンイミド（「NOS」）エステルをカップ
リングすることによって光標識した。これらのNOS−誘
導体を0.5×量で１×量ジエファミンに高度に脱水した
（高純度）溶媒中で加えた（ANP-EAC-NOSは脱水テトラ
ヒドロフラン中、BBA-NOSは脱水ジオキサンまたはジメ
チルホルムアミド中、ニトロBBA-NOSは脱水ジオキサン
またはジメチルホルムアミド中）。暗黒下、室温で16時
間反応させた後、生成物をクロロホルム／メタノール／
H2O／酢酸、85/15/1/1のTLCで分離した。モノ置換ジエ
ファミン誘導体をTLC溶媒で抽出し、水と共沸蒸溜して
残存する酢酸を除いた。水溶性生成物ANP-EAC−ジエフ
ァミン、BBA−ジエファミン、およびnBBA−ジエファミ
ンをそれぞれ15％、10％および12％の収率で分離した。 C.ANP−ヒアルウロン酸の調製 ヒト胎盤ヒアルウロン酸（見かけの分子量100-130,00
0）の末端糖を、イー．ジャノウイッツ及びエス．イ
ー．チャーム「蛋白固定化およびアフィニティークロマ
トグラフィーのための酸化多糖の誘導」ビオキミカ エ
ビオフィジカ アクタ428巻、157-165頁（1976年）
（E.Junowicz and S.E.Charm,“The Derivation of Oxi
dized Polysaccharides for Protein Immobilization a
nd Affinity Chromatography",Biochimica et Biophysi
ca Acta Vol.428:157-165（1976））に記載され、本明
細書に参考文献とした、過ヨウ素酸法によって活性化し
た。この方法では、このように末端の糖を活性化してい
るヒアルウロン酸溶液に過ヨウ素酸ナトリウムまたはカ
リウムを加えることを伴う。ヒアルウロン酸を10倍量の
ジエファミンに加え、室温で４時間反応させる。シアノ
水素化ホウ素ナトリウムで還元することによって連結を
安定化させ、十分に透析して過剰のジエファミンを除去
した。DMFに溶解した10倍モルのANP-EAC-NOSを、0.1M炭
酸塩、pH9.0に溶解したジエファミンに注射器で加え
た。この添加は16時間かけて暗黒下、室温で行った。過
剰のANP-EAC-NOSとANP-EAC-ジエファミンをゲル濾過ク
ロマトグラフィーによって除いた。コンタクトレンズポ
リマー骨格への基の光カップリングに必要なアジド基の
組込みはANP基を検出するために赤外吸収分光法で分析
し、ジエファミンスペーサーを検出するためにポリエチ
レングリコール分析を、また誘導体のウロン酸含量を定
量するために、ここに参考文献として挙げるティー．ビ
ター及びエイチ．ミュアー、アナリティカル バイオケ
ミストリー４巻、330-334頁（1962年）（T.Bitter and
H Muir,Analytical Biochemistry Vol.4:330-334（196
2））に記載された修正カルバゾール分析を行った。 ポリエチレングリコール分析はドラゴンドルフ試薬で
検出した（テトラヨウドビスマス酸−塩化バリウム）。
貯蔵試薬（酢酸と水に425mg硝酸ビスマス、10gヨードカ
リウムを溶解）5mlを10％塩化バリウム水溶液10mlに加
え、516nmでバックグランウンドを読む。次いで、0.1ml
の試料を加え、キュベットを逆転させて内味を混合し、
１分間のインキュベイション後に516nmで読みとった。
値を標準曲線と比較した。 カルバゾール分析は以下のように行った：硫酸試薬
（硫酸中に0.025M四ホウ酸ナトリウム−10H2O）3.0mlを
−70℃に冷却した。これに試料0.5mlを乗せ、混合物を
室温になるまで攪拌した（30分間）。試験管を100℃に
加熱し（10分間）、カルバゾール試薬（無水エタノール
中に0.125％カルバゾール）0.1mlを加えて内容物を混合
した（５分間）。100℃に加熱した後、氷浴で室温に冷
却した。硫酸試薬をブランクとして試料を530nmで分光
法分析した。結果を４−40μg/mlグルクロノラクトン標
準でつくった標準曲線と比較した。この分析はヒアルウ
ロン酸20pmoleを検出できる感度を持っていた。１個のA
NP、１個のジエファミンおよび１個のヒアルウロン酸分
子を持つ画分を集め、生物適合性剤として使用した。 D.光標識ヒアルウロン酸、メチルセルロースおよび硫酸
コンドロイチン ANP-EAC−ジエファミン、BBA−ジエファミンおよびニ
トロ−BBA−ジエファミンをヒアルウロン酸および硫酸
コンドロイチンのウロン酸残基のカルボキシル基にカル
ボジイミドを使って以下の方法により連結した。５モル
過剰の光標識ジエファミンと１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミドをHClと共に多
糖ポリマーと、0.1NHClでpH4.5に調節した水中で混合し
た。混合物を暗黒下、室温で24時間反応させた。生成物
をゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、光基と炭水化
物含量を上記のようにして分析した。 E.光標識したコラーゲンの調製 ヒト胎盤IV型コラーゲン（シグマ ファーマシューテ
ィカルズ（Sigma Pharmaceuticals）から入手）を0.1M
ホウ酸塩、pM9.0に1mg/mlの濃度で溶解した。DMFに溶解
したANP-EAC-NOS、ジオキサンに溶解したBBA−サルファ
ーNOSまたはジオキサンに溶解したニトロBBA-NOSをコラ
ーゲン溶液に50×モル過剰にして、暗黒下、４℃で注射
器により16時間かけてゆっくりと加えた。完全に添加し
た後、混合物を冷却して４時間攪拌した。コラーゲン生
成物をPBSを４回交換して透析した後、遠心分離して不
溶物を除去した。上清を260nm、280nmおよび462nmで分
光法的に測定して光基／蛋白比を分析した。 F.光標識プロティナーゼの調製 有機溶媒に25mg/mlの濃度に溶解したANP-EAC-NOS,BBA
-NOSおよびnBBA-NOS光基を50モル過剰にしてパパイン
（パパヤ、分子量23,426）に対し、暗黒下、４℃で注射
器をつかって16時間かけて加えた。光基の添加終了後、
混合物を更に４時間攪拌し、次いでPDSに透析してカッ
プリングしていない光基を除去した。上清を250nm、280
nm、および462nmで分光法的に測定して光基／蛋白比を
分析した。 2.レンズ表面に対する生物適合性剤の光カップリング 上記のようにして得られた光標識生物適合性剤を第４
表記載のコンタクトレンズ材料に250-1000pmole/コンタ
クトレンズの濃度で加えた。溶液をコンタクトレンズ上
に暗黒下、室温で３時間吸着させた。次いで光標識剤を
適当な波長で（ANPでは450nm、BBAおよびnBBA誘導体で
は320nm）12時間、光分解によってプラスチックに共有
結合させた。光分解後、コンタクトレンズを５×5mlの
正常な食塩液（0.85％NaCl）で洗浄して共有結合してい
ない基を除去した。 放射性標識基をレンズ材料にカップリングし、レンズ
片をテトラヒドロフラン、次いでDMSOで処理して放射性
標識を固体表面から放出させることができる。シンチレ
イション剤を加え、液体シンチレイション分光法により
生物適合性剤／cm2を測定した。代表的な結果を第４表
に示す。 ソフスピン（Sofspin）コンタクトは水分約38.6％を
持つポリマコン（ポリメタクリレート）でつくられ、パ
ウシュ アンド ロン、インコーポレイテッド（Bausch
＆ Lomb,Inc.）の商標付製品である。 パーマフレックス（Permaflex）コンタクトは水分約7
4％を持つポリメタクリレートがらつくられ、コーパー
ビジョン、インコーポレーテッド（Coopervision,In
c.）の商標付製品である。 ビスタマーク（Vistamarc）コンタクトは水分約58％
を持つポリメタクリレートからつくられ、ジョンソン
アンド ジョンソン（Johnson ＆ Johnson）の商標付製
品である。 リドフィルコン（Lidofilcon）コンタクトは水分約70
％を持つポリメタクリレートからつくられ、バウシュ
アンド ロン、インコーポレイテッド（Bausch ＆ Lom
b,Inc.）の製品である。 第４表の値は平方センチメートル表面積当たりのpmol
e生物適合性剤またはng/cm2で表わされている。 カップリング効率は260pmole/cm2生物適合性剤／コン
タクトレンズ材料、710pmole/cm2生物適合性剤／シリコ
ン、および660pmole/cm2／生物適合性剤／cm3ポリマコ
ン ボタンの添加に基く。ANP−ヒアルウロネートはシ
リコンに対し357pmole/cm2およびポリマコン ボタンに
対し1655pmole/cm3で加えた。ハイドロゲルコンタクト
レンズ材料に対しnBBA−ジェフよりANP−誘導体の方が
高い負荷密度でカップリングした。この結果はシリコン
化合物では逆になった。 3.インビトロ（試験管内）吸着試験 人工ヒト涙液を、ここに参考文献としたビー．ピー．
グルア、「涙装置」、アドラーの眼の生理学：臨床応用
（アール．エイ．モーゼス編）、シー．ブイ．モスビー
カンパニー、セントルイス ミズリー（1981年）（B.
P.Gloor,“The Lacrimal Apparatus"in Adlev′s Physi
logy of the Eye : Clinical Applications （R.A.Mose
s,ed.）,C.V.Mosby Co.,Sf.Louis,Mo（1981））に記載
されている配合に従って調製した。この文献に示されて
いるように、ヒトの涙に存在する主要蛋白は血清アルブ
ミン（HSA）、ガンマグロブリン（HGG）およびリゾチー
ム（LYZ）である。ヒトの涙に存在する主要なステロー
ルはコレステロールとコレステロールエステルである。 A.3H蛋白質 蛋白成分を、ここに参考文献としたエヌ．ジェントフ
ト及びディー．シー．ディアボーン、ジャーナル オブ
バイオケミストリー254巻4359-4365頁（1979年）（N.
Jentoft and D.C.Dearborn、Journal of Biochemistry
Vol.254:4359-4365（1979））に記載されているように
ホルムアルデヒドおよびトリチウム標識された水素化ホ
ウ素ナトリウムで還元的にメチル化してトリチュウム標
識した。要約すると0.1M HEPES、pH7.4に1mg/ml濃度に
溶解した生物適合性剤をトリチウム標識された水素化ホ
ウ素ナトリウムと反応させ、22℃で２時間ゆり動かしつ
つ、ホルムアルデヒドによりメチル化した。生成物を0.
01Mリン酸塩、0.15M塩化ナトリウム、pH7.4のPBSに対し
て透析し、ゼラチンセファローズを使った親和クロマト
グラフィーで精製した。結合した剤を1M臭化ナトリウ
ム、0.02M酢酸ナトリウム、pH5.0で溶出し、PBS、pH7.4
に対して透析した。 B.人工涙液の調製 上記の放射性標識蛋白質を人工涙液の調製に使用し
た。放射性標識した蛋白質の１種またはトリチュウム標
識されたコレステロールを各人工涙液混液に含ませた。
他の成分は放射性標識されていない。コンタクトレンズ
材料を人工涙液中に37℃で１週間、ゆるやかにゆすりな
がらインキュベートした。終了後、レンズ材料を0.85％
NaClの５×10mlで洗浄した。次いで、レンズ材料に吸着
した蛋白質の量を液体シンチレイション測定で分析し
た。 インビトロ蛋白沈着の結果を第５表に示す。全蛋白質
沈着の減少はANT-1000-OH修飾ソフスピンレンズで85％
に達した。各生物適合性剤は対照コンタクトレンズ材よ
り高いか、同じレベルであったが、ANP-1000-OH被覆ポ
リマコンボタン、ANP-4000-OH被覆ポリマコンボタンお
よびANP-ヒアルウロネート被覆ポリマコンボタンを除く
すべてのレンズ材料で全体の蛋白量は減少していた。成
績の悪いものはすべてポリマコン材料そのものについて
であり。これはソフスピンレンズのようなポリマコンコ
ンタクトレンズと異なって反応しているようであった。
全体的に見て、これらインビトロ蛋白沈着試験により、
１週間でコンタクトレンズ材料上に人工涙液からおこる
蛋白沈着に有意にあるいは劇的に減少していた。 インビトロのコレステロール沈着試験結果を第６表に
示す。人工涙液中に７日間インキュベイトした後のコレ
ステロール沈着量はポリ塩化ビニルの場合より83％減少
していた。ポリマコンボタン以外のすべての型のコンタ
クトレンズでコレステロール沈着の減少が見られた。こ
の場合もこれらの材料は同じポリマーでつくられたコン
タクトレンズと異なる反応をする。 C.アミノ酸分析 対照および表面修飾したレンズを37℃で１週間、ゆる
やかにゆすりながら人工涙液中でインキュベイトした。
レンズを５×10mlの0.85％NaClで洗浄し、6NHClで加水
分解した後、加水分解物をアミノ酸分析機によって標準
的なアミノ酸分析を行った。対照と表面修飾したレンズ
の全アミノ酸含量をたがいに比較した。全アミノ酸含量
のの減少は蛋白質吸収の減少を示す。 酸水解したコンタクトレンズの全アミノ酸分析を第８
表に示す。これらの結果は全アミノ酸をnmole/mlで示し
ている。これらの結果から、ソフスピン ポリマコンレ
ンズのANP-1000-OH,ANP-4000-OHおよびnBBA−ジェフ修
飾は人工ヒト涙液に７日間インキュベイトした後のレン
ズへの蛋白質沈着を減少させることが明らかになった。 4.インビトロ毒性試験 上記の生物適合性レンズ材料について刺激性または毒
性反応を調べた。対照および生物適合性レンズをラミナ
ー フロー（層状流）フード内で最終洗浄を行って無菌
的に調製した。レンズを、10％仔ウシ胎仔血清と５％グ
ルタミンを加えたダルベツコ修正エッセンシャル培地
（抗生物質および抗かび剤を添加）のような公知の高グ
ルコース細胞培地の溶液中に置いた。生きている３−５
ケ月令胎仔ウシ角膜をレンズ上に置いた。角膜の上皮表
面をいくつかの試験ではレンズ表面と接触させ、他の試
験では内皮細胞表面をレンズ表面に直接置く。この系を
７−10％CO2培養器内で37℃、１−２週間置いた。培養
開始から種々の時間後に上皮および／または内皮細胞の
生存を染色法で測定した。 5.共有結合の安定性のインビトロ試験 表面修飾したポリマコン（ポリメタクリレート）を酵
素クリーナー（パパイン）、熱殺菌および化学殺菌（塩
化ナトリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸を含む緩
衝化した水溶液）処理することによって共有結合の安定
性を調べた。これらの結果を第８表に示す。 第８表 クリーニング殺菌操作に対する共有結合の安定
性 共有結合は酵素的洗浄と熱殺菌に対して100％安定で
あった。化学殺菌に対して100％安定であった。化学殺
菌に対してANP−ヒアルウロン酸以外は生物適合性剤の
幾分の損失があった。 6.生物適合性剤のインビボ（生体内）試験 予備的なインビボ生物適合性試験をウサギ系で行っ
た。少くとも24匹の動物を各試験に使用した。ウサギの
眼に合うようにデザインした鞏膜レンズをこの試験で使
用した。ウサギには次のスケジュールでレンズを着用さ
せた。 ６匹のウサギ 左眼はレンズなし。右眼に対照のレン
ズ。 ６匹のウサギ 左眼に対照のレンズ。右眼に物理的に処
理したレンズ（表面修飾レンズと同じ物理的処理をした
が、生物適合性剤で被覆していない）。 12匹のウサギ 左眼に対照のレンズ。右眼に表面修飾し
たレンズ。 ウサギの眼にレンズを装着する前に、ケラタミン／キ
シラジンによりウサギを麻酔した。メチルセルロース／
正常食塩液湿潤液を１時間毎に与えて眼とレンズの適当
な潤滑性を保った。コンタクトレンズを８時間／日装着
させた。適当な時間、レンズ着用後、スリットランプと
螢光染料法でウサギを検査した。眼刺激の程度を、参考
文献としたティー．オウ．マクドナルド及びジェイ．エ
イ．シャダック、「眼刺激」、アドバンシズ イン モ
ダン トキシコロジー ４巻162-166頁（1977年）（T.
O.McDonald and J.A.Shadduck,“Eye lrritation,"in A
dvances in Modern Toxicology,Vol.4,pp 162-166（197
7））に記載されているマクドナルド−シャダック（McD
onald−Shadduck）スケールによってグレード付を行っ
た。マクドナルド−シャダック法では、結膜充血、結膜
肥厚、眼脂、水性発赤、虹彩異常および角膜混濁および
その他の病状を０−４のスケールでグレード付けし、そ
の際、０は正常、＋４が異常が最高とした。 インビボのウサギ試験結果を第９表に示す。ウサギに
ついてのマクドナルド−シャダックスコアを表に示し
た。これらの結果についてマン−ホイットニー（Mann-W
hituey）Ｕ検定を行い、表面修飾および対照レンズ間に
統計学的に有意差が認められなかった（Ｐ＜0.05）。 したがって、これらの検定から、このウサギにおける
４日間の試験で、表面修飾レンズの結膜充血、結膜肥
厚、眼脂、水性発赤、虹彩異常、角膜混濁、パンヌス血
管新生、上皮由来損傷は対照レンズに比較して差は認め
られないことが明らかになった。対照および修飾レンズ
で見られた刺激はウサギのコンタクトレンズへの耐性発
現と関連しているようであった。 第９表 インビボのウサギ試験におけるマクドナルド−
シャダック法の平均スコア ポリウレタンチューブへのアルブミン、ヘパリンおよび
ウロキナーゼのカップリング 1.光標識アルブミンの調製 血清アルブミン（イヌ）を0.1Mホウ酸緩衝液、pH9.0
％に溶解した。DMFに25mg/mlに溶解した４−アジド−２
−ニトロフェニル−６−アミノカプロイル−Ｎ−オキシ
スクシンイミド（ANP-EAC-NOS）溶液をアルブミンに対
してANP-EAC-NOSが10倍モル過剰になるような量を、暗
黒下、室温で攪拌しつつ注射器で12時間かけてアルブミ
ンに加えた。次いでこの溶液を暗黒下、１のリン酸緩
衝化食塩液（PBS）に対しての透析を３回行った。透析
後、溶液を遠心分離して不溶物質を除去した。1/100に
希釈して470nmでの吸収を分光学的に測定してANP/アル
ブミン比を測定した。 2.ポリウレタンチューブへのアルブミンの光カップリン
グ ポリウレタンチューブをジオキサンに30秒間浸漬し、
直ちに脱イオン水ですすいだ。このエッチングしたチュ
ーブを暗黒下、室温で攪拌しつつ少なくとも２時間、光
反応性アルブミン溶液に浸漬した。次いで、チューブを
暗黒下で少くとも10分間、風乾し、次いで少くとも１時
間、強烈な可視光線に露光した。光反応性アルブミンへ
の浸漬、乾燥および光反応を２回繰返し、最後は浸漬を
一夜行う。次いでチューブを室温で１時間、1.0N NaCl
で洗浄した。NaCl溶液は１時間の間に少くとも１回交換
した。 3.ポリウレタンチューブ上のアルブミンへのヘパリンの
カップリング アルブミン−ポリウレタンチューブを脱イオン水5.0m
lに浸漬した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド（EDC）200mgを水に溶解し、
pHを1NHClで4.0に調整した。ヘパリン30mgを含む水1ml
をEDC溶液に加えpHを再び1NHClで4.0に調整した。浸漬
したポリウレタンチューブを含む溶液を室温で２時間攪
拌し、その後、更にEDCを200mgを加えた。反応を室温で
一夜、続け、次いでチューブをPBS中ですすぎ、カップ
リングしていないヘパリンと反応副生成物を除去した。 4.ポリウレタンチューブ上のアルブミンへのウロキナー
ゼのカップリング 血清アルブミンを固定化したポリウレタンチューブを
0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0に溶解した1.25％グルタルア
ルデヒドに室温で15-18時間浸漬した。次いで、チュー
ブを脱イオン水中で30分間洗浄し、その間、少くとも一
回水を交換した。ポリウレタン−アルブミン−グルタル
アルデヒドを次に0.1Mホウ酸緩衝液、pH9.0に溶解した
ウロキナーゼ溶液（8.3units/ml、２−3mg/ml）に浸漬
し、４℃で一夜攪拌した。チューブをPBSで４時間すす
ぎ、その後、ウロキナーゼ活性を測定した。 ポリウレタンとポリヘマの二種のポリマーを固体表面
として使用した。修飾表面は１−10mgヘパリン／cm2、
0.6-1.3mgウロキナーゼ／cm2を持っていた。 実施例４ 固体表面へのフィルムのカップリング 被覆フィルムの形成と表面へのその共有結合 ANP−ヒアルウロン酸の調製 ヒアルウロン酸の光標識誘導体（ANP-EAC-ジェファミ
ン、BBA−ジェファミンおよびニトロBBA−ジェファミ
ン）を前述のようにして調製した。 光反応性被覆材からフィルムをつくり、暗黒下にコン
タクトレンズの表面上に置く（浸漬して乾燥による）。
生体用材表面への共有結合および分子間架橋によるフィ
ルムの強化を照明によって行った。 もうひとつの実施例において、人工股関節をANP-EAC
−ジェファミン−ヒアルウロン酸（0.1:1mg/ml）に暗黒
下で３時間浸漬した。これを溶液から取り出し、乾燥し
て人工関節上に被覆材料の薄いフィルムを形成させた。
次いで、フィルムを関節に対し、４℃で８時間、400乃
至450nmで照明を当てて共有結合させた。次に、関節を
生理食塩液ですすいで未カップリングのANP-EAC−ジェ
ファミン−ヒアルウロン酸を除去した。骨に結合したヒ
アルウロン酸は摩擦を低減し、関節領域での骨の磨耗を
減らす。 ウシ血清アルブミン100mgを2mlの0.1Mホウ酸緩衝液、
pH9に溶解した。ANP-AUD-NOS 14mgを50μｌのジメチル
ホルムアミド（DMF）に溶解し、このANP-AUD-NOS溶液を
BSA溶液に対し、暗黒下、室温で十分攪拌しながら15時
間かけてゆっくりと加えた。更に３乃至４時間攪拌した
後、溶液を0.1Mホウ酸緩衝液pH9に対し暗黒下で24時間
透析し、この間少くとも４回、各2lの緩衝液を交換し
た。透析したANP-BSAを暗黒下でパラフィンフィルム上
にピペットで100μｌ置き、乾燥させた、フィルムが乾
燥した後、ホウ酸緩衝液、pH9中の1.25％グルタルアル
デヒド100μｇを重ねて載せ、暗黒下、室温で１時間イ
ンキュベイトした。次いでフィルムをパラフィンフィル
ム上で水をゆっくりと滴下して洗浄し、水を流してお
く。この洗浄を１時間行った後、フィルムを再乾燥し
て、注意深くパラフィンフィルムからフィルムを持ち上
げ、プラスチック表面に移す（例えばポリウレタン）。
プラスチック表面上で、フィルムを再び20％ジオキサン
含有水で湿らせ、暗黒下で再乾燥した。プラスチック表
面上のフィルムを４℃で４時間、強烈な可視光線に露光
してフィルムを表面に結合させるが、この間表面の過熱
を防ぐためにファンで通気した。 本発明の望ましい実施態様を記載したが、本発明の主
旨、特許請求の範囲から離れることなしに、種々の変
更、適応および修飾を行うことができることを銘記すべ
きである。
物適合性の強化に関する。 発明の背景 代用血管、合成物の眼内レンズ、電極、カテーテルそ
の他のような生体用材の体内および体表への移植は急速
に発展している医学の分野である。合成の血管用グラフ
ト（移植片）のような生体用材移植物を長期間使用する
際の第一の障害は満足すべきグラフト表面を持たないこ
とである。例えば、プラスチック製の合成血管の非処理
表面は、急速な血栓形成作用を刺激することが多い。種
種の血漿蛋白質はプラスチック表面において血小板およ
びフイプリン沈着を起こさせる。このような作用が血流
障害となる血管圧縮につながり、それに引き続く炎症反
応が合成移植物の機能を失わせることにつながる。 「生体用材」（バイオマテリアル）とは、実際上、体
液に不溶で、体内または体表面に置くか、体液と接触さ
せるように設計され、つくられた機材を云う。血管グラ
フトおよびコンタクトレンズが生体用材の例である。 理想的には、生体用材は次のような性質を持つ。 1.凝血、組織死、腫瘍形成、アレルギー反応、異物反応
（拒否反応）または炎症反応のような、体内での望まし
くない反応を誘導しない。 2.目的通りに機能するために要求される、強度、弾性、
透過性および柔軟性のような物理的性質を持つ。 3.容易に精製、製造および滅菌できる。 4.1時間であれ一生涯であれ、体内に移植され、または
体と接触している間は、その物理的性質および機能を実
際上保っている。 生物体に対し、正味で有益な効果を与えつつ生物体の
生物学的液体および／または組織と接触して機能し、存
在し得るならば、ここに使ったように、その生体用材の
固体表面は「生物適合性」としての性質を持つ。宿主生
物にとっての妨害を低減するために長期の生物適合性が
望まれる。 移植物体の生物適合性を改善するため多くの解決法が
提案されてきた。ひとつの解決法は、望ましくない蛋白
質の付着を防ぐために生体用材に低分極性表面、負荷電
表面または酵素、内皮細胞や蛋白質のような生物学的物
質によって被覆した表面を与えることによって、生体用
材の表面を修飾することであった。固体表面をヘパリ
ン、アルブミンおよびストレプトキナーゼのような生化
学材で被覆して血栓耐性を強化した。特にアルブミンは
ポリマー表面に物理的に吸着され、静電的および共有的
に結合される。 アメリカ特許第4,530,974号明細書においてマンロー
等（Munro et al）は、アルブミンが選択的に結合する
非イオン性疎水性脂肪族鎖を表面に共有結合させること
により、ポリウレタンのような水不溶性ポリマーにアル
ブミンを吸着させる方法を発表している。 アメリカ特許第4,378,224号明細書においてニンニ等
（Nimni et al）は、補綴物をつくるために使用される
動物組織を、主としてカルシウム化阻害剤からなる三次
元架橋マトリックスを形成させることにより被覆する方
法を示している。 生体用材の存在で起る副作用の一例はコンタクトレン
ズ上への蛋白質の沈着である。コンタクトレンズ装着者
は時間が経つにつれてコンタクトレンズに対してしばし
ば我慢ができなくなる。これは装着している間にレンズ
上に沈着した生化学物質（蛋白質、脂質、ムコ多糖その
他）に対する刺激およびアレルギー反応と結びついてい
る。現在行われている洗浄および消毒法でこれらの沈着
物をある程度除去できるが、これらの方法はしばしばレ
ンズに穴やひびを残し、それが装着者の眼への刺激を更
に加えたり、一層生化学物質沈着の中心になったりす
る。 アメリカ特許第3,959,078号明細書においてガイア（G
uire）はアミノエチルセルロースまたはアルキルアミン
ガラスに酵素を共有結合する試薬を使用することを記載
している。下記のものも参照。ガイア（Guire）、酵素
安定化および固定化のための段階的熱光化学的架橋；エ
ンザイム エンジニアリング３巻63-70頁（1978年）（E
nzyme Engineering 3:63-70（1978））およびガイア（G
uire）、酵素および他の生化学物質の光化学的固定化、
メソーズ イン エンザイモロジーXL IV巻、280-288
頁（1976年）（Methods in Enzymology XL IV:280-288
（1976））。固体表面に連結試薬を熱化学的にカップリ
ングさせ、次いでこの連結試薬に酵素を光化学的にカッ
プリングさせることにより、調節した孔を持つガラス、
セルロース、アガロースおよびポリアクリルアミドのよ
うな基質に酵素を共有的に結合させて体外診断分析を行
う際に有用な表面をつくる方法がこれらの文献に記載さ
れている。 発明の要約 本発明は望ましい生物適合性表面を与えられた生体用
材に関する。生体用材の固体表面を修飾する方法には、
生物適合性剤の分子と、活性化することにより固体表面
に共有結合することができる光化学反応性基および活性
化することにより生物適合性剤の離れた分子に共有結合
することができる別に反応性基を持つ化学的連結性基の
分子を使用する。これらの基の一方は他方の基が応答す
る刺激による活性化に対して応答しない。本方法は、刺
激を加えて基を順次活性化し、連結基の上記の別の反応
性基を生物適合性剤の分子に共有結合させ、次いで生物
適合性剤の分子が固体表面を効果的に覆いつくすに十分
な表面密度を持たせて固体表面に連結基を光化学的に共
有結合させることにより、生物適合性の効果ある表面を
得ることを特徴とする。 生物適合性の「効果ある」表面は、連結基を介して生
体用材の固体表面に共有結合的に連結されて、生物適合
性剤が持っているものと実質的に同じ生物適合性の性質
を持つ表面を得るようにした、生物適合性剤の複数の分
離した分子から形成されている。生物適合性剤の分子に
よって形成された効果ある表面は生体用材の全表面を覆
う必要はない。表面を点で覆ってよい。例えば、血管グ
ラフトの表面に沿った点をフィブロネクチンのような細
胞付着因子で被覆してよい。このような点で形成された
生物適性の効果ある表面はこの修飾した表面への細胞付
着の中心として働く。 連結基の別の反応性基は、最初に述べた光化学的な反
応性基が応答する刺激に応答せず、生物適合性剤が共有
結合する熱化学的基または光化学的基であることが望ま
しい。 本発明のもうひとつの実施態様として、化学的連結基
残基で器具の固体表面に共有的に連結された生物適合性
剤の離れた分子で形成された、生物適合性の効果ある表
面を持つ器具を得ることである。化学的連結基残基に
は、固体表面に共有的に結合された光化学的反応性基の
残基、および、生物適合性剤の分子に共有結合された別
の反応基の残基で、その反応基はもうひとつの反応基が
応答する刺激に応答しない反応基のひとつであるものを
含む。生物適合剤の個々の分子は、たがいに十分に近づ
いて固体表面を効果的に覆い、生物適合性の効果ある表
面となるように、固体表面に連結基残基を介して付着し
ている。 生物適合性剤はそれぞれの器具の機能を高めるような
ものを選択する。例えば、コンタクトレンズの機能は、
ポリエチレングリコール分子をレンズ表面に付着させて
表面へ蛋白質の沈着を低減することで高められる。もう
ひとつの例としては、フイブロネクチンまたはラミニン
のような細胞付着因子をポリ塩化ビニル表面を持つ器具
に結合させて器具への細胞付着を増加させる。これはカ
テーテルや付用血管のような移植物の場合に望ましい。 更に、もうひとつの本発明の実施態様に、生物適合性
剤をたがいに結びつけて生物適合性のフィルムとした生
物適合性剤の分子と、生体用材の固体表面にこのフィル
ムを連結することができる化学的連結基を使用する、生
体用材の固体表面を修飾する方法が含まれる。この化学
的連結基には、活性化によって固体表面に共有結合され
得る光化学反応性基、およびフィルムに共有結合された
（例えば、フィルムをつくっている生物適合性剤の残基
に共有結合された）反応基の残基が含まれる。反応基の
ひとつは他の反応基が応答する刺激に応答しない。この
方法には光化学的反応基を刺激で活性化して生物適合性
分子を共有結合させることが含まれる。本明細書で「結
びつける」ということは、隣接した生物適合性剤分子を
共有結合させるだけでなく、水素結合、イオン結合、フ
ァンデルバール力による結合その他のような力により引
起される相互作用を云う。 たがいに結びつけられてフィルムを形成した分子を持
つ生物適合性剤は、一種の剤の分子でもよいし、ヘパリ
ンとアルブミンのような二種以上の剤の分子でもよい。 望ましい実施態様の説明 本発明の生物適合性を示す固体表面は生理的液体に不
溶の合成または天然の材料が望ましい。その表面は、生
きている生物の組織および／または液体に接触して機能
するよう意図された器具のひとつ以上の表面であってよ
い。器具の固体表面は研磨されたチタンまたはステンレ
ススチールのようないかなる好適な金属、またはポリウ
レタン、ポリビニルピロリドン、シリコンエラストマ
ー、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ
−（ｐ−フェニレンテレフタルアミノード）、ポリ塩化
ビニル、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリエステ
ル、ポリアクリレート（ポリメタクリレートを含む）の
ようなポリマー；ヒドロキシアパタイトのようなミネラ
ルまたはセラミックス；骨、皮ふおよび歯のような人の
組織；木材、セルロースおよび圧縮炭素のような有機材
料；およびガラス、ゴム、木材のような他の天然および
合成の材料であってよい。本発明の生物適合性表面を持
った器具の例は、血管グラフトチューブ、透析チューブ
または膜、血液オキシジェネイターチューブまたは膜、
限外過膜、大動脈内バルーン、血液バック、カテーテ
ル、縫合糸、軟質または硬質組織補綴、合成補綴、人工
器官、およびコンタクトおよび眼内レンズのような眼の
ためのレンズである。 固体表面は熱化学的に反応性のないものが望ましい。
「熱化学的に反応性のない」とは熱化学的に反応する表
面の能力を高めるために考えられたいかなる表面処理も
さていないという意味である。熱化学的に反応性のない
表面の例はポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロ
リドン、シリコンエラストマー、ステンレススチールお
よびチタンである。 生物適合性剤の分子を生体用材の表面に付着させて生
物適合性を改善する。生物適合性剤は、内皮細胞増殖因
子、造骨細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板誘
導増殖因子、神経生長因子、または脈管形成生長因子の
ような増殖因子；ライソザイムまたはペニシリンのよう
な抗菌剤；ヘパリン、アルブミン、ストレプトキナー
ゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子（TPA）またはウ
ロキナーゼのような抗血栓形成剤；コラーゲンのような
血栓形成剤またはポリエチレングリコール、ヒアルウロ
ン酸、キトサンまたはメチルセルロース、その他の蛋白
質、炭水化物、脂肪酸のような親水性ポリマーである。
生物適合性剤は上記の剤の一種の剤の分子であってもよ
いし、二種以上の剤の分子であってもよい。例えば、生
物適合性剤はアルブミンとヘパリン両方を含んでいてよ
い。 ひとつの実施態様において、生物適合性材料をたがい
に結びつけてフィルムとし、それを連結基により固体表
面に付着させる。生物適合性剤はヒアルウロン酸または
アルブミンが望ましい。フィルムを付着させた生物適合
性器具としてフィルムまたはヒアルウロン酸で被覆され
た人工股関節が挙げられる。 化学的連結基は、次式： Ａ−Ｘ−Ｂ （式中、 Ａは特別の活性化に応答して固体表面に共有的に結合
できる光化学的反応性基を表わし； ＢはＡで表わされる基が応答しない特別の活性化に応
答して生物適合性剤と共有結合を形成することができる
別の反応性基を表わし、 ＸはＡおよびＢで表わされる両基を結び合わせる相対
的に不活性で非妨害性の骨格基で、水性の生理的液体中
で分解されにくいものを表わす） で表わされることが望ましい。 この生理的液体とはＸが接触するであろう液体を云
う。 Ｘはポリメチレンのような炭素原子数１乃至10のアル
キル基、ポリメチロールのような炭水化物、ポリエチレ
ングリコールのようなポリオキシエチレン、またはポリ
リジンのようなポリペプチドであることが望ましい。 Ｂで表わされる反応性基は好適な活性化により蛋白性
またはその他の生物適合性剤と共有結合する基である。
典型的なこのような基は、本明細書で参照文献として示
したガイア（Guire）、アメリカ特許第3,959,078号明細
書に記載し例示されているような、熱化学的基および光
化学的基である。 光化学的反応性基（Ａ）（活性照射により活性化され
て共有結合）は、アリール、アルキルおよびアシルアジ
ド、オキサジデイン、イソシアネート（ニトレン生成
剤）、アルキルおよび２−ケトジアゾ誘導体およびジア
ジリン（カルペン生成剤）、芳香族ケトン（トリプレッ
ト酸素生成剤）、芳香族ジアゾニウム誘導体およびカル
ボニウムイオンおよびラジカル生成剤の多くの群で代表
される。参照文献であるフレデリックジェイ．ダーフラ
ー アンド アンドルー エム．トメツコ、ケミストリ
ー アンド バイオケミストリー オブ アミノアシッ
ズ、ペプタイズ アンド プロテインズ（ボリス ワイ
ンスタイン編）５巻、マーセル デッカー、インコーポ
レイテッド．ニューヨーク1978年の２章（Frederick J.
Darfler and Andrew M.Tometsko、chapter 2 of Chemis
try and Biochemistry of Aminoacids、Peptides and P
roteins（Borris Weinstain、ed.）vol.5、Marcel Dekk
er、Inc.New York、1978）に光化学的反応性基について
更に記載されている。暗黒下での化学反応条件に安定で
あり、ほとんどの生体用材に無害の波長の光による活性
化に応答して、生体用材のほとんどの部位について有用
である収率で共有結合を形成できる短寿命の反応性中間
体を形成できることから、アジドニトニフェニル、フル
オロアジドニトロベンゼンおよび芳香族ケトンが望まし
い基を形成する。 ニトロフェニルアジド誘導体（Ｘで表わされる基を含
むとして示される）は、大部分の光化学的反応性基がフ
ルオロ−２−ニトロ−４−アジドベンゼンから誘導され
るので使用するのに適当であり、４−アジド−２−ニト
ロフェニル（ANP）−４−アミノ−ブチリール、ANP−６
−アミノカプロイル、ANP−11−アミノウンデカノイ
ル、ANP−グリシル、ANP−アミノプロピル、ANP−メル
カプトエチルアミノ、ANP−ジアミノヘキシル、ANP−ジ
アミノプロピル、およびANP−ポリエチレングリコール
が含まれる。ANP−６−アミノカプロイル、ANP−11−ア
ミノウンデカノイル、およびANP−ポリエチレングリコ
ールが望ましい。光化学的反応性基として使用するに望
ましい芳香族ケトンにベンジルベンゾイルおよびニトロ
ベンジルベンゾイルが含まれる。 熱化学的反応性基（熱エネルギーで活性化される）は
ニトロフェニルハライド、アルキルアミノ、アルキルカ
ルボキシル、アルキルチオール、アルキルアルデヒド、
アルキルメチルイミデート、アルキルイソシアネート、
アルキルイソチオシアネートおよびアルキルハライド基
が代表的なもので、これらが含まれる。 熱化学的反応性基として使用するに適当な基にはカル
ボキシル基、ヒドロキシル基、第一アミノ基、チオール
基、マレイミドおよびハライド基が含まれる。６−アミ
ノヘキサン酸およびアミノウンデカン酸のような基のＮ
−オキシスクシンイミドカルボン酸エステル、メルカプ
トスクシニックアンヒドリドおよびβ−メルカプトプロ
ピオン酸、ホモシステインチオラクトン、およびポリエ
チレングリコール誘導体が望ましい。 本発明の器具は生物適合性剤の分子および化学的連結
基残基を含む生物適合性固体表面を持っている。化学的
連結基残基は、固体表面に結合された光化学的反応性基
の残基並びに生物適合性剤に共有結合された別の基の残
基を持っている。光化学的反応性基の残基は一般式にお
いて「Ａ」で表わされる光反応性基（前述）の一部で、
共有結合形成後も残っている。光反応基がANPで固体基
質がポリエチレンの時、その残基は炭素−窒素結合であ
る。ANPが光活性化されて形成されたニトレンはポリエ
チレンの炭素と反応して共有結合を形成する。光反応性
基がBBAで固体基質がポリエチレンである時、残基は炭
素−炭素結合である。BBAが光で刺激されると、２個の
フェニル基を結び合わせている炭素が活性化されてトリ
プレット状態となり、炭素−炭素結合をポリエチレンと
BBAの間に形成し、ヒドロキシル基を形成する。別の反
応性基（「Ｂ」）がNOSである場合、その残基はフィブ
ロネクチンのような生物適合性剤の酸素または窒素基に
結合された基のカルボキシル炭素である。 生物適合性剤として使用する酵素、細胞付着因子およ
びある種の他の物質はやゝ高温に感受性であるため、本
発明に使用する連結基上の別の反応性基は、中程度の熱
（例えば体温またはそれ以下）および光のような容易に
適用できて無害の刺激によって活性化（すなわち、それ
に応答して共有結合を生ずる）されることが望ましい。
光化学的反応性基が応答する刺激に応答しない反応性基
は、pH変化、またはもうひとつの化学分子種その他の添
加に反応する基である。 化学的連結基は、固体表面を遮蔽して生物適合性の効
果ある表面をつくり得るような密度で、表面に共有結合
することが望ましい。効果ある表面をつくるに必要な結
合化学基の密度は使用する生物適合性剤によって変る。 本発明は以下の非限定的な実施例を参照することによ
り理解が深かまる。第１表は以下の記載に使用した用語
の略記の表である。 実施例１ 内皮細胞付着／生育 1.プラスチック表面 種々の細胞因子をインビトロで（試験管で）試験する
ための重合体表面に結合させ、これらの因子の細胞付着
と過剰生育への効果を測定した。重合体表面としては、
ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリエチレン（PE）、ポリプ
ロピレン（PP）およびポリテトラフルオロエチレン（PT
FE）GORE-TEX（6mmの強化伸展PTFE、ダブリュー．エ
ル．ゴア アンド アソシエイツ、インコーポレイテッ
ド（W.L.Gore and Associates,Inc,）の商標付製品）で
あった。試験した市販のチューブはポリエステル（Dacr
on,D,6mmの真直に編んだダクロン ベロア、デュポン
（Dupont）の商標付製品）、シリコンエラストマー（Si
lasticR,S,0.03内径のチューブ、ダウ コーニング（Do
w Corning）の商標付製品）およびポリウレタンであ
る。ポリスチレンプレートを対照として使用した。 2.化学的連結基の調製 これらの実施例に使用した化学的連結基は４−アジド
−２−ニトロフェニルε−アミノカプロン酸（ANP-EAC
A）、４−アジド−２−ニトロフェニル アミノウンデ
カン酸（ANP-AUDA）およびベンゾイル安息香酸（BBA）
のＮ−オキシスクシンイミド（NOS）エステルであっ
た。ANP-EAC-NOSとANP-AUD-NOSは本明細書に参考文献と
して示したピー．ガイア、ディー．フリガーおよびジェ
イ．ホドグソン、「哺乳動物細胞への酵素の光化学的カ
ップリング」、ファーマコロジカル リサーチ コミュ
ニケーションズ、９巻、131-141頁（1977年）（P.Guir
e,D.Fliger and J.Hodgson,“Photochemical Coupling
of Engymes to Mammalian Cells",Pharmacolojical Res
earch Communications,Vol.9,pp131-141（1977））に記
載された方法で調製した。要約すると、フルオロ−２−
ニトロ４−アジドベンゼンをε−アミノカプロン酸また
はアミノウンデカン酸と反応させて比較的反応性の低い
フッ素をアミノアルキルカルボキシル基で置換する。次
いでカルボキシル基をカルボジイミド活性化によりＮ−
ヒドロキシサクシンイミドでエステル化してＮ−オキシ
スクシンイミドカルボン酸エステルを得る。ベンゾイル
安息香酸のNOSエステルはカルボキシル基をカルボジイ
ミド活性化によりＮ−ヒドロキシスクシンイミドでエス
テル化して調製した。 ANP-EAC-NOSまたはANP-AUD-NOSを化学的連結基として
使用した時、ANP基が前述の一般式Ａ−Ｘ−Ｂの「Ａ」
で表わされる光化学的反応性基である。NOS基はこの式
の「Ｂ」で表わされる別の反応性基である。EACまたはA
UD基は２個の反応性基の間でスペーサーとして作用し、
一般式の「Ｘ」で表わされる。 BBA-NOSが化学的連結基である場合には、ベンゾイル
安息香酸基が一般式「Ａ」で表わされる光化学的反応性
基であり、NOS基は「Ｂ」で表わされる別の反応性基で
ある。Ｘで表わされる基は２個の反応性基を結びつける
炭素である。 3.化学的連結基への生長因子の共有結合 生物適合性剤フイブロネクチン、ラミニン、コラーゲ
ン、内皮生育因子、およびヒト血漿アルブミンについて
合成生体用材への内皮細胞付着および過剰増殖を促進で
きるかどうかを試験した。これらの剤を４−アジド−２
−ニトロフェニルε−アミノカプロン酸（ANP-EACA）、
４−アジド−２−ニトロフェニル−ウンデカンアミノ酸
（ANP-AUDA）またはベンゾイル安息香酸（BBA）のＮ−
オキシスクシンイミド（NOS）エステルに次のようにし
てカップリングさせた。ここで使用する「光標識した」
とは別の反応性基によって化学的連結基にカップリング
させて光化学的反応性基を持つ生物適合性剤を云う。 A.連結基へのフイブロネクチンおよびラミニンの共有結
合 ヒトのフイブロネクチン（ウィスコンシン大学医学
部）およびマウスのラミニン（ベセスダ リサーチ ラ
ブBethesda Research Lab.から入手）を別々に0.1Mホウ
酸塩、pH9.0に1mg/mlの濃度で溶解した。脱水したジメ
チルホルムアミド（“DMF"）に溶解したANP-EAC-NOSま
たはANP-AUD-NOSまたは脱水したジオキサンに溶解したB
BA-NOSの溶液をフィブロネクチンまたはラミニン溶液に
対し、蛋白質のε−アミノ基（リジン残基）の濃度に当
モルになるように、暗黒下で16時間かけ、４℃で注射器
を使ってゆっくりと加えた。次いで、その混合物を冷却
しつつ４時間攪拌した。このフイブロネクチンまたはラ
ミニン溶液を遠心分離して不溶物を除き、セファテック
ス（Sephadex）G-75カラムに流して未カップリングの光
反応剤を除いた。画分について光基／蛋白質比を調べる
ため260nmと462nmで追跡した。 B.化学的連結基へのEGF、コラーゲンおよびHSAの共有結
合 ヒト胎盤IV型コラーゲン（シグマ ファーマシューテ
ィカルSigma Pharmaceutical）、内皮生長因子（シグマ
ファーマシューティカルSigma Pharmaceutical）、お
よびヒト血漿アルブミン（シグマ ファーマシューティ
カルSigma Pharmaceutical）を別々に0.1Mホウ酸塩、pH
9.0に2mg/mlの濃度で溶解した。DMFに溶解したANP-EAC-
NOS、DMFに溶解したANP-AUP-NOSまたはシオキサンに溶
解したBBA-NOSの溶液を、ε−アミノ基（リジン）の濃
度に対し5Xモル量で、生物適合性剤を含む溶液に対し
て、注射器を使い４℃で暗黒下、16時間かけてゆっくり
と加えた。次いで、この溶液をリン酸緩衝化食塩水（PB
S）1000mlを４回交換して透析し、不溶物を遠心分離で
除く。生成物について光基／蛋白質比を知るため260n
m、280nmおよび462nmで分析した。 4.プラスチック表面への生物適合性剤の共有結合 ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポ
リウレタン、ダクロン（DacronR）（ベロア）、シラス
チック（SilasticR）（医学用）、およびポリテトラフ
ルオロエチレンの種々のシート、チューブおよび平板片
を使用した。光標識した生物適合性剤０乃至500μg/ml
を含む溶液0.05mlをプラスチック表面各0.5cm2切片に加
える。この溶液を暗黒下、室温で３時間、各片に吸収さ
せた。過剰の液体を除き、適当な波長で（ANPにはタン
グステン「スポットライトSpotlite」およびBBAには長
波長UV）12時間光分解することにより生物適合性剤を表
面に共有結合させた。光分解後、光標識生物適合性剤の
共有結合していない分子を除くために標本片にPBSを４
秒間流して洗浄した。その後、標本片を組織培養中に置
き、下記により細胞因子への内皮細胞の反応を調べた。 5.修飾した表面について行ったインビトロ試験 A.放射性標識生物適合性剤 放射性標識した〔3H〕生物適合性剤を上記のようにし
て光標識し、プラスチック表面に光カップリングした。
このプラスチック表面をPBSで十分に洗浄し、有機溶剤
に溶解して液体シンチレーション分光法で測定した。代
表的な結果を第２表に示す。 これらの結果が示すように光標識生物適合性剤は表面
に共有結合されている。 B.修飾プラスチック表面へのウシ内皮細胞の付着 ウシ内皮細胞は長さ8-24インチの胎仔から集めた。角
膜、大動脈およびへその内皮細胞を無菌的に集めた。細
胞を、25mmole HEPES緩衝液、10％仔ウシ血清および2.5
μｇアンホテリシンB/mlを加えたダルベッコの改良イー
グル培地（アール．ダルベッコおよびジー．フリーマ
ン、バイロロジー８巻.396頁（1959年）（R.Dulbecco a
nd G.Freeman,Virology,Vol.8:396（1959））およびジ
ェイ．ディー．スミス、ジー．フリーマン、エム．ボグ
トおよびアール．ダルベッコ、バイロロジー12巻、185-
196頁（1960年）（J.D.Smith,G.Freeman,M.Vogt and R.
Dulbecco,Virology Vol.12:185-196（1960））に記載）
のような公知の高グルコース細胞生育培地（「生育培
地」）中で、37℃、５％CO2インキュベーターで生育さ
せた。プレート、チューブまたはシートを準備する毎
に、細胞培養は一次培養から調製した。細胞を0.25％ト
リプシン溶液で細胞株から取り、生育培地に再懸濁し
た。次いでトリパンブルー（0.4％）溶液と血球計を使
って細胞数を計測した。種々の濃度の細胞を準備した材
料の上に層状に置いた。細胞の付着を５分から14日間の
種々の時間間隔で追跡した。付着は少くとも２種の方法
で測定した。第一の方法においては、試料材料を培地か
ら離し、殺菌した食塩液で２回洗浄した。次いで細胞染
色を行い、表面上の全細胞数を計測した。第二の方法で
は、トリプシン溶液を使って細胞を表面から離し、トリ
パンブルー法で細胞数を計測した。 予備被覆したポリ塩化ビニルプラスチック上の内皮細
胞の付着および生育について代表的結果を第３表に示
す。各片に付着した生細胞数はトリパンブルー染色法で
測定した。 C.ヒト臍の内皮細胞の付着 一次のヒト内皮細胞を新鮮なヒト臍帯（４日令以前）
から採取した。帯を20mlのコード（cord）緩衝液（0.14
4MNaCl、0.004MKClおよび0.001MPO4）で２回洗浄して血
液および凝固物を除く。コラゲナーゼを帯の中に注入
し、室温で20分間放置した。温コード（cord）緩衝液10
mlを使い、コラゲナーゼと剥離した細胞を試験に噴出さ
せる。試験管内の懸濁液を合わせて、1500rpmで５〜10
分間遠心分離した。上清を捨て、細胞を10mlのコード
（cord）緩衝液に再懸濁した。二回目の遠心分離後、細
胞をコード（cord）緩衝液に再懸濁し、組織培養ディス
クに置いた。すべての細胞を５％CO2を流した37℃のイ
ンキュベイター中でインキュベイトした。細胞は仔ウシ
血清を含まないコード（cord）培地中で51Crを使って放
射性標識した。 この放射標識した細胞を細胞付着試験に使用した。上
記のプラスチックのプレート、シートおよびチューブは
前述の通りに調製した。細胞をトリプシン処理し、トリ
パンブルー法で細胞数を測定した。細胞を調製したプラ
スチックに３時間乃至７日間付着させるようにした。細
胞をすすぎ落し、残りの付着してている細胞全数を付着
していない細胞数と比較した。代表的な結果を第３表に
示す。 D.内皮細胞を使った生育の測定 下記のようにして修飾した上記のプラスチック表面を
細胞が生育して覆う時に、開始時から次の方法で細胞の
生育を追跡した。細胞因子０乃至500μｇを含む生物適
合性剤溶液を１乃至6cmの長さの表面を濃度勾配をつけ
て被覆した。細胞を組織からトリプシンまたはなにかプ
ロテイナーゼを使って取るという処理は行わなかった。
この組織を勾配の低い方の開始点に置いて印をつけた。
室温で15分間組織を落ちつかせ、生育培地をプラスチッ
ク上を湿めって覆うように加えた。すべての手順は無菌
的に行った。次いで、プレートを５％CO2インキュベイ
ター中、37℃でインキュベートした。生育を２週間また
はプラスチックの長さが完全に覆われるまで毎日測定し
た。第３表に示したように、処理した表面上の生育を非
処理対照の表面と比較した。すべての材料をすすぎ、永
久走査電顕観察のために染色した。 これらの結果は、生育因子のフィブロネクチン（FN）
およびコラーゲン（COL）をプラスチック表面に共有的
に付着させると、プラスチックのウシ内皮細胞への生物
適合性が改善されることを示した。細胞がプラスチック
表面で生育した距離で示されるように、細胞は対照表面
より修飾表面に優先的に付着した。 6.イン ビボ（生体内）試験 この試験のために２匹の条件付けしたイヌ準備した。
GORE-TEX（強化伸展ポリテトラフルオロエチレン、ダブ
リュー．エル．ゴア アンド アソシエイツ、インコー
ポレイテッド（W.L.Gore and Associates,Inc.）の商標
付製品）の小片をFN,ANP-EAC-FN（吸着および光カップ
リング）、ANP-EAC-FN（吸着のみ）およびPBS対照によ
り前被覆した。試験はブラインド試験で行った。グラフ
トは文字によって標識されているが、外科のチームはど
のグラフトが修飾表面で、どれが対照かを知らない。各
イヌの左右の腸骨動脈に２個の6mm×5cmのGORE-TEX片を
移植した。グラフトをイヌの中で１ケ月（30日）間放置
した。ヒトでの移植手順を模倣するために、抗炎症剤ペ
ルソンチン（Persontine）およびアスピリン（Aspiri
n）をイヌに与えた。 両対照グラフト（PBSとFN）は開いていて十分な口径
を持っていた。吻合線はそのままで、内部表面は滑らか
であった。対照グラフトについては内皮化は不十分であ
った。有意な血栓の証拠はみられなかった。ANP-EAC-FN
が結合した両グラフト（光カップリングと吸着のみ）に
血栓はなく、内皮化は完全で、グラフト内部表面は平滑
で輝いて見えた。 実施例２ コンタクトレンズおよび眼内レンズ移植物の表面の修飾 本実施例の実験においては、化学的連結基に結合した
親水性ポリマー（生物適合性剤）の調製、コンタクトレ
ンズ表面への基の光カップリング、および非処理レンズ
と比較したこれらレンズへの人工涙液からのインビトロ
での蛋白の沈着測定を行った。生物適合性剤の角膜片と
のインビトロでの適合性およびインビボでのウサギ眼内
での適合性を知る実験を行い、レンズへの毒性または刺
激性反応がないことを確かめた。 1.化学的連結基への生物適合性剤の結合 A.光標識ポリエチレングリコールの調製 分子量1000（PEG-1000）と4000（PEG-4000）のポリエ
チレングリコールを、本明細書に参考文献で取り入れた
「キムラ、及びエス．レーゲン、ジャーナル オブ オ
ーガニック ケミストリー48巻、195頁（1983年）（Kim
ura,and S.Regen,Journal of Organic Chemistry 48:19
5（1983））」の相輸送法の修飾法により、フルオロニ
トロアジドベンゼン（FNAB）で標識した。要約すると、
４−アジド−２−ニトロフェニルポリエチレングリコー
ル（ANP-PEG）の相輸送合成では、60％水酸化カリウム
水溶液（「KOH」）／トルエンとFNABおよびPEGを混合
し、抽出して下記のように薄膜クロマトグラフィー（TL
C）精製を行う。 ANP-PEG-1000 ANP-PEG-1000は0.05mmole PEG-1000を5mlの60％KOHお
よび0.5mmole FNAB、10mlのトルエンに加えて調製し
た。この反応混液を室温で16時間、急速に攪拌した。生
成物を有機溶媒層から分離した。クロロホルム／メタノ
ール／H2O／酢酸または水酸化アンモニウム、85/15/1/1
でのTLCにより、非標識PEGからANP-PEG-1000のモノ−お
よびジ−置換誘導体を分離した。ANP-PEG-1000に相当す
るバンド（低いRf値）をシリカゲルからTLC溶媒で抽出
し、残存の酸または塩基を除くために共沸蒸溜した。最
絡生成物は水に可溶で、出発物質PEGの30-40％がANP-PE
G-1000に転換した。 ANP-PEG-4000 ANP-PEG-4000を、反応中にすべての試薬を溶液中に止
まらせつつ50℃で反応混液を急速に攪拌すること以外
は、上記と同じ方法で調製した。ANP-PEG-4000-OHの収
率は10％であった。 B.光標識ジエファミンの調製 ポリオキシプロピレンポリアミンおよびポリオキシエ
チレンポリアミン（ジエファミン（Jeffamines）と呼
ぶ。ジエファーソン ケミカル カンパニー、インコー
ポレイテッド（Jefferson Chemical Co.,Inc.）の商
標）を、これらポリマーにANP-EACA,BBAおよびnBBAのＮ
−オキシスクシンイミド（「NOS」）エステルをカップ
リングすることによって光標識した。これらのNOS−誘
導体を0.5×量で１×量ジエファミンに高度に脱水した
（高純度）溶媒中で加えた（ANP-EAC-NOSは脱水テトラ
ヒドロフラン中、BBA-NOSは脱水ジオキサンまたはジメ
チルホルムアミド中、ニトロBBA-NOSは脱水ジオキサン
またはジメチルホルムアミド中）。暗黒下、室温で16時
間反応させた後、生成物をクロロホルム／メタノール／
H2O／酢酸、85/15/1/1のTLCで分離した。モノ置換ジエ
ファミン誘導体をTLC溶媒で抽出し、水と共沸蒸溜して
残存する酢酸を除いた。水溶性生成物ANP-EAC−ジエフ
ァミン、BBA−ジエファミン、およびnBBA−ジエファミ
ンをそれぞれ15％、10％および12％の収率で分離した。 C.ANP−ヒアルウロン酸の調製 ヒト胎盤ヒアルウロン酸（見かけの分子量100-130,00
0）の末端糖を、イー．ジャノウイッツ及びエス．イ
ー．チャーム「蛋白固定化およびアフィニティークロマ
トグラフィーのための酸化多糖の誘導」ビオキミカ エ
ビオフィジカ アクタ428巻、157-165頁（1976年）
（E.Junowicz and S.E.Charm,“The Derivation of Oxi
dized Polysaccharides for Protein Immobilization a
nd Affinity Chromatography",Biochimica et Biophysi
ca Acta Vol.428:157-165（1976））に記載され、本明
細書に参考文献とした、過ヨウ素酸法によって活性化し
た。この方法では、このように末端の糖を活性化してい
るヒアルウロン酸溶液に過ヨウ素酸ナトリウムまたはカ
リウムを加えることを伴う。ヒアルウロン酸を10倍量の
ジエファミンに加え、室温で４時間反応させる。シアノ
水素化ホウ素ナトリウムで還元することによって連結を
安定化させ、十分に透析して過剰のジエファミンを除去
した。DMFに溶解した10倍モルのANP-EAC-NOSを、0.1M炭
酸塩、pH9.0に溶解したジエファミンに注射器で加え
た。この添加は16時間かけて暗黒下、室温で行った。過
剰のANP-EAC-NOSとANP-EAC-ジエファミンをゲル濾過ク
ロマトグラフィーによって除いた。コンタクトレンズポ
リマー骨格への基の光カップリングに必要なアジド基の
組込みはANP基を検出するために赤外吸収分光法で分析
し、ジエファミンスペーサーを検出するためにポリエチ
レングリコール分析を、また誘導体のウロン酸含量を定
量するために、ここに参考文献として挙げるティー．ビ
ター及びエイチ．ミュアー、アナリティカル バイオケ
ミストリー４巻、330-334頁（1962年）（T.Bitter and
H Muir,Analytical Biochemistry Vol.4:330-334（196
2））に記載された修正カルバゾール分析を行った。 ポリエチレングリコール分析はドラゴンドルフ試薬で
検出した（テトラヨウドビスマス酸−塩化バリウム）。
貯蔵試薬（酢酸と水に425mg硝酸ビスマス、10gヨードカ
リウムを溶解）5mlを10％塩化バリウム水溶液10mlに加
え、516nmでバックグランウンドを読む。次いで、0.1ml
の試料を加え、キュベットを逆転させて内味を混合し、
１分間のインキュベイション後に516nmで読みとった。
値を標準曲線と比較した。 カルバゾール分析は以下のように行った：硫酸試薬
（硫酸中に0.025M四ホウ酸ナトリウム−10H2O）3.0mlを
−70℃に冷却した。これに試料0.5mlを乗せ、混合物を
室温になるまで攪拌した（30分間）。試験管を100℃に
加熱し（10分間）、カルバゾール試薬（無水エタノール
中に0.125％カルバゾール）0.1mlを加えて内容物を混合
した（５分間）。100℃に加熱した後、氷浴で室温に冷
却した。硫酸試薬をブランクとして試料を530nmで分光
法分析した。結果を４−40μg/mlグルクロノラクトン標
準でつくった標準曲線と比較した。この分析はヒアルウ
ロン酸20pmoleを検出できる感度を持っていた。１個のA
NP、１個のジエファミンおよび１個のヒアルウロン酸分
子を持つ画分を集め、生物適合性剤として使用した。 D.光標識ヒアルウロン酸、メチルセルロースおよび硫酸
コンドロイチン ANP-EAC−ジエファミン、BBA−ジエファミンおよびニ
トロ−BBA−ジエファミンをヒアルウロン酸および硫酸
コンドロイチンのウロン酸残基のカルボキシル基にカル
ボジイミドを使って以下の方法により連結した。５モル
過剰の光標識ジエファミンと１−エチル−３−（３−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミドをHClと共に多
糖ポリマーと、0.1NHClでpH4.5に調節した水中で混合し
た。混合物を暗黒下、室温で24時間反応させた。生成物
をゲル濾過クロマトグラフィーで精製し、光基と炭水化
物含量を上記のようにして分析した。 E.光標識したコラーゲンの調製 ヒト胎盤IV型コラーゲン（シグマ ファーマシューテ
ィカルズ（Sigma Pharmaceuticals）から入手）を0.1M
ホウ酸塩、pM9.0に1mg/mlの濃度で溶解した。DMFに溶解
したANP-EAC-NOS、ジオキサンに溶解したBBA−サルファ
ーNOSまたはジオキサンに溶解したニトロBBA-NOSをコラ
ーゲン溶液に50×モル過剰にして、暗黒下、４℃で注射
器により16時間かけてゆっくりと加えた。完全に添加し
た後、混合物を冷却して４時間攪拌した。コラーゲン生
成物をPBSを４回交換して透析した後、遠心分離して不
溶物を除去した。上清を260nm、280nmおよび462nmで分
光法的に測定して光基／蛋白比を分析した。 F.光標識プロティナーゼの調製 有機溶媒に25mg/mlの濃度に溶解したANP-EAC-NOS,BBA
-NOSおよびnBBA-NOS光基を50モル過剰にしてパパイン
（パパヤ、分子量23,426）に対し、暗黒下、４℃で注射
器をつかって16時間かけて加えた。光基の添加終了後、
混合物を更に４時間攪拌し、次いでPDSに透析してカッ
プリングしていない光基を除去した。上清を250nm、280
nm、および462nmで分光法的に測定して光基／蛋白比を
分析した。 2.レンズ表面に対する生物適合性剤の光カップリング 上記のようにして得られた光標識生物適合性剤を第４
表記載のコンタクトレンズ材料に250-1000pmole/コンタ
クトレンズの濃度で加えた。溶液をコンタクトレンズ上
に暗黒下、室温で３時間吸着させた。次いで光標識剤を
適当な波長で（ANPでは450nm、BBAおよびnBBA誘導体で
は320nm）12時間、光分解によってプラスチックに共有
結合させた。光分解後、コンタクトレンズを５×5mlの
正常な食塩液（0.85％NaCl）で洗浄して共有結合してい
ない基を除去した。 放射性標識基をレンズ材料にカップリングし、レンズ
片をテトラヒドロフラン、次いでDMSOで処理して放射性
標識を固体表面から放出させることができる。シンチレ
イション剤を加え、液体シンチレイション分光法により
生物適合性剤／cm2を測定した。代表的な結果を第４表
に示す。 ソフスピン（Sofspin）コンタクトは水分約38.6％を
持つポリマコン（ポリメタクリレート）でつくられ、パ
ウシュ アンド ロン、インコーポレイテッド（Bausch
＆ Lomb,Inc.）の商標付製品である。 パーマフレックス（Permaflex）コンタクトは水分約7
4％を持つポリメタクリレートがらつくられ、コーパー
ビジョン、インコーポレーテッド（Coopervision,In
c.）の商標付製品である。 ビスタマーク（Vistamarc）コンタクトは水分約58％
を持つポリメタクリレートからつくられ、ジョンソン
アンド ジョンソン（Johnson ＆ Johnson）の商標付製
品である。 リドフィルコン（Lidofilcon）コンタクトは水分約70
％を持つポリメタクリレートからつくられ、バウシュ
アンド ロン、インコーポレイテッド（Bausch ＆ Lom
b,Inc.）の製品である。 第４表の値は平方センチメートル表面積当たりのpmol
e生物適合性剤またはng/cm2で表わされている。 カップリング効率は260pmole/cm2生物適合性剤／コン
タクトレンズ材料、710pmole/cm2生物適合性剤／シリコ
ン、および660pmole/cm2／生物適合性剤／cm3ポリマコ
ン ボタンの添加に基く。ANP−ヒアルウロネートはシ
リコンに対し357pmole/cm2およびポリマコン ボタンに
対し1655pmole/cm3で加えた。ハイドロゲルコンタクト
レンズ材料に対しnBBA−ジェフよりANP−誘導体の方が
高い負荷密度でカップリングした。この結果はシリコン
化合物では逆になった。 3.インビトロ（試験管内）吸着試験 人工ヒト涙液を、ここに参考文献としたビー．ピー．
グルア、「涙装置」、アドラーの眼の生理学：臨床応用
（アール．エイ．モーゼス編）、シー．ブイ．モスビー
カンパニー、セントルイス ミズリー（1981年）（B.
P.Gloor,“The Lacrimal Apparatus"in Adlev′s Physi
logy of the Eye : Clinical Applications （R.A.Mose
s,ed.）,C.V.Mosby Co.,Sf.Louis,Mo（1981））に記載
されている配合に従って調製した。この文献に示されて
いるように、ヒトの涙に存在する主要蛋白は血清アルブ
ミン（HSA）、ガンマグロブリン（HGG）およびリゾチー
ム（LYZ）である。ヒトの涙に存在する主要なステロー
ルはコレステロールとコレステロールエステルである。 A.3H蛋白質 蛋白成分を、ここに参考文献としたエヌ．ジェントフ
ト及びディー．シー．ディアボーン、ジャーナル オブ
バイオケミストリー254巻4359-4365頁（1979年）（N.
Jentoft and D.C.Dearborn、Journal of Biochemistry
Vol.254:4359-4365（1979））に記載されているように
ホルムアルデヒドおよびトリチウム標識された水素化ホ
ウ素ナトリウムで還元的にメチル化してトリチュウム標
識した。要約すると0.1M HEPES、pH7.4に1mg/ml濃度に
溶解した生物適合性剤をトリチウム標識された水素化ホ
ウ素ナトリウムと反応させ、22℃で２時間ゆり動かしつ
つ、ホルムアルデヒドによりメチル化した。生成物を0.
01Mリン酸塩、0.15M塩化ナトリウム、pH7.4のPBSに対し
て透析し、ゼラチンセファローズを使った親和クロマト
グラフィーで精製した。結合した剤を1M臭化ナトリウ
ム、0.02M酢酸ナトリウム、pH5.0で溶出し、PBS、pH7.4
に対して透析した。 B.人工涙液の調製 上記の放射性標識蛋白質を人工涙液の調製に使用し
た。放射性標識した蛋白質の１種またはトリチュウム標
識されたコレステロールを各人工涙液混液に含ませた。
他の成分は放射性標識されていない。コンタクトレンズ
材料を人工涙液中に37℃で１週間、ゆるやかにゆすりな
がらインキュベートした。終了後、レンズ材料を0.85％
NaClの５×10mlで洗浄した。次いで、レンズ材料に吸着
した蛋白質の量を液体シンチレイション測定で分析し
た。 インビトロ蛋白沈着の結果を第５表に示す。全蛋白質
沈着の減少はANT-1000-OH修飾ソフスピンレンズで85％
に達した。各生物適合性剤は対照コンタクトレンズ材よ
り高いか、同じレベルであったが、ANP-1000-OH被覆ポ
リマコンボタン、ANP-4000-OH被覆ポリマコンボタンお
よびANP-ヒアルウロネート被覆ポリマコンボタンを除く
すべてのレンズ材料で全体の蛋白量は減少していた。成
績の悪いものはすべてポリマコン材料そのものについて
であり。これはソフスピンレンズのようなポリマコンコ
ンタクトレンズと異なって反応しているようであった。
全体的に見て、これらインビトロ蛋白沈着試験により、
１週間でコンタクトレンズ材料上に人工涙液からおこる
蛋白沈着に有意にあるいは劇的に減少していた。 インビトロのコレステロール沈着試験結果を第６表に
示す。人工涙液中に７日間インキュベイトした後のコレ
ステロール沈着量はポリ塩化ビニルの場合より83％減少
していた。ポリマコンボタン以外のすべての型のコンタ
クトレンズでコレステロール沈着の減少が見られた。こ
の場合もこれらの材料は同じポリマーでつくられたコン
タクトレンズと異なる反応をする。 C.アミノ酸分析 対照および表面修飾したレンズを37℃で１週間、ゆる
やかにゆすりながら人工涙液中でインキュベイトした。
レンズを５×10mlの0.85％NaClで洗浄し、6NHClで加水
分解した後、加水分解物をアミノ酸分析機によって標準
的なアミノ酸分析を行った。対照と表面修飾したレンズ
の全アミノ酸含量をたがいに比較した。全アミノ酸含量
のの減少は蛋白質吸収の減少を示す。 酸水解したコンタクトレンズの全アミノ酸分析を第８
表に示す。これらの結果は全アミノ酸をnmole/mlで示し
ている。これらの結果から、ソフスピン ポリマコンレ
ンズのANP-1000-OH,ANP-4000-OHおよびnBBA−ジェフ修
飾は人工ヒト涙液に７日間インキュベイトした後のレン
ズへの蛋白質沈着を減少させることが明らかになった。 4.インビトロ毒性試験 上記の生物適合性レンズ材料について刺激性または毒
性反応を調べた。対照および生物適合性レンズをラミナ
ー フロー（層状流）フード内で最終洗浄を行って無菌
的に調製した。レンズを、10％仔ウシ胎仔血清と５％グ
ルタミンを加えたダルベツコ修正エッセンシャル培地
（抗生物質および抗かび剤を添加）のような公知の高グ
ルコース細胞培地の溶液中に置いた。生きている３−５
ケ月令胎仔ウシ角膜をレンズ上に置いた。角膜の上皮表
面をいくつかの試験ではレンズ表面と接触させ、他の試
験では内皮細胞表面をレンズ表面に直接置く。この系を
７−10％CO2培養器内で37℃、１−２週間置いた。培養
開始から種々の時間後に上皮および／または内皮細胞の
生存を染色法で測定した。 5.共有結合の安定性のインビトロ試験 表面修飾したポリマコン（ポリメタクリレート）を酵
素クリーナー（パパイン）、熱殺菌および化学殺菌（塩
化ナトリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸を含む緩
衝化した水溶液）処理することによって共有結合の安定
性を調べた。これらの結果を第８表に示す。 第８表 クリーニング殺菌操作に対する共有結合の安定
性 共有結合は酵素的洗浄と熱殺菌に対して100％安定で
あった。化学殺菌に対して100％安定であった。化学殺
菌に対してANP−ヒアルウロン酸以外は生物適合性剤の
幾分の損失があった。 6.生物適合性剤のインビボ（生体内）試験 予備的なインビボ生物適合性試験をウサギ系で行っ
た。少くとも24匹の動物を各試験に使用した。ウサギの
眼に合うようにデザインした鞏膜レンズをこの試験で使
用した。ウサギには次のスケジュールでレンズを着用さ
せた。 ６匹のウサギ 左眼はレンズなし。右眼に対照のレン
ズ。 ６匹のウサギ 左眼に対照のレンズ。右眼に物理的に処
理したレンズ（表面修飾レンズと同じ物理的処理をした
が、生物適合性剤で被覆していない）。 12匹のウサギ 左眼に対照のレンズ。右眼に表面修飾し
たレンズ。 ウサギの眼にレンズを装着する前に、ケラタミン／キ
シラジンによりウサギを麻酔した。メチルセルロース／
正常食塩液湿潤液を１時間毎に与えて眼とレンズの適当
な潤滑性を保った。コンタクトレンズを８時間／日装着
させた。適当な時間、レンズ着用後、スリットランプと
螢光染料法でウサギを検査した。眼刺激の程度を、参考
文献としたティー．オウ．マクドナルド及びジェイ．エ
イ．シャダック、「眼刺激」、アドバンシズ イン モ
ダン トキシコロジー ４巻162-166頁（1977年）（T.
O.McDonald and J.A.Shadduck,“Eye lrritation,"in A
dvances in Modern Toxicology,Vol.4,pp 162-166（197
7））に記載されているマクドナルド−シャダック（McD
onald−Shadduck）スケールによってグレード付を行っ
た。マクドナルド−シャダック法では、結膜充血、結膜
肥厚、眼脂、水性発赤、虹彩異常および角膜混濁および
その他の病状を０−４のスケールでグレード付けし、そ
の際、０は正常、＋４が異常が最高とした。 インビボのウサギ試験結果を第９表に示す。ウサギに
ついてのマクドナルド−シャダックスコアを表に示し
た。これらの結果についてマン−ホイットニー（Mann-W
hituey）Ｕ検定を行い、表面修飾および対照レンズ間に
統計学的に有意差が認められなかった（Ｐ＜0.05）。 したがって、これらの検定から、このウサギにおける
４日間の試験で、表面修飾レンズの結膜充血、結膜肥
厚、眼脂、水性発赤、虹彩異常、角膜混濁、パンヌス血
管新生、上皮由来損傷は対照レンズに比較して差は認め
られないことが明らかになった。対照および修飾レンズ
で見られた刺激はウサギのコンタクトレンズへの耐性発
現と関連しているようであった。 第９表 インビボのウサギ試験におけるマクドナルド−
シャダック法の平均スコア ポリウレタンチューブへのアルブミン、ヘパリンおよび
ウロキナーゼのカップリング 1.光標識アルブミンの調製 血清アルブミン（イヌ）を0.1Mホウ酸緩衝液、pH9.0
％に溶解した。DMFに25mg/mlに溶解した４−アジド−２
−ニトロフェニル−６−アミノカプロイル−Ｎ−オキシ
スクシンイミド（ANP-EAC-NOS）溶液をアルブミンに対
してANP-EAC-NOSが10倍モル過剰になるような量を、暗
黒下、室温で攪拌しつつ注射器で12時間かけてアルブミ
ンに加えた。次いでこの溶液を暗黒下、１のリン酸緩
衝化食塩液（PBS）に対しての透析を３回行った。透析
後、溶液を遠心分離して不溶物質を除去した。1/100に
希釈して470nmでの吸収を分光学的に測定してANP/アル
ブミン比を測定した。 2.ポリウレタンチューブへのアルブミンの光カップリン
グ ポリウレタンチューブをジオキサンに30秒間浸漬し、
直ちに脱イオン水ですすいだ。このエッチングしたチュ
ーブを暗黒下、室温で攪拌しつつ少なくとも２時間、光
反応性アルブミン溶液に浸漬した。次いで、チューブを
暗黒下で少くとも10分間、風乾し、次いで少くとも１時
間、強烈な可視光線に露光した。光反応性アルブミンへ
の浸漬、乾燥および光反応を２回繰返し、最後は浸漬を
一夜行う。次いでチューブを室温で１時間、1.0N NaCl
で洗浄した。NaCl溶液は１時間の間に少くとも１回交換
した。 3.ポリウレタンチューブ上のアルブミンへのヘパリンの
カップリング アルブミン−ポリウレタンチューブを脱イオン水5.0m
lに浸漬した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ
プロピル）カルボジイミド（EDC）200mgを水に溶解し、
pHを1NHClで4.0に調整した。ヘパリン30mgを含む水1ml
をEDC溶液に加えpHを再び1NHClで4.0に調整した。浸漬
したポリウレタンチューブを含む溶液を室温で２時間攪
拌し、その後、更にEDCを200mgを加えた。反応を室温で
一夜、続け、次いでチューブをPBS中ですすぎ、カップ
リングしていないヘパリンと反応副生成物を除去した。 4.ポリウレタンチューブ上のアルブミンへのウロキナー
ゼのカップリング 血清アルブミンを固定化したポリウレタンチューブを
0.1Mリン酸緩衝液、pH7.0に溶解した1.25％グルタルア
ルデヒドに室温で15-18時間浸漬した。次いで、チュー
ブを脱イオン水中で30分間洗浄し、その間、少くとも一
回水を交換した。ポリウレタン−アルブミン−グルタル
アルデヒドを次に0.1Mホウ酸緩衝液、pH9.0に溶解した
ウロキナーゼ溶液（8.3units/ml、２−3mg/ml）に浸漬
し、４℃で一夜攪拌した。チューブをPBSで４時間すす
ぎ、その後、ウロキナーゼ活性を測定した。 ポリウレタンとポリヘマの二種のポリマーを固体表面
として使用した。修飾表面は１−10mgヘパリン／cm2、
0.6-1.3mgウロキナーゼ／cm2を持っていた。 実施例４ 固体表面へのフィルムのカップリング 被覆フィルムの形成と表面へのその共有結合 ANP−ヒアルウロン酸の調製 ヒアルウロン酸の光標識誘導体（ANP-EAC-ジェファミ
ン、BBA−ジェファミンおよびニトロBBA−ジェファミ
ン）を前述のようにして調製した。 光反応性被覆材からフィルムをつくり、暗黒下にコン
タクトレンズの表面上に置く（浸漬して乾燥による）。
生体用材表面への共有結合および分子間架橋によるフィ
ルムの強化を照明によって行った。 もうひとつの実施例において、人工股関節をANP-EAC
−ジェファミン−ヒアルウロン酸（0.1:1mg/ml）に暗黒
下で３時間浸漬した。これを溶液から取り出し、乾燥し
て人工関節上に被覆材料の薄いフィルムを形成させた。
次いで、フィルムを関節に対し、４℃で８時間、400乃
至450nmで照明を当てて共有結合させた。次に、関節を
生理食塩液ですすいで未カップリングのANP-EAC−ジェ
ファミン−ヒアルウロン酸を除去した。骨に結合したヒ
アルウロン酸は摩擦を低減し、関節領域での骨の磨耗を
減らす。 ウシ血清アルブミン100mgを2mlの0.1Mホウ酸緩衝液、
pH9に溶解した。ANP-AUD-NOS 14mgを50μｌのジメチル
ホルムアミド（DMF）に溶解し、このANP-AUD-NOS溶液を
BSA溶液に対し、暗黒下、室温で十分攪拌しながら15時
間かけてゆっくりと加えた。更に３乃至４時間攪拌した
後、溶液を0.1Mホウ酸緩衝液pH9に対し暗黒下で24時間
透析し、この間少くとも４回、各2lの緩衝液を交換し
た。透析したANP-BSAを暗黒下でパラフィンフィルム上
にピペットで100μｌ置き、乾燥させた、フィルムが乾
燥した後、ホウ酸緩衝液、pH9中の1.25％グルタルアル
デヒド100μｇを重ねて載せ、暗黒下、室温で１時間イ
ンキュベイトした。次いでフィルムをパラフィンフィル
ム上で水をゆっくりと滴下して洗浄し、水を流してお
く。この洗浄を１時間行った後、フィルムを再乾燥し
て、注意深くパラフィンフィルムからフィルムを持ち上
げ、プラスチック表面に移す（例えばポリウレタン）。
プラスチック表面上で、フィルムを再び20％ジオキサン
含有水で湿らせ、暗黒下で再乾燥した。プラスチック表
面上のフィルムを４℃で４時間、強烈な可視光線に露光
してフィルムを表面に結合させるが、この間表面の過熱
を防ぐためにファンで通気した。 本発明の望ましい実施態様を記載したが、本発明の主
旨、特許請求の範囲から離れることなしに、種々の変
更、適応および修飾を行うことができることを銘記すべ
きである。
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．生体用材の固体表面と、生物適合性剤の分子と、活
性化により前記固体表面に共有結合できる光化学的反応
性基および前記生物適合性剤の分子に結合できる別の反
応性基で、一方の基は他方の基が応答する刺激に応答し
ないような基を持つ化学的連結基とを使って生物適合性
表面を持つ生体用材を得る方法であって、 前記連結基の別の反応性基を活性化して、該別の反応性
基を前記生物適合性剤の分子に結合させ、そして 前記連結基の光化学的反応性基を活性化して、該光化学
的反応性基を前記固体表面に共有結合させて前記固体表
面を遮蔽するのに十分な密度の生物適合性剤の分子を与
え、生物適合性の効果のある表面を与えることを特徴と
する、生物適合性表面を持つ生体用材を得る方法。 ２．前記別の反応性基が熱化学的基である請求項１記載
の方法。 ３．前記別の反応性基が光化学的基である請求項１記載
の方法。 ４．前記固体表面が熱化学的に実質的に非反応性である
請求項１記載の方法。 ５．生物適合性剤の分子を持つ固体表面と、該固体表面
に前記生物適合性剤の個々の分子を共有結合する化学的
連結基とを有する生物適合性の生体用材であって、 該化学的連結基は前記固体表面に共有結合される光化学
的反応性基の残基と、生物適合性剤の分子に共有結合さ
れる別の反応性基の残基とを有し、 前記反応性基の一方は他方の反応性基が応答する刺激に
対して非応答性であり、 前記生物適合性剤の個々の分子は、該分子が固体表面を
遮蔽し、生物適合性の効果ある表面が得られるように、
互いに十分に近接している、上記生体用材。 ６．前記固体表面が実質的に熱化学的に非反応性である
請求項５記載の生体用材。 ７．前記生物適合性剤が細胞付着因子である請求項５記
載の生体用材。 ８．前記細胞付着因子がラミニンまたはフィブロネクチ
ンである請求項７記載の生体用材。 ９．前記生物適合性剤が成長因子である請求項５記載の
生体用材。 １０．前記成長因子が内皮成長因子、上皮成長因子、造
骨細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板誘導成長
因子、神経成長因子またはアンジオゲニン成長因子であ
る請求項９記載の生体用材。 １１．前記生物適合性剤がコラーゲンである請求項５記
載の生体用材。 １２．前記生物適合性剤がアルブミンである請求項５記
載の生体用材。 １３．前記固体表面がポリマー材料からなる請求項５記
載の生体用材。 １４．前記ポリマー材料がポリウレタン、ポリビニルピ
ロリドン、ポリアミド、ポリアミン、ポリテトラフルオ
ロエチレン、ポリ（ｐ−フェニレンテレフタルアミ
ド）、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリアクリレ
ート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリ
イミン、ポリエステル、ポリエチレン、セルロースまた
はシリコーンである請求項13記載の生体用材。 １５．前記生体用材が血管グラフトチューブ、透析チュ
ーブまたは膜、血液酸素供給器チューブまたは膜、血液
バッグ、カテーテル、縫合糸、軟質または硬質組織補
綴、合成補綴、人工器官、コンタクトレンズまたは眼内
レンズからなる請求項５記載の生体用材。 １６．前記生体用材がレンズである請求項５記載の生体
用材。 １７．前記レンズがコンタクトレンズであり、前記生物
適合性剤が親水性ポリマーである請求項16記載の生体用
材。 １８．前記親水性ポリマーがポリエチレングリコール、
ヒアルロン酸、メチルセルロース、コラーゲンまたは硫
酸コンドロイチンである請求項17記載の生体用材。 １９．前記生物適合性剤がプロテイナーゼである請求項
16記載の生体用材。 ２０．前記プロテイナーゼがパパインである請求項19記
載の生体用材。
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