DE69030730T2

DE69030730T2 - Oberflächen mit wünschenswerten zellhaftungseffekten

Info

Publication number: DE69030730T2
Application number: DE69030730T
Authority: DE
Inventors: Neil Desai; Jeffrey Hubbell; Stephen Massia
Original assignee: University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas at Austin
Priority date: 1989-09-28
Filing date: 1990-09-27
Publication date: 1998-01-02
Anticipated expiration: 2010-09-28
Also published as: DK0494216T3; DE69030730D1; ATE153064T1; EP0494216B1; CA2066213A1; JPH05502998A; WO1991005036A2; AU646644B2; EP0494216A1; US5330911A; AU6447290A; WO1991005036A3; ES2102366T3

Description

Das Gebiet der vorliegenden Erfindung betrifft allgemein die biospezifische Adhäsion von Zellen an eine Oberfläche. Insbesondere betrifft die Erfindung die chemische Modifizierung einer Oberfläche und die kovalente Anlagerung kleiner Peptide daran zur Förderung der Zelladhäsion. Insbesondere kann auch die Oberfläche eine Keramik, ein Metall oder ein Polymeres umfassen. Die kleinen Peptide umfassen eine minimale Zellrezeptor-Erkennungs-Aminosäuresequenz, die die Zelladhäsion fördert und einer Reihe von Zelladhäsionsmolekülen gemeinsam ist. Die Oberflächen und Verfahren der vorliegenden Erfindung beziehen sich somit auf Zelladhäsionstechniken, die unabhängig sind von der Nährmedien-Serumzusammensetzung und adsorbierten Oberflächenproteinen.
Darüber hinaus bezieht sich das Gebiet der vorliegenden Erfindung auf die Modifizierung polymerer Materialien mittels einer Lösungsverarbeitungstechnik, um die Oberflächen äußerst nichtadhäsiv gegenüber Zellen zu machen. Derartige Oberflächen finden wichtige Anwendungen in der Biomedizin und Biotechnologie. Daneben betrifft das Gebiet die Anlagerung von Zelladhäsionspeptiden an diese nichtadhäsiven Oberflächen, um Oberflächen zu erhalten, die zelladhäsiv sind und den besonderen Vorteil besitzen, daß sie für bestimmte Zelltypen spezifisch adhäsiv sind, jedoch nicht für andere Zelltypen.
Die Wechselwirkung von Zellen mit extracellulärer Matrix in vivo ist bei einer Anzahl wichtiger biologischer Prozesse involviert, wie der Regulation des Zellwachstums, der (Zell-)Migration (Wanderung) und der (Zell-)Differenzierung. Die Rolle der eukaryontischen Zelladhäsion in Kulturen diktiert in großem Maße den Erfolg der Bemühungen oder Anstrengungen bei einer besonderen Zellkultur. Adhäsion, Ausbreitung und Kontraktion auf festen Substanzen sind Voraussetzungen für das Wachstum von normalen, von Verankerung abhängigen Zellen in vitro (1, 2). Diese celluläre Bioadhäsion wird durch mehrere Faktoren beeinflußt, einschließlich des speziellen Zelltyps, der verwendeten Zellnährmedien und der speziellen Oberfläche, auf der die Zellen gezüchtet werden.
Viele Säugerzellen werden auf Polymeroberflächen gezüchtet. Fast die gesamte Adhäsion von Säugerzellen an synthetische Polymeroberflächen wird durch adsorbierte Proteine gesteuert und erfolgt über dazwischengeschobene Rezeptoren. Fibronectin (FN) war das erste Zelladhäsionsmolekül (CAM), von dem gezeigt wurde, daß es bei der Adhäsion einiger Geflügel- und Säugerzelltypen an extracelluläre Substrate involviert ist (3, 4). FN wird üblicherweise der in vitro Umgebung durch die Zugabe von Serum bereitgestellt in einer Form, die als kalt-unlösliches Globulin (Kug) bekannt ist. Es wurde gefunden, daß Kug an die Kulturoberfläche adsorbiert werden muß (5, 6), damit eine normale Anlagerung und ein normales Ausbreiten der Zellen stattfindet.
FN besteht aus mehreren protease-resistenten Domänen, von denen jede spezifische Bindungsstellen für andere extracelluläre Moleküle und für die Zelloberfläche enthält (7). Die Zellanlagerungsaktivität wurde als eine Tripeptidsequenz (RGD) lokalisiert, die in der Zellbindungsdomäne von FN sowie einigen anderen CAMs angeordnet ist (8). Man hat gefunden, daß substratgebundenes RGD-haltiges Peptid, das direkt an das Substrat adsorbiert ist, oder Peptid, das mit adsorbiertem Albumin oder IGG vernetzt ist, Fibroblastenanlagerung und -ausbreitung fördert. Man hat gefunden, daß diese Anlagerungs- und Ausbreitungsaktivität leicht durch die Zugabe löslicher RGDhaltiger Peptide zum Medium inhibiert wird (8).
Eine Affinitätschromatografie von cellulären Extrakten auf die Zellanlagerung fördernden FN-Fragmenten, kombiniert mit einer spezifischen Elution, bei der synthetische RGD-haltige Peptide verwendet werden, ergab einen Rezeptor mit zwei 140 kD-Untereinheiten (9). Der Säuger-FN-Rezeptor und andere RGD-gerichtete Rezeptoren sind typischerweise Heterodimere aus zwei Untereinheiten, Alpha und Beta (10). Familien dieser Rezeptoren bestehen aus Mitgliedern mit ähnlichen Beta-Untereinheiten, während die Alpha-Untereinheiten unterschiedlicher sind und die Affinität des Rezeptors auf ein oder wenige CAMs beschränken (11). Insgesamt sind diese strukturell und funktionell verwandten Rezeptorfamilien als die Integrin-Überfamilie bekannt (12, 13).
Somit hat sich ein grundlegendes Verständnis für die molekularen Mechanismen, die dem Prozeß der Zelladhäsion zugrunde liegen, entwickelt, was die Rolle der Zellkultursubstrate und anderer Oberflächen bei der Förderung der Zelladhäsion anbelangt. Grundsätzlich werden Proteine, nachdem eine Proteinlösung auf ein Nährsubstrat aufgebracht worden ist, sofort an der Oberfläche adsorbiert. Wenn für einige dieser adsorbierten Proteine auf der Zelloberfläche Rezeptoren vorliegen und wenn die Konformation der adsor bierten Proteine durch die Adsorption nicht so eingehend geändert wird, daß die hohe Ligand-Rezeptor-Affinität zerstört wird, dann kann sich eine Zelladhäsion an das Nährsubstrat und ein Zellwachstum bzw. eine Zellausbreitung ergeben.
Wenn die Zellen auf ein Substrat in Abwesenheit von adsorbierten Proteinen ausgesät werden, dann können sich die Proteine auf der Zelloberfläche direkt an der Oberfläche adsorbieren und die Zelle sekretiert, vorausgesetzt es liegen günstige Bedingungen vor, ihre eigenen Proteine zur Oberfläche hin in Form einer extracellulären Matrix. Wenn jedoch das Substrat nicht die Proteinadsorption unterstützt oder wenn es eine hohe Affinitätsadsorption eines Proteins unterstützt, für das kein Zell-Oberflächen-Rezeptor vorhanden ist, dann unterstützt das Substrat nicht die Zelladhäsion. In keinem Fall wurde gefunden, daß die Zelle in Kultur tatsächlich die Oberfläche berührt, außer durch diese adsorbierten Zwischen-Proteine.
Einige Forscher, die kurzfristige Zelladhäsion untersuchen, haben die Verwendung von Substratbehandlungssystemen vorgeschlagen, die die Zelladhäsion fördern, wobei spezifische Peptide auf einer Polymeroberfläche adsorbiert werden. Zum Beispiel haben Singer et al. die Adsorption eines 13-mer Peptids, das die RGD-Sequenz enthält, auf einem Polymersubstrat zur Förderung der Zelladhäsion vorgeschlagen (14). Jedoch hat man gefunden, daß Peptide dieser Länge hochempfindlich gegen Zersetzung bei hohen Temperaturen und gegen die proteolytische Wirkung der gezüchteten Zellen selbst sind. Darüber hinaus sind an einer Oberfläche adsorbierte Peptide einer Desorption bei bzw. nach wiederholter Verwendung ausgesetzt. Somit hat man herausgefunden, daß Oberflächen mit daran absorbierten Peptiden mit langen Aminosäureresten instabil sind und somit bei der Herstellung wiederverwendbarer Zellkultursubstrate bzw. Zellnährsubstrate ungeeignet sind.
Eine alternative Vorgehensweise zur Förderung der Zelladhäsion besteht darin, durch chemische Modifizierung der Oberfläche die Adsorption und Anlagerung von Proteinen und Peptiden an das Substrat zu erleichtern oder fördern. Jedoch ist die derzeitige Technologie zur chemischen Modifizierung von Substraten insbesondere nicht-spezifisch und empirisch. Zum Beispiel wurde die Behandlung von Polymeroberflächen mit verschiedenen Radiofrequenz-Plasmaentladungen, sowohl polymerisierend als auch nicht-polymerisierend, vorgeschlagen. Alternative Näherungsversuche einer Oberflächensäurebehandlung oder die Einverleibung von geladenen Gruppen auf der Oberfläche wurden auch beschrieben. Jedoch ändern diese unterschiedlichen Oberflächenbehandlungen nur das Muster der Proteinadsorption auf der Kulturoberfläche, was wiederum dazu führt, daß das charakteristische Adhäsions- und Ausbreitungsverhalten der Zellen modifiziert wird. Somit bleiben die mit der Protein- und Peptidoberflächenadsorption und -desorption verbundenen Probleme noch bestehen, was die Wiederverwendbarkeit der Nährplatten und anderer derartig behandelter Oberflächen beschränkt.
Eine Alternative zur Oberflächenadsorption von Peptiden zur Förderung der Zelladhäsion bestand darin, statt dessen Peptide an eine Oberfläche chemisch anzulagern. Zum Beispiel wurde das Verfahren der chemischen Modifizierung von Polymeroberflächen von Brandley et al., (1988) (Analyt. Biochem. 172: 270) eingesetzt, die den Einschluß eines 9-mer Peptids in ein Polymersubstrat zur Förderung der Zelladhäsion vorschlugen (Id.). Während unter Verwendung der Brandley-Technik eine erhöhte Zelladhäsion erreicht wurde, erforderte das Verfahren ähnliche Konzentrationen an Peptid, um den gleichen Level an Zelladhäsion zu fördern, der in den Systemen mit adsorbierten Peptiden beobachtet wurde. Zum Beispiel zeigt Fig. 1 von Brandley Oberflächenkonzentrationen an Peptid von im Durchschnitt von etwa 6 Nanomol pro Quadratzentimeter (Brandley, S. 275). Diese hohen Peptidkonzentrationen lassen vermuten, daß das Brandley-Verfahren nicht den Einschluß von Peptiden nur an der Polymeroberfläche steuert, sondern statt dessen den Einbau von Peptid durch den Bulk oder Hauptteil des Polymeren hindurch erlaubt. Geht man davon aus, daß synthetische Peptide etwa $ 5.000 pro Gramm kosten, wurde dieses Verfahren die wirtschaftliche Herstellung von Zellkultursubstraten kommerziell nicht erleichtern.
Somit besteht in der Technik noch ein Bedarf an einem wirtschaftlichen System zur Herstellung thermisch stabiler, peptidbeschichteter Oberflächen mit zelladhäsions-fördernden Eigenschaften, die widerstandsfähig sind gegen die desorptiven Wirkungen wiederholter Verwendung und die Proteolyse durch celluläre Proteasen oder Proteasen, die zur Entfernung der Zellen zugegeben werden. Ein mehr kommerziell machbares und wirtschaftliches System wurde im wesentlichen peptid-effizienter sein als diejenigen, die von Brandley und anderen Fachleuten auf dem Gebiet der Zellkultur- und Polymerchemie vorgeschlagen wurden.
Derzeitig verwendete biomedizinische Polymere in Anwendungen mit Blutkontakt erwiesen sich als nicht ausreichend nicht-thromboseerzeugend, um in Gefäßtransplantaten mit kleinem Durchmesser brauchbar zu sein. Die Adhäsion von Blutplättchen und anderen Blutzellen ist der Hauptgrund fur das geringe Offenbleiben der Transplantate mit kleinem Durchmesser, und ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Reduzierung der Wechselwirkungen von Blutbestandteilen mit biomedizinischen Polymeren. Da die Adhäsion von Blutplättchen, weißen Blutzellen, Fibroblasten etc. durch die Adsorption von Proteinen an der Polymeroberfläche vermittelt wird, wurde eine Vorgehensweise gewählt, die die Wechselwirkung von Proteinen mit diesen Polymeren reduzierte.
Man hat beobachtet, daß Polyethylenoxid (PEO)-Oberflächen der Adsorption von Plasmaproteinen widerstehen als Folge ihrer starken Hydrophilie, Kettenmobilität und dem Mangel an ionischer Ladung. Mehrere Gruppen haben PEO oder PEG (Polyethylenglykol) als Modifizierer in einem Versuch verwendet, um eine biokompatible oder nichtadhäsive Oberfläche zu erhalten. Verschiedene Vorgehensweisen wurden verwendet, um Polymeroberflächem mit PEO zu modifizieren. Darunter sind diejenigen Techniken, die ein kovalentes Pfropfen von PEO auf ein Ausgangspolymeres bzw. Grundpolymeres wie ein PET, ein Polyurethan oder ein Polyvinylalkohol, eine Polymerisation eines Monomeren mit einer hängenden PEO-Kette, eine Einverleibung von PEO in ein Ausgangspolymer durch Blockcopolymerisation oder eine direkte Adsorption von PEO-haltigen grenzflächenaktiven Mitteln, die typischerweise Blockcopolymere vom AB- oder ABA-Typ sind, wobei einer der Blöcke ein PEO ist, umfassen. Die meisten dieser Techniken verwendeten PEO mit relativ niedrigen Molekulargewichten (weniger als 5000 Dalton) und nur wenige verwendeten signifikant höhere Molekulargewichte.
Obwohl einige der oben beschriebenen Techniken annehmbar gut bei der Reduzierung der cellulären Wechselwirkungen an den Oberflächen der modifizierten Polymere arbeiten, erfordern die meisten von ihnen mehrfache Stufen, um die notwendige Oberflächemodifizierung zu erhalten. Darüber hinaus sind sie durch die Struktur und Verfügbarkeit der labilen chemischen Anteile auf der Oberfläche des Ausgangspolymeren beschränkt und in vielen Fällen sind sie spezifisch für die Modifizierung der Ausgangspolymeren.
EP-A 0 278 781 beschreibt Peptide, die kovalent an eine Oberfläche gebunden sind. Diese Peptide wurden auf ihre Eigenschaft zur Zellanlagerung getestet.
Graf et al. (Biochemistry, 1987, 26, S. 6896-6900) zeigen, daß spezifische Peptide nur zur Förderung der Anlagerung von epithelialen Zellen an ein mit einem Peptid derivatisierte Oberfläche geeignet sind.
Yamada et al. (Dialog Information Servia, File 351:WPI, WPI Acc. Nr. 89- 1505g/20 und US-A-7,221,982) offenbaren ein Prolin-Aspartin- bzw. Asparagin-Serin-Glycin-Arginin-Peptid, das als Substrat für alle Anlagerungen für in vitro Anwendungen verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Technik, die PEO und andere wasserlösliche Polymere (WLP) der Oberfläche eines Grundpolymeren bzw. Ausgangspolymeren bzw. Basispolymeren (BP) einverleibt.
Die folgenden Abkürzungen werden von den Anmeldern in der ganzen Anmeldung verwendet:
A = Ala (Alanin)
C = Cys (Cystein)
D = Asp (Asparaginsäure)
E = Glu (Glutaminsäure)
F = Phe (Phenylalanin)
G = Gly (Glycin)
I = Ile (Isoleucin)
K = Lys (Lysin)
P = Pro (Prolin)
R = Arg (Arginin)
S = Ser (Serin)
V = Val (Valin)
Y = Tyr (Tyrosin)
BP = Basispolymer bzw. Ausgangspolymer bzw. Grundpolymer
CAM = celluläres Adhäsionsmolekül
CFN = celluläre Fibronectine
Kug = kaltunlösliches Globulin
EIFW = entionisiertes und gefiltertes Wasser
FK = fokale Kontakte
FEP = fluorierte Ethylenpolymere
fg = fibrinogen
FN = Fibronectin
GREDV = Glycin, Arginin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Valin oder Gly-Arg-Glu-Asp-Val
GRGD = Aminosäuresequenz Glycin, Arginin, Glycin, Asparaginsäure; oder Gly-Arg-Glu-Asp
HVF = Human-Vorhaut-Fibroblastzellen
HGGMZ = Human-Gefäß-Glattmuskel-Zellen
kD = Kilodalton
mer = Aminosäurerest
nm = nanomolar
SAE = Schweine-Aorta-Endotheliale (Zellen)
PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung
PDMS = Poly(dimethylsiloxan)
PEG = Polyethylenglycol
PELL = Polyurethan (Pellethan)
PEO = Polyethylenoxid
PEOX = Polyethyloxazolin
PET = Polyethylenterephthalat
PFN = Plasmafibronectine
PHEMA = Poly(hydroxyethylmethacrylat)
PIPN = physikalisches ineinandergreifendes bzw. interpenetrierendes Netzwerk
Plt = menschliche Blutplättchen
PMMA = Polymethylmethacrylat
Vorstim. Plt = menschliche Blutplättchen, vorstimuliert mit 5 µm Adenosindiphosphat
PTFE = Poly(tetrafluorethylen)
PVP = Polyvinylpyrrolidon
REDV = Arginin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Valin oder Arg-Glu- Asp-Val
RGD = Aminosäuresequenz Arginin, Glycin, Asparaginsäure oder Arg- Gly-Asp
OAM = Oberflächen- (oder Substrat-) Adhäsionsmolekül
TFES = Trifluoressigsäure
THF = Tetrahydrofüran
µg = Microgramm
µl = Microliter
WLP = wasserlösliches Polymer
YIGSR = Tyrosin, Isoleucin, Glycin, Serin, Arginin oder Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg
Die vorliegende Erfindung bringt ein neues Verfahren, durch das Oberflächen modifiziert werden können, um proteolytisch stabile, wiederverwendbare Oberflächen zu erhalten, die das Ausmaß der Zelladhäsion über einen dazwischengeschobenen Zellrezeptor fördern und die Rate davon erhöhen.
Die hierin offenbarten, spezifisch gerichteten und gesteuerten chemischen Prozesse sehen die chemische Anlagerung von Peptiden an der Oberfläche eines Kolbens oder einer anderen Vorrichtung ohne Diffusion des Peptids durch die Masse bzw. den Bulk des behandelten Materials hindurch vor. Somit stellen die offenbarten Verfahren eine Oberfläche bereit, die die überraschend erhöhte Zelladhäsion fördert, unter Verwendung nur einer Fraktion des Peptids, das bei den früher vorgeschlagenen Verfahren erforderlich war. Die Peptide werden chemisch an eine Oberfläche gebunden bzw. angelagert und vermeiden somit Desorptionsprobleme, die Systeme der Vergangenheit mit an der Oberfläche adsorbierten Peptiden plagten. Diese Vorteile werden erreicht durch die chemische Anlagerung von kleinen Peptiden, z.B. denjenigen, die weniger als 12 Aminosäurereste besitzen, an nur der Oberfläche des Substrats.
Ein zusätzliches Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt darin, daß das Verfahren die Verwendung von Zelladhäsions-Molekülfragmenten anstelle von ganzen Oberflächenadhäsionsmolekül (OAM)-Proteinen vorsieht. Die Akronyme OAM und CAM werden austauschbar verwendet, um die Oberflächen-, Substrat- oder Zelladhäsionsmoleküle zu bezeichnen, die Proteine sind, die mit extracellulären Matrixkomponenten über eine spezifische Bindungsdomäne wechselwirken, um die Adhäsion von Zellrezeptoren (d.h. den Zellen) über eine dazwischengeschobene spezifische Domäne zu fördern. OAMs sind eine Familie von Proteinen, die Fibronectin, Vibronectin, Thrombospondin, Laminin und andere Proteine einschließen. Ein Pfropfen kleiner Peptidfragmente bietet einen weiteren Vorteil darin, daß auf diese Weise behandelte Oberflächen weniger anfällig sind für Denaturierung und proteolytische Zersetzung als Oberflächen, die mit ganzen Proteinen oder größeren Peptiden gepfropft sind.
Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß es ein wirksameres Oberflächenmodifizierungssystem bereitstellt. Zum Beispiel sind die Anmelder in der Lage, eine derivatisierte Oberfläche mit maximalen Zelladhäsionseigenschaften zu erzeugen, wobei nur 1/500stel der Menge an Peptid der früher vorgeschlagenen chemischen Pfropfverfahren verwendet wird. Zum Beispiel setzten Brandley et al. ein Verfahren ein, das im Durchschnitt 6 Nanomol/cm² (6.000 Picomol/cm²) Peptidoberflächenkonzentration ergab (Brandley et al., S. 274, Tabelle 1). Im Gegensatz dazu haben die Anmelder eine Erhöhung der Zelladhäsion mit einer Oberflächenpeptidkonzentration von nur 0,001 Nanomol/cm² (eine sechmillionenfache Verbesserung) gezeigt. Die Anmelder waren in der Lage, eine signifikante Menge des Oberflächenpeptids bei dem Verfahren zum chemischen Binden eines Peptids an eine Oberfläche wegzulassen, und waren in der Lage, dies ohne einen Verlust an die Zelladhäsions fördernde Aktivität zu erzielen.
Ein zusätzliches Merkmal der offenbarten Oberflächenmodifizierungstechniken besteht darin, daß sie eine neue Vorgehensweise zur Förderung der Anlagerung von Zellen über einen dazwischengeschobenen Zellrezeptor, unabhängig von den adsorbierten Serumkomponenten bereitstellen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von Oberflächen bereit, das bei der Förderung der Adhäsion von beliebigen Spezies und beliebigem Zelltyp wirksam ist, einschließlich z.B. Schweine-, Mäuse- und Human-Zellen. Zelltypen, die bereits erfolgreich auf den behandelten Oberflächen gezüchtet wurden, umfassen Aorta-, Vorhaut-Fibroblasten- und 3T3- Fibroblasten-Zellen (ATCC # CRL1658) und vaskuläre endotheliale Zellen.
Die vorliegende Erfindung bringt auch eine Anpassungsfähigkeit für die Anwendung mit einer breiten Vielfalt kleiner Peptide. Während zahlreiche kleine Peptide in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen die kleinen Peptide diejenigen mit weniger als 12 Aminosäureresten (12 mer) ein. Insbesondere enthalten diese Peptide 3-9 Aminosäurereste (3-9 mer). Die am meisten bevorzugte Peptide besitzen entweder 6 Aminosäurereste (6 mer) oder 4 Aminosäurereste (4 mer). Die Anzahl der Aminosäurereste in einem Peptid wird hierin oft durch eine sog. Nomenklatur (z.B. 6 mer, 4 mer, etc.) angegeben.
In einer spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Zellkultursubstrat, das zur Unterstützung von Zellausbreitung befähigt ist, das eine Oberfläche mit einem kovalent gebundenen Peptid, chemisch daran gebunden, umfaßt, wobei das Peptid weniger als 12 Aminosäurereste besitzt und ausgew:hlt ist aus denjenigen, die die folgenden Erkennungssequenzen einschließen:
RGDY; REDVY; GRGDF; GPDSGR;
GRGDY; GREDV; GRGDFY; GPDSGRY;
GYIGSRY; GREDVY; GIKVAV; IKVAV;
YIGSRY; RGDF; PDSGR; IKVAVY;
REDV; RGDFY; PDSGRY; GIKVAVY,
wobei die Oberflächenkonzentration des Peptids zwischen 0,5 bis 20 pmol/cm² liegt.
In einer weiteren spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Zelladhäsion an einer Oberfläche, wobei das Verfahren umfaßt:
- chemisches Derivatisieren einer Oberfläche mit einem Peptid; und
- Aufbringen von Zellen auf die peptid-derivatisierte Oberfläche,
wobei das Peptid aus denjenigen ausgewählt wird, die die Erkennungssequenzen, wie sie oben definiert sind, einschließen, und wobei die Oberflächenkonzentration des Peptids zwischen 0,5 bis 20 pmol/cm² liegt.
In einer weiteren spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Zellkulturoberflächenmodifizierung, wobei das Verfahren umfaßt:
- das Aktivieren von reaktiven Gruppenanteilen einer Oberfläche;
- das Kuppeln von Peptiden an die oberflächen-reaktiven Gruppenanteile, wobei die Peptide aus denjenigen ausgewählt werden, die die folgenden Erkennungssequenzen einschließen:
RGDY; REDVY; GPDSGRY;
GRGDY; GREDVY; IKVAV;
GYIGSRY; RGDF; GIKVAV;
YIGSRY; GRGDF; IKVAVY;
REDV; PDSGR; GIKVAVY;
GREDV; GPDSGR;
und
- das kovalente Kuppeln eines Peptids an eine reaktive Gruppe auf der Oberfläche,
wobei die Peptide weniger als 12 Aminosäurereste besitzen und eine kovalente Bindung an die oberflächen-reaktiven Gruppenanteile auf der Zellkulturoberfläche bilden, wobei die Oberflächenkonzentration des Peptids zwischen 0,5 und 20 pmol/cm² liegt.
In einer weiteren spezifischen Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung einer biomedizinischen Vorrichtung für ein in vivo-Implantat, das das kovalente Binden eines Peptids an eine Oberfläche der Vorrichtung umfaßt, wobei das Peptid weniger als 12 Aminosäurereste besitzt und eine Aminosäuresequenz einschließt, die eine Anlagerung von Zellen über einen dazwischengeschobenen Zellrezeptor an die Vorrichtungsoberfläche fördert, wobei die Aminosäuresequenz ausgewählt wird aus:
RGDY; GREDVY; PDSGR; GIKVAV;
GRGDY; REDVY; PDSGRY; GIKVAVC;
GYIGSRY; RGDF; GPDSGR; GIKVAVCY;
YIGSRY; GRGDF; GPDSGRY;
REDV; GRGDFY; IKVAVC;
GREDV; RGDFY; IKVAVCY;
wobei eine Oberflächenkonzentration des Peptids zwischen 0,5 und 20 pmol/cm² vorliegt.
In einer weiteren, spezifischen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Zellsubstrat von endothelialen Zellen, das eine Oberfläche mit einem kovalent gebundenen Peptid, einschließend ein REDV-, YIGSR- oder PDGSR-Peptid, chemisch daran gebunden, umfaßt, wobei die Oberflächenkonzentration des Peptids zwischen 0,5 und 20 pmol/cm² liegt.
In einer noch weiteren, spezifischen Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Zelloberfläche zum selektiven Ausschluß von Blutplättchenadhäsion, die eine Oberfläche mit einem kovalent gebundenen Peptid, einschließend ein RGD-Peptid, chemisch daran gebunden, umfaßt, wobei das Peptid am N-Terminus des Peptids an die Oberfläche immobilisiert ist, und wobei die Oberflächenkonzentration des Peptids zwischen 0,5 und 20 pmol/cm² liegt.
Diese kleinen Peptide werden weiter beschrieben als solche, die eine mimmale Zelloberflächen-Rezeptor-Erkennungssequenz einschließen, z.B. RGD, YIGSR oder REDV. Diese Sequenz erlaubt das Stützen von Zellen an einer behandelten Oberfläche über einen dazwischengeschobenen Zellrezeptor. Beispielsweise schließen die am meisten bevorzugten Peptide, die die etwa minimalen Zelloberflächen-Rezeptor-Erkennungssequenzen einschließen, die GYIGSR (Gly-Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg-Tyr)-, GRGDY (Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr)-, RGD (Gly-Arg-Asp)-, REDV (Arg-Glu-Asp-Val)-, GREDV (Gly-Arg-Glu-Asp, Val)-, GREDVY (Gly-Arg-Glu-Asp-Val-Tyr)-, RGDF (Arg-Gly-Asp-Phe)-, GRGDF (Gly-Arg-Gly-Asp-Phe)-, PDSGR (Pro-Asp-Ser-Gly-Arg)-, GPDSGR (Gly-Pro-Asp-Ser-Gly-Arg)-, GPDSGRY (Gly-Pro-Asp-Ser-Gly-Arg-Tyr)-, IKVAVC (Ile-Lys-Val-Ala-Val-Cys)-, GIKVAV (Gly-Ile-Lys-Val-Ala-Val)-, IKVAVY (Ile-Lys-Val-Ala-Val-Tyr)-, GIKVAVY (Gly-Ile-Lys-Val-Ala-Val- Tyr)-Aminosäuresequenzen ein. Diese Fragmente enthalten entweder die Zellanlagerungssequenz vieler Oberflächenadhäsionsmoleküle (RGD) oder eine der Zellanlagerungssequenzen von Laminin (YIGSR und PDSGR), ein spezifisches Oberflächenadhäsionsprotein oder das Zelladhäsionsmolekül Fibronectin (REDV). Das IKVAV-Peptid von Laminin ist auch für spezifische Zellen brauchbar. Diese am meisten bevorzugten Peptide können weiterhin ein C-terminales Y für Radiojodierung einschließen. Das N-terminale G wird als Spacer mit dem spezifischen Peptid zwischen dem adhäsiven Peptid und der Oberfläche verwendet. Die kleinen Peptide werden verwendet, um Zellrezeptor-Erkennungsstellen bereitzustellen, die für eine Zelladhäsion an der behandelten Oberfläche erforderlich sind.
Während eine Oberflächenkonzentration an Peptiden von wenigstens 0,001 Picomol/cm² ausreichend ist, um die zelladhäsiven Eigenschaften einer Oberfläche zu erhöhen, beträgt die Peptidoberflächenkonzentration 0,5 bis 20 Picomol/cm². Die am meisten bevorzugte Peptidoberflächenkonzentration der vorliegenden Erfindung beträgt etwa 12 Picomol/cm².
Die herkömmlichen Methodiken beruhen auf einer direkten Adsorption des CAM oder des Peptids an der Oberfläche oder einer Adsorption von Nicht- CAM-Proteinen, gefolgt von einem Vernetzen der Peptide mit den adsorbierten Proteinen, was somit eine Desorption dieser Komponenten in die Nährmedien erlaubt. Die vorliegende Erfindung bietet den weiteren Vorteil, daß dieses Problem einer Proteindesorption durch chemisches Binden des Peptids über kovalente Bindungen an Hydroxyl- oder andere reaktive Anteile des gewünschten Substrats vermieden wird.
Bei der Verwendung biomedizinischer Implantate gibt es viele Situationen, in denen es wünschenswert ist, daß die umgebenden Zellen in den Geweben an der Implantatoberfläche haften bleiben und sich darauf ausbreiten (darauf integriert werden). Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Oberflächenmodifizierung bereit, um eine derartige erwünschte Implantatintegration innerhalb des Wirtes zu erhalten. Die vorliegende Erfindung zeigt weiterhin ein Verfahren zur Reduzierung des Auftretens einer Begleitinfektion bei dem in vivo-Implantat von biomedizinischen Vorrichtungen. Ein mit der Implantation von biomedizinischen Vorrichtungen verbundenes Hauptrisiko bestand in einer Infektion. Der Mangel an einer kontinuierlichen schützenden Schicht zwischen der Vorrichtung und dem biologischen Gewebe begünstigt den Eintritt von Bakterien und anderen infektiösen Mitteln in das Gewebe. Mit der Oberfläche, die die erhöhte Zelladhäsion fördert, als Teil der Vorrichtung, werden derartige unerwünschte Nebenwirkungen minimiert, da eine kontinuierliche, schützende Zellabdeckung vorgesehen ist, die den potentiellen Eintritt von infektiösen Mitteln verschließt.
Darüber hinaus treten bei der Verwendung biomedizinischer Implantate häufig Situationen auf, bei denen sich nur spezifische Zellen aus den umgebenden Geweben an die Implantatoberfläche anlagern. Zum Beispiel ist es bei der Gefäßtransplantattechnologie wünschenswert, daß sich endotheliale Zellen an das Implantat anlagern, so daß es wie die natürliche Blutgefäßwand ausschaut, die mit endothelialen Zellen ausgekleidet ist. Jedoch lagern sich auch Blutplättchen an und führen zu Klumpenbildung, und Fibroblasten und glatte Muskelzellen infiltrieren auch aus den Geweben, was zu einer sehr schädlichen Verdickung der Gewebeschichten innerhalb des Gefäßtransplantats führt. Daher wäre es vorteilhaft, ein Material einzusetzen, an das sich Blutplättchen nicht anlagern und an das sich nur endotheliale Zellen anlagern. Die vorliegende Erfindung bietet als einen überraschenden Vorteil gegenüber absorbierenden Peptiden an Oberflächen dieses Merkmal einer Spezifität für Zelltypen.
Darüber hinaus macht die Langzeitstabilität des offenbarten Verfahrens zur Behandlung von Oberflächen das System ideal zur Herstellung verschiedener biomedizinischer Implantate für Langzeitkörperprothesen. Zum Beispiel in Verwendung mit Nervenwachstumsleitern bzw. -leitungen und Verweilkathedern. Das Oberflächenmodifizierungssystem der vorliegenden Erfindung stellt auch neue Wege für die Gestaltung von Säugerzellbioreaktoren bereit, da es eine stabile integrale Oberflächenkomponente vorsieht, die die Zelladhäsion unabhängig von Medien-CAMs stützt. Derartige Substrate bieten den weiteren Vorteil, die Verwendung serumfreier Medien zu gestatten, denen Zelladhäsionsmoleküle fehlen.
Die Chemie der vorliegenden Erfindung ist direkt anwendbar auf jedes Material mit Oberflächen-Hydroxylanteilen oder anderen oberflächenreaktiven Gruppen, an die derartige Anteile angefügt werden können. Bei den meisten anderen Oberflächenbehandlungen zur Erhöhung der Zelladhäsion erfolgt dies durch Erhöhung der Proteinabsorption. Die Peptid-Pfropf-Vorgehensweise der vorliegenden Erfindung eliminiert die Notwendigkeit von absorbierten Proteinen völlig, da die Zellen Rezeptoren für die oberflächen-gekuppelten synthetischen Peptide besitzen. Diese kovalent gebundenen, minimalen Sequenzen sind gegenüber cellulärer Proteolyse und thermischer Zersetzung viel stabiler als adsorbierte Zelladhäsionsproteine oder adsorbierte Proteine, die mit Adhäsionspeptiden konjugiert sind, da die Desorption eliminiert wird und die aktiven Gruppen (z.B. RGD-, YIGSR-, PDSGR-, IKVAV- oder REDV- Sequenz) nicht so löslichen Proteasen ausgesetzt sind.
Während eine Vielfalt an chemischen Verfahren existiert, durch die die vorliegenden Oberflächen hergestellt werden können, fallen die verschiedenen Vorgehensweisen unter die allgemeine Klasse der Oberflächenaktivierung über eine Modifizierung eines Nucleophilen, wie ein Amin oder Hydroxyl, gefolgt von einem Kuppeln an die Peptide über ein weiteres Nucleophiles wie ein Amin oder Hydroxyl oder Thiol (23). Beispielsweise kann die Aktivierung von Oberflächenhydroxylgruppen erreicht werden durch die Behandlung mit Mitteln wie Tresylchlorid, Glutaraldehyd, Cyanurchlorid, Sulfonylchlorid, Cyanbromid; Oberflächenhydroxyle können zugefügt werden über Benzoin mit Kalium-tert-butoxid in Dimethylsulfoxid. Einer Behandlung mit diesen spezifischen Oberflächenaktivatoren schließt sich eine Prozedur an, durch die ein Peptid kovalent an die Hydroxylgruppe gebunden wird. Darüber hinaus kann die vorliegende Erfindung über die Erzeugung aktiver Carboxylgruppen auf der Oberfläche unter Verwendung von z.B. Bernsteinsäureanhydrid durchgeführt werden. Die ausgesetzte Oberfläche wird dann gewaschen und mit Peptid gekuppelt.
Beispielsweise umfassen biomedizinische Implantate, die unter Einbeziehung der vorliegenden Oberflächenpeptidbehandlung Nutzen ziehen würden, Penis-, Herz-, Vaginal- und Hüftimplantate, Katheter; künstliche Venen oder Arterien, künstliche Sehnen und Bänder; künstliche Knochenschrauben, Knochenplatten, Knochenfragmente und Knochengelenke; künstliche Haut; Nervenwachstumsleitungen bzw. Nervenstrangleitungen bzw. -leiter; und intraokülare Linsen und dergleichen. Beispielsweise schließen Materialien, die als Zellund Gewebekultursubstrate verwendet werden, die aus der vorliegenden Oberflächenpeptidbehandlung Nutzen ziehen, Gewebenähr- bzw. -kulturkolben, Petri-Schalen, Mikroträgerkügelchen, poröse Makroträger, Fasern, Hohlfasern, monolithische Träger und Rollflaschen ein.
Die offenbarten Verfahren können zur Derivatisierung jeder Oberfläche verwendet werden, bei der eine erhöhte Zelladhäsion erwünscht ist. Beispielsweise und nicht beschränkend schließen diese Oberflächen Metall, keramische oder Polymeroberflächen ein. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist gerichtet auf die Derivatisierung von Polymeroberflächen. Während jede Polymeroberfläche unter Verwendung der vorgeschlagenen Verfahren derivatisiert werden kann, schließen spezifische, beispielhafte Polymeroberflächen am meisten bevorzugt Poly(hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA)-, Poly(ethylenterephthalat) (PET)-, Poly(tetrafluorethylen) (PTFE)-, fluorierte Ethylen (FEP)-, Poly(dimethylsiloxan) (PDMS)- und andere Siliconkautschukoberflächen ein. PET, auch bekahnt als Dacron, ist ein Polyester, der häufig für biomedizinische Implantate verwendet wird. PTFE ist auch als Teflon bekannt. Die am meisten bevorzugte Polymermatrix der vorliegenden Erfindung umfaßt Poly(hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA).
Die PHEMA-Polymermatrix umfaßt eine gelähniiche Matrix, die etwa eine 45%-ige Wasserzusammensetzung besitzt und vor der Offenbarung der vorliegenden Erfindung nicht in der Lage war, eine Zelladhäsion zu unterstützen.
Die Verwendung von Peptiden in Verbindung mit anderen Polyacrylamidgelmatrizes mit hohem Wassergehalt ist viel weniger peptidwirksam, verglichen mit der Verwendung mit Polymeren von niedrigem Wassergehalt. Hochhydratisierte Gele sind hochpermeabel gegenüber Peptiden und erleichtern somit die wesentliche und unterschiedslose Diffusion von kleinen Peptiden in die Masse bzw. den Bulk des Polymeren. Diese hochhydratisierten Polymere wurden für Proteinelektrophorese verwendet, wobei sie zeigten, daß sie selbst gegenüber ganzen Proteinen, die sehr große Moleküle sind, permeabel sind (21). Polyacrylamid umfassende Polymergele schließen üblicherweise wenigstens etwa 90% Wasser ein und wären somit bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung ungeeignet.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist auf die Derivatisierung einer spezifischen Keramik, eines Glyco-Phasenglases bzw. eines Glases mit Glyco-Phase (glycerin-propylsilan-gebundenes Glas) gerichtet. Beispielsweise ist ein bevorzugtes Metall, das bei dem beschriebenen Verfahren verwendet wird, Titan.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Verfahren zur Erhöhung der Zelladhäsion an eine Oberfläche ein, die zuerst ein Aktivieren der Oberfläche, ein Kuppeln eines Peptids an die aktivierte Oberfläche und dann ein Aufbringen von Säugerzellen auf die peptid-derivatisierte Oberfläche umfassen, wobei das bevorzugte Peptid kleiner als ein 12 mer ist. Das Verfahren, wodurch das Peptid an eine beliebige aktivierte Oberfläche gekuppelt wird, umfaßt am meisten bevorzugt, daß eine aktivierte Oberfläche einer Lösung ausgesetzt wird, die eine ausreichende Menge an den oben beschriebenen Peptiden (mit zelladhäsiven Eigenschaften) enthält. Während jede Konzentration an Peptidlösung von wenigstens etwa 10 ng/ml zu gleichen Ergebnissen bei dem vorliegenden Kupplungsverfahren führen würde, sind auch Lösungen zwischen etwa 10 ng/ml Peptid und 100 µg/ml Peptid geeignet. Am meisten bevorzugt umfaßt das Verfahren eine Peptidlösung mit einer Konzentration von 10 ng/ml Peptid. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung schließt das Peptid der Peptidlösung PDSGR, IKVAV, REDV oder RGDF ein. Ein am meisten bevorzugtes Peptid, das bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, umfaßt eine Peptidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus RGDY, GRGDY, GYIGSR,

GYIGSRY, REDV, GREDV, GREDVY, RGDF, GRGDF, PDSGR,

GPDSGR, GPDSGRY, IKVAV, GIKVAV, IKVAVY und GIKVAVY. Diese Peptide werden am bevorzugtesten bei der Derivatisierung von Polymeroberflächen, wie PET-Polymer- und PHEMA-Polymer- oder Glasoberflächen, wie Glycophasen-Glas bzw. Glas mit Glyco-Phase verwendet. Jedoch kann jedes Peptid, das eine Aminosäuresequenz einschließt, die zur Unterstützung der Zellrezeptorerkennung befähigt ist, in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Anwendungen der Vorgehensweise, bei der bioaktive zelladhäsive Peptide gepfropft werden, um die Zelladhäsion zu erhöhen, umfassen die folgenden Verwendungen:
1. Im Labormaßstab für Gewebe- und Zellkulturen von von Verankerung abhängigen Zellen und Zellinien. Diese Vorgehensweise kann brauchbar sein bei der Behandlung von Laborglasgeräten und - kunststoffgeräten, die als Zellkultursubstrate verwendet werden, wie z.B. Gewebekulturkolben und Petri-Schalen. Sie wäre brauchbar für Tier-, Insekten- und Pflanzenzellen und -gewebe, da alle im wesentlichen die gleiche Molekularbiologie zur Adhäsion nutzen.
2. Für Gewebe- und Zellkultur in großem Maßstab. Die Vorgehensweise kann nützlich sein bei der Behandlung von Mikroträgern, porösen Makroträgern, Hohlfasern, monolithischen Trägern und Rollflaschen.
3. Für das Innere von implantierbaren, künstlichen Gefäßtransplantaten zur Förderung der Endothelialisierung dieser Oberflächen.
4. Für die äußeren und anastamotischen Bereiche (Enden) der Gefäßtransplantate zur Förderung der Integration in die Gewebe.
5. Für andere implantierbare Vorrichtungen, bei denen eine Integration mit den Geweben wünschenswert ist, wie z.B. künstlichen Sehnen, Bändern, Knochenschrauben und -platten, Knochenfragmenten, Gelenken und Haut.
6. Für die Behandlung von Nähten (Sutura) zur Förderung der Adhäsion mit den Geweben und der Integration in die Gewebe.
7. Für die Förderung des gerichteten Wachstums oder der gerichteten Migration von Zellen oder Geweben, diese Vorgehensweise kann nützlich sein, wenn die Peptide auf die Oberfläche mit einem Oberflächenkonzentrationsgradienten gepfropft werden. Ein Beispiel, bei dem dies nützlich sein kann, ist in Nervenwachstumsleitungen bzw. -leitern für die peripherische Nervenregeneration.
8. Zur Verwendung in der Forschung. Die vorliegenden Systeme erlauben Studien zur Zelladhäsion in Gegenwart von Serum ohne Störeffekte durch Proteinadsorption. Somit bleiben die Hintergrundleveis in dem Testsystem niedrig. Darüber hinaus steuern die vorliegenden Verfahren die Menge an Peptid, das an eine Oberfläche gekuppelt wird, was auch beim Studium der Zelladhäsion wichtig ist.
Erfindungsgemäß hergestellte Oberflächen, die modifiziert wurden, um einer Zelladhäsion zu widerstehen, können nützlich sein in:
1. Situationen in der Biomedizin, bei denen eine Zellanlagerung schädlich ist, wie z.B. Kathetern, Hämodialysemembranen, Blutfiltern, intraokularen Linsen, Kontaktlinsen und
2. Situationen in der Biotechnologie, bei denen eine Proteinadsorption schädlich ist, wie z.B. Chromatografieträgersäulen.
FIG. 1 zeigt die Hydroxymethylierung von PET-Filmen über eine elektrophile aromatische Substitution. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur mit 18,5%-igem Formaldehyd (V/V) und 1M Essigsäure durchgeführt.
FIG. 2 zeigt die Tresyl-Aktivierung und GRGD-Kupplung an hydroxymethylierte PET-Filme. Alle Reaktionen wurden bei Raumtemperatur ausgeführt.
FIG. 3 zeigt fest haftende und ausgebreitete 3T3-Fibroblasten auf (a) GRGD-gekuppelten und (b) unbehandelten PET-Filmen. Pfeile zeigen die individuellen Zellen an, die als Ausbreitungszellen gescored (ausgewertet) wurden. (200X Hoffman-Beleuchtung).
FIG. 4 zeigt die Ausbreitung von 3T3-Fibroblasten auf GRGD-gekuppelten und unbehandelten PHEMA-Filmen in einem serumfreien Nährmedium. Das Ausmaß der Zellausbreitung wurde 3 Stunden nach dem Aussäen der Substrate bestimmt.
FIG. 5 zeigt einen Vergleich von 3T3-Ausbreitung auf GRDG-gekuppeltem PET (durchgezogene Kurve, offene Kästchen) gegen GRGD-adsorbiert auf PET (schraffierte Linie, geschlossene Rauten) und unbehandeltes PET (punktiert-schraffierte Kurve, offene Kästchen).
FIG. 6 zeigt die Menge an 3T3-Ausbreitung auf den modifizierten (geschlossene Balken) und unmodifizierten (gestrichelte Balken) Filmen in einem serumfreien und kompletten Medium. Das Ausmaß der Zellausbreitung wurde 2 Stunden nach Inokulation auf jedem Film bestimmt. Die Zellen wurden bei einer Dichte von 10.000 Zellen/cm² ausgesät.
FIG. 7 zeigt die Wirkungen löslichen RGDS auf die Ausbreitung von 3T3- Zellen auf den GRGD-derivatisierten PET-Filmen in einem serumfreien Nährmedium. Die Zellen wurden für 30 Minuten mit RGDS vor der Inokulation der Filme prä-inkubiert. Das Ausmaß der Zellanlagerung wurde 3 Stunden nach Inokulation bestimmt. Mit RGDS prä-inkubierte Zellen (gestrichelter Balken). Unbehandelte Kontrollzellen (geschlossener Balken).
FIG. 8 zeigt die Wachstumskinetik von 3T3-Zellen auf GRGD-derivatisierten (offene Quadrate) und unbehandelten (geschlossene Rauten) PET-Oberflächen. Diese Studien wurden in komplettem Medium ausgeführt.
FIG. 9 zeigt die Oberflächenkonzentration an GRGDY-¹²&sup5;I, das auf Glas mit Glycophase gepfropft wurde, das zu Kupplungspuffer (0,2M Natriumbicarbonat, pH 10) zugegeben wurde und auf tresyl-aktiviertem Glas bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Die Eingabekonzentration war das lösliche Peptid, das für die Reaktion pro Einheit Glasoberfläche verfügbar war. Die Oberflächenkonzentration ist definiert als die Mole an gekuppeltem Peptid pro Einheit Glasfläche und gewaschene Glasproben in einem Gamma-Zähler und Berechnen der auf das markierte Peptid bezogenen Werte. Jeder Punkt stellt den Mittelwert von Dreifachbestimmungen dar. Die Oberflächenkonzentration betrug 12,1 pmol/cm².
FIG. 10 zeigt kumulative Histogramme, die die Zellflächen von HVFs auf Glas mit Glycophase mit GRGDY zeigen. Die Zellen wurden in entweder kompletten Medium (A) enthaltend Albumin (C), (D) suspendiert und auf den Substraten inokuliert. A und C stellen Werte dar, die auf dem RGD-derivatisierten Glas gesammelt wurden, während (B) und (D) nicht-adhäsive Kontrolloberflächen darstellen. Die Flächen der individuellen Zellen wurden mittels Videomikroskopie aufgenommen, gekuppelt mit digitaler Bildverarbeitung. Die Zellausbreitung wurde auf den peptid-gepfropften Oberflächen beobachtet, selbst in Abwesenheit von Serum; es gab keine Zellausbreitung auf den ungepfropften Oberflächen, selbst mit Serum, und die meisten dieser Zellen waren nicht haftend. Mindestens 100 Zellen wurden an jedem Zeitpunkt analysiert, um die kumulativen Daten zu erzeugen. Linien: (durchgezogene Linie) 15 Minuten; (punktierte Linie) 30 Min.; (dick gestrichelte Linie) 60 Min.; und (dünn gestrichelte Linie) 120 Min. Mittelpunkt mit 50% darüber und 50% darunter für die verschiedenen Zeitpunkte (in der Reihenfolge): A: 15 Min. 265 µm²; 30 Min. 906 µm²; 60 Min., 1113 µm ; 120 Min., 2130 µm²; B: 385, 397, 448, 453; C: 248, 950, 864, 1207; D: 377, 325, 388, 388.
FIG. 11 zeigt das Wachstum von HVFs auf GRGDY-derivatisiertem Glas mit Glycophase (offene Quadrate) und unbehandeltem Borsilikatglas (volle Quadrate) in DMEM, das mit 10% fötalem Kalbserum ergänzt war. Die Zellen wurden mit 100X Phasenkontrastmikroskopie visualisiert. Die Anzahl der Zellen pro Einheit Wachstumsoberfläche wurde bezogen auf eine durchschnittliche Zellzählung pro Feldfläche von einer Probengröße von 10 Feldern pro Zeitpunkt berechnet. Die ähnlichen Wachstumsraten zeigen an, daß die Zellen in der Lage sind, sich von den peptid-gepfropften Oberflächen zu sammeln und darauffim zu teilen.
FIG. 12 zeigt kumulative Histogramme, die die Zellflächen von HVFs auf Glas mit Glycophase, das mit GYIGSR derivatisiert wurde, zeigen. Die Zellen wurden entweder in komplettem Medium (A), (B) oder serumfreiem Medium, enthaltend Albumin (C), (D) suspendiert und auf den Substraten inokuliert. (A) und (C) stellen Daten dar, die auf dem YIGSR-derivatisierten Glas gesammelt wurden, während (B) und (D) Daten darstellen, die auf den nicht-adhäsiven Kontroll oberflächen gesammelt wurden. Die Flächen der individuellen Zellen wurden durch Phasen-Kontrast-Videomikroskopie bestimmt, gekuppelt mit digitaler Bildverarbeitung (12). Die Zellausbreitung wurde auf den peptid-gepfropften Oberflächen beobachtet, selbst in Abwesenheit von Serum; auf den ungepfropften Oberflächen gab es selbst mit Serum keine Zellausbreitung, und die meisten dieser Zellen waren nicht haftend. (Mindestens 100 Zellen wurden bei jedem Zeitpunkt zur Erzeugung der kumulativen Daten analysiert.) Linien (durchgezogene Linie) 0 Stunden; (gepunktete Linie) 3 Stunden; (dick gestrichelt) 6 Stunden; und (dünn gestrichelt) 9 Stunden. Mittelpunkt-Zellfläche mit 50% der Zellen darüber und 50% darunter für die verschiedenen Zeitpunkte (in der Reihenfolge): A: Stunden; 505 µm²; 3 Stunden, 2200 µm²; 6 Stunden, 2333 µm²; 9 Stunden, 3375 µm²; B: 340, 520, 486, 517; C: 517, 1045, 1033, 1400; D: 245, 306, 362, 514.
FIG. 13 zeigt Phasenkontrast (13 A, C)- und IRM (13 B, D)-mikrografische Aufnahmen von ausgebreiteten HVFs auf RGD-gepfropftem Glas. Die Zellen wurden 4 Stunden in serumfreien (13 A, B) oder komplettem Medium (13 C, D) inkubiert. Maßstabsbalken = 10 µm.
FIG. 14 zeigt Phasenkontrast (14 A, C)- und IRM (14 B, D)-mikrografische Aufnahmen von ausgebreiteten HVFs auf YIGSR-gepfropftem Glas. Die Zellen wurden für 8 Stunden in serumfreien (14 A, B) oder komplettem Medium (14 C, D) inkubiert. Maßstabsbalken = 10 µm.
FIG. 15 zeigt mikrografische Fluoreszenzaufnahmen von HVFs, die auf F- Actin angefärbt waren. Die HVFs wurden für 4 Stunden auf RGDderivatisierten Substraten in serumfreiem (15 A) und komplettem (15 B) Medium inkubiert. 15 C und 15 D sind ausgebreitete Zellen auf YIGSR-derivatisierten Substraten nach 8 Stunden Inkubation in serumfreiem (C) und komplettem (D) Medium. Maßstabsbalken = 10 µm.
FIG. 16 zeigt die Wirkung der Abwesenheit oder Anwesenheit von Serum auf die Ausbreitung von endothelialen Schweine-Aorta-Zellen in Zellkulturen, die entweder auf PET oder GRGD-peptid-derivatisierten PET-Oberflächen angelegt wurden.
FIG. 17 zeigt die Zellausbreitungsrate, beobachtet auf peptid-derivatisierten PET (Polymer)-Oberflächen gegen nicht behandelte PET (Polymer)- Oberflächen.
FIG. 18 zeigt die Wirkungen der RGD-Peptiddichte auf die Zell (HVF)- Ausbreitung.
FIG. 19 zeigt ein Schema einer vorgeschlagenen Oberflächenstruktur des physikalischen interpenetrierenden oder ineinandergreifenden Netzwerkes (PIPN).
FIG. 20 zeigt eine Darstellung einer Durchflußkammer, die zur in vitro Online-Visualisierung der Blutplättchenadhäsion an den modifizierten Polymeroberflächen verwendet wird, in zerlegter Anordnung.
FIG. 21 zeigt die I¹²&sup5;-Albuminadsorption auf modifizierten PET-Oberflächen, die niedrige Level an Adsorption auf der mit PEO 18500 modifizierten Oberfläche zeigen.
FIG. 22 zeigt die Blutplättchenadhäsion auf PET-PIPNs, wie durch Fluoreszenzvideomikroskopie erhalten. Der Kontrollwert von 100% entspricht 46,25 Blutplättchen/ 1000 µm² Polymeroberfläche.
FIG. 23 zeigt Zellausbreitungsassays auf PET-PIPNs über 30 Tage in Kultur. Die Zellen wurden bei einer Konzentration von 30.000/cm² ausgesät. Auf die PEO 18500-modifizierte Oberfläche wurde 9 und 15 Tage auf das anfängliche Aussäen nochmal ausgesät.
FIG. 24 zeigt Zellausbreitungsassays auf Pellethan-PIPNs. Die Zellen wurden bei einer Konzentration von 70.000/cm² ausgesät. Diese Oberflächen wurden nur mit PEO 18500 modifiziert. Die Zahlen in Klammem geben die Stärke des für das Modifizierungsverfahren verwendeten THFS an.
FIG. 25 zeigt Zellausbreitungsassays auf PMMA-PIPNs. Die Zellen wurden bei einer Konzentration von 70.000/cm² ausgesät. Diese Oberflächen wurden nur mit PEO 18500 modifiziert. Die Zahlen in Klammern geben die Stärke des für das Modifizierungsverfahren verwendeten Acetons an.
Die vorliegende Erfindung betrifft Oberflächen mit einzigartigen selbsthaftenden Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung behandelter Oberflächen, die spezifisch die Zell-Oberflächen-Adhäsion daran erhöhen, unabhängig von getrennt adsorbierten Peptiden und löslichen Medienkomponenten. Diese Methodik stellt Techniken zur Herstellung unterschiedlicher Substrattypen bereit, die die Optimierung von Kultursystemen vereinfachen und die auch die Menge und Rate der Zellbioadhäsion an Oberflächen verschiedener Materialien steuern. Darüber hinaus werden Materialien mit spezifischen zellnichtadhäsiven Eigenschaften und Verfahren zur Herstellung derartiger Oberflächen zur Reduzierung der Zelladhäsion und Proteinadsorption offenbart. Diese Materialien besitzen wichtigen Nutzen als nichtadhäsive Oberflächen und bieten besondere Vorteile, wenn sie mit die Adhäsion fördernden Peptiden modifiziert werden.
Insbesondere sehen die Oberflächenmodifizierungstechniken vor das chemische Pfropfen von Peptiden auf eine Oberfläche, wobei das Peptid, das wenigstens die minimale Aminosäuresequenz umfaßt, eingeschlossen ist in einem Zell (Oberflächen)-Adhäsionsmolekül, wie z.B. RGD in Fibronectin oder YIGSR, IKVAV oder PDSGR in Laminin, REDV in einigen Formen von Fibronectin oder irgendeiner anderen kurzen Peptidsequenz, die mit der Sequenz eines Proteins, das bei der Zell-Oberflächen- oder Zell-Zell-Adhäsion involviert ist, verwandt ist oder von dieser abgeleitet ist. Die Begriffe "Celladhäsionsmolekül" (CAM) und "Substratadhisionsmolekiil" (SAM) werden wechselweise verwendet, um die Familie der Proteine und Peptide zu beschreiben, von denen gefünden wurde, daß sie die Adhäsion oder Anlagerung an eine Oberfläche über einen dazwischengeschobenen Zellrezeptor erleichtern.
Die vorliegenden Oberflächenbehandlungsverfahren umfassen ein chemisches Aktivieren einer Oberfläche, um reaktive Gruppen freizusetzen, ein Waschen der aktivierten Oberfläche und anschließend wird die Oberfläche einer Lösung ausgesetzt, die kleine Peptide enthält, z.B. ein Peptid, das die PDSGR-, IKVAV-, REDV- oder eine andere Aminosäuresequenz einschließt, die eine Zellanlagerung mit weniger als insgesamt 12 Aminosäurereste (12 mer) über einen dazwischengeschobenen Rezeptor erleichtert. Eine kovalente chemische Bindung verbindet das terminale Ende des Peptids mit einem reaktiven Anteil auf der behandelten Oberfläche. Es existiert eine Vielfalt von chemischen Verfahren, durch die eine Oberfläche aktiviert werden kann, um reaktive Gruppen freizusetzen. Eines dieser Verfahren erfolgt über Tresylaktivierung. Andere alternative chemische Wege, die bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung eingeschlagen werden können, umfassen beispielsweise:
(1) Aktivierung der Oberfläche mit Glutaraldehyd: Bei Temperaturen zwischen 0ºC und 80ºC behandle man die Oberfläche mit einer wäßrigen Lösung von 5% bis 37% Glutaraldehyd für etwa eine Stunde. Der Glutaraldehyd kuppelt mit beliebigen, freiliegenden nucleophilen Gruppen, wie Aminen und Hydroxylen. Man wasche die Oberfläche mit Wasser und behandle die Oberfläche mit einer Lösung von Peptid zwischen 10 ng/ml und 1 mg/ml. Nucleophile Gruppen auf dem Peptid, wie Thiole, Amine und Hydroxyle kuppeln an die oberflächen-gekuppelte Glutaraldehydfünktion.
(2) Aktivierung der Oberfläche mit Cyanurchlorid: Bei Temperaturen zwischen 0ºC und 80ºC behandle man die Oberfläche mit einer nicht wäßrigen Lösung von etwa 5% Cyanurchlorid für etwa eine Stunde. Das Cyanurchlorid kuppelt mit beliebigen, freiliegenden nucleophilen Gruppen, wie Aminen und Hydroxylen. Man wasche die Oberfläche mit trockenem Lösungsmittel und behandle die Oberfläche mit einer Lösung von Peptid zwischen 10 ng/ml und 1 mg/ml in einem nicht wäßrigen Lösungsmittel, wie beispielsweise Acetonitril. Beliebige nucleophile Gruppen auf dem Peptid, wie z.B. Thiole, Amine und Hydroxyle kuppeln an die oberflächen-gekuppelte Cyanurchloridfunktion.
(3) Aktivierung der Oberfläche mit anderen Sulfonylchloriden: Man folge den Verfahrensumrissen in Beispiel 3, wobei man ein anderes Glied der Sulfonylchloridfamilie verwendet, z.B. Tosylchlorid.
(4) Aktivierung der Oberfläche mit Cyanbromid: Bei Temperaturen von etwa 20ºC oder darunter setze man die Oberfläche einer wäßrigen Lösung von Cyanbromid bei einem pH-Wert von 10-11 für etwa eine Stunde aus. Das Cyanbromid kuppelt kovalent und aktiviert die Oberflächenhydroxylgruppen. Man wasche die Oberfläche mit Wasser bei einem pH von 10-11 und kupple mit Peptid mit 10 ng/ml und 1 mg/ml in dieser gleichen Lösung für etwa 1 Stunde. Das Peptid kuppelt sich an die Cyanbromidgruppen über beliebige Aminfünktionen auf dem Peptid.
(5) Aktivierung der Oberfläche zur Erzeugung aktiver carbonyl-tragender Ester, z.B. mit Bernsteinsäureanhydrid: Bei Temperaturen von etwa 20ºC setze man die Oberfläche einer Lösung von Bernsteinsäureanhydrid aus, woraufhin diese Verbindung mit Oberflächenhydroxyl- und -amingruppen reagiert, um Ester bzw. Amide zu erzeugen. Man wasche die Oberfläche und kupple mit Peptid zwischen 10 mg/ml und 1 mg/ml für etwa 1 Stunde. Das Peptid reagiert mit der aktivierten Oberfläche über Amin- oder Hydroxylgruppen.
(6) Voraktivieren eines Polymers durch Zufügen von Hydroxylgruppen mit Benzoindimethylsulfoxid: Hydroxylfunktionen werden Poly(tetrafluorethylen) (PTFE) zugefügt. Wie beschrieben von Costello und McCarthy, Surface-Selective Introduction of Specific Functionalities onto Poly(tetrafluoroethylen), Macromolecules 20:2819-2828 (1987). Benzoin wird zu einer Lösung von Kalium-tert-Butoxid in Dimethylsulfoxid zugefügt und in Kontakt mit der PTFE-Oberfläche gebracht. Man läßt 1 Stunde bei 50ºC reagieren. Das Material wird entfernt und mit Tetrahydrofüran (THF) gewaschen. Diese intermediäre Oberfläche wird dann mit 1 M Boran in THF bei Raumtemperatur für 12 Stunden behandelt. Die Oberfläche wird dann mit 1 M NaOH, das 10% Wasserstoffperoxid enthält, 3 Stunden bei 0ºC behandelt, danach wird es aufeinanderfolgend mit verdünnter NaOH, Wasser, verdünnter HCl, Wasser, THF und Heptan gewaschen. Dies führt zu einer Oberfläche, die reich an Hydroxylgruppen ist und anschließend durch irgendeine der oben beschriebenen chemischen Verfahren aktiviert werden kann.
Das am meisten bevorzugte Verfahren, durch das Peptide an eine Oberfläche angelagert oder gebunden werden, umfaßt eine Oberflächenaktivierung der Oberfläche durch ein Tresyl-Immobilisierungsverfahren, wie beschrieben von Nusson und Mosbach (1981), (Biochem. Biophys. Res. Commun., 102: 449-457). Typischerweise ist die Tresylaktivierung ein Verfahren, bei dem die Oberfläche zuerst in 20 ml trockenen Ether, der etwa 40 µl 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid (Tresylchlorid) und etwa 2 ml Triethylamin enthält, für 15 Minuten bei Raumtemperatur eingetaucht wird. Diese aktivierten Oberflächen werden dann mit 0,2 M Natriumbicarbonat-Puffer mit pH 10 gewaschen. Die Oberflächen werden dann in den gleichen Puffer, der etwa 60- 100 ng/ml des Peptids enthält, für etwa 20 Stunden bei Raumtemperatur eingebracht. Am meisten bevorzugt beträgt die Konzentration an Peptidlösung etwa 10 ng/ml. Diese Inkubationszeit erlaubt das Kuppeln des Peptids an die Oberflächenhydroxylgruppen.
Die Peptide kuppeln an eine aktivierte Oberfläche am meisten bevorzugt, indem man die aktivierte Oberfläche einer Lösung aussetzt, die eine geeignete Menge an dem gewünschten Peptid enthält. Während jede Konzentration an Peptidlösung von wenigstens etwa 10 ng/ml zu in gleicher Weise befriedigenden Ergebnissen führen würde, sind Lösungen, die zwischen etwa 10 ng/ml Peptid und 100 ug/ml Peptid enthalten, bevorzugt. Am meisten bevorzugt wird eine Peptidlösung von etwa 10 ng/ml Peptid bei dem Kupplungsverfahren verwendet.
Die behandelten, durch die offenbarten Verfahren hergestellten Oberflächen sind durch eine Peptidoberflächenkonzentration von 0,5 bis 20 Picomol/cm² gekennzeichnet. Die am meisten bevorzugte Oberflächenpeptidkonzentration beträgt etwa 12 Picomol/cm².
Dort, wo keine Oberflächenhydroxylanteile auf den zu behandelnden Oberflächen vorliegen, wurde die Oberfläche vorbehandelt. Diese Vorbehandlung umfaßte vorzugsweise eine Oberflächenhydroxylierungsprozedur, wobei eine elektrophile aromatische Substitution eingesetzt wurde, um Hydroxyalkyl gruppen an eine Oberfläche einzuführen. Ein besonders bevorzugtes Verfahren dieser Vorbehandlung umfaßt das Eintauchen einer Oberfläche in eine etwa 18,5%-ige (V/V) Lösung von Formaldehyd und etwa 1 M Essigsäure für etwa 4 Stunden bei Raumtemperatur. Diese Vorgehensweise wurde bei der Hydroxymethylierung einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, die eine PET-Polymeroberfläche umfaßt, verwendet. Die hydroxylierte Oberfläche wurde dann tresyl-aktiviert mit der Anlagerung bzw. Bindung der Peptide daran, wie oben beschrieben. Verschiedene andere Oberflächenhydroxylierungen wären genauso brauchbar zur Verwendung in Verbindung mit anderen Polymeren oder Materialien. Verschiedene andere Bindungseigenschaften können auch verwendet werden, bei denen die N- terminale Amin- oder eine andere reaktive Gruppe auf dem Peptid mit einer Gruppe auf der Oberfläche umgesetzt wird, vielleicht unter Verwendung einiger Linker.
Jede Oberfläche kann bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise umfassen Oberflächen, die besonders geeignet sind zur Anwendung bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung, eine Keramik, ein Metall oder eine Polymeroberfläche. Am meisten bevorzugt wird die vorliegende Erfindung bei der Behandlung von Polymeroberflächen und Keramik-(Glas-)Oberflächen verwendet. Beispielsweise umfassen die Polymeroberflächen Poly(hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA), Poly(ethylenterephthalat) (PET), Poly(tetrafluorethylen) (PTFE), fluoriertes Ethylen (FEP), Poly(dimethylsiloxan) (PDMS) und andere Siliconkautschuke. Während eine Vielfalt von Glasoberflächen mit den vorgeschlagenen Verfahren behandelt werden kann, weist die Glasoberfläche am bevorzugtesten glycerin-propylsilan-gebundenes Glas (Glas mit Glycophase bzw. Glyco-Phasen-Glas) auf. Eine besonders bevorzugte Polymeroberfläche ist eine mit einem physikalischen interpenetrierenden polymeren Netzwerk von wasserlöslichem Polymer, das der Zelladhäsion ohne Peptidsubstitution widersteht.
Eine minimale Aminosäuresequenz, die in vielen Zelladhäsionsmolekülen eingeschlossen ist, ist RGD (Arginin-Glycin-Asparaginsäure-Aminosäuresequenz) oder YIGSR (Tyrosin-Isoleucin-Glycin-Serin-Arginin) oder REDV (Arginin-Glutaminsäure-Asparaginsäure-Valin). Während jedes Peptid, das eine in der Zelladhäsion aktive, minimale Aminosäuresequenz enthält, bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, umfassen diejenigen Sequenzen, die am meisten bevorzugt sind PDSGR, IKVAV, GRGDY, GYIGSRY, RGDY, YIGSRY, REDV, GREDV, RGDF und GRGDF.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Peptide GRGDY und GYIGSRY chemisch an eine Oberfläche von glycerin-propylsilan-gebundenem Glas (Glas mit Glycophase), einem spezifischen Typ einer Keramik, gepfropft. Das C-terminale Y dieser bevorzugten Peptide ist für eine Radioiodierung eingeschlossen, das N-terminale G (Glycin) ist zur Verwendung als Spacer mit dem spezifischen Peptid zwischen dem adhäsiven Peptid und der Oberfläche vorgesehen. Die kleinen Peptide werden verwendet, um Zellrezeptor-Erkennungsstellen bereitzustellen, die für die Zelladhäsion auf der behandelten Sequenz erforderlich sind.
Eine am meisten bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt eine PHEMA- oder PET-Polymeroberfläche, die mit GYIGSRY-Peptiden derivatisiert ist. Eine weitere, sogar noch mehr bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt eine PHEMA- oder PET-Polymeroberfläche, die mit GYIGSRY-Peptiden derivatisiert ist.
Eine Oberfläche, die dergestalt behandelt worden ist, daß sie kovalent gebundenes Peptid einschließt, stellt Säuger-Zellrezeptor-Erkennungsstellen bereit, die den Zellen gestatten, an dem Substrat festzuhaften und unabhängig vom Serumgehalt der Medien und oberflächen-adsorbierten Proteinen zu wachsen. Somit offenbart die vorliegende Erfindung Verfahren, die eine Zelladhäsion über einen dazwischengeschobenen Rezeptor in Abwesenheit irgendeines intermediären adsorbierten Proteins, d.h. eine völlig selbstausreichende Zelladhäsion und sich ausbreitende, tragende Oberfläche, vorsehen.
Während jedes Peptidfragment, das die minimale Aminosäuresequenz des Zelladhäsionsmoleküls einschließt, bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, sind Peptidftagmente, die weniger als 12 Aminosäurereste (mer) enthalten, bevorzugt. Peptidfragmente mit zwischen etwa 3 und etwa 9 Aminosäureresten sind mehr bevorzugt. Die am meisten bevorzugten Peptide schließen entweder 4 oder 6 Aminosäurereste ein. Die Länge des Peptidfragments beeinflußt die Zersetzungsanfälligkeit des Peptids und daher wäre mit kürzerem Fragment eine geringere Peptidoberflächenzersetzung zu erwarten.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin oberflächen-behandelte biomedizinische Implantatvorrichtungen und Verfahren zur Herstellung derselben. Vorrichtungen mit derartigen Oberflächenbehandlungen erhöhen die Menge und Rate der Zelladhäsion und somit die Rate der Gewebeintegration der Vorrichtung in vivo. Eine erhöhte Zelladhäsion und Gewebeintegration bewirkt eine Infektionsminimierung, da potentielle Gewebeeintrittsöffnungen geschlossen durch eine schützende Zellschicht "abgedichtet" werden.
Jede Vorrichtungsoberfläche, an die die beschriebenen Peptide chemisch gepfropft werden können, können mit dem beschriebenen Verfahren behandelt werden. Beispielsweise umfassen diese Vorrichtungsoberflächen diejenigen von Penis-, Vagina-, Herz- und Hüftimplantaten oder -ersatz; Kathetern; künstlicher Haut, (künstlichen) Venen und Arterien; künstlichen Sehnen und Bändern; künstlichen Knochenschrauben, -platten, -fragmenten und -gelenken, Nervenwachstumsleitern bzw. -leitungen, intraokularen Linsen und dergleichen.
Da gezeigt wurde, daß Polyethylenoxid (PEO)-Oberflächen einer Adsorption von Proteinen widerstehen, wurde PEO den Oberflächen von herkömmlich verwendeten biomedizinischen Polymeren wie Polyethylenterephthalat (PET), Pellethan (ein im Handel erhältliches Polyurethan, PELL) und Polymethylmethacrylat (PMMA) einverleibt. Eine neue Lösungstechnik wurde eingesetzt, um PEO und andere wasserlösliche Polymere (WLP), wie Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Polyethyloxazolin (PEOX) einzuverleiben. Das Vorhandensein von PEO, PVP und PEOX auf diesen Oberflächen wurde unter Einsatz der Kontaktwinkelanalyse und ESCA verifiziert. Die kurzzeitige Blutkompatibilität auf den modifizierten Polymeren wurde in einem in vitro Parallel-Platten- Durchflußsystem untersucht, das in Verbindung mit Epifluoreszenz-Videomikroskopie verwendet wurde, die zur Quantifizierung anhaftender Blutplättchen auf den Polymeroberflächen verwendet werden konnte. Es wurde gefünden, daß die PEO-modifizierten Oberflächen eine niedrigere Thrombogenizität gegenüber den jeweiligen Kontrolloberflächen zeigten, wobei das PEO mit einem Molekulargewicht von 18.500 eine viel geringere celluläre Antwort zeigte als das PEO mit einem Molekulargewicht von 5.000 oder 100.000 sowie die anderen wasserlöslichen Polymere. Eine Rasterelektronenmikroskopie wurde auf diesen Oberflächen nach Blutdurchfluß eingesetzt und diese Tests zeigten ähnliche Ergebnisse wie die videomikroskopische Analyse. Eine Adhäsion und Ausbreitung menschlicher Vorhaut-Fibroblasten auf den modifizierten Oberflächen wurde verwendet, um die Wirksamkeit von PEO, PVP und PEOX bei der Verhinderung der Zelladhäsion zu testen. Eine drastische Antwort wurde für die PEO 18.500-modifizierten Oberflächen erhalten dergestalt, daß über die fast 30 Tage im Anschluß an das Aussäen dieser Zellen ein extrem niedriges Anhaften auf den PEO 18. 500-modifizierten Oberflächen erhalten wurde, wohingegen alle anderen innerhalb 5 bis 10 Tagen Konfluenz erreichten. Diese Ergebnisse lassen zusammen mit den Untersuchungen zur Proteinadsorption, die eine signifikante Reduktion an adsorbiertem Protein nur bei den PEO 18.500-modifizierten Oberflächen zeigten, vermuten, daß dieses Molekulargewicht bei der Verhinderung der Proteinadsorption und somit cellulärer Wechselwirkungen an der Oberfläche des modifizierten Polymers geeignet sein kann. Das PEO 5.000-Molekül kann zu kurz sein, um diese Funktion wirksam auszuüben, und das PEO 100.000 kann zu lang oder zu sperrig sein, um wirksam in die Ausgangsoder Grundpolymeroberfläche eingebaut zu werden. Sowohl PVP als auch PEOX besitzen in ihrer sich wiederholenden Einheit Amide und dies kann als potentielle Wechselwirkungsstelle dienen, die zu Proteinadsorption und cellulärer Anlagerung bzw. Bindung führt. Somit ist ein PEO-Molekül mit mehr als 5.000 und weniger als 100.000 geeignet zum Ausschluß von Protein- und cellulärer Adhäsion an ein nacktes Polymer.
Während diese Zell-Nichtadhäsionsmaterialien eigenen Nutzen finden, können sie auch besonders nützlich sein, wenn sie als Ausgangsmaterial verwendet werden, an das die Adhäsion fördernde Peptide angelagert oder gebunden werden. In dieser Situation adsorbieren Proteine nicht an die Oberfläche und als solches sind die einzigen adhäsions-fördernden Materialien auf der Oberfläche diejenigen, die chemisch in Form des Peptids zugegeben werden. Dies erlaubt den Einbau einer Zelltypspezifität in die Oberfläche durch Steuerung des spezifischen Peptids, das eingebaut wird, Modulation bzw. Anpassen des Verbindungsarmes, durch den das Peptid an die Oberfläche gebunden wird und Modulation bzw. Anpassen der Peptidoberflächendichte. Eine derartige Spezifität ist nicht möglich, wenn das Peptid an die Oberfläche adsorbiert wird, da Proteine auch adsorbieren würden, was zu mehrfachen Adhäsionssignalen führt.
Das hierin dargelegte Beweismaterial der Anmelderin veranschaulicht die zelladhäsiven Eigenschaften, die einer Oberfläche verliehen werden, die mit offenbarten Peptiden behandelt wurde, und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derartiger behandelter Oberflächen. Die behandelten Oberflächen sind für die Kultur von Spezies und Typen von Zellen, die z.B. Schweine-, Mäuse-, Insekten- und Humanzellen einschließen, geeignet. Die Anmelder haben eine Vielfalt von Zellen verwendet, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen, einschließlich beispielsweise und nicht beschränkend menschliche bzw. Human-Vorhaut-Fibroblast (HVF)-Zellen, Schweine-Aorta- Endothelial (SAE)-Zellen bzw. endotheliale Schweine-Aorta-Zellen, Embryonen- und Neugeborenen-Gewebezellen. Jedoch kann die vorliegende Erfindung in Verbindung mit jeder Spezies oder Gewebequelle von Zelle verwendet werden, und sie ist nicht auf die Verwendung mit irgendeinem bestimmten Zelltyp beschränkt. Die folgenden Absätze umreißen bestimmte bevorzugte Verfahren zur Züchtung spezifischer Zelltypen, die zur Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

ZELLKULTURARBEITSVORGÄNGE

3T3-ZELLEN

NIH/3T3-Zellen, eine unsterbliche Zellinie von Embryonenzellen, die von Schweizer Mäuse-Embryonen angelegt wurden, wurden von der American Type Culture Collection Zellhinterlegungsstelle (ATCC # CRL 1658) erhalten. Die Kulturen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium, das mit 10% fötalem Kalbserum ergänzt war, gehalten und bei 37ºC in einer befeuchteten 5%-igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Konfluente Monolayer von Zellen wurden durch Inkubation in einer Lösung von 0,5% Trypsin und 0,53 mM EDTA in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 37ºC für 15 Minuten gezüchtet. Die Zellen wurden in frischem Medium resuspendiert und subkultiviert, indem man die Zellen anlagern ließ und in neuen Kulturschalen wachsen ließ.

HUMAN-VORHAUT-FIBROBLASTEN

Human-Vorhaut-Fibroblasten (HVFs) sind primäre Zellinien, die aus Neugeborenen-Vorhaut-Gewebe vom Seton-Krankenhaus, Neugeborenenstation, Austin, Texas, isoliert werden. Etwa 5-10 Neugeborenen-Vorhäute werden aseptisch in steriler PBS gesammelt, in 5 mm²-Stücke zerschnitten und für 4 Stunden in Trypsin-EDTA inkubiert. Die HVFs wurden durch Zentrifügieren bei 200 g für 5 Minuten gesammelt und in Dulbeccos Modifizierung von Eagles Medium (DMEM, Mediatech), das mit 10% fötalem Kalbserum (GIBCO), 400 u/ml Penicillin (Irvine) und 400 ug/ml Streptomycin (Irvine) ergänzt war, resuspendiert und bei 37ºC in einer befeuchteten 5%-igen CO&sub2;- Atmosphäre inkubiert. Die Zellen wurden subkultiviert durch Trypsinisierung von konfluenten Monolayern, Suspendieren der Zellen in frischem Medium und Aussäen der Zellen in neue Kolben. Die HVFs wurden in Kultur für bis zu 20 Durchgänge gehalten, bevor sie verworfen werden.

ENDOTHELIALE SCHWEINE-AORTA-ZELLEN

Endotheliale Schweine-Zellen wurden von getöteten Miniaturschweinen erhalten. Die endothelialen Zellen wurden mittels des Verfahrens von Jaffe et al., (1973, J. Clin. Invest., 52: 2745-2756) isoliert. Konkret wurden Schweine- Aorta-Gewebesegmente von getöteten Minaturschweinen mit warmem (37ºC) PBS zur Entfernung von Blut gewaschen und in 10 cc Spritzen eingebracht. Das Lumen der Segmente wurde dann mit einer 100 µl/ml Lösung von Sigma, Typ II Kollagenase gefüllt. Das Gewebe wurde dann für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Lumen der Aorta wurde daraufhin mit PBS gewaschen, und die Zellen wurden für 5 Minuten bei 200 g zentrifügiert und in Medium 199, das mit 20% fötalem Kalbserum und Antibiotikum ergänzt war, resuspendiert. Die Suspension wurde zu Kulturkolben zugefügt und die Kulturen wurden bei 37ºC in einer befeuchteten, 5%-igen CO&sub2;-Atmosphäre gehalten.

ENDOTHELIALE HUMAN-NABEL-VENEN-ZELLEN

Human-Nabel (Umbilikal)-Venen-Endothelial-Zellen (HUVEZs) sind primäre Zellinien die aus Postpartum-Nabelschnüren vom Seton-Krankenhaus, Entbindungsstation, Austin, TX, durch das Verfahren von Jaffe et al. (1973 J. Clin. Invest., 52:2745-2756) erhalten werden. Die Postpartum-Nabelschnüre werden in 5-12 Inch-Abschnitte abgeklemmt, von dem Placentagewebe abgeschnitten und aseptisch in steriler PBS gesammelt. Die Klemmen werden von den geschnittenen Schnüren entfernt, verklumptes Blut in der Nabelvene wird herausgepreßt, indem man sanften Druck auf die Schnur ausübt. Blut wird aus der Vene herausgewaschen, indem man ein Ende der Vene mit einer sterilen Pipette durchdringt und sterile PBS durch das Lumen der Vene sanft fließen läßt. Das offene Ende der Vene wird dann extern mit einer Gefäßklemme abgeklemmt, um die Vene abzuschließen, und PBS, das 240 U/ml Typ II Collagenase (Sigma) enthält, wird durch die Kanüle zugegeben, bis die Vene vollständig mit der Enzymlösung gefüllt war. Die Kanüle wurde dann entfernt und das offene Ende der Vene wurde abgeklemmt, so daß die Schnur mit dieser Lösung für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert werden konnte. Die Arterienklemmen wurden nach der 30-minütigen Inkubationszeit entfernt und die Enzymlösung, die die HUVEZs enthielt, wurde in ein steriles Zentrifugationsröhrchen abgeleitet. Zusätzliche 20 ml steriler PBS ließ man durch das Lumen der Vene laufen und sammelte sie in dem sterilen Zentrifugenröhrchen. Die HUVEZs in diesem Röhrchen wurden durch Zentrifugieren bei 200 g für 5 Minuten gesammelt und in Medium 199 (M199, GIBCO), das mit 20% fötalem Kalbserum (GIBCO), 400 U/ml Penicillin, 400 µg/ml Streptomycin (GIBCO), 100 µg/ml endothelialem Zellwachstumszusatz bzw. -supplement (Collaborative Search) und 100 µg/ml Schweine-Heparin (Sigma) ergänzt war, resuspendiert und bei 37ºC in einer befeuchteten, 5%-igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Die Zellen wurden subkultiviert durch Trypsinisierung kontluenter Monolayer, Suspendieren der Zellen in frischem Medium und Aussäen der Zellen in neue Kolben. Die HUVEZs wurden für bis zu 5 Durchgänge in Kultur gehalten, bevor sie verworfen werden.

HUMAN-GEFÄSS-GLATTMUSKEL-ZELLEN

Zellen der menschlichen, vaskulären, glatten Muskeln (HVGMZs) sind primäre Zellinien, die aus Postpartum-Nabelschnüren vom Seton-Krankenhaus, Entbindungsstation, Austin, TX, durch das Verfahren von Jaffe et al. (1973, J. Clin. Invest., 52:2745-2756) isoliert werden. Postpartum-Nabelschnüre, von denen HUVEZs isoliert wurden, wurden durch wiederholtes Drücken der Schnur extern mit einer Gefäßklemme verletzt bzw. traumatisiert. PBS, das 240 U/ml, Typ II Collagenase (Sigma) enthielt, wurde zum Lumen der Vene zugegeben, bis die Vene komplett mit der Enzymlösung gefüllt war.
Die Schnur wurde abgeklemmt, so daß die Schnur mit dieser Lösung für 30 Minuten bei 37ºC inkubiert werden konnte. Die Gefäßklemmen wurden nach der 30-minütigen Inkubationszeit entfernt und die Enzymlösung, die die HVGMZs enthielt, wurde in ein steriles Zentrifugationsröhrchen abgeleitet.
Zusätzliche 20 ml der sterilen PBS wurden durch das Lumen der Vene laufengelassen und in dem sterilen Zentrifugenröhrchen gesammelt. Die HVGMZs in diesem Röhrchen wurden durch Zentrifugieren bei 200 g für 10 Minuten gesammelt und in Medium 199 (M199, GIBCO), das mit 20% fötalem Kalbserum (GIBCO), 400 U/ml Penicillin, 400 µg/ml Streptomycin (GIBCO), 100 µg/ml endothelialem Zellwachstumsersatz bzw. -supplement (Collaborative Search) und 100 µg/ml Schweine-Heparin (Sigma) ergänzt war, resuspendiert und bei 37ºC in einer befeuchteten, 5%-igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Die Zellen wurden subkultiviert durch Trypsinisierung konfiuenter Monolayer, Suspendieren der Zellen in frischem Medium und Aussäen der Zellen in neue Kolben. Die HVGMZs wurden in Kultur für bis zu 5 Durchgänge gehalten, bevor sie verworfen werden.

MENSCHLICHE BLUTPLÄTTCHEN (Plt)

Menschliche Blutplättchen wurden aus heparinisiertem Vollblut (4 U/ml) erhalten, das bei 250 g für 15 Minuten zentrifügiert wurde, um ein blutplättchenreiches Plasma (PRP) zu erhalten. Das Blut wurde von gesunden, mänrilichen, nicht rauchenden Donoren gesammelt. PRP wurde aus dem zentrifugierten Blut entfernt und in Blutplättchenausbreitungsassays verwendet. Vorstimulierte Blutplättchen (Vorstim Pit) wurden mit 5 µM ADP vor der Bestimmung der Blutplättchenausbreitung behandelt.
In den folgenden Beispielen werden die Peptide YIGSR, GRGD, GRGE, GYIGSR, GRGEY und RGDS u.a. verwendet. Zwar fallen diese Peptide nicht unter den Wortlaut der Ansprüche, die sich darauf beziehenden Beispiele und Figuren wurden zum besseren Verständnis der Erfindung beibehalten.
Beispiel 1 beschreibt das Verfahren, durch das besonders bevorzugte Peptidfragmente synthetisiert wurden.
Beispiel 2 beschreibt die Derivatisierung einer PHEMA-Polymeroberfläche.
Beispiel 3 beschreibt die Derivatisierung einer PET-Polymeroberfläche.
Beispiel 4 beschreibt das bevorzugte Verfahren zur Herstellung einer primären Zellkultur aus Vorhautgewebe.
Beispiel 5 beschreibt die Adhäsion von Zellen an eine derivatisierte PHEMA- und PET-Polymeroberfläche.
Beispiele 6, 7 und 8 beschreiben die Derivatisierung einer Glasoberfläche, die zelladhäsiven und unterstützenden Eigenschaften von derartigen derivatisierten Glasoberflächen und die vergleichenden, zellunterstützenden Eigenschaften, die durch verschiedene Peptide an einer derivatisierten gegenüber einer nichtderivatisierten Glasoberfläche bereitgestellt werden.
Beispiel 9 beschreibt die relative Stabilität einer derivatisierten PET-Polymer- und Glycophasen-Glas-Oberfläche gegenüber Hitze und Proteolyse.
Beispiel 10 stellt eine vergleichende Untersuchung zu den zellunterstützenden Eigenschaften einer vorbehandelten gegenüber einer nicht vorbehandelten PET-Polymeroberfläche dar.
Beispiele 11 und 12 veranschaulichen vorgeschlagene Verfahren zur Verwendung der beschriebenen Oberflächenderivatisierungsverfahren mit einem biomedizinischen Implantat (Beispiel 11 - Verweilkatheter; Beispiel 12 - Nervenwachstumsleiter bzw. Nervenstrangleiter bzw. -leitungen).
Beispiel 13 beschreibt die HVF-Zelladhäsion und -ausbreitung auf behandelten Oberflächen mit verschiedenen Leveis an Peptidsubstitution.
Beispiel 14 beschreibt Glas mit Glycophase - ein zell-nichtadhäsives Modellsubstrat, an das Peptide gekuppelt werden können.
Beispiel 15 beschreibt Glas mit Glycophase, das mit RGD-Materialien gekuppelt ist, die die Adhäsion von Fibroblasten und endothelialen Zellen, jedoch nicht von Blutplättchen, unterstützen.
Beispiel 16 beschreibt Glas mit Glycophase, das mit YIGSR-Materialien gekuppelt ist, die die Adhäsion von Fibroblasten und endothelialen Zellen, jedoch nicht Blutplättchen, unterstützen.
Beispiel 17 beschreibt Glas mit Glycophase, das mit PDSGR-Materialien gekuppelt ist, die die Adhäsion von Fibroblasten und endothelialen Zellen, jedoch nicht Blutplättchen, unterstützen.
Beispiel 18 beschreibt Glas mit Glycophase, das mit REDV-Materialien gekuppelt ist, die die Adhäsion von endothelialen Zellen, jedoch nicht von Fibroblasten oder Blutplättchen, unterstützen.
Beispiel 19 beschreibt Glas mit Glycophase, das mit IKVAV-Materialien gekuppelt ist, die nicht die HUVEZ- oder Blutplättchenausbreitung unterstützen, jedoch den Neuritauswuchs unterstützen sollten.
Beispiel 20 beschreibt Polyethylenterephthalat, an das Polyethylenglycol immobilisiert worden ist - ein polymeres zell-nichtadhäsives Substrat, an das Peptide angelagert werden können (abgekürzt PET/PEG).
Beispiel 21 beschreibt PET/PEG, das mit RGD-Materialien gekuppelt wurde, die die Adhäsion von Fibroblasten und endothelialen Zellen, jedoch nicht von Blutplättchen oder vaskulären, glatten Muskelzellen unterstützen.
Beispiel 22 beschreibt PET/PEG, das mit REDV-Materialien gekuppelt wurde, die die Adhäsion von endothelialen Zellen, jedoch nicht von Fibroblasten oder Blutplättchen oder vaskulären, glatten Muskelzellen unterstützen.
Beispiel 23 beschreibt PET/PEG, das mit IKVAV-Materialien gekuppelt wurde, die nicht die HUVEZ- oder Blutplättchenausbreitung unterstützen, jedoch die HFV-Ausbreitung unterstützen und den Neuritauswuchs unterstützen sollten.
Beispiel 24 beschreibt eine Lösungstechnik zum Einbau von Polyethylenoxid und anderen, wasserlöslichen Polymeren in die Oberflächen von polymeren Biomaterialien.

BEISPIEL 1 - KLEINE PEPTIDE

Dieses Beispiel veranschaulicht besonders bevorzugte Verfahren zur Synthetisierung von Peptiden, die weniger als 12 Aminosäurereste besitzen und wenigstens die Aminosäuresequenz Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) einschließen. Diese Sequenz ist eine spezifische, minimale Zellanlagerungssequenz, die von Zellen bei der Zelladhäsion über einen dazwischengeschobenen Zellrezeptor erkennbar ist.
Die in diesen Untersuchungen verwendeten Peptide umfassen GPDSGRY, GIKVAVY, GREDVY, GRGD, GRGE, GYIGSR, GRGDY, GRGEY und GYIGSRY, wurden durch die bekannten Arbeitsschritte an der Universität von Texas Southwestern Medical School, Peptidsyntheselabor, hergestellt oder von Biosynthesis, Inc., Denton Texas, erhalten.

BEISPIEL 2 - HERSTELLUNG VON PHEMA-POLYMER OBERFLÄCHE

Dieses Experiment wurde darauf angelegt, ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer Polymeroberfläche mit kleinen Peptidfragmenten, die daran kovalent gebunden sind, zu beschreiben. PHEMA (Poly(hydroxyethylmethacrylat)) ist ein Hydrogel, von dem man gefunden hat, daß es in seinem unbehandelten Zustand nicht in der Lage ist, Zelladhäsion zu unterstützen.
Die besonders bevorzugten Peptide GRGD und GYIGSR wurden auf die Polymeroberfläche unter Verwendung der PHEMA-Oberfiächenhydroxylgruppen und des terminalen primären Amins des Glycin-Linkerarms des Peptids unter Einsatz der Tresylchloridaktivierung gepfropft. Die G-Gruppe am terminalen Ende des jeweiligen Peptids wurde verwendet, um einen Abstand zwischen dem oberflächenaktiven Peptid (GRGD) und der Polymeroberfläche einzufügen.
Insbesondere wurde bei dem Kupplungsverfahren die Aktivierung von PHEMA-Oberflächenhydroxylanteilen mittels Tresylchlorid in einem organischen Lösungsmittel für die Reaktionskomponente, jedoch einem Nichtlösungsmittel für das Polymere, eingesetzt. Die PHEMA-Filme benötigten keine Vorbehandlung, da ihre Oberflächen reichlich mit Hydroxyethylgruppen ausgestattet sind. Die zelladhäsiv-fördernden Aktivitäten dieser modifizierten Oberfläche wurden wie in Beispiel 4 umrissen bestimmt, wobei in vitro Zelladhäsionsund Ausbreitungsassays durchgeführt wurden. Die Tresylabgangsgruppe wurde dann in einem wäßrigen Lösungsmittel durch das terminale Amin des Peptids GRGD oder GYIGSR verdrängt.
Die unmodifizierten PHEMA-Filme wurden dann tresyl-aktiviert in 20 ml trockenem Ether, der 20 µl 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid (Tresylchlorid) und 2 ml Triethylamin enthielt, für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die aktivierten Filme wurden dann mit 0,2 M Natriumbicarbonatpuffer mit pH 10 gewaschen und in den gleichen Puffer, der 80 ng/ml GRGD enthielt, für 20 Stunden bei Raumtemperatur eingebracht, um das Peptid zu kuppeln.

BEISPIEL 3 - HERSTELLUNG VON POLY(ETHYLENTEREPHTHALAT) (PET)-POLYMEROBERFLÄCHE

Dieses Experiment war darauf angelegt, ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer Oberfläche zu beschreiben, die frei von Hydroxylanteilen ist, um den Einschluß kleiner Peptide darin zur Förderung der Zelladhäsion zu erleichtern.
Die PET-Oberfläche ist ein Polymer, das frei von Hydroxylanteilen ist und daher muß die Oberfläche vorbehandelt werden, bevor sie daraufhin mit einem Peptid modifiziert wird. Konkret wurde die PET-Filmoberfläche über eine elektrophile aromatische Substitution modifiziert, die Hydroxymethylgruppen zu der Oberfläche hinzufügte. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck ausgeführt. Die Filme wurden dann in 18,5%- igem (V/V) Formaldehyd und 1M Essigsäure für etwa 4 Stunden eingetaucht. Die vorbehandelte PET-Oberfläche wurde dann exakt modifiziert, wie es für die PHEMA-Oberfläche, in Beispiel 2 umrissen, beschrieben ist.
Die folgende Auflistung stellt das bevorzugteste Verfahren zur Vorbehandlung einer Polymeroberfläche, wie einer PET-Matrix dar, die keine Hydroxylanteile einschließt. Die Oberflächenmodifizierung von Hydroxylanteilen und die Anlagerung von Peptidfragmenten daran wurde mit dem folgenden Protokoll erreicht:
1. Einfügung von Oberflächenhydroxymethylanteilen - an die PET-Polymeroberfläche, indem man eine elektrophile aromatische Substitution der Oberflächengruppen oder der Polymeroberfläche ausführt, wobei das PET-Polymer in 18,5%-igen (V/V) Formaldehyd und 1 M Essigsäure für 4 Stunden bei Raumtemperatur eingetaucht wird.
2. Tresylaktivierung - von Oberflächenhydroxylanteilen, wobei der vorbehandelte PET-Film in 20 ml trockenen Ether, der 40 µl 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid (Tresylchlorid) und 2 ml Triethylamin enthält, für 15 Minuten bei Raumtemperatur eingetaucht wird.
3. Waschen - der aktivierte PET-Film wurde dann mit 0,2 M Natriumbicarbonatpuffer mit pH 10 bei Raumtemperatur gewaschen, um das Peptid zu kuppeln.
4. Peptidkupplung an die Oberfläche - die gewaschenen PET-Filme wurden dann in den gleichen Puffer, der 80 ng/ml GRGD- oder GYIGSR- Peptid enthielt, für 20 Stunden eingebracht.

BEISPIEL 4 - PRIMÄRE ZELLKULTUR VON HUMAN-VORHAUT- GEWEBE

Human-Vorhaut-Fibroblasten (HVFs) sind primäre Zellinien, die aus Neugeborenen-Vorhautgewebe vom Seton-Krankenhaus, Neugeborenenstation, Austin, Texas, isoliert wurden. Die folgenden Arbeitsschritte wurden durchgeführt, um primäre Zellinien von diesen Geweben anzulegen: 5-10 Vorhäute wurden aseptisch in steriler PBS gesammelt, in 5 mm²-Stücke geschnitten und in Trypsin-EDTA fur 4 Stunden inkubiert. Die HVFs wurden durch Zentrifügieren bei 200 g für 5 Minuten gesammelt und in Dulbeccos-Modifizierung von Eagles Medium, das mit 10% fötalem Kaibserum ergänzt war, resuspendiert. Die Zellen wurden subkultiviert durch Trypsinierung konfiuenter Monolayer, Suspendieren der Zellen in frischem Medium und Aussäen der Zellen in neue Kolben. Die HVFs wurden in Kultur für bis zu 20 Durchgänge gehalten, bevor sie verworfen wurden.

BEISPIEL 5 - ZELLADHÄSIONSUNTERSUCHUNGEN ÜBER DERIVATISIERTE PHEMA- UND PET-POLYMEROBERFLÄCHEN

Dieses Experiment war dazu angelegt zu bestimmen, ob eine Polymeroberfläche entwickelt und synthetisiert werden konnte, die eine Zelladhäsion über einen dazwischengeschobenen Rezeptor in Abwesenheit irgendwelcher intermediärer adsorbierten Proteine unterstützen würde, d.h. zur Erzeugung einer Oberfläche, die bezüglich ihrer Stütze für die Zelladhäsion und -ausbreitung völlig selbstausreichend ist. Eine Immobilisierung der gesamten Proteine, wie z.B. Collagen oder Fibronectin, kann dies erreichen, ist jedoch mit Proteolyse-, Proteinzersetzungs- und Proteindenaturierungsschwierigkeiten verbunden. Um dies zu umgehen, wurde die kleine, thermisch stabile Peptidregion der meisten CAMs, Arg-Gly-Asp (RGD) kovalent an die Oberfläche der Polymerfilme mit einem Gly-N-terminalen Linker in Form von Gly-Arg-Gly-Asp (GRGD) gekuppelt. Dies führte zu stabilen Oberflächen, die an sich bioadhäsiv war, d.h. die Materialoberflächen enthielten Gruppen mit einer hohen Affinität für Zelloberflächen-Rezeptoren, völlig unabhängig von adsorbierten CAMs aus dem Kulturmedium. Diese Oberflächenmodifizierung stellte eine systematische Methodik zur Entwicklung gut charakterierter Substrate bereit, die die Optimierung eines Kultursystems vereinfachen. Mäuse-NIH- 3T3 (ATCC # CRL 1658)-Fibroblasten wurden gewaschen und in serumfreiem Medium sowohl auf behandelten als auch unbehandelten PHEMA-Substraten inokuliert. Die behandelten PHEMA-Substrate wurden hergestellt, wie in Beispiel 2 umrissen.

KULTURVERFAHREN

NIH/3T3-Fibroblasten (ATCC # CRL 1658, Rockville MD) wurden in DMEM, das mit 10% Kalbserum ergänzt war, in einer befeuchteten 5%-igen Kohlendioxidatmosphäre bei 37 ºC gezüchtet. Schweine-Aortas wurden von getöteten Miniaturschweinen erhalten. Die endothelialen Zellen wurden durch das Verfahren von Jaffe et al. (1973, J. Clin. Invest 52 2745-2756) mit einer Modifizierung erhalten, um einen Überfluß an luminaler Oberfläche des Gefäßes mit Collagenase zu erleichtern. Schweine-Aorta-Endothelial-Zellen (SAE) wurden in DMEM, das mit 10% fötalem Kalbserum ergänzt war, unter den gleichen Inkubationsbedingungen wie oben gehalten.

OBERFLÄCHENMODIFIZIERUNGSPROZEDUR

GRGD wurde auf Polymeroberflächen über das glycyl-terminale Amin unter Einsatz der Tresylchlorid-Immobilisierungsmethode von Nilsson und Mosbach und, wie in Beispielen 3 und 4 beschrieben, gepfropft. Zwei Polymeroberflächen wurden modifiziert, Poly(hydroxyethylmethacrylat) (abgekürzt PHEMA) und Poly(ethylenterephthalat) (abgekürzt PET). Bei dem Kupplungsverfahren wurde eine Aktivierung der Oberflächenhydroxylanteile durch Tresylchlorid in einem organischen Lösungsmittel für die Reaktionskomponenten, das auch ein Nichtlösungsmittel für das Polymere ist, eingesetzt.
Die Tresyl-Abgangsgruppe wurde dann in wäßrigem Lösungsmittel durch das terminale Amin des Peptids verdrängt.
Poly(ethylenterephthalat) (PET) besitzt keine verfügbaren Hydroxylgruppen für eine Tresylchlorid-Aktivierung, daher wurde ein Oberflächenhydroxylierungs verfahren entwickelt. Es wurde eine elektrophile aromatische Substitution eingesetzt (FIG. 1), die Hydroxymethylgruppen an die PET-Filme addiert. Konkret wurden die kommerziell erhältlichen PET-Filme in 18,5%-igem (V/V) Formaldehyd und 1 M Essigsäure für 4 Stunden bei Raumtemperatur eingetaucht, wie es spezifisch in Beispiel 3 definiert ist. PHEMA-Filme erfordern keine Vorbehandlung, da ihre Oberflächen reichlich mit Hydroxyethylgruppen ausgestattet sind.
Die modifizierten PET- und unmodifizierten PHEMA-Filme wurden tresylaktiviert in 20 ml trockenem Ether, der 40 µl 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid (Tresylchlorid) und 2 ml Triethylamin enthielt, für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die aktivierten Filme wurden dann mit 0,2 M Natriumbicarbonatpuffer mit pH 10 gewaschen und in den gleichen Puffer, der etwa 80 ng/ml GRGD enthielt, für 20 Stunden bei Raumtemperatur zur Kupplung des Peptides eingebracht. FIG. 2 veranschaulicht grafisch einen modifizierten PET-Film mit Hydroxymethylanteilen und die anschließenden Schritte, die bei der Tresyl-Aktivierung und GRGD-Kupplung involviert sind.

ZELLAUSBREITUNGSASSAY

NIH/3T3- und PAE-Zellen wurden von Kulturkolben losgelöst durch Trypsinisierung und in serumfreiem Medium (DMEM mit 1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA) suspendiert. Die Zellen wurden zweimal durch Zentrifügieren in dem BSA-haltigen Medium gewaschen und bei einer Dichte von 3.000 Zellen pro cm² Film ausgesät, soweit nichts anderes angegeben ist, in serumfreien Medium und in der normalen Kulturumgebung inkubiert. Ausgebreitete Zellen wurden durch morphologische Merkmale, wie getrennte Kerne bzw. Zellkerne, Pseudopodium und polygonale Form (FIG. 3) gescored bzw. ausgewertet. Die Zellen wurden bei 200X Vergrößerung unter Einsatz einer Hoffman-Modulationskontrastoptik auf einem Leitz Fluovert umgekehrten Objektträgermikroskop visualisiert. Das Zellwachstum wurde auch ausgewertet durch Bestimmung der Ausbreitungs-Zell-Counts (bzw. -zählungen) zu verschiedenen Zeitpunkten für Zellen, die in Medien gezüchtet wurden, die mit 10% Kalbserum ergänzt waren.

ACTIN-BELASTUNGSFASER-VISUALISIERUNG

NBD-Phallacidin (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazolylphallacidin) (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) wurde zur Visualisierung von Actin-Belastungsfasern und Mikrofaserbündeln in Zellen, die an die modifizierten Oberflächen gebunden waren, eingesetzt. Die Proben wurden gemäß den Herstellerangaben hergestellt und 1000X-Bilder wurden unter Einsatz des Fluovert-Mikroskops, das mit einem Leitz E3-Anregungsfilter und UV-Beleuchtung ausgestattet war, in Augenschein genommen.

UNTERSUCHUNGEN ZUR KONKURRENZ VON LÖSLICHEN PEPTIDEN

In den Kohkurrenzuntersuchungen wurden 3T3-Fibroblasten für 30 Minuten entweder in serumfreiem Medium, das etwa 90 ug/ml RGDS oder kein Peptid enthielt, vorinkubiert. Die Zellen wurden dann bei einer Dichte von etwa 3.000 Zellen/cm² auf GRGD-derivatisiertem PET inokuliert und die Ausbreitung wurde nach dreistündiger Inkubation unter normalen Kulturbedingungen bestimmt.
Die GRGD-derivatisierten Substrate wurden charakterisiert durch ihre Fähigkeit, die aktive Adhäsion von Zellen auf ihren Oberflächen zu unterstützen. Die PET-Vorbehandlung wurde optimiert, indem man GRGD an tresylchlorid-aktivierte Filme kuppelte, die für verschiedene Zeitdauern hydroxyliert wurden. Es wurden Zellausbreitungsassays unter Verwendung von NIH/3T3- Fibroblasten ausgeführt, um die Bedingungen zu bestimmen, die eine Maximalantwort unterstützten. Vier Stunden Vorbehandlung erschienen optimal für maximale Zelladhäsion und -ausbreitung. PHEMA-Filme wurden mit GRGD unter Einsatz niedriger Konzentrationen an Peptid (80 ng/ml) derivatisiert, was zu einer Zunahme bei der cellulären Adhäsion um drei Größenordnungen führte (FIG. 4).
Ein Vergleich von GRGD-gekuppelten PET-Filmen mit vorbehandelten untresylierten Filmen, die mit GRGD für die normale Kupplungszeit inkubiert wurden, zeigte, daß entweder wenig Peptid an die letzteren Filme adsorbiert wurde oder daß das adsorbierte Peptid nicht für die Adhäsionsantwort über einen dazwischengeschobenen Rezeptor verfügbar war (FIG. 5). Die GRGD-modifizierten Oberflächen unterstützten viel besser die 3T3- Zelladhäsion als das unbehandelte PET, selbst in Anwesenheit von Serum, was eine intrinsische bzw. innere bzw. spezifische Aktivität auf der modifizierten Oberfläche anzeigt (FIG. 6).
Das Konkurrenzexperiment führte zu einer 75%-igen Reduktion der Anlagerung an die modifizierten Oberflächen in Anwesenheit von etwa 90 ug/ml RGDS, was weiterhin die biospezifische Aktivität der Substrate veranschaulicht (FIG. 7). Eine makroskopische bzw. Grund-Morphologie (FIG. 3) von ausgebreiteten 3T3-Fibroblasten in serumfreiem Medium auf den modifizierten Filmen erschien normal (FIG. 3).
Die Tatsache, daß keine Cytoskelettorganisation auf RGDS-modifizierten Oberflächen beobachtet wird, zeigt an, daß die vollständige adhäsive Antwort dieser Zellinie und anderen nicht auf RGDS-modifizierten Oberflächen erhalten wird. Dies ist jedoch keine allgemeine Erscheinung, da von einigen Zelltypen einschließlich normalen Rattennierenfibroblasten und NIL 8, einer normalen Hamster-Fibroblast-Zellinie, gezeigt wurde, daß sie voll auf Substrate, die nur RGD-Peptide enthalten, antworten (14). Ein Wachstum auf dem GRGD-derivatisiertem PET war serumabhängig und war ähnlich zu dem auf unmodifiziertem PET (FIG. 8), jedoch war die anfängliche Anlagerung und Ausbreitung schneller, wie es durch die Beobachtung angezeigt wird, daß die GRGD-Kurve (offene Kästchen) die Kontrollkurve (geschlossene Rauten) in dieser Figur führt.
Eine Anlagerung und Ausbreitung von endothelialen Schweine-Aorta-Zellen auf den GRGD-gekuppelten Oberflächen war ebenfalls serumunabhängig, wie erwartet, da vaskuläre, endotheliale RGD-gerichtete Rezeptoren charakterisiert wurden (15). PAE-Zellausbreitung in komplettem Medium war auf den GRGD-derivatisierten Filmen viel ausgedehnter als den unbehandelten Filmen bei 4 Stunden, jedoch hatten beide Oberflächen konfluente Monolayer von Zellen bei 24 Stunden. Diese Beoachtungen zeigen an, daß die Kinetik der PAE-Zellanlagerung auf der modifizierten Oberfläche schneller war.
Die offenbarten Verfahren der Anmelder stellen Mittel bzw. Einrichtungen zum Erhalt stabiler, chemisch definierter Oberflächen zur Verwendung bei der Untersuchung cellulärer Antworten zu Signalen von unlöslicher, extracellulärer Matrix zur Verfügung. Es stellt Einrichtungen zur Verfügung, durch die Zelladhäsion und -ausbreitung von einer Proteinadsorption entkoppelt werden. In diesem Sinne kann es nützlich für diejenigen sein, die lieber serumfreie Zellkulturmedien (d.h. Medien, in die gereingte Proteine individuell zugefügt werden anstelle einer Einführung aus Serum) verwenden, daß Zelladhäsionsmoleküle (CAMs) nicht eingeschlossen werden brauchen. Ob diese Oberflächen in der Lage sind, ein Zeliwachstum bei sehr geringen Serumkonzentrationen zu unterstützen, bleibt zu bestimmen.
Es versteht sich, daß in Anwesenheit der Medienproteine die GRGD-Ober fläche schnell durch adsorbierte Proteine bedeckt wird. Dies ist jedoch nicht problematisch, da Untersuchungen der Anmelder mit Albumin in den Kulturmedien (FIG. 4, 5, 7) anzeigten, daß die hochaffine RGD-Integrin-Verbindung in der Lage ist, in günstiger Weise mit den adsorbierten Proteinen zu konkurrieren. Eine Zellablösung kann durch Calcium-Chelatbildung erreicht werden, da die RGD-Integrin-Affinität calciumabhängig ist.
Es sei angemerkt, daß die Zellfünktion in hohem Maße von der Zellanlagerungsoberfläche abhängig ist (16, 17). Diese Oberfläche kann eine lokale Umgebung bereitstellen, die näher zu der in vivo liegt, und somit kann sie eine stärkere Adhäsion und/oder höhere Produktivität stimulieren.

BEISPIEL 6 - PEPTIDDERIVATISIERUNG EINER GLASOBERFLÄCHE

Das vorliegende Beispiel ist darauf angelegt, das am meisten bevorzugte Verfahren zur Derivatisierung einer keramischen Oberfläche, wie Glas, zu umreißen, um ein die Adhäsion über einen dazwischengeschobenen Zellrezeptor förderndes Substrat zur Verfügung zu stellen.
Glas mit Glycophase wurde mittels des Verfahrens von Ohlson et al. (18) hergestellt. Deckgläser (Coverslips) aus Glas (18 mal 18 mm; Thomas) wurden für zwei Stunden in 0,5 M Natriumhydroxid getränkt, mit entionisiertem Wasser gewaschen und in eine wäßrige Lösung (1%, pH 5,5) (3-Glycidoxypropyl)-trimethoxysilan (Petrarch Systems, Inc.) eingetaucht. Die Präparation wurde erhitzt und 2 Stunden bei 90ºC gehalten. Der pH wurde dann auf 3,0 eingestellt, gefolgt von einem nochmaligen Erhitzen für 1 Stunde, um die Oxiran-Anteile auf dem derivatisierten Glas in Glycolgruppen umzuwandeln. Trockene Deckgläser aus Glas mit Glycophase wurden mit getrockenem Aceton (getrocknet über Molekularsieb 4A; Fisher) gewaschen. Zu etwa 1 ml trockenem Aceton wurden etwa 200 µl trockenes Pyridin und etwa 100 µl trockenes Tresylchlorid (Fluka) zugefügt. Ein minimales Volumen dieses Gemisches wurde zu der oberen Oberfläche jedes Deckglases aus Glas mit Glycophase zugegeben, die in eine Glaskristallisationsschale eingebracht wurden. Man ließ etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur reagieren, dann wurden die Deckgläser in etwa 1 mM Salzsäure gewaschen und schließlich in einem etwa 0,2 M Natriumbicarbonatpuffer bei pH 9 (Kupplungspuffer) gewaschen. Der Kupplungspuffer, der zwischen etwa 5-30 ng/ml Peptid, vorzugsweise etwa 10 ng/ml enthielt, wurde zu einem minimalen Volumen auf den Deckgläser zugegeben und für etwa 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um das Peptid auf die Oberfläche zu pfropfen. Die bei dieser Untersuchung verwendeten Peptide wurden synthetisiert, wie in Beispiel 1 umrissen. Der peptidhaltige Puffer wurde nach einer Inkubationsdauer von etwa 20 Stunden entfernt und durch Kupplungspuffer ersetzt, der einen etwa 0,8 M beta-Mercaptoethanol enthielt. Die Deckgläser wurden für etwa 2 Stunden inkubiert, so daß nicht umgesetzte Tresylgruppen mit einem nichtadhäsiven Anteil reagieren würden.

MESSUNG DER PEPTIDOBERFLÄCHENKONZENTRATION

GRGDY wurde radiomarkiert, indem etwa 20 ug Peptid zu phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4, die etwa 5,0 mCi Na¹²&sup5; I enthielt, zugegeben wurden und für etwa 15 Minuten bei Raumtemperatur mit Iodobeads (Pierce) gemäß den Herstellerangaben inkubiert wurden. Das markierte Peptid wurde gereinigt durch Aufgeben des Reaktionsgemisches auf eine Sep-Pak C&sub1;&sub8;-Probenherstellungskartusche (Waters), die mit Methanol-H&sub2;O-Trifluoressigsäure (TFES) (80:19:1 V/V) gewaschen wurde und mit PBS reequilibriert wurde. Die Kartusche wurde mit 1 % V/V TFES gewaschen, um nicht eingebautes Iod zu eluieren. Das Reaktionsgemisch wurde fraktioniert, indem man die Methanolkonzentration in 1 % TFES stufenweise um 10% mit Methanol-H&sub2;O-TFES (18:19:1 V/V) als endgültigem Eluierungsmittel erhöhte. Die Kartusche wurde mit jeder Konzentration gewaschen, bis die Radioaktivität auf den Ausgangslinienlevel zurückging. Jede Fraktion wurde auf ihrem Peptidgehalt durch Messen der Absorption (Extinktion) bei 220 nm (Epsilon = 8441 M&supmin;¹ cm&supmin;¹) analysiert. Mehr als 90% des eluierten Peptids befand sich in der Methanol-H&sub2;O-TFES (40:59:1 V/V)-Fraktion, die lyophilisiert und in PBS wiederhergestellt wurde. Die spezifische Aktivität des Peptids wurde dann bestimmt nach Zählen einer bekannten Menge markierten Peptids in einem automatischen Gammazähler (Isoflex, ICN Micromedic Systems). Die durchschnittliche spezifische Aktivität betrug 44,0 ± 2,0 mCi/mmol.
Zur Bestimmung der Peptidoberflächenkonzentrationen wurde radiomarkiertes Peptid zu Kupplungspuffer (0,2 M Natriumbicarbonat, pH 10) bei verschiedenen Konzentrationen zugegeben und für 20 Stunden bei tresyl-aktiviertem Glas bei Raumtemperatur inkubiert. Die Eingangskonzentrationen wurden definiert als die Mole an löslichem Peptid, das für die Reaktion pro Einheit Glasoberfläche zur Verfügung stand. Die Oberflächenkonzentrationen wurden definiert als die Mole an Peptid, das pro Einheit Glasfläche gekuppelt wurde, und sie wurden bestimmt durch Zählen der gewaschenen Glasproben in einem Gammazähler und Berechnen der Werte, bezogen auf die spezifische Aktivität des markierten Peptids.
Die synthetischen Peptide Gly-Arg-Gly-Asp-Tyr (GRGDY) und Gly-Tyr-Ile- Gly-Ser-Arg-Tyr (GYIGSRY), die die Liganden für zwei wichtige Klassen von Zelladhäsionsrezeptoren enthalten, wurden kovalent an die nicht-adhäsive, modifizierte Glasoberfläche, glycerin-propylsilan-gebundenes Glas (Glas mit Glycophase bzw. Glycophasenglas) durch das N-terminale Gly gekuppelt. Glas mit Glycophase enthält eine kovalent gebundene, organische Schicht, die Wasser imbibiert bzw. aufnimmt und die Proteinadsorption reduziert, ähnlich zu Hydrogelen, ohne die damit verbundenen Probleme eines Quellens und einer Bulk-Permeation bzw. Permeation der Hauptmenge der wäßrigen Lösungen. Da Glas mit Glycophase Proteine schlecht absorbiert, ist es allein nicht zur Unterstützung der Zelladhäsion geeignet, selbst mit Serum in dem Medium. Daher wurden GRGDY und GYIGSR an Glas mit Glycophase unter Einsatz der Tresylchlorid-Immobilisierungsmethode von Nilsson et al. (1987), Methods Enzymol., 135:65-78). Der Nilsson et al.-Artikel wird hierin durch Bezugnahme besonders mitaufgenommen.
Das N-terminale "G" wurde als Spacer zwischen dem adhäsiven Peptid und der Oberfläche verwendet und das C-terminale "Y" wurde für die Radioiodierung verwendet. Da primäre Amine als Nucleophile dienen, die mit tresylchlorid-aktivierten Trägern reagieren und kovalent daran binden, banden sich die eingesetzten Peptide an das Glas mit Glycophase ausschließlich über das primäre Amin des N-terminalen "G". Die Oberflächenkonzentration an Peptid wurde mittels ¹²&sup5;I-Radiomarkierung gemessen und sie betrug 12,1 Picomol/cm². Dieses Derivatisierungsverfahren erzeugt chemisch stabile Substrate, die beim Studium einer Zelladhäsion über einen dazwischengeschobenen Rezeptor nützlich sein können, da die Menge an auf der Oberfläche verfügbarem Peptid genau gemessen und gesteuert werden kann.

BEISPIEL 7 - ADHÄSION UND AUSBREITUNG VON ZELLEN AUF EINER PEPTID-DERIVATISIERTEN GLASOBERFLÄCHE

Die vorliegenden Beispiele wurden darauf angelegt, die Wirksamkeit der vorgeschlagenen, chemischen Glasoberflächenbehandlungen zur Förderung der Menge und Rate der Zelladhäsion an eine Glasoberfläche zu bestimmen.

SUBSTRATHERSTELLUNG

Die Substrate aus Glas mit Glycophase wurden durch das in Beispiel 6 beschriebene Verfahren hergestellt. Diese modifizierten Substrate unterstützten die Adhäsion und Ausbreitung der gezüchteten Human-Vorhaut-Fibroblasten (HVFs), unabhängig von adsorbierten Proteinen.

GEMESSENE PARAMETER

Die biologische Aktivität von sowohl gepfropften GRGDY als auch GYIGSRY wurde durch Messen der Adhäsion und Ausbreitung von HVF in Anwesenheit und Abwesenheit von Serum in dem Medium bewertet. Eine fokale Kontaktbildung und Cytoskelettorganisation wurden auch auf diesen Substraten beobachtet.

ERGEBNISSE

Die HVF-Ausbreitungsraten waren auf gepfropften YIGSR (GYIGSRY)- Peptidsubstraten viel langsamer als auf den RGD-haltigen (GRGDY)-Peptidoberflächen. Die Zellen bildeten fokale Kontakte oder waren (fokal) abwesend auf den RGD-derivatisierten Substraten in Anwesenheit von Serum. Fokale Kontakte bildeten sich auf den YIGSR-gepfropften Oberflächen nur, wenn Serum im Medium vorlag, und sie besaßen unterschiedliche Morphologien zu denen, die auf den RGD-haltigen Oberflächen beobachtet wurden (FIG. 10; FIG. 12).
Serum beeinflußte die Mikrofaserorganisation und das Ausmaß der Ausbreitung von anhaftenden Zellen, obwohl die Adsorption von Adhäsionsproteinen auf allen Oberflächen minimal war.

BEISPIEL 8 - VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN ZU DEN PEPTIDFRAGMENTEN GRGDY, GYIGSR UND GRGEY AUF EINER DERIVATISIERTEN GLASOBERFLÄCHE

Derivatisierte Glasoberflächen wurden gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren unter Einsatz der GRGDY-, GRGEY- und GYGSRY-Peptide hergesteut. HVF-Zellen wurden dann auf jede der hergestellten Oberflächen aufgestrichen. Dann wurden die Bestimmungen zu der Ausbreitungs- und Wachstumsrate durchgeführt. Man fand, daß unbehandeltes Glas mit Glycophase die Zelladhäsion nicht unterstützt, selbst wenn die Zellen auf diesem Substrat in serum-ergänztem Medium inkubiert wurden, was für ein wenig protein-bindendes Substrat anzeigend ist (Tabelle 1).
Beta-mercaptoethanol-gepfropftes Glas war in gleicher Weise für Zelladhäsion und -ausbreitung nicht unterstützend, wie die Ergebnisse der Zellausbreitungsuntersuchungen (FIG. 2B, D; 3B, D) anzeigen. Da beta-Mercaptoethanol eingesetzt wurde, um mit jeder verbleibenden Tresylgruppe auf der Oberfläche des Glases zu reagieren, wurde ein nicht-adhäsiver Hintergrund auf dieser Oberfläche geschaffen. Darüber hinaus unterstützte gepfropftes GRGEY, das nicht intrinsisch bzw. spezifisch eine Zelladhäsion über einen dazwischengeschobenen Rezeptor unterstützt und Proteine, ähnlich zu gepfropftem GRGDY adsorbiert, nicht die Zelladhäsion (Tabelle 1). Dieses Ergebnis läßt vermuten, daß eine Immobilisierung von GRGDY auf Glas mit Glycophase nicht signifikant die Proteinadsorption auf diesem Substrat erhöht.

BESTIMMUNG DER AUSBREITUNGS- UND WACHSTUMSRATE

HVF-Zellen wurden wie in Beispiel 4 umrissen hergestellt. Diese Zellen wurden für Experimente gezüchtet und zweimal mit Ca²&spplus;- und Mg²&spplus;-freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann in 0,05%- igem Trypsin plus 0,53 mM EDTA in PBS (GIBCO) für 10 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugieren gesammelt und in serumergänztem Medium oder serumfreiem Medium, das aus DMEM mit 2 mg/ml hitzeinaktiviertem (90ºC, 10 Min.) Albumin (Sigma) und Antibiotika bestand, resuspendiert.
Die in komplettem oder serumfreiem Medium suspendierten Zellen wurden auf die Substrate bei einer Dichte von etwa 10.000 Zellen/cm² ausgesät und man ließ sie bei 37ºC in 5%-igem CO&sub2; anlagern und ausbreiten. Ein umgekelrrtes Mikroskop (Fluovert, Leitz), das mit Phasenkontrastobjektiven und einer hochauflösenden Videokamera (67M series, Dage-MTI) ausgestattet war, wurde zur Visualisierung der ausbreitenden Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten verwendet.
Die Bilder wurden mit einem Bildverarbeitungssystem (Series 150, Imaging Technology Inc.) digitalisiert und die Flächen der individuellen Zellen wurden bestimmt mittels Pausen bzw. Kopieren bzw. Aufzeichnen des Umfangs (Perimeters) jeder Zelle in den digitalisierten Bildern mit einem Pausblock (tracing pad) (Digi-Pad, GTCC) und Berechnen der von jeder Pause bzw. Kopie bzw. Spur eingeschlossenen Fläche mit einer Integrationsroutine. Mindestens 100 Zellen wurden analysiert und kumulative Histogramme wurden für jede Zeitdauer konstruiert, so daß die Zellausbreitungsraten bestimmt werden konnten.
Das Zellwachstum in komplettem Medium auf Substraten wurde durch Visualisierung der Zellen mit 100X Phasenkontrastmikroskopie untersucht. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden die Zellen in zehn Feldern gezählt und die Anzahl der Zellen pro Wachstumsoberfläche wurde berechnet, bezogen auf eine durchschnittliche Zellzählung pro Feldfläche.
In den Endpunkt-Zellausbreitungsassays wurde die Proteinsynthese inhibiert, indem man Zellen mit 20 ug/ml Cycloheximid für etwa 30 Minuten, bevor sie auf den Substraten inokuliert wurden, behandelte. Die Zellen wurden während des gesamten Versuchs in Medium gehalten, das Cycloheximid enthielt. Die Zellen, die mit löslichem Peptid behandelt wurden, wurden mit Medium, das Peptid enthielt, für etwa 30 Minuten vorinkubiert und wurden in diesem Medium während des gesamten Versuchs gehalten. Die ausgebreiteten Zellen wurden in 10 Feldern gemäß den Verfahren, die von Massia et al. (1989) (Biochem. Engin. VI Ann. N.Y. Acad. Sci., Band 589, S. 261-270, 1990) beschrieben sind, gescored bzw. ausgewertet. Der prozentuale Anteil an ausgebreiteten Zellen pro Feld wurde berechnet durch Multiplizieren des Verhältnisses von ausgebreiteten Zellen zur Gesamtanzahl an Zellen pro Feld mit 100.

MORPHOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN

Zellen, die an peptid-gepfropften 24 x 50 Deckgläsern (Thomas) hafteten, wurden in einem Kulturkammerobjektträger montiert und auf das Fluorovent umgekehrtes Mikroskop eingepaßt. Ein NPL-Fluotar 100X (Leitz)-Objektiv wurde verwendet, so daß eine Transmissionsphasenkontrast- und Interferenzreflexions (IRM)-Mikroskopie auf dem gleichen Feld ohne Wechseln der Objektive ausgeführt werden konnte. Die Phasenkontrast- und IRM-Bilder wurden von lebenden Zellen, die in Medium eingetaucht waren und bei 37ºC gehalten wurden, erhalten. Die Beleuchtung für den Phasenkontrast lieferte eine 100 W Halogenlampe und ein Modell 050260 Netzgerät (Leitz), das mit einem hitzereflektierenden Filter ausgestattet war. Eine 100 W Quecksilber-Bogenlampe, die von einer HBO 100 Modell 990023 Gleichstromquelle (Leitz) angetrieben wurde, wurde für IRM verwendet. Die Bilder wurden mit einer hochauflösenden Videokamera (70 Series, Dage-MTI) erhalten und mit dem Series 150 Bildverarbeitungssystem digitalisiert. Die digitalisierten Bilder wurden von einem hochauflösenden Videomonitor (Modell PVM 1271Q, Sony) unter Einsatz eines Illford Pan F-Films fotografiert.

FLUORESZENZMIKROSKOPIE

Zellen auf peptid-gepfropftem Deckgläsern aus Glas wurden am Ende der Inkubationszeiten in PBS gewaschen und für etwa 20 Minuten mit 3,7%- igem (V/V) Formaldehyd in PBS fixiert. Dann wurden sie in PBS gewaschen und durch Inkubierung bei Raumtemperatur für etwa 1 Minute in PBS, das etwa 0,2% (V/V) TRITON X-100 enthielt, permeabilisiert bzw. durchlässig gemacht. Die Zellen wurden dann in PBS gewaschen und auf F- Actin mit einer 20 minütigen Inkubation bei Raumtemperatur mit etwa 900 ng/ml rhodamin-konjugiertem Phalloidin (Molecular Probes, Inc.) angefärbt. Die Deckgläser wurden dann gründlich mit PBS gewaschen und auf Mikroskopobjektträgern in 50% PBS-50% Glycerin montiert. Diese Präparationen wurden angeschaut und auf dem Fluovertmikroskop, das mit einem 100X PL Fluotar-Objektiv (Leitz) ausgestattet war, fotografiert.

ERGEBNISSE

Bestimmung der GRGDY-Oberflächenkonzentration

Die Anzahl der reaktiven Stellen und der entsprechenden Peptidkonzentration auf der Oberfläche wurde durch Titration mit dem radiomarkierten GRGDY bestimmt (FIG. 9). Die Oberflächenkonzentration an gepfropftem GRGDY wurde als linearer Anstieg bestimmt für steigende Konzentrationen an Peptid, das für die Kupplung an die Oberfläche verfügbar war, wobei sie einen maximalen Wert von 12,1 ± 0,1 Picomol/cm² erreichte (FIG. 9). Darauf folgende Anstiege in den Eingabepeptidkonzentrationen über 12,0 Picomol/cm² erhöhten nicht weiter die Oberflächenkonzentration des Peptids. Eine maximale Oberflächenkonzentration von 12,1 Picomol/cm² entspricht einer Oberflächenbedeckung von 73.000 Moleküle pro Quadratmikrometer oder einem Abstand von etwa 3,3 nm zwischen den Peptiden.

HVF-Ausbreitungsraten auf peptid-gepfropften Substraten

Es wurde beobachtet, daß sich die Zellen fortschreitend während der 2 Stunden Zeitdauer auf dem RGD-derivatisiertem Glas ausbreiteten, sowohl in Anwesenheit als auch Abwesenheit von Serum, wobei 50% der analysierten Zellen Flächen von 2.130 µm² oder weniger 2 Stunden nach dem Aussäen in komplettem Medium (FIG. 10A) besaßen und 50% der Zellen Flächen von 1.210 µm² oder weniger 2 Stunden nach dem Aussäen in serumfreiem Medium (FIG. 10C) besaßen. Die Durchschnittsfläche einer gut ausgebreiteten Zelle auf Gewebekulturkunststoff in komplettem Medium wurde mit 2.100 µm² beobachtet, während eine nicht ausgebreitete Zelle eine Durchschnittsfläche von 355 µm² besaß. Die Flächenbereiche von Zellen, die auf den nicht adhäsiven Oberflächen gezüchtet wurden, variierten nicht mit der Zeit in Anwesenheit oder Abwesenheit von Serum, wobei 50% der Zellen Flächen von weniger als 500 µm² besaßen (FIG. LOB, D). Diese Ergebnisse zeigen an, daß auf diesen Oberflächen keine Ausbreitung stattfand, und daß die meisten der Zellen als nicht haftend beobachtet wurden.
Eine Zellausbreitung wurde auch auf YIGSR-derivatisiertem Glas in Anwesenheit oder Abwesenheit von Serum beobachtet. Die Ausbreitungsraten waren auf gepfropften YIGSR-Substraten viel langsamer als auf den RGD- haltigen Oberflächen, was mehr als 6 Stunden für eine vollständige Ausbreitung in komplettem (FIG. 10A) oder serumfreiem (FIG. 10B) Medium erforderte. Nach etwa 9 Stunden in serumfreiem Medium besaßen 50% der analysierten Zellen Flächen von 1.400 µm² oder weniger (FIG. 10B), was mit den Flächen von gut ausgebreiteten HVFs auf den RGD-Oberflächen in serumfreiem Medium vergleichbar ist. Es wurde beobachtet, daß Serum die Zellausbreitung auf den YIGSR-Oberflächen erhöht; 50% der analysierten Zellen zeigten Flächen von 2.333 µm² oder weniger (FIG. 10A) 9 Stunden nach Inokulation. Nicht-adhäsive Kontrolloberflächen waren identisch zu denjenigen, die für die RGD-derivatisierten Glasuntersuchungen hergestellt wurden, und eine Zellausbreitung wurde auf diesen Oberflächen nicht beobachtet; 50% der Zelloberflächen überschritten nie 600 µm² während des gesamten Zeitrahmens der Untersuchung (FIG. 10C, D).

Wirkungen von gepfropften GRGDY auf Zellwachstum

Die Wirkung dieser RGD-haltigen Substrate auf das Zellwachstum wurde überprüft durch Überwachen des Wachstums von HVFs, die auf Glas ausgesät wurden, das gekuppeltes GRGDY enthielt. Kein Unterschied in der Wachstumsrate wurde beobachtet, wenn wir das Wachstum der Zellen, die auf RGD-derivatisiertem Glas gezüchtet wurden, mit dem von unbehandeltem Glas (keine Glycophase) verglichen (FIG. 11).

Charakterisierung der cellulären Antworten auf die peptid-gepfropften Substrate

Da Serum die Zellausbreitung auf dem peptidhaltigen Glas erhöhte, wurde postuliert, daß die Peptide, die an die Oberfläche des nicht-adhäsiven Glases gepfropft wurden, die Adsorption von Serum und abgesonderten cellulären Proteinen, die die Zelladhäsion und Ausbreitung auf diesen Substraten vergrößern würden, förderten. Zur Überprüfung dieses möglichen Effektes wurde synthetisches Peptid GRGEY an Glas gekuppelt und die Zellaus breitung auf diesen Oberflächen wurde untersucht. Es wurde gezeigt, daß der Ersatz von Asparaginsäure (D) gegen Glutaminsäure (E) (Hinzufügung einer Methylengruppe zu der Carbonsäureseitenkette) die adhäsions-fördernde Aktivität des Peptids (8) auffiebt, jedoch geringe Auswirkung auf die Weise, in der das Peptid mit potentiell adsorbierenden Proteinen wechselwirkt, haben sollte.
Keine Zellausbreitung wurde auf kovalent gebundenem GRGEY nach etwa 8 Stunden beobachtet, selbst wenn komplettes Medium verwendet wurde und die celluläre Proteinsynthese nicht inhibiert wurde (Tabelle 1). Diese Feststellungen lassen vermuten, daß die kovalent gebundenen GRGEY- und GRGDY-Peptide nicht signifikant die Adsorption der Zelladhäsionsproteine erhöhen, die die Zellausbreitung fördern und erhöhen würden. Das heißt, daß das zelladhäsive Verhalten der peptid-gepfropften Oberflächen auf die Affinität des Peptids gegenüber Zelloberflächenrezeptoren zurückzuführen ist und nicht auf eine erhöhte Serumproteinadsorption durch das Peptid.
Zur Bestimmung, ob die Proteinsynthese bei der Zellausbreitung auf den RGD- und YIGSR-gekuppelten Substraten eine Rolle spielte, und ob Serum signifikant den Anteil bzw. die Fraktion der Zellen erhöhte, die sich zu einem Zeitpunkt ausbreiteten, bei dem die Ausbreitung beendet war, wurde der Prozentsatz an ausgebreiteten Zellen auf jeder Oberfläche unter unterschiedlichen Bedingungen nach einer 8 stündigen Inkubationszeitdauer bestimmt. Es wurde beobachtet, daß weder die Proteinsynthese noch die Anwesenheit von Serum in dem Medium den Anteil der Zellen beeinflußten, die sich auf dem RGD- und YIGSR-derivatisierten Glas ausbreiteten (Tabelle 1). Die Zellausbreitung wurde auf beiden peptid-gepfropften Oberflächen vollständig inhibiert, jedoch durch die Anwesenheit von löslichem Peptid in dem Medium (Tabelle 1), was anzeigt, daß eine celluläre Adhäsion auf diesen Substraten primär durch Zellrezeptor-Ligand-Wechselwirkungen beherrscht wird. Tabelle 1

Zell-Substrat-Kontakte und Cytoskelettorganisation

Zellen wurden lebend durch IRM- und Phasenkontrastmikroskopie etwa 4 Stunden nach dem Aussäen auf RGD-derivatisierten Substraten und etwa 8 Stunden nach dem Aussäen auf YIGSR-derivatisierten Substraten untersucht. Die fixierten Proben wurden mit rhodamin-konjugiertem Phalbidin angefärbt, um die Mikrofaserverteilung in den ausgebreiteten Zellen zu beurteilen. Alle Bilder wurden digitalisiert und ein Hochpaßfilter wurde zur besseren Darstellung der Einzelheiten verwendet.
Die Zellen, die in Abwesenheit von Serum auf RGD-gepfropftem Glas ausgesät worden waren, bildeten kleine, runde fokale Kontakte, die hauptsächlich an den äußeren Rändern der Zellen beobachtet wurden (FIG. 138). Serum-ergänztes Medium unterstützte die Bildung von großen, verlängerten fokalen Kontakten, die typisch sind für Zellen, die sich auf zelladhäsionsmolekül-beschichteten Substraten ausbreiten (FIG. 13D). Zellen, die sich auf YIGSR-gepfropftem Glas ausbreiteten, bildeten keine fokalen Kontakte in Abwesenheit von Serum (FIG. 148). Fokale Kontakte waren auf diesem Substrat gut definiert, wenn das Medium mit Serum ergänzt war (FIG. 14D), jedoch waren sie morphologisch verschieden von denjenigen von FIG. 13D auf den RGD-derivatisierten Substraten. Die fokalen Kontakte auf den YIGSR-derivatisierten Substraten wurden verlängert, ähnlich zu denen in FIG. 13D, jedoch waren sie überwiegend in den äußeren Rändern der Zellen angeordnet. Phasenkontrastbilder (FIG. 13A, C; 14A, C) zeigten keine offensichtlichen morphologischen Unterschiede zwischen ausgebreiteten Zellen auf den verschiedenen Substraten, jedoch dienen sie als entsprechendes Bild für die IRM-Bilder.
Anfärben mit Rhodamin-Phalloidin offenbarte ein ausgedehntes Netzwerk von wirkenden Mikrofaserbündeln in ausgebreiteten Zellen auf RGD-gepfropftem Glas, die in serumfreiem (FIG. ISA) oder komplettem (FIG. 158) Medium inkubiert wurden. Bündel, die durch ausbreitende Zellen gebildet wurden, die in serum-ergänztem Medium inkubiert wurden, färbten intensiver als diejenigen, die von Zellen gebildet wurden, die in serumfreiem Medium inkubiert worden waren, was anzeigt, daß sich dickere Fasern bildeten, wenn Serum vorlag. Die Zellen, die in serumfreiem Medium auf den YIGSR-gepfropften Substraten inkubiert worden waren, bildeten sehr wenig Mikrofaserbündel (FIG. 15C), jedoch bildeten sich dicke Bündel, wenn Serum in dem Medium vorlag (FIG. 15D).
Diese Untersuchungen zeigen, daß adhäsions-fördernde, synthetische Peptide mit minimalen Sequenzen kovalent auf die Oberfläche eines nicht-permeablen, nicht-adhäsiven Materials, wie z.B. Glas mit Glycophase gepfropft werden können, um biologisch aktive, chemisch gut definierte Oberflächen zu erzeugen, die die Zelladhäsion unterstützen. Diese Substrate können beim Studium der Zelladhäsion nützlich sein, da die Menge an auf der Oberfläche verfügbarem Peptid genau gemessen werden kann (FIG. 9) und es möglich ist, die Menge an Peptid zu steuern, das kompetitiv durch Zugabe gesteuerter Mengen einer nicht-adhäsiven Spezies, wie Glycin, in dem Kupplungspuffer gepfropft wird. Dies könnte ein wichtiges Erfordernis für Modellsubstrate für Zelladhäsion über einen dazwischengeschobenen Rezeptor sein, da kürzlich gezeigt wurde, daß eine Zelladhäsion über ein dazwischengeschobenes Integrin an adsorbierte RGD-Albumin-Konjugate sehr empfindlich auf die Dichte der RGD-haltigen Gruppen reagiert, die kovalent an das native Protein gebunden sind.

BEISPIEL 9 - STABILITÄT DER PEPTID-GEPFROPFTEN SUBSTRATE

Radiomarkierte GRGDY-Peptide wurden kovalent auf Glycophasen-Glassubstrate gepfropft, um die Stabilität der immobilisierten Peptide gegenüber Hitze und Proteolyse zu bestimmen. Die Prozent (%) weniger an Radioaktivität wurden als Anzeige für die Prozent (%) an immobilisiertem Peptid interpretiert, das zersetzt wurde und somit für die Erhöhung der Zelladhäsion nicht mehr verfügbar war.
Die Daten lassen vermuten, daß diese peptid-gepfropften Substrate ziemlich stabil gegenüber Autoklavieren (Dampfsterilisation bei 121 ºC) sind, da nach dieser Behandlung kein Verlust an Radioaktivität erkennbar war (Tabelle 2). Ebenso ging nach Züchtung der Zellen auf diesen Substraten für 1 Woche keine Radioaktivität verloren. Die Daten zeigen auch an, daß die behandelten Substrate gegenüber cellulären Proteasen stabil sind. Tabelle 2 Stabilität des RGD-derivatisierten Glases mit Glycophase

BEISPIEL 10 - VERGLEICH DER PEPTIDADSORPTION VON GRGD-GEKUPPELTEN PET-SUBSTRATEN MIT VORBEHANDELTEN, NICHT TRESYLIERTEN PET-SUBSTRATEN

Die GRGD-derivatisierten PET-Substrate wurden charakterisiert durch ihre Fähigkeit, die aktive Adhäsion von Zellen auf ihren Oberflächen zu unterstützen. Die PET-Vorbehandlung wurde optimiert, indem GRGD an tresylchlorid-aktivierte Filme gekuppelt wurde, die über verschiedene Zeitdauern hydroxyliert wurden. Zellausbreitungsassays wurden unter Verwendung von NIH/3T3-Fibroblasten durchgeführt, um die Bedingungen zu bestimmen, die eine Maximalantwort unterstützten. Eine etwa vierstündige Vorbehandlung erschien als optimal für optimale Zelladhäsion und -ausbreitung (FIG. 17).
Ein Vergleich von GRGD-gekuppelten PET-Filmen mit vorbehandelten, nicht tresylierten Filmen, die mit GRGD für die "normale" Kupplungszeit (etwa Stunden) inkubiert worden waren, zeigte, daß entweder wenig Peptid an den Film adsorbiert wurde, oder daß das adsorbierte Peptid nicht für die Adhäsionsantwort über einen dazwischengeschobenen Rezeptor verfügbar war (Fig. 5). Die GRGD-modifizierten Oberflächen untersliitzten viel besser die 3T3-Zelladhäsion als das unbehandelte PET, selbst in Anwesenheit von Serum, was für eine intrinsische bzw. spezifische Aktivität auf der modifizierten Oberfläche anzeigend ist (FIG. 6). Das Kohkurrenzexperiment führte zu einer 75%-igen Reduktion der Anlagerung an die modifizierten Oberflächen in Anwesenheit von etwa 90 ug/ml RGDS, was weiter die biospezifische Aktivität der Substrate zeigt (FIG. 7).
Eine makroskopische bzw. grobe Morphologie (FIG. 3) von ausgebreiteten 3T3-Fibroblasten in serumfreiem Medium auf den modifizierten Filmen erschien normal, jedoch konnten Mikrofaserbündel und Belastungsfaserbildung nicht unter diesen Bedingungen detektiert werden. Diese Ergebnisse zeigen an, wie andere mit absorbierten RGD-Peptiden gezeigt haben (19, 20, 14), daß die vollständige adhäsive Antwort dieser Zellinie und anderer nicht auf diesen modifizierten Oberflächen erhalten wird. Dies ist jedoch keine allgemeine Erscheinung, da von einigen Zelltypen einschließlich normalen Rattennieren-Fibroblasten und Nil 8, einer normalen Hamster-Fibroblasten- Zellinie gezeigt wurde, daß sie voll auf Substrate antworten, die nur RGD- Peptide enthalten (14). Das Wachstum auf dem GRGD-derivatisierten PET war serumabhängig und war ähnlich zu dem auf unmodifiziertem PET (FIG. 8), aber die anfängliche Anlagerung und Ausbreitung war schneller, wie es durch die Beobachtung, daß die GRGD-Kurve die Kontrollkurve führt (FIG. 8), angezeigt wird.
Eine Anlagerung und Ausbreitung von endothelialen Schweine-Aorta-Zellen auf den GRGD-gekuppelten Oberflächen war ebenfalls serumunabhängig (FIG. 16). Wie erwartet, da vaskuläre endotheliale RGD-gerichtete Rezeptoren charakterisiert worden sind (15). PAE-Zellausbreitung in vollständigem Medium war auf den GRGD-derivatisierten Filmen viel ausgedehnter als den unbehandelten Filmen bei vier Stunden, jedoch besaßen beide Oberflächen konfluente Monolayer von Zellen bei 24 Stunden. Diese Beobachtungen zeigen an, daß die Kinetik der PAE-Zellanlagerung schneller auf der modifizierten Oberfläche erfolgte.

BEISPIEL 11 - EIN VERWEILKATHETER MIT EINER BIOADHÄSIVEN DACRONVELOURMANSCHETTE IN EINEM KANINCHEN (Prophetisch)

Eine Dacronvelourmanschette mit einem Innendurchmesser von etwa 1 mm und einem Außendurchmesser von etwa 3 mm würde um einen Polyethylenkatheter herum als Grundlage plaziert werden und am Platze mit Mörtel chirurgischen Grades angeklebt werden. Vor der Plazierung würde eine Manschette in der Essigsäure/Formaldehyd-Lösung, wie in Beispiel 3 beschrieben, behandelt werden, um die Oberfläche zu hydroxylieren. Das Tetra-Peptid GRGD würde dann kovalent an die Manschettenmaterialoberfläche gebunden werden wie in Beispiel 3 beschrieben durch Tresylaktivierung und Kupplung. Der Pelz des Tieres würde dann entlang des Abdomens (Bauches) abrasiert werden, und die Haut mit einem lateralen Schnitt von etwa 1 cm Länge geöffnet werden. Der Katheter würde in eine Vene eingeführt werden, z.B. die deszendierende große Hohlvene (Vena Cava), und die Maschette würde genau unterhalb der Haut plaziert werden. Die Haut würde um den hervorstehenden Katheter herum zusammengenäht werden, dergestalt, daß sie die Manschette bedeckte. Die Raten einer bakteriellen Infektion auf dem Katheter würden dann gemessen werden. Einige der Maschetten würden nach einer Zeitdauer, z.B. 1, 2, 3 und 4 Wochen für eine histologische Untersuchung der Gewebeintegration, des Wiedereinsetzens des Gewebewachstums und der Gewebeentzündung entfernt werden. Kontrollexperimente würden unmodifizierte Dacronmanschetten verwenden.

BEISPIEL 12 - EIN WIEDERWACHSENDER NERVENLEITER

(Prophetisch)

Ein Polymerröhrchen mit einer hohen Permeabilität für Wasser und Sauerstoff mit einem Innendurchmesser von etwa 1,5 mm und einem Außendurchmesser von etwa 3 mm würde als wiederwachsender Nervenleiter bzw. als wiederwachsende Nervenleitung in der Ratte verwendet werden. Ein Beispiel für ein geeignetes Material wäre Poly(hydroxyethylmethacrylat). Das Lumen des Röhrchens würde aktiviert werden und mit dem Peptid GRGD oder GYIGSR wie in Beispiel 3 gekuppelt werden. Ein Nervenbündel in einem Bein würde abgetrennt werden und ein Abschnitt von etwa 1 cm Länge würde entfernt werden. Beide Enden der Nervenbündel würden in die Enden des röhrenförmigen wiederwachsenden Leiters eingefügt werden und die Kanten des Leiters würden fest an das epiaxonale Gewebe angenäht werden. Die Wunde würde geschlossen werden, und die Nerven(wieder)einpflanzung würde elektrophysiologisch wöchentlich gemessen werden. Bei Kontrollexpenmenten würden unmodifizierte Poly(hydroxyethylmethacrylat)-Röhrchen verwendet werden.
Die folgenden Druckschriften werden in der gesamten Beschreibung zitiert.

BEISPIEL 13 - VERGLEICHENDE UNTERSUCHUNGEN ZU GRGDY, DAS BEI UNTERSCHIEDLICHEN DICHTEN AUF EINE DERIVATISIERTE GLASOBERFLÄCHE GEPFROPFT WURDE

Derivatisierte Glasoberflächen wurden hergestellt gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren unter Einsatz des GRGDY-Peptids, außer, daß die Menge an zu dem tresylaktivierten Glas zugegebenen Peptid weniger als die 12 Picomol/cm² betrug. Dies gestattete die Bildung von Substraten mit bekannten Peptidoberflächendichten. Der lineare Bereich von Fig. 9, auf den in Beispiel 6 Bezug genommen wurde, zeigt an, daß die Menge an zu dem reaktiven Glas zugegebenem Peptid gleich der Menge an an das Glas gekuppeltem Peptid ist, solange die Menge weniger als oder gleich 12 Picomol/cm² ist. Das Peptid wurde kovalent an das derivatisierte Glas gebunden bei Oberflächenkonzentrationen von 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5 und 1,0 Picomol/cm². Human-Vorhaut-Fibroblasten wurden auf das Material in DMEM, das hitzeinaktiviertes Albumin als das einzige Protein enthielt, ausgesät, und die Zellausbreitung wurde nach 4 Stunden Inkubation bestimmt. Die Zellen wurden nach der Morphologie der Ausbreitung gemäß dem folgenden Schema eingeteilt: Gerundete Zelle, kein Filopod bzw. feines Scheinfüßchen, Stufe 1; gerundete Zelle, ein Filopod bzw. feines Scheinfüßchen, Stufe 2; gerundete Zelle, mehr als ein Filopod bzw. gerundetes Scheinfüßchen, Stufe 3; flache Zelle mit Pseudopoden bzw. Scheinfüßchen und polygonal geformte, voll ausgebreitete Zelle, Stufe 4. Die Ergebnisse sind in FIG. 18 gezeigt und zeigen an, daß Levels von nur 0,001 Picomol/cm² ausreichend sind, um fast eine volle Ausbreitungsantwort zu fördern; dies ist besonders ersichtlich aus den Daten von Zellen von Stufe 4, wo 0,001 Picomol/cm² zu 42% Zellen in Stufe 4 führten, während 1,0 Picomol/cm² zu 81 % Zellen in Stufe 4 führten. Somit hängt die zelluläre Antwort von der Peptidoberflächendichte ab, aber 0,001 Picomol/cm² ist ausreichend, um eine starke (etwa halbmaximale) Antwort auf der Oberfläche zu ergeben.

BEISPIEL 14 - GLAS MIT GLYCOPHASE - EIN NICHT-ADHÄSIVES MODELLZELLSUBSTRAT, AN DAS PEPTIDE GEKUPPELT WERDEN KÖNNEN

Dieses Beispiel ist eingeschlossen, um zu veranschaulichen, daß Glas mit Glycophase schlecht zelladhäsiv ist. Es veranschaulicht bei Kombination mit den Beispielen 15-19 die vorteilhafte Zelltyp-Spezifität, die erreicht werden kann, wenn Peptide an ansonsten zell-nicht-adhäsive oder schlecht zelladhäsive Substrate gebunden oder angelagert werden.
Glas mit Glycophase wurde durch das Verfahren von Beispiel 6 hergestellt. Eine Zellausbreitung auf dieser Oberfläche wurde sowohl in Abwesenheit als auch Anwesenheit von Serum gemessen und die Ergebnisse sind unten tabelliert. Bei den Zellen handelte es sich um Human-Vorhaut-Fibroblasten (HVF), endotheliale Human-Nabelvenen-Zellen (HUVEZ), menschliche Blutplättchen (Plt) und menschliche Blutplättchen, die mit 5 µm Adenosindiphosphat vorstimuliert waren (Vorstim Plt). HVFs und HUVEZs wurden nichtenzymatisch mit einer PBS-Lösung, die 54 nM EGTA enthielt, gezüchtet, zentrifugiert und in normalem Kulturmedium oder Medium, das 2 mg/ml hitzeinaktiviertes Serum für serumfreie Ausbreitungsassays enthielt, resuspendiert. Zur Bestimmung des Ausmaßes der Zellausbreitung wurden Zellen auf den Substraten für 4 Stunden inkubiert und der prozentuale Anteil an ausgebreiteten Zellen wurde durch die vorher beschriebenen Verfahren bestimmt. Die Blutplättchenausbreitung wurde bestimmt, indem PRPP zu jedem Substrat zugegeben wurde und die Blutplättchen mit 1000X Modulationskontrast (Hoffman)-Optik nach einer 10 minütigen Inkubationszeitdauer visualisiert wurden. Bei den vorstimulierten Blutplättchen wurde 5 µm ADP zu PRP vor der Inkubation auf den Substraten zugegeben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

BEISPIEL 15 - GLAS MIT GLYCOPHASE, GEKUPPELT MIT RGD-MATERIALIEN, DIE DIE ADHÄSION VON FIBROBLASTEN UND ENDOTHELIALEN ZELLEN, JEDOCH NICHT VON BLUTPLÄTTCHEN, UNTERSTÜTZEN

Das Peptid GRGDY wurde an die Oberfläche des Glases mit Glycophase, wie in Beispiel 6 beschrieben, gekuppelt. Zellausbreitungsassays wurden, wie in Beispiel 14 beschrieben, ausgeführt. Die Zellausbreitung wurde gemessen und ist in Tabelle 4 dargestellt. Dieses Material kann viele Vorteile für Gefäßtransplantate bieten, wo das Eindringen von endothelialen Zellen erwünscht ist, jedoch eine Anlagerung von Blutplättchen schädlich ist. Tabelle 4

BEISPIEL 16 - GLAS MIT GLYCOPHASE, GEKUPPELT MIT YIGSR-MATERIALIEN, DIE DIE ADHÄSION VON FIBROBLASTEN UND ENDOTHELIALEN ZELLEN, JEDOCH NICHT VON BLUTPLÄTTCHEN, UNTERSTÜTZEN

Das Peptid GYIGSRY wurde an eine Oberfläche eines Glases mit Glycophase gekuppelt. YIGSR ist eine Sequenz in dem CAM-Laminin, das die Zelladhäsion fördert (Graf et al., 1987, Cell, 48:989-996). Die Zellausbreitung wurde durch die in Beispiel 14 beschriebenen Arbeitsschritte gemessen. Dieses Material kann Vorteile für Gefäßtransplantate bieten, wo das Eindringen von endothelialen Zellen erwünscht ist, jedoch die Anlagerung von Blutplättchen schädlich ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5

BEISPIEL 17 - GLAS MIT GLYCOPHASE, GEKUPPELT MIT PDSGR-MATERIALIEN, DIE DIE ADHÄSION VON FIBROBLASTEN UND ENDOTHELIALEN ZELLEN, JEDOCH NICHT VON BLUT- PLÄTTCHEN, UNTERSTÜTZEN

Das Peptid GPDSGRY wurde an eine Oberfläche eines Glases mit Glycophase gekuppelt. PDSGR ist eine Sequenz, die in Laminin entdeckt wurde, das die Zelladhäsion fördernde Aktivitäten besitzt (Kleinman et al., 1989, Arch. Biochem. Biophys., 272:1:39-45). Die Zellausbreitung wurde durch die in Beispiel 14 beschriebenen Arbeitsschritte gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Dieses Material kann Vorteile für Gefäßtransplantate bieten, wo das Eindringen von endothelialen Zellen erwünscht ist, jedoch die Anlagerung von Blutplättchen schädlich ist. Tabelle 6

BEISPIEL 18 - GLAS MIT GLYCOPHASE, GEKUPPELT MIT REDV-MATERIALIEN, DIE DIE ADHÄSION VON ENDOTHELIALEN ZELLEN, JEDOCH NICHT VON FIBROBLASTEN ODER BLUTPLÄTTCHEN, UNTERSTÜTZEN

Das Peptid GREDVY wurde an eine Oberfläche eines Glases mit Glycophase gekuppelt. Von der Sequenz REDV, die sich von einer Fibronectin- Sequenz-Information ableitete, wurde von Humphries et al. (1986 J. Cell Bio., 103:6, 2637-2647) gezeigt, daß sie die b16-f10-Zelladhäsion, aber nicht die BHK-Fibroblast-Adhäsion fördert. Die Zellausbreitung wurde durch die in Beispiel 14 beschriebenen Arbeitsschritte gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 gezeigt. Dieses Material kann für Gefäßtransplantate Vorteile bieten, wo das Eindringen von endothelialen Zellen erwünscht ist, aber das Eindringen von Fibroblasten und Zellen der vaskulären, glatten Muskeln und die Anlagerung von Blutplättchen schädlich ist. Tabelle 7

BEISPIEL 19 - GLAS MIT GLYCOPHASE, GEKUPPELT MIT IKVAV-MATERIALIEN, DIE NICHT HUVEZ- ODER BLUTPLÄTTCHENAUSBREITUNG UNTERSTÜTZEN, ABER NEURITAUSWUCHS UNTERSTÜTZEN SOLLTEN

Das Peptid GIKVAVY wurde an eine Oberfläche eines Glases mit Glycophase gekuppelt. Von Tashiro et al. (1989 J. Bio. Chem., 264:27, 16174- 16182) wurde von der Sequenz IKVAV, die von einer Laminin-Sequenz- Information abgeleitet wurde, gezeigt, daß sie die Zelladhäsion fördert, aber keine Ausbreitung von mehreren Zelltypen und Neuritauswuchs von neuronalen Zelltypen. Die Zellausbreitung wurde mittels der in Beispiel 14 beschriebenen Arbeitsschritte gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 gezeigt. Dieses Material kann Vorteile für Implantate in Nervengewebe bieten, wo das Eindringen von Neuronen und die Bildung von axonalen Prozessen (Neunten) erwünscht ist. Tabelle 8

BEISPIEL 20 - POLYETHYLENTEREPHTHALAT, AN DAS POLYETHYLENGLYCOL IMMOBILISIERT WORDEN IST - EIN ZELL-NICHTADHÄSIVES POLYMERSUBSTRAT, AN DAS PEPTIDE ANGELAGERT BZW. GEBUNDEN WERDEN KÖNNEN (PET/PEG)

Polyethylenglycol (PEG) mit einem Molekulargewicht von 18.500 wurde auf einen Polyethylenterephthalat (PET)-Film unter Verwendung einer Lösungs verarbeitungstechnik, die hierin später beschrieben wird, immobilisiert. Der resultierende Film (PET/PEG) war viel benetzbarer als das unmodifizierte PET und unterstützte nicht die Anlagerung bzw. Bindung und Ausbreitung von Zellen. Die PET/PEG-Filme wurden 10 Minuten in Dioxan extrahiert als Kontrolle für das in den Peptidpfropfarbeitsschritten verwendete Lösungsmittel. Zellen von menschlichen, vaskulären, glatten Muskeln (HVGMZ) wurden beim Testen dieser Materialien auf PET/PEG-Basis ebenfalls einge schlossen, da dieser Zelltyp in Gefäßgeweben gefünden wird und mit Gefäßimplantaten wechselwirken kann. Der prozentuale Anteil an ausgebreiteten Zellen wurde durch die in Beispiel 14 beschriebenen Arbeitsschritte bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 gezeigt. HVF-, HUVEZ- und HVGMZ-Ausbreitung wurde in Anwesenheit von serum-ergänztem Medium bestimmt. Tabelle 9

BEISPIEL 21 - PET/PEGG GEKUPPELT MIT RGD-MATERIALIEN, DIE DIE ADHÄSION VON FIBROBLASTEN UND ENDOTHELIALEN ZELLEN, JEDOCH NICHT VON BLUTPLÄTTCHEN ODER ZELLEN VON VASKULÄREN, GLATTEN MUSKELN UNTERSTÜTZEN

Das Peptid GRGDY wurde kovalent an die PET/PEG-Oberfläche von Beispiel 20 unter Verwendung der gleichen Chemie wie in Beispiel 15 gekuppelt. Die HVF-, HUVEZ- und HVGMZ-Ausbreitung wurde in Anwesenheit von serum-ergänztem Medium bestimmt. Die Zellausbreitung war wie sie unten in Tabelle 10 gezeigt ist. Dieses Material kann Vorteile für Gefäßtransplantate bieten, wo das Eindringen von endothelialen Zellen erwünscht ist, aber die Anlagerung bzw. Bindung von Blutplättchen schädlich ist. Tabelle 10

BEISPIEL 22 - PET/PEG, GEKUPPELT MIT REDV-MATERIALIEN DIE DIE ADHÄSION VON ENDOTHELIALEN ZELLEN, ABER NICHT VON FIBROBLASTEN ODER BLUTPLÄTTCHEN ODER ZELLEN VON VASKULÄRENE GLATTEN MUSKELN UNTERSTÜTZEN

Das Peptid REDY wurde an die PET/PEG-Oberfläche von Beispiel 20 gekuppelt. Die HVF-, HUVEZ- und HVGMZ-Ausbreitung wurde in Anwesenheit von serum-ergänztem Medium bestimmt. Die Zellausbreitung war wie sie unten in Tabelle 11 gezeigt ist. Dieses Material kann Vorteile für Gefäßtransplantate bieten, wo das Eindringen von endothelialen Zellen erwünscht ist, aber das Eindringen von Fibroblasten und Zellen von vaskulären, glatten Muskeln und die Anlagerung bzw. Bindung von Blutplättchen schädlich ist. Tabelle 11

BEISPIEL 23 - PET/PEG, GEKUPPELT MIT IKVAV- MATERIALIEN, DIE NICHT DIE HUVEZ- ODER BLUTPLÄTTCHENAUSBREITUNG UNTERSTÜTZEN, ABER DIE HVF-AUSBREITUNG UNTERSTÜTZEN UND DEN NEURITAUSWUCHS UNTERSTÜTZEN SOLLTEN

Das Peptid GIKVAVY wurde an die PET/PEG-Oberfläche von Beispiel 20 gekuppelt. Von Tashior et al. (1989 J. Bio. Chem., 264:27, 16174-16182) wurde gezeigt, daß die Sequenz IKVAV, die von einer Laminin-Sequenz- Information abgeleitet wurde, die Zelladhäsion, aber nicht die Ausbreitung von mehreren Zelltypen und den Neuritauswuchs von neuronalen Zelltypen fördert. Die Zellausbreitung wurde durch die in Beispiel 14 beschriebenen Arbeitsschritte gemessen und ist in Tabelle 12 gezeigt. Dieses Material kann Vorteile für Implantate in Nervengewebe bieten, wo das Eindringen von Neuronen und die Bildung von axonalen Prozessen (Neuriten) erwünscht ist. Tabelle 12

BEISPIEL 24 - EINE LÖSUNGSTECHNIK ZUM EINBAU VON POLYETHYLENOXID UND ANDEREN WASSERLÖSLICHEN POLYMEREN IN OBERFLÄCHEN VON POLYMEREN BIOMATERIALIEN

Die derzeit verwendeten biomedizinischen Polymere in Anwendungen mit Blutkontakt haben sich nicht als ausreichend nichtthromboseerzeugend erwiesen, um in Gefäßtransplantaten mit kleinem Durchmesser brauchbar zu sein. Eine Adhäsion von Blutplättchen und anderen Blutzellen ist der Hauptgrund für das geringe Offenbleiben der Transplantate kleinen Durchmessers, und ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Reduzierung der Wechselwirkungen von Blutkomponenten mit biomedizinischen Polymeren. Da die Adhäsion von Blutplättchen, weißen Blutzellen, Fibroblasten, etc. durch die Adsorption von Proteinen an die Polymeroberfläche vermittelt wird, wurde eine Vorgehensweise gewählt, die die Wechselwirkung von Proteinen mit diesen Polymeren reduzierte.
Bei Polyethylenoxid-(PEO-)Oberflächen wurde beobachtet, daß sie der Adsorption von Plasmaproteinen als Ergebnis ihrer starken Hydrophilie, Kettenmobilität und dem Nichtvorhandensein von ionischer Ladung widerstehen [25]. Mehrere Gruppen haben PEO oder PEG (Polyethylenglycol) als Modifikationsmittel auf der Suche danach, eine biokompatible oder nicht adhäsive Oberfläche zu erhalten, verwendet. Verschiedene Vorgehensweisen wurden angewandt, um Polymeroberflächen mit PEO zu modifizieren. Darunter sind diese Techniken, die ein kovalentes Pfropfen von PEO an ein Grund- bzw. Ausgangspolymer wie PET [26,27], ein Polyurethan [28] oder einen Polyvinylalkohol [29], eine Polymerisation eines Monomeren mit einer hängenden PEO-Kette [30,31], einen Einbau von PEO in ein Grund- bzw. Ausgangspolymer durch Blockcopolymerisation [32,33] oder eine direkte Adsorption von PEO-enthaltenden oberflächenaktiven Mitteln, die typischerweise Blockcopolymere vom AB- oder ABA-Typ sind, wobei einer der Blöcke ein PEO ist [25,34], umfassen. Bei den meisten dieser Techniken wurde PEO mit relativ niedrigen Molekulargewichten (weniger als 5.000 Dalton) verwendet, und nur wenige verwendeten signifikant höhere Molekulargewichte [26,27,34].
Obwohl einige der oben beschriebenen Techniken annehmbar gut bei der Reduzierung der cellulären Wechselwirkungen an den Oberflächen der modifizierten Polymere arbeiten, verlangen die meisten von ihnen Mehrfachstufen, um die erforderliche Oberflächenmodifizierung zu erhalten. Darüber hinaus sind sie durch die Struktur und Verfugbarkeit labiler chemischer Anteile auf der Oberfläche des Ausgangs- bzw. Grundpolymers beschränkt und sie sind in vielen Fällen spezifisch für die Modifizierung der Ausgangsbzw. Grundpolymeren.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Technik zum Einbau von PEO oder anderen wasserlöslichen Polymeren (WLP) in die Oberfläche eines Basisbzw. Ausgangs- bzw. Grundpolymers (BP). Diese Technik ist von allgemeiner Anwendbarkeit und sie wird nur durch die Lösungseigenschaften des BP in einem Lösungsmittel, das ebenso das in die Oberfläche einzuverleibende WLP löst, beschränkt. Die Technik umfaßt ein Eintauchen der polymeren Vorrichtung oder des polymeren Materials (hergestellt aus dem BP), die bzw. das modifiziert werden soll, in eine Flüssigkeit, die ein gemeinsames Lösungsmittel fur das BP und das WLP ist. Die Grenzfläche zwischen dem BP und der Flüssigkeit beginnt dann aufzuweichen und führt zu einem Lösen des Polymernetzwerks auf der Oberfläche des BP. Während dieser Zeit sind die Moleküle des WLP frei, um in die halb aufgelöste Grenzfläche zu diffundieren. Nach einer Zeitdauer wird das System mit Wasser gequencht, das ein Nichtlösungsmittel für das BP ist, aber mit dem Eintauchlösungsmittel gegenseitig löslich ist. Dies führt zu einem schnellen Kollaps der Grenzfläche, wobei die Ketten des WLP innerhalb des BP- Netzwerks gefangen werden. Auf diese Weise wird das BP nichtkovalent, aber stabil mit dem WLP modifiziert. Alternative Quench- bzw. Abschrecklösungsmittel können auch verwendet werden anstelle von Wasser, wobei das Quenchlösungsmittel ein Lösungsmittel für das WLP, aber nicht für das BP ist. Beispiele alternativer Quenchlösungsmittel umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Methanol, Ethanol, Aceton, Dimethyl, Formamid, Tetrahydrofüran und Benzol für die PET-TIENs; und Ethanol und Methanol für die PMMA-PIPNs. Alternativ könnte ein gemeinsames Nichtlösungsmittel für sowohl das WLP als auch das BP verwendet werden, um zu quenchen bzw. abzuschrecken, und dem könnte sich ein Waschen mit einem Lösungsmittel für das WLP, jedoch nicht für das WP, anschließen. Alternativ kann das System getrocknet werden und dann in einem Quench- bzw. Abschrecklösungsmittel zur Entfernung von überschüssigem Lösungsmittel gewaschen werden. Schematisch ist das vorgeschlagene Einfangen von WLP-Ketten in dem BP in FIG. 19 gezeigt. Die Bedingungen des Einfangprozesses, wie geeignete Lösungsmittelverdünnung (zur Verhinderung eines vollständigen Auflösens des BP), die Konzentration des WLP und die Behandlungszeit, müssen natürlich optimiert werden, um ein geeignet modifiziertes, stabiles physikalisches, ineinandergreifendes (interpenetrierendes) Netzwerk (PIPN) zu erhalten. Hinzu kommt, daß das Molekulargewicht des WLP von gewisser Bedeutung sein sollte, da Moleküle mit relativ kurzen Kettenlängen (d.h. mit niedrigen Molekulargewichten) nicht wirksam durch das kollabierende Netzwerk auf dem BP eingefangen werden können und es ihnen in angemessener Zeit gelingen kann, aus dem Netzwerk herauszudiffundieren. Aus dem gleichen Grund unterliegen sehr große Moleküle (d.h. mit hohen Molekulargewichten) Massentransferbeschränkungen und sie werden nicht wirksam in die Oberfläche des BP eingebaut.
In der Literatur wurde eine Technik beschrieben [35], die nur die Verwendung von Zweiblock-Surfactant-Copolymeren betont, bei denen ein Block hydrophob ist und der andere hydrophil ist. Daß die Technik Anwendung bei Biomaterialien finden kann, wird erwähnt, aber es werden keine Daten oder Beispiele vorgelegt. Die Technik der vorliegenden Erfindung ist allgemein anwendbar auf jedes in eine BP-Oberfläche einzubauende Homopolymer und als solches nicht auf Zweiblock-Copolymere mit oberflächenaktiven Eigenschaften beschränkt.

MATERIALIEN UND VERFAHREN

Herstellung eines physikalischen, interpenetrierenden (ineinandergreifenden) Netzwerkes PIPN auf PET.
Dünne PET-Filme (Mylar, Du Pont) wurden für die Oberflächenmodifizierung unter Einsatz der PIPN-Technik zur Einverleibung von PEO (mit Molekulargewichten von 5000, 18500 und 100000 g/Mol, Polysciences, Inc.), PVP (Molekulargewicht 24000 g/Mol, Aldrich Chemical Co.) und PEOX (Molekulargewicht 439000 g/Mol, Dow Chemical Co., # XA10874.05) verwendet. Die PET-Filme wurden für wenigstens 24 Stunden bei Raumtemperatur vor der Verwendung in Aceton extrahiert. Trifluoressigsäure (TFES, Morton Thiokol, Inc.) wurde als das Behandlungslösungs mittel verwendet, da es alle WLPs sowie PET löste. Man fand, daß ganz starkes TFES das PET sehr schnell löste bzw. auflöste und somit eine Verdünnung erforderlich war, damit das BP eine ausreichende Zeitdauer behandelt wurde. Lösungen der WLPs wurden in entionisiertem und gefiltertem Wasser (EIFW) bei Konzentrationen von 0,4 g/ml hergestellt, außer für das PEO 100000 und PEOX, die aufgrund ihrer hohen Viskosität bei 0,2 g/ml verwendet wurden. Man fand, daß eine Verdünnung von TFES um 18-20% geeignet war, um eine Auflösung bzw. Lösung des PET-Films zu verhindern und nach dem Quenchen mit Wasser die optische Klarheit zu erhalten. TFES wurde auf die geeignete Konzentration durch Zufügen der wäßrigen WLP-Lösungen verdünnt. Die PET-Filme wurden dann zu der Lösung des WLP in verdünnter TFES zugefügt und man ließ sie für 30 Minuten unter periodischem Durchwirbeln bei Raumtemperatur stehen. Das Gemisch wurde dann rasch mit einem großen Überschuß an EIFW zur Herstellung des PIPN gequencht bzw. abgeschreckt. Die Filme wurden dann in EIFW übertragen, in dem sie gelagert wurden. Das Wasser wurde periodisch ausgetauscht, um jegliches WLP zu entfernen, das von der BP- Oberfläche ausgelaugt werden konnte. Eine Kontrolle wurde mit der gleichen Verdünnung von TFES mit EIFW, jedoch ohne irgendein WLP durchgeführt.

Herstellung von PIPN auf Pellethan.

Pellethan (Dow Chemical Co., # 2363-80AE) wurde in Form von Pellets bzw. Kügelchen erhalten. Eine Lösung von Pellethan in Tetrahydrofuran (THF) bei einer Konzentration von 50 g/l wurde zum Gießen von Filmen mit 50 mil Dicke unter Einsatz einer Gießrakel bzw. eines Gießmessers verwendet. Diese Filme wurden in einem Ofen bei 60-70ºC ausgehärtet, wobei sich dem Gießen ein Verdampfen des Lösungsmittels anschloß. Man versuchte eine Anzahl von verschiedenen Losungsmitteln und fand, daß THF zur Erzeugung des PIPN auf Pellethan geeignet ist. Das PIPN wurde hergestellt unter Verwendung von nur PEO 18500 WLP aus den unten erklärten Gründen. Aus den Kontroliversuchen (d.h. Lösungsmittelverdünnungen ohne jegliches WLP) wurde gefunden, daß eine Verdünnung von THF auf 40% mit EIFW erforderlich war, um die strukturelle Integrität und optische Dichte des Films nach dem Quenchen zu erhalten. Das PEO 18500 war in THF bei Raumtemperatur unlöslich, aber es war bei 60ºC löslich, daher wurde die Oberflächenmodifizierungsprozedur für Pellethan bei dieser Temperatur durchgeführt. Die Behandlungslösung bestand aus 40% THF, 20% der PEO 18500-Lösung in Wasser und verbleibenden 40% EIFW. Dieses Gemisch wurde auf 60ºC erwärmt, bis sich das PEO löste und die Pellethanfilme wurden für 15 bis 25 Minuten in die Lösung eingetaucht. Die Prozedur wurde bei 60ºC in einem Ofen durchgeführt. Die Lösung wurde dann mit einem Überschuß an EIFW gequencht bzw. abgeschreckt und die behandelten Filme wurden zur Lagerung in Wasser übertragen. Bei der gleichen THF-Verdünnung wurde auch ein Kontrollversuch ohne die Anwesenheit von PEO durchgeführt.

Herstellung von PIPN auf PMMA.

PMMA (mittleren Molekulargewichts, Aldrich Chemical Co.) wurde als Pulver erhalten. Es wurde in Aceton bei 50 g/l gelöst und ein Film, ähnlich zu dem von Pellethan, wurde gegossen. Aceton wurde als Modifikationslösungsmittel für PMMA verwendet. Es wurde gefunden, daß eine Verdünnung von Aceton auf 60% für die Prozedur geeignet war. Die Behandlungslösung bestand aus 60% Aceton, 20% der wäßrigen PEO 18500-Lösung (40% PEO in Wasser) und den verbleibenden 20% Wasser. Die Behandlung wurde für 15 bis 25 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt, gefolgt von einem Quenchen bzw. Abschrecken mit Wasser. Die modifizierten Filme wurden noch einmal in Wasser gelagert, das periodisch ausgetauscht wurde. Kontrollproben wurden ebenfalls gefahren.
Oberflächenanalyse und -charakterisierung.
Die Kontaktwinkel auf den modifizierten Oberflächen wurden in einer nach Maß gebauten Vorrichtung gemessen. Die Luftkontaktwinkel wurden unter Wasser gemessen, um jede Änderung in der Hydrophilie, die der Modifizierungsprozedur folgte, zu bestimmen.
Eine ESCA-Analyse (VG Instruments, UK) auf den Polymeroberflächen wurde durchgeführt, um die Anwesenheit des WLP auf der BP-Oberfläche nach der Modifizierungsprozedur zu bestimmen.

Messung der biologischen Antworten auf PIPN-Oberflächen.

Die Untersuchungen zur Proteinadsorption auf den modifizierten Oberflächen wurden unter Verwendung von Albumin (BSA, Sigma) durchgeführt. Das Protein wurde mit I¹²&sup5; NaI (ICN Biochemicals, Inc.) unter Einsatz der Iodkügelchen (Iodobead)-Technik radiomarkiert [36]. Es wurde eine spezifische Aktivität des markierten Albumins von 53,9 µCi/mg gefunden. Kleine Filme (0,5 x 0,5 cm²) wurden aus den modifizierten Polymeren ausgeschnitten und mit radiomarkiertem Albumin bei einer Konzentration von 0,094 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 4 Stunden bei 37ºC inkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurden die Filme mit einer nicht- radiomarkierten Albuminlösung in PBS der gleichen Konzentration wie die Adsorptionslösung gewaschen und die Filme wurden in einem Gammazähler (Isoflex, ICN Micromedic Systems) auf adsorbiertes Protein gezählt. Alle Proben wurden vierfach angefertigt.
Die Kurzzeit-Blutverträglichkeit wurde in einer Parallelplatten-Durchflußkammer untersucht, die den erforderlichen kontrollierten Durchfluß und die Scherumgebung, die für diese Untersuchung erforderlich ist, bereitstellte. Die Durchflußkammer ist in Fig. 20 gezeigt. Die oberflächen-modifizierten Filme wurden auf Deckgläsern aus Glas (24 x 50 mm) montiert, die die Basis der Durchflußkammer bildeten. Alle nicht wichtigen Oberflächen wurden mit Albumin (4 g/dl, in HEPES-Puffer) vor einem Blutkontakt beschichtet, um eine Voraktivierung der Blutplättchen vor Kontakt mit der Testmaterialoberfläche zu vermeiden. Frisch entnommenes heparin-anticoaguliertes (2 units/ml) menschliches Vollblut wurde in diesen Untersuchungen verwendet. Die Blutplättchen wurden mit einem Fluoreszenzfarbstoff, Mepacrin (10 µm) zum Zeitpunkt der Venenpunktion markiert. Epifluoreszenz-Mikroskopie und digitale Bildverarbeitung wurden eingesetzt, um die Blutplättchenadhäsion und die Thrombusbildung während des Fließens zu visualisieren und die Counts bzw. Zählungen von anhaftenden Blutplättchen auf den getesteten Oberflächen zu bestimmen. Das Bilderfassungssystem wurde anderswo beschrieben [37,38]. Der Blutfluß wurde für 10 Minuten bei einer Wandscherrate von 100 sec&supmin;¹ gehalten.
Im Anschluß an den Blutfluß über die modifizierten Polymeroberflächen wurden die Filme sanft in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) abgewaschen und dann in einer 2,5%-igen Lösung von Glutaraldehyd in PBS über Nacht fixiert. Die blutkontaktierenden Oberflächen wurden dann rasterelektronenmikroskopisch (REM) untersucht, um die Blutplättchenadhäsion sowie die Morphologie der anhaftenden Blutplättchen zu beurteilen, um den Grad der Ausbreitung und Aktivierung der Blutplättchen auf den unterschiedlichen Oberflächen zu bewerten.
Als weiterer rigoroserer Test zur Wirksamkeit von PEO und anderen WLPs bei der Verhinderung der Zelladhäsion an den modifizierten Polymeroberflächen wurde eine Zellkultur von Human-Vorhaut-Fibroblasten (HVF) auf diesen Oberflächen geprüft. Adhäsions- und Ausbreitungsassays wurden durchgeführt, um die Wirksamkeit dieser Oberflächen bei der Reduzierung der Proteinadsorption und damit der Adhäsion und Ausbreitung dieser Zellen auf den modifizierten Polymeren zu bestimmen.

ERGEBNISSE UND DISKUSSION

Die Messung der Kontaktwinkel auf den modifizierten Oberflächen zeigt die relative Hydrophilie dieser Oberflächen vor und nach der Modifizierungsprozedur an. Alle Polymeren wurden in Wasser für wenigstens eine Woche extrahiert, bevor irgendwelche Messungen durchgeführt wurden. Tabelle 13 zeigt die Kontaktwinkeldaten auf den PET-modifizierten Oberflächen. Tabelle 14 zeigt die Kontaktwinkeldaten auf Pellethan und Tabelle 15 die Daten für PMMA. Tabelle 13 Kontaktwinkel für modifizierte PET-Oberflächen. Tabelle 14 Kontaktwinkel für modifizierte Pellethan-Oberflächen. Tabelle 15 Kontaktwinkel für modifizierte PMMA-Oberflächen.
Abnehmende Kontaktwinkel zeigen zunehmende Hydrophilie der Polymeroberflächen an. PET-unbehandelt stellt das unbehandelte Polymer dar, das nur in Aceton extrahiert worden ist. Das Kontroll-PET zeigt einen kleineren Kontaktwinkel als das unbehandelte Polymer, was anzeigt, daß die Behandlung mit TFES tatsächlich seine Hydrophilie in einem geringen Ausmaß erhöht. Die WLP-behandelten Filme zeigen stark erhöhte Hydrophilie, was die Anwesenheit der jeweiligen WLPs an der Oberfläche des PET anzeigt.
Die Kontaktwinkeldaten auf Pellethan (PELL) zeigen den gleichen Trend wie für die PET-Oberflächen. Das PEO 18500 modifizierte Pellethan zeigt einen ähnlichen Kontaktwinkel wie die entsprechende PET-Oberfläche. Noch einmal der gleiche Trend wird auf PMMA erhalten. Somit besitzen alle WLP- modifizierten Oberflächen Kontaktwinkel, die sehr nahe beinander liegen, was ähnliche Grade an Hydrophilie und ähnliche Grenzflächenenergien anzeigt.
Eine Analyse der Adsorption von radiomarkiertem Albumin auf den modifizierten PET-Oberflächen ergab die in FIG. 21 gezeigten Ergebnisse. Die Daten zeigen klar einen scharfen Abfall bei der Albuminadsorption nur für die Oberfläche, die mit PEO 18500 modifiziert ist. Eine etwa 80%-ige Abnahme bei der Adsorption wird für diese Oberfläche gegenüber der Kontrolle beobachtet. Die PVP-modifizierte Oberfläche zeigt eine Abnahme um etwa 20% und die PEOX-modifizierte Oberfläche zeigt eine Abnahme um etwa 30% gegenüber der Kontrolle. Die PEO 5000 und 100000 modifizierten Oberflächen zeigen keine signifikant verschiedenen Adsorptionslevel. Diese Daten können anzeigen, daß das PEO 5000 kein ausreichend großes Molekulargewicht besitzt, um eine Proteinadsorption an der Polymeroberfläche zu verhindern und daß das PEO 100000 zu sperrig ist, um wirksam in die Polymeroberfläche in eine Konfiguration integriert zu werden, die es ermöglicht, eine Adsorption von Protein zu verhindern.
Eine Analyse der Blutplättchenadhäsion an den modifizierten PET-Oberflächen, wie sie durch Epifluoreszenz-Videomikroskopie während es Fließens von Vollblut über die Polymeroberfläche erhalten wurde, ist in Fig. 22 gezeigt. Die PEO 18500 modifizierte Oberfläche zeigt eine Abnahme bei der Blutplättchenadhäsion bzw. -haftung auf etwa 5% des Kontrollwertes. Die PEOX-modifizierte Oberfläche zeigt auch eine signifikante Reduktion auf etwa 10% der Kontrollevels. Die PEO 100000 modifizierte Oberfläche zeigt eine Reduktion auf etwa 30%, die PEO 5000 und PVP-modifizierte Oberfläche zeigen eine Reduktion auf 40-80% der Kontrollwerte. Dies korreliert gut mit den Proteinadsorptionsdaten auf dem PEO 18500 modifizierten PET. Die signifikant niedrigere Blutplättchenadhäsion bzw. -haftung auf dem PEOX-modifizierten PET wurde nicht erklärt.
Die Adhäsion und Ausbreitung von Human-Vorhaut-Fibroblasten in Dulbeccos Modifizierung von Eagles Medium (DMEM), das mit 10% fötalem Kalbserum ergänzt war, wurde als Test für die Wirksamkeit der WLP-modifizierten Oberflächen bei der Verhinderung der Proteinadsorption verwendet. Die Zellen wurden bei einer bekannten Dichte auf die PET-, Pellethan- und PMMA-modifizierten Oberflächen ausgesät und die Anzahl der ausgebreiteten Zellen wurde zuerst 4 Stunden nach dem Aussäen und daraufhin periodisch gezählt, bis sie Konfluenz erreichten.
Auf die PET-modifizierten Filme wurden 30000 Zellen/cm² nach Extraktion in Wasser für 25 Tage ausgesät. Die drastischsten Ergebnisse wurden hier für die PEO 18500 modifizierte Oberfläche auf PET erreicht. Wie aus FIG. 23 ersehen werden kann, erreichten alle Oberflächen, außer dem einen mit PEO 18500 modifizierten PET, Konfluenz innerhalb 5 bis 10 Tagen nach dem anfänglichen Aussäen. Trotz des Wiederaussäens des PEO 18500 am Tag 9 und am Tag 15, lagerten sich diese Zellen bzw. banden sich diese Zellen nicht an diese Oberfläche, selbst nach mehr als 30 Tagen in Kultur. Von den Oberflächen, die Konfluenz erreichen, antwortet die PEOX-modifizierte Oberfläche am langsamsten, aber schließlich erreicht sie Konfluenz. Diese Ergebnisse sind in strikter Übereinstimmung mit den Daten, die aus Proteinadsorptions- und Blutplättchenadhäsionsexperimenten erhalten wurden.
Die Ergebnisse für die PEOX-Oberflächen können anzeigen, daß in einer Anwendung mit Blutkontakt sich eine solche Oberfläche kurzzeitig geeignet verhält, aber über längere Kontaktzeiten schließlich thromboseerzeugend wird.
Diese Ergebnisse zeigen die Wirksamkeit und Eignung von PEO 18500 bei der Verhinderung von Proteinadsorption und somit von cellulären Wechselwirkungen an bei der Impragnierung einer Polymeroberfläche in Form eines PIPN an. Als Folge dieser Ergebnisse wurde entschieden, die Oberflächen von Pellethan und PMMA nur mit PEO 18500 zu modifizieren und die früheren Ergebnisse auf PET nochmals zu bestätigen. Nach der Bestimmung der geeigneten Bedingungen, Lösungsmittel etc. wurden diese Polymeren mit PEO 18500 imprägniert, um ein PIPN auf diesen Oberflächen zu erhalten. Zellen wurden auf diesen modifizierten Oberflächen unter rigoroseren Bedingungen (d.h. 2,5-fache PET-Aussaatdichte) ausgesät. Unter diesen Bedingungen würde ein angemessen adhäsives Substrat, wie das unbehandelte PET, Konfiuenz in weniger als 2 Tagen erreichen. Die für Pellethan erhaltenen Ergebnisse sind in FIG. 24 gezeigt und diejenigen für PMMA in FIG. 25. Noch einmal ist PEO 18500 erfolgreich bei der Reduzierung der Zellausbreitung und des Zellwachstums auf diesen Substraten Man sieht, daß, sobald die Konzentration an dem Behandlungslösungmittel erhöht wird, die Zelladhäsion bzw. -haftung abnimmt, was einen besseren Einbau von PEO 18500 in das Basis- bzw. Grundpolymer anzeigt.
Ähnliche Oberflächenhydrophilien auf den verschiedenen modifizierten Oberflächen führten zu weit voneinander differierenden cellulären Antworten, was anzeigt, daß die Oberflächenbeweglichkeit und eine geeignete Kettenlänge des einverleibten Polymeren wichtige Faktoren bei der Bestimmung des Ergebnisses der cellulären Wechselwirkungen an einer Polymeroberfläche sind.
Diese Ergebnisse zeigen die allgemeine Anwendbarkeit der PIPN-Technik zur Modifizierung von Polymersystemen und darüber hinaus die außerordentliche Fähigkeit von PEO 18500 zur Inhibierung der Proteinadsorption und somit der cellulären Wechselwirkungen an einer Biomaterialoberfläche an. Das Potential dieser Technik bei der Anwendung auf bestehende biomedizinische Polymere ist enorm. Da es ein einfaches Lösungsverfahren ist, können vorerzeugte Vorrichtungen einfach durch Eintauchen in eine geeignete Lösung des WLP und anschließend Transferieren in ein Nichtlösungsmittel für das Vorrichtungsmaterial, wie z.B. Wasser, modifiziert werden.
Das PIPN scheint ziemlich stabil über eine Zeitdauer von wenigstens mehreren Wochen zu sein. Die Zelladhäsions- und Proteinadsorptionsexperimente mit den PEO 18500 modifizierten Oberflächen (die niedrige Zelladhäsion und Proteinadsorption zeigten) wurden über 25 Tage bzw. 20 Tage nach der Herstellung dieser PIPNs durchgeführt. Während dieser 20-25 Tage Zeitdauer wurden sie kontinuierlich in Wasser extrahiert.
Potentielle Anwendungen dieses Verfahrens und des wasserlöslichen Polymeren PEO (PEG) (vorzugsweise mit einem Molekulargewicht von 18500) umfassen Gebiete, die blutkontaktierende Biomaterialien involvieren, z.B. Gefäßtransplantate, Katheter und Frequenzstimulationsableitungen bzw. (pacing leads). Darüber hinaus könnten die labilen PEO-Endgruppen auf diesen modifizierten Polymeroberflächen als Stelle für eine Anlagerung von geeigneten biospezifischen Peptiden (anderswo hierin beschrieben) dienen, um Oberflächen zu erzeugen, an denen nur spezifische Zelltypen haften. Zum Beispiel könnten endotheliale Zellen im Falle einer Anwendung als Gefäßtransplantat anhaften bzw. adhärieren. Etwa die Hälfte der derzeit vertriebenen Gefäßtransplantate sind aus Dacron (PET) hergestellt, das der Hauptbrennpunkt dieses Beispiels ist. Andere Anwendungen umfassen Materialien, die in Kontakt mit Gewebe sind, wo eine Zelladhäsion nicht erwünscht ist, wie Biosensormembranen, intraokulare Linsen (PMMA). Es können auch Materialien für den Einsatz in der Proteinaffinitätschromatografie hergestellt werden, wo nicht-adsorbierende Trägermaterialien für die Anlagerung bzw. Bindung von spezifisch adsorbierenden Liganden bevorzugt sind. Nichtadsorbierende Röhrchen und Taschen könnten auch auf anderen Gebieten der Protein- und Blutverarbeitung von Nutzen sein. Die Technik der vorliegenden Erfindung kann Anwendung finden bei der Herstellung oder Behandlung von Ultrafiltrationsmembranen für den Einsatz in der Biotechnologie und Nahrungsmittelverarbeitung. Nichtbiologische Anwendungen sind ebenfalls möglich, wie z.B. Rohrleitungssysteme für Systeme für sehr klares Wasser (z. B. wie in der Mikroelektronikindustrie verwendet) und vielleicht in Antifoulingoberflächen.
Weitere Untersuchungen sind geplant bezüglich der Fibrinogenadsorption auf den PET-Oberflächen und der Albumin- und Fibrinogen-Adsorption auf PMMA- und Pellethan-Oberflächen; ESCA-Daten, die die Anwesenheit von PEO oder anderen WLPs auf diesen Oberflächen zeigen, Blutkontakt für Pellethan- und PMMA-Oberflächen sowie REM-Analyse im Anschluß auf den Blutkontakt, um die Morphologie von Blutplättchen auf diesen Oberflächen zu bewerten; und schließlich weiterhin in vivo Tests wie eine subkutane Implantation in Mäusen. Vorläufige Daten auf PET-PEO 18500 zeigten, daß es wirksam bei der Verhinderung der Zelladhäsion ist. Ein Einwochen- Kontroll-PET-Implantat zeigte eine ausgedehnte Fibrose und Einkapselung, während man bei der entsprechenden PET-Oberfläche, die mit PEO 18500 modifiziert war, fand, daß sie freifließend war bei minimaler cellulärer Adhäsion.

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Claims

1. Zellkultursubstrat, befähigt zur Unterstützung von Zellausbreitung, umfassend eine Oberfläche mit einem kovalent gebundenen Peptid chemisch daran gebunden, wobei das Peptid weniger als 12 Aminosäurereste besitzt und ausgewahlt ist aus denjenigen, die die folgenden Erkennungssequenzen einschließen:

RGDY; REDVY; GRGDF; GPDSGR;

GRGDY; GREDV; GRGDFY; GPDSGRY;

GYIGSRY; GREDVY; GIKVAV; IKVAV;

YIGSRY; RGDF; PDSGR; IKVAVY;

REDV; RGDFY; PDSGRY; GIKVAVY,

dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenkonzentration des Peptids zwischen 0,5 bis 20 pmol/cm² liegt.

2. Substrat nach Anspruch 1, wobei das Substrat ein Material aufweist, das ausgewählt ist aus:

- einem Metall, insbesondere Titan,

- einer Keramik, insbesondere Glas, vorzugsweise ein Glas, das Glycerin-Propylsilan-gebundenes Glas aufweist und

- einem Polymeren.

3. Substrat nach Anspruch 2, wobei das Substrat ein Polymeres aufweist, das ausgewählt ist aus:

einem Kunststoff;

einem Poly(hydroxyethyl-methacrylat);

einem Poly(ethylen-terephthalat);

einem Poly(tetrafluorethylen);

einem fluorierten Ethylen; und

einem Poly(dimethylsiloxan).

4. Substrat nach Anspruch 1, wobei das Substrat ein wasserunlösliches Grundpolymeres mit einer Oberfläche mit einem physikalisch durchdringenden wasserlöslichen Polymeren aufweist, wobei das wasserlösliche Polymere kovalent gebundene Peptide besitzt zur Bildung des physikalisch durchdringenden wasserlöslichen Polymeren.

5. Substrat nach Anspruch 1, wobei das Peptid an das Substrat bei einer Oberflächenkonzentration von etwa 12 Picomol/cm² gebunden ist.

6. Substrat nach Anspruch 4, wobei das Grundpolymere ein thermoplastisches Polymeres, insbesondere Poly(ethylen-terephthalat), Poly(urethan), Poly(methylmethacrylat) oder Poly(styrol), ist.

7. Substrat nach Anspruch 4, wobei das wasserlösliche Polymere Polyethylenglycol, Polyethylenoxid, Poly(ethyloxazolin) oder Poly(N-vinylpyrrolidon) ist.

8. Substrat nach Anspruch 7, wobei das wasserlösliche Polymere ein Molekulargewicht größer als 5000 und kleiner als 100000, insbesondere eines von etwa 18500, besitzt.

9. Substrat nach Anspruch 4, wobei das Grundpolymere und das wasserlösliche Polymere wenigstens ein gemeinsames Lösungsmittel besitzen.

10. Verfahren zur Erhöhung der Zelladhäsion an einer Oberfläche, wobei das Verfahren umfaßt:

- chemisches Derivatisieren einer Oberfläche mit einem Peptid; und

- Aufbringen von Zellen auf die Peptid-derivatisierte Oberfläche,

wobei das Peptid ausgewählt ist aus denjenigen, die die Erkennungssequenzen wie in Anspruch 1 definiert einschließen, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenkonzentration des Peptids zwischen 0,5 bis 20 pmol/cm² liegt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei es sich bei den Zellen um Aortazellen, Vorhautzellen oder 3T3 handelt, die von Menschen, Mäusen, Insekten oder Schweinen stammen, insbesondere menschliche Vorhaut- Fibroblasten oder 3T3-Fibroblasten (ATCC # CRL 1658).

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, wobei die Oberfläche eine Peptidkonzentration von etwa 12 Picomol/cm² aufweist.

13. Verfahren zur Zellkulturoberflächenmodifizierung, umfassend:

- Aktivieren von reaktiven Gruppenteilen einer Oberfläche;

- Kuppeln von Peptiden an die Oberflächen-reaktiven Gruppenteile, wobei die Peptide ausgewählt werden aus denjenigen, die die folgenden Erkennungssequenzen einschließen:

RGDY; REDVY; GPDSGRY;

GRGDY; GREDVY; IKVAV;

GYIGSRY; RGDF; GIKVAV;

YIGSRY; GRGDF; IKVAVY;

REDV; PDSGR; GIKVAVY;

GREDV; GPDSGR;

und

- kovalentes Kuppeln eines Peptids an eine reaktive Gruppe auf der Oberfläche,

wobei die Peptide weniger als 12 Aminosäurereste besitzen und eine kovalente Bindung an die Oberflächen-reaktiven Gruppenteile auf der Zellkulturoberfläche bilden, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenkonzentration des Peptids zwischen 0,5 und 20 pmol/cm² liegt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Oberfläche die Oberfläche einer Vorrichtung umfaßt, die ausgewählt wird aus:

einem Gewebekultur-Kolben;

einer Petri-Schale;

Mikroträgern;

Makroträgern;

Fasern;

monolithischen Trägern; und

Rollflaschen.

15. Verfahren nach Anspruch 10 oder 13, wobei die Oberfläche ein Material umfaßt, das ausgewählt wird aus:

- einer Keramik;

- einem Polymeren, insbesondere Poly(hydroxyethylmethacrylat), und

- einem Metall, insbesondere Titan.

16. Verfahren nach Anspruch 10 oder 15, wobei ein terminales primäres Amin eines Glycin-Linker-Arms auf dem Peptid auf die Hydroxylgruppen der Polymeroberfläche durch Tresylchlorid-Aktivierung gepfropft wird.

17. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die reaktive Gruppe auf der Oberfläche aktiviert werden kann, indem die Oberfläche einer Chemikahe ausgesetzt wird, die ausgewählt ist aus:

Glutaraldehyd;

Cyanurchlorid;

Sulfonylchlorid;

Cyanbromid; und

Trifluorethansulfonylchlorid.

18. Verfahren zur Herstellung einer biomedizinischen Vorrichtung für ein in vivo Implantat, umfassend das kovalente Binden eines Peptids an eine Oberfläche der Vorrichtung, wobei das Peptid weniger als 12 Aminosäurereste besitzt und eine Aminosäuresequenz einschließt, die eine Anlagerung von Zellen über einen dazwischengeschobenen Zellrezeptor an die Vorrichtungsoberfläche fördert, wobei die Aminosäuresequenz ausgewählt wird aus:

RGDY; GREDVY; PDSGR; GIKVAV;

GRGDY; REDVY; PDSGRY; GIKVAVC;

GYIGSRY; RGDF; GPDSGR; GIKVAVCY;

YIGSRY; GRGDF; GPDSGRY;

REDV; GRGDFY; IKVAVC;

GREDV; RGDFY; IKVAVCY;

dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenkonzentration des Peptids zwischen 0,5 und 20 pmol/cm² liegt.

19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche eine Peptidkonzentration von etwa 12 pmol/cm² aufweist.

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei die biomedizinische Vorrichtung ausgewählt wird aus

intraokülaren Linsen;

Sutura (Nähten);

Penisimplantaten;

Herzimplantaten;

Hüftimplantaten;

künstlichen Venen;

künstlichen Arterien

künstlichen Vaginaimplantaten;

künstlichen Sehnen;

künstlichen Bändern;

künstlichen Knochenschrauben;

künstlichen Knochenplatten;

künstlichen Knochenfragmenten;

künstlichen Knochengelenken;

künstlicher Haut;

künstlichen Nervenstrangleitungen; und

Kathedern, insbesondere einen Polyethylen aufweisenden Katheder.

21. Zellsubstrat von endothelialen Zellen, aufweisend eine Oberfläche mit einem kovalent gebundenem Peptid einschließend ein REDV-, YIGSRoder PDGSR-Peptid chemisch daran gebunden, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenkonzentration des Peptids zwischen 0,5 und 20 pmol/cm² liegt.

22. Zellsubstrat nach Anspruch 21, wobei das Peptid ein REDV-Peptid einschließt.

23. Zelloberfläche zum selektiven Ausschluß von Blutplättchenadhäsion, aufweisend eine Oberfläche mit einem kovalent gebundenen Peptid einschließend ein RGD-Peptid chemisch daran gebunden, wobei das Peptid am N-Terminus des Peptids an die Oberfläche immobilisiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberflächenkonzentration des Peptids zwischen 0,5 und 20 pmol/cm² liegt.