JP2665503B2

JP2665503B2 - インシュリン様成長因子の免疫分析を可能にするインシュリン様成長因子に対するモノクローナル抗体対

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Publication number: JP2665503B2
Application number: JP63112654A
Authority: JP
Inventors: ミッチェル・ジィー・スコット
Original assignee: 株式会社第一ラジオアイソトープ研究所
Priority date: 1987-05-29
Filing date: 1988-05-11
Publication date: 1997-10-22
Anticipated expiration: 2012-10-22
Also published as: AU1232188A; EP0292656A1; JPS643561A

Description

【発明の詳細な説明】この発明は血清インシュリン様成長因子Ｉ（IGF−
Ｉ）の濃度を測定するための臨床方法、及びその方法を
行なうために用いられるモノクローナル抗体の単離方法
に関するものである。

インシュリン様成長因子（IGF）は、生体細胞に対し
ていろいろなインシュリン様の成長促進効果をもたら
し、特に骨格や他の身体の組織に対する成長ホルモンの
成長促進作用の仲介をする、互いに極めて類似した一群
のペプチドである。IGF−Ｉ（ソマトメジンＣ）とIGF−
II（ソマトメジンＡ）は分子量約7500ダルトンの小さな
タンパク質で、互いに相同な約62％のアミノ酸配列を有
する。

IGF−Ｉはこの物質の初期の研究において推測された
肝臓だけではなく、身体組織の種々の部位や細胞で分泌
されていると考えられている。プラズマ中のその濃度
は、成長ホルモンが下垂体から分泌されると増加するこ
とができる。従って、IGF−Ｉの分泌は主に成長ホルモ
ンによって調節される。

血清IGF−Ｉ濃度は成長期の動物やヒトの成長状態と
かなり相関することがわかった。例えば、成長不全は
（ａ）下垂体の病気を持つ子供の場合のように、成長ホ
ルモンを分泌することができず、それに伴いIGF−Ｉが
欠如すること、又は（ｂ）IGF濃度は標準に近いにもか
かわらず標準以下の速さでしか成長しないターナー症候
群の女の子供の場合のように、IGF−Ｉに対する末梢抵
抗（peripheral resistance）に起因することがわかっ
た。さらに標準的な濃度の成長ホルモンを有するヒトが
時々IGF−Ｉの最適量を産生することができなくなる。5
00を超えるピグミーのIGF−Ｉ濃度に関する最近の調査
では、IGF−Ｉが思春期の成長を調節している主な因子
であると強く示唆されている。従って、IGF−Ｉ濃度は
成長異常の患者の成長状態を評価するために臨床的に重
要である。

成長ホルモンを用いた治療により、下垂体機能が低下
した多くの子供は血清IGF−１の濃度が標準範囲にまで
上昇することを示す。成人では下垂体疾病による成長ホ
ルモンの過剰生産は先端巨大症のような身体的奇形を引
き起こすのかもしれない。この状態は、成長ホルモンの
半減期が短く、脈動的に分泌されるので測定するのが難
しいために、奇形が明らかになるまで見つけられないこ
とが多い。幸い、これらの構造変化が明らかになる前に
IGF−Ｉ濃度が高くなることが発見されたので、IGF−Ｉ
測定法を用いてこれらの人々に対する治療を開始するこ
とができ、成功裡に監視することができる。その上、激
しい変動を示すヒト成長ホルモンと違い、IGF−Ｉ血清
濃度は安定で変化もとても緩やかである。従って、IGF
−Ｉを測定することは、ヒト成長ホルモンを直接測定す
ることよりも臨床的な価値を有し得る。何故なら、ダブ
リュ・エイチ・ドウアディら、“Serum Somatomedin Bi
nding Proteins:Physiologic Significance and Interf
erence in Radioligand Assay".,J.Clin.Endocrinal.Me
tab.1987,109:355のIGF−Ｉ臨床効用についての評論に
よると、IGF−Ｉは長期の成長状態をより正確に反映し
ており、また多様で誘発的な成長ホルモン測定の必要性
を排除するからである。それにもかかわらず、IGF−Ｉ
の日常的な測定法は臨床検査室では一般的になっていな
い。IGF−Ｉの測定に関する方法はダブリュ・エイチ・
ドウアディら、“Measurement of somatomedin By Cati
lage In−Vitro",Methods In Enzymology,1975,vol.37,
pp.93−109.で述べられているように、生体外での生物
検査法を含んでいた。さらに、アール・エヌ・マーシャ
ルら、Journal of Clinical Endocrinology and Metabo
lism,vol.39,pp.238−292、ドーアディら、Journal of
Clinical Endocrinology and Metabolism,vol.53,pp.28
2−288、バクスターら、Journal of Clinical Endocrin
ology,vol.24 267−278,.に述べられているように、放
射受容器検査法が用いられている。これらの方法はしか
しながら時間がかかり、技術的に複雑でしばしば判定に
問題が起こる。このようにこれらの方法は、臨床検査室
で日常的に使用するには実用的ではない。

競合阻害免疫検査法を可能にする、IGF−Ｉに特異的
な多クローン性抗血清が発見された。（ハァーラネット
ら、Journal of Clinical Investigations,vol.60,pp.6
48−657）。これらの手法は、測定対象となるIGF−Ｉと
放射活性元素¹²⁵Iと多クローン抗血清の複合体を形成す
ることに基づく。検査対象となるIGF−Ｉは既知量の標
識されたIGF−Ｉと、一定量の多クローン抗血清結合部
位に関して競合する。多クローン性抗血清に結合された
標識されたIGF−Ｉの量は試料中のIGF−Ｉに反比例す
る。従って、結合された標識IGF−Ｉを、結合されなか
った標識IGF−Ｉから分離した後の検出及び／又は定量
分析が測定法の基本となる。これらの検査法は多くの段
階と長いインキュベーション、結合したリガンドと結合
していないリガンドとの難しい分離を必要とし、大変扱
いにくいので、臨床研究室で日常的に用いるには利用性
に乏しい。

IGF−Ｉを高分子に結合させ、次いで免疫感作させて
ミエローマ細胞と融合させ、生体外でハイブリドーマを
生産することによってIGF−Ｉに対するモノクローナル
抗体が開発されたにもかかわらず、これら従来技術で得
られたモノクローナル抗体は交差反応の問題を完全には
解決していない。バクスターら、Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism,vol.54,pp.474−476,リ
ードら、Biochemical Journal,vol.233,pp.215−221,ロ
ーブリら、FEBS Letters,vol.149,p109。

IGF−Ｉに対する放射免疫検定法は検査される血清中
のIGF−Ｉ結合蛋白質複合体の存在により阻害される。
これらの複合体は正確な総IGF−Ｉを測定するために、
血清を検査する前に分離しなければならない。酸性化、
酸−エタノール混合、酸クロマトグラフィー、蛋白水加
水分解を含む色々な抽出方法がこの問題を解決するため
に用いられた。しかし、これらの抽出方法はかなり手間
がかかり、抽出した試料を蒸発及び再構成あるいは中和
する必要がある。

ゲイリーデビットの米国特許第4,376,110号には、測
定すべき抗原ではなく、抗体を標識する簡易二部位すな
わちサンドイッチ標識免疫検定法の方法が開示されてい
る。この方法は、固体支持体に結合されたある量の非標
識モノクローナル抗体と、放射標識又は酵素標識された
可溶性のモノクローナル抗体とを用いる。この方法によ
り、固相抗体、抗原及び標識された可溶性抗体間に形成
された複合物を検出及び／又は定量測定することができ
る。

しかしながら、この方法では、抗原の異なる部位に結
合する相補的な一組の抗体を必要とする。このような相
補的抗体を生産するのに、インシュリン自身、甲状腺刺
激ホルモン、ガンマグロブリン、アレルゲン、ウイル
ス、ウイルスサブユニット、細菌、破傷風や動物の毒に
付随する毒素は、その高分子上の種々の異なる抗原部位
を利用できることから成功裡に用いることができること
がわかった。このような成功の例としては、ガン胎児性
抗原、肝炎Ａ及びＢ、肝炎非A/非Ｂ、IgE並びにアルフ
ァフェトプロテインを挙げることができる。しかしなが
ら、このような方法は分子量8000以下の小さな分子、特
にIGF−Ｉにはこれまで利用されていない。十分な相補
性を有し、IRMA立体配置（configuration）を可能にす
るIGF−IIと交差反応しないモノクローナル抗体はいま
だ開発されていない。

従来の技術のIGF−Ｉの臨床分析における問題を解決
し、IGF−Ｉの抽出操作を単純化することができる、簡
易放射免疫分析により、この分野は実質的に進歩するで
あろう。

従って、この発明の目的は、IGF−Ｉの放射免疫分析
のための改良された方法を提供することである。

さらに詳細に述べると、この発明の目的は、より迅速
で、インキュベーションを同時に行なうことができる、
IGF−Ｉに対するモノクローナル抗体の単離方法を提供
することである。

この発明のもう一つの目的は、これらの新規なモノク
ローナル抗体をIGF−Ｉを測定するためのより高感度な
免疫分析に用いることである。

さらにこの発明の目的は、抽出した試料の蒸発、再構
成（reconstitution）又は中和を行なうことなく分析を
行なうためにIGF−Ｉ血清を抽出する方法を提供するこ
とである。

この発明によると、インキュベーション時間が短く、
操作が容易で、IGF−IIとの交差反応性が1.2％未満であ
るという利点を有する、同時的なインキュベーションを
行なう、モノクローナル抗体に基くIGF−Ｉのための放
射免疫分析方法が提供される。この方法はまた、感度が
高いので、抽出操作が予期しない程単純化される。IGF
−Ｉに対して特異的なこの新規な放射免疫分析方法は、
臨床実験室におけるIGF−Ｉの単純な定型的測定方法を
与える。

この発明によると、IGF−Ｉ上の空間的に異なる部位
に対する新規な一対の抗体（相補的）が、純粋な非結合
IGF−Ｉをマウスの腹腔内で免疫化することにより得ら
れる。

精製された、生物活性組換えIGF−Ｉは好ましくは、
ブエルらにより、「ソマトメジンＣ（IGF−Ｉ）をコー
ドする合成遺伝子の大腸菌における発現の最適化」と題
してNucleic Acids Research,Volume 13,pp.1923−1937
に記載された方法、及びバーレイらにより、「組換え細
菌により産生されるソマトメジンＣの２つの形態の特徴
づけ」と題して1986年に出版のためにJournal of Biolo
gical Chemistryに提出された方法により調製すること
ができる。組換えIGF−Ｉ製剤の純度及び均一性は、SDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、
アミノ酸分析、ゲルろ過クロマトグラフィー及び逆相HP
LC（高速液体クロマトグラフィー）等のタンパク質を特
徴づけるための標準的な方法により確立される。精製さ
れた組換えIGF−Ｉは、ヒト胎盤膜放射レセプター分析
においてIGFレセプターに特異的に結合することが見出
された。この結合は、その親和性において、天然の精製
されたIGF−Ｉに匹敵する。その調製物は、バクスター
らによって、「天然及び組換えDNA由来ヒトインシュリ
ン様成長因子Ｉの比較並びに放射分析」と題して1987年
にClinical Chemistry 33:544に記載された。この調製
物は、Ｎ末端のメチオニンリーダー残基を除いて、生化
学的に内発性IGF−Ｉに一致している。

IGF−Ｉ分子は小さいので、オバルブミン又はキーホ
ールリンペットヘモシアニンのような担体タンパク質に
結合しなければ免疫原性に乏しいと考え得るにもかかわ
らず、例えば動物当たり合計25マイクログラムの非結合
IGF−Ｉとフロインドの完全アジュバントとを用いてマ
ウスの腹腔内に免疫化し、同量のIGF−Ｉをフロイント
の不完全アジュバントと共に第14日、第28日及び第38日
にブースター投与することができる。Nature 1978 pp.2
78:269に記載されたシュルマンらの標準的な拡散方法を
最後のブースターの３日後に行なう。選択されたセルラ
インは次いで限界希釈法によりクローン化し、ハイブリ
ドーマ細胞培養物を増殖させ、腹水生産のために隔離さ
れた繁殖動物に注射する。モノクローナル抗体は、50％
飽和硫酸アンモニウム中での沈殿及び高速液体イオン交
換クロマトグラフィーによりさらに分離することができ
る。これらは次いで周知のハンター−グリーンウッドク
ロラミンＴ法の修飾によってヨウ素化することができ、
又はこれらを用いて表面をコートすることができる。

このようにして発見された精製モノクローナル抗体は
驚くべきことに相補的であり、（１）1.2％未満のIGF−
IIとの交差反応性を有する2D12.1と（２）6B1.1と同定
された。以前にはこのような「相補的」なモノクローナ
ル抗体の組は報告されていない。これらの相補的な抗体
の驚くべき単離は、免疫化に用いられたIGF−Ｉの非結
合形態に由来するものと信じられる。この存在は完全に
理解されているわけではないが、１つの理由づけとし
て、担体タンパク質に結合された場合よりも小さな免疫
原性を有する小さな分子量にもかかわらず、IGF−Ｉ上
の空間的に異なるエピトープに対するモノクローナル抗
体を同定する能力又は蓋然性が、IGF−Ｉを担体タンパ
ク質に結合することなく免疫化することによって高めら
れるということが考えられる。担体タンパク質に結合さ
れたIGF−Ｉによる従来の免疫化では、いくつかのエピ
トープすなわち抗原決定部位がマウスの免疫系に作用す
ることが妨げられた。

２つのモノクローナル抗体6B1.1と2D12.1は、これら
のどちらもが液相において他の固相抗体によって組換え
IGF−Ｉの結合を阻害しなかったので、IGF−Ｉ上に異な
るエピトープに結合することがわかった。個々の抗体
は、それ自身の固相結合を完全に阻害した。抗体は両者
とも例えば6B1.1についてKa＝２×10⁹L/mol,2D12.1にて
６×10⁸L/molの高い結合親和性を有する。

IGF−Ｉ特異的放射免疫分析は以下の工程により行な
うことができる。

これらの２つのモノクローナル抗体のうち、好ましく
は6B1.1は固相表面、好ましくはポリスチレンチューブ
の内面上に受動的に吸収される。他の表面としては例え
ばポリスチレンビーズ、ポリスチレン若しくはポリビニ
ルマイクロタイタープレート、ポリエチレンチューブ又
はラテックスビーズを挙げることができる。コーティン
グの量は500ngと10μｇの間である。

液相モノクローナル抗体2D12.1はセイヨウワサビパー
オキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ又はβ−ガラ
クトシダーゼ等の酵素に容易に結合してこの発明の酵素
免疫分析（EIA）を行なうことができるし、ルミノー
ル、イソルミノール、アクリジニウム及びフェナンスリ
ジニウムエステル若しくはそれらの誘導体に結合してこ
の発明の発光免疫分析態様を行なうこともでき、さらに
フルオロフォアのような他の標識化合物に結合してこの
発明の発光免疫分析（LIA）を行なうこともできる。

この第２のモノクローナル抗体は、従来の免疫分析に
おいて用いられているいくつかの標識のいずれか、好ま
しくは¹²⁵Iで標識され、一般的に10−150mMの塩と、0.0
−１％ウシ血清アルブミン又は他の非特異的タンパク
質、好ましくはpH6.5ないしpH8.0、好ましくはpH7.4に
中和された食塩中のリン酸ナトリウム並びに好ましくは
ヘパリン及びエチレンジアミン四酢酸のようなキレート
剤を含む溶液に溶解される。溶液は第１のモノクローナ
ル抗体でコートされたポリスチレン又は他のプラスチッ
クチューブに加えられ、試験すべき血清が例えば25μｌ
ないし100μｌ、好ましくは25μｌの量でチューブに加
えられる。

この発明の方法により試験すべき尿、唾液、組織培養
上清、好ましくは血清は、試験の前に抽出してIGF結合
タンパク質の妨害を排除すべきである。このような抽出
は従来技術の抽出に比較してかなり単純化される。従来
技術では抽出された試料の中和、又は蒸発及び再構成
が、放射免疫分析等に用いる前に必要であった。この発
明ではこれらの後者の工程が排除される。結合タンパク
質は室温で30分間インキュベートした酸エタノールで血
清を抽出することによって省略することができる。試料
は次いで、10分間遠心分離し、その上清分画は、従来の
ように蒸発や中和を行なうことなく直接分析に用いるこ
とができる。85％エタノール中0.2Mギ酸又は70−95％エ
タノール中0.1Nないし0.5Mギ酸若しくは塩酸が好まし
い。

抽出した血清、又は所望ならばチューブに加えた後の
血清標準を好ましくは数分ないし約３時間、20℃ないし
40℃の温度下でインキュベートする。チューブを次いで
傾しゃし、洗浄し、放射活性レベルをカウントする。IG
F−Ｉ濃度は、試料チューブ中に結合された¹²⁵Iカウン
トを直接標準曲線と比較することによって測定すること
ができる。標準曲線は、分析中に結合された結合¹²⁵I−
2D12.1のカウントに対する、分析された標準におけるIG
F−Ｉ濃度のプロットとして記載することができる。分
析結果は０〜800μg/のIGF−Ｉでは直線的であり、4m
g/以下の濃度では「フック」効果（高ドーズ阻害）を
示さなかった。インシュリン又はプロインシュリンのい
ずれとも交差反応性を示さなかった。IGF−IIは1.6％未
満の交差は能性であった。分析の感度（検出可能な最低
量）は、バックグランドの２倍のカウント速度に基いて
５μg/である。この標準曲線の線形回帰分析により、
相関係数が0.99、異なる標準濃度（ｎ＝５）についての
変数係数が3.3％ないし10％であることが示された。変
数係数（C.V.）は標準偏差を平均値で除したものである
と定義される。

以下、実施例によりこの発明をさらに例示する。以下
の実施例より他の具体例も明らかになるであろう。以下
の実施例は発明の範囲を限定することを意図するもので
はない。

実施例において、以下の略号を用いる。

BSA＝ウシ血清アルブミン、 MIg＝マウス免疫グロブリン、 Ig＝免疫グロブリン、 ml＝ミリリットル、＝リットル、 ng＝ナノグラム、 MAb＝モノクローナル抗体、 PBS＝リン酸緩衝食塩水、 Mg＝ミリグラム、 μｇ＝マイクログラム、 μｌ＝マイクロリットル実施例Ｉ IGF−Ｉ結合モノクローナル抗体の同定融合10〜14日後、一次ハイブリドーマ培養ウェルから
の上清を回収し、以下のようにして¹²⁵I−IGF−Ｉに対
する結合能力をスクリーニングした。ポリ塩化ビニルマ
イクロタイターウェルを、150mlのリン酸緩衝食塩水（p
H7.4）中の２μg/mlの親和性精製ヤギ抗マウス免疫グロ
ブリン（MIg）でコートした。ウェルを10g/ウシ血清
アルブミンで30分間ないし60分間ブロックした。150μ
ｌの一次ハイブリドーマ培養物ウェル上清を抗マウスIg
がコートされたプレートに移した。もしマウスモノクロ
ーナル抗体が培養上清中に存在するならば、それらはマ
イクロタイターウェル上の固相ヤギ抗MIgにより結合さ
れる。これらの上清はウェル中で室温でインキュベート
した。このインキュベーション後、結合されたあらゆる
MAbを残したまま上清を除去し、水で３回洗った。つい
で10g/のBSA、10mMのリン酸緩衝食塩水（pH7.4）150
μｌ中に含まれた100,000cpmの¹²⁵I−IGF−Ｉを個々の
マイクロタイターウェルに加え、室温で３時間インキュ
ベートした。マイクロタイターウェルに結合された、IG
F−Ｉに対して特異性を有するいかなるMAbも¹²⁵I−IGF
−Ｉを結合するのでウェルを洗浄し、カウントし、分離
した際に、高いcpmにより同定される。モノクローナル
抗体2D12.1及び6B1.1がIGF−Ｉを結合したことを示す最
初のスクリーニング分析の結果が表１に示されている。
2D12.1及び6B1.1という命名は任意的なものであり、そ
れらが初めて同定されたウェルを示すものである。

２）モノクローナル抗体6B1.1及び2D12.1がIGF−Ｉ上の
位置的に異なるエピトープを結合するか否かの決定異なるモノクローナル抗体がIGF−Ｉ上の異なるエピ
トープに同時に結合する（相補的）能力を、２つのモノ
クローナル抗体が可溶性¹²⁵I−IGF−Ｉに対して競合す
ることを許す阻害分析により決定した。簡単に言うと、
10⁵cpmのIGF−Ｉを、10μｇの特定のモノクローナル抗
体と１％BSAとを含む150μｌのPBS中で１時間インキュ
ベートした。つぎにこれを同一のモノクローナル抗体又
は他のモノクローナル抗体で予めコートしたウェルに添
加した。モノクローナル抗体の相補性は、液相抗体によ
る、固相抗体への¹²⁵I−IGF−Ｉの結合の阻害の量によ
り評価した。

これらのモノクローナル抗体のおよその親和性は、ナ
ームら、J.Immunol.1977,vol.119,p301に「シップス等
式の新しい適用方法」と題して記載されたシップス等式
の修飾を用いて決定された。

液相の抗体はいずれも他の固相抗体によってmet−hIG
F−Ｉへの結合を阻害しなかったので（表３）、２つの
抗体6B1.1と2D12.1は空間的に区別できるエピトープに
結合することが示された。それぞれの抗体は、自身の固
相結合を完全に阻害した。両方の抗体とも高い結合親和
性を有することが示された。すなわち、6B1.1について
はKa＝２×10⁹/mol、2D12.1についてはKa＝６×10⁸
/molであった。

実施例II 選択されたIGF−Ｉ特異的モノクローナル抗体の特徴づ
け上述のスクリーニングでIGF−Ｉに結合すると同定さ
れたモノクローナル抗体をさらに特徴づけた。モノクロ
ーナル抗体6B1.1及び2D12.1の特異性の故に、この実施
例はこれらのモノクローナル抗体に限定して記載する。

1.）IGF−Ｉに関連するタンパク質に対する6B1.1及び2D
12.1の交差反応性の測定モノクローナル抗体の特徴づけこれらの抗体の特異性は、パールマッターにより「ネ
ズミ抗炭水化物抗体のサブクラス限定」と題して、J.Im
munol.,1978.121:566に記載された競合的阻害マイクロ
タイタープレート放射免疫分析により測定された。簡単
に述べると、96ウェルの、可撓性のポリ塩化ビニルマイ
クロタイタープレート（ファルコン社）を精製抗IGF−
Ｉモノクローナル抗体6B1.1又は2D12.1の至適希釈物
（0.5−2mg/ml）でコートし、次いでPBS（pH7.4）中ウ
シ血清アルブミン（10mg/ml）でブロックした。阻害剤
として試験する試料を加え、同じプレート内で３倍逓減
希釈を行なった。10⁵cpmの¹²⁵I−IGF−Ｉをそれぞれの
ウェルに加え、室温で４ないし６時間インキュベートし
た。試料による阻害をIGF−Ｉ標準と比較し、交差反応
性を評価した。

これら２つの抗体の特異性を上記した阻害RIAにより
測定した。表２は、２つの抗体による¹²⁵I−IGF−Ｉの
最大結合の50％が阻害される種々のタンパク質の濃度を
示す。ヒトソマトトロピン及びプロラクチンはいずれの
抗体も検出可能な交差反応性を示さなかった。モノクロ
ーナル抗体6B1.1はIGF−IIと21％の交差反応性を有し、
モノクローナル抗体2D12.1はこの分析においてIGF−II
に対して1.2％未満の交差反応性を有していた。

実施例III IGF−Ｉ分析標準曲線及びIGF−Ｉ免疫反応性モノクロー
ナル抗体の交差反応性の測定 IGF−Ｉ特異的IRMA分析が、セビアーらの「臨床免疫
学におけるモノクローナル抗体」と題するClinical Che
mistry.1981,27:1797に記載された方法を修飾して開発
された。この分析は、1mlの100mMリン酸ナトリウム、15
0mM NaCl、pH7.4、0.3U/mlのヘパリン、1.0ml/のトゥ
イーン20、1g/のEDTA、pH7.4中の２×10⁵cpmの
［¹²⁵I］−MAb 2D12.1を、2.5μｇのモノクローナル抗
体6B1.1が受動的に吸収されたポリスチレンチューブ
（マキシソープ、NUNC）に加えた。25μｌの抽出された
血清又は標準を次いでこのチューブに加え、37℃で３時
間インキュベートした。チューブを次いで傾しゃし、水
で３回洗いカウントした。試料チューブ中に結合したカ
ウントを標準曲線と比較することによってIGF−Ｉ濃度
を、測定した。

タンパク質標準： 10g/のBSA及び20ユニット/mlのヘパリンを含む10mM
リン酸、150mM NaCl、pH7.4（PBS）中にIGF−Ｉ標準を
調製した。この操作において用いた全てのBSAは、予め
スクリーニングしてIGF−Ｉが存在しないことを確認し
た。

IGF−IIは、ディー・ハーレイン博士、バイオジェン
・エス・エイ社の好意により供与された。精製ヒトプロ
ラクチン及びソマトトロピンはカルビオケム（カリフォ
ルニア州ラジョラ）から購入した。ヒトインシュリンは
シグマ・ケミカル社（ミズーリー州セント・ルイス）か
ら購入した。ヒトインシュリンはシカゴ大学のエイチ・
ティガー博士から親切にも供与された。

これらの他のタンパク質はIGF−Ｉ標準のために用い
たのと同じ標準緩衝液中で調製した。

第１図及び表４はIGF−Ｉ IRMA分析によって得られ
た代表的な標準曲線である。この分析は０−800μg/
の範囲で直線的であり、血清試料に対する感度は10μg/
であった。4mg/（図示せず）の高きに至るまでカウ
ント率の低下は観察されなかった。インシュリン及びプ
ロインシュリンについては検出可能な交差反応性が見ら
れず、IGF−IIはIGF−Ｉ IRMA分析において1.6％の交
差反応性を示した。この標準の線形回帰解析により、標
準曲線の相関係数は0.99でCVは異なる標準濃度において
3.3％ないし10％であることがわかった。

実施例IV 血清試料上のIRMA分析能血清試料は、糖尿病リサーチの中央研究所及びミズー
リ州セント・ルイスのワシントン大学医学部のトレーニ
ングセンターの成長疾患を有する患者から得た。IGF−
Ｉの測定は、酸−エタノール抽出の後、その実験室で、
先に出版されたドウアディらの二重抗体RIA（J.Clin.En
do.Metab.,1980 vol.51.p.781）を用いて行なった。

IRMA分析能５つの患者血清に加えられたIGF−Ｉの回収率は表５
に示す様に75−103％であった。５つの患者血清を用い
た内部分析精度試験（Intra−assay precision studie
s）によるとCVは2.5％ないし7.8％であった（表６）。
これらと同じ試料を用いた内部分析精度はCVが1.8％な
いし14％（表７）であった。

広い分析範囲（25−1008μg/）をカバーするRIA値
を有する25の患者血清についてIRMA及びRIAの両方を行
なった（第２図）。RIA及びIRMから得られた値の線形回
帰分析により、優れた相関（ｒ＝0.97）が得られ、有為
なバイアスは見られなかった。勾配＝1.07（ｙ＝1.97x
＋2.9）。

表１ハイブリドーマ上清結合した¹²⁵I−IGF−I^a 6B1.1 33,356 2D12.1 55,341 ^ｂ媒体 1,143 ^ｃサイトトロピンに特異 1,267 的な無関係なMAb ａヤギ抗MIg、次いでハイブリドーマ培養上清でコー
トされたマイクロタイターウェル中に結合されたcpm。

ｂ非特異的結合対照としての倍地。

ｃ非特異的な、無関係なモノクローナル抗体対照とし
てのサイトトロピン（TSH 7D3.2）に対するモノクロー
ナル抗体。

表５外来性IGF−Ｉの回収血清試料No. ａ値ｂ予測値実測値 5513 287 487 477（95％） 5519 75 275 280（103％） 5523 77 277 260（92％） 5540 83 283 272（95％） 5532 168 368 319（75％）ａ回収実験を行ったのと同じ条件のIRMで得られた
値。

ｂ 1mlの血清に200ngのIGF−Ｉを加えた後に予測され
る値。

表６内部分析精度試料No. ｎ（ug/L） C.V. 4744 ５ 583±14 2.5％ CB ５ 143±6.6 4.6％ 5532 ５ 228±18 7.8％ 5513 ５ 255±11 4.7％ 5519 ５ 88±5.2 5.9％

【図面の簡単な説明】

第１図はIGF−Ｉ IRMA分析によって得られた標準曲線
図、第２図はIRMA分析およびIRA分析の両方を行った結
果を示す線図である。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）担体タンパク質に結合されていな
いIGF−Ｉを腹腔内投与した後に同定される、IGF−IIに
対して２％未満の交差反応性を有し、IGF−Ｉの特異的
領域を認識するモノクローナル抗体及び、IGF−Ｉの特
異的領域以外を認識するモノクローナル抗体からなるIG
F−Ｉに対する相補的な一対のモノクローナル抗体のい
ずれかで固相免疫分析表面を覆う工程と、（ｂ）酸−エタノール抽出され、蒸発及び再構成又は
中和されていない液体試料を反応系に直接添加する工程
と、（ｃ）試料を添加するのと同時に、前記反応系に、標
識された相補的な第２のモノクローナル抗体を添加し
て、（ｉ）存在する全てのIGF−Ｉ、（ii）第１の固定
化モノクローナル抗体、及び（iii）第２の標識された
相補的なモノクローナル抗体、を結合した複合体を形成
させる工程と、（ｄ）混合物を同時に３時間以下インキュベートする
工程と、（ｅ）固相支持体を洗浄して残留する未反応の標識モ
ノクローナル抗体を抽出する工程と、（ｆ）標識をカウントし、そのカウントを予め測定さ
れたIGF−Ｉに対する標準曲線と直接比較することによ
って複合体中に結合されたIGF−Ｉの濃度を測定する工
程と、を備えた液体中のIGF−Ｉの免疫分析方法。
【請求項２】IGF−Ｉを担体タンパク質に結合すること
なく腹腔内免疫化し、IGF−IIに対して２％未満の交差
反応性を有し、IGF−Ｉの特異的領域を認識するモノク
ローナル抗体及び、IGF−Ｉの特異的領域以外を認識す
るモノクローナル抗体をスクリーニングすることを含
む、IGF−Ｉに対する相補的な一対のモノクローナル抗
体の単離方法。
【請求項３】第２のモノクローナル抗体の標識が、放射
性同位元素である請求項１記載の方法。
【請求項４】第２のモノクローナル抗体の標識が、酵素
である請求項１記載の方法。
【請求項５】第２のモノクローナル抗体の標識が、発光
物質である請求項１記載の方法。
【請求項６】第２のモノクローナル抗体の標識が、蛍光
物質である請求項１記載の方法。
【請求項７】免疫臨床分析に適し、担体タンパク質に結
合されていないIGF−Ｉを腹腔内投与した後に同定さ
れ、IGF−IIに対して２％未満の交差反応性を有し、IGF
−Ｉの特異的領域を認識するモノクローナル抗体及び、
IGF−Ｉの特異的領域以外を認識するモノクローナル抗
体からなるIGF−Ｉに対する相補的な一対のモノクロー
ナル抗体。